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Procédé de détermination des concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt en plaque
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et boite utilisee dans ce procede.
La présente invention est relative ä un procédé de détermination des concentrations de microbes par un procédé de dépôt sous forme de plaque, qui consiste â mettre un échantillon et un milieu sous forme de plaque dans une boite, ä laisser le milieu se solidifier, et ä faire incuber la plaque solidifiee, puis ä dénombrer les colonies de la plaque. L'invention concerne également une botte qui convient pour determiner des concentrations de microbes au moyen d'un procédé de dépôt sous forme de plaque.
En microbiologie laitière et alimentaire, en microbiologie médicale, ainsi qu'en microbiologie generale, on effectue en general la détermination du nombre de microbes contenus dans un échantillon au moyen de procédés sur plaque avec dilution. Nombre des procédés comparatifs, dits internationaux, sont de ce type.
Dans des procédés sur plaque avec dilution,
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on inocule un certain volume d'un echantillon à exa- miner ou une dilution de celui-ci dans une boite de . petri. C'est ainsi, par exemple, que l'on verse de
10 ä 15 ml d'un milieu de culture sterile susceptible de se solidifier (gelose) et ayant une température
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de 45 + 1 C sur l'échantillon. On melange immédiatement l'échantillon au milieu et on laisse la solidification s'effectuer à la température ambiante sur une surface horizontale. On peut aussi melanger l'échantillon et le milieu avant le dépôt en plaque.
Le milieu solidifié forme une couche d'une epaisseur uniforme sur la botte. Les plaques solidifiées sont retournées sens dessus-dessous et placées dans un
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incubateur (incubation). Les températures d'incubation (par exemple 10oye, 30 C, 37OC, 44OC, 55 C) et la duree d'incubation (par exemple 2, 3, 6 et 10 jours) dépendent du procédé applique, principalement du groupe de microbes ä examiner. Les boltes sont en position horizontale pendant l'incubation.
Après l'incubation, on denombre les colonies dans la holte de Pétri. Connaissant la quantité de l'inoculum de l'echantillon et les rapports de dilution, on peut determiner le nombre de microbes par unité de volume ou par unite de poids de l'echantil- lon, habituellement exprimé en microbes/ml ou en microbes/g, ä partir du nombre de colonies dénombrables.
Le milieu peut contenir une diversité d'agents nutritifs aussi grande que possible pour que des types de microbes de l'échantillon aussi nombreux que possible aient les conditions de croissance requises (ce que l'on appelle un dénombrement total des colonies). On peut également restreindre les agents nutritifs du milieu ou ajouter au milieu des composes connus d'inhibition de la croissance. On désigne ces milieux comme étant des milieux sélectifs et leur but est de permettre de distinguer un certain groupe de microbes.
On peut effectuer le denombrement ä l'oeil (au moyen de dispositifs auxiliaires connus) ou au
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moyen de divers dispositifs électriques de dénombrement (dispositifs automatiques de dénombrement de colonies).
Une grande concentration de colonies dans la boite impose des limites au dénombrement. 11 est courant d'inclure dans le dénombrement seulement des plaques dont la quantité de colonies ne dépasse pas une limite déterminée ; c'est ainsi, par exemple, qu'avec des plaques ayant un diamètre de 9 cm, on considère que la limite supérieure est de 300 colonies. Pour pouvoir examiner des échantillons ayant une grande concentration de microbes, il est nieces- saire d'utiliser des techniques de dilution. En pra-
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tique, il est habituellement toujours necessaire d'utiliser des dilutions dans le travail de déport sous forme de plaque.
La preparation des dilutions successives représente de 70 ä 90 % du temps de travail requis pour tout le stade de depot sous forme de plaque (en fonction de la dilution dont on croit avoir besoin). D'une manière correspondante, la substance dont on a besoin est un multiple de nombre de dilutions.
Les procedes anterieurs en plaque avec dilution ont ainsi l'inconvenient d'exiger la preparation de grandes successions de dilutions et la culture de plusieurs dilutions. Il faut un grand nombre de boltes ä cet effet ; en outre, on a besoin de beaucoup d'espace d'incubation. En d'autres termes, les proche- des sont compliques et prennent du temps.
