CZ20003789A3 - Mutované proteiny se sníženou alergenitou pro lidi a způsoby konstrukce, identifikace a produkce takovýchto proteinů - Google Patents

Description

Mutované proteiny se sníženou alergenitou pro lidi a způsoby konstrukce, identifikace a produkce takovýchto proteinů

Oblast techniky

Vynález se týká proteinů, které vyvolávají nižší alergickou reakci u lidí vystavených kontaktu s takovýmito proteiny, a testu předpovídajícího takovouto odpověď. Konkrétně se vynález týká nového vylepšeného mutantního proteinu, který ve srovnání s výchozím proteinem způsobuje velmi nízkou alergickou odpověď u lidí sensibilisovaných tímto proteinem v důsledku vystavení tomuto proteinu.

Dosavadní stav techniky

Průmyslové, farmaceutické a obchodní využití proteinů neustále narůstá. Toto všeobecné rozšíření a s ním související zvýšené vystavení vlivu proteinů způsobuje určité zdravotní risiko pro osoby sensibilisované těmito peptidy, u nichž následné setkání s proteinem způsobuje prudkou alergickou reakci, jež může být škodlivá či dokonce fatální. Je například známo, že proteasy mohou u některých jedinců způsobovat nebezpečnou přecitlivělost. To má za následek, že

2o navzdory užitečnosti průmyslového využití proteas, např. v pracích prášcích, kosmetice, zpracování textilií atd., a navzdory rozsáhlému výzkumu na tomto poli směrovanému k nalezení vylepšených proteas, které by např. dosahovaly účinnějšího odstraňování skvrn při použití pracích prášků, průmyslové využití proteas zůstává problematické právě pro jejich schopnost vyvolávat u některých lidí hypersensitivní alergickou reakci.

Ke zmírnění těchto problémů bylo vynaloženo velké úsilí. Mezi strategie směřující ke snížení imunogenního potenciálu plynoucího z • · · · • · ···· · · · • · ········· · · ~ · · ··· « · · . 2 .···· · ·· · ·· ··· používání proteas patří zlepšené výrobní procesy omezující případný kontakt tím, že na pracovištích se monitorují a minimalizují koncentrace prachových částic nebo aerosolů nesoucích proteasu ve vzduchu, vylepšené postupy granulace, jež snižují množství prachu nebo aerosolu vznikajícího z proteasového produktu, a dále zlepšené izolační postupy snižující množství potenciálně alergenních příměsí ve výsledném produktu. Snahy o snížení alergenity proteasy jako takové, však byly relativně neúspěšné. Alternativním řešením byly snahy maskovat v molekule proteasy epitopy, jež jsou u hypersensitivních jedinců rozpoznávány imunoglobuliny E (IgE) (PCT dokument WO 92/10755), nebo zvětšit, případně změnit charakter antigenních determinant problematické proteasy připojením polymerů nebo peptidů/proteinů.

O člověku říkáme, že je hypersensitivní, jestliže u něj nastává adaptivní imunitní reakce v přehnané nebo nevhodné formě. Hypersensitivní reakce jsou výsledkem imunitních reakcí, za normálních okolností prospěšných, které působí nevhodně a někdy způsobují zánětlivé reakce a tkáňové poškození. Tyto reakce mohou být vyvolány mnoha antigeny; příčina hypersensitivní reakce je nadto u jednotlivých osob rozdílná. Při prvním kontaktu s antigenem se hypersensitivita normálně neprojeví, ale obvykle se objeví při následném kontaktu. K jedné z forem hypersensitivity dochází, když je odpověď imunoglobulinů IgE namířena proti neškodným antigenům z okolního prostředí, jako jsou pyl, roztoči v prachu nebo částečky zvířecí srsti a pokožky. Žírné buňky po sensibilisaci molekulami IgE uvolňují farmakologické mediátory, což má za následek akutní zánětlivou reakci spojenou se symptomy, jako je astma nebo alergická rýma.

Strategie k zabránění prvotní sensibilisační reakce, spočívající v modifikaci vazebných míst pro IgE, není obecně úspěšná. Zatímco takovéto strategie snad neutralizují nebo snižují prudkost následné hypersensitivní reakce, nesnižují počet fakticky sensibilisovaných • · osob. Je-li například o nějakém člověku známo, že je hypersensitivní na nějaký antigen, pak jediný bezpečný způsob řešení takovéto situace je, co možná nejúplnější isolace dotyčné hypersensitivní osoby od případného kontaktu s daným antigenem. Jakékoli jiné řešení by mohlo být i nebezpečné pro zdraví hypersensitivního jedince. Omezit nebezpečí plynoucí z konkrétního proteinu pro hypersensitivní osobu je jistě důležité, avšak z hlediska průmyslového by bylo mnohem prospěšnější, kdyby protein v prvé řadě vůbec nebyl schopen iniciovat hypersensitivní reakci.

T lymfocyty (T buňky) hrají klíčovou roli při indukci a regulaci imunitních reakcí a při realisaci imunologických efektorových funkcí. Na těchto buňkách závisí specifická imunita proti infekčním agens a proti tumorům, a má se zato, že tyto buňky též přispívají k hojení poranění. Na druhé straně, poruchy v regulaci těchto odpovědí mohou vést k napadení vlastního těla. Antigen je T buňkám obecně předkládán buňkami nabízejícími antigen, které prostřednictvím různých mechanismů pohlcují a poté vystavují na svém povrchu antigeny nebo části antigenů způsobem, jež umožňuje rozpoznání antigenu T buňkou. Po rozpoznání specifického epitopu prostřednictvím receptorů na povrchu T buněk (tzv. T buněčných receptorů, TCR) zahájí T buňky řadu komplexních interakcí, včetně proliferace, které vedou nakonec k tvorbě protilátek v B buňkách. Zatímco T i B buňky jsou aktivovány antigenními epitopy daného proteinu nebo peptidu, skutečné epitopy rozpoznávané těmito mononukleárními buňkami jsou obecně odlišné. Epitop, který původně aktivoval T buňku při tvorbě imunologické diversity, dosti často nebývá shodný s epitopem, který je později v průběhu imunitní odpovědi rozpoznáván B buňkami. Co se tedy týče hypersensitivity, kritickým článkem při iniciaci imunitní odpovědi na kontakt s antigenem je specifická interakce mezi T buňkou a antigenem, kdežto pro následný vývoj plně rozvinuté alergické reakce často nejsou specifika této interakce, tzn. rozpoznaný epitop, relevantní.

• · · · • · • · · · · · · · . 4 * »· · ·· ···

V PCT dokumentu WO 96/40791 je uveden postup pro přípravu konjugátů polypeptidů s polyalkylenoxidy,’ jež mají sníženou alergenitu, a kde výchozím materiálem je polyalkylenoxid.

PCT dokument WO 97/30148 popisuje polypeptidový konjugát se sníženou alergenitou, který obsahuje jednu polymerní nosičovou molekulu, k níž jsou kovalentně připojeny dvě nebo více polypeptidových molekul.

PCT dokument WO 96/17929 popisuje postup přípravy polypeptidů se sníženou alergenitou, zahrnující krok konjugace 1 až 30 polymolekul k příslušnému výchozímu polypeptidů.

PCT dokument WO 92/10755 popisuje způsob přípravy variantních proteinů, které vyvolávají u zvířat sníženou imunitní odpověď. V přihlášce se studovaly proteiny, konkrétně série proteas a jejich varianty, které se použily k imunizaci potkanů. Získaná séra se pak použila ke stanovení reaktivity vytvořených polyklonálních protilátek přítomných v imunním séru namířeném proti studovanému proteinu a jeho variantám. Z těchto výsledků bylo možné určit, zda protilátky v preparátu byly více nebo méně reaktivní vůči proteinu a jeho variantám, což umožnilo posoudit, jaké změny v proteinu by pravděpodobně mohly neutralizovat nebo snížit vazbu Ig. Z těchto pokusů vyplynulo, že z 309 aminokyselinových zbytků subtilisinu, budou mít změny v pozicích 127, 128, 129, 130, 131, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 za následek změnu imunologických vlastností.

PCT dokument WO 94/10191 popisuje málo alergenní proteiny obsahující oligomerní formy výchozího monomerního proteinu, přičemž oligomer si v podstatě zachovává svoji aktivitu.

