CS275876B6

CS275876B6 - Method for determination of microbes concentration by inoculation process and a dish for carrying out said method

Info

Publication number: CS275876B6
Application number: CS871143A
Authority: CS
Inventors: Viljo Tapio Juhani Nordlung
Original assignee: Valio Meijerien
Priority date: 1986-02-21
Filing date: 1987-02-20
Publication date: 1992-03-18
Also published as: NZ219308A; GB2187474A; NL8700429A; GB2187474B; CA1290667C; FI72741C; HK17191A; DK83187A; CH670100A5; FI860767A0; PL156162B1; IT8719422A0; FI72741B; US5134064A; SE467412B; GB8703721D0; BR8700812A; FR2594848B1; IT1203494B; DE3705229C2

Description

(57) Anotace :

Způsob stanovení koncentrace mikrobů očkovací metodou, při kterémže vzorek a médium smíchají a vlijí na misku, přičemž se geometrií dna misky řídí tloušťka ztuhlé ploty, ztuhlá plotna se inkubuje a poté se počítají kolonie. Při způsobu se používá jedna nebo několik misek, přičemž nakloněné dno misky je okrouhlé nebo pravoúhlé a je tvarované.

275 876 (13) Druh dokumentu : B 6 (51) Int. Cl.⁵ :

C 12 M 1/22

CS 275876 Β 6

Vynález se týká způsobu stanovení koncentrace mikrobů očkovací metodou, při které se vzorek a médium nalijí na misku, médium se nechá ztuhnout, ztuhlé médium se inkubuje, načež se spočítají kolonie na misce.

Vynález se také týká misek vhodných pro stanovení mikrobů pomocí očkovací metody.

V mlékárenství a rovněž v dalších odvětvích potravinářské mikrobiologie, lékařské mikrobiologii jakož i obecné mikrobiologii, se stanovení počtu mikrobů obsažených ve vzorku obecně provádí zřeďovacími očkovacími metodami. Mnoho tak zvaných mezinárodních srovnávacích metod je tohoto typu.

U zřeďovacích očkovacích metod se určitý objem vzorku, který má být zkoušen nebo zředěný vzorek, očkuje na Petriho misku, např. 10 až 15 ml sterilního kultivačního média schopného ztuhnutí (agar) a majícího teplotu 45 - 1 °C se vlije na vzorek. Vzorek se ihned smísí s médiem a nechá se tuhnout v horizontální poloze při teplotě místnosti. Vzorek a živná půda mohou být také míšeny před nalitím na Petriho misku. Ztuhlá půda vytvoří na misce hladkou vrstvu. Ztuhlé plotny se převrátí a umístí do inkubátoru (inkubace). Inkubační teploty (např. 10 °C, 30 °C, 37 °C, 44 °C, 55 °C) a inkubační časy (např. 2, 3, 6 a 10 dní) závisí na aplikované metodě a zejména na typu stanovovaných skupin mikrobů.

Plotny jsou během inkubace v horizontální poloze.

Po inkubaci se kolonie v Petriho miskách spočítají. Množství naočkované látky ve vzorku a zředovací poměry jsou známé, počet mikrobů na jednu jednotku objemu nebo jednu jednotku hmotnosti vzorku, obvykle mikroby/ml nebo mikroby/g, lze stanovit z počtu kolonií, které lze spočítat.

Médium může obsahovat tak široký rozsah živných látek, aby všechny mikrobiální typy, které připadají v úvahu, měly potřebné podmínky růstu (tzv. celkový počet kolonií). Živné látky média mohou být také omezeny nebo mohou být přidány známé inhibitory růstu. Takové půdy jsou označovány jako půdy selektivní a jsou připravovány pro rozlišení určitých skupin mikrobů.

Počítání lze provést vizuálně (pomocí známých pomocných zařízení) nebo pomocí různých elektronických zařízení (automatické počítače kolonií).

Vysoká koncentrace kolonií v misce omezuje jejich počítání. 8e obvyklé zahrnovat do počítání pouze plotny s množstvím kolonií, které nepřevyšuje stanovený limit; např. u ploten majících průměr 9 cm se za horní limit považuje 300 kolonií. Ke stanovení vzorků majících vyšší koncentraci mikrobů je proto nezbytné používat zředovací techniky. V praxi je obvyklé vždy nutné při očkovací metodě použít zřeďování. Příprava po sobě jdoucích ředění pokrývá 70 až 90 % pracovní doby požadované pro celou přípravu ploten (závisí na předpokládané potřebě ředění). Stejně tak je spotřeba materiálu násobkem počtu ředění.

Ořívější zředovací metody mají tak nevýhodu v tom, že připravují velké série ředěním a kultivací několika ředění. Je zapotřebí velký počet misek; dále je zapotřebí značný inkubační prostor. Jinými slovy, tyto metody jsou složité a náročné na čas.

Předmětem tohoto vynálezu je způsob, který se vyhýbá výše uvedeným nevýhodám a umožňuje stanovení koncentrace mikrobů jednoduchým a spolehlivým způsobem. Toho se dosáhne pomocí metody podle vynálezu, která se vyznačuje tím, že vzorek a médium se smísí, aby se získala homogenní směs, jejíž mikrobiální koncentrace je konstantní a směs se nechá ztuhnout takovým způsobem, že tlouštka vrstvy média se definovaným způsobem mění.

Základní myšlenka tohoto vynálezu je, že médium obsahující mikroby se nechá ztuhnout v misce tak, že tlouštka vrstvy ztuhlého média se mění definovaným způsobem. Médium se může nechat ztuhnout v jedné misce tak, že tlouštka vrstvy se stanoví pomocí geometrie misky. Jestliže se tloušíka vrstvy média mění od jedné misky ke druhé, mění se počet kolonií odpovídajícím způsobem.

CS 275876 Β 6

Tato myšlenka může být aplikována takovým způsobem, že směs vzorku a média se odměří do běžných Petriho misek v množstvích, která se odlišují vzájemně přesně stanoveným způsobem. Tak se získá série ploten majících různou tlouštku vrstvy. Tato metoda však nenabízí jiné racionalizační výhody než eliminaci potřeby postupných ředění.

Podle základní myšlenky tohoto vynálezu se vyvinuté kolonie liší různými hustotami. Hustota je nejnižší v nejtenších vrstvách a nejvyšší ve vrstvách nejtlustších, a mění se v tomto rozmezí v závislosti na povrchu media. Jestliže se vzorek a medium (agar) pečlivě smísí před vlitím do misky, jeho množství je známo, geometrie média a misky je matematicky definována, pak se koncentrace mikrobů ve vzorku snadno stanoví. Všechny informace jsou v souladů ^s přijatými mikrobi ologickými standardními metodami a mohou být využity při stanovení. Pouze kolonie zřetelně rozlišitelné v různých tlouštkách vrstvy plotny jsou brány v úvahu. Gradient tlouštky vrstvy stanoví gradient hustoty kolonií a je vzat v úvahu při matematickém výpočtu počtu kolonií. Je důležité při přípravě ploten, že misky jsou skutečně umístěny v horizontální poloze.

Výhody očkovací metody podle vynálezu:

1. Nejsou potřebná žádná postupná řešení, protože hustota kolonií je dostatečně nízká, aby mohla být počítána, přinejmenším v některých částech plotny díky kolísání tlouštky vrstvy živného média. Ve srovnání s předcházejícími postupy se ušetří 70 až 90 % pracovní doby, protože nejsou zapotřebí žádná postupná ředění.

2. Úspora získaná na živných půdách je úměrná potřebě postupných ředění v předcházejících postupech (s tím souvisí i úspora paralelních misek).

3. Jestliže budou použity misky pro jedno použití, jsou úspory materiálu úměrné počtu ředění požadovaných v předchozích postupech.

4. Významně je redukována potřeba inkubačního prostoru, protože není zapotřebí žádných paralelních misek potřebných pro postupná ředění. To samé se vztahuje na potřebu pracovních prostor a zařízení.

5. Není nezbytné počítat kolonie na celé misce, ale dostatečný počet kolonií pro stanovení se získá z počítaných zon a sektorů daných geometrii dna misky. Počítací etapa se tak zjednoduší a zrychlí na základě skutečnosti, že ředění a jeho důsledky jsou eliminovány

6. Celá metoda včetně počítání kolon může být mechanizována a automatizována, hlavně využi tím a modifikací předcházejících technik.

Koncentrace mikrobů získaná metodou podle vynálezu neobyčejně dobře souhlasí s výsled ky předcházejících postupů. Metoda může nahradit všechny dříve používané očkovací zředovací metody.

Vynález se také týká vhodné misky pro stanovení koncentrace mikrobů pomocí očkovací metody, při které se vzorek a médium vlijí do misky, ponechají se ztuhnout a ztuhlá plotna se inkuhuje a poté se spočítají kolonie na plotně. Tato miska se vyznačuje tím, že její tvar je takový, že po vlití vzorku a média na misku vytvoří ztuhlá vrstva v misce definovanou a různou tlouštku.

Základní myšlenka tohoto vynálezu, tj. že tlouštka ztuhlého média v misce se mění známým a definovaným způsobem, může být realizována použitím misek nového typu: miska má takový tvar, že po smísení vzorku a média a jejich vlití na misku v horizontální poloze se v misce vytvoří pevná vrstva, jejíž tlouštka se mění definovaným způsobem. Tento nový typ misky může být například kruhový jako je běžná Petriho miska nebo např. pravoúhlý. Tlouštka vrstvy média je nastavena na takovou požadovanou hodnotu pomocí povrchu dna kruhově misky sférického nebo matematicky definovaného nesférického tvaru, který může být vzestupný nebo sestupný. Ono kruhové misky může být vyrobeno vzestupně nebo sestupně pomocí misky, kde povrch je koncentricky kruhový, horizontálně planární nebo středově cirkulárně planární. Ono pravoúhlé misky může lineárně stoupat obloukově nebo jiným matema3

CS 275876 8 6 ticky definovaným způsobem. Je také možno použít dna pravoúhlé misky s pravoúhlým vzestupným planárním povrchem. Výhodným tvarem pravoúhlé misky je obdélník. Geometrie dna misky může být také nastavena pomocí přepážek různé výšky umístěných na jejím dně. Minimální tlouštka vrstvy média může být například 1 mm a maximální výška 10 mm v miskách podle tohoto vynálezu.

Všechny uvedené výhody, které poskytuje způsob podle vynálezu lze dosáhnout pomocí těchto typů misek. Nejsou zapotřebí žádná postupná ředění a úspory materiálu, média a inkubačního prostoru jsou ve srovnání s dřívějšími postupy značné. Při použití misky mající pravoúhlý tvar je potřeba média automaticky nižší, nejvýše asi 50 média potřebného pro Petriho misku a potřeba inkubačního prostoru je o více než 20 % menší, než při použití kruhových misek počítáno na plochu povrchu.

Z toho vyplývá, že nejvýhodnější použití podle vynálezu je použití misek pravoúhlých, dále je výhodné, aby vzorek (inokulum) a užité médium se důkladně před vlitím na misky promísily.

Obr. ΙΑ, 2A, 3, 4A, 5, 6 a 7 jsou vertikálními řezy různých provedení misek podle vynálezu a popřípadě médií a obr. 18, 2B a 48 jsou pohledy shora na příslušné misky.

Obr. ΙΑ, IB znázorňují misku £, která je, jak je zřejmé, kruhová a dno misky la je vzestupně konvexní. Médium je označeno číslem 2. 1 obrázků je zřejmé, že jestliže tlouštka vrstvy média se zvyšuje směrem k vnějšímu okraji misky známým způsobem daným geometrií dna misky, hustota kolonií se zvyšuje stejným způsobem.

Obr. 2A a 28 znázorňují misku 11, která se od předcházející liší tim, že dno 11a této misky je vzestupně konvexní a toho vyplývá, že jak tlouštka vrstvy média 2, tak hustota kolonií je nejvyšší uprostřed misky a směrem k jejím okrajům klesá.

Obr. 3 znázorňuje misku 21 a dno 21a, které je tvořeno horizontálními rovinnými plochami, které jsou uspořádány koncentricky tak, že tvar dna se stupňovitě mění. V misce jsou tak vytvořeny cirkulární vrstvy o tlouštce odpovídající geometrii dna.

Obr. 4A a 48 znázorňuje misku 31, která má, jak je zřejmé z obrázku, pravoúhlý tvar a tvar dna 31a se mění lineárně. Tlouštka vrstvy se zvyšuje od jedné kratší strany směrem ke druhé a množství kolonií se zvyšuje odpovídajícím způsobem.

Obr. 5 znázorňuje misku 41 a dno 41a, které stoupá obloukově, gradient tloušíky vrstvy a gradient hustoty kolonií se mění odpovídajícím způsobem.

Obr. 6 znázorňuje misku 51 a dno 51a, které je tvořeno pravoúhlými plenárními povrchy, takže se stupňovitě zvyšuje. V misce se proto vytvoří zóny o tlouštce vrstev odpovídající geometrii dna.

Obr. 7 znázorňuje misku 61, jejíž dno je opatřeno přepážkami 61a. Směs vzorku a agaru se vlije do sekce £, ze které část směsi přetéká do sekce 2 atd., takže se vytvoří oddělené zóny určité tloušíky.

Vynález bude dále podrobněji ilustrován následujícími příklady.

Příklad 1 yul vzorku mléka se asepticky naočkuje (smyčkou nebo mikropipetou) do 12 ml tekutého sterilního agaru (Standard Plate Count Agar, jako je FIL-IDF 100:1981) umístěného ve sterilní zkumavce a ochlazeného na teplotu 45 °C. Po naočkování se směs vzorku a agaru důkladně protřepává, např. v třepačce pro zkumavky.

Po smísení se směs vzorku a agaru vlije do pravúhlé misky, jejíž dno je vzestupné a tvořené horizontálními pravoúhlými planárními plochami. Miska obsahuje pět rovinných 2 povrchů, velikost každého je 4 cm . Rovinné plochy jsou stupňovány s dvoumilimetrovými rozdíly vzestupným způsobem. Objem kapaliny 12 ml, tj. objem agaru tohoto příkladu, se naplní do popsané misky takovým způsobem, že se v misce vytvoří 5 sektorů majících stejnou

CS 275876 B 6 plochu povrchu, ale lišících se tloušťkou agarové vrstvy. V sekci 1 je tloušťka 2 mm, v sekci II 4 mm, v sekci. III 6 mm, v sekci IV 8 mm a v sekci V 10 mm; množství agaru (a množství vzorku) odpovídá: I 0,80 ml (0,066 yul), II 1,60 ml(0,133 yul), III 2,40 ml (0,199 /Ul), IV 3,20 ml (0,266 yul) a V 4,00 ml (0,333 /Ul), Celková plocha agaru všech sektorů je po vlití 20 cm^. Množství agaru a množství vzorku jsou také uvedeny v tabulce 1.

Misky se uzavrou víčkem a inkubují se v horizontální poloze po dobu 72-2 hodin při teplotě +10-1 °C.

Výsledky se spočítají odděleně pro každý sektor dělením počtu počitatelných kolonií v každém sektoru (prakticky inéně než 40 kolonií na sektor) specifickým množstvím vzorku pro každý sektor; v tomto případě je množství vzorku 0,066 yul neboli 0,000066 ml v sektoru I a 0,333 iu1 neboli 0,000333 ml v sektoru V. Z toho vyplývá, že jestliže počet kolonií v sektoru 1 je 3, jsou 3 kolonie v 0,000066 ml a tedy 45 000 kolonií na ml; jestliže počet kolonií v sektoru 5 je 17, pak je 17 kolonií v 0,000333 ml a tedy 50 000 kolonií na: ml. Výsledek poskytuje přímo koncentraci mikrobů v ml vzorku. Počty kolonií v sektorech a vypočítané výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Informace získané ze všech počitatelných sektorů lze využít pro výpočet průměrné hodnoty pomocí výsledků získaných pro každý sektor.

Tabulka 1

Sektor (A = 4 cm^)	agar (ml)	vzorek (ml)	% vzorku
V	4,00	0,000333	33
IV	3,20	0,000266	28
III	2,40	0,000199	20
II	1,60	0,000133	13
I	0,80	0,000066	6

Tabulka 2

SPC x 1000	SPC	-modifi kace	množství mikrobů ve vzorku,
mikroby	x 10	³/ml
	I	II	III	IV	V	I	II	III	IV	V
'10	1	1	2	3	3	-	-	-	11 ’	9
50	3	7	10	13	17	45	53	50	49	51
100	7	13	20	27	33	106	98	100	101	99
200	13	27	40	53	67	197	203	201	199	-

CS 275876 B 6

Příklad 2

Vzorek se asepticky naočkuje do agaru při zřeďovacím poměru 10 *(10 ^ul původního vzorku na 100 ml agaru). Po inokulací se směs vzorku a agaru dostatečně promísí a vlije na běžné Petriho misky v množství 2, 5, 10, 20, 40 a 60 ml, takže množství původního vzorku je 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml a 0,006 ml. Misky se inkubují a kolony se sečtou. Počty kolonií spočítané z misek se převedou na hustotu mikrobů původního vzorku pomocí následujícího vzorce:

hustota mikrobů ve vzorku spočítaná hustota kolonii množství původního vzorku

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

	Kolonie na miskách (množství směsi vzorku a agaru)
SPC x 1000	2 ml	5 ml	10 ml	20 ml	40 ml	60 ml
5	1	3	5	10	20	30
20	4	10	20	40	80	120
50	10	25	50	100	200	300
200	(40)	(100)	200	(400)	-	-
100	20	50	100	200	(400)	(600)
300	(60)	(150)	300	-	-	-
500	(100)	(250)	(500)	-	-	-

Závorky v tabulce znamenají, že není možné v těchto miskách počítat hustotu kolonií Při. použití Petriho misek majících průměr 90 mm je dno misky zcela pokryto agarem pouze, u misek obsahujících 10 nebo více ml agaru.

Odkazy:

Standardní metoda počítání na plotnách:

1. FIL-IOF 100:1981 Liquid Milk Enumeration of Microorganisrous Colony Count Technjque at 30 °C.

2. ISO/DP 6610 ibid.

3. APHA American Public Health Association Standards Methods for Examination of Dairy Products 14. vyd. 1978, str. 77 až 93,

Metoda očkování na plotny:

1. APHA 14. vyd. str. 315 až 317.

2. Thompson, Oonnelly Black 1960 A Plate Loop Method for Oetermining Viable Counts of Raw Milk.

3. J.Milk Food Technol. 26: 156 až 171.

CS 275876 Β 6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 až 3, vyznačený tím, že nakloněné pravoúhlé

1. Způsob stanovení koncentrace mikrobů očkovací metodou, při kterém se vzorek a živné médium smíchají, vlijí na misku, nechají ztuhnout a ztuhlá plotna se inkubuje a poté se počítají kolonie, vyznačený tím, že se inkubace provádí na plotně, jejíž tloušíka závisí na tvaru dna misky.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že

3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že

4. Miska pro provádění způsobu podle bodů nebo okrouhlé dno misky je tvarované.

se médium nechá ztuhnout v jediné misce, se médium nechá ztuhnout v několika miskách.

5. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno 6. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno 7. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno 8. Mi ska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno 9. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno tálními rovinnými povrchy s kruhovou | pian 10. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že dno planárními | plochami. 11. Miska podle bodu 4, vyznačená tím, že na i

výšky.

je konkávní.

je konvexní.

lineárně stoupá.

stoupá kruhovým obloukem.

je vytvořeno koncentricky kruhovými horizon rní plochou uprostřed.

je stoupající a je vytvořeno pravoúhlými ně je jedna nebo několik přepážek různé