NO171282B - Fremgangsmaate for bestemmelse av mikrobekonsentrasjoner med en smelteagarmetode, samt deri anvendte skaaler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for bestemmelse av mikrobekonsentrasjoner med en smelteagarmetode, hvorved prøve og næringsunderlag støpes i en skål, næringsunderlaget får stivne, og den stivnede plate inkuberes, hvoretter koloniene i skålen telles. Oppfinnelsen angår enn videre en skål som er anvendbar ved bestemmelse av mikrobe-konsentras joner med en smelteagarmetode.

Smelteagarmetoder anvendes generelt innen melkehushold-ningsmikrobiologi og øvrig næringsmiddelmikrobiologi, medisinsk mikrobiologi samt generell mikrobiologi for bestemmelse av mikrobeinnholdet i forskjellige prøver. Mange såkalte inter-nasjonale sammenligningsmetoder er slike.

I smelteagarmetoder podes et visst volum av en prøve som skal undersøkes, eller en utspeeing derav, i en petriskål.

Oppå prøven helles f.eks. 10 - 15 ml sterilt, stivnende (agar) næringsunderlag hvis temperatur er 45 - 1°C. Prøven blandes umiddelbart med næringsunderlaget, og stivningen tillates å skje ved romtemperatur på en vannrett overflate. Prøven og næringsunderlaget kan også blandes før de støpes i skålen.

Det stivnede næringsunderlag danner et jevnt tykt skikt i skålen. De stivnede plater vendes opp og ned og flyttes til dyrkningsskap (inkubering). Inkuberingstemperaturen (f.eks. 10°C, 30°C, 37°C, 44°C, 55°C) og inkuberingstiden (f.eks. 2 døgn, 3 døgn, 6 døgn og 10 døgn) velges ut fra de anvendte metoder (først og fremst hvilke mikrobegrupper man ønsker å bestemme). Under inkuberingen ligger skålene vannrett.

Etter inkuberingen telles koloniene i petriskålen. Da man på forhånd kjenner til podemengden av prøven og de anvendte utspeeingsforhold, kan man på basis av antall tellede kolonier regne ut mikrobenes antall/volum eller vektenhet prøve, vanligvis st/ml eller st/g.

Næringsunderlaget kan med hensyn til næringsmiddelinn-holdet være mest mulig mangesidig slik at det finnes vekst-forutsetninger for så mange mikrobetyper i prøven som mulig (såkalt total kolonimengde). Substratet kan inneholde et be-grenset antall eller begrensede innhold av næringsstoffer, eller det kan inneholde kjente vekstinhiberende forbindelser.

Herved taler man om selektive substrater, og målsetningen er

å få frem visse mikrobegrupper.

Tellingen kan utføres etter øyemål (ved å anvende kjente hjelperedskaper) eller ved anvendelse av forskjellige elek-troniske telleanordninger (automatiske kolonitellere).

Tellingen begrenses av høy kolonitetthet i platen. Vanligvis godkjennes bare slike plater for telling hvis koloni-antall ikke overskrider en viss grense, f.eks. er den øvre

grense i plater med en diameter på 9 cm 300 stykker kolonier. For å oppnå informasjon også fra prøver hvis mikrobekonsentrasjon er høy, må man anvende utspeeingsteknikker. I praksis er man vanligvis alltid tvunget til å anvende utspeeinger ved smelteagararbeide. Tilberedningen av utspeeingsserier tar 70-90% (avhengig av det vurderte utspeeingsbehov) av hele smelteagartrinnets nødvendige arbeidstid. På tilsvarende måte står materialbehovet i forhold til antall utspeeinger.

Ulempen med kjente smelteagarmetoder er således behovet for å utføre store utspeeingsserier og dyrke flere utspeeinger. Herved kreves selvsagt et stort antall skåler, og behovet

for inkuberingsplass er også stort. Fremgangsmåtene er altså kompliserte og tidkrevende.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for bestemmelse av mikrobekonsentrasjoner med en smelteagarmetode, hvorved prøve og næringsunderlag støpes i en skål, næringsunderlaget får stivne, og den stivnede plate inkuberes, hvoretter koloniene i skålen telles, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at næringsunderlag og prøve blandes slik at en homogen blanding dannes, i hvilken mikro-bekonsentras j onen er konstant, og at blandingen bringes til å stivne i en skål hvorved næringsunderlagets skikt-

tykkelse reguleres ved hjelp av skålens geometri.

