DE69920434T4

DE69920434T4 - Verfahren zur herstellung von protein mutanten mit reduzierter allergener wirkung in menschen.

Info

Publication number: DE69920434T4
Application number: DE69920434T
Authority: DE
Inventors: A. David ESTELL; A. Fiona HARDING
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2019-04-15
Also published as: DE69920434T2; EP1997897B1; BR9909640A; EP1997897A1; EP1073754A2; EP1586649A2; EP1073754B9; MXPA05003288A; US6218165B1; IL138445A0; IL138445A; ATE452195T1; JP4447774B2; NZ524596A; EP1073754B1; PL343509A1; CN1302113C; DK1073754T3; DE69920434D1; ES2229703T4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von Proteinen, die eine geringere allergene Antwort in Menschen auslösen, die gegenüber solchen Proteinen exponiert sind, sowie ein Assay, das für diese Antwort prognostisch ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung einer neuen verbesserten Proteinmutante, die im Vergleich mit dem Vorläufer dieser Proteinmutante eine sehr geringe allergene Antwort in Menschen auslöst, die durch Exposition gegen dieses Protein sensibilisiert sind.
B. Stand der Technik
Proteine, die in industriellen, pharmazeutischen oder kommerziellen Anwendungsbereichen eingesetzt werden, erfahren eine zunehmende Verbreitung. Als Ergebnis war die zunehmende Exposition infolge dieser Verbreitung für einige Sicherheitsrisiken verantwortlich, die durch die Sensibilisierung von gewissen Personen gegen diese Peptide verursacht wurden, woraufhin eine nachfolgende Exposition extreme allergische Reaktionen verursacht, die schädlich und sogar tödlich sein können. Es ist beispielsweise bekannt, dass Proteasen eine gefährliche Hypersensibilität in einigen Individuen verursachen. Infolgedessen war die Verwendung von Proteasen in der Industrie, trotz der Nütrlichkeit von Proteasen in der Industrie, z. B. in Waschmitteln, Kosmetika, Textilbehandlung etc. und der intensiven Forschung, die in diesem Gebiet vorgenommen worden ist, um verbesserte Proteasen bereitzustellen, die beispielsweise unter Reinigungsbedingungen eine wirksamere Fleckenentfernung aufweisen, aufgrund ihrer Fähigkeit zur Auslösung von einer hypersensiblen allergenen Reaktion in einigen Menschen problematisch.
Es sind einige Anstrengungen unternommen worden, um diese Probleme zu verringern. Unter den erforschten Strategien zur Verringerung des immunogenen Potentials der Proteaseverwendung gab es verbesserte Produktionsverfahren, die durch Kontrollieren und Minimieren der Arbeitsplatzkonzentrationen von Staubteilchen oder Aerosol, die durch Luft übertragene Protease tragen, einen potentiellen Kontakt verringern, verbesserte Granulierungsverfahren, die die Menge an Staub oder Aerosol verringern, die durch das eigentliche Proteaseprodukt produziert werden, und verbesserte Rückgewinnungsverfahren, um den Gehalt an potentiell allergenen Verunreinigungen im Endprodukt zu verringern. Jedoch waren Bemühungen zur Reduktion der Allergenität der Protease selbst relativ erfolglos. Alternativ wurden Bemühungen unternommen, Epitope in einer Protease zu maskieren, die in hypersensiblen Individuen durch Immunglobulin E (IgE) erkannt werden (PCT Anmeldung Nr. WO 92/10755) oder die Natur der antigenen Determinanten zu vergrößern oder zu verändern, indem Polymere oder Peptide/Proteine an die fragliche Protease angehängt wurden.
Wenn eine adaptive Immunantwort in einer übertriebenen oder unpassenden Form auftritt, sagt man von dem Individuum, das diese Reaktion erfährt, dass es hypersensibel (hypersensitive) ist. Hypersensibilitätsreaktionen sind das Ergebnis von normalerweise nützlichen Immunantworten, die unangebracht funktionieren und manchmal Entzündungsreaktionen und Gewebeschaden verursachen. Sie können durch viele Antigene provoziert werden, und der Grund für eine Hypersensibilitätsreaktion variiert von einem Individuum zum anderen. Die Hypersensibilität zeigt sich normalerweise nicht beim ersten Kontakt mit dem Antigen, sondern tritt im allgemeinen bei einem nachfolgenden Kontakt auf. Eine Form der Hypersensibilität tritt auf, wenn eine IgE-Antwort gegen harmlose Umweltantigene gerichtet ist, wie z. B. Pollen, Hausstaubmilben oder Tierhautschuppen. Die resultierende Freisetzung von pharmakologischen Mediatorsubstanzen durch IgE-sensibilisierte Mastzellen erzeugt eine akute Entzündungsreaktion mit Symptomen wie Asthma oder Rhinitis.