L'invention vise un procédé qui pallie les inconvenients mentionnés ci-dessus et qui permet de determiner des concentrations de microbes d'une maniere simple et fiable. Ceci est obtenu au moyen du procédé suivant l'invention qui est caracterise en ce qu'il consiste à melanger le milieu et l'echan-
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tillen pour obtenir un mélange homogene dont la con- centration de microbes est constante, et ä faire se solidifier le milieu de façon que l'épaisseur de couches du milieu varie d'une maniere reglee.
L'idee de base de l'invention est de faire se solidifier dans une botte un milieu contenant des microbes de manière que l'épaisseur de couche du milieu solidifie varie d'une façon déterminée. On peut faire se solidifier le milieu dans une holte unique en faisant en sorte que l'épaisseur de couche soit déterminée au moyen de la géométrie de la holte. Quand l'épaisseur de couche du milieu varie d'une partie de la botte à une autre, la quantité des colonies varie d'une maniere correspondante.
On peut également appliquer l'idee de base en plaçant le melange de l'échantillon et du milieu dans des bottes de Pétri classiques en des quantities différentes, d'une manière déterminée de façon preci- se. Ceci donne une serie de plaques ayant des épaisseurs de couche differentes. Mais le procédé tel quel n'offre pas d'autre avantage de rationalisation que celui de n'avoir plus â effectuer des dilutions successives.
Suivant l'idee de base de l'invention, on distingue des colonies développées après incubation en des densités différentes au stade du dénombrement, la densité etant la plus basse dans les couches de gélose les plus minces, et la plus grande dans les couches les plus epaisses et variant avec la géromé- trie du milieu dans les zones ayant une épaisseur de couches intermédiaires. Quand l'échantillon et le milieu (gélose) sont mélangés soigneusement avant le dépôt en forme de plaque, leurs quantités étant connues et la geometrie du milieu et de la holte étant régléee mathématiquement, il est facile de
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determiner la concentration de microbes de l'echan- tillon.
On peut utiliser, pour la determination, toute information correspondant ä des normes micro- biologiques attestées : on ne prend en considération que des colonies qui se distinguent nettement dans les zones de la plaque qui ont une épaisseur de couche differente. Le gradient d'épaisseur de couche détermine le gradient de densité des colonies et ceci est pris en compte pour le calcul mathematique du dénombrement des colonies. Au stade du depot en forme de plaque il est important que les boites soient placées sur une surface bien horizontale.
Les avantages du procédé de dépôt en forme de plaque suivant l'invention sont :
1. Aucune dilution successive n'est necessaire, parce que la densité des colonies est suffisamment faible pour pouvoir etre dénombrée au moins dans certaines parties de la plaque, en raison de l'epaisseur de couche variable du milieu de culture.
En comparaison des procédés antérieurs, on gagne de 70 a 90 % de temps de travail, parce qu'on n'a pas besoin d'effectuer des dilutions successives.
2. L'economie sur le milieu de culture est proportionnelle aux dilutions successives dont on a besoin dans les procédés antérieurs (ainsi que, en consequence, au nombre de boltes en parallele dont on a besoin).
3. Si l'on utilise des boites ä jeter, les économies de matière sont proportionnelles au nombre de dilutions successives necessaires dans les procédés antérieurs.
4. L'espace d'incubation dont on a besoin est réduit d'une manière considérable, parce que l'on n'a pas besoin de boites paralleles qui sont necessaires dans le cas de dilutions successives. Il en
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va de même directement pour les salles de travail et les equipements dont on a besoin.
5. Il n'est pas nécessaire de dénombrer les colonies sur toute la bolte ; on obtient un matériau 3 colonies suffisant pour la détermination ä partir des zones et des secteurs de denombrement determines . par la geometrie du fond de la boite. L'opération de denombrement est également simplifide et est accole- rée par l'elimination de la dilution et de ses conséquences.
6. Tout le procédé, y compris le denombrement des colonies, peut etre mécanisé et rendu automatique pour l'essentiel en utilisant et en modifiant des techniques antérieures.
Les concentrations de microbes obtenues au moyen du procédé suivant l'invention sont extrêment bien corrélées aux résultats obtenus au moyen de pro- cédés antérieurs. Le procédé peut remplacer tous les procédés antérieurs sur plaque avec dilution.
L'invention vise également une holte qui convient pour la détermination de concentrations de microbes au moyen d'un procède de dépôt sous forme de plaque, qui consiste ä déposer un échantillon et un milieu sous forme de plaque, ä laisser le milieu se solidifier et ä faire incuber la plaque solidifiée, puis ä dénombrer les colonies de la plaque. La bolte est caractérisée en ce que sa forme est telle, qu'apres le dépôt de l'échantillon et du milieu sous forme de plaque, il se forme dans la bolte une couche solidifiée ayant une épaisseur variant de maniere
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réglée.
L'idée de base de l'invention, crest dire que l'épaisseur du milieu solidifié dans la holte varie d'une maniere réglable et connue, peut être réalisée en utilisant des boltes d'un type nouveau :
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la bol te a une forme teile qu'après que le melange d'un échantillon et d'un milieu a été mis sous forme de plaque sur une surface horizontale, il se forme dans la holte une couche solidifiée dont l'épaisseur varie d'une maniere réglée. Ce type nouveau de bolte peut etre par exemple rond, comme une holte de Pétri classique, ou rectangulaire par exemple.
L'épaisseur de couche du milieu est ajustee ä une valeur souhaitee, en donnant ä la surface du fond d'une boite ronde une forme sphérique ou sphérique répondant ä une loi mathématique, cette forme pouvant etre montante ou descendante. On peut faire également monter ou descendre le fond d'une boîte ronde en munissant la botte de surfaces horizontales planes concentriques de forme annulaire avec une surface plane circulaire au milieu. Le fond d'une boite rectangulaire peut s'élever d'une maniere lineaire le long d'un arc de cercle, ou suivant une autre courbe mathema- tique. 11 est également possible de munir le fond d'une botte rectangulaire de surfaces planes rectangulaires pour le faire s'élever. Une holte de forme préférée est en rectangle.
La geometrie de la boite peut aussi etre donnée au moyen de cloisons de hauteurs différentes placées sur son fond. L'épaisseur de couche minimale du milieu peut être, par exemple, de 1 mm et l'épaisseur maximale de 10 mm dans les boltes suivant l'invention.
Tous les avantages procures par le procédé suivant l'invention peuvent être obtenus au moyen de ce type de bolte. On n'a pas besoin d'effeetuer de dilutions successives et les economies de matériaux, de milieu. et d'espace d'incubation sont considérables en comparaison des procédées antérieurs. Quand on utilise une bolte ayant la forme d'un rectangle, on a automatiquement besoin de moins de milieu, au
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plus de 50 % environ du milieu que nécessite une holte de Petri, et l'espace d'incubation dont on a besoin, calculé en surface, est inférieur de plus de 20 % ä celui de boites rondes.
C'est pourquoi il est très avantageux, suivant l'invention, d'utiliser une boîte ayant la forme d'un rectangle. En outre, il vaut mieux mélanger correctement l'échantillon (inocule=) et le milieu utilisd avant le dépôt sous forme de plaque.
. Au dessin annexe, donné uniquement ä titre d'exemple : les figures IA, 2A, 3, 4A, 5, 6 et 7 sont des vues en coupe verticale de divers modes de réalisation de la botte suivant l'invention et des milieux respectifs, et les figures 1B, 2B et 4B sont des vues en plan des bottes respectives.
Les figures 1A et 1B représentent une boîte 1 qui est ronde, telle que vue par le haut, et dont un fond la tour ne sa convexité vers le haut. Le milieu est désigné par le numéro de référence 2. On voit, aux figures, que quand l'épaisseur de couche du milieu augmente vers la peripherie extérieure de la bolte, d'une manière connue déterminée par la géométrie du fond de la bolte, la densité des colonies augmente d'une manière correspondante.
Les figures 2A et 2B représentent une bolte 11 qui differe de la precedente par le fait que son fond lla tourne sa convexite vers le bas, et en consequence l'épaisseur de couche du milieu 2 et, d'une maniere correspondante, la densite des colonies, est la plus eleväe au milieu de la boite en diminuant vers les bords de la bolte.
La figure 3 represente une holte 21 dont un fond 21a est forme de surfaces planes horizontales qui sont disposées concentriquement, de sorte que la
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forme du fond change par paliers. La bolte est ainsi munie de zones circulaires d'épassieur de couche correspondant ä la géométrie du fond.
Les figures 4A et 4B representent une holte 31 qui a la forme d'un rectangle, vue par le haut, et dont la forme du fond 31a varie d'une manière lineaire. L'épaisseur de couche augmente d'un petit cöte ä l'autre de la bolte et la quantité des colonies augmente d'une manière correspondante.
La figure 5 représente une botte 41 dont le
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fond 4la s'glove suivant un arc, le gradient d'épaisseur de couche et le gradient de densite des colonies variant d'une manière correspondante.
La figure 6 représente une boite 51 dont le fond 5la est forme de surfaces planes rectangulaires, de sorte qu'il s'relève par paliers. Des zones d'epaisseur de couche correspondant ä la geometrie du fond de la boîte sont ainsi formees dans la boite.
La figure 7 represente une bolte 61 dont le fond est muni de cloisons 61a. Le mélange d'échantillons et de gélose est introduit dans un compartiment 1, une partie du mélange s'en (coulant dans un compartiment 2, etc., de manibre ä former des zones d'épaisseur de couche distinctes.
L'invention est illustrée, d'une manière plus
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détaillée, par les exemples suivants.
Exemple 1
On inocule aseptiquement (une anse ou une micropipette), l pl d'un echantillon de lait ä 12 ml de gelose normalisee de dénombrement en plaque, sterile et fondue (telle que FIL-IDF 100 : 1981) contenue dans un tube ä essai sterile et on refroidit ä une temperature de 45 C. Apres l'inoculation, on agite le melange de l'échantillon et de la gelose correctement, par exemple dans un mélangeur de tube ä essai.
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Après avoir effectué le mélange, on met le melange d'échantillon et de gelose sous la forme d'une plaque dans une bolte rectangulaire ä fond montant formE de surfaces planes horizontales et rec-
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tangulaires. La botte comprend cinq surfaces planes 2 dont chacune a une dimension de 4 cm2. Les surfaces planes s'elevent par paliers de 2 mm de hauteur. Une quantité de liquide de 12 ml, qui est le volume de gélose de l'exemple, remplit la boîte décrite de façon à y former cinq secteurs de surface égale, mais ayant des epaisseurs différentes de couche de gélose.
Les épaisseurs de couche sont de 2 mm dans le Secteur I, de 4 mm dans le Secteur II, de 6 mm dans le Secteur III, de 8 mm dans le Secteur IV et de 10 mm dans le Secteur V ; les quantités de gelose (et les quantités d'échantillons) étant d'une maniere correspondante : I 0, 80 ml (0, 066 ul), II 1, 60 ml (0, 133 pl), III 2, 40 ml (0, 199 nl), IV 3, 20 ml (0, 266 ul) et V 4, 00 ml (0, 333 ul). La surface totale de gelose des secteurs, apres le dépôt sous forme de
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2 plaque, est de 20 cm2. Les quantities de gélose et d'échantillon dans les secteurs sont également indi- quées au tableau 1.
On ferme la bolte a l'aide d'un couvercle et on la soumet ä une incubation en position horizontale pendant 72 ¯ 2 heures ä une temperature de +30 ¯ lOC.
On calcule les résultats séparément pour chaque secteur en divisant le nombre des colonies denom- brables dans chaque secteur (en pratique, inférieur ä 40 colonies par secteur) par la quantite 'chan- tillon spécifique ä chaque secteur ; dans le present exemple, la quantité d'echantillon est de 0, 066 til ou de 0, 000066 ml dans le Secteur I, et de zul ou de 0, 000333 ml dans le Secteur V. En conséquence, si le nombre des colonies dans le Secteur 1 est de
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3, il y a 3 colonies par 0, 000066 ml, soit environ 45. 000 colonies par ml ; et si le nombre des colonies dans le Secteur V est de 17, il y a 17 colonies par 0, 000333 ml, soit environ 50. 000 colonies par ml.
Le resultat donne directement la quantité de microbes de l'echantillon par ml. Les nombres de colonies dans les secteurs et les résultats calcules sur cette base sont consignés au tableau 2.
On peut utiliser l'information obtenue de tous les secteurs dénombrables dans le resultat, en calculant la valeur moyenne des résultats obtenus, ä partir de chaque secteur.
