DE3048852A1

DE3048852A1 - Vorrichtung zur durchfuehrung eines mikrobiologischen radiorespirometrischen tests und damit durchgefuehrtes bestimmungsverfahren

Info

Publication number: DE3048852A1
Application number: DE19803048852
Authority: DE
Inventors: Gilbert V. 21403 Annapolis Levin, Md.; Patricia Ann 21207 Baltimore Straat, Md.
Original assignee: Biospherics Inc
Current assignee: Dominari Holdings Inc
Priority date: 1979-12-26
Filing date: 1980-12-23
Publication date: 1981-09-10
Also published as: JPS56102796A; GB2066461A; GB2066461B; US4294931A

Description

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER " R. F. MEYER-ROXLAU

DIPL.-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING

■Η-

8000 MÜNCHEN

LUCILE-GRAHN-STRASSE

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

23. Dezember 1980 18869

Biospherics Incorporated, 4928 Wyaconda Road, Rockville, Maryland 20852, USA

Vorrichtung zur Durchführung eines mikrobiologischen radiorespirometrischen Tests und damit durchgeführtes

Bestimmungsverfahren

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung für die Durchführung einer mikrobiologischen Reaktion unter aeroben oder anaeroben Bedingungen. Insbesondere bezieht sie sich auf eine wegwerfbare Platte für die Durchführung radiorespirometrischer mikrobiologischer Tests, z.B. zum Nachweis und/oder zur Identifizierung von Mikroorganismen oder zur Bestimmung antibiotischer Suszeptibilität.

Eine der Hauptfunktionen eines modernen Hospital- oder klinischen Labors ist die Durchführung mikrobiologischer Analysen von Blut und anderem Material von Patienten. Dies ist von Bedeutung bei der Diagnose und Behandlung zahlreicher Infektionskrankheiten. Die derzeitigen Kosten für mikrobiologische Dienstleistungen sind verhältnismäßig hoch, da erheblicher manueller Aufwand für die Durchführung der Bestimmungen erforderlich ist und die derzeitige Technik Wiederholungen für angemessenes statistisches Gewicht verlangt. Ferner müssen die Proben in Inkubatoren viele Tage aufbewahrt werden, was wertvollen Krankenhauslaborraum verbraucht. In den letzten Jahren wurde Vorhaben zur Automatisierung dieser mikrobiellen Methoden erhebliche Aufmerksamkeit geschenkt. Abgestellt wird auf die Kostensenkung, um dadurch die Analysen breiter auf die Öffentlichkeit anwendbar zu machen, auf die Verbesserung der Genauigkeit der Bestimmungen und auf die Abkürzung der zu ihrer Erlangung notwendi-

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gen Zeitspanne. Die letzteren Punkte verbessern die derzeit verfügbare Qualität der medizinischen Aufmerksamkeit.

Für den Schnellnachweis, die Identifizierung und den Test der antibiotischen Empfindlichkeit von Mikroorganismen ist eine Methode unter Anwendung der Radiorespirometrie entwickelt worden. Die Radiorespirometrie ist eine Technik zur Messung der Stoffwechselaktivitäten lebender Zellen. Mikroorganismen, darunter Bakterien, Fungi, Hefen und Actinomyceten, produzieren, wenn sie in ein Medium gebracht werden, das organische Substra-

1 4 te enthält, die mit radioaktivem Kohlenstoff ( C) markiert

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sind, radioaktives Kohlendioxid ( CO₉) als Produkt des

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Substratabbaus. Das CO₉ entwickelt sich als Gas und kann eingefangen und gemessen werden. Das Auftreten von Radioaktivität in der Falle kann daher als positiver Nachweis für das Vorliegen eines Mikroorganismus herangezogen werden.

J. R. Schrot, Vl'. C. Hess und G. V. Levin "Method für Radiorespirometrie Detection of Bacteria in Pure Culture and in Blood", Applied Microbiology, Band 26, Nr. 6, Dezember 1973, J. R. Schrot, G. V. Levin, M. Takeguchi und R. Levin "Radiorespirometrie Identification of Bacteria", im Druck, beschreiben den hohen Grad an Empfindlichkeit der r.adiorespirometrischen Methode für den mikrobiellen Nachweis.

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Winzige Mengen an CO₂-GaS können leicht nachgewiesen werden. Ausgehend von einer über Nacht-Kultur liefern radiorespirometrisehe Methoden positive Ergebnisse in einer halben Stunde, während herkömmliche Arbeitsweisen wenigstens einen weiteren Tag und im allgemeinen länger benötigen. Herkömmliche Arbeitsweisen sind zeitraubend, mühsam und deshalb teuer und erfordern Handhabungen, die zu Kontamination führen können. Die radiorespirometrische Methode ist auf allen diesen Gebieten von Vorteil. Sie kann zum Nachweis von Bakterien in jedem Material, einschließlich Blut, Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Faeces, Operationssaaloberflächen und Luft, parenterale Nahrung und

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Nahrungsbearbeitungsbereichen, Arzneimitteln, Lotion, Wundverband, Creme, Augenwäsche, Kosmetika und Wasser, angewandt werden. Da sich die Methode für die Automatisierung eignet, kann eine große Anzahl von Proben pro Tag geprüft werden. Die Schnelligkeit der Tests und die Wirtschaftlichkeit hinsichtlich der Materialien und der Arbeit führen zu erheblichen Einsparungen gegenüber derzeit verfügbaren Methoden.

Herkömmliche Arbeitsweisen zur Identifizierung von Bakterien umfassen das Inokulieren einer unbekannten Species und das Überwachen der Inkubationsröhrchen für 1 bis 10 Tage oder langer. Die Röhrchen werden auf Gasblasen, Farbänderungen, Wachstum usw. geprüft. Auf der Grundlage der in den Medien beobachteten Änderungen erfolgt eine Identifizierung. Die radiorespirometrische Methode der Identifizierung, beschrieben in der US-PS 3 969 496, ist einfacher, indem nur ein Signal, entwickelte bzw. abgegebene Radioaktivität, als Reaktionsendpunkt erfaßt wird. Mit der radiorespirometrischen Methode werden mehrere verschiedene Vorteile erreicht: a) Reaktionen sind innerhalb 30 min bis zu 1 h ablesbar, b) die Ergebnisse werden alle als Radioaktivität erfaßt, was einen Fehler aufgrund der Farbdeutung eliminiert, c) eine mit Computern aufgebaute Bibliothek macht die Identifizierung einfach und genau, d) die Methode ist einfach, eine sterile Technik ist nicht nötig, e) hochqualifiziertes Personal ist nicht erforderlich, da die Erfassung und Deutung der Daten durch Instrument und Computer erfolgt, f) Bakterien, Fungi, Hefen und Actinomyceten können nach dieser Methode identifiziert werden.

Die in klinischen Laboratorien heutzutage im größten Umfang vorgenommene Arbeitsweise ist wohl die des Testens der antibiotischen Empfindlichkeit. Die Papierscheibenmethode, bei der antiobiotisch imprägnierte Papierscheiben auf eine Agarplatte gelegt werden, die mit dem Testorganismus bekeimt ist, ist die am meisten angewandte Methode. Die Platte wird über Nacht inkubiert, und Hemmzonen um die Scheiben herum geban

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die Empfindlichkeit an. Trotz der weit verbreiteten Anwendung unterliegt die Methode erheblicher Fehlinterpretation. Eine andere Methode, die RÖhrchenverdünnungstechnik, ist genauer, aber für die meisten Laboratorien zu zeitaufwendig. Da die

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Entwicklung von CO₂ aus markiertem Medium das Ergebnis von Stoffwechselaktivitäten von vorhandenen Mikroorganismen ist, hemmt jede Substanz, die den Stoffwechsel dieser Organismen

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hemmt, auch die CO^-Entwicklung. Dies ist die Grundlage für den radiorespirometrischen antibiotischen Empfindlichkeits-

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test. C-markierte Substrate und verschiedene Konzentrationen an Antibiotika enthaltende Medien werden mit dem infektiösen

1 λ Organismus beimpft. Der Vergleich des entwickelten CO₂ aus Tests mit und ohne Antibiotikum-Konzentrationen liefert die Kriterien zur Auswahl des gegen den Organismus wirkenden Anti-

1 4 biotikums und dessen Konzentration. Die Entstehung von CO₂ in den zum Nachweis durch das radiorespirometrische System nötigen Spurenmengen geht dem meßbaren Wachstum erheblich voraus. Daher ist die radiorespirometrische Methode ganz erheblich viel schneller als jede andere derzeit verfügbare Methode. · .

Bei allen obigen Testmethoden und Forschungstechniken wird von einer Rein- oder Mischkultur oder einer eine solche Kultur enthaltenden Substanz mit einer oder mehreren Verbindungen, in der bzw. denen eines oder mehrere der Elemente radioaktiv ist bzw. sind, ausgegangen. Die Kultur wird dann auf Entwicklung radioaktiven Gases als Index der Keim- oder Lebensfähigkeit, Stoffwechselaktivität und/oder Wachstum überwacht. Im allgemeinen werden markierte Kohlenstoffatome in organischen Verbindungen verwendet, und das entwickelte Gas ist im allgemeinen radioaktives Kohlendioxid. Doch können bei dem Verfahren andere Markierungen verwendet werden, z.B. S-markierte Verbindungen, die H₂ S entstehen lassen.

Eines des Probleme der radiorespirometrischen Technik ist bisher das des Einfangens des entwickelten Gases und der quantitativen, genauen und raschen Messung seiner Radioaktivität.

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Erfindungsgemäß wird dieses Problem durch die Schaffung einer Vorrichtung gelöst, die einen Träger mit wenigstens einem Paar Kammern aufweist. Die Kammern stehen miteinander über einen Durchgang in Verbindung. Der Durchgang mündet in jede der Kammern in deren oberem Teil. Die Vorrichtung umfaßt auch eine Verschlußeinrichtung zum Schließen der Kammern und des Durchgangs.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Figuren ausführlicher beschrieben; von diesen ist:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer Mikrokulturenschale gemäß der Erfindung,

Fig. 2 eine vergrößerte Ansicht einer Abdeckung und eine Schnittansicht der in Fig. 1 gezeigten Schale entlang den Linien 2-2 der Fig. 1,

Fig. 3 eine Draufsicht auf den Boden einer Abdeckung, die gegebenenfalls mit der wegwerfbaren Schale gemäß Fig. 1 verwendet werden kann,

Fig. 4 ein Seitenaufriß der in Fig. 3 gezeigten Abdeckung,

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer weiteren Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 6 eine Schnittansicht entlang den Linien 6-6 der Schale gemäß Fig. 5, die die mit der gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung verwendeten Abdeckung verbundene Schale vergrößert wiedergibt,

Fig. 7 eine Draufsicht auf den Boden der in Fig. 6 dargestellten Abdeckung,

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Fig. 8 eine perspektivische Ansicht einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäß gestalteten Mikrokulturschale,

Fig. 9 eine Schnittansicht entlang den Linien 9-9 der Fig. 8, dargestellt in Verbindung mit einer Abdekkung und

Fig. 10 eine vergrößerte Ansicht eines Filmentwicklungssystems

Unter Bezugnahme insbesondere auf die Figuren 1 und 2 ist eine wegwerfbare Platte oder Mikrokulturschalenanordnung 10 dargestellt. Die wegwerfbare Platte 10 besteht aus einem tragenden Teil oder Träger 12 und einer Abdeckung 14. In dem Träger 12 liegen mehrere Paare von Kammern 16 und 18. Jede der Kammern 16 und 18 in jedem Paar steht miteinander über einen Durchgang 20 in Verbindung. Der Durchgang 20 öffnet sich in jede der Kammern 16 und 18 an deren oberem Teil.

Jede Kammer 16 ist ein Kulturbehälter und enthält Flüssigkeit, getrocknetes oder lyophilisiertes Wachstumsmedium. Das Wachstumsmedium ist ein radioaktiv markiertes Substrat, das im Stoffwechsel verarbeitet zu werden vermag, so daß während des Wachstums eines Mikroorganismus ein radioaktives Gas entsteht, 14

z.B. ein C-markiertes Substrat. Beispiele für solche Substrate sind u.a. folgende:

UL¹⁴C-Harnstoff

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1 C-Lactose

15¹⁴C-Citrat
UL¹⁴C-Ornithin
UL¹⁴C-Maltose

UL C-Saccharose

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UL¹⁴C-D-Glucose 1 ¹⁴C-DL-Lysin ΐ ¹⁴C-Dulcit ÜL¹⁴C-Sorbit UL¹⁴C-D-Xylose UL¹⁴C-D-Mannit

1 C-Ring-DL-Phenylalanin

UL¹⁴C-Glycin UL¹⁴C-D-Alanin

2 ¹⁴C-Xanthin UL L-Alanin UL^{1 4}C-Fonni at UL¹⁴C-ACetat UL¹⁴C-DL-Lactat

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1 C-Fumarat UL¹⁴C~Malat 1 ¹⁴C-Gluconat UL¹⁴C-Glutamat UL¹⁴C-L-Tyrosin UL¹⁴C-L-Threonin

1 4
UL C-L-Asparaginsäure

1 ¹⁴C-Succinat (Ring-2-¹⁴C)-L-Histidin

2 C-(Ring-markiertes) Tryptophan 1 ¹⁴C-DL-Leucin

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1.3 ¹⁴C-Glycerin

1 4 1 C-D-Galactose

14 1 C-D-Mannose

1 Carbonyl- C-DL-Methionin 1 4

1,2 ¹⁴C-Oxalat 1 ¹⁴C-DL-VaUn

1 ¹⁴C-Malonat

1 4 4 C-DL-Asparaginat

1 (Guanido C)-DL-Arginin

1 UL CL-Trehalose

2 ¹⁴C-Uracil UL¹⁴C-Erythrit

1.4 ¹⁴C-DL-Tartrat (Carbonyl C).-Dextran UL ¹⁴C-Stärke UL¹⁴C-CeIlUlOSe

14 1 C-Glucose 6¹⁴C-Glucose

1 4 1 C-Propionat 1 ¹⁴C-Buttersäure

Die Substrate sollten in den Kammern 16 in genügender Menge vorliegen, um eine leicht nachweisbare Menge an radioaktivem Gas nach dem Stoffwechsel des Mikroorganismus zu liefern. Vorzugsweise enthält das Substrat in jeder Kammer 16 wenigstens

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40 nCi Radioaktivität.

Jede Kammer 18 ist entweder eine Sammel- oder Zählvertiefung, deren Boden einen Getter für Kohlendioxid oder ein anderes Gas von Interesse enthält. Das Gettermatial kann ein solches sein,

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das mit CO₀ (oder einem anderen Gas) reagiert, wie Hyaminhydroxid, oder ein mit Bariumhydroxid oder Lithiumhydroxid getränktes Filterpolster. So reagiert, wenn das Gettermatial Bariumhydroxid ist, CO₂ damit zu Ba CO,. Wenn in diesem Zusammenhang auf das Auffangen eines Gases Bezug genommen wird, so ist darunter auch zu verstehen, daß das Gas mit Hilfe einer chemischen Reaktion fixiert wird. Das Gettermaterial kann auch geeignete Pluoreszenzstoffe und "Misch"-Materialien ("cocktail") für nachfolgende Szintillationszählung enthalten.

Bei Nichtgebrauch sind die ganze Platte 10 und alle darin enthaltenen Kammern und Durchgänge mit einer gasdichten Abdeckung 14 verschlossen. Die Abdeckung ist am Träger 12 mit Hilfe eines Klebers oder durch Druckanwendung befestigt. Gegebenenfalls kann, wie in den Figuren 3 und 4 gezeigt, die Abdeckung 14 mit Formzapfen 22 ausgestattet sein, die mit der Abdeckung einen integralen Teil bilden können. Diese Zapfen 22 sind so gestaltet, daß sie während der Lagerung der Schalen in die Durchgänge 20 passen und diese verschließen, um zu gewährleisten, daß kein Gettermaterial in die Kulturvertiefung während der Lagerung gerät und kein radioaktives Material während der Lagerung in den Getterbehälter gelangt.

Wenn die wegwerfbare Platte 10 verwendet werden soll, wird die Abdeckung 14 entfernt, um die Kammerpaare 16 und 18 und die Durchgänge 20 freizulegen. Ein oder mehrere Paare von Kammern können gleichzeitig freigelegt werden. Teilmengen des auf die Anwesenheit von Mikroorganismen oder auf irgendwelche anderen, oben beschriebenen Zwecke zu testenden Materials werden den Kulturbehältern 16 zugesetzt. Sie können in Form einer wässrigen

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Suspension vorliegen. Diese Beimpfung kann erfolgen, indem die Suspension der Mikroorganismen manuell oder nach automatisierten oder Massenreplikationstechniken eingeführt wird. Wenn das markierte Substrat in trockener Form im Kulturbehälter 16 vorliegt, rekonstituiert das wässrige, zum Einführen des Mikroorganismus in die Kammer 16 verwendete Medium das Substrat und bildet ein Gemisch aus dem markierten Medium und dem Organismus.

Statt die Abdeckung 14 zum Beimpfen der Ku.l turbehälter 1 (> zu entfernen, kann die Abdeckung 14 in Form eines selbstdichtenden Films vorgesehen sein, und das Kulturmaterial kann durch die Abdeckung direkt in die Kulturkammer 16 injiziert werden.

Nachdem die Kulturbehälter 16 beimpft worden sind, wird eine Abdeckung oben über den Träger 12 gebracht, um einen luftdichten Verschluß für jedes Kammerpaar 16 und 18 und den Durchgang 20 zu schaffen. Wenn jedes Kammerpaar 16 und 18 und der verbindende Durchgang 20 gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen sind, stehen die Kammern 16 und 18 in offener Verbindung miteinander über den Durchgang 20, d.h. nach der Inkubation würde die Abdeckung mit den integrierten Zapfen 22, wie in den Fig. 3 und 4 dargestellt, nicht verwendet. Die Ersatzabdeckung kann mit bekannten Klebern oder durch Druckanwendung mit dem Träger dichtend verbunden werden.

Nach dem Beimpfen und Verschließen mit der Abdeckung wird die Platte dann bei der gewünschten Temperatur für die gewünschte Zeit inkubiert. Während der Inkubation wandert alles entwickelte radioaktive Gas aus dem Kulturbehälter 16 durch den Durchgang 20 aufgrund des Konzentrationsgradienten zum Zählerbehälter 18. Wenn die gewünschte Inkubationszeit vorbei ist, wird die Platte in eine geeignete, lichterfassende Vorrichtung gebracht, so daß die Szintillationszählung eines jeden Zählbehälters 18 entweder manuell oder automatisch erfolgen kann. Mehrfach-Photodetektoren können das gleichzeitige Zählen der Proben ermöglichen

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und die insgesamt verstrichene Zeit, die zur Erlangung der gewünschten Werte von statistischer Bedeutung erforderlich ist, herabsetzen. Wenn das Gettermaterial auf Filterpolster aufgebracht ist, können diese auch aus der Platte 10 entfernt und in einem geeigneten "Gemisch" ("cocktail") nach Flüssig-Szintillationstechniken gezählt werden.

Wenn gewünscht, kann ein Zählen der Radioaktivität auch durch Anordnen einer Strahlungszählvorrichtung für den festen Zustand, ein Geiger-Müller- oder ein anderer geeigneter Zähler, über jedem Zählbehälter erfolgen. Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung der vom Kulturbehälter 16 in den Zählbehälter 18 freigesetzten Radioaktivitätsmenge besteht im Einführen eines strahlungsempfindlichen Pigments oder einer anderen Verbindung in den Getterfilm, so daß der Film seine Farbe oder optische Dichte relativ zur integrierten Radioaktivitätsdosis, erhalten vom radioaktiven Gas, ändert. Die Zählbehälter in einer solchen Platte können dann in einem einfachen photoelektrischen Densitometer am Ende der gewünschten Inkubationsperiode gezählt werden. Dies ermöglicht ein rascheres Zählen als durch Szintillations- oder Geiger-Müller-Zählung, die die Ereignisse während der Zählperiode sammeln müssen.

Die aus jedem Kulturbehälter 16 in jeden Zählbehälter 18 freigegebene Radioaktivitätsmenge kann auch durch Verwendung eines photographischen Films und radioautographischer Techniken gemessen werden, um die vom Gettermaterial aufgefangene Dosis zu integrieren. Das radioaktive Gas, das freigesetzt wird und sich auf einem Gettermaterial enthaltenden Filter sammelt, bildet auf dem Film Flecke, die dann mit einem Densitometer gezählt werden, was das Zählen zu einer verhältnismäßig einfachen und raschen Aufgabe macht, verglichen mit der Notwendigkeit, jedes Getterpolster etwa 1 min lang mit herkömmlichen beta-Nachweistechniken zu zählen, wie durch die Verwendung von Geiger-Müller-Zählrohren oder nach Flüssig-Szintil-1ationsmethoden.

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Bei der radioautographischen Technik ist das getternde Material, wie Bariumhydroxid, im Auffangbehälter in einem Filterpolster enthalten. Nach dem Auffangen der Radioaktivität durch den Getter wird das Getterpolster entfernt und dann einem photographischen Film ausgesetzt, der gegenüber emittierten beta-Teilchen empfindlich ist. Wenn gewünscht, kann die Abdeckplatte für die wegwerfbare Kultur/Gassammelplatte den Film plus Entwickler und Fixiermittel nach Art der Polaroid-Land-Technik zur Herstellung eines Direktpositivabzugs auf dem Film enthalten.

Eine Variante der im vorhergehenden Absatz beschriebenen Technik besteht in der Kombination einer lichtempfindlichen Emulsion oder Materials mit dem radioaktiven Getter, Szintillationsleuchtstofferi, photographischem Entwickler und Fixiersalz (Natriumthiosulfat, Hypo) im Sammelbehälter, so daß das lichtempfindliche Material ständig Lichtphotonen und/oder beta-Teilchen ausgesetzt wird, so wie sie von der Kulturzelle freigesetzt und in der Sammelzelle aufgefangen werden. So würde die freigesetzte Radioaktivitätsdosis über die gesamte Inkubationszeit integriert. Die Entwicklung des photographischen Materials zur Erhöhung der optischen Dichte kann gleichzeitig mit dem Belichten und Auffangen oder anschließend erfolgen. Die Verwendung von Thiosulfat zum Fixieren des lichtempfindlichen Materials vor dem Erfassen seiner Dichte in einem Densitometer kann gegebenenfalls erfolgen. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit teurer Geiger-Müller- oder Photomultiplier-Rohre als Teil des Erfassungs- und Zählmechanismus und setzt die bis zum Abschluß des Mikroorganismentests verstrichene Zeit erheblich herab.

Wenn gewünscht, kann nach dem Abschluß des Tests die Platte wieder geöffnet und ein geeignetes Desinfektionsmittel jedem der Kulturbehälter zugesetzt werden, worauf die Abdeckung zum endgültigen Verwerfen aufgebracht werden kann. Andererseits kann die Platte vor dem Verwerfen hitzesterilisiert werden. Alternativmaßnahmen (z.B. Wärme oder Äthylenoxid)

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zum Sterilisieren können je nach den verwendeten Materialien angewandt werden.

Diese Vorrichtung eignet sich für aerobe Verwendung, kann aber auch anaerob verwendet werden, indem sie in einen Handschuhkasten oder Brauerkessel gebracht und die Atmosphäre in dem Kasten oder dem Kessel, durch ein Gas wie Stickstoff oder Helium, inert gehalten wird. Restsauerstoff kann aus dieser Atmosphäre durch Zugabe von Pyrogallol oder Phosphorpentoxid entfernt werden. Jede Vorrichtung, die für anaerobe Verwendung bestimmt ist, kann unter Stickstoff oder anderem Inertgas abgefülltes Nährmedium enthalten und mit einem Dichtungsmittel, wie Paraffin, bedeckt sein.

Die wegwerfbaren Platten gemäß der Erfindung können aus jedem gewöhnlich dafür verwendeten Material sein, z.B. aus Glas, Kunststoff oder einem anderen synthetischen oder natürlichen Material. Sie können nach irgendwelchen bekannten Formtechniken hergestellt worden sein. Durch die Wahl eines geeigneten Materials kann die Vorrichtung auch zur überwachung von Radioaktivität verwendet werden, die durch Pyrolyse irgendeiner radioaktiven organischen Verbindung freigesetzt würde.

Die Fig. 5 bis 7 zeigen eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung. Während in der in den Fig. 1 bis 4 dargestellten Ausführungsform der die beiden Kammern verbindende Durchgang im Träger liegt, ist bei der in den Fig. 5 bis 7 dargestellten Ausführungsform.kein die Kammern 26 und 28 verbindender Durchgang im Trägerteil 30. Während der Lagerung schließt die klebende Abdeckung 32, die über der gesamten Kulturplatte liegt, das Kulturmedium und das Gasauffangmaterial in ihren jeweiligen Behältern dicht ab. Wenn die Platte beimpft werden soll, wird die Abdeckung 32 entfernt und verworfen. Nach dem Beimpfen wird eine neue, wegwerfbare Abdeckplatte 34 über den Träger 30 gebracht und selbstdichtend oder nach einer anderen Dichtungsmethode dichtend aufgebracht. Die neue

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Abdeckplatte 34 hat eine Reihe von Vertiefungen oder Durchgängen 36 auf ihrer Bodenseite, so daß, wenn die Abdeckung 34 über den Träger 3.0 gebracht wird, ein Durchgang 36 über einem Kammerpaar 26 und 28 zu liegen kommt und miteinander verbindet. So bietet die Abdeckplatte 34 einen individuellen oberen Raum für jedes Paar Kultur/Auffangbehälter 26 und 28. Gas, das von der Kulturzelle 26 freigesetzt wird, diffundiert zum Auffangmaterial in dem entsprechenden Auffangbehälter 28 und wird von diesem absorbiert. Der dichte Verschluß um die paarigen Auffang- und Kulturbehälter 26 und 28 verhindert eine Querkontamination benachbarter Auffangzellen. Diese Ausführungsform beseitigt die Notwendigkeit der Zapfen 22 zum Verhindern des Austretens von Gas oder Flüssigkeit zwischen den paarigen Kultur- und Auffangzellen während der Plattenlagerung, wie unter Bezugnahme auf die Fig. 3 und 4 beschrieben.

Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung ist in den Figuren 8 und 9 veranschaulicht. Diese Ausführungsform ist besonders brauchbar, wenn verhältnismäßig geringe Mengen an radioaktivem Gas aus dem Kulturbehälter vermutlich freigesetzt werden und für die quantitative Gasentwicklung ein photographischer Film verwendet werden soll.

Manche Mikroorganismen-Kulturen liefern bei ihrer Inkubation im Kulturbehälter Radioaktivitätswerte bis herab zu etwa 100 Zählimpulsen pro Minute, erfaßt durch das Zählen von Getterpolstern entweder in Geigerzählern oder in Flüssigkeits-Szintillationszählern. So geringe Strahlungswerte, insbesondere

von C, sind im allgemeinen nicht nachweisbar, wenn photoempfindliche Filme zur Aufzeichnung der Strahlung verwendet werden, es sei denn, sie werden mehrere Stunden, z.B. 10h oder länger, belichtet. Solche langen Belichtungszeiten sind nicht erwünscht, d.h., es ist wünschenswert, den Mikroorganismus in weniger als 1 h zu identifizieren. Dieses Problem wurde

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durch die in den Figuren 8 und 9 dargestellte Ausführungsform der Erfindung überwunden. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung ist anstelle gleicher Abmessungen des Auffangbehälters und des Kulturbehälters, wie in den Fig. 1 und 5 gezeigt, die Oberfläche des Auffangbehälters viel kleiner als die Oberfläche des Kulturbehälters.

Wie in den Fig. 8 und 9 gezeigt, ist ein Träger 40 mit einer Anzahl Kulturbehälter 42, Auffangbehälter 44 und Abdeckung 45 vorgesehen. Der Boden aller Auffangbehälter 44 wird durch ein Filterpolster 46 gebildet, das mit Gettermaterial, wie Bariumhydroxid, getränkt ist. In der dargestellten Ausführungsform erstrecken sich die Auffangbehälter durch den Träger, und das Filterpolster bildet den Boden der wegwerfbaren Platte. Es sei jedoch bemerkt, daß die Auffangbehälter nicht notwendigerweise ganz durch den Träger sich erstrecken müssen, d.h., sie können sich nur bis zur gleichen Tiefe wie die Kulturbehälter erstrecken, und Gettermaterial kann dann einfach in den Boden des Auffangbehälters gebracht werden. Ein Durchgang 48 verbindet jeden Kulturbehälter 42 und Auffangbehälter 44. Während die Durchgänge 48 in den Fig. 8 und 9 als im Träger angeordnet dargestellt sind, können sie natürlich auch in der Abdeckung angeordnet sein, wie zuvor unter Bezugnahme auf die Fig. 5 und 6 beschrieben. Eine Abdeckplatte ist so vorgesehen, daß ein luftdichter Verschluß eines jeden Satzes aus Kulturbehälter, Auffangbehälter und Durchgang entsteht.

Der weite, flache Kulturbehälter 42 induziert vollständige und rasche Gasfreisetzung nach dem Beimpfen und während der Inkubation. Die Getterflache ist jedoch viel kleiner als der Querschnitt des Kulturbehälters. Bei einem typischen Beispiel ist der Durchmesser des Kulturbehälters 42 10 mm, der Durchmesser des Auffang- oder Getterbehälters 44 3 mm und 0,02 ml Reaktionsmischung liegen im Kulturbehälter vor. Da die Fläche direkt mit dem Quadrat des Durchmessers variiert,

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ist die Getterflache nur etwa 10 % so groß wie die Querschnittsfläche des Kulturbehälters. So wird das von der Kultur gebildete Gas nun konzentriert und die Radioaktivität durch das Auffangen auf einer verhältnismäßig kleinen Fläche verstärkt. Während sich die vom Getter aufgefangene Gesamtradioaktivität nicht verändert hat, ist die Radioaktivität pro Flächeneinheit des Getterpolsters erheblich erhöht worden, d.h., auf etwa das Zehnfache.

Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird das Filterpolster 46 vom Boden der wegwerfbaren Platte genommen. Nimmt man an, daß X mikrobiologische Tests durchgeführt worden sind unter Verwendung von X Kulturbehältern und Auffangbehältern, liegen X Kreisflächen von auf dem Filterpolster aufgefangener Radioaktivität vor. Ein photographischer Film (Kodak Film Nr. 2485) mit einem ASA-Wert von 2000 wird in der in Fig. 10 dargestellten Weise dem Filterpolster ausgesetzt. So wird das Filterpolster 46 mit den nach oben weisenden radioaktiven Stellen auf einen Träger 52 gebracht. Der photographische Film 54 wird mit der Emulsionsseite nach unten mit dem Filterpolster in Berührung gebracht. Ein Gewicht 55 wird dann oben auf die Rückseite des Films gebracht. Nur 30 min Belichtungszeit liefern befriedigende Flecken auf dem Film, die bei entwickelten Radioaktivitätswerten bis herab zu 100 Zählimpulsen pro Minute (1000 dpm), erfaßt durch die Entwicklung radioaktiven Gases aus dem Kulturbehälter, quantitativ gemessen werden können. Der bevorzugte Arbeitsbereich ist 500 bis 25.000 Zählimpulse pro min.

Bei der praktischen Durchführung dieser Ausführungsform der Erfindung kann es notwendig sein, verschiedene Faktoren in Abhängigkeit von den Umständen einzustellen. Beispielsweise kann die Zeit, die der Film dem Getterpolster ausgesetzt wird, verändert werden, da die optische Dichte direkt proportional der Belichtungszeit innerhalb der Grenzen des Films ist.

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Für den Kodak-Film Nr. 2485 ist die maximale optische Dichte 2,0. Andere Filme können verwendet werden, indem demgegenüber die Belichtungszeit proportional zum Unterschied der ASA-Werte eingestellt wird. Zur Ermittlung der Belichtungszeit eines anderen Films zur Gewinnung vergleichbarer Ergebnisse kann die folgende Beziehung herangezogen werden:

(ASA)^t). = (ASA)₂ (t)₂, wobei ASA₁ 2000 ist (der ASA-Wert des Kodak-Films Nr. 2485), t.. ist 30 min, ASA₂ ist der ASA-Wert des anderen Films und t₂ ist die Belichtungszeit.