Nichtsdestoweniger ist eine Strategie, die das Modifizieren der IgE-Stellen umfasst, bei der Verhinderung der Ursache der anfänglichen Sensibilisierungsreaktion nicht allgemein erfolgreich. Folglich werden solche Strategien, auch wenn sie möglicherweise die Schwere der anschließenden Hypersensibilitätsreaktion neutralisieren oder vermindern können, nicht die Anzahl oder Personen, die tatsächlich sensibilisiert werden, verringert. Wenn z. B. eine Person bekanntermaßen gegen ein gewisses Antigen hypersensibel ist, besteht die allgemeine und einzig sichere Art und Weise des Umgangs mit solch einer Situation darin, die hypersensible Person von dem Antigen so vollständig wie möglich zu isolieren. In der Tat könnte jede andere Vorgehensweise für die Gesundheit des hypersensiblen Individuums gefährlich sein. Während die Reduktion der Gefahr eines bestimmten Proteins für ein hypersensibles Individuum wichtig ist, wäre es jedoch für industrielle Anwendungszwecke sehr viel nützlicher, von vorneherein ein Protein unfähig zu machen, die Hypersensibilitätsreaktion zu initiieren.
T-Lymphozyten (T-Zellen) sind Hauptakteure bei der Induktion und Regulation von Immunantworten und bei der Ausführung von immunologischen Effektorfunktionen. Es ist bekannt, dass die spezifische Immunität gegen infektiöse Mittel und Tumore von diesen Zellen abhängt und es wird davon ausgegangen, dass sie zur Heilung von Verletzungen beitragen. Andererseits kann eine Fehlfunktion bei der Steuerung dieser Antworten zu einer Autoaggression führen. Im allgemeinen wird ein Antigen den T-Zellen in Form von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, die über eine Vielzahl von Zelloberflächenmechanismen ein Antigen oder ein partielles Antigen fangen und ausstellen, auf eine Art und Weise, die für die Antigenerkennung durch die T-Zelle geeignet ist. Bei der Erkennung eines spezifischen Epitops durch die Rezeptoren auf der Oberfläche der T-Zellen (T-Zell-Rezeptoren) beginnen die T-Zellen mit einer Reihe von komplexen Wechselwirkungen, einschließlich Proliferation, die zur Produktion von Antikörpern durch B-Zellen führen. Während T-Zellen und B-Zellen beide durch antigene Epitope aktiviert werden, die auf einem gegebenen Protein oder Peptid vorliegen, sind die eigentlichen Epitope, die von diesen mononukleären Zellen erkannt werden, im allgemeinen nicht identisch. In der Tat ist das Epitop, das eine T-Zelle aktiviert, um die Erzeugung von immunologischer Vielfalt zu initiieren, recht häufig nicht das gleiche Epitop, das später von B-Zellen im Rahmen der immunologischen Antwort erkannt wird. Während die spezifische antigene Interaktion zwischen der T-Zelle und dem Antigen ein entscheidendes Element bei der Initiierung der Immunantwort auf Antigenaussetzung darstellt, sind folglich im Hinblick auf die Hypersensibilität die Einzelheiten dieser Interaktion, d. h. das erkannte Epitop, häufig nicht relevant für eine anschließende Entwicklung einer kompletten allergischen Reaktion.
Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 96/40791 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Polyalkylenoxid-Polypeptid-Konjugaten mit reduzierter Allergenität unter Verwendung von Polyalkylenoxid als Ausgangsmaterial.
Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 97/30148 offenbart ein Polypeptid-Konjugat mit reduzierter Allergenität, das ein polymeres Trägermolekül mit 2 oder mehr Polypeptidmolekülen, die daran kovalent gebunden sind, umfasst.
Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 96/17929 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit reduzierter Allergenität umfassend den Schritt des Konjugierens von 1 bis 30 Polymolekülen an ein Vorgänger-Polypeptid.
Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 92/10755 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Proteinvarianten, die eine reduzierte immunogene Antwort in Tieren hervorrufen. In dieser Anmeldung wurden die Proteine von Interesse, eine Reihe von Proteasen und Varianten davon, zur Immunisierung von Ratten eingesetzt. Die Seren von diesen Ratten wurden anschließend verwendet, um die Reaktivität der bereits produzierten und in den immunisierten Seren vorliegenden polyklonalen Antikörpern gegen das Protein von Interesse und deren Varianten zu messen. Aus diesen Ergebnissen war es möglich zu bestimmen, ob die Antikörper in der Präparation im Vergleich mehr oder weniger reaktiv mit dem Protein und dessen Varianten waren, wodurch eine Analyse ermöglicht wurde, welche Veränderungen in dem Protein möglicherweise die Fähigkeit von Ig zur Bindung neutralisieren oder reduzieren. Aus diesen Tests an Ratten konnte die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Veränderung eines der 309 Reste von Subtilisin entsprechend 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 zu einer Veränderung des immunologischen Potentials führt.