Tableau 1
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<tb>
<tb> Secteur <SEP> Gélose <SEP> Echantillon <SEP> %
<tb> (A <SEP> = <SEP> 4 <SEP> crin2) <SEP> (ml) <SEP> (ml) <SEP> d'6chantillon
<tb> Secteur <SEP> Gélose <SEP> Echantillon <SEP> %
<tb> (A <SEP> = <SEP> 4 <SEP> cm2) <SEP> (ml) <SEP> (ml) <SEP> d'échant
<tb> V <SEP> 4,00 <SEP> 0,000333 <SEP> 33
<tb> IV <SEP> 3,20 <SEP> 0,000266 <SEP> 28
<tb> 111 <SEP> 2,40 <SEP> 0, <SEP> 000199 <SEP> 20
<tb> II <SEP> 1,60 <SEP> 0, <SEP> 000133 <SEP> 13
<tb> I <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 0,
<SEP> 000066 <SEP> 6
<tb>
Tableau 2
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<tb>
<tb> Quantity <SEP> de <SEP> microbes
<tb> Modification <SEP> des <SEP> CPS <SEP> de <SEP> l'échantillon
<tb> x <SEP> 1000 <SEP> microbes <SEP> X <SEP> 103/ml
<tb> 1 <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V
<tb> 10 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> 50 <SEP> 3 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 17 <SEP> 45 <SEP> 53 <SEP> 50 <SEP> 49 <SEP> 51
<tb> 100 <SEP> 7 <SEP> 13 <SEP> 20 <SEP> 27 <SEP> 33 <SEP> 106 <SEP> 98 <SEP> 100 <SEP> 101 <SEP> 99
<tb> 200 <SEP> 13 <SEP> 27 <SEP> 40 <SEP> 53 <SEP> 67 <SEP> 197 <SEP> 203 <SEP> 201 <SEP> 199
<tb>
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Exemple 2
On inocule aseptiquement rechantillon ä de la gélose en un rapport de dilution de 10-4 (lo ul de
l'echantillon original pour 100 ml de gélose).
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Après l'inoculation, on mélange efficacement le me- lange de gélose et d'échantillon et on le place dans des boites de Pétri classiques en des quantites de 2,5, 10,20, 40 et 60 ml, de sorte que les quanti-
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tes de l'echantillon d'origine soient de 0, 0002 ml, 0, 0005 ml, 0, 001 ml, 0, 002 ml, 0, 004 ml et 0, 006 ml respectivement. On fait incuber les bo ! tes et on dénombre les colonies. On transforme les nombres de colonies comptées dans les boltes en la densité de microbes de l'échantillon d'origine, par la formule suivante : densités de colonies Densité de microbes = dénombrées de l'échantillon - quantité de l'échantillon d'origine
Les résultats sont consignés au tableau 3.
Tableau 3
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<tb>
<tb> Colonies <SEP> dans <SEP> les <SEP> boltes
<tb> (quantités <SEP> de <SEP> melange
<tb> CPSxlOOO <SEP> d'échantillon <SEP> et <SEP> de <SEP> gelose)
<tb> 2 <SEP> rol <SEP> 5 <SEP> rol <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> 20 <SEP> ml <SEP> 40 <SEP> ml <SEP> 60 <SEP> ml
<tb> 5 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 30
<tb> 20 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 120
<tb> 50 <SEP> 10 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 200 <SEP> 300
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 200 <SEP> (400) <SEP> (600)
<tb> 200 <SEP> (40) <SEP> (100) <SEP> 200 <SEP> (400)
<tb> 300 <SEP> (60) <SEP> (150) <SEP> 300
<tb> 500 <SEP> (100) <SEP> (250) <SEP> (500)
<tb>
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Les parentheses au tableau signifient qu'il n'est pas possible de compter ces densités de colonies dans les boites.
Quand on utilise des boltes de Pétri ayant un diamètre de 90 mm, le fond de la holte est complètement recouvert de gelose seulement dans des boites contenant 10 ml de gelose ou davantage.
Le procédé de dénombrement normalisé de plaque est decrit dans les documents bibliographiques suivants :
1. FIL-IDF 100 : 1981 Liquid Milk Enumeration of Microorganisms Colony Count Technique at 30oc.
2. ISO/DP 6610 ibid.
3. APHA American Public Health Association Standard Methods for the Examination of Dairy Products 14ième édition 1978, p. 77 ä 93.
Plato Loop Method :
1. APHA 14ineed. p. 315 ä 317.
2. Thompscn, Donnelly & Black 1960 A Plate Loop Method for Determining Viable Counts of Raw Milk.
3. J. Milk Food Technol. 26 : 156 ä 171.