Dosavadní stav techniky poskytuje způsoby vedoucí ke snížení alergenity určitých proteinů a identifikaci epitopů, jež v některých jedincích vyvolávají alergické reakce, přičemž testy používané • · · · • · k identifikaci těchto epitopů obecně zahrnují měření protilátek IgE a IgG v krevních sérech jedinců vystavených tomuto antigenu. Nicméně, jakmile byla jednou Ig reakce iniciována, došlo již k sensibilisaci. Je tedy především žádoucí mít způsob na stanovení epitopů, které způsobují sensibilisaci, neboť neutralizací těchto epitopů se výrazně sníží možnost sensibilisace a tím tedy i možnost počáteční sensibilisace.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnout protein mající ve srovnání s výchozím proteinem snížený potenciál k vyvolání alergické reakce u lidí.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout variantu proteasy, která má aktivitu použitelnou v aplikacích, kde se běžně užívají proteasy, jako například v detergentech nebo při úpravě vlny proti plstnatění, v mýdle tekutém nebo kostkovém, v přípravcích na mytí nádobí, v čisticích roztocích nebo přípravcích pro kontaktní čočky, při hydrolyse peptidů, při zpracování odpadů, při úpravě textilu proti plstnatění, v kosmetických přípravcích a v přípravcích pro péči o pleť, nebo jako štěpící enzymy při produkci proteinů z fúzovaných prekursorů, přičemž tato varianta proteasy umožňuje bezpečnější užívání vzhledem k sníženému alergennímu potenciálu.

Vynález poskytuje způsob jak identifikovat v proteinech epitopy rozpoznávané T buňkami. V testu, kterým se podle vynálezu identifikují epitopy, se antigen nabízející buňky smíchají s naivními lidskými T buňkami a se studovaným peptidem. Podle výhodného provedení vynálezu zahrnuje postup na určení epitopů rozpoznávaného T buňkami tyto kroky: (a) získání suspense dendritických buněk a suspense naivních CD4+ a/nebo CD8+ T buněk z jednoho zdroje krve; (b) stimulování diferenciace v suspensi dendritických buněk; (c) smíchání suspensi řečených diferenciovaných • · • · · · • · • * · · · * «······

dendritických buněk a řečených CD4+ a/nebo CD8+ T buněk se studovaným peptidem; (d) změření proliferace Ť buněk z kroku (c).

Jiné provedení vynálezu poskytuje protein, ve kterém je epitop rozpoznávaný T buňkami modifikován takovým způsobem, aby se snížila, nebo výhodněji neutralizovala (eliminovala) schopnost T buněk identifikovat tento epitop. Poskytuje se tedy protein, který má sníženou alergenitu, přičemž tento protein obsahuje modifikaci sestávající ze substituce nebo delece aminokyselinových zbytků, jež byly identifikovány jako součást epitopu rozpoznávaného T buňkami.

Podle výhodného provedení vynálezu se v proteinu nebo peptidu určí epitop, který při rozpoznání T buňkou vede k proliferaci T buněk vyšší, než odpovídá pozadí. Tento epitop rozpoznávaný T buňkou se pak modifikuje tak, aby peptid obsahující tento epitop stimuloval v testu podle vynálezu nižší proliferaci, než protein obsahující nemodifikovaný epitop. Ve výhodnějším provedení vyvolává ve vzorku epitop určený k modifikaci třikrát vyšší proliferaci T buněk, než je proliferace odpovídající pozadí. Modifikovaný epitop pak ve vzorku stimuluje proliferaci T buněk nižší než trojnásobek proliferace odpovídající pozadí, výhodněji nižší než dvojnásobek pozadí, a nejvýhodněji stimuluje proliferaci T buněk, která je menší než, nebo v podstatě stejná, jako proliferace odpovídající pozadí.

Epitop je s výhodou modifikován jedním z následujících způsobů: (a) aminokyselinová sekvence epitopu je substituována analogickou sekvencí z lidského proteinu homologního k danému proteinu, tj. z lidského subtílisinu nebo jiné lidské proteasy podobné subtilisinu, jako jsou např. furin nebo kexiny (viz např. Methods in Enzymology, sv. 244 (1994), str. 175 a dále; Roebroek et al., 1986, EMBO J. 5:2197-2202; Tomkinson et al., 1991, Biochem. 30:168-174; Keifer et al., 1991, DNA and Cell Biol. 10:757-769); (b) aminokyselinová sekvence epitopu je substituována analogickou sekvencí z jiného než lidského proteinu homologního k danému proteinu, přičemž tato analogická sekvence vyvolává při rozpoznání • «· · ·· ···· · · ·· ·♦·· · · .

• · ·· ······· « · _ ·· ·»···♦ _ 7 _ ····· ·· · .. ...

T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u studovaného původního proteinu; (c) aminokyselinová” sekvence epitopu je substituována sekvencí, která v podstatě mimikuje hlavní rysy terciární struktury epitopu, ale vyvolává při rozpoznání T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u původního proteinu; nebo (d) jakoukoli sekvencí, která vyvolává při rozpoznání T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u původního proteinu.

Konkrétní provedení vynálezu poskytuje variantu proteasy, jež obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou substituci v pozici odpovídající zbytkům 170, 171, 172 a/nebo 173 v BPN', přičemž tyto substituce zahrnují změnu zbytku 170 na kyselinu asparagovou, změnu zbytku 171 na glutamin, změnu zbytku 172 na methionin a/nebo změnu zbytku 173 na kyselinu asparagovou. V nejvýhodnějším provedení substituce zahrnují změny zbytků 170, 171 a 173 na kyselinu asparagovou, glutamin a kyselinu asparagovou.

V dalším provedení vynálezu se poskytuje způsob produkce proteinu podle vynálezu, jenž má sníženou alergenitu. Mutantní protein se s výhodou získá prostřednictvím takové mutace DNA, jež kóduje výchozí protein, aby tato modifikovaná DNA kódovala mutovaný protein podle vynálezu.

V ještě dalším provedení vynálezu se poskytují DNA sekvence kódující mutovaný protein, jakož i expresní vektory obsahující takovéto DNA sekvence a hostitelské buňky transformované těmito vektory, přičemž tyto hostitelské buňky jsou s výhodou schopné exprimovat takovéto DNA a tak produkovat, intracelulárně nebo extracelulárně, mutantní protein podle vynálezu.

Mutovaný protein podle vynálezu lze použít v jakémkoli přípravku nebo postupu, ve kterých se obecně využívá výchoz? protein. Je-li například výchozím proteinem proteasa, pak proteasa se sníženou alergenitou může být použita jako součást čisticích prostředků jako jsou prací prášky a leštidla, jako pomůcka při • · · · • 4 zpracování kůže, při úpravě textilií jako vlny a/nebo hedvábí proti plstnatosti, jako složka přípravků osobní hygieny, kosmetických nebo pleťových krémů, a jako součást krmiv chovných a domácích zvířat ke zvýšení jejich nutriční hodnoty. Podobně, je-li výchozím proteinem amylasa, pak amylasa se sníženou alergenitou může být použita při ztekucování škrobu, jako součást prostředků na mytí nádobí, v avivážních prostředcích, v pracích prášcích, nebo pro jakýkoli účel, pro který je použití amylasy užitečné.

Jednou z výhod vynálezu je, že měřením proliferace T buněk io vyvolané rozpoznáním epitopu T buňkou, lze identifikovat peptidy, které obsahují epitopy zodpovědné za prvotní sensibilisaci jedince. Jinak řečeno, proliferace T buněk vyvolaná rozpoznáním epitopu T buňkami má za následek sensibilisaci jedince na dotyčný peptid nebo protein, který jej obsahuje. Neutralizace takovýchto sensibilisujících” epitopů rozpoznatelných T buňkami nutně povede k větší míře bezpečnosti osob přicházejících do styku s antigenem obsahujícím takovýto epitop, neboť nedojde k jejich prvotní sensibilisaci, čímž se předejde tvorbě lg protilátek, typických pro alergickou reakci, po následném kontaktu s antigenem.

Vynález je výhodný v tom, že umožňuje přípravu proteinů, včetně enzymů, které při použití představují pro osoby v kontaktu s nimi podstatně nižší riziko sensibilisace. Proteiny podle vynálezu tak mohou být například bezpečnější pro použití v kosmetických přípravcích, jako jsou pleťové krémy, v detergentech jako jsou prací prášky, v leštidlech a v přípravcích k namáčení prádla nebo při jakémkoli jiném použití proteinů, včetně enzymů, při kterém je lidský kontakt nevyhnutelný.

·· ···« .. . ·. · • · ···. ···· ·· ···· ··· • · ·· *······ · · * · ··· ··· ····· ·· · · · ··<

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A, B1, B2 a B3 znázorňují DNA (SEQ ID NO:1) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:2) sekvenci subtilisinu (BPN') Bacillus amyloliquefaciens a částečnou restrikční mapu příslušného genu.

Obr. 2 ukazuje konservované aminokyselinové zbytky v molekulách subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO:3) a Bacillus lentus (divoký typ) (SEQ ID NO:4).

Obr. 3A a 3B znázorňují porovnání aminokyselinových sekvencí proteas subtilisinového typu z Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (SEQ ID NO:5) a Bacillus lentus. Symbol * označuje nepřítomnost specifických aminokyselinových zbytků v porovnání se subtilisinem BPN'.