Die PCT Veröffentlichung Nr. WO 94/10191 offenbart schwach allergene Proteine umfassend oligomere Formen des monomeren Vorläuferproteins, wobei das Oligomer im wesentlichen seine Aktivität beibehalten hat. Gundlach, B. R. et al. (1996), Journal of Immunological Methods 192, 149–155, beschreibt die Determinierung von T-Zellepitopen mit statistischen Peptid-Bibliotheken.
Der Stand der Technik hat Verfahren zur Reduzierung der Allergenität von gewissen Proteinen und zur Identifizierung von Epitopen, die in einigen Individuen allergische Reaktionen verursachen, bereitgestellt, wobei die Assays, die zur Identifizierung dieser Epitope angewendet werden, im allgemeinen die Messung von IgE- und IgG-Antikörpern in Blutseren, die zuvor dem Antigen ausgesetzt wurden, umfassen. Nichtsdestoweniger hat eine Sensibilisierung bereits stattgefunden, sobald eine Ig-Reaktion initiiert worden ist. Folglich besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum Bestimmen von Epitopen, die in erster Linie eine Sensibilisierung verursachen, da die Neutralisierung dieser Epitope zu einer deutlich geringeren Möglichkeit des Auftretens einer Sensibilisierung führt, wodurch die Möglichkeit einer anfänglichen Sensibilisierung reduziert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Proteins mit einem verminderten Potential zur Verursachung einer allergenen Antwort in Menschen im Vergleich zu einem Vorläuferprotein.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer Proteasevariante, die in üblichen Proteaseverwendungszwecken eine nützliche Aktivität besitzt, wie z. B. als Waschmittel oder die Behandlung von Wolle zur Verhinderung von Verfilzen, in Seifenstücken- oder Flüssigseifen-Anwendungen, Geschirrspülformulierungen, Kontaktlinsen-Reinigungslösungen oder -produkten, Peptid-Hydrolyse, Abfallbehandlung, Textilanwendungen wie z. B. Anti-Verfilzen, in kosmetischen Formulierungen und zur Hautpflege, oder als Fusions-Spaltungs-Enzyme bei der Proteinherstellung, wobei die Proteasevariante aufgrund ihres erniedrigten allergenen Potentials sicherer verwendet werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von T-Zell-Epitopen innerhalb eines Proteins bereitgestellt, worin ein T-Zell-Epitop erkannt wird, umfassend die folgenden Schritte: (a) Erhalten aus einer einzelnen Humanblutprobe einer Lösung von dendritischen Zellen und einer Lösung von naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen, (b) Fördern der Differenzierung in der Lösung von dendritischen Zellen, (c) Vereinigen der Lösung von differenzierten dendritischen Zellen und der naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen mit einem Peptid von Interesse, (d) Messen der Proliferation von T-Zellen im Schritt (c).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Protein, in dem ein T-Zell-Epitop identifiziert worden ist, derart modifiziert, dass die Fähigkeit der T-Zelle zur Identifizierung des Epitops reduziert oder vorzugsweise neutralisiert (eliminiert) wird. Das Protein besitzt eine reduzierte Allergenität und vorzugsweise umfasst es eine Modifikation umfassend die Substitution oder Deletion von Aminosäureresten, die innerhalb eines T-Zell-Epitops identifiziert wurden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Epitop in einem Protein oder Peptid bestimmt, das bei Erkennung durch eine T-Zelle zu der Proliferation von T-Zellen führt, die größer ist als die Basislinie (baseline). Dieses T-Zell-Epitop wird dann derart modifiziert, dass wenn das Peptid umfassend das Epitop in dem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert wird, es zu einer geringeren Proliferation als das Protein, das das unmodifizierte Epitop enthält, führt. Noch bevorzugter erzeugt das zu modifizierende Epitop mehr als 3 mal die Basislinien-T-Zellproliferation in einer Probe. Sofern modifiziert, produziert das Epitop weniger als 3 mal die Basislinien-T-Zellproliferation, vorzugsweise weniger als 2 mal die Basislinien-T-Zellproliferation und am bevorzugtesten weniger als oder im wesentlichen gleich der Basislinien-T-Zellproliferation in einer Probe.
