CN105586260B - 一种细胞分层共培养的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞分层共培养的装置及方法，属于细胞培养技术领域。本发明提供的细胞分层共培养装置包括培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。本发明提供的培养瓶不仅能够实现浮力不同的细胞的共培养，模拟动物细胞的内环境，而且还能够节省原料、有利于气体的内外交换、避免漏液，有效防止细胞污染等。

Description

一种细胞分层共培养的装置及方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞分层共培养的装置及方法。
背景技术
动物体内的脂肪组织是决定动物产品生产性能及其肉的品质的主要因素。按照脂肪在动物体内分布位置的不同，脂肪组织可以分为皮下脂肪、内脏脂肪和肌内脂肪，不同部位脂肪沉积主要来自于前体脂肪细胞的增殖和分化。随着对动物发育规律的不断研究和认识，人们发现动物体内的前体脂肪细胞可以分化为成熟脂肪细胞，而成熟脂肪细胞还可以去分化为前体脂肪细胞，甚至可以向肌肉细胞，成骨细胞进行转化。
将同一动物的脂肪细胞和其它细胞在同一培养液中共培养，可以更好的模拟动物体内环境，便于更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点，填补了单层细胞培养的整体动物实验的鸿沟。针对于此，现有技术中已公开利用两种细胞浮力的差异在培养瓶中进行共培养的方法，称为“天花板”法。但该培养方法存在明显的缺点，一是耗费较大，需要将整个培养瓶都充满细胞培养液，容易造成浪费；二是培养过程瓶口盖子必须拧紧，否则液体会漏出，不利于细胞培养过程中气体内外交换；三是操作过程中容易出现漏液，加大了细胞污染的危险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞分层共培养的装置及方法，发明提供的细胞分层共培养的装置不仅提供了一种将不同浮力细胞共同培养的方法，成本低、气体交换好、细胞污染风险小，还能够实现动物细胞内环境的模拟，使实验环境更接近于体内状态，从而提高细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点结果的精准性与可信度。
本发明提供了一种细胞分层共培养的装置，包括培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
优选的是，所述隔板与培养瓶除瓶口方向的三侧侧壁相接。
优选的是，所述隔板将培养瓶内空间隔为上部的气体交换空间和下部的细胞培养空间，所述细胞培养空间的体积与所述气体交换空间的体积之比为4:1～1:1，更优选为2:1。
优选的是，所述培养瓶侧壁设置有瓶口，所述瓶口与相接隔板的侧壁相对设置，与瓶口临近的隔板侧边缘低于所述瓶口的底边缘(3)且，垂直距离为0～1cm。
优选的是，所述隔板的水平长度为培养瓶水平长度的2/3～5/6，更优选为3/4，所述隔板的厚度为0.3～1cm，更优选为0.5cm。
本发明提供了细胞分层共培养的装置在培养两种不同浮力的细胞中的应用。
优选的是，所述细胞分层共培养装置设置有瓶盖(5)，所述瓶盖通过旋转来保证瓶内的通气，移动培养装置时，旋紧瓶盖，进行细胞培养时，旋转瓶盖使瓶内气体与瓶外气体能够流通。
本发明还提供了细胞分层共培养的装置进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
1)通过离心的方法分离待培养细胞，得到不同浮力的细胞；
2)在培养瓶中预先加入不含细胞的培养液，使液面不溢过隔板且垂直距离隔板0.5～2cm，进行孵育；
3)在培养装置中加入浮力小的细胞悬液和浮力大的细胞悬液，使培养装置中的液面接触但不溢过隔板，培养24～48h，两种悬液的加入顺序没有限制；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。
优选的是，所述孵育是在37～39℃、5～6％CO2，更优选为37℃，5％CO2培养箱中静置4～6h，更优选为5h。
优选的是，所述待培养细胞在加入到所述细胞分层共培养装置内之前，先分别进行2～5h的预培养。
本发明提供了一种细胞分层共培养的装置，包括培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。本发明在传统培养瓶的中间部位加入一层隔板，用隔板代替了“天花板”，有效的减少了利用“天花板”法共培养不同浮力细胞时所用培养液量，既达到了两种细胞在同一体系中共培养的效果又避免了不必要的浪费。同时，由于培养过程中瓶内培养液不会充盈瓶口，使得瓶内外气体交换良好，操作过程中也不会出现漏液等现象，有效的防止了细胞污染。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细胞分层共培养装置的结构示意图；
图2为图1所示装置的俯视图。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞分层共培养的装置，包括培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
本发明的细胞分层共培养装置的结构示意图具体参见图1和图2，其中，图1为本发明实施例提供的细胞分层共培养装置的结构示意图：(1)表示培养瓶，(2)为隔板，(3)为瓶口的底边缘，(4)为培养瓶瓶底，(5)为培养瓶瓶盖。
本发明的培养瓶与隔板一体化制成，所用材料没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的制备动物细胞培养瓶的材料即可。
本发明对培养瓶的体积没有特殊的限制，本领域技术人员根据需求进行设置。本发明所述的细胞培养瓶的体积是指培养瓶的总体积，包括上部的气体交换空间和下部的细胞培养空间。
在本发明中，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)，所述隔板与培养瓶除瓶口方向的三侧侧壁相接；所述隔板将培养瓶内空间隔为上部的气体交换空间和下部的细胞培养空间，减少了培养液的使用，且提升了瓶内外气体交换的效率，还解决了培养过程中漏液以及细胞污染的问题。在本发明中，所述细胞培养空间的体积与所述气体交换空间的体积之比为4:1～1:1，更优选为2:1。
在本发明的实施例中，所述隔板的水平长度为培养瓶水平长度的2/3～5/6，更优选为3/4，所述隔板的厚度为0.3～1cm，更优选为0.5cm。
培养瓶侧壁设置有瓶口，所述瓶口与相接隔板的侧壁相对设置，与瓶口临近的隔板侧边缘低于所述瓶口的底边缘(3)且，垂直距离为0～1cm；上述设置使得细胞培养液的液面始终低于瓶口的底边缘，在细胞培养过程中不会出现漏液的问题，避免了细胞污染。
本发明提供了细胞分层共培养的装置在培养两种不同浮力的细胞中的应用，实现了在细胞培养瓶更好地模拟动物细胞内环境。
本发明的细胞分层共培养装置设置有瓶盖(5)，所述瓶盖可通过螺纹连接的方式与瓶口相接。在本发明的实施例中，所述瓶盖通过旋转来保证瓶内的通气，移动培养装置时，旋紧瓶盖，进行细胞培养时，旋转瓶盖使瓶内气体与瓶外气体能够流通。
本发明还提供了利用上述技术方案所述细胞分层共培养的装置进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
1)通过离心的方法分离待培养细胞，得到不同浮力的细胞；
2)在培养瓶中预先加入不含细胞的培养液，使液面不溢过隔板且垂直距离隔板0.5～2cm，进行孵育；
3)在培养装置中加入浮力小的细胞悬液和浮力大的细胞悬液，使培养装置中的液面接触但不溢过隔板，培养24～48h，两种悬液的加入顺序没有限制；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。
本发明通过离心的方法，优选为差速离心法分离待培养的细胞，得到不同浮力的细胞。本发明的离心速度和时间的选择取决于细胞混合液中各细胞的重力大小，以能够分离得到不同浮力的细胞为准。
本发明通过离心的方法将待培养的细胞分离为大浮力细胞和小浮力细胞，两种细胞悬液的加入顺序没有限制。两种浮力的细胞既可以同时接入培养瓶中，也可以分别加入培养瓶中，为使分层效果更好，接种时优选向培养瓶中加入浮力大的细胞，并于36.5～39℃、5～6％CO2培养箱中静置培养2～3h，优选为于37℃、5％CO2培养箱中静置培养2h，再向培养瓶中加入浮力小的细胞
本发明在向培养装置中加入待培养细胞前，在培养瓶中预先加入不含细胞的培养液，使液面不溢过隔板且垂直距离隔板0.5～2cm，进行孵育。在本发明中，所述孵育的温度优选为36.5～39℃，更优选为37℃；所述孵育的时间优选为4～6h，更优选为5h；所述孵育环境的CO2浓度优选为5～6％，更优选为5％。
本发明优选将上述技术方案所述培养装置置于培养箱内进行细胞培养，所述培养装置放入培养箱内时优选水平回旋两圈，以便瓶内外气体交换。
本发明在将分离得到的细胞加入到培养装置之前，优选经筛网过滤，以除去过大的组织块、细胞团以及细胞碎片等。在本发明中，所述筛网的孔径优选为70～90μm，更优选为80μm；本发明对所述筛网的材质没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的用于细胞过滤的筛网即可，如在本发明的实施例中可具体采用尼龙网筛。
本发明所述的待培养细胞在加入到所述细胞分层共培养装置内之前，优选先分别进行2～5h的预培养。
本发明提供的上述培养方法可以应用于原代培养，也可以应用于传代培养。
细胞原代培养的方法，包括以下步骤：
1、选取待培养动物细胞，冲洗2～4次；
2、使用胰酶对所述冲洗后的细胞进行消化，消化后离心；
3、在培养瓶中预先灌入完全培养基，进行孵育；
4、取消化后的上层悬浮细胞置于培养瓶中静置培养；
5、取消化后的下层细胞于培养皿中进行预培养，然后转移到培养瓶中培养。
本发明原代培养中的动物细胞需去除其它细胞组织或血管等杂细胞，冲洗采用PBS缓冲液，冲洗次数为2～4次，更优选为3次。
本发明原代培养加入的胰酶消化液的量为动物细胞质量的0.15～0.4％，更优选为0.25％；所述消化的时间优选为0.5～5min，更优选为3min。本发明优选用含5～15％，更优选为8～15％胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)等体积终止消化。
本发明在终止消化后，用孔径为200～350μm，更优选为250μm的网筛过滤细胞悬液，1200～2000r/min离心5～10min，更优选为1200r/min离心10min，取上层悬浮细胞液加入培养瓶中静置培养。
本发明在加入上层细胞进行培养后，对离心得到的下层细胞用60～180μm，更优选为80μm的网筛过滤，收集滤液，1000～1500r/min离心5～10min，更优选为1000r/min离心5min，弃上清；加入完全培养基吹打成单细胞悬液后接种于培养皿中进行预培养。培养2～5h后，将细胞转移到培养瓶中静置培养。
细胞传代培养的方法，包括以下步骤：
1、移除细胞培养瓶中原代培养的培养液，冲洗2～4次；
2、使用胰酶对所述冲洗后的细胞进行消化，消化后离心，弃上清；
3、将所述离心后的细胞沉淀悬浮，接种于预先灌入完全培养基的培养瓶中，进行孵育；
4、将步骤3中的培养瓶倒置，按步骤1和2继续消化隔板层的两种细胞，同样分别接种于新的预先灌入完全培养基的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈。
本发明的传代培养需待原代培养细胞培养2～4天，更优选为3天后，待细胞汇合度达到70～90％，更优选为80％时，进行传代，此时为传代的最佳时期。
本发明传代培养的冲洗采用PBS缓冲液，添加量为培养瓶体积的4～8％，更优选为6％，冲洗次数为2～4次，更优选为3次。
本发明传代培养加入的胰酶消化液的量为培养瓶体积的0.5～2％，更优选为1％；所述消化的时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明优选待细胞呈花斑状时，向其中加入4～8％的完全培养液中止消化，并轻轻吹打，转移细胞悬液。