Obr. 4 ukazuje aditivní odpověď T buněk z 16 vzorků mononukleárních buněk periferní krve na peptidy odpovídající protease Bacillus lentus. Peptid E05 pokrývá oblast, v níž jsou obsaženy zbytky odpovídající aminokyselinám 170-174 v protease Bacillus amyloliquefaciens.

Obr. 5 ukazuje aditivní odpověď T buněk z 10 vzorků mononukleárních buněk periferní krve na peptidy odpovídající lidskému subtilisinu. Peptidy F10, F9, F8 a F7 obsahují aminokyselinovou sekvenci DQMD, jež odpovídá oblasti 170-173 v protease Bacillus amyloliquefaciens podle přiřazení sekvencí uvedeného v Obr. 3.

Obr. 6A a 6B/6C znázorňují aminokyselinové posloupnosti odpovídající peptidům odvozeným ze sekvence proteasy Bacillus lentus, resp. lidského subtilisinu.

Obr. 7 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci lidského subtilisinu (SEQ ID NO:6).

•9 ♦··· . _Λ * · ··· ··«

- 10 - ..... .......

Obr. 8 znázorňuje přiřazení aminokyselinových sekvencí proteasy BPN' (Bacillus amyloliquefaciens)', proteasy SAVINASY (Bacillus lentus) a lidského subtilisinu (S2HSBT).

Obr. 9 znázorňuje odpověď T buněk ze vzorku odebraného 5 jedinci hypersensitivnímu na proteasu Bacillus lentus na peptidy odvozené z proteasy Bacillus lentus. Peptid E05 představuje oblast odpovídající zbytkům 170-173 v protease z Bacillus amyloliquefaciens.

Obr. 10 znázorňuje odpověď T buněk ze vzorku odebraného io jedinci hypersensitivnímu na proteasu Bacillus lentus na sérii peptidů

E05 z proteasy Bacillus lentus, nesoucích různé substituce alaninem.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsob na identifikaci epitopů 15 rozpoznávaných T buňkami. Epitopy se v testu podle vynálezu identifikují následovně: diferencované dendritické buňky se smíchají s naivními lidskými CD4+ a/nebo CD8+ T buňkami a s testovaným peptidem. Přesněji řečeno, vynález poskytuje způsob, podle kterého stanovení epitopu rozpoznávaného T buňkou zahrnuje tyto kroky: (a) z téhož zdroje krve se získá suspense dendritických buněk a suspense naivních CD4+ a/nebo CD8+ T buněk; (b) v uvedené suspensi dendritických buněk se navodí diferenciace; (c) suspense diferencovaných dendritických buněk se smíchá s naivními CD4+ a/nebo CD8+ T buňkami a s testovaným peptidem; (d) změří se proliferace T buněk z kroku (c).

Daný peptid, který se má analyzovat v testu podle vynálezu je ' odvozen z proteinu nebo enzymu, u něhož je žádoucí nebo nutné snížení alergenity. Podle vynálezu je možné identifikovat přesně polohu epitopu, který by mohl působit sensibilisaci jednotlivce nebo skupiny jednotlivců. Podle obzvláště účinného provedení vynálezu se φ φ φφ φφ připraví série oligopeptidů, které odpovídají celému proteinu či enzymu, nebo jejich částem. Například se připraví peptidová knihovna pokrývající relevantní část proteinu nebo celý protein. Jeden obzvláště užitečný způsob přípravy peptidů se vyznačuje tím, že vnáší do peptidové knihovny překryv mezi peptidy; například první peptid odpovídá aminokyselinové sekvenci 1-10 příslušného proteinu, druhý peptid odpovídá aminokyselinové sekvenci 4-14 daného proteinu, třetí peptid odpovídá aminokyselinové sekvenci 7-17 daného proteinu, čtvrtý peptid odpovídá aminokyselinové sekvenci 10-20 daného w proteinu atd..., až jsou připraveny representativní peptidy odpovídající celé molekule proteinu. Individuální analýzou každého z peptidů v testu podle vynálezu je možné přesně stanovit polohu epitopů rozpoznávaných T buňkami. Ve shora uvedeném příkladu je možné na základě silnější reakce jednoho konkrétního peptidu ve srovnání s jeho sousedy zúžit centrum epitopové oblasti na tři aminokyseliny. Po stanovení polohy těchto epitopů je možné pozměňovat aminokyselinové zbytky v rámci každého epitopů, dokud peptid nevyvolává u T buněk méně výraznou odpověď.

Termínem buňka nabízející antigen”, jak se zde užívá, se rozumí buňka imunitního systému, která předkládá na svém povrchu antigen, který je rozpoznatelný receptory na povrchu T buněk. Příkladem buněk nabízejících antigen jsou dendritické buňky, aktivované B buňky a makrofágy.

Termínem proliferace T buněk”, jak se zde užívá, se rozumí počet T buněk vzniklých během společné inkubace T buněk s buňkami nabízejícími antigen, a to s antigenem nebo bez antigenu.

Termínem pozadí proliferace T buněk”, jak se zde užívá, se rozumí proliferace T buněk u jedince, normálně pozorovaná jako odpověď na kontakt s buňkami nabízejícími antigen v nepřítomnosti

3o peptidového nebo proteinového antigenu. Pro účely zde popisované, bylo tato hodnota pozadí proliferace T buněk stanovena ve vzorku pro • 4 4444

- 12 - ..... ......

každého jedince, jako proliferace T buněk inkubovaných v přítomnosti buněk nabízejících antigen bez přítomnosti antigenu.

Termínem epitop rozpoznávaný T buňkou” se rozumí strukturní rys peptidu nebo proteinu, který je rozpoznáván receptorem T buňky při iniciaci imunitní odpovědi na peptid obsahující tento epitop. Rozpoznání takovéhoto epitopu T buňkou obecně probíhá mechanismem, při kterém T buňky rozpoznávají peptidové fragmenty antigenů vázané k molekulám hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) třídy I nebo II, které jsou exprimovány na povrchu buněk io nabízejících antigen (viz např. Moeller, G., ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses, Immunological Review, Vol. 98, str. 187 (Copenhagen; Munksgaard) (1987).

Epitopy odhalené testem podle vynálezu se pak modifikují tak, aby se snížil alergenní potenciál zkoumaného proteinu. Ve výhodném provedení vynálezu vyvolává ve vzorku epitop určený k modifikaci třikrát vyšší proliferaci T buněk, než je proliferace odpovídající pozadí. Modifikovaný epitop pak ve vzorku stimuluje proliferaci T buněk nižší než trojnásobek proliferace odpovídající pozadí, výhodněji nižší než dvojnásobek pozadí, a nejvýhodněji stimuluje proliferaci T buněk, která je menší než, nebo v podstatě stejná jako proliferace odpovídající pozadí.

Epitop je s výhodou modifikován jedním z následujících způsobů: (a) aminokyselinová sekvence epitopu je substituována analogickou sekvencí z lidského proteinu homologního k danému proteinu; (b) aminokyselinová sekvence epitopu je substituována analogickou sekvencí z jiného než lidského proteinu homologního k danému proteinu, přičemž tato analogická sekvence vyvolává při rozpoznání T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u studovaného původního proteinu; (c) aminokyselinová sekvence epitopu je substituována sekvencí, která v podstatě mimikuje hlavní • · ·»·· ·· ·

- 13 Φ φ

φ φφφφ rysy terciární struktury epitopu, ale vyvolává při rozpoznání T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u původního proteinu; nebo (d) jakoukoli sekvencí, která vyvolává při rozpoznání T buňkami menší alergenní odpověď, než je tomu u původního proteinu.

Vzorek”, jak se zde užívá, obsahuje mononukleární buňky, které jsou naivní, tj. nejsou sensibilisované k předmětnému antigenu.

Homolog”, jak se zde užívá, znamená protein nebo enzym s podobným katalytickým účinkem, strukturou a/nebo použitím jako má sledovaný protein. Je žádoucí nalézt homolog, jenž má terciární a/nebo primární strukturu podobnou předmětnému proteinu, aby výměna epitopu v předmětném proteinu analogickým segmentem z homologu neznamenala příliš disruptivní změnu. Blízce homologní enzymy tak představují nejvhodnější zdroj substitucí epitopu. Výhodné též může být hledat zdroj substitucí, je-li to možné, mezi lidskými analogy daného proteinu. Například substituce specifického epitopu v bakteriálním subtilisinu sekvencí z lidského analogu subtilisinu (tzn. lidského subtilisinu) by měla vést ke snížení alergenity bakteriálního proteinu.

