DE126206T1 - Cdns fuer glucoamylase. - Google Patents

Cdns fuer glucoamylase.

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DE126206T1 DE198484100834T DE84100834T DE126206T1 DE 126206 T1 DE126206 T1 DE 126206T1 DE 198484100834 T DE198484100834 T DE 198484100834T DE 84100834 T DE84100834 T DE 84100834T DE 126206 T1 DE126206 T1 DE 126206T1
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David Harrow Oakland California 94611 Gelfand
Michael Alan Oakland California 94602 Innis
James Henry Pinole California 94564 Meade
Jack H. Oakland California 94618 Nunberg
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Claims (25)

VOSSIUS ■ TAUCHNER J - HAUH SF-BERTSTR, 4, BOOO MÜNCHEN 8O -^ TEL. (088) 47 4-O 75 ^ EP 84100834.5 0Ί 26206 Cetus Corp. Deutsche übersetzung der Patentansprüche nach Art. 67(1) EPÜ Patentansprüche
1. Modifizierte DNA-Sequenz, dadurch g e -
kennzeichnet, daß sie für ein Glucoamylase-Protein aus Pilzen codiert oder deren einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen oder -Inversionen, daß sie sich von natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Quellen ableitet und daß: sie in der Lage ist, wenn sie mit einem gespaltenen Expressions-Vektor in richtiger Weise kombiniert wird, nach Transformation eines Wirtsorgan.ismus mit dem Vektor ein nicht natives Protein mit Glucoamylase-Enzymaktivität zu exprimieren.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA cDNA ist und wobei das Glucoamylase-Protein aus Pilzen, für das die Sequenz codiert, von den Spezies A. awamori oder A. niger stammt.
3. Sequenz nach Anspruch 2, wobei die Spezies A. awamori NRRL 15 271 ist und die DNA-Sequenz, in 5' nach 3'-Richtung, im wesentlichen die folgende ist:
GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT 30
ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC AGT CTC CTC
TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC CAG GCA ATT GTC CAG GGT
ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GGC TTC GGG CAA TGG CTG CTT ACG GAC ATT GTT TGG CCC CTC GCT CAA TAC TGG AAC CAG ACA AAT GGC TCG TCT TTC TTT ACG GTC GAA GGT AGT GCC TTC GCG TGG TGT GAT TCT CAG GCA CCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC ATT TCC CGG AAG GAC GCA AAC ACC GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC GCC GCA AGC AAC GGC TCC ATG GGC GAG CAG CTT TCC GCT CGC CTG CTG ACC GCC AAC AAC CGT TGG GGC GAG ACC TCT GCC AGC ACA TCT GCC ATT GGT ACC TAC CCG AGT ATC GTG GCT ACT GGC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC
TCC AGC - -" γ- CTC 0 126206 _ GCC TAC TCT GGT GAA CTG TCT GAG GGC GGT GCT TGG GGA ACT AAT GGC ACT GGT AGC ATG ATC GCC AGG AAC AGA ACT TCG ACC GCA GAC TAT GAT TAC ACC GAA TAT GTG GTT GCT GTG GAC CTG CGC GAA GTC GGA GCC GTC CTC TGG TCC GCC CTT ATT ATT CTC CAA CAC CTG TGC TCC ACG GCC AAC GGC TCG AGC CAG TCC GAA CTG GGA TGC TAC CAC AGC CGT CTG TCC ACC TTC GAT CCC ACC TTT CTC GAG GTT AGC ATC TCT TGC TCC GAC CTC AGT TTC CAG GAG TTC CGC AAG ACG TAC GTA GAC GGC GCT GTT GGT GCA GAG GAC AGC TAC AAC CCG GAC TCG TTG TAC AAC ACA GAT GCT GCC TAC AGC CAG TTG GCT GAT GTG GGG TAT AGT GAG GTC GTA ACT GGC CTG GTC TCT GAT GCT GAA GAT GCC ■ ACT GAG CAA AGC ATT AAG ACT CAC TTC CTG. ACC ATT GTG TAT TCT GAT TCC AAC GTC TAC GAC TCC GCT GCT . . GAC GTG CCC TGG TCT TGT GCT TCT CGT AGT GTG GTG CCT ACC GCG GCC AGC ACC ACT GGC ACC GCT TCG TGG AGC ACC AGC ACT GTC ACC ACC CCC GGC ACG ACG GCG ACT TCG AAG ACC
GCT AGC AAG ACC AGC ACC AGT ACG TCA TCA AGC TCC TGT ACC ACT CCC ACC GCC GTG GCT GTG ACT TTC GAT CTG ACA GCT ACC ACC ACC
TAC GGC GAG AAC ATC TAC CTG GTC GGA TCG ATC TCT CAG CTG GGT ο
GAC TGG GAA ACC AGC GAC GGC ATA GCT CTG AGT GCT GAC AAG TAC ACT TCC AGC GAC CCG CTC TGG TAT GTC ACT GTG ACT CTG CCG GCT GGT GAG TCG TTT GAG TAC AAG TTT ATC CGC ATT GAG AGC GAT GAC TCC GTG GAG TGG GAG AGT GAT CCC AAC CGA GAA TAC ACC GTT CCT
CAG GCG TGC GGA ACG TCG ACC GCG ACG GTG ACT GAC ACC TGG CGG
4. Ein DNA-Expressions-Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Promotor-Fragment, welches in einem Wirtsorganismus wirksam ist, und ein DNA-Segment mit einer modifizierten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis enthält, wobei das DNA-Segment sich in einer derartigen Orientierung zum Promotor-Fragment befindet, daß es im Wirtsorganismus unter Erzeugung eines nicht-nativen Glucoamylase-Proteins exprimiert wird.
