MXPA05003289A - Proteinas mutantes que tienen respuesta alergenica disminuida en humanos, y metodos para construir, identificar y producir tales proteinas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un mutante de proteina mejorado novedoso el cual produce una respuesta alergenica disminuida en humanos en comparacion con la secuencia parental de ese mutante. Especificamente, la presente invencion comprende neutralizar o reducir la capacidad de celulas T para reconocer epitopos y de esta manera evitar la sensibilizacion de un individuo a la proteina.

Description

PROTEÍNAS MOTANTES QUE TIENEN RESPUESTA ALERGENICA DISMINUIDA EN HUMANOS , Y MÉTODOS PARA CONSTRUIR, IDENTIFICAR Y PRODUCIR TALES PROTEÍNAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con proteínas las cuales producen una respuesta alergénica disminuida en humanos expuestos a tales proteínas, y un ensayo predictivo de tal respuesta. Más específicamente, la presente invención relaciona con un mutante novedoso de proteína mejorado eL cual produce una respuesta alergénica muy baja en humanos sensibilizados a esa proteina a través de exposición en comparación con el precursor de tal proteína mutante.

B. ESTADO DE LA TÉCNICA Las proteínas utilizadas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales son de prevalencia cada vez mayor. Como resultado, una exposición aumentada debido a esta prevalencia ha sido la responsable de algunos peligros de seguridad causados por la sensibilización de ciertas personas a algunos péptidos, ante la exposición subsecuente lo que provoca reacciones alérgicas extremas las cuales pueden ser dañinas e incluso mortales. Por ejemplo, se sabe que las proteasas causan hipersensibilidad peligrosa en algunos individuos. Como resultado, pese a las hostilidad de las proteasa en la industria, por ejemplo en ios detergentes de lavandería, cosméticos., tratamientos textiles, etc..., y las búsqueda extensa realiza en el campo para proporcionar proteasas mejoradas la cual ha tenido, por ejemplo, la remoción de cepas más efectivas bajo condiciones de detergencia , el uso de proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos humanos. Se ha realizado mucho trabajo para resolver estos problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el potencial inmunogénico del uso de proteasas ha sido procesos de producción mejorados los que reducen el contacto potencial al controlar y minimizar las concentraciones en el lugar de trabajo de partículas de polvo o aerosoles que transporten la proteasa por aire, procesos de granulación mejorados los que reduzcan la cantidad de polvo o aerosol que es producido en realidad a partir del producto de proteasa y procesos de recuperación mejorados para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergenicos en el producto final. Sin embargo, los esfuerzos por reducir la alergenicidad de la proteasa, per se, han sido relativamente poco exitosos. De manera alternativa, se han realizado esfuerzos cor enmascarar epitopos en proteasa los cuales son reconocidos Dor inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (publicación PCT No'. WO 92/10755) o para agrandar o cambiar la naturaleza de los determinantes antigénicos al unir polímeros o péptidos /proteínas a la proteasa problemática. Cuando se produce una respuesta inmune adaptable e una forma exagerada o inapropiada se cice que el individuo experimenta una reacción de hipersensibilidad . Las reacciones de hipersensibilidad son el resultado de respuestas inmunes normalmente benéficas que actúan de manera inapropiada y algunas veces provocan reacciones inflamatorias y daño a- los tejidos. Puede ser provocada por muchos antí genos; y la causa de reacción de hipersensibilidad puede variar de un individuo al siguiente. La hipersensibilidad normalmente no se manifiesta así misma al primer contacte con el antígeno, sino que habituaimente aparece por contacto subsecuente. Una forma de hipersensibilidad se produce cuando se dirige una respuesta de IgE contra antígenos ambientales inocuos tales como polen, ácaros del polvo o desperdicios de animales. La liberación resultante de mediadores farmacológicos por células cebadas sensibilizadas por IgE produce una reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como asma o rinitis. No obstante, una estrategia que comprende modificar los sitios de IgE generalmente no tiene éxito en evitar la causa de la · acción de sensibilización inicial. En consecuencia, tales estrategias, aunque tal vez neutralicen o reduzcan la gravedad de la reacción de h persensibiiidad subsecuente, no reducen el número de personas sensibilizadas en realidad. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensiole a cierto antigeno, la manera general, y la única manera segura de resolver tal situación es aislar a la persona hipersensible del antigeno tanto como sea posible. En realidad, cualquier otro curso de acción puede ser dañino para la salud del individuo hipersensible. Por lo tanto, aunque se reduce el peligro de una proteina especifica para un individuo hipersensible es importante, para propósitos industriales puede ser más valioso volver a la proteina incapaz de iniciar la reacción de hipersensibil idad en primer lugar. Los linfocitos T (células T) son elementos claves en la inducción y regulación de respuestas inmunes y en la ejecución de funciones efectores inmunológicas . La inmunidad especifica contra agentes infecciosos y tumores se sabe que depende de estas células y se considera que contribuyen al sanado de heridas. Por otra parte, una falla de control de estas respuestas puede llevar a una autoagres ión . En general, un antígeno se presenta a células T en forma de células presentadoras de antigeno las cuales, mediante diversos mecanismos de superficie celular, retienen y muestran el antigeno o un antigeno parcial de una manera adecuada para el reconocimiento del antígeno por la célula T. Ante el reconocimiento de un epitopo específico por ios receptores de la superficie de las células T (repectores de células T) , las células T comienzan una serie de interacciones complejas, que incluyen proliferación, lo que resulta en la producción de anticuerpos por células B. Aunque las células T y B son activadas ambas por epitopos antigénicos les cuales existen en una proteína o péptido dado, los epitopos reales reconocidos por estas células mononucleares generalmente no son idénticos. De hecho, el epitopo el cual activa a una célula T a iniciar la creación de diversidad inmunológica con frecuencia no es el mismo epitopo el cual es reconocido posteriormente por las células B en el curso de la respuesta inmunológica. Por lo tanto, con respecto a la hipersensibilidad, aunque la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno es un elemento critico en el inicio de la respuesta inmune a exposición antigénica, las especificidades de tal interacción, es decir, el epitopo reconocido, con frecuencia no son importantes para el desarrollo subsecuente de una reacción alérgica completamente desarrollada . La publicación PCT No. O 96/40791 describe un proceso para producir conjugados de óxido de polialqueno-polipéptido con alergenicidad reducida utilizando óxido de polialquileno como un material inicial.

La publicación PCT No. WO 97/30148 describe u conjugado polipeptidico con alergení cidad reducida el cual comprende una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas polipeptidicas acopiadas cov lentamente a la misma . La publicación PCT No. WO 96/17929 describe un proceso para describir polipéptidos con alergenicidad reducida que comprende la etapa de conjugar de 1 a 30 pol imolécuias a un polipéptido parental. La publicación PCT No. WO 92/10755 describe un método para producir variantes de proteína que inducen una respuesta inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, las proteínas de interés, una serie de proteasas y variantes de la mismas, se utilizan para razas inmunizadas. El suero de las ratas después se utiliza para medir la reactividad de los anticuerpos policlcnales producidos de antemano y presentes en los sueros inmunizados para la proteína de interés y variantes de la misma. A partir de estos resultados, es posible determinar si los anticuerpos en la preparación son comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus variantes, y de esta manera se permite un análisis del cual es probable que ios cambios en la proteína neutralicen o reduzcan la capacidad de IgE a unirse. A partir de estas pruebas en ratas, se llega a la conclusión de que al cambiar cualquiera de los 309 residuos de subtilisina que corresponden a 127, 128, 129, 130, 131 , 151, 136, 151, 152, 153, 154 , 161, 162, 163, 167, 163, 169, 170, I " 1 , 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 19", . - ": , 251, 261 resultará en un cambio en el potencial inmuno! o:: ico . La publicación PCT No. WO 94/10191 describe proteínas poco alergénicas que comprenden formas oiigoméricas de la proteina monomérica parentai, er. donde el oligómero a retenido su actividad sustancialmente . La técnica anterior ha proporcionado métodos para reducir la alergenicidad de ciertas proteínas y la identificación de epitopos los cuales causen reacciones alérgicas en algunos individuos, los ensayos utilizados para identificar estos epitopos generalmente involucran la medición de los anticuerpos IgE e IgG en los sueros sanguíneos previamente expuestos al antígeno. No obstante, una vez que se a iniciado una reacción de IgE, la sensibilización ha ocurrido de antemano. En consecuencia, existe la necesidad de un método para determinar epitopos los cuales provocarán sensibilización en primer lugar, así como la neutralización de estos epitopos que resultará en una posibilidad significativamente disminuida de que se produzca sensibilización, por lo que se reduce la posibilidad de sensibilización inicial.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es proporcionar una proteina que tiene potencial disminuido para provocar una respuesta alergénica en humanos, en comparación con una proteina precursora. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una vanante de proteasa la cual tenga actividad útil en aplicaciones de proteasa comunes, tales como detergentes y en el tratamiento de lana para evitar el enfieitrado, en aplicaciones de jabón en barra o liquido, formulaciones para el cuidado de trastes, soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto, hidrólisis peptidica, tratamiento de desperdicios, aplicaciones textiles tales como antienfieltrado, en formulaciones cosméticas y para el cuidado de la piel o como enzimas de separación de fusión en la producción de proteínas, variantes de proteasas las cuales se pueden utilizar de manera más segura debido a su potencial alergénicc disminuido. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para identificar epitopos de células T dentro de una proteína. La presente invención proporciona un ensayo el cual identifica epitopos como sigue: se combinan células presentadoras de antígenc con células T humanas no expuestas y con un péptido de interés. En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método en el que ;e reconoce un epitopo de células T, que comprende las e.aoas de: (a) obtener a partir de una sola fuente de sangre, una solución de células dendríticas y una solución de c lulas T CD4+ o CD8+, o ambas, no expuestas; (b) promover la diferenciación en la solución de células dendríticas; (c ¦ combinar la solución de células dendríticas diferenciadas e las células T CD4+ o CD8 + , o ambas, no expuestas, con un péptido de interés; (d) medir la proliferación de células T en la etapa (c) . De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona una proteína en la cual se modifica el epitopo de célula T de manera que se reduce o preferiblemente se neutraliza (se elimina) la capacidad de la célula T para identificar ese epitopo. Por lo tanto, se proporciona una proteína que tiene alergenicidad reducida, en donde la proteína comprende una modificación que comprende la sustitución o supresión de residuos aminoácidos los cuales se identifican come dentro de un epitopo de células T. De acuerdo con una modalidad preferida, se determina un epitopo en una proteína o péptido. el cual, cuando es reconocido por una célula T, resulta en la proliferación de células T la cual es mayor que la línea de base. El epitopo de célula T después se modifica de manera que, cuando se analiza el péptido que comprende al epitopo, en el ensayo de la invención, resulta en una proliferación menor que la proteína constituida del epitopo no modificado. De manera, más preferible, el epitopo que se va a modificar produce más de rres veces la proliferación de línea de base de célula T en una muestra. Cuando se modifica, el epitopo produce menos de tres veces la proliferación de célula T en línea de base, preferiblemente menos de dos veces la proliferación de células T en linea de base, y de manera mucho más preferible menos que o sustancialmente igual a la proliferación de células T en línea de base, en una muestra. Preferiblemente, el epitopo se modifica en una de las siguientes maneras: (a) la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con una secuencia análoga a partir de un homologo humano para la proteína de interés, es decir, subtilisina humana u otra proteasa humana derivada de una molécula similar a subtilisina tal como furina o la quexina (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, Vol. 244, (1994), pp. 175 et seq; Roebroek et al., EM30 J., Vol. 5, No. 9,pp. 2197-2202 (1986); Tomkinson et al., Biochem. , Vol. 30, pp . 168-174 (1991); Keifer et al., DNA and Cell Bíol. Vol.10, No. 10, pp. 757-769 (1991)); (b) la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con una secuencia análoga a partir de un homologo no humano para la proteína de interés, secuencia análoga la cual produce una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento de células T en comparación con la proteína de interés; (c) la secuencia de aminoácidos del epitopc se sustituye con una secuencia la cual imita susoanciaimente ios atributos de la estructura terciaria principal del epitopo, pero el cual produce una respuesta alergénica menor decido al reconocimiento de células T en comparación con la proteína de interés; o (d) con cualquier secuencia la cual produzca una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento de células T en comparación con la proteína de interés. En una modalidad específica de la invención, se proporciona una variante de proteasa que comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos en una posición que corresponde a los residuos 170, 171 y 172 y/o 173 en BPN', en donde tales sustituciones comprenden modificar el residuo 170 a ácido aspártico, modificar los residuos 1~1 a glutamina, modificar el residuo 172 a metionina y/o modificar el residuo 173 a ácido aspártico. En una modalidad más preferida, la sustitución comprende modificar los residuos 170, 171 y 173 a ácido aspártico, glutamina y ácido aspártico, respectivamente. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir la proteína de la invención que tiene alergenicidad reducida. Preferiblemente, la proteína mutante se prepara al modificar un ADN que codifica para una proteína precursora de manera que el ADN modificado codifica para la proteína mutante de la invención.