Oppfinnelsens grunnidé er at et næringsunderlag som inneholder mikrober, bringes til å stivne i en skål slik at det stivnede næringsunderlags skikttykkelse varierer på en kontrollert måte. Næringsunderlaget kan bringes til å stivne i en skål hvorved skikttykkelsen reguleres ved hjelp av skålens geometri. Da næringsunderlagets skikttykkelse varierer fra ett område av platen til et andre, varierer også antallet kolonier på tilsvarende måte.

Grunnideen kan også tilpasses slik at prøve-nærings-underlagsblandingen doseres nøyaktig i forskjellige mengder i vanlige petriskåler. Herved erholdes en serie plater med forskjellig skikttykkelse. Fremgangsmåten som sådan frembyr imidlertid ikke noen andre rasjonaliseringsfordeler enn at behovet for utspeeingsserier elimineres.

Ifølge oppfinnelsens grunnidé kan de dannede kolonier etter inkubering i tellingstrinnet iakttas glissent utspredt i de tynneste agarskikt, og tettest i de tykkeste skikt, og mellom disse i tettheter som er avhengig av næringsunderlagets geometri. Da prøven og næringsunderlaget (agar) er omhyggelig blandet før støpingen, og deres mengder er kjente, samt at næringsunderlagets og skålens geometri er matematisk bestemt, er det lett å regne ut prøvens mikrobekonsentrasjon. For resultatet kan man anvende all informasjon som tilsvarer god-kjente mikrobiologiske standarder, og bare de kolonier som tydelig adskilles i platens forskjellige skikttykkelsessoner tas i betraktning. Skikttykkelsesgradienten bestemmer kolonienes tetthetsgradient, og dette tas i betraktning ved kolonitellingen. Ved platestøpningen er det viktig at skålene virkelig befinner seg på et vannrett underlag.

Fordelene med smelteagarmetoden ifølge oppfinnelsen er: 1. Utspeeingsserier er unødvendige ettersom næringsunderlagets varierende skikttykkelse minsker kolonitettheten slik at den kan telles i det minste i en del av skålen. Innsparingen av arbeidstid er 70-90% sammenlignet med nåværende metoder da utspeeingsserier ikke er nødvendige. 2. Innsparingen av næringsunderlag er like mangfoldig som behovet for utspeeingsserier (og det derav beroende behov for parallelle skåler) i nåværende metoder. 3. Ved anvendelse av engangsskåler er innsparingen av materiale like mangfoldig som det av utspeeingsserier forår-sakede behov i nåværende metoder. 4. Innsparingen av inkuberingsplass er stor da parallelle skåler forårsaket av utspeeingsserier ikke er nødvendige. Dette gjelder også direkte proporsjonalt innsparingen av arbeidsplass og materialfunksjoner. 5. Koloniene behøver ikke telles i hele skålen idet det kolonimateriale som anvendes for resultatet, erholdes fra tellesoner eller -sektorer som bestemmes av skålens bunngeo-metri. Eliminering av utspeeingsbehovet og følgene derav letter også teningsarbeidet og gjør dette raskere.

6. Hele fremgangsmåten, kolonitellingen medregnet, kan

i stor grad mekaniseres og automatiseres ved utnyttelse og modifisering av kjent teknikk.

De mikrobekonsentrasjoner som erholdes med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, korrelerer meget godt med de resultater som erholdes ved hjelp av kjente metoder. Fremgangsmåten kan erstatte alle kjente smelteagarmetoder.

Oppfinnelsen angår også en skål som er anvendbar ved bestemmelse av mikrobekonsentrasjoner med en smelteagarmetode, hvorved prøve og næringsunderlag støpes i en skål, næringsunderlaget får stivne, og den stivnede plate inkuberes, hvoretter koloniene i skålen telles, hvilken skål er kjennetegnet ved at skålen har en matematisk kjent og konstant utforming, slik at når prøve og næringsunderlag støpes i skålen, dannes et stivnet skikt hvis tykkelse varierer på en kontrollert måte.

Oppfinnelsens grunnidé, at det stivnende næringsunderlags skikttykkelse i skålen varierer på en kjent og kontrollert måte, kan tilveiebringes ved hjelp av anvendelse av en ny type av skåler, idet skålen er slik utformet at når blandingen av prøve og næringsunderlag støpes i skålen, hvilket utføres på et vannrett underlag, dannes det i skålen et stivnet skikt hvis tykkelse varierer på en kontrollert måte. Den nye skål kan være eksempelvis rund slik som en vanlig petriskål, eller f.eks. rektangulær. Næringsunderlagets skikttykkelse reguleres til den ønskede verdi ved at den runde skåls bunn utformes som en sfærisk overflate eller en matematisk behersket asfærisk overflate, hvorved disse enten er stigende eller synkende. Den runde skåls bunn kan også være stigende eller synkende slik at skålen utviser konsentrisk ringformede, vannrette plan med et sirkelformet plan i midten. I en rektangulær skål kan bunnen stige lineært, sirkelbueformet eller forøvrig matematisk behersket. Den rektangulære skåls bunn kan også utformes stigende i rektangulære plan. Den rektangulære skåls mest fordelaktige form er et rektangel. Skålens geometri kan også reguleres ved hjelp av mellomlegg av forskjellig høyde,

hvilke anordnes i skålens bunn. Næringsunderlagets skikttykkelse kan som tynnest være f.eks. 1 mm og som tykkest 10 mm i skålene ifølge oppfinnelsen.