5. Vektor nach Anspruch 4, wobei der Wirtsorganismus ein Bakterium, ein Virus oder eine Hefe ist.
6. Vektor nach Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus
E. coli ist.
7. Vektor nach Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus eine Hefe ist.
8. Vektor nach Anspruch 7, wobei die Hefe eine Spezies der Gattung Saccharomyces ist.
9. Vektor nach Anspruch 4, wobei das Glucoamylase-Protein aus Pilzen, für das die Sequenz codiert, von der Spezies A. awamori oder A. niger stammt.
10. DNA-Expressions-Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Promotor-Fragment, welches in einem Wirtsorganismus wirksam ist, und ein DNA-Segment mit einer modifizierten DNA-Sequenz nach Anspruch 3 enthält, wobei das DNA-Segment in derartiger Orientierung zum Promotor-Fragment vorliegt, daß es im Wirtsorganismus unter Erzeugung eines nicht nativen Glucoamylase-Proteins exprimiert wird.
11. Vektor nach Anspruch 4, welcher das Plasmid pGAC9 ist. 15
12. Wirtsorganismus, transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 4.
13. Wirt nach Anspruch 12, wobei der Wirtsorganismus ein Bakterium, ein Virus oder eine Hefe ist.
14. Wirt nach Anspruch 13, wobei der Wirtsorganismus E. coli ist.
15. Wirt nach Anspruch 13, wobei der Wirtsorganismus eine Hefe ist.
16. Wirt nach Anspruch 15, wobei die Hefe eine Spezies der Gattung Saccharomyces ist.
17. Ein Hefe-Wirt, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 11.
18. Hefe-Wirt nach Anspruch 17, wobei der Stamm C468 ist. 35
■"* O "~
19. Verfahren zur extrazellulären Sekretion eines Protein-Materials, gekennzeichnet durch die Züchtung eines Wirtsorganismus, welcher mit einem DNA-Expressionsvektor transformiert ist, der ein in dem Wirtsorganismus wirksames Promotorfragment, eine im wesentlichen die folgende Aminosäuresequenz aufweisende Signalsequenz :
MET SER PHE ARG SER LEU LEU ALA LEU SER GLY LEU VAL CYS THR
GLY LEU ALA ASN VAL ILE SER LYS ARG,
10
und ein für das Protein-Material codierendes DNA-Segment umfaßt, wobei das Protein-Material als ein Zeil-Protein gekennzeichnet ist, welches in seinem normalen Wirtsorganismus mit einer hydrophoben Signalsequenz synthetisiert wird, die normalerweise während der Sekretion aus ihrem normalen Wirtsorganismus abgespalten wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Protein-Material Glucoamylase ist.
21. Verfahren zur Herstellung von Glucoamylase, gekennzeichnet durch Züchtung des Wirtsorganismus nach Anspruch 12 in einem Kulturmedium.
22. Verfahren zur Verzuckerung von Stärke oder Oligosacchariden enthaltenden Stärkehydrolysaten, gekennzeichnet durch Behandlung der Stärke oder des Stärkehydrolysats mit einer Glucoamylase-Enzymzubereitung, wobei die Glucoamylase von dem Wirtsorganismus nach Anspruch 12 erzeugt worden ist.
23. Verfahren zur Erzeugung von Äthanol durch gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation, gekennzeichnet durch Züchtung, auf einer nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle, welche ein Substrat für Glucoamylase ist,
— b —
einer mit einem DNA-Expressionsvektor, welcher ein Promotor-Fragment und ein DNA-Segment mit einer modifizierten, für ein Glucoamylase-Protein aus Pilzen codierenden DNA-Sequenz umfaßt, transformierten Wirtsorganismus, wobei sich das DNA-Segment in einer derartigen Orientierung zum Promotor-Fragment befindet, daß es im Wirtsorganismus unter Erzeugung eines nicht nativen Glucoamylase-Proteiris exprimiert wird.
24. Verfahren nach Anspruch 19, 21, 22 oder 23, wobei der Wirtsorganismus eine Hefe ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Hefe eine
Spezies der Gattung Saccharomyces ist. 15
26« In einem Verfahren zur extrazellulären Sekretion eines Protein-Materials nach Anspruch 19 nützliche Signalsequenz mit im wesentlichen der folgenden Aminosäuresequenz .
MET SER PHE ARG SER LEU LEU ALA LEU SER GLY LEU VAL CYS THR GLY LEU ALA ASN VAL HE SER LYS ARG-
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