Vorzugsweise wird das Epitop auf eine der folgenden Arten modifiziert: (a) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine analoge Sequenz von einem humanen Homolog des Proteins von Interesse ersetzt, d. h. humanes Subtilisin oder ein weiteres Humanprotease-abgeleitetes Subtilisin-ähnliches Molekül wie z. B. Furin oder die Kexine (siehe z. B. Methods in Enzymology, Vol. 244, (1994), Seiten 175 et seq, Roebroek et al., EMBO J., Vol. 5, Nr. 9, Seiten 2197–2202 (1986); Tomkinson et al., Biochem., Vol. 30, Seiten 168–174 (1991); Keifer et al., DNA and Cell Biol., Vol. 10, Nr. 10, Seiten 757–769 (1991)); (b) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine analoge Sequenz von einem nicht-humanen Homolog zu dem Protein von Interesse substituiert, wobei die analoge Sequenz eine geringere allergene Antwort infolge der T-Zell-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst; (c) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine Sequenz ersetzt, die die wesentlichen Tertiärstrukturattribute des Epitops im wesentlichen nachahmt, jedoch eine geringere allergene Antwort infolge der T-Zell-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst, oder (d) mit einer beliebigen Sequenz, die eine geringer allergene Antwort infolge der T-Zell-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst.
Ein mutiertes Protein mit einem modifizierten Epitop kann durch Modifizieren einer DNA hergestellt werden, die für ein Vorläuferprotein codiert, so dass die modifizierte DNA für das mutierte Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.
Das mutierte Protein ist für jede Zusammensetzung oder jedes Verfahren geeignet, für die das Vorläuferprotein bekanntermaßen geeignet ist. Wenn es sich z. B. bei dem Protein um eine Protease handelt, kann die Protease mit verminderter Allergenität als Komponente in Reinigungsprodukten wie Waschmitteln und Reinigungsmitteln von harten Oberflächen, als Hilfsmittel bei der Herstellung von Leder, bei der Behandlung von Textilien wie z. B. Wolle und/oder Seide zur Verminderung von Verfilzung, als Komponente in einem Körperpflegeprodukt, kosmetischem Produkt oder Gesichtscremeprodukt, und als Komponente in Tier- oder Haustiernahrung zur Verbesserung des Nährwerts der Nahrung eingesetzt werden. Gleichermaßen, wenn es sich bei dem Protein um eine Amylase handelt, kann die Amylase mit reduzierter Allergenität zur Verflüssigung von Stärke, als Komponente in Geschirrspülmittel, zum Entschlichten von Textilien, in einem Waschmittel oder für einen beliebigen weiteren Verwendungszweck, für den eine Amylase geeignet ist, eingesetzt werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es durch Messung der Proliferation von T-Zellen infolge der T-Zellen-Epitoperkennung möglich ist, Peptide zu identifizieren, die Epitope enthalten, die für die anfängliche Sensibilisierung eines Individuums verantwortlich sind. Das heißt, die T-Zell-Proliferation infolge der T-Zell-Epitoperkennung führt zur Sensibilisierung eines Individuums gegen das Peptid oder ein Protein, was dieses enthält. Die Neutralisierung solcher "sensibilisierenden" T-Zell-Epitope führt unausweichlich zu einem höheren Maß an Sicherheit für jene, die das Antigen, das das Epitop enthält, handhaben oder diesem auf andere Weise ausgesetzt sind, da sie nicht anfänglich sensibilisiert werden, wodurch die Herstellung von Ig-Antikörpern, die für eine allergische Reaktion nach einer nachfolgenden Exposition gegenüber dem Antigen typisch sind, verhindert wird.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Proteinen, einschließlich Enzymen, die mit einem deutlich kleineren Risiko für eine Sensibilisierung für die exponierten Individuen eingesetzt werden können. So können die Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung z. B. sicherer in Kosmetika wie z. B. Gesichtscremes, Reinigungsmitteln wie z. B. Waschmitteln, Reinigungsmitteln für harte Oberflächen und Vorwaschmitteln oder beliebigen weiteren Anwendungen von Proteinen, einschließlich Enzymen, worin eine menschliche Exposition ein notwendiges Nebenprodukt ist, eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A, B1, B2 und B3 zeigen die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) für Bacillus amyloliquefaciens Subtilisin (BPN') und eine partielle Restriktionsmappe dieses Gens.
2 zeigt die konservierten Aminosäurereste unter Subtilisinen von Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID Nr. 3) und Bacillus lentus (Wildtyp) (SEQ ID Nr. 4).
Die 3A und 3B zeigen eine Aminosäuresequenz-Anordnung von Proteasen vom Subtilisin-Typ von Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (SEQ ID Nr. 5) und Bacillus lentus Das Symbol * steht für die Abwesenheit von spezifischen Aminosäureresten im Vergleich zu Subtilisin BPN'.
Die 4 zeigt die additive T-Zellