CN117925389A - 一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生防菌活性测定技术领域，尤其涉及一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法。本发明的生防菌活性检测方法，样品(活菌)与测试靶标生物(草、病原菌、害虫)分隔开，样品中的活菌和靶标生物独立生长，不产生相互干扰(污染或改变基质成分等)；样品中的代谢产物可以向靶标层扩散，产生杀虫、除草、杀菌等效果；样品中活菌在持续生长过程中，不断产生新的代谢产物，在筛选体系中形成代谢产物的富集，提高体系中代谢产物的总量，相应地提高了筛选体系的敏感性。

Description

一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法

技术领域

本发明涉及生防菌活性测定技术领域，尤其涉及一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法。

背景技术

当前，生态文明建设和保护生态环境已经成为发展生产力的重要组成部分。利用有益微生物杀灭或压低病、虫、草害生物数量以控制病、虫、草害的的绿色防控技术已经越来越受到重视。利用有益微生物的实质就是利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过微生物代谢产物等，来抑制病、虫、草害生物的存活和活动。因此，在生防菌的活性检测中受测样品中的微生物(活菌)不应该被分离出来。在平面式的筛选体系里，样品和测试靶标是处于同一位面，是二维结构；在活性检测中受测样品中的微生物会与测试靶标形成相互干扰作用。例如，当测试靶标也是微生物时，样品中的活菌和测试微生物都会持续混合生长，无法分辨测试靶标微生物的生长状态；当测试靶标是昆虫时，样品中的固形物在昆虫和昆虫饲料之间会形成物理隔断，影响昆虫的正常取食；当测试靶标是植物时，含有样品中活菌的生长会与植物开成竞争，影响根系的呼吸、对水分和养分的正常吸收。

基于目前的平面式的生防菌筛选方法存在的缺陷，有必要对此进行改进。

发明内容

有鉴于此，针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种结构新型的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法，以解决或至少部分解决现有技术中存在的缺陷。

第一方面，本发明提供了一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，包括：

管体；

分隔层，位于所述管体内；

样品层，位于所述分隔层一侧面，所述样品层与所述管体之间形成样品生长空间；

靶标层，位于所述分隔层另一侧面，所述靶标层与所述管体之间形成靶标生长空间；

所述样品层包括生防菌所对应的培养基；

所述分隔层为凝胶、生防菌对应的培养基、靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基或饲料中的任一种；

所述靶标层为靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基、饲料、凝胶中的任一种。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述生防菌包括放线菌、真菌或细菌及其发酵液或活菌制剂。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述生防菌所对应的培养基包括PDA培养基和/或PDB培养基。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述凝胶包括水琼脂、明胶中的至少一种。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述靶标培养基包括PDA培养基和/或PDB培养基。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述样品层还包括稀释剂；

所述稀释剂包括水、琼脂、琼脂糖、高岭土、膨润土、粘土、硅藻土、蒙脱土、活性白土、白云石、石英、碳酸钙、氧化膜、滑石、硅镁土中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括烷基磺酸盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸盐、山梨醇聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-脂肪醇醚、聚氧乙烯-脂肪酸酯、芳烷基聚乙二醇醚、氟代烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、木质素磺酸盐中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括聚乙烯醇、羧甲基纤维素、阿拉伯胶和以粉末、颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括无机染料、有机染料和痕量营养剂中的一种或几种。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述水琼脂中琼脂质量浓度为0.5～2％。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，所述生防菌所对应的培养基或所述靶标培养基中含有质量浓度为0.5～1％的琼脂。

优选的是，所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，还包括支架，所述支架上阵列设置有所述管体，所述管体内设置有所述分隔层、样品层以及靶标层。

第二方面，本发明还提供了一种生防菌活性检测方法，包括以下步骤：

提供所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置；

将含有生防菌的样品加入至样品生长空间内；

将测试靶标生物加入至靶标生长空间内；

测试含有生防菌的样品的杀菌活性。

本发明生防菌活性筛选装置及方法相对于现有技术具有以下有益效果：

1、本发明的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，包括管体，位于管体内的分隔层、样品层、靶标层，样品层与管体之间形成样品生长空间，靶标层与管体之间形成靶标生长空间；而本发明的生防菌活性筛选装置，利用三层(区)式结构，实现样品和测试靶标(虫、菌、草)既能独立处理和培养，又不隔断活性成分的传递，形成一种样品和靶标分隔，但是代谢产物可形成传递的三维测试结构，防止活菌和靶标生物相互干扰，防止相互污染；样品中的活菌持续产生代谢产物，形成代谢产物富集进而提高筛选敏感性；根据筛选的需要，样品和靶标可以同步接入和培养，也可以分时段接入和培养，通过对三层式基本结构单元的集成，实现批处理，以实现筛选的高通量；

2、本发明的生防菌活性检测方法，样品(活菌)与测试靶标生物(草、病原菌、害虫)分隔开，样品中的活菌和靶标生物独立生长，不产生相互干扰(污染或改变基质成分等)；样品中的代谢产物可以向靶标层扩散，产生杀虫、除草、杀菌等效果；样品中活菌在持续生长过程中，不断产生新的代谢产物，在筛选体系中形成代谢产物的富集，提高体系中代谢产物的总量，相应地提高了筛选体系的敏感性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明其中一个实施例中基于活菌的高通量生防菌活性检测装置的结构示意图；

图2为本发明另一个实施例中基于活菌的高通量生防菌活性检测装置的结构示意图；

图3～4为本发明实施例1中基于活菌的高通量生防菌活性检测装置的结构示意图；

图5为本发明实施例1中基质层(分隔层、样品层和靶标层)的加入；

图6为本发明实施例1中样品的加入；

图7为本发明实施例1中样品的加入后进行翻转使靶标层向上；

图8为本发明实施例1中展示了不同操作加入了样品及拟南价种子；

图9为本发明实施例1中在靶标层上接入了拟南芥种子；

图10为本发明实施例2中Rhizoctonia solani的测试图；

图11为本发明实施例4中拟南芥活性测试中的杂菌污染；

图12为本发明实施例5中四种除草活性测试靶标：稗草、马唐、反枝苋和拟南芥的测试图；

图13为本发明实施例6中发酵液涂布于小菜蛾人工饲料表面。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

本申请实施例提供了一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，如图1所示，包括：

管体1；

分隔层2，位于管体1内；

样品层3，位于分隔层2一侧面，样品层3与管体1之间形成样品生长空间11；

靶标层4，位于分隔层2另一侧面，靶标层3与管体1之间形成靶标生长空间12；

样品层3包括生防菌所对应的培养基质；

分隔层2为凝胶、生防菌对应的培养基、靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基或饲料中的任一种；

靶标层4为靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基、饲料、凝胶中的任一种。

本发明的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，包括管体1，位于管体1内的分隔层2、样品层3、靶标层4，样品层3与管体1之间形成样品生长空间11，靶标层3与管体1之间形成靶标生长空间12；本发明的生防菌活性筛选装置为三层(区)管式体系，如图1所示为一个基本筛选单元-由三个层(分区)组成的方口I形直管式结构。管口可以为圆形、方形或其它形状，管形可以是T形、U形、L形、U形、I形直管或者其它管形。为了表述方便，本示例选择方口I形直管为示范。为了实现样品(含活菌)和靶标生物(害虫、病原菌、杂草)的分隔，实现既独立培养，又不阻碍代谢产物向靶标生物。管内的空间以分隔层2为界，形成两个相互独立的区域，本发明中称为样品区(即样品层3与管体1之间形成样品生长空间11)，和靶标生长区(即靶标层3与管体1之间形成靶标生长空间12)；样品生长空间11可以为样品中的活菌生长提供通气条件和生长空间；样品层3，生防菌样品直接移加到该层；靶标生长空间12，可以为靶标生物生长提供通气、光照等条件及生长空间)；靶标层4，靶标生物(害虫、病原菌、杂草)直接移入该层。平面式的筛选体系里，样品和测试靶标是处于同一位面，是二维结构。而本发明的生防菌活性筛选装置，利用三层(区)式结构，实现样品和测试靶标(虫、菌、草)既能独立处理和培养，又不隔断活性成分的传递，形成一种样品和靶标分隔，但是代谢产物可形成传递的三维测试结构，是本发明解决活菌和靶标生物相互干扰，防止相互污染的关键创新点；样品中的活菌持续产生代谢产物，形成代谢产物富集是本发明提高筛选敏感性的另一个关键创新点；根据筛选的需要，样品和靶标可以同步接入和培养，也可以分时段接入和培养，是本发明在操作流程上的创新点。通过对三层式基本结构单元的集成，实现批处理，以实现筛选的高通量。

在一些实施例中，在一些实施例中，生防菌包括放线菌、真菌或细菌及其发酵液或活菌制剂。

在一些实施例中，生防菌所对应的培养基包括PDA培养基和/或PDB培养基。

在一些实施例中，凝胶包括水琼脂、明胶中的至少一种。具体的，固态凝胶类物质为惰性材料，对受测试样品中的活菌和供试靶标均无影响，也对各种代谢产物分子无阻隔作用，只分隔受测试样品中的固形物和供试靶标，不影响活性物质的传递。利用固态凝胶类物质的可塑性和固化后形成稳定网络结构、具有惰性和透过性的特点，只能隔断样品与供试靶标的相互干扰，而受测样品中的代谢产物可以自由传递，不影响活性代谢产物对靶标的作用，以达到发挥样品中活菌与活性组分协同作用的效果是本发明解决的关键技术问题。

在一些实施例中，凝胶包括水琼脂、明胶中的至少一种。

在一些实施例中，靶标培养基包括PDA培养基(即马铃薯葡萄糖琼脂培养基)和/或PDB培养基(马铃薯葡萄糖肉汤，PDB培养基，指的是不加琼脂的PDA培养基，用于真菌等的液体培养)。

在一些实施例中，样品层还包括稀释剂，稀释剂包括水、琼脂、琼脂糖、高岭土、膨润土、粘土、硅藻土、蒙脱土、活性白土、白云石、石英、碳酸钙、氧化膜、滑石、硅镁土中的一种或几种；

或，稀释剂包括烷基磺酸盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸盐、山梨醇聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-脂肪醇醚、聚氧乙烯-脂肪酸酯、芳烷基聚乙二醇醚、氟代烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、木质素磺酸盐中的一种或几种；

或，稀释剂包括聚乙烯醇、羧甲基纤维素、阿拉伯胶和以粉末、颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物中的一种或几种；

或，稀释剂包括无机染料、有机染料和痕量营养剂中的一种或几种。

其中，稀释剂起到调节样品层流动性和进行批处理时的可操作性，主要选自水、琼脂、琼脂糖、高岭土、膨润土、粘土、硅藻土、蒙脱土、活性白土、白云石、石英、碳酸钙、氧化膜、滑石、硅镁土中的一种或几种；或者为烷基磺酸盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸盐、山梨醇聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-脂肪醇醚、聚氧乙烯-脂肪酸酯、芳烷基聚乙二醇醚、氟代烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、木质素磺酸盐中的一种或几种；或者为聚乙烯醇、羧甲基纤维素、阿拉伯胶和以粉末、颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物中的一种或几种；或者为无机染料、有机染料和痕量营养剂中的一种或几种。具体应用时，所述含有活菌的样品可以是发酵培养物，也可以是含有活菌的固态或液态材料。

在一些实施例中，水琼脂中琼脂质量浓度为0.5～2％。

在一些实施例中，生防菌所对应的培养基或靶标培养基中含有质量浓度为0.5～1％的琼脂。

在一些实施例中，为了便于使分隔层2固定在管体1内，可设置分隔层支架，分隔层支架固定在管体1内，分隔层2位于分隔层支架上，具体的，分隔层支架可为金属网状物，分隔层2位于分隔层支架上下两侧面。

在一些实施例中，分隔层2可以是生防菌对应的培养基，也可以是其它惰性材料(如凝胶)，还可以是生物测定靶标生长所需要的基质(用于种子或者植物培养的基质)、样品菌(样品中所含活菌)培养基、靶标培养基(病原菌)或饲料(昆虫)。靶标层4是生物测定靶标生长所需要的基质(用于种子或者植物生长的基质)、培养基(病原菌或样品菌)和饲料(昆虫)。

