SE467412B - Foerfarande foer bestaemning av mikrobkoncentrationer med en smaeltagarmetod samt daeri anvaenda skaalar - Google Patents

Description

4-67 4-12 UI 10 'J UI .20 30 la) UI IQ Näringsunderlaget kan till sitt näringsämnesinne- håll vara möjligast màngsidigt, så att det finns växtför- utsättningar för så många mikrobtyper i provet som möj- ligt (sk. total kolonimängd). Substratet kan innehålla ett begränsat antal eller begränsade halter av närings- ämnen, eller det kan innehålla kända växtinhiberande före- ningar. Härvid talar man om selektiva substrat, och mål- sättningen är att få fram vissa mikrobgrupper.

Räknandet kan utföras efter ögonmått (genom att använda kända hjälpredskap) eller medelst användning av olika elektroniska räkneanordningar (automatiska koloni- räknare).

Räknandet begränsas av en hög kolonitäthet i plat- tan. Vanligen godkänns endast sådana plattor för räkning, vilkas koloniantal inte överstiger en viss gräns; t.ex. i plattor med en diameter på 9 cm, är den övre gränsen 300 stycken kolonier. För att erhålla information även ur prover, vilkas mikrobkoncentration är hög, måste man an- vända utspädningstekniker. I praktiken är man vanligtvis alltid tvungen att använda utspädningar vid smältagarar- bete. Beredningen av utspädningsserier tar 70 -90 % (be- roende av det uppskattade utspädningsbehovet) av hela smältagarskedets arbetstid i anspråk. På motsvarande sätt står materialbehovet i proportion till antalet utspäd- ningar.

Nackdelen med kända smältagarmetoder är således behovet att göra stora utspädningsserier och odla flera utspädningar. Härvid krävs naturligtvis ett stort antal skålar och även behovet av inkuberingsutrymme är stort.

Förfarandena är alltså komplicerade och tidsdryga.

Föreliggande uppfinning avser att åstadkomma ett örfarande, som eliminerar ovannämnda nackdelar och möj- i |-' H1 ggör bestämning av mikrobkoncentrationer på ett enkelt -och tillförlitligt sätt. Detta uppnås medelst förfaran- det enligt uppfinningen, vilket är kännetecknat därav, _«,/ 10 15 20 25 30 467 412 att näringsunderlag och prov blandas så, ning bildas, att en homogen bland- i vilken mikrobkoncentrationen är konstant, och blandningen bringas att stelna så, att näringsunderlagets skikt- tjocklek varierar på ett kontrollerat sätt, varpå efter inkube- ringen kolonitätheten i en eller flera lämpliga sektorer räknas Uppfinningens grundidê är, att ett näringsunder- lag, som innehåller mikrober, bringas att stelna i en skàl så, att det stelnade näringsunderlagets skikttjock- lek varierar pà ett kontrollerat sätt. Nä kan bringas att stelna i en skäl, regleras medelst skálens geometri. skikttjocklek varierar från ett omr ringsunderlaget varvid skikttjockleken Då näringsunderlagets áde av plattan till ett annat, varierar även antalet kolonier pâ motsvarande sätt.

Grundidën kan även tillämpas så, att prov-närings- underlagsblandningen doseras noggrant i olika mängder i sedvanliga petriskàlar. Härvid erhålles en serie plattor med olika skikttjocklek. Förfarandet som sådant erbjuder dock inte några andra rationaliseringsfördelar än att be- hovet av utspädningsserier elimineras.

I enlighet med uppfinningens grundidë kan de bil- dade koloniernaefterinkubationen i räkningsskedet iakt- tas glest utspridda i de tunnaste agarskikten och tätast» i de tjockaste skikten, och mellan dessa i tätheter, som är beroende av näringsunderlagets geometri. och näringsunderlaget (agar) Dá provet är omsorgsfullt blandade före gjutningen och deras mängder är kända samt närings- underlagets och skâlens geometri är matematiskt behärskad, är det lätt att räkna ut provets mikrobkoncentration. resultatet kan man använda all information, godkända mikrobiologiska standarder: För som motsvarar endast de kolonier, som tydligt urskiljes i plattans olika skikttjockleks- zoner, beaktas. Skik tjockleksgradienten bestämmer kolo- niernas täthetsgradient och detta beaktas vid koloniräk- ningen. Vid plattgjutningen är det viktigt, att skàlarna 4-67 10 15 20 30 412 verkligen befinner sig på ett vågrätt underlag.

Fördelarna med smältagarmetoden enligt uppfinningen: h 1. Utspädningsserier är onödiga, eftersom närings- underlagets varierande skikttjocklek minskar kolonität- heten så, att den kan räknas åtminstone i en del av skålen.

Inbesparingen av arbetstid är 70 - 90 % jämfört med nuva- rande metoder, dà utspädningsserier inte är nödvändiga. 2. Inbesparingen av näringsunderlag är lika mång- faldig som behovet av utspädningsserier (och det därav be- roende behovet av parallella skålar) i nuvarande metoder. 3. Vid användning av engångsskålar är inbesparingen av material lika mångfaldig, som det av utspädningsserier orsakade behovet i nuvarande metoder. 4. Inbesparingen av inkuberingsutrymme mångfaldigas, då parallella skålar orsakade av utspädningsserier inte är nödvändiga. Detta gäller även direkt proportionellt inbe- sparingen av arbetsutrymmen och materialfunktioner. 5. Kolonierna behöver inte räknas i hela skålen; det kolonimaterial, som används för resultatet, erhålles från räkningszoner eller -sektorer, som bestäms av skålens bottengeometri. Elimineringen av utspädningsbehovet och dess följder underlättar även räkningsarbetet samt gör det snabbare. 6. Hela förfarandet, koloniräknandet medräknat, kan till stor del mekaniseras och automatiseras genom utnytt- jande och modifiering av känd teknik.

De mikrobkoncentrationer som erhålls med förfaran- det enligt uppfinningen korrelerar mycket väl med resul- tat, som erhållits medelst kända förfaranden. Förfarandet kan ersätta alla kända smältagarmetoder. * Uppfinningen avser även en skål, vilken är använd- ((1 bar vid bestämning av mikrobkoncentrationer med en smält- agarmetod, varvid prov och näringsunderlag gjuts i en skål, näringsunderlaget får stelna och den stelnade plattan in- kuberas, varefter kolonierna i skålen räknas. Skälen är 10 15 20 k) UI 30 (n) UI 467 412 kännetecknad därav, att den har utformats så, att då prov och näringsunderlag gjutits i skälen häri bildas ett stelnat skikt, vars tjocklek varierar på ett kontrol- lerat sätt.

Uppfinningens grundidê, att det stelnande närings- underlagets skikttjocklek i skålen varierar på ett känt och kontrollerat sätt, kan åstadkommas medelst användning av en ny typ av skålar: skålen är utformad så, att då blandningen av prov och näringsunderlag gjutits i skålen, vilket utförs på ett vågrätt underlag, bildas i skälen ett stelnat skikt, vars tjocklek varierar på ett kontrollerat sätt. Den nya skålen kan vara t.ex. rund, såsom en sed- vanlig petriskàl, eller t.ex. rektangulär. Näringsunder- lagets skikttjocklek regleras till önskat värde genom att den runda skàlens botten utformas som en sfärisk yta el- ler en matematiskt behärskad asfärisk yta, varvid dessa är antingen stigande eller sjunkande. Den runda skàlens botten kan även vara stigande eller sjunkande så, att skålen uppvisar koncentriskt ringformade vågräta plan med ett cirkelformigt plan i mitten. I en rektangulär skål kan bottnen stiga lineärt, cirkelbågformigt eller i öv- rigt matematiskt behärskat. Den rektangulära skàlens botten kan även utformas stigande i rektangulära plan.

Den rektangulära skàlens fördelaktigaste form är en rek- tangel. Skålens geometri kan även regleras medelst mellan- lägg av olika höjd, vilka anordnats i skàlens botten.

Näringsunderlagets skikttjocklek kan som lägst vara t.ex. 1 mm och som tjockast 10 mm i skålar enligt uppfinningen.

Med hjälp av dessa skålar uppnås alla fördelar, som förfarandet enligt uppfinningen erbjuder. Utspädnings- serier behövs inte, och inbesparingen av material, närings- underlag och inkuberingsutrymme är mångfaldig jämfört med nuvarande metoder. Ifall en rektangulär skål används, är behovet av näringsunderlag i vilket fall som helst mindre, som bäst endast ca 50 % av behovet av näringsunderlag i 467 10 }_| UI 20 412 en petriskål, och behovet av inkuberingsutrymme är över 20 % av ytarealen. mindre än vid användning av runda skålar, beräknat I enlighet med uppfinningen är det således fördel- å aktigast att använda en rektangulär skål. Härvid är det åter fördelaktigast, att provet (ymPen) och det använda näringsunderlaget blandas effektivt före gjutningen i skålen. figurerna 1A, 2A, 3, 4A, 5, 6 och 7 presenterar i vertikalsnitt olika utföringsformer av skàlarna enligt uppfinningen inklusive deras näringsunderlag, och figu- rerna lB, 2B och 4B presenterar motsvarande skålar sedda ovanifrån.

I figurerna 1A och lB visas en skål l, vilken sedd ovanifrån är rund och vars botten la är uppåt konvex. Nä- ringsunderlaget är betecknat med referensnumret 2. Ur fi- gurerna framgår, att då näringsunderlagets skikttjocklek växer i riktning mot skålens periferi på ett känt sätt definierat av skålbottnens geometri, växer kolonitätheten på motsvarande sätt.

I figurerna 2A och 2B visas en skål ll, vilken av- viker från den föregående i det, att dess botten lla är nedåt konvex, varvid näringsunderlagets 2 skikttjocklek och på motsvarande sätt koloniernas täthet är störst i mitten av skålen och minskar i riktning mot skålens kanter.

I figur 3 visas en skål 21, vars botten Zla för- ändras stegvis i koncentriska vågräta plan. Cirkelformiga skikttjocklekszoner, som motsvarar bottnens geometri, bildas i skålen.

I figurerna 4A och 4B visas en skål 31, som sedd ovanifrån är rektangulär och vars botten äla är lineärt varierande. Då skikttjockleken växer från en kortsida av skålen till en annan, växer antalet kolonier på motsva- rande sätt.

I figur 5 visas en skål 41, vars botten 4la är 10 20 30 35 467 412 \l bágformigt stigande, varvid en motsvarande.skikttjock- leksgradient och täthetsgradient för kolonierna erhålles.

I figur 6 visas en skål 51, vars botten 5la är stegvist stigandei.rektangulära plan, varvid skikttjock- lekszoner, som motsvarar skàlbottnens geometri, bildas i skålen.

I figur 7 visas en skål 6l, i vars botten mellan- lägg 6la är anordnade. Prov-agarblandningen tillsätts i fack l, varifrån en del rinner över i fack 2 etc, varvid olika skikttjocklekszoner bildas i skålen.

Uppfinningen beskrivs närmare med hjälp av följande exempel.

Exempel l 1 fl av ett mjölkprov ympas aseptiskt (ögla eller mikropipett) i 12 ml smulten, steril och till 45oC nedkyld Standard Plate Count Agar FIL-IDP lO0:l98l) sterilt provrör. Efter ympningen omskakas prov-agarbland- (t.ex. i ett ningen kraftigt, t.ex. i en provrörsmixer.

Efter omblandningen gjuts prov-agarblandningen i en rektangulär skål, vars botten är stigande i vågräta, rektangulära plan. Skälen omfattar fem plan, vilka alla har en ytareal på 4 cm2. Planen bildar stigande avsatser med 2 mmzs höjdskillnader. Vätskemängden pà l2 ml, vilket är exemplets agarvolym, fyller den beskrivna skålen så, att i skålen bildas 5 till sin ytareal lika stora, men till sin agarskikttjocklek olika sektorer. Skikttjock- leken är 2 mm i sektor I, 4 mm i sektor II, 6 mm i sektor III, 8 mm i sektor IV och 10 mm i sektor V; agarmängderna (och provmängderna) är på motsvarande sätt: I 0,80 ml (C,066 Pl), II 1,60 ml (0,l33 Fl), III 2,40 ml (0,l99 Fl), IV 3,20 ml (0,266 Pl) och V 4,00 ml (O,333 Pl). âektorer- nas totala agarytareal efter gjutningen är 20 cm . Sek- torernas agar- och provmängder anges även i tabell 1.

Skälen inkuberas sluten med ett lock i vàgrät ställ- ning 72I 2 timmar i + BOI lOC. 467 412 10 |_a UI 20 30 Resultaten räknas per sektor genom att koloni- mängder, som kan räknas (i praktiken < 40 st/sektor) di- ; videras med provmängden i sektorn, vilken enligt exemplet i sektoren I är 0,066,pl, dvs. 0,000066 ml och i sektoren * V är 0,333 Fl, dvs. 0,000333 ml. Härvid betyder koloni- antalet 3 st i sektor I 3st/0,000066 ml-=45.000 st/ml och koloniantalet 17 st i sektor V 17 st/0,000333 mlffl 50.000 st. Resultatet anger direkt provets mikrobmängd st/ml. Antalet kolonier i sektorerna och resultaten, som beräknats på basen av dessa, presenteras i tabell 2.

Informationen från alla sektorer, som kan räknas, kan utnyttjas i resultatet genom att medeltalet för de olika sektorernas resultat uträknas.

Tabell 1 Sektor (A = 4 cmz) Agar Prov % av provet (ml) (ml) V 4,00 0,000333 33 IV 3,20 0,000266 28 III 2,40 0,000l99 20 II 1,60 0,000l33 13 I 0,80 0,000066 6 Tabell 2 SPC x 1 000 st SPC-modifikation Provets mikrobmängd st x 103/ml I II III IV V I II III IV V 10 1 1 2 3 3 - - - ll 9 so 3 7 io 13 17 45 53 so 49 51 * 100 7 13 20 27 33 106 98 100 101 99 200 13 27 40 53 67 197 203 201 l99 - | v 10 }_I UI 20 25 30 467 412 Exempel 2 Ett prov ympas aseptiskt i agar i ett utspädnings- förhållande av 1o'4 (10 Pl ursprungligt prov i 100 ml agar). Efter ympningen omblandas prov-agarblandningen effektivt och gjuts i mängder av 2, 5, 10, 20, 40 och 60 ml i sedvanliga petriskàlar, vilka härvid innehåller 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml re- spektive 0,006 ml ursprungligt prov. Plattorna inkuberas och kolonierna räknas..Plattornas kolonimängder omräknas i det ursprungliga provets mikrobtäthet medelst följande formel: räknad kolonitäthet provets mikrobtäthet = mängden ursprungligt prov Resultaten presenteras i tabell 3.

Tabell 3 Antal kolonier i skálarna (mängden prov-agar) SPCxlO00 2 ml 5 ml 10 ml 20 ml 40 ml 60 ml 5 l 3 5 10 20 30 20 « 4 10 20 40 80 120 50 l0 25 50 100 200 300 l00 20 50 100 200 (400) (600) 200 (40) (100) 200 (400) - - 300 (60) (150) 300 - - - 500 (100) (250) (500) - ~ - Parenteserna i tabellen betyder, att ifrågavarande kolonitätheter inte kan räknas i plattorna. Vid använd- ning av petriskàlar, vilkas diameter är 90 mm, täcks he- la skålbottnen av agar endast i sådana skålar, som inne- håller 10 ml eller mera agar. 4-67 412 10 10 Referenser: Standard Plate Count Method: 1. FIL-IDF l00:l981 Liquid Milk Enumeration of Micro-organisms Colony Count Technique at 30oC. 2. ISO/DP 6610 ibid. 3. APHA American Public Health Association Stan- dard Methods for the Examination of Dairy Products, 14th edition 1978 s. 77-93.

Plate Loop Method 1. APHA 14th edition s. 315 - 317 2. Thompson, Donnelly & Black 1960 A Plate Loop Method for Determing Viable Counts of Raw Milk J. Milk Food Technol. 26: 156 - 171 11 1/

Claims (13)

10 15 20 25 30 35 ff 467 412 Patentkrav

1. Förfarande för bestämning av mikrobkoncentra- tioner med en smältagarmetod, varvid prov och näringsun- derlag gjuts i en skål, näringsunderlaget får stelna och den stelnade plattan inkuberas, varefter kolonierna i skålen räknas, k ä n n e t e c k n a t därav, att nä- ringsunderlag och prov blandas så, att en homogen bland- ning bildas, i vilken mikrobkoncentrationen är konstant, och blandningen bringas att stelna så, att näringsunder- lagets skikttjocklek varierar på ett kontrollerat sätt, varpå efter inkubering kolonitätheten i en eller flera lämpliga sektorer räknas.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t därav, att näringsunderlaget bringas att stelna i. en skål och skikttjockleken regleras medelst skålens geometri.

3. Förfarande enligt patentkravet 1, t e c k n a t därav, att näringsunderlaget bringas att stelna i flera skålar och skikttjockleken regleras me- delst skålens storlek och/eller näringsunderlagets volym. k ä n n e -

4. Skål, vilken är användbar vid bestämning av mikrobkoncentrationer med en smältagarmetod, varvid en homogen blandning av prov och näringsunderlag gjuts i en skål, blandningen får stelna och den stelnade plattan in- kuberas, varefter kolonierna i skålen räknas, k ä n n e - t e c k n a d därav, att skålen har en matematiskt känd och konstant utformning, varvid då den homogena bland- ningen gjutits i skålen häri bildas ett stelnat skikt, vars tjocklek varierar på ett kontrollerat sätt.

5. Skål enligt patentkrav 4, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den i tvärsnitt är cirkelformig.

6. Skål enligt patentkravet 4, t e c k n a d därav, att den i tvärsnitt är rektangulär. k ä n n e -

7. Skål enligt patentkravet 4, k ä n n e - t e c k n a d därav, att dess botten är konkav.

8. Skål enligt patentkravet 4, k ä n n e - 467 412 V* t e c k n a d därav, att dess botten är konvex.

9. Skål enligt patentkravet 4, k ä n n e - t e c k n a d därav, att dess botten är lineärt stigan- de. 5

10. Skål enligt patentkravet 4, k ä n n e - t e c k n a d därav, att dess botten är cirkelbågformigt stigande.

11. Skål enligt patentkravet 5, k ä n n e - t e c k n a d därav, att dess botten är stigande eller sjunkande så, att skålen innehåller koncentriska ringfor- miga plan och i mitten ett cirkelformigt plan.

12. Skål enligt patentkravet 6, k ä n n e - t e c k n a d därav, rektangulära plan. 10 att dess botten omfattar stigande 15

13. Skål enligt patentkravet 4, k ä n n e - t e c k n a d därav, att ett mellanlägg eller flera mel- lanlägg av olika höjd har anordnats i skålens bottendel. J] . *V7