En otra modalidad adicional de la invención, se proporcionan secuencias de ADN que codifican para la proteina mutante, asi como los vectores de expresión que contienen tales secuencias de ADN y células huéspedes transformadas con tales vectores, células huéspedes las cuales preferiblemente son capaces ae expresar tal ADN para producir la proteina mutante de la invención ya sea intraceiular o extraceluiarmente . La proteina mutante de la invención es útil en cualquier composición o proceso en el cual la proteina precursora generalmente se sabe que es útil. Por ejemplo, cuando la proteina es una proteasa, la alergenicidad reducida a la proteasa se puede utilizar como un componente en productos de limpieza tales como detergentes de lavandería y 1 impiadores de superficie duras, como un auxiliar en la preparación de piel o cuero, en el tratamiento de textiles tales cerno lana o cera para reducir el enfieltrado, como un componente en un producto del cuidado personal, cosmético o una crema facial, y como un componente en un alimento animal o para mascotas, para mejorar el valor nutricional del alimento. Similarmente, cuando la proteína es una amilasa, la alergenicidad reducida de la amilasa se puede utilizar para la licuefacción de almidón, como un componente en un detergente para trastos, para retirar el apesto de textiles, en un detergente de lavandería en cualquier otro uso para ei cual sea útil la amilasa. Una ventaja de la presente invención es que mediante la medición de la proliferación de células T debido ai reconocimiento del epitopo de células T, es posible identificar péptidos los cuales contienen epitopos responsables para sensibilizar inicialmente a un individuo. Esto es, la proliferación de células T debido ai reconocimientos de epitopos de células T respecto a la sensibilización de un individuo a ese péptido o a una proteína que la contiene. La neutralización de tales epitopos de células T "sensibilizantes" inevitablemente resultará en un mayor grado de seguridad para aquellos quienes manejan o quienes son expuestos de una u otra manera al antígeno que contiene el epitopo debido a que inicialmente no serán sensibilizados, y de esta manera se evita la producción de anticuerpos IgE típicos de una reacción alergénica ante la exposición subsecuente al antígeno. Una ventaja de la presente invención es la preparación de proteínas, que incluyen enzimas, las cuales se pueden utilizar con un daño significativamente menor de sensibilización para los individuos expuestos. Así, por ejemplo, las proteínas de la invención se pueden utilizar de manera más segura en cosméticos tales como cremas faciales, detergentes tales como detergentes de lavandería, composiciones limpiadoras de superficies duras y composiciones de prelavado o cualquier otro uso de proteínas, que incluye enzimas, en donde la exposición humana es un subproducto necesario .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A, 1B-1, 1B-2 y 1B-3 ilustran el ADN (SEC. DE IDENT. NO. : 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 2) de la subtilisina de Bacillus amyloliquefáciens (BPN' ) y un mapa de restricción parcial de este gen. La figura 2 ilustra los residuos de aminoácidos entre las subtilisinas de Bacillus amylcliquefaciens (SEC. DE IDENT. NO.: 3) y de Bacillus lentus (tipo silvestre) (SEC. DE IDENT. NO. : 4 ) . Las figuras 3A y 3B ilustran una alineación de secuencia de aminoácidos de proteasas tipo subtilisina de Bacillus amyloliquefáciens (BPN' ) , Bacillus subtilis , Bacillus lichenifor is (SEC. DE IDENT. NO. : 5) y Bacillus lentus. El símbolo * indica la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN' . La figura 4 ilustra la respuesta aditiva de células T a 16 muestra de sangre mononuclear periférica a péptidos que corresponden a la proteasa de Bacillus amyloliquefáciens . El péptido E05 incluye la región que comprende los residuos que corresponden a 170-173 en la proteasa de Bacillus amyloliquefa ciens . La figura 5 ilustra la respuesta aditiva de células T de 10 muestras de sangre mononuclear periférica a péptidos aue corresponden a la molécula de subtiiisina humana. La totalidad de los péptidos FIO, F9, F8 y . F7 contienen la secuencia de aminoácidos DQMD que corresponde a la región que comprende los residuos correspondientes a 170-173 en proteasa a partir de Bacillus amyloliquefaciens en la alineación de secuencia de la figura 3. La figura 6A y 6B/6C ilustran las cadenas de aminoácidos que corresponden a los péptidos derivados de la secuencia de la proteasa de Bacillus lentus y una subtiiisina humana, respectivamente. La figura 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de la subtiiisina humana (SEC. DE IDENT. NO.: 6). La figura 8 ilustra una alineación de secuencia de aminoácidos de proteasa BPN' {Bacillus amyloliquefaciens) , una proteasa SAVINASA (Bacillus lentus) y subtiiisina humana (S2HSBT) . La figura 9 ilustra la respuesta de células T a péptidos derivados de proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada de un individuo que se sabe que es hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la región que corresponde a 170-173 en la prcteasa de Bacillus amyloliquefaciens. La figura 10 ilustra la respuesta de células T a diversas sustituciones de alanina en el péptido de la prcteasa de Bacillus lentus E05 establecida en una muestra tomada de un individuo que se sabe es hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para identificar epitopos de células T. La presente invención proporciona un ensayo el cual identifica epitopos, como sigue: se combinan células dendriticas diferenciadas con células T CD4+ o CD8+, o ambas, humanas no expuestas y con un péptido de interés. De manera más específica, se proporciona un método en el que se reconoce un epitcpo de células T, que comprende las etapas de: (a) obtener a partir de una sola fuente de sangre, una solución de células dendriticas y una solución de células T CD4+ o CD8+, o ambas, no expuestas; (b) promover la diferenciación en la solución de las células dendriticas; (c) combinar la solución de células dendriticas diferenciadas y las células T CD4+ o CD8+, o ambas, no expuestas, con un péptido de interés; (d) medir la proliferación de células T en la etapa (c) .

El péptido de interés a ser analizado de acuerdo con el ensayo de la invención se deriva de una proteina o enzima para la cual es deseable o se requiere alergenicidad reducida. En la práctica de la invención, es posible identificar con precisión la posición de un epitopo el cual puede provocar sensibilización de un individuo o de una muestra de individuos. En una modalidad particularmente efectiva de la invención, se preparan una serie de oligómeros peptidicos los cuales corresponden a la totalidad o parte de la proteina o la enzima. Por ejemplo, se produce una biblioteca peptidica que cubre una porción relevante de toda la proteína. Una manera particularmente útil para producir los péptidos, es introducir superposiciones dentro de la biblioteca peptícica, por ejemplo, produciendo un primer péptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos 1-10 de la proteína sujeto, un segundo péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 4-14 de la proteína sujeto, un tercer péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 7-17 de la proteína sujeto, un cuarto péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 10-20 de la proteína sujeto, etc.. hasta que se crean los péptidos representativos que corresponden a la totalidad de la molécula. Al analizar cada uno de los péptidos individualmente en el ensayo que se proporciona aquí, es posible identificar con precisión la posición de epitopos reconocidos por células T. En el ejemplo anterior, la reacción de un péptido -específico en mayor grado a su vecinos facilitará la identificación de la región de ancla de epitopo dentro de tres aminoácidos. Después de determinar la posición de estos epitopos, es posible alterar los aminoácidos dentro de cada epitopo hasta que el péptido produzca la respuesta en células T menos significativa. Como se utiliza aquí, el término "célula presentadora de antígenos" significa una célula del sistema inmune la cual presenta antígeno en su superficie el cual es reconocible por receptores sobre la superficie de células T. Los ejemplos de células presentadoras de antígenos son células dendriticas, células interdigitantes , células B activadas y macrófagos . Como se utiliza en la presente, el término "proliferación de células T" significa que el número de células T producidas durante la incubación de células T con las células presentadoras de antígeno, ccn o sin antígeno. Como se utiliza en la presente, el término "línea de base de proliferación de células T" significa la proliferación de células T la cual normalmente se observa en un individuo en respuesta a la exposición a las células presentadoras de antígeno en ausencia de péptido o antígeno proteínico. Para los propósitos en la presente, el nivel de proliferación de células T de línea de base se determina en una base por muestra para cada individuo como proliferación de células T en respuesta a células presentadoras de antígeno en ausencia de antigeno. El término "epitopo de células T" significa una característica de un péptido o proteína el cual es reconocido por un receptor de células T en el inicio de una respuesta inmunológica al péptido, que comprende a ese antígeno. El reconocimiento del péptido de células T por una célula T generalmente se considera que es vía un mecanismo en el que las células T reconocen fragmentos peptídicos de antígenos los cuales se unen a moléculas del complejo principal de histocompatibil idad clase I o clase II (MHC) expresadas en células presentadoras de antígeno (véase, por ejemplo, Moeller, G. Ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses. Immunological Review, Vol . 98, p. 187 (Copenhague; Munksgaard) (1987). Los epitopos determinados de acuerdo con el ensayo que se proporcionan aquí se modifican para reducir el potencial alergénico de la proteína de interés. En una modalidad preferida, el epitopo que se va a modificar produce un nivel de proliferación de células T de más de tres veces la proliferación de células T de línea de base en una muestra. Cuando se modifica, el epitopo produce menos de tres veces la proliferación de línea de base, preferiblemente menos de dos veces la proliferación de línea de base, y de manera más preferible menos que, o sustancialmente igual a la proliferación de línea de base de una muestra. Preferiblemente, los epitopos se modifican de una de las siguientes maneras: (a) la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con una secuencia análoga a partir de un homologo humano para la proteína de interés; (b) la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con una secuencia análoga a partir de un homologo no humano para la proteína de interés, secuencia análoga la cual produce una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento del epitopo de células T en comparación con la proteína de interés; (c) la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con ' una secuencia la cual imita sustancialmente a los atributos de la estructura terciaria principal del epitopo, pero el cual produce una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento del epitopo de células T en comparación con el de la proteína de interés; o (d) con cualquier secuencia la cual produzca una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento del epitopo de células T en comparación con la proteína de interés. Como se utiliza en la presente, el término "muestra" comprende células mononucleares las cuales son no expuestas, es decir, no sensibilizadas, al antígeno en cuestión .