在一些实施例中，如图2所示，还包括支架5，支架5上阵列设置有管体1，管体1内设置有分隔层2、样品层3以及靶标层4。

具体的，根据测试靶标生物(病原菌、杂草、害虫等)的不同特征和测试需要，将管体1按照不同的阵列排布进行组合，如4×6、8×6、8×12、16×24等。组合后的多管集合体适合进行批处理，如使用多通道移液器或者其他自动化移液设备。其中的每一个测试单位与上述基本单元结构完全一致。先在每个测试单位(即管体)中间部分填充凝胶，凝胶固化后得到基本测试模板。然后在其中一面加入样品培养基或样品，最后在另一面加入靶标生物所需的基质和靶标生物。有些靶标生物(如昆虫)接入后需要加盖，以防止靶标生物外逃。

在一些实施例中，管体1两端敞口以便于加入含有生防菌的样品和靶标生物。

基于同一发明构思，本发明还提供了一种生防菌活性检测方法，包括以下步骤：

S1、提供上述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置；

S2、将含有生防菌的样品加入至样品生长空间内；

S3、将测试靶标生物加入至靶标生长空间内；

S4、测试含有生防菌的样品的杀菌活性。

本发明的生防菌活性检测方法，基本原理为：样品(活菌)与测试靶标生物(草、病原菌、害虫)分隔开，样品中的活菌和靶标生物独立生长，不产生相互干扰(污染或改变基质成分等)；样品中的代谢产物可以向靶标层扩散，产生杀虫、除草、杀菌等效果；样品中活菌在持续生长过程中，不断产生新的代谢产物，在筛选体系中形成代谢产物的富集，提高体系中代谢产物的总量，相应地提高了筛选体系的敏感性。

在一些实施例中，测试靶标为Rhizoctonia solani，靶标层是马铃薯葡萄糖琼脂(包括PDA培养基和PDB培养基，PDA培养基和PDB培养基的质量比为4:3)，分隔层为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为放线菌WS-65560的发酵液；具体而言，放线菌WS-65560(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液的质量浓度为0.78～25％，且在生防菌活性筛选过程中先加入样品，24h后再加入靶标菌Rhizoctonia solani。

在一些实施例中，试靶标为Pyricularia oryzae、Rhizoctonia solani和Colletotrichum gloeobosporioides，靶标层是马铃薯葡萄糖琼脂(包括PDA培养基和PDB培养基，PDA培养基和PDB培养基的质量比为4:3)，分隔层为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为18株放线菌(具体的放线菌WS-38434、WS-38501、WS-38596、WS-38670、WS-38933、WS-39003、WS-39004、WS-39086、WS-39092、WS-39280、WS-40320、WS-40369、WS-58580、WS-58583、WS-59058、WS-59170、WS-59197、WS-65560)的发酵液(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)。在实际筛选中，样品加入和结果检查之间的时间间隔从48小时增加到96小时。

在一些实施例中，测试靶标为拟南芥(杂草种子)，靶标层和分隔层均为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品分别为3株放线菌(WS-50052发酵液、WS-76228发酵液、WS-76242发酵液)和3株真菌(SF-56534发酵液、SF-56536发酵液、SF-56538发酵液)的发酵液(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)。

本发明通过把样品、测试靶标生物通过分隔层进行分层处理，构建了一种三维测试体系。该测试体系具有对样品类型、样品加入量和靶标种类更广范的适应性，明显的提高了生防菌的筛选通量和筛选敏感性，适用用于农药、医药等生物测定和高通量筛选中，并且，该筛选体系的构建过程简单易行，原料易得，可以对样品和测试靶标进行分时处理，是一种具有广阔应用前景的测试方法。在将管式结构进行组合，便于实际测试中对样品和测试靶标进行批处理，从而提高筛选通量。

以下进一步以具体实施例说明本申请的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置及方法。本部分结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。如未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

本发明的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置中部分靶标、靶标层、分隔层、样品层的具体组成如下表1所示。

表1-部分靶标、靶标层、分隔层、样品层的具体组成

按表1中不同靶标对应的生防菌活性筛选装置，如图3～4所示，其包括8×12＝96个阵列排布的管体；进行含有活菌的样品杀虫活性、除草活性和杀菌活性筛选测试。该测试与常规生物测定方法的有相似之处：样品加入方式相同；靶标接入方式相同；活性判定标准相同。不同之处：样品和靶标有独立的生长区域，必须分别接入；样品中活菌的生长和靶标的生长没有交叉；样品中的代谢产物通过渗透到达靶标生长基质对靶标生物产生作用；可以通过提前加入样品(样品中活菌的持续产生代谢产物)或者增加样品量来实现靶标层中代谢产物的富集和提高代谢产物总量。

如图5中所示，样品层、分隔层和靶标层分批次有序加入至管体内；通常前一层稳定后再加入下一层。每层加入200微升，样品基质层、分隔层和靶标生物生长基层总体积为600微升左右。

如图6(左边为样品板，右边为已经填冲基质层的测试板)中所示为测试样品的加入。根据测试需要，每孔加入样品量为20-400微升。

如图7所示为靶标生物的加入。加入样品后静置2～4小时，翻转管体使靶标层向上(透过靶标层可见不同样品呈现出的色差)，加入靶标生物。

如图8中所示，以拟南芥种子测试除草活性为示例，图中4个生防菌活性筛选装置(包括8×12＝96个阵列排布的管体)展示了不同操作加入了样品及拟南价种子。每个管体加入样品量为60微升。4个生防菌活性筛选装置所示如下：

右下：空白管体；

右上：管体填充了各层基质(分隔层、样品层和靶标层)；

左上：在靶标层上接入了拟南芥种子；

左下：在样品层加入了样品(60微升/孔)。

如图9中所示，在靶标层上接入了拟南芥种子。

实施例2

以实施例1中的方法作为基础，依据靶标的特征，通过分时接入靶标和样品，以达到提高筛选敏感性的效果。

本实施例中使用图1所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为Rhizoctonia solani，靶标层是马铃薯葡萄糖琼脂(包括PDA培养基和PDB培养基，PDA培养基和PDB培养基的质量比为4:3)，分隔层为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，测试样品分别为化合物Benzovindiflupyr和放线菌WS-65560的发酵液。

Rhizoctonia solani是一个生长相对较快的病原真菌，如图10所示Rhizoctoniasolani的菌丝生长状况。图中10中，A排为同一个样品，浓度从左向右依次降低，靶标层表面靶标菌菌丝生长密度从左向右依次增大。B排为不同样品的活性表现，第三、四显示有杀菌活性。

如果同步接入样品和靶标菌(25℃，以PDA培养基和PDB培养基作为靶标培养基)，样品中活性成分在向靶标层扩散时，Rhizoctonia solani的菌丝也在快速生长，24小时后可以布满整个靶标层表面，此时显示出的活性较弱。如果在Rhizoctonia solani接入前24小时加入样品，使活性成分充分扩散，可以提高活性率。以Benzovindiflupyr和放线菌WS-65560(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液为标准样品的测试结果，如表2所示，同步接入靶标和样品两个样品显示出杀菌活性的最低浓度分别为2.0mg/L和12.5％。而提前24小时加入样品时，两个样品显示出杀菌活性的最低浓度都有降低，分别为0.02mg/L和1.56％。

表2-提前加入样品引起的活性反应结果

备注：REP 1、REP 2分别表示重复测试两次；活性评价指标是以靶标层表面的菌丝生长密度(目测)进行分级，分级梯度为0、3、7、9。梯度分级标准：0表示菌丝生长密度与对照相近；3表示菌丝生长密度比对照略小，缺损率在30％以下；7表示菌丝生长缺损率30％～90％之间；9表示菌丝生长缺损率在90％以上或者菌丝不可见。

实施例3

本实施例中使用图1所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为Pyricularia oryzae、Rhizoctonia solani和Colletotrichumgloeobosporioides，靶标层是马铃薯葡萄糖琼脂(包括PDA培养基和PDB培养基，PDA培养基和PDB培养基的质量比为4:3)，分隔层为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为18株放线菌的发酵液。

Pyricularia oryzae是一个生长缓慢的病原菌，通常(25℃，以PDA培养基和PDB培养基作为靶标培养基)在培养72小时后才培养基表面可见菌丝，培养96小时后菌丝密度才达到判定杀菌活性的标准。Rhizoctonia solani和Colletotrichum gloeobosporioides的生长速度接近，通常(25℃，以PDA培养基和PDB培养基作为靶标培养基)在培养24小时后才培养基表面布满菌丝，但菌丝密度较小。培养48小时后菌丝密度才达到判定杀菌活性的标准。

选择一批有杀菌活性的放线菌发酵液作为测试样品，分别以样品加入和结果检查之间的时间间隔为48小时和96小时，设置2组实验。如表3所示，加入样品和结果检查之间的时间间隔为48小时，三个病原菌(Pyricularia oryzae、Rhizoctonia solani和Colletotrichum gloeobosporioides)的测试活性率分别为55.6％、61.1％、27.8％；样品加入和结果检查之间的时间间隔为96小时，三个病原菌(Pyricularia oryzae、Rhizoctonia solani和Colletotrichum gloeobosporioides)所反应出的活性检出率分别为94.4％、77.8％、55.6％。杀菌活性评定标准与实施例2相同。从以上活性率变化可见，在实际筛选中，样品加入和结果检查之间的时间间隔从48小时增加到96小时，三个病原菌所反应出的活性检出率分别提升38.8％、16.7％、27.8％。

表3-不同加入样品与结果检查时间间隔引起的活性反应结果

实施例4

本实施例中使用图2所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为拟南芥(杂草种子)，靶标层和分隔层均为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品分别为3株放线菌和3株真菌(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液。

实施例4中除草剂类的筛选靶标以杂草或模式植物种子为测试起点，用于除草活性的筛选。由于种子萌发和初期生长的营养物质主要来源于子叶或胚乳，靶标层只需要为种子提供水分，所以这类筛选中的分隔层和靶标层可以使用相同材料：水琼脂。适于种子萌发和生长的条件同样适合活菌的生长和发育，因此在直接把种子和样品混合的方法，种子和样品中的活菌存在竞争关系(营养或水分)。特别是真菌类样品中的真菌，因其菌丝生长快，2-4天菌丝可布满整个培养表面，可以直接对种子和杂草的根系和幼苗形成包埋，引起假阳性结果。所以在直接把样品与杂草种子加于同一层面的表面涂布法除草剂活性筛选中，杂菌污染率限制了样品加入量的上限。以拟南芥为测试靶标，使用带有活菌的真菌和放线菌发酵液，对比表面涂布法(96孔板)和本发明的方法(组合方式为8×12＝96个阵列排布的管体)的杂菌污染情况进行统计。以0.7％水琼脂作为靶标生长基质，使用12个复孔。培养条件为：温度19℃、光照/黑暗时间为9小时/15小时，培养板上表面光照强度4500～5000LUX。培养7天后，统计12个复孔中杂菌污染总孔数。以目测有菌落形成或菌线生长判定为杂菌污染，如图11所示：上2格中为空白对照，下2格中为空白培养基引起的杂菌污染。表4结果显示，在表面涂布法中，样品加入量与杂菌污染孔数成正相关。而在本发明的方法中，靶标生长层表面无杂菌污染。

表4-不同样品加入量引起的杂菌污染孔数(个)

实施例5

本实施例中使用图1所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为稗子、马唐、反枝苋和拟南芥(均为种子)，靶标层和分隔层均为水琼脂(琼脂质量含量为0.7％)，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为放线菌WS-75928(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液。

以实施例1中的方法作为基础，测试两个单子叶靶标(稗草和马唐)和两个双子叶靶标(反枝苋和拟南芥)对放线菌WS-75928发酵液样品的活性反应。以0.7％水琼脂作为靶标生长基质，使用2个复孔。培养时间为7天，培养条件为：温度为19℃、光照/黑暗时间为9小时/15小时，培养板上表面光照强度4500～5000LUX。如示图12所示(四种除草活性测试靶标：稗草、马唐、反枝苋和拟南芥的测试图)，图中靶标依次为：1.稗草：A1-12，B1-12；2.马唐：C1-12，D1-12；3.反枝苋：E1-12，F1-12；4.拟南芥：G1-12，H1-12。浓度从左向右依次降低，靶标白化程度从左向右依次降低。样品加入量以2.5～100μl/孔，四种除草剂筛选靶标生长显示出稳定的活性，而且无杂菌在靶标层生长。样品为WS-75928，培养基为PDA。表5结果显示，采用本发明的方法，突破了常规筛选方法中样品加入量的上限。随着样品加入量的增加，黄化率变大，即提高了筛选的敏感性。

表5-四种除草剂筛选靶标的活性反应(黄化率％)

实施例6

本实施例中使用图1所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为小菜蛾(初孵幼虫)，靶标层和分隔层均为小菜蛾人工饲料，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为放线菌WS-55921(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液及相同发酵液制得的上清液(无活菌)、提取物和菌丝。

针对鳞翅目害虫幼虫的活性筛选通常使用表面涂布法或饲料混合法。在生防菌的测试中，因为样品中的成分除了代谢产物，主要为其它成分，比如大量的培养基组分、活菌(菌丝、孢子或其它形态的菌体)和水分等。这些成分是保持活菌活力的物质基础，但是加入人工饲料表面或混合进人工饲料中后，会在饲料表面形成物理隔离层或者改变饲料的组成(图13，发酵液涂布于小菜蛾人工饲料表面)，引起幼虫的拒食，造成假阳性的结果。因此在使用含有活菌的样品进行筛选时，为了降低假阳性率，样品加入量受到限制。在化合物的筛选中这个问题可以通过提取、纯化和浓缩来提高代谢产物浓度来减少对活性样品的漏筛，但是在生防菌的筛选中，为保持生防菌的活力，不能使用这些方法处理样品。因此，在常规筛选方法中，直接使用含有活菌的样品进行筛选，存在假阳性和假阴性的冲突。使用本发明的方法，可以在保持生防菌活力的同时对生防菌代谢产物实现富集，也可以增加样品加入量来提高代谢产物的总量，从而减少漏筛。

以放线菌WS-55921为测试菌株，培养基为PDA。分别使用本发明的方法和表面涂布法，对不同类型样品的杀虫活性进行了比较测试。样品类型分别为：样品A为WS-55921摇瓶发酵液；样品B为WS-55921摇瓶发酵液通过细菌滤器(孔径为0.22μm)过滤得到的上清液(无活菌)，以无菌培养基定容，还原到原体积；样品C为WS-55921摇瓶发酵液提取物(乙酸乙酯等体积萃取后干燥)，以无菌培养基定容，还原为原体积；样品D为WS-55921摇瓶发酵液离心并经过等体积清洗，反得处理三次后的得到的菌体(含有部分培养基成分)，以无菌空白培养基定容，还原为原体积。各样品以100％原液作为母液，以无菌空白培养基进行梯度稀释，七个浓度梯度为100％、50％、25％、12.5％、6.2％、3.1％、1.5％。空白对照CK1为无菌水，空白对照CK2为无菌空白培养基。比较不同类型样品进行代谢产物富集2天后和直接使用样品测试的杀虫活性。每个样品进行两次重复，每个重复使用5头小菜蛾初孵幼虫，接虫后继续培养5天后，统计死亡率。培养室浓度25℃，无光照。对比两种培养方式中同类样品的活性反应，表6结果表明，样品A(发酵液)引起的活性反应(死亡率)在2种处理中表现出不同的死亡率。各浓度样品提前培养2天后接虫引起死亡率分别比加样和接虫同步的样品引起的死亡率都有上升(浓度为100％和50％时，两组样品引起的死亡率都达到上限100％)。25％、12.5％、6.2％、3.1％、1.5％浓度样品对应的死亡率分别上升30％、60％、30％、10％、10％；而样品D(菌体)在2种处理中表现出的死亡率差异更大。接前培养2天后接虫的各浓度样品分别比加样和接虫同步的相同浓度样品引起的死亡率都有上升。100％、50％、25％、12.5％、6.2％、3.1％、1.5％浓度样品对应的死亡率分别上升80％、100％、100％、90％、30、20％。可见活菌在样品层持续生长引起代谢产物的富集可以提高杀虫活性测试体系的敏感性。

表6-不同类型样品进行代谢产物富集前后的杀虫活性

实施例7

本实施例中使用图1所示的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置进行活性筛选测试，测试靶标为小菜蛾(初孵幼虫)和棉铃虫(初孵幼虫)，靶标层和分隔层均为小菜蛾人工饲料，样品层为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，样品为34个真菌和16个放线菌(菌株来源于“国家植保微生物种质资源库(湖北)”)的发酵液。

使用人工饲料表面涂布法和实施例1中的方法对50个样品(在提取物测试中有杀虫活性)对两个磷翅目害虫(棉铃虫和小菜蛾)进行了杀虫活性筛选。采用了分级法统计活性：培养5天后，按照幼虫死亡情况及幼虫个体大小(目测，对空白照组比较)进行分级，分级梯度为0、3、7、9。分级标准：0表示幼虫无死亡且虫体大小与对照组相近；3表示幼虫无死亡且虫体比对照组小；7表示幼虫有部分死亡；9表示幼虫全部死亡。

按人工饲料表面涂布法对样品进行如下操作：发酵液样品加入量20微升(加样量超过20微升，引起幼虫拒食)，静置2～4小时，待人工饲料表面样品无明水后，分别接入小菜蛾和棉铃虫的初孵幼虫，加盖，培养5天后检查结果；按实施例1中的方法对样品进行如下操作：发酵液样品加入量为20微升(受样品区孔容积的限制，样品加入量上限为400微升左右，由于样品区和靶标区有物理分隔，样品加入量不影响幼虫的生长)，发酵液样品在样品区继续培养2天后，在靶标区分别接入小菜蛾和棉铃虫的初孵幼虫，加盖，培养5天后检查结果。培养室温度25℃，每天9小时光照，光照强度1000LUX。表7结果表明，以人工饲料表面涂布法进行的筛选中，小菜蛾组的活性率为62％，棉铃虫组的活性率为8％；以实施例1中的方法进行的筛选中，小菜蛾的活性样品检出率为92％，棉铃虫的活性检出率为36％。使用实施例1中的方法，小菜蛾和棉铃虫对这组样品的活性检出率分别增加了30％和28％。

表7-对50个样品在两种方法中的活性测试结果

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以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，包括：

管体；

分隔层，位于所述管体内；

样品层，位于所述分隔层一侧面，所述样品层与所述管体之间形成样品生长空间；

靶标层，位于所述分隔层另一侧面，所述靶标层与所述管体之间形成靶标生长空间；

所述样品层包括生防菌所对应的培养基；

所述分隔层为凝胶、生防菌对应的培养基、靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基或饲料中的任一种；

所述靶标层为靶标生长基质、样品菌或病原菌培养基、靶标培养基、饲料、凝胶中的任一种。

2.如权利要求1所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述生防菌包括放线菌、真菌或细菌及其发酵液或活菌制剂。

3.如权利要求1所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述生防菌所对应的培养基包括PDA培养基和/或PDB培养基。

4.如权利要求1所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述凝胶包括水琼脂、明胶中的至少一种。

5.如权利要求1所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述靶标培养基包括PDA培养基和/或PDB培养基。

6.如权利要求1所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述样品层还包括稀释剂；

所述稀释剂包括水、琼脂、琼脂糖、高岭土、膨润土、粘土、硅藻土、蒙脱土、活性白土、白云石、石英、碳酸钙、氧化膜、滑石、硅镁土中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括烷基磺酸盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸盐、山梨醇聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-脂肪醇醚、聚氧乙烯-脂肪酸酯、芳烷基聚乙二醇醚、氟代烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、木质素磺酸盐中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括聚乙烯醇、羧甲基纤维素、阿拉伯胶和以粉末、颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物中的一种或几种；

或，所述稀释剂包括无机染料、有机染料和痕量营养剂中的一种或几种。

7.如权利要求4所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述水琼脂中琼脂质量浓度为0.5～2％。

8.如权利要求3或5任一所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，所述生防菌所对应的培养基或所述靶标培养基中含有质量浓度为0.5～1％的琼脂。

9.如权利要求1～7任一所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置，其特征在于，还包括支架，所述支架上阵列设置有所述管体，所述管体内设置有所述分隔层、样品层以及靶标层。

10.一种生防菌活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供如权利要求1～9任一所述的基于活菌的高通量生防菌活性检测装置；

将含有生防菌的样品加入至样品生长空间内；

将测试靶标生物加入至靶标生长空间内；

测试含有生防菌的样品的杀菌活性。