Analogická” sekvence se vyznačuje tím, že náhradní aminokyseliny, které poskytuje, vykazují podobnou funkci, terciární strukturu a/nebo konservované aminokyselinové zbytky jako aminokyseliny epitopu nebo okolí epitopu v dotyčném proteinu. Když tedy například epitopová oblast obsahuje alfa-helix nebo strukturu beta-listu, měly by náhradní aminokyseliny zachovat tuto specifickou strukturu.

Vynález se týká všech proteinů, u kterých je žádoucí snížit alergenitu, pro jednoduchost však bude v dalším popsána, jako obzvláště výhodné provedení vynálezu, modifikace proteasy. Proteasy patří mezi karbonylhydrolasy, které obecně štěpí peptidové vazby v proteinech nebo peptidech. Výrazem proteasa”, jak se zde užívá, se rozumí přirozeně se vyskytující proteasy nebo rekombinantní proteasy.

·· ··«· • · ···· ·· * * 9 9 9999999 9 • · 9 9 9 9 9

- 14 - ** * ·· · ..

Přirozeně se vyskytující proteasy zahrnují enzymy jako aaminoacylpeptidhydrolasa,peptidylaminoacylhyďrolasa, acylaminohydrolasa, serinová karboxypeptidasa, metalokarboxypeptidasa, thiolové proteinasy, karboxylproteinasa a metaloproteinasy. Zahrnuty jsou serínové, metalo-, thiolové a kyselé proteasy, jakož i endo- a exoproteasy.

Subtilisiny jsou proteasy bakteriálního nebo plísňového původu, které obecně štěpí peptidové vazby proteinů nebo peptidů. Subtilisin”, jak se zde užívá, znamená přirozeně se vyskytující nebo io rekombinantní subtilisin. Různé druhy mikroorganismů produkují, a často secernují, řadu přirozeně se vyskytujících subtilisinů. Aminokyselinové sekvence členů této skupiny nejsou zcela homologní. Subtilisiny této skupiny však vykazují stejný nebo podobný typ proteolytické aktivity. Tato třída serinových proteas obsahuje shodnou aminokyselinovou sekvenci určující katalytickou triádu, kterou se odlišují od třídy serinových proteas příbuzných chymotrypsinu. Jak subtilisiny, tak i chymotrypsinu podobné serinové proteasy obsahují katalytickou triádu sestávající z aspartátu, histidinu a šeřinu. V subtilisinech je pořadí aminokyselin katalytické triády, čteno od amino- ke karboxy- konci, aspartát-histidin-serin. U proteas příbuzných chymotrypsinu je však toto pořadí histidin-aspartát-serin. Subtilisinem se tedy zde rozumí serinové proteasy mající katalytickou triádu charakteristickou pro subtilisinové proteasy. Příklady zahrnují, ale bez omezení, subtilisiny zde uvedené v Obr.3. Obecně a pro účely vynálezu, odpovídá číslování aminokyselinových zbytků v proteasach číslům přiřazeným sekvenci maturního (tj. zralého) subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, uvedené v Obr. 1.

Rekombinantní subtilisin nebo rekombinantní proteasa” se týká subtilisinu nebo proteasy, u nichž DNA sekvence kódující

3o subtilisin nebo proteasu je modifikována za vzniku variantní (neboli mutantní) DNA sekvence, jež kóduje substituci, deleci nebo inserci jedné nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytující ·«·· ·· ·

- 15 • * · · • · · • · 9 9

9 9

9999 9

9999 • · aminokyselinové sekvenci. Vhodné postupy vedoucí k takovýmto modifikacím, které mohou být i kombinovány s postupy zde uvedenými, zahrnují způsoby uveřejněné v dokumentech US Patent 4,760,025 (RE 34,606), US Patent 5,204,015 a US Patent 5,185,258.

Jiné než lidské subtilisiny” a DNA, jež je kódují lze získat z mnoha prokaryotických a eukaryotických organismů. Vhodné příklady prokaryotických organismů zahrnují gramnegativní organismy jako jsou E. coli nebo Pseudomonas a grampositivní bakterie jako Micrococcus nebo Bacillus. Příklady eukaryotických organismů, z nichž lze získat io subtilisiny a jejich geny zahrnují kvasinky jako jsou Saccharomyces cerevisiae a houby jako např. zástupci rodu Aspergillus.

Výrazem lidský subtilisin” se rozumí proteiny lidského původu, které mají katalytickou aktivitu subtilisinového typu, např. kexinová rodina proteas lidského původu. Sekvence na Obr. 7 je příkladem takovéhoto proteinu. Pro účely vynálezu jsou dále považovány za lidské subtilisiny též deriváty nebo homology lidského subtilisinu, včetně těch, které jsou jiného původu než lidského, např. myšího nebo králičího, a které mají zachovanou základní schopnost hydrolyzovat peptidovou vazbu, přičemž vykazují alespoň 50%, s výhodou alespoň

65% a nejvýhodněji alespoň 80% homologii s proteinem uvedeným na

Obr. 7.

Proteasová varianta” má aminokyselinovou sekvenci, jež je odvozená z aminokyselinové sekvence výchozí proteasy”. Výchozí proteasy zahrnují přirozeně se vyskytující proteasy a rekombinantní proteasy. Aminokyselinová sekvence variantní proteasy je z aminokyselinové sekvence výchozí proteasy odvozená” substitucí, delecí nebo insercí jedné či více aminokyselin ve výchozí aminokyselinové sekvenci. Takovéto modifikace se zpravidla provádějí na úrovni prekurzorové DNA sekvence”, která kóduje aminokyselinovou sekvenci výchozí proteasy, a nikoli manipulací proteinové molekuly proteasy per se. Vhodné způsoby takovýchto ·♦ ·««· • · · ♦ · · ··· • · · · · · «· • * · · · ···» « · » _ . · · ·»· · ·

- 16 - ···· · ......

manipulací DNA sekvence zahrnují způsoby uvedené zde, jakož i způsoby známé osobám zběhlým v oboru (víz např. EP 0 328299, WO 89/06279 a US patenty a přihlášky zde již citované).

Číslování aminokyselinových zbytků zde užívané odpovídá 5 číslům přiřazeným aminokyselinové sekvenci maturního subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, uvedené v Obr. 1. Vynález však není omezen jen na mutace tohoto konkrétního subtilisinu, ale týká se i výchozích proteas obsahujících aminokyselinové zbytky v posicích, jež jsou ekvivalentní” konkrétním identifikovaným zbytkům io v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Podle výhodného provedení vynálezu je výchozí proteasou subtilisin z Bacillus lentus a substituce, delece a inserce se provádějí v ekvivalentních posicích subtilisinu B.

lentus, odpovídajících shora uvedeným aminokyselinovým zbytkům.

Zbytek (aminokyselina) výchozí proteasy je ekvivalentní 15 zbytku v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, je-li homologní (tj. zaujímá stejnou posici v primární nebo terciární struktuře), nebo analogický specifickému aminokyselinovému zbytku či jeho částí v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens (tzn. má stejnou nebo podobnou funkční schopnost ke kombinaci, reakci nebo chemické interakci).

Ke zjištění homologie v primární struktuře se aminokyselinová sekvence výchozí proteasy přímo porovnává s primární strukturou subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens a zejména s vybranými aminokyselinovými zbytky, jež jsou ve známých sekvencích subtilisinů invariantní. Například, Obr. 2 ukazuje konservované aminokyselinové zbytky v subtilisinu z B. amyloliquefaciens a B. lentus. Po vzájemném přiložení sekvencí v místech konservovaných zbytků, při kterém se povolí nezbytné inserce a delece nutné k zachování přiřazení (tj. nesmí dojít k eliminaci konservovaných zbytků arbitrární delecí nebo

3o insercí) se pak dají v přiložené sekvenci definovat zbytky ekvivalentní konkrétním aminokyselinám v primární sekvenci subtilisinu z B.

·♦ ····

;.·♦·· »«.· * , · »·»« * » , • » » » « *«·· « « « I * · · φ · φ φ ·

- 17 - ··*· · ·· · .« ..

amyloliquefaciens. Přiložení konservovaných zbytků by s výhodou mělo konservovat 100% takovýchto zbytků. Avšak k určení ekvivalentních zbytků je adekvátní i vzájemné přiložení sekvencí, jež poskytuje více než 75% nebo pouhých 50% konservovaných zbytků.

Konservace katalytické triády Asp32/His64/Ser221 by měla být zachována.

Například, aminokyselinové sekvence subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) a Bacillus lentus mohou být k sobě vzájemně w přiloženy tak, aby poskytovaly maximální homologii mezi aminokyselinovými sekvencemi. Porovnání těchto sekvencí ukazuje, že každá sekvence obsahuje velký počet konservovaných aminokyselinových zbytků. Zbytky konservované mezi BPN' a subtilisínem B. lentus jsou vyznačeny na Obr. 2.

Tyto konservované zbytky tak mohou být použity k určení ekvivalentních aminokyselinových zbytků, odpovídajících zbytkům subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, v jiných subtilisinech, jako např. v subtilisinu z Bacillus lentus (PCT dokument WO 89/06279 publikovaný 13. července 1989), což je výhodná výchozí proteasová molekula pro zde popisovaný vynález, nebo v subtilisinu označovaném PB92 (EP 0 328 299), který je vysoce homologní s výhodným subtilisínem Bacillus lentus. Aminokyselinové sekvence některých z těchto subtilisinů jsou v Obr. 3A a 3B přiřazeny k sekvenci subtilisnu Bacillus amyloliquefaciens tak, aby se dosáhlo maxima homologie konservovaných zbytků. Jak je patrné, v sekvenci subtilisinu Bacillus lentus je ve srovnání se sekvencí subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens určitý počet delecí. Pro Valí65 subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je tedy například ekvivalentní aminokyselinou v subtilisinu B. lentus a B. licheniformis isoleucin.

3o Například, v aminokyselinové posici +170 je lysin (K) v subtilisinu z B. amyloliquefaciens i B. licheniformis, kdežto ·· ·««· ··

« » · ···· · · • · · * »· · u Savinasy je v této posici arginin (R). V jednom provedení proteasových variant podle vynálezu je však ' aminokyselina v posici +170 subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens substituována kyselinou asparagovou (D). Zkratky a jednopísmenkový kód pro aminokyseliny jsou v tomto vynálezu v souladu s příručkou Patentln User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, str. 101.

Ekvivalentní zbytky” mohou být též definovány na základě homologie na úrovni terciární struktury výchozí proteasy, jejíž struktura byla určena proteinovou rentgenovou krystalografií. Za ekvivalentní io zbytky jsou pak definovány ty zbytky, pro které platí, že atomové koordináty dvou nebo více atomů hlavního řetězce konkrétního aminokyselinového zbytku výchozí proteasy a subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens (N na N, CA na CA, C na C, a O na O) se při vzájemném přiložení neliší o více než 0,13 nm, a s výhodou 0,1 nm.

Vzájemného přiložení je dosaženo, když se nejlepší model orientuje a umístí tak, aby poskytoval maximální překryv atomových koordinát nevodíkových atomů dotyčné proteasy a subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Nejlepší model je krystalografický model s nejnižším R faktorem pro experimentální difrakční data, získaná při nejvyšším dosaženém rozlišení.

Σ_λ I Fo(h) | -1 Fc(h)

R faktor

Z_h I Fo(h)

Ekvivalentní zbytky, jež jsou funkčně analogické specifickému zbytku v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens jsou definovány jako takové aminokyseliny výchozí proteasy, pro něž platí, že mohou zaujmout takovou konformaci, že buď mění, modifikují nebo přispívají k proteinové struktuře, vazbě substrátu nebo katalyse způsobem definovaným a připisovaným specifickému zbytku v subtilisinu Bacillus

- 439..:

• ····· · · • · · · ·· · « amyloliquefaciens. Dále jde o takové zbytky ve výchozí protease (pro níž byla určena terciární struktura pomocí ‘proteinové rentgenové krystalogragfie), které zaujímají posici analogickou do té míry, že i když atomy hlavního řetězce daného zbytku nesplňují kriteria ekvivalence z hlediska polohy v homologní posici, atomové koordináty alespoň dvou z atomů hlavního řetězce zbytku leží do 0,13 nm od odpovídajících atomů hlavního řetězce subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Koordináty trojrozměrné struktury subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens jsou uvedeny v dokumentu EPO No. 0 io 251 446 (odpovídá US Patentu 5,182,204, jehož zveřejnění je zde zahrnuto odkazem) a mohou být použity k stanovení ekvivalentních zbytků na úrovni terciární struktury, jak bylo naznačeno shora.

Některé z aminokyselinových zbytků identifikovaných k substituci, inserci nebo deleci jsou konservované, zatímco jiné nejsou. V případě zbytků, které nejsou konservované je náhrada jedné nebo více aminokyselin omezena na substituce, které dávají vznik variantě mající aminokyselinovou sekvenci, jež neodpovídá sekvenci vyskytující se v přírodě. V případě konservovaných zbytků by takovéto substituce zbytků neměly vést k přirozeně se vyskytující sekvenci. Proteasové varianty podle vynálezu zahrnují maturní formy proteasových variant, jakož i pro- a prepro- formy těchto proteasových variant. Výhodné konstrukce jsou prepro- formy, neboť umožňují expresi, sekreci a zrání (maturaci) proteasových variant.

Prosekvence” znamená sekvenci aminokyselin vázaných na

N-koncové části maturní formy proteasy a její odstranění vede k vytvoření maturní” formy proteasy. V přírodě se mnoho proteolytických enzymů vyskytuje ve formě proenzymů a jako takové jsou v nepřítomnosti posttranslačních úprav též exprimovány. Při produkci proteasových variant se jako výhodná prosekvence uplatňuje předpokládaná prosekvence subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, i když lze použít i prosekvence jiných proteas.

• · ·

- 30..:

Signální sekvence” nebo presekvence” znamenají jakoukoli sekvenci aminokyselin vázaných k N-koncové části proteasy nebo k Nkoncové části proproteasy, která může hrát úlohu v sekreci maturní formy nebo pro- formy proteasy. Toto je funkční definice signální sekvence a rozumí se jí všechny aminokyselinové sekvence kódované N-koncovou částí proteasového genu, které se podílejí na umožnění sekrece proteasy za nativních podmínek. Vynález využívá takovýchto sekvencí k zajištění sekrece proteasových variant, jak je zde definováno. Jedna možná signální sekvence zahrnuje prvních sedm aminokyselinových zbytků signální sekvence subtilisinu Bacillus subtilis fúzovaných ke zbytku signální sekvence subtilisinu Bacillus lentus (ATCC 21536).

Prepro-” forma proteasové varianty sestává z maturní formy proteasy, která je svým N-koncem funkčně spojena s prosekvencí, která je svým amino- koncem funkčně připojena k ”pre” nebo signální” sekvenci.

Expresní vektor” znamená DNA konstrukt, který obsahuje DNA sekvenci, jež je funkčně připojená k vhodné regulační sekvenci schopné řídit expresi této DNA ve vhodném hostiteli. Takovéto regulační sekvence zahrnují promotor k řízení transkripce, případně operátorovou sekvenci k regulaci této transkripce, sekvenci kódující vhodná místa pro vazbu mRNA k ribosomu a sekvence určující terminaci transkripce a translace. Jako vektor může sloužit plasmid, fágová částice, nebo, jednoduše, potenciální insert pro integraci do genomu. Po transformaci do vhodného hostitele se může vektor replikovat a fungovat nezávisle na hostitelském genomu, nebo se může v některých případech integrovat do genomu. V tomto textu se výrazy plasmid” a vektor někdy zaměňují, neboť v současnosti je nejběžněji užívanou formou vektoru plasmid. Vynález však zahrnuje všechny další formy expresních vektorů majících ekvivalentní funkci a které jsou nebo se stanou známými v oboru.

• ·· ·· · ··· · · · · • · · · · · · · · • · ·· ········ · _Λ·, · · · · · · ·

- 24·- · ·· · .....

Hostitelské buňky” používané ve vynálezu jsou zpravidla prokaryotícké nebo eukaryotické buňky, které byly s výhodou manipulovány způsoby uvedenými v dokumentu US Patent 4,760,025 (RE 34,606), čímž byly zbaveny schopnosti secernovat enzymaticky aktivní endoproteasy. Výhodným hostitelem pro expresi proteasy je kmen BG2036 rodu Bacillus, kterému chybí enzymaticky aktivní neutrální proteasa a alkalická proteasa (subtilisin). Konstrukce kmene BG2036 je podrobně popsána v dokumentu US Patent 5,264,366. Další hostitelské buňky k expresi proteasy zahrnují Bacillus subtilis io 1168 (rovněž popsaný v dokumentech US Patent 4,760,025 (RE 34,606) a US Patent 5,264,366, jejichž zveřejnění je zde zahrnuto odkazem), jakož i jakýkoli vhodný kmen rodu Bacillus, jako např. B.

licheniformis, B. lentus atd.

Hostitelské buňky se transformují nebo transfekují vektory, k jejichž konstrukci se používají techniky rekombinantní DNA. Takovéto transformované hostitelské buňky jsou schopné buď vektory kódující proteasové varianty replikovat, nebo požadovanou proteasovou variantu exprimovat. V případě vektorů kódujících prea prepro- formu proteasové varianty, jsou tyto varianty při expresi typicky secernovány hostitelskou buňkou do média.

Při popisu vzájemného vztahu dvou úseků DNA, znamená termín funkčně připojený”, že tyto dvě oblasti DNA jsou ve vzájmeném funkčním vztahu. Například presekvence je funkčně připojená k peptidu, jestliže působí jako signální sekvence a účastní se na sekreci maturní formy proteinu, přičemž velmi pravděpodobně dochází k odštěpení signální sekvence. Promotor je funkčně spojený s kódující sekvencí, jestliže řídí transkripci této sekvence; vazebné místo pro ribosom je funkčně připojeno ke kódující sekvenci, jestliže je umístěno takovým způsobem, aby umožňovalo translaci.

Geny kódující přirozeně se vyskytující výchozí proteasu mohou být získány obecnými postupy, které jsou známy osobám zběhlým v oboru. Obecně tyto metody zahrnují syntézu značených sond s předpokládanými sekvencemi kódujícími úseky dotyčné proteasy, konstrukci genomových knihoven z organismů exprimujících proteasu, a vyhledání dotyčného genu v knihovnách pomocí hybridisace se sondami. Positivně hybridisující klony jsou pak mapovány a sekvenovány.

Klonovanou proteasou se pak transformují hostitelské buňky, aby exprimovaly proteasu. Proteasový gen se liguje do plasmidu, pro který je charakteristický vysoký počet kopií. Tento plasmid se replikuje v hostitelích, tj. obsahuje dobře známé prvky regulace nezbytné pro replikaci piasmidů, dále promotor funkčně spojený s příslušným genem (může to být vlastní, homologní, promotor tohoto genu, pokud je rozpoznáván, tzn. transkribován hostitelem), signál pro terminaci transkripce a pro polyadenyiaci (nezbytnou pro stabilitu mRNA transkribované z . proteasového genu v některých eukaryotíckých hostitelských buňkách), který může být exogenní nebo endogenní součástí terminační oblasti proteasového genu, a selekční gen, jako např. gen resistence k antibiotiku, který umožňuje kontinuálně udržet plasmid v hostitelských buňkách tím, že kultivace probíhá v médiu obsahujícím antibiotikum. Plasmidy s vysokým počtem kopií dále obsahují sekvenci specifikující počátek replikace v hostiteli, čímž je zajištěno generování vysokého počtu piasmidů v cytoplasmě bez omezujícího vlivu chromosomu. V rozsahu vynálezu je však i možnost integrace mnoha kopií proteasového genu do hostitelského genomu.

To je možné v prokaryotických a eukaryotíckých organismech, které jsou obzvláště náchylné k homologní rekombinací.

V jednom provedení vynálezu může genem být přirozený gen, jako např. gen z B. lentus nebo B. amyloliquefaciens. Jinou možností je syntetický gen, kódující přirozeně se vyskytující proteasu nebo

3o proteasu mutovanou. V takovém případě se stanoví DNA a/nebo aminokyselinová sekvence výchozí proteasy. Poté se syntetizují četné, překrývající se jednořetězcové DNA fragmenty, které pak po ·· ···« hybridizaci a ligaci vytvoří syntetickou DNA, kódující výchozí proteasu. Příklad na sestavení syntetického genu je uveden v Příkladu 3 US Patentu 5,204,015, jehož uvedení je zde zahrnuto odkazem.

Po nakloňování přirozeně se vyskytujícího nebo syntetického genu výchozí proteasy se provede řada modifikací s cílem zvýšit využitelnost genu nad rámec syntézy přirozeně se vyskytující výchozí proteasy. Tyto modifikace zahrnují produkci rekombinantních proteas, uvedenou v dokumentech US Patent 4,760,025 (RE 34,606) a EPO No. 0 251 446, a produkci proteasových variant popsanou zde.

io Následující kazetový způsob mutageneze lze použít k usnadnění konstrukce proteasových variant podle vynálezu, i když lze použít i jiné způsoby. Nejprve se získá gen kódující přirozeně se vyskytující proteasu, a celý nebo zčásti se osekvenuje. Pak se v sekvenci kódovaného enzymu vyhledá místo, kde by bylo žádoucí provést mutaci (deleci, inserci nebo substituci) jedné nebo více aminokyselin. Sekvence ohraničující toto místo se vyhodnotí z hlediska přítomnosti restrikčních míst na překlenutí příslušného krátkého úseku genu směsí oligonukleotidových duplexů, které by při expresi kódovaly různé mutanty. Tato restrikční místa by s výhodou měla být v rámci proteasového genu unikátní, aby se umožnila náhrada příslušného genového segmentu. Může se však použít jakékoli výhodné, v proteasovém genu nepříliš časté restrikční místo, za podmínky, že genové fragmenty vzniklé restrikčním štěpením lze zpětně sestavit ve správném pořadí. Jestliže se v rozumné vzdálenosti (10 až 15 nukleotidů) od zvoleného bodu nenacházejí restrikční místa, lze je vytvořit záměnami nukleotidů v genu tak, aby se ve výsledném konstruktu nezměnil ani čtecí rámec, ani kódované aminokyseliny. Mutace genu za účelem změny sekvence na požadovanou sekvenci se dosahuje obecně známými postupy v systému M13 extenzí primeru.

3o Nalezení vhodných lemujících oblastí a vyhodnocení potřebných změn nutných k vytvoření sekvencí dvou výhodných restrikčních míst je rutinní záležitost díky degeneraci genetického kódu, známé restrikční ·· ··♦·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9999 999 9

9 9 9 9 9 9 9

- 24*·-.........

mapě genu a velkému počtu různých restrikčních enzymů. Nachází-li se v jedné přiléhající oblasti výhodné restrikční místo, shora popsaný postup se použije pouze pro tu přiléhající oblast, která neobsahuje restrikční místo.

Po nakloňování přirozeně se vyskytující nebo syntetické DNA se příslušnými restrikčními enzymy štěpí restrikční místa ohraničující posice, které budou mutovány, a do genu je ligováno velké množství oligonukleotidových kazet s komplementárními konci. Mutageneza je tímto postupem zjednodušena, neboť všechny nukleotidy mohou být io syntetizovány tak, aby měly stejná restrikční místa a k vytváření restrikčních míst není potřeba používat syntetické linkery.

V jednom aspektu je cílem vynálezu získání variantní proteasy, jež má ve srovnání s výchozí proteasou změněný alergenní potenciál, neboť snížení tohoto potenciálu umožňuje bezpečnější využívání enzymu. Zatímco bezprostředně je tento vynález užitečný z hlediska sníženého alergenního potenciálu, zde popsané mutace mohou být využity v kombinaci s mutacemi již známými v oboru, které ve srovnání s výchozím enzymem vedou k změněné termální stabilitě a/nebo změněné substrátové specifitě, modifikované aktivitě nebo změněné stabilitě vůči alkáliím.

Vynález tedy směřuje ke změně schopnosti epitopu rozpoznávaného T buňkami, který zahrnuje aminokyselinové zbytky 170-173 v protease Bacillus lentus, indukovat proliferaci T buněk. Obzvláště výhodné provedení vynálezu zahrnuje uskutečnění modifikace v jedné nebo všech z možností R170D, Y171Q a/nebo N173D. Podobně, jak bylo podrobně probráno shora, má se zato, že modifikace odpovídajících zbytků v jakékoli protease povede v této protease k neutralizaci klíčového epitopu rozpoznávaného T buňkami. Kombinace zde zveřejněných mutací v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům 170-173 a substituce v posicích odpovídajících N76D/S103A/V104I/G159D, případně v kombinaci ·· ·♦·· «» · ·· · * · · · · · · • · « » · · *· « • « * · · ··«· · · · · • · · · · · · ·

- 25* - * ** ......

s jednou nebo více substitucemi vybranými ze skupiny sestávající z posic odpovídajících V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, a T260A v subtilisinu B. amyloliquefaciens tedy může být použita u variantní proteasy podle vynálezu vedle snížení alergenního potenciálu k modulaci celkové stability a/nebo proteolytické aktivity enzymu. Podobně, zde poskytnuté substituce mohou být kombinovány s mutací asparaginu (N) v ekvivalentní pozici +76 subtilisinu B. lentus na kyselinu asparagovou (D) v kombinaci s mutacemi S103A/V104I/G159D a případně v kombinaci s jednou nebo více substitucemi vybranými ze skupiny sestávající z posic odpovídajících V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, a T260A v subtilisinu B. amyloliquefaciens za vzniku mutovaného enzymu se zvýšenou stabilitou a/nebo zvýšenou aktivitou.

Nejvýhodnější provedení vynálezu zahrnují následující specifické kombinace substituovaných zbytků odpovídajících posicím: N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245 R;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236 H/Q245R/T260A v subtilisinu B. amyloliquefaciens. Tyto substituce se s výhodou provádějí v subtilisinu B. lentus (rekombinantním nebo přirozeném), avšak mohou být provedeny v jakékoli protease rodu Bacillus.