Como ¦ se utiliza en la presente, el término "homologo" significa una proteina o enzima la cual tiene una acción, estructura o uso catalítico similar que la proteína de interés. Es deseable encontrar un homologo que tenga una estructura terciaria o primaria, o ambas, similares a las de la proteína de interés como sustitución del epitopo en la proteína de interés con un segmento análogo del homologo lo que reducirá la ruptura del cambio. Por lo tanto, las enzimas homologas estrechas proporcionarán la fuente más deseable de ' sustituciones de epitopos. Alternativamente, si es posible, es ventajoso buscar análogos humanos para una proteína dada. Por ejemplo, al sustituir un epitopo específico en una subtilisina bacteriana con una secuencia a partir de un análogo humano para subtilisina (es decir, subtilisina humana) resultaría en una aiergenicidad disminuida en comparación con la proteína bacteriana. Una secuencia "análoga" se puede determinar al asegurar que los aminoácidos de sustitución muestran una función similar, la estructura terciaria o los residuos conservados, o ambos para los aminoácidos en la proteína de interés en o cerca del epitopo. Por lo tanto, cuando la región del epitopo contiene, por ejemplo, una hélice alfa o una estructura de lámina beta, los aminoácidos de sustitución deben de mantener tal estructura específica.

Aunque la presente invención se extiende a todas las proteínas para las cuales se desea reducir la alergenicidad, por fines de sencillez, lo siguiente se describirá como una 'modalidad particularmente preferida de ia invención, la modificación de la proteasa. Las proteasas son carbonilhidrolasas las cuales generalmente actúan para separar enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se utiliza en ia presente, el término "proteasa" significa una prcteasa que se presenta de manera natural o una proteasa recombinante . La proteasa que se presenta de manera natural incluye o¡-aminoacilpéptido hidrolasa, peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serina carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa , tiolproteinasa , carboxi lproteinasa y metaloproteinasa . Se incluyen las serina, metalo, tiol y ácido proteasas, así como las endo y exoproteasas . Las subtilisinas son proteasas bacterianas o micóticas las cuales generalmente actúan para separar enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se utiliza en la presente, el término "subtilisina" significa una subtilisina que se presenta de manera natural o una subtilisina recombinante. Se sabe que se producen una serie de subtilisinas que se presentan de manera natural y con frecuencia son secretadas por diversas especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son completamente homólogos. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie muestran el mismo tipo o un tipo similar de actividad proteolitica . Esta clase de serina proteasas comparten una secuencia aminoácida común definida por una triada catalítica la cual los diferencia de la quimiotripsina, una clase relacionada de serina proteasas. Las subtilisinas y la serina proteasa relacionadas con quimiotripsina tienen, ambas, una triada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con subtilisina, el orden relativo de estos aminoácidos, leídos desde la parte amino a la carboxi, es aspartato-histidina-serina. En las proteasas relacionadas con quimiotripsina, el orden relativo, sin embargo, es histidina-aspartato-serina . Por lo tanto, el término subtilisina se refiere en la presente una serina proteasa que tiene una triada catalítica de proteasas relacionadas con subtilisina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a las subtilisinas identificadas en la figura 3 en la presente. De manera general y para propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponde a los números asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la figura 1. Los términos "subtilisinas recombinantes" o "proteasa recombinante" se refiere a una subtilisina o proteasa en la cual se modifica la secuencia de ADN que codifica para la subtilisina o la proteasa, para producir una secuencia de ADN- variantes (o mutante) la cual codifica para la sustitución, supresión o inserción de uno c más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que se presentan de manera natural. Los métodos adecuados para producir tal modificación, y los cuales se pueden combinar con los descritos aquí, incluyen los que se mencionan en la patente de los Estados Unidos 4,760,025, (RE 34,606) patente de los Estados Unidos 5,204,015 y patente de los Estados Unidos 5,185,258. Las "subtilisinas no humanas", y el ADN que las codifica se puede obtener de muchos organismos procarióticos y eucarióticos . Los ejemplos adecuados de organismos procarióticos incluyen organismos gram negativos tales como £. ccli o Pseudomonas, y bacterias gram positivas tales como Micrococcus o Bacillus . Los ejemplos de organismos eos a partir de los cuales las subtilisinas y sus genes se pueden obtener, incluyen levaduras tales como Saccharomyces ceravisiae , hongos tales como Aspergillus sp. La "subtilisina humana" significa proteínas de origen humano las cuales tienen actividad catalítica de tipo subtilisina, por ejemplo, la familia cexina de proteasas derivadas humanas. Un ejemplo de tal proteína está representada por la secuencia de la figura 7. Adicionalmente, los derivados homólogos de subtilisina humana, incluyen los de fuentes humanas tales como ratón o conejo, las cuales retienen la capacidad esencial para hidrolizar enlaces peptidicos que. tienen por lo menos 50%, de manera preferiblemente por lo menos 65% y de manera mucho más preferible por lo menos 80% de homología con la proteína de la figura 7 se consiaeran subtilisinas humanas para el propósito de la invención. Una "variante de proteasa" tiene una secuencia de aminoácidos la cual se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen proteasas que se presentan de manera natural y proteasas recombinantes . Las secuencia de aminoácidos de la variante de proteasas se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora por sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la "secuencia de ADN precursora" la cual codifica para la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en vez una manipulación de la enzima de proteasa precursora per se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluye métodos descritos aquí, así como métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos EP 0 328299, WO89/06279) y las patentes de los Estados Unidos y las solicitudes mencionadas antes aquí ) . Los números de posición de aminoácidos utilizados aquí se refieren a aquellos asignados a la secuencia de subtiiisina de Bacillus a ylolique aciens madura presentada en la figura 1. Sin embargo, la invención no se limita a la mutación de esta subtiiisina particular sino que se extiende a proteasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones las cuales son "equivalentes" a los residuos identificados particulares en la subtiiisina de Saci llus amyloliquefaciens . En una modalidad preferida de la presente invención, la proteasa precursora es subtiiisina de Bacillus ienzus y la sustituciones, supresiones e inserciones se realizan en un residuo aminoácido equivalente en B. len us que corresponde a los incluidos antes. Un residuo (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de subtiiisina de Bacillus amyloliquefaciens si es ya sea homologa (es decir, corresponde en posición ya sea a la estructura primaria o terciaria) o bien análoga a un residuo especifico o una porción de ese residuo en la subtiiisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que tenga la misma capacidad o una capacidad similar funcional para combinarse, reaccionar o interactuar químicamente) .- Con el fin de establecer homologías con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de subtiiisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente con un conjunto de residuos que se sabe no varían en las subtilisinas para las cuales se conocen las secuencias. Por ejemplo, la figura 2 de la presente muestran los residuos observados como entre la subtilisina 3. amyloliquefaciens y subtilisina de B. lentus. Desoues de alinear los residuos conservados, permitiendo las inserciones y supresiones necesarias con el fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de los residuos conservados a través de supresión e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . La alineación de los residuos conservados preferiblemente debe conservarse en 100% de tales residuos. Sin embargo, también es adecuada una alineación de más de 75% o tan pequeña como 50% -de residuos conservadores para definir residuos equivalentes. Se debe mantener la conservación de la triada catalítica, Asp32 /His6 /Ser221. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis ( carlsbergensis ) y Bacillus lentus se pueden alinear para proporcionar la cantidad máxima de homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que existen muchos residuos conservados contenidos en cada secuencia. Los residuos conservados entre BPN' y B. lentus se identifican en la figura 2.

Estos residuos conservados, por lo tanto, se pueden utilizar para definir los residuos aminoácidos equivalentes correspondientes de subtilisina de Bacillus amylcliquefaciens en otras subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus (publicación PCT No. O89/06279 publicada el 13 de julio de 1989) , la enzima precursora de proteasa preferida en la presente, o la subtilisina denominada como PB92 (EP 0 328 299) , la cual es altamente homologa a la subtilisina preferida de Bacillus lentus. Las secuencias de aminoácidos de algunos de estas subtilisinas se alinean en las figuras 3A y 3B con la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la homología máxima de residuos conservados. Como se puede ver, existen varias supresiones de la secuencia de Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Vall65 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para B . lentus y B. lichenifor is. Así, por ejemplo, el aminoácido en la posición +170 es lisina (K) en ambas subtilisinas, de Bacillus amyloliquefaciens y B. Licheniformis , y arginina (R) en Savinasa. En una modalidad de las variantes de proteasa de la invención, sin embargo, el aminoácido equivalente a +170 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens está sustituido con ácido aspártico (D). Las abreviaturas y ios códigos de una letra para todos los aminoácidos en la presente invención se adaptan al Patentln User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, p.101. Los "residuos equivalentes" también se pueden definir al determinar la homología a nivel de estructura terciaria por una proteasa precursora cuya estructura terciaria a sido determinado por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como tales para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más átomos de cadena principal de un residuo aminoácido particular de la proteasa precursora y de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N en N, Ca en CA, C en C y O en O) estén dentro de 0.13 nm, y preferiblemente 0.1 nm después de la alineación. La alineación se obtiene después de que se ha orientado y colocado el mejor modelo para proporcionar la superposición máxima de coordenadas atómicas de átomos de proteína diferente de hidrógeno de la proteasa en cuestión con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el menor factor R para datos de difracción experimental a la mayor resolución disponible.

?„\Fo(h)\-\Fe(h)\ U Fo(h)\ Los residuos equivalentes los cuales son funcionalmente análogos a un residuo especifico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefacians se definen como aquellos aminoácidos de la proteasa precursora los cuales pueden adoptar una conformación de manera que alteren, modifiquen o contribuyan a la estructura de la proteína, el sustrato de unión o la catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo especifico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Además, son aquellos residuos de la proteasa precursora (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) la cual ocupa una posición análoga hasta el grado en que, los átomos de cadena principal de un residuo dado pueden no satisfacer ios criterios de equivalencia en cuanto a ocupación de una posición homologa, las coordenadas atómicas de por lo menos dos de los átomos de las cadenas laterales del residuo se encuentran dentro de 0.13 nm de los átomos de la cadena lateral correspondiente de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Las coordenadas de la estructura tridimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se establece en la publicación EPO No. 0 251 446 (equivalente a la patente de los Estados Unidos 5,182,204, cuya descripción se incorpora aquí como referencia) y se puede utilizar como se establece antes, para determinar los residuos equivalentes a nivel de estructura terciaria.

Algunos de los residuos identificados por sustitución, inserción o supresión son residuos conservados mientras que otros no. En el caso de residuo los cuales no están conservados, la sustitución de uno o más aminoácidos se iimira a sustituciones las cuales producen una variante la cual tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una que se encuentra en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, tales sustituciones no resultan en una secuencia que se presente de manera natural. Las variantes de proteasa de la presente invención incluye las formas maduras de las variantes de proteasa, asi como la formas pro- y prepro- de tales variantes de proteasa. Las formas prepro- son la construcción preferida puesto que facilita la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa. El término "prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a la porción N terminal de la forma madura de una proteasa la cual, cuando se remueve, resulta en la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteol iticas se encuentran en la naturaleza como productos de proenzima traduccionales y, en ausencia de un procesamiento postraduccional , se expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia putativa de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens aunque se pueden utilizar otras prosecuencias .