Der Durchmesser der Getterflache kann auf die Änderung der Konzentration aufgefangenen radioaktiven Gases pro Flächeneinheit und damit der Verstärkungsfaktor eingestellt werden. Für die Einstellung dieses Durchmessers gilt die folgende Beziehung:

(d²)₁(ZlZmIn)₁ = (d²)₂(ZI/min)₂

2
nach (d )₁ aufgelöst wird die Gleichung:

» ,(ZlZmIn)_{9 0}

(d^)₁ = ±. (d^Z)

(ZlZmIn)₁

2
wobei (d J₁ das Quadrat des Durchmessers der jeweiligen Get-

2 2

terfläche (d.h. 3 = 9), (d )₂ das Quadrat des Durchmessers der anderen Getterf lache, ,(ZlZmIn)₁ der Wert der Zählimpulse pro min ist, der mit d.. eine gegebene optische Dichte ergäbe, und ZlZmIn₂ZZlZmIn₁ der Verstärkungsfaktor der optischen Dichte ist, der sich aus der Änderung des Durchmessers von d₁ zu

d₂ ergäbe, (d ).. und der Verstärkungsfaktor würden dann ersetzt und die Gleichung nach d ₂ aufgelöst.

Beim Einstellen des Reaktionsgemische auf eine angemessene

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Entwicklung von CO₉ zu berücksichtigende Faktoren sind das spezielle radioaktive Substrat, die radioaktive Konzentration des Substrats im Reaktionsgemisch und die Reaktionsaus-

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beute (d.h., die pro Mol Substrat und Zeiteinheit entwickelten

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Mole CO₂). Weitere mit dem Reaktionsgemisch zusammenhängende Überlegungen sind die Inkubationszeit und die Abmessungen der Reaktionskammer. Das Volumen des Reaktionsgeniischs muß groß genug sein, um ein gleichförmiges Mischen aller Bestandteile sicherzustellen. Ein typisches Volumen ist 0,02 ml. Die Abmessungen des Kulturbehälters sollten eine verhältnismäßig große Oberfläche zulassen, um eine rasche Diffusion des entwickelten Gases zum Getter zu gewährleisten. Die Menge aufgefangenen Gases kann durch Ändern der Zeit oder der Temperatur der Inkubation der Reaktion geändert werden.

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Claims

23. Dezember 1980 18869 Patentansprüche

1. Vorrichtung zur Durchführung eines mikrobiologischen radiorespirometrischen Tests unter aeroben oder anaeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Träger mit einer Anzahl von Kammerpaaren, von denen eine Kammer jeden Paares ein radioaktiv markiertes Substrat enthält, das von wenigstens einigen Mikroorganismen unter Bildung eines radioaktiven Gases im Stoffwechsel verarbeitet werden kann, während die andere Kammer eines jeden Paares eine Einrichtung zum Auffangen radioaktiven Gases enthält, wobei die beiden Kammern eines jeden Paares über einen Durchgang miteinander in Verbindung stehen, der sich im oberen Teil der Kammern in diese öffnet, sowie eine Verschlußeinrichtung zum Schließen der Kammern und des Durchgangs, der im Träger oder in der Verschlußeinrichtung liegt, aufweist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchgang im Träger liegt.

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3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchgang in der Verschlußeinrichtung liegt.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktiv markierte

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Substrat ein C-markiertes Substrat ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Auffangen radioaktiven Gases Ba(OH)₂ umfaßt.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Querschnittsfläche
der eine Einrichtung zum Auffangen radiaktiven Gases enthaltenden Kammern der Paare wesentlich kleiner ist als die Querschnittsfläche der anderen Kammer in den Paaren.

7. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Material, das
Mikroorganismen enthalten kann, ein radioaktiv markiertes Substrat unter aeroben oder anaeroben Bedingungen im Stoffwechsel zu verarbeiten vermag, dadurch gekennzeichnet, daß das Material mit einem radioaktiv markierten Substrat in Berührung gebracht, jedes freigesetzte Gas aufgefangen, ein photographischer Film dem aufgefangenen Gas ausgesetzt und bestimmt wird, ob ein Fleck auf dem Film entstanden ist,
wobei die Entstehung eines Flecks ein Anzeichen für das Vorliegen von Radioaktivität ist, was wiederum anzeigt, daß
das Substrat vom Stoffwechsel eines Mikroorganismus verarbeitet worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, Is radioaktiv marki«
Substrat verwendet wird.

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daß als radioaktiv markiertes Substrat ein C-markiertes

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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ba(OH)_ umfassende Einrichtung zum Auffangen des Gases verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein radioaktiv markiertes Substrat mit gegebener Oberfläche verwendet wird, von der radioaktives Gas abgegeben werden kann, während eine Einrichtung zum Auffangen des Gases von verhältnismäßig kleiner Fläche, die unter der Hälfte der Fläche des radioaktiven Substrats liegt, verwendet wird, wodurch die Radioaktivität pro Flächeneinheit erhöht wird.

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