Ved hjelp av disse skåler oppnås alle fordeler som fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen medfører. Utspeeingsserier behøves ikke, og innsparing av materiale, næringsunderlag og inkuberingsplass er mangfoldig sammenlignet med nåværende metoder. Hvis en rektangulær skål anvendes, er behovet for næringsunderlag i hvilket som helst tilfelle mindre, og som best bare ca. 50% av behovet for næringsunderlag i en petriskål, og behovet for inkuberingsplass er over 20% mindre enn ved anvendelse av runde skåler, beregnet på overflatearealet.

Ifølge oppfinnelsen er det således mest fordelaktig å anvende en rektangulær skål. Herved er det igjen mest fordelaktig at prøven (podestoffet) og det anvendte næringsunderlag blandes effektivt før støpning i skålen.

Figur IA, 2A, 3, 4A, 5, 6 og 7 viser i vertikalsnitt forskjellige utførelsesformer av skålene ifølge oppfinnelsen inklusive deres næringsunderlag, og figur IB, 2B og 4B illus-trerer tilsvarende skåler sett ovenfra.

I figur IA og IB vises en skål 1 som sett ovenfra er

rund og hvis bunn la er konveks oppover. Næringsunderlaget er betegnet med referansenummer 2. Fra figurene fremgår det at når næringsunderlagets skikttykkelse vokser i retning mot skålens periferi på en kjent måte definert av skålbunnens geometri, vokser kolonitettheten på tilsvarende måte.

I figur 2A og 2B er det vist en skål 11 som avviker fra den foregående i det at dens bunn lia er konveks nedover, hvorved næringsunderlagets 2 skikttykkelse, og på tilsvarende måte kolonienes tetthet, er størst i midten av skålen og minsker i retning mot skålens kanter.

I figur 3 er det vist en skål 21 hvis bunn 21a forandres trinnvis i konsentriske, vannrette plan. Sirkelformede skikttykkelsessoner, som tilsvarer bunnens geometri, dannes i skålen.

I figur 4A og 4B er det vist en skål 31 som sett ovenfra er rektangulær og hvis bunn 31a er lineært varierende. Da skikttykkelsen vokser fra en kortside av skålen til en annen, vokser antall kolonier på tilsvarende måte.

I figur 5 er det vist en skål 41 hvis bunn 41a er bue-formet stigende, hvorved en tilsvarende skikttykkelsesgradient og tetthetsgradient for koloniene erholdes.

I figur 6 er det vist en skål 51 hvis bunn 51a er trinnvis stigende i rektangulære plan, hvorved skikttykkelsessoner som tilsvarer skålbunnens geometri, dannes i skålen.

I figur 7 er det vist en skål 61 i hvis bunn mellomlegg 61a er anordnet. Prøve-agarblandingen tilsettes i rom 1, hvor-fra en del renner over i rom 2 etc, hvorved forskjellige skikttykkelsessoner dannes i skålen.

Oppfinnelsen beskrives nærmere ved hjelp av de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

1 ul av en melkeprøve ble podet aseptisk (løkke eller mikropipette) i 12 ml smeltet, sterilt og til 45°C nedkjølt Standard Plate Count Agar (f.eks. FIL-IDF 100:1981) i et sterilt prøverør. Etter podingen ble prøve-agarblandingen ristet kraftig, f.eks. i en prøverørsblander.

Etter blandingen ble prøve-agarblandingen støpt-i en rektangulær skål hvis bunn er stigende i vannrette, rektangulære plan. Skålen omfatter fem plan som alle har et.overflateareal pa 4 cm 2. Planene danner stigende avsatser med 2 mm høydeforskjell. Væskemengden på 12 ml, hvilket er eksemplets agarvolum, fyller den beskrevne skål slik at det i skålen dannes 5 med hensyn til overflateareal like store, men med hensyn til agarskikttykkelse forskjellige sektorer. Skikttykkelsen er 2 mm i sektor I, 4 mm i sektor II, 6 mm i sektor III, 8 mm i sektor IV og 10 mm i sektor V; og agarmengdene (og prøvemengdene) er på tilsvarende måte: I 0,80 ml (0,066 pl),

II 1,60 ml (0,133 pl), III 2,40 ml (0,199 ul), IV 3,20 ml (0,266 ul) og V 4,00 ml (0,333 ul). Sektorenes totale agar-overflateareal etter støpingen er 20 cm 2. Sektorenes agar- og prøvemengder er også angitt i tabell 1.

Skålen ble inkubert lukket med et lokk i vannrett still-ing i 7 2 - 2 timer ved + 30 - 1°C.

Resultatene beregnes pr. sektor ved at kolonimengder

som kan telles (i praksis < 40 st/sektor) divideres med prøve-mengden i sektoren, hvilket ifølge eksemplet i sektor I er 0,066 ul, dvs. 0,000066 ml, og i sektor V er 0,333 ul, dvs. 0,000333 ml. Herved betyr koloniantallet 3 st i sektor I 3 st/0,000066 ml~45.000 st/ml, og koloniantallet 17 st i sektor V 17 st/0,000333 ml~50.000 st. Resultatet angir direkte prøvens mikrobemengde st/ml. Antall kolonier i sek-torene og resultatene som er beregnet på basis av disse, er angitt i tabell 2.

Informasjonen fra alle sektorer som kan telles, kan ut-nyttes i resultatet ved at middeltallet for de forskjellige sektorers resultat utregnes.

Eksempel 2

En prøve ble podet aseptisk i agar i et utspeeingsforhold på 10 <4> (10 ul opprinnelig prøve i 100 ml agar). Etter pod-ningen ble prøve-agarblandingen effektivt blandet og støpt i mengder på 2, 5, 10, 20, 40 og 60 ml i vanlige petriskåler som derved inneholder 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml hhv. 0,006 ml opprinnelig prøve. Platene ble inkubert og koloniene tellet. Platenes kolonimengder ble om-regnet i den opprinnelige prøves mikrobetetthet ved hjelp av følgende formel:

Resultatene er angitt i tabell 3.

Parentesene i tabellen betyr at angjeldende koloni-tettheter ikke kan telles i platene. Ved anvendelse av petriskåler hvis diameter er 90 mm, dekkes hele skålbunnen av agar bare i slike skåler som inneholder 10 ml eller mer agar.

Referanser:

Standard Plate Count Method:

1. FIL-IDF 100:1981 Liquid Milk Enumeration of

Micro-organisms Colony Count Technique at 30°C.

2. ISO/DP 6610 ibid.

3. APHA American Public Health Association Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 14th edition 1978 s. 77-93.

Plate Loop Method

I. - AP HA 14th edition s. 315 - 317

2. Thompson, Donnelly & Black 1960 A Plate Loop

Method for Determing Viable Counts of Raw Milk

J. Milk Food Technol. 26: 156 - 171

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av mikrobekonsentrasjoner med en smelteagarmetode, hvorved prøve og næringsunderlag støpes i en skål, næringsunderlaget får stivne, og den stivnede plate inkuberes, hvoretter koloniene i skålen telles, karakterisert ved at næringsunderlag og prøve blandes slik at en homogen blanding dannes, i hvilken mikrobekonsentrasjonen er konstant, og at blandingen bringes til å stivne i en skål hvorved næringsunderlagets skikttykkelse reguleres ved hjelp av skålens geometri.

2. Skål som er anvendbar ved bestemmelse av mikrobe-konsentras j oner med en smelteagarmetode, hvorved prøve og næringsunderlag støpes i en skål, næringsunderlaget får stivne, og den stivnede plate inkuberes, hvoretter koloniene i skålen telles, karakterisert ved at skålen har en matematisk kjent og konstant utforming, slik at når prøve og næringsunderlag støpes i skålen, dannes et stivnet skikt hvis tykkelse varierer på en kontrollert måte.

3. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at den i tverrsnitt er sirkelformet.

4. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at den i tverrsnitt er rektangulær.

5. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at dens bunn er konkav.

6. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at dens bunn er konveks.

7. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at dens bunn er lineært stigende.

8. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at dens bunn er sirkelbueformet stigende.

9. Skål ifølge krav 3, karakterisert ved at dens bunn er stigende eller synkende slik at skålen inneholder konsentriske, ringformede plan og i midten et sirkelformet plan.

10. Skål ifølge krav 4, karakterisert ved at dens bunn omfatter stigende rektangulære plan.

11. Skål ifølge krav 2, karakterisert ved at et mellomlegg eller flere mellomlegg av ulik høyde er anordnet i skålens bunndel.