Una "secuencia de señal" c "presecuencia" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unido a la porción N terminal de la proteasa o a la porción N terminal de una proteasa la cual puede participar en la secreción de las formas maduras o pro de la proteasa. Esta definición de la secuencia de señal es una - funcional , y significa que incluye todas las secuencias de aminoácidos codificados por la porción N terminal del gen de proteasa el cual participa en la realización de la secreción de la proteasa bajo condiciones nativas. La presente invención utiliza tales secuencias para llevar a cabo la secreción de las variantes de proteasa como se definen aquí. Una posible secuencia de señal comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia de señal de subtilisina de Bacillus Subtilis fucionada al resto de la secuencia de señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC21536) . Una forma "prepro" de una variante . de proteasa consiste de la forma madura de la proteasa que tiene una prosecuencia unida operablemente a la parte aminoterminal de la proteasa y una secuencia "pre" o de "señal" unida operablemente a la parte aminoterminal de la prosecuencia. El término "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN la cual se une operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de llevar a cabo la expresión de tal AD en un huésped adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para llevar a cabo la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión de ribosoma ARNm adecuados y secuencias las cuales controlan la terminación de transcripción y traducción. El vector puede ser un piásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto geonómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma del huésped o, en algunos casos, se puede integrar en el genoma mismo. En la presente especificación, algunas veces se utiliza intercambiablemente los términos "piásmido" y "vector" puesto que el término piásmido es la forma utilizada más comúnmente de un vector hasta la fecha. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión ios cuales proporcionan funciones equivalentes y las cuales sean, o se vuelvan conocidas en la técnica. Las "células huéspedes" utilizadas en la presente invención generalmente son huéspedes procaríóticos o eucarióticos , los cuales preferiblemente han sido manipulados por los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) para volverlos incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula huésped preferida para expresar proteasa es Bacillus cepa BG2036, la cual es deficiente en la proteasa neutra enzimát icamente activa y la proteasa alcalina ( subt i i isina ) . La construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la párente de los Estados Unidos 5,264,366. Otras células huéspedes para expresar proteasa incluyen Bacillus subtilis 1168 (también descrita en la patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) y la patente de los Estados Unidos 5,264,366, cuya descripción se incorpora aquí como referencia) , asi como cualquier cepa adecuada de Bacillus tal como B. licheniformis, B. ientus, etc. Las células huéspedes se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante . Tales células huéspedes transformadas son capaces de codificar para vectores replicantes de las variantes de proteasas o bien para expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores los cuales codifican para la forma pre- o prepro- de la variante de proteasa, tales variantes, cuando se expresan, típicamente son secretadas de la célula huésped al medio de la célula huésped . El término "unido operablemente", cuando se describe la relación entre las regiones de dos ADN, simplemente significa que están funcionalmente relacionadas entre si. Por ejemplo, la presecuencia está unida operablemente a un péptido si funciona como una secuencia de señal, participando en la región de la forma madura de la proteína que involucra de manera más probable la separación de la secuencia de señal. Un promotor está unido operablemente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; un sitio de unión de ribosoma está unido operablemente a una secuencia codificante si se coloca de manera que permite la traducción . Los genes que codifican para la proteasa precursora que se presenta de manera natural se puede obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos generalmente comprenden sintetizar sondas etiquetadas que tengan secuencias putativas que codifiquen para regiones de la proteasa de interés, preparar bibliotecas genómicas a partir de organismos que expresen la proteasa, y analizar las bibliotecas del gen de interés por hibridación con las sondas. Las clonas que hibridicen positivamente después son mapeadas y secuenciadas . La proteasa clonada después se utiliza para transformar una célula huésped con el fin de expresar la proteasa. El gen de proteasa después se liga en un plásmido con un número alto de copias. Este plásmido se replica en huéspedes de una manera tal que contiene elementos bien conocidos necesarios para la replicación del plásmido: un promotor unido operablemente al gen en cuestión (el cual se puede suministrar como el promotor homologo propio del gen si es reconocido, es decir, transcrito por el huésped) , una región de terminación de transcripción y poiiadenilación (necesaria para la estabilidad del ARNm transcripto en el huésped a partir del gen de proteasa en ciertas células huéspedes eucarióticas ) , el cual es exógeno o se suministra por la región terminadora endógena del gen de proteasa y, de manera deseable, un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos que permita el mantenimiento en cultivo continuo de las células huéspedes infectadas con el plásmido mediante crecimiento en un medio que contenga antibióticos. Los plásmidos con un número de copias elevado también contienen un origen de replicación para el huésped, por lo que se permite que se generen grandes cantidades de plásmido en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, está dentro del alcance en la presente integrar copias múltiples del gen de proteasa dentro del genoma del huésped. Esto se facilita por organismos procarióticos y eucarióticos los cuales son particularmente susceptibles a recombinación homologa. En una modalidad, el gen puede ser un gen natural tal como el de B. lantus o B. amyloliquefaciens. Alternativamente, se puede producir un gen sintético que codifique para una proteasa precursora que se presente de manera natural o mutante. En tal solución, el ADN o la secuencia de aminoácidos, o ambos de la proteasa precursora se determinan. Los fragmentos de ADN múltiples, superpuestos y sintéticos posteriormente se sintetizan, lo cual, mediante hibridación y ligación, produce un ADN sintético que codifica para la proteasa precursora, Un ejemplo de esta construcción de gen sintético se establece, en el ejemplo 3 de la patente de los Estados Unidos 5,204,015, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Una vez que se ha clonado el gen de proteasa precursora que se presenta de manera natural o sintético, se llevan a cabo muchas modificaciones para mejorar el uso del gen sobrepasando la síntesis de la proteasa precursora que se presenta de manera natural. Tales modificaciones incluyen la producción de proteasas recombinantes , como se describe en la patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) y la publicación EPO No. 0 251 446, y la producción de variantes de proteasa descritas aquí. Se puede utilizar el siguiente método de mutagénesis de cásete para facilitar la construcción de las variantes de proteasa de la presente invención, aunque se pueden utilizar otros métodos. En primer lugar, se obtiene y secuencia, en su totalidad o en parte, el gen que se presenta de manera natural que codifica para la proteasa. Después, se explora la secuencia en búsqueda de un punto en el cual se desee realizar una mutación (supresión, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que flanquean este punto se evalúan para determinar la presencia de sitios de restricción para sustituir un segmento corto del gen con un acumulado oligonucleotidico el cual, cuando se exprese, codificará para diversos mulantes. Tales sitios de restricción preferiblemente son sitios únicos dentro del gen de proteasa de manera que facilitan la sustitución del segmento del gen. Sin embargo, cualquier sitio de restricción conveniente el cual sea redundante en el gen de proteasa se puede utilizar, con la condición de que los fragmentos de genes generadores por digestión por restricción se pueden reensamblar en secuencia apropiada. Si los sitios de restricción no están presentes en posiciones dentro de una distancia conveniente desde un punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos ) , tales sitios se generan al sustituir nucleótidos en el gen de manera tal que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados cambien en la construcción final. La mutación del gen con el fin de cambiar su secuencia para adaptarla a la secuencia deseada, se lleva a cabo por la extensión del cebador M13, de acuerdo con métodos conocidos generalmente. La tarea de localizar regiones flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias convenientes de sitios de restricción se realizan sistemáticamente por la redundancia del código genético, un mapa de enzima de restricción del gen y la gran cantidad de diferentes enzimas de restricción. Nótese que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el método anterior necesita utilizarse únicamente con respecto a la región flanqueante la cual no contiene un sitio. Una vez que se clona ADN que se presenta de manera natural o ADN sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que se van a ir.utar se digieren con las enzimas de restricción connatas y una pluralidad de casetes oligonucieotidicos complementarios en la parte terminal se ligan dentro del gen. La mutagénesis se simplifica por este método, debido a que la totalidad de los oligonucleótidos se pueden sintetizar de manera que tengan los mismos sitios de restricción, y no son necesarios enlazadores sintéticos para crear los sitios de restricción. En un aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una proteasa variante que tenga un potencial alergénico alterado en comparación con la proteasa precursora, puesto que la disminución de tal potencial permite un uso más seguro de la enzima. Aunque la presente invención es útil para disminuir el potencial alergénico, las mutaciones especificadas aquí se pueden utilizar en combinación con mutaciones conocidas en la técnica para que resultan en estabilidad térmica alterada o especificidad de sustrato alterada o ambos, actividad modificada o estabilidad alcalina alterada, en comparación con el precursor.

En consecuencia, la presente invención está dirigida a la alteración de la capacidad del epitopo de células T, el cual incluye las porciones de residuo 170-173 en Bacillus lentus para inducir la proliferación de células T. Una modalidad particularmente preferida de la invención comprende realizar la modificación ya sea de uno o de la totalidad de R170D, Y171Q y/o N173D. De manera similar, como se discute con detalle antes, se considera que la modificación de los residuos correspondientes en cualquier proteasa resultarán en la neutralización del epitopo de células T clave en esa proteasa. Por lo tanto, en combinación con las mutaciones actualmente descritas en la región que corresponden a los residuos aminoácidos 170-173, las sustituciones en las posiciones que corresponden a N76D/S103A/V104I/G159D opcionalmente en combinación con una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de las posiciones que corresponden a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se pueden utilizar, además de disminuir el potencial alergénico de la proteasa variante de la invención, para modular la estabilidad total o la actividad proteolitica , o ambas, de la enzima. Similarmente, las sustituciones que se proporcionan aquí se pueden combinar con mutación en la asparagina (N) en la subtilisina de Bacillus lentus en la posición equivalente +76 a aspartato (D) en combinación con mutaciones S103A/V104I/G159G y opcionalmente en combinación con una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de posiciones que corresponden a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir estabilidad mejorada o actividad mejorada, o ambas, de la enzima mutante resultante. Las modalidades más preferidas de la invención incluyen las siguientes combinaciones especificas de residuos sustituidos que corresponden a las posiciones: N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H V68A/N76D/S103A/V10 I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V10 I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q 245R; y V68A/N76D/S103A/V10 I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q 236H/Q245R/T260A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Estas sustituciones preferiblemente se realizan en subtilisina de Bacillus lentus ( recombinante o tipo nativo), aunque las sustituciones se pueden realizar en cualquier proteasa de Bacillus . En base en los resultados de análisis obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones indicadas anotadas antes en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son importantes para la actividad proteoliticas , el funcionamiento o estabilidad, o ambos, de estas enzimas y en el funcionamiento ¦ en cuanto a limpieza o lavado de tales variantes de enzima. Muchas de las variantes de proteasa de la invención son útiles para formular diversas composiciones detergentes. Muchos compuestos conocidos son tensoactivos adecuados útiles en composiciones que comprenden les mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, aniónicos o zwiteriónicos , como se describe en US 4,404,128 para Barry J. Anderson y US 4,261,861 para Jiri Flora et al. Una formulación detergente adecuada es la descrita en el ejemplo 7 de la patente de los Estados Unidos 5,204,015 (incorporada previamente como referencia). La técnica es conocida con diferentes formulaciones las cuales pueden ser utilizadas como composiciones limpiadoras. Además de las composiciones limpiadoras típicas, se entiende fácilmente que se pueden utilizar variantes de proteasa de la presente invención para cualquier propósito que se utilicen las proteasas nativas o de tipo silvestre. Por lo tanto, estas variantes se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicación de jabón en barra o jabón líquido, formulaciones para el cuidado de trastes, soluciones o productos para limpieza de lentes de contacto, hidrólisis peptídica, tratamiento de desperdicios, aplicaciones textiles, como enzimas de separación de fusión, en la producción de proteínas, etc. Las variantes de la - ¿J3 -presente invención pueden comprender, además de alergenicidad disminuida, funcionamiento mejorado en una composición detergente (en comparación con el precursor) . Como se utiliza en la presente, un funcionamiento mejorado en un detergente se define como una limpieza aumentada de ciertas manchas sensibles a las enzimas tales como grasa o sangre, determinado por la evaluación habitual después de un ciclo de lavado estándar . Las proteasas de la invención se pueden formular en detergentes conocidos pulverizados y líquidos que tengan pH entre 6.5 y 12.0 a niveles de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5% (preferiblemente 0.1% a 0.5% en peso) . Estas composiciones limpiadoras detergentes también pueden incluir otras enzimas tales como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas , conocidas, así como mejoradores de detergencia y estabilizantes. Además de las proteasas de la invención a las composiciones limpiadoras convencionales estas no generan ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente también es adecuado para las presentes composiciones en la medida en que el pH esté dentro del intervalo anterior, y que la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de proteasas descrita. Además, las proteasas de la invención se pueden utilizar como una composición limpiadora sin detergentes, ya sea solas c en combinación con mejoradores de detergencia y estabilizantes. Las variantes de proteasas de la presente invención se pueden incluir en alimento animal tales partes de aditivo de alimento animal como se describen, por ejemplo, en documento de los Estados -Unidos 5,612,055; documento de los Estados Unidos 5,314,692 y documento de los Estados Unidos 5, 147, 642. Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento de un textil que incluye variantes de proteasas de la presente invención. La composición se puede utilizar para tratar, por ejemplo seda o lana como se describe en la publicaciones tales como RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359; y EP 344,259. Los siguiente se presenta a manera de ejemplo y no se construye como una limitación del alcance de las reivindicaciones. Las variantes pueden ser analizadas para actividad proteolitica de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Las variantes de proteasa preferidas incluyen sustituciones múltiples en las posiciones que corresponden a: N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I GI59D/ 170D/Y171Q/SI73D/A232V/Q236K/Q 245R y V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/KI70D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q 236H/Q245R/T260A de subtilisina de Bacillus amylcliquefaciens. Todas las publicaciones y patentes a las que se hace referencia se incorporan aquí como referencia en su totalidad .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Ensayo para la Identificación de Epitopos de células T Peptidicas Utilizando Células T Humanas no Expuestas Se recolectan células sanguíneas periféricas humanas frescas de humanos "no expuestos", es decir, personas que no se sabe que hayan sido expuestas o que hayan sido sensibilizadas a proteasa de Bacillus lentus, por determinación de epitopos antigénicos en proteasa de subtilisina de Bacillus lentus y subtilisina humana. Se pretende que los humanos no expuestos signifique que el individuo no conoce haber sido expuesto o haber desarrollado una reacción a proteasa en el pasado. Se preparan células sanguíneas mononucleares periféricas (almacenadas a temperatura ambiente, como máximo 24 horas) para su uso como sigue: aproximadamente 30 mi de una solución de preparación de cubierta amarilla de una unidad de sangre completa se completa a 50 mi con solución amortiguada de fosfato de Dulbecco (DPBS) y se divide en dos tubos. La muestra se coloca debajo de 12.5 mi de un medio de separación de densidad lymphoprep a temperatura ambiente (Nycomec aensidad 1.077 g/ml) . Los tubos se centrifugan durante 30 minutos a 600G. La interfase de las dos fases se recolecta, se acumula y se lava con DP3S . La densidad celular de la solución resultante se mide por hemocitómetro . Se mide la viabilidad por exclusión de azul de tripan. A partir de la solución resultante, se prepara un cultivo de células dendriticas diferenciadas a partir de una-muestra de células mononucleares de sangre periférica que tienen una densidad de 10: células por matraz de cultivo de 75 mi, en una solución como sigue: (1) se suplementan 50 mi de suero libre de medio RIE V (Gibco) con una dilución 1:100 de beta-mercaptoetanol (Gibco) . Los matraces se dejan planos durante 2 horas a 37°C en C02 5% para permitir la adherencia de los monocitos a la pared del matraz. (2) la diferenciación de las células de monocitos a células dendriticas es como sigue: se remueven las células no adherentes y las células adherentes resultantes (monocitos) se combinan con 30 mi de AI V 800 unidades/ml de GM-CSF - Al - (Endogen) y 500 unidades /mi de IL-4 (Endogen); la mezcla resultante se cultiva durante 5 días bajo condiciones a 37°C en CO; 5%. Después de 5 días, se agrega la TNFa de citocina (Endogen) a 0.2 unidades/ml, y se agrega la citocina IL-l (Endogen) a una concentración final de 50 unidades/ml, y la mezcla se incuba a 37°C en CO: 5% durante 2 o más días. (3) en el séptimo día, se agrega mitomicina C a una concentración de 50 microgramos/ml y se agrega para detener el crecimiento de el cultivo de células dendríticas no diferenciadas. La solución se incuba durante 60 minutos a 37°c en C02 5%. Las células dendríticas se cosechan al raspar obviamente las células adherentes del fondo del matraz con un raspador de células. Las células no adherentes después se centrifugan a 600G durante 5 minutos, se lavan con DPBS y se cuentan. (4) las células dendríticas preparadas se colocan en un arreglo de fondo redondo de 96 pozos a 2 x lOVpozo en un volumen total de 100 microlitros de medio AIM V. Se preparan células T CD4+ a partir de alícuotas congeladas de muestras de células de sangre periférica utilizada para preparar la células dendríticas utilizando el equipo CD4+ Cellect (Biotex) como lo indica las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: las alícuotas se calientan y lavan de manera que aproximadamente 108 células serán aplicadas por columna Cellect; las células se resuspenden en -4 mi de DPBS y 1 mi de reactivo Cell del equipo Cellect, la solución se mantiene a temperatura ambiente durante 20 minutos. La solución resultante se centrifuga durante 5 minutos a 600G, a temperatura ambiente, y el sedimento se resuspende en 2 mi de DPBS y se aplica a las columnas Cellect. El efluente de la columna se recolecta en suero humano 2% en DPBS. La solución de células CD4+ resultantes se centrifugan, se resuspende en medio AIM V y se realiza una cuenta de la densidad. La suspensión de células T CD4 + se resuspende hasta una cuenta de 2 x 106 mi en medio AIM V para facilitar la manipulación eficiente de la placa de 96 pozos. El antigeno peptidico se prepara a partir de una solución concentrada 1M en DMSO por una dilución de medio AIM V en una relación 1:10. Se colocan 10 microlitros de la solución concentrada en cada pozo de la placa de 96 pozos que contiene células dendriticas diferenciadas. Se agregan adicionalmente a cada pozo 100 microlitros de la solución de células T CD4+ diluida como se prepara antes. Los controles útiles incluyen blanco de DMSO diluidos y controles positivos al toxoide del tétanos. Las concentraciones finales en cada pozo, a un volumen total de 210 microlitros, son como siguen: 2 x 104 de CD4 + 2 x 10= de células dendriticas (R:S de 10:1) 5 mM de péptido.