Na základě systematického porovnání výsledků získaných s variantními proteasami lze říci, že shora uvedené mutace v subtilisinu B. amyloliquefaciens jsou důležité pro proteolytickou aktivitu, výkonnost a/nebo stabilitu těchto enzymů a pro čistící a prací účinek takovýchto variantních enzymů.

· · · · · · · . 26··- · ·· · ·· ···

Mnohé z proteasových variant podle vynálezu jsou užitečné pro sestavování různých detergentových přípravků. V přípravcích obsahujících mutované proteasy podle vynálezu se jako vhodný surfaktant může uplatnit řada známých sloučenin. Tyto zahrnují neionické, anionické, kationické nebo zwitterionické detergenty, jak bylo zveřejněno v dokumentu US 4,404,128 uděleném Barry J. Andersonovi a v dokumentu US 4,261,868 uděleném Jiri Florovi et al. Vhodný přípravek detergentu popisuje Příklad 7 v US Patentu 5,204,015 (dříve již zahrnutého odkazem). V oboru jsou známy různé přípravky, které se mohou používat jako čisticí prostředky. Je jasné, že proteasové varianty podle vynálezu mohou být vedle typických čisticích prostředků využity k jakémukoli účelu, ke kterému se používají přirozené proteasy nebo proteasy divokého typu. Tyto varianty tedy například mohou najít uplatnění v mýdle tekutém nebo kostkovém, v přípravcích na mytí nádobí, v čisticích roztocích nebo přípravcích pro kontaktní čočky, v hydrolyse peptidů, v zpracování odpadů, v úpravě textilií, jako štěpící enzymy při produkci proteinů z fúzovaných prekursorů atd. Varianty podle vynálezu mohou vedle snížené alergenity vykazovat zvýšenou výkonnost v pracích prostředcích (ve srovnání s výchozí proteasou). Zvýšenou výkonností v pracím prostředku se zde rozumí zvýšení pracího účinku na některé skvrny citlivé k enzymům, jako např. trávu nebo krev, stanovenou při obvyklém vyhodnocení po standardním pracím cyklu.

Proteasy podle vynálezu se mohou přidávat do známých práškových nebo tekutých pracích prostředků, majících pH mezi 6,5 a 12,0, v množstvích, vyjádřených váhovými procenty, 0,01% až 5% (s výhodou 0,1% až 0,5%). Tyto prací a čisticí prostředky mohou též obsahovat jiné enzymy, jako například známé proteasy, amylasy, celulasy, lipasy nebo endoglykosídasy, jakož i plnidla a stabilizátory.

Přidávání proteas podle vynálezu k běžným čisticím prostředkům nepředstavuje žádné omezení využití. Jinak řečeno, jakákoli teplota a hodnota pH vhodná pro detergent je rovněž vhodná • · • · · · pro prostředek podle vynálezu, pokud je pH v rámci shora uvedeného rozsahu a teplota pod popsanou teplotou denaturace proteasy. Kromě toho mohou být proteasy podle vynálezu použity v čisticích prostředcích bez detergentů, opět buď samotné nebo v kombinaci s plnidly a stabilizátory:

Variantní proteasy podle vynálezu mohou být součástí krmiv pro zvířata, jako např. součástí přísad krmiv, jak je např. popsáno v dokumentech US 5,612,055; US 5,314,692; a US 5,147,642.

Jedním aspektem vynálezu je prostředek na zpracování textilií, io který obsahuje variantní proteasy podle vynálezu. Prostředek může být například používán při zpracování hedvábí nebo vlny, jak je např. popsáno v dokumentech RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359;

a EP 344,259.

Následující text slouží jako příklady, které nelze chápat jako 15 omezení rozsahu nároků.

Varianty mohou být systematicky testovány na proteolytickou aktivitu s použitím metod dobře známých v oboru. Výhodné proteasové varianty zahrnují četné substituce v pozicích odpovídajících:

N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;

V68A/N76D/S103A/V104Í/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/

Q245R;

V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236 H/Q245R/T260A v subtilisinu B. amyloliquefaciens.

Všechny citované publikace a patenty jsou zde v úplnosti zahrnuty odkazem.

• ·

- 28»

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Test na identifikaci peptidových epitopů rozpoznávaných T buňkami s použitím naivních lidských T buněk

Čerstvé lidské buňky periferní krve byly odebrány od naivních” dárců, tj. osob, u kterých se nepředpokládal kontakt nebo sensibilisace proteasou B. lentus, za účelem určení antigenních epitopů v protease B. lentus a v lidském subtilisinu. Termínem naivní dárce se rozumí jedinec, který v minulosti nebyl vystaven kontaktu s proteasou a nevyvinula se u něj reakce na proteasu. Mononukleární buňky periferní krve (skladované při pokojové teplotě, ne starší 24 hodin) se k použití připravily následujícím způsobem: Přibližně 30 ml roztoku s preparátem buffy coat” získaným z jedné jednotky plné krve bylo doplněno do 50 ml Dulbeccovým roztokem PBS (DPBS), a rozděleno do dvou kyvet. Vzorky byly při pokojové teplotě podvrstveny

12,5 ml hustotního separačního lymphoprep” média (Nycomed o hustotě 1,077 g/ml). Kyvety se centrifugovaly třicet minut při 600xg. Mezivrstva mezi dvěma fázemi byla odebrána, spojena a promyta v DPBS. Hustota buněk ve výsledném roztoku byla změřena pomocí hemocytometru. Životnost buněk byla stanovena na základě testu s barvením trypanovou modří.

Z takto získané suspense byla připravena buněčná kultura diferencovaných dendritických buněk ze vzorku mononukleárních buněk periferní krve o hustotě 10⁸ buněk na 75 ml média v kultivační lahvi následovným způsobem:

(1) 50 ml bezsérového AIM V média (GIBCO) bylo doplněno βmerkaptoetanolem (GIBCO) v ředění 1:100. Lahve byly ponechány ležet naplocho dvě hodiny při 37°C v 5% CO2, aby se umožnilo přichycení monocytů ke stěně lahve.

(2) Diferenciace monocytů na dendritické buňky probíhala takto: neadherentní buňky byly odstraněny a ke zbývajícím adherentním buňkám (monocytům) bylo přidáno 30 ml AIM V média, 800 • ·

- 29·*·

jednotek/ml GM-CSF (Endogen) a 500 jednotek/ml IL-4 (Endogen); výsledná směs byla kultivována 5 dnů při 37~°C v 5% CO₂. Po pěti dnech byly přidány cytokiny, TNFa (Endogen) do koncentrace 0,2 jednotky/ml, a IL-1a (Endogen) do koncentrace 50 jednotek/ml. Kultivace pak pokračovala při 37°C v 5% CO₂ další dva dny.

(3) Sedmý den byl přidán Mitomycin C do výsledné koncentrace 50 pg/ml, aby se zastavil růst kultury nyní již diferencovaných dendritických buněk. Roztok byl inkubován 60 minut při 37°C v 5% CO₂. Dendritické buňky byly stěrkou mechanicky jemně uvolněny z povrchu kultivační lahve a adherentní a neadherentní buňky pak byly zcentrifugovány 5 minut při 600xg, promyty v DPBS a spočítány.

(4) Takto připravené dendritické buňky byly nasazeny do 96jamkové destičky s kulatým dnem jamek, v koncentraci 2x10⁴ buněk v 100μΙ AIM V média na jamku.

CD4+ T buňky byly připraveny ze zamražených alikvotů buněk periferní krve, které byly použity k přípravě dendritických buněk, s použitím soupravy CD4+ Cellect Kit (Biotex) podle návodu výrobce, s následujícími modifikacemi: alikvoty byly rozmraženy a promyty tak, aby na kolonku Cellect přišlo přibližně 10⁸ buněk; buňky byly resuspendovány v 4 ml DPBS a 1 ml reagencie Cell ze soupravy Cellect Kit a roztok byl ponechán 20 minut při pokojové teplotě. Výsledná suspense pak byla centrifugována pět minut při 600xg při pokojové teplotě, peleta byla resuspendována ve 2 ml DPBS a roztok nanesen na kolonku Cellect. Protékající podíl byl sbírán do DPBS obsahujícího 2 % lidského séra. Výsledná suspense CD4+ buněk byla centrifugována, resuspendována v AIMV médiu a byla spočítána hustota buněk.

Suspense CD4+ T-buněk byla médiem AIM V upravena na hustotu 2x10⁶/ml, aby se usnadnila manipulace ve formátu 96-jamkové destičky.

• ·

Peptidový antigen se připravoval z 1M zásobního roztoku v DMSO ředěním 1:10 v AIM V médiu. Z tohoto roztoku se pipetovalo 10 μΙ do každé jamky 96-jamkové destičky obsahující diferencované dendritické buňky. Do každé jamky bylo dále přidáno 100 μΙ zředěné suspense CD4+ T buněk připravených, jak uvedeno shora. Užitečné kontrolní vzorky zahrnovaly ředěný DMSO jako slepé kontroly a tetanový toxoid jako positivní kontroly.

Konečné koncentrace v každé jamce byly při výsledném objemu 210 μΙ:

ίο 2x10⁴ CD4+

2x10⁵ dendritické buňky (R:S v poměru 10:1) mM peptid

Příklad 2: Identifikace epitopů rozpoznávaných T buňkami v protease 5. lentus a v lidském subtilisinu

Peptidy pro potřeby testu popsaného v Příkladu 1 byly připraveny na základě aminokyselinových sekvencí proteasy B. lentus a lidského subtilisinu. Peptidové antigeny byly navrženy takto: podle aminokyselinové sekvence plné délky lidského subtilisinu nebo

2o proteasy B. lentus, které jsou uvedeny na Obr. 1, byly syntetizovány 15-mery, přičemž každý 15-mer se až na tři zbytky překrýval s předcházejícím a následujícím 15-merem.

Použité peptidy odpovídají aminokyselinovým sekvencím proteasy B. lentus (uvedené na Obr. 8) a lidského subtilisinu (uvedené na Obr. 7). Použité peptidy odvozené ze sekvencí proteas jsou uvedeny na Obr.6. Všechny testy byly provedeny minimálně v duplikátech. Všechny testy vykazovaly v positivní kontrole silnou reakci na tetanový toxoid. V každém experimentu byly odpovědi průměrovány a pak normalizovány vzhledem k hodnotě pozadí. Za • · · ·

- 31« positivní byla odpověď považována, jestliže byla rovna minimálně trojnásobku odpovědi pozadí.

Vyhodnocení imunogenní odpovědi (tj. proliferace T buněk) na peptidy navržené podle lidského subtilisinu a proteasy B. lentus je uvedeno na Obr. 4, resp. Obr. 5. Proliferace T buněk se měřila metodou inkorporace tritia. Výsledky jsou uvedené na Obr. 4 a 5 jako srovnání imunogenní aditivní odpovědi na různé peptidy u 10 jedinců (Obr. 4) a 16 jedinců (Obr.5). Odpověď je vyznačena jako přičítaná odpověď, přičemž hodnota 1,0 představuje odpověď odečtenou pro pozadí u každého vzorku. Na Obr. 4 tak hodnota 10,0 nebo nižší představuje odpověď pozadí a na Obr. 5 představuje odpověď pozadí hodnota 16,0 nebo nižší.

Jak ukazují Obr. 4 a 5, imunogenní odpověď vzorků naivních buněk z nesensibilisovaných jedinců vykazuje výraznou alergenní odpověď na peptidový fragment z B. lentus, který odpovídá zbytkům 170-173 proteasy B. amyloliquefaciens. Podle očekávání odpovídající fragment lidského subtilisinu vyvolává pouze odpověd pozadí.

Obr. 9 ukazuje odpověď T buněk na peptidy odvozené z proteasy B. lentus v případě vzorku odebraného od jedince hypersensitivního vůči protease B. lentus. Peptid E05 představuje oblast odpovídající zbytkům 170-173 proteasy B. amyloliquefaciens. Jak je vidět na Obr. 9, buňky hypersensitivního jedince silně odpovídaly na epitop rozpoznávaný T buňkami, který je v tomto případě representován peptidem E05. Tento výsledek potvrzuje, že pomocí testu podle vynálezu je možné předpovědět hlavní epitopy rozpoznávané T buňkami hypersensitivního jedince.

Obr. 10 ukazuje odpověď T buněk jedince hypersensitivního vůči protease B. lentus na peptid E05 odvozený z proteasy B. lentus, ve kterém byly provedeny různé substituce alaninem. Substituce alaninem byly zavedeny s cílem určit roli specifických zbytků v epitopu. Popis v Obr. 10 souvisí s pozicí v peptidu, ve které byla ·· · · provedena substituce alaninem, tzn. pro peptid E06 (sekvence GSISYPARYANAMAV) změna G na A = 2, Sna A = 3, I na A = 4, S na A = 5, Y na A = 6, P na A = 7, R na A = 8, Y na A = 9, N na A = 10, M na A = 11, a V na A = 12. Jak ukazuje Obr. 10, každá ze substitucí

R170A, Y171A a/nebo N173A v protease B. lentus vede u vzorku buněk z krve hypersensitivního jedince k dramatickému snížení odpovědi.

Z těchto výsledků je zřejmé, že pro odpověď T buněk jsou v tomto peptidu kritické aminokyselinové zbytky 170, 171 a 173. Proto io je také dále zřejmé, že tyto zbytky jsou do velké míry zodpovědné za iniciaci alergické reakce vůči protease z B. lentus.

Zastupuje:

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Proteasová varianta obsahující substituci v jedné nebo více pozicích výchozí proteasy, jež odpovídají K170D, Y171Q a/nebo S173D subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens.
2. 2. Proteasová varianta podle nároku 1, dále obsahující substituci v jedné nebo více pozicích výchozí proteasy, jež jsou ekvivalentní pozicím vybraným ze skupiny sestávající z N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, a T260A.
3. 3. Proteasová varianta podle nároku 2, která je odvozená ze subtilisinu rodu Bacillus.
4. 4. Proteasová varianta podle nároku 3, která je odvozená ze subtilisinu z Bacillus lentus nebo subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens.
5. 5. DNA kódující proteasovou variantu podle nároku 1.
6. 6. Expresní vektor obsahující DNA podle nároku 5.
7. 7. Hostitelská buňka transformovaná expresním vektorem podle nároku 6.

   ·· ····

   ·· ···· ·· · • · · · · · * * · * 9 * • · · • · · · * · · · ····· O-/1? · · · · - · ·· · • · · • · · · • · · • · · · · 8. Čisticí prostředek vyznačující se obsahuje proteasovou variantu podle nároku 1: tím, že 9. Krmivo pro zvířata, vyznačující se 5 obsahuje proteasovou variantu podle nároku 1. tím, že 10. Prostředek pro úpravu textilií, vyznačující se tím, že obsahuje proteasovou variantu podle nároku 1.

   ίο 11. Proteasová varianta podle nároku 1 obsahující kombinace substitucí vybrané ze skupiny sestávající z pozic odpovídajících K170D/Y171Q/S173D; N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S17 3D;V68A/N76D/SI03A/V104l/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;

   V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/ is Q245R;

   V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H /Q245R; a

   V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V /Q236H/Q245R/T260A v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens.
8. 12. Způsob určení epitopů rozpoznávaných lidskými T buňkami, vyznačující se tím,že zahrnuje kroky:

   (a) získání suspense dendritických buněk a suspense naivních CD4+ a/nebo CD8+ T buněk z jednoho zdroje krve;

   25 (b) navození diferenciace v řečené suspensi dendritických buněk;

   (c) smíchání suspensi řečených dendritických buněk a řečených naivních CD4+ a/nebo CD8+ T buněk se zkoumaným peptidem;

   *· 4 «4 » 4 4 4 « • 4 4 4 · « » 4 4444 44 · » 4 4 4 « ·· 4 44

   44 4444

   - 3&· (d) změření tvorby protilátek v kroku (c).
9. 13. Způsob snížení alergenity proteinu, vyznačující se t í m , ž e zahrnuje kroky:

   5 (a) identifikaci epitopu rozpoznávaného T buňkami v řečeném proteinu;

   (b) modifikaci tohoto proteinu za účelem neutralizace příslušného epitopu rozpoznávaného T buňkami.

   io
10. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m , ž e tento epitop se modifikuje:

    (a) substituováním aminokyselinové sekvence epitopu analogickou sekvencí z lidského homologu původního proteinu;

    (b) substituováním aminokyselinové sekvence epitopu
11. 15 analogickou sekvencí z jiného než lidského homologu daného proteinu, přičemž tato analogická sekvence vyvolává menší alergenní odpověď T buněk, než je tomu u původního proteinu; nebo (c) substituováním aminokyselinové sekvence epitopu sekvencí, která v podstatě mimikuje hlavní atributy terciární struktury

    20 epitopu, ale vyvolává menší alergenní odpověď T buněk, než je tomu u původního proteinu.

    15. Protein se sníženou alergenitou, vyrobený způsobem podle nároku 14.
12. 16. Protein se sníženou alergenitou, přičemž tento protein obsahuje modifikaci zahrnující substituci nebo deleci • ♦ ··· · ·· ·

    - 30· aminokyselinových zbytků, jež byly testem podle nároku 13 identifikovány jako součást epitopu rozpoznávaného T buňkami.