本发明在消化后，将得到的消化产物进行离心，弃上清液。在本发明中，所述离心的速率优选为1000～2000r/min，更优选为1200r/min；所述离心的时间优选为3～5min，更优选为4min。
本发明在离心后，将所述离心得到的细胞沉淀进行悬浮，接种于预先灌入完全培养基的培养瓶中，进行孵育。在本发明中，所述悬浮优选采用4～8％的完全培养液进行。所述悬浮后，本发明将得到的悬浮细胞分别接种于两个预先灌入完全培养基的培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育4～8h，更优选为6h，随后每隔2～3天换一次完全培养基。
本发明将上述装有孵育完的细胞的细胞培养瓶倒置，按步骤1和2继续消化，同样分别接种于新的预先灌入完全培养基的培养瓶中静置培养4～8h，更优选为6h。
本发明的培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈。
下面结合实施例，对本发明提供的细胞分层共培养的装置及方法进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。
实施例1
如图1、2所示，设置培养装置，包含培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
在细胞进行原代培养过程中
1、取动物肌肉样组织，除去可见的结缔组织和血管，PBS缓冲液冲洗。
2、超净台内将组织剪成小块，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化2min，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)等体积终止消化。
3、随后选取体积为25cm3的培养瓶，预先灌入完全培养基，加入后，培养基液面垂直距离隔板下表面0.8cm，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育5h，使培养瓶内保持均衡。培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈。然后用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液，1200r/min离心10min，取顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入25cm3培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；
4、取上述步骤3中离心的下层细胞，向其中加入红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打5min裂解红细胞，1200r/min离心3min，弃上清。PBS稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min，弃上清；加入完全培养基吹打成单细胞悬液后接种于培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。接种后3h，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿底部，吸出含肌细胞的培养液，转移到3中的25cm3培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
5、成熟的脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到中间隔板的底面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，24h后实现了在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的分层共培养的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞。
实施例2
如图1、2所示，设置培养培养装置，包含培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)一侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
在细胞传代培养过程中
实施例1中原代培养细胞培养2天后，待细胞汇合度达到80％时，进行传代。
1、拧紧25cm3培养瓶瓶盖，从培养箱中取出需要传代的细胞，置于超净台内，小心吸弃培养瓶中原有的培养液，加入培养瓶体积8％的PBS缓冲液冲洗2次。
2、向培养瓶中加入4％胰酶消化液，静置消化3min左右，待细胞呈花斑状时，向其中加入4％完全培养液中止消化，并轻轻吹打，转移细胞悬液于EP管中，1200r/min离心3min，弃上清。
3、向步骤2中离心管内加入4％完全培养液，轻轻吹打成均匀的细胞悬液，分别接种于两个预先灌入完全培养基的培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育6h。
4、将步骤3中的培养瓶倒置，按步骤1和2继续消化隔板层的肌内脂肪细胞，同样分别接种于新的预先灌入完全培养基的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈，6h即可见细胞贴壁，随后每3d换液一次即可。
实施例3
如图1、2所示，设置培养装置，包含培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
在细胞进行原代培养过程中
1、取动物肌肉样组织，除去可见的结缔组织和血管，PBS缓冲液冲洗。
2、超净台内将组织剪成小块，加入0.15％的胰蛋白酶消化液消化5min，并用含8％胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)等体积终止消化。
3、随后选取体积为75cm3的培养瓶，预先灌入完全培养基，加入后，培养基液面垂直距离隔板下表面0.5cm，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育4h，使培养瓶内保持均衡。培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈。然后用孔径为200μm的尼龙网筛过滤细胞悬液，1500r/min离心8min，取顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入75cm3培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；
4、取上述步骤3中离心的下层细胞，向其中加入红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打8min裂解红细胞，1500r/min离心5min，弃上清。PBS稀释洗涤下层细胞，再用孔径为100μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1500r/min离心5min，弃上清；加入完全培养基吹打成单细胞悬液后接种于培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。接种后2h，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿底部，吸出含肌细胞的培养液，转移到3中的75cm3培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
5、成熟的脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到中间隔板的底面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，24h后实现了在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的分层共培养的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞。
实施例4
如图1、2所示，设置培养培养装置，包含培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)一侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)。
在细胞传代培养过程中
实施例3中原代培养细胞培养3天后，待细胞汇合度达到90％时，进行传代。
1、拧紧75cm3培养瓶瓶盖，从培养箱中取出需要传代的细胞，置于超净台内，小心吸弃培养瓶中原有的培养液，加入培养瓶体积5％的PBS缓冲液冲洗2次。
2、向培养瓶中加入5％胰酶消化液，静置消化5min左右，待细胞呈花斑状时，向其中加入5％完全培养液中止消化，并轻轻吹打，转移细胞悬液于EP管中，1000r/min离心5min，弃上清。
3、向步骤2中离心管内加入5％完全培养液，轻轻吹打成均匀的细胞悬液，分别接种于两个预先灌入完全培养基的培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中静置孵育6h。
4、将步骤3中的培养瓶倒置，按步骤1和2继续消化隔板层的肌内脂肪细胞，同样分别接种于新的预先灌入完全培养基的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。培养瓶放入培养箱内时要水平回旋两圈，5h即可见细胞贴壁，随后每2d换液一次即可。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种细胞分层共培养方法，包括以下步骤：
1)通过离心的方法分离待培养细胞，得到不同浮力的细胞；
2)在细胞分层共培养装置中预先加入不含细胞的培养液，使液面不溢过隔板且垂直距离隔板0.5～2cm，进行孵育；
3)在细胞分层共培养装置中加入浮力小的细胞悬液和浮力大的细胞悬液，使细胞分层共培养装置中的液面接触但不溢过隔板，培养24～48h，两种悬液的加入顺序没有限制；
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制；
所述细胞分层共培养装置包括培养瓶(1)和设置在培养瓶(1)内的隔板(2)，所述隔板(2)与所述培养瓶(1)侧壁相接，所述隔板(2)平行于培养瓶瓶底(4)；
所述培养瓶侧壁设置有瓶口，所述瓶口与相接隔板的侧壁相对设置，与瓶口临近的隔板侧边缘低于所述瓶口的底边缘(3)且，垂直距离为0～1cm；
所述隔板(2 )上没有孔洞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述隔板与培养瓶除瓶口方向的三侧侧壁相接。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述隔板将培养瓶内空间隔为上部的气体交换空间和下部的细胞培养空间，所述细胞培养空间的体积与所述气体交换空间的体积之比为4∶1～1∶1。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述隔板的水平长度为培养瓶水平长度的2/3～5/6，所述隔板的厚度为0.3～1cm。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述孵育是在37～39℃、5～6％CO2培养箱中静置4～6h。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述待培养细胞在加入到细胞分层共培养装置内之前，先分别进行2～5h的预培养。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述细胞分层共培养装置设置有瓶盖(5)，所述瓶盖通过旋转来保证瓶内的通气，移动培养装置时，旋紧瓶盖，进行细胞培养时，旋转瓶盖使瓶内气体与瓶外气体能够流通。
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