Ejemplo 2 Identificación de Epitopos de Células T en Proteasa de Subtilisina de Bacill s ¿entus y Humana Los péptidos para uso en el ensayo descrito en el ejemplo 1 se preparan en base en la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus y humana. Los antigenos peptidicos se diseñan como sigue. A partir de la secuencia de aminoácidos de longitud completa ya sea de subtilisina humana o de proteasa de Bacillus lentus proporcionada en la figura 1, se preparan sintéticamente bloques de 15 unidades, cada bloque de 15 unidades se superpone con el bloque de 15 unidades previo y subsecuente por tres residuos. Los péptidos utilizados corresponden a las cadenas de residuos aminoácidos en Bacillus lentus como se proporciona en la figura 8, y los péptidos corresponden a los residuos de aminoácidos en subtilisina humana como se proporcionan en la figura 7. Los péptidos utilizados corresponden a las proteasas que se proporcionan en la figura 6. Todas las pruebas se realizan por lo menos por duplicado. Todas las pruebas reportadas muestran respuestas de control positivo robusto al antigeno del toxoide del tétanos. Las respuestas se promedian dentro de cada -experimento, y después se normalizan a la respuesta de linea de base. Se registra un resultado positivo si la respuesta es de por lo menos tres veces la resouesta de línea de base. La respuesta inmunogér.ica (es decir, proliferación de células T) a los péptidos preparados a partir de subtilisina humana y Bacillus lentus se adecúa y se proporcionan en las figuras 4 y 5, respectivamente. Se mide la proliferación de células T por incorporación del método de tritio. Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5 como una comparación de la respuesta aditiva inmunogénica de 10 individuos (figura 4) y 16 individuos (figura 5) a los diversos péptidos. Las respuesta se indica como la respuesta agregada, en donde 1.0 es igual a una respuesta de línea de base para cada muestra. Por lo tanto, una lectura de 10.0 o menos en la figura 4 es la respuesta de línea de base y en la figura 5 una lectura de 16.0 o menos es la respuesta de línea de base. Como se indicó en las figuras 4 y 5, la respuesta inmunogénica de las muestras de sangre no expuestas de individuos no sensibilizados muestran una respuesta alergénica marcada en el fragmento peptídico de Bacillus lentus que corresponden a los residuos 170-173 de la proteasa de Bacillus amyloliquefaciens. Como se esperaba, el fragmento correspondiente en la subtiiisina humana induce únicamente una respuesta de linea de base. La figura 9 muestra la respuesta de células T a péptidos derivados de la proteasa de Baci 1 lus ienzus en una muestra tomada de un individuo que se sabe es hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus. El péptido ?05 representa la región que corresponde a 170-173 en la proteasa a partir de Bacillus amyloliquefaciens. Como se muestra en la figura 9, el individuo hipersensible responde en gran medida al epitopo de células T representado por el péptido E05. Este resultado confirma que, al llevar a la práctica el ensayo de acuerdo con la invención, es posible predecir los epitopos principales identificados por las células T de un individuo hipersensible . La figura 10 muestra la respuesta de células T a diversas sustituciones de alanina en el péptido E05 derivado de la proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada de un individuo que se sabe es hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus. Se utilizan las sustituciones de alanina como sustituciones con el propósito de determinar el papel de cualquier residuo especifico dentro del epitopo. La leyenda de la figura 10 se refiere a la posición del péptido en la cual se sustituye la alanina, es decir, en el péptido E06 (secuencia GSISYPARYANAMAV) , G a A = 2 , S a A = 3, I a A = 4, S a A =5, Y a A = 6 , P a A = 7, R a A = 8, Y a A = 9, N a A = 10, M a A = 11 y V a A = 12. Como se indica en la figura 10, la sustitución de cualquier de los residuos R170A, Y171A y/o N173A en la proteasa de Bacillus lantus resulta en una respuesta notablemente reducida en la muestra de sangre del individuo hipersensible . A partir de estos resultados, es evidente que los residuos 170, 171 y 173 son críticos para la respuesta de células T dentro de este péptido. En consecuencia, es evidente además que estes residuos son responsables principalmente por el inicio de la reacción alérgica dentro de la proteasa de Bacillus lentus. Se hace constar que con relación a esta fecha, el me] oí mé odo conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims (3)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para reducir la alergenicidad de una proteina, caracterizado porque comprende las etapas de: a) identificar un epitope de célula T en la proteina al i) poner en contacto una célula dendrítica derivada de monocitos adherentes que haya sido diferenciada al exponer la célula dendrítica a citocinas, factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interleucina 4 (IL-4), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina 1 alfa (IL-?a), con un péptido que comprenda el epitope de célula T; y ii) poner en contacto la célula dendrítica y péptido con una célula T inmadura, en donde la célula T inmadura se ha obtenido de la misma fuente que la célula dendrítica derivada de monocitos adherentes, y con lo cual la célula T prolifera en respuesta al péptido; y b) modificar la proteína para neutralizar el epitope de célula T de tal forma que la proteína modificada induzca menos que o sustancialmente igual a la proliferación de linea de base de las células T inmaduras.

2. Un método para reducir la alergenicidad de una subtilisina microbiana, caracterizado porque comprende las etapas de: a) determinar un epitope de célula T de la subtilisina que comprende i) obtener de una sola fuente de sangre humana una solución de células dendriticas y una solución de células T CD4+ y/o CD8+ inmaduras; ii) promover la diferenciación en la solución de células dendriticas; combinar la solución de células dendriticas diferenciadas y las células T CD4+ y/o CD8+ inmaduras con fragmentos de péptido de la subtilisina y iv) medir la proliferación de las células T en la etapa iii) ; y b) modificar el péptido que incluya el epitope de célula T para neutralizar el epitope.

3. Un método para reducir la alergenicidad de una proteína, caracterizado porque comprende las etapas de: a) identificar un epitope de célula T en la proteína al i) poner en contacto una célula dendrítica derivada de monocitos adherentes que haya sido diferenciada mediante exposición a factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interleucina 4 (IL-4), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina 1 alfa (IL-?a), con un péptido que comprenda el epítope de célula T; y ii) poner en contacto la célula dendrítica diferenciada y péptido con una célula T inmadura, en donde la célula T inmadura se ha obtenido de la misma fuente que la célula dendrítica derivada de monocitos adherentes, y con lo cual la célula T prolifera en respuesta al péptido; y b) modificar la proteína para neutralizar el epítope de célula T de tal forma que la proteina modificada induzca menos que o sustancialmente igual a la proliferación de línea de base de las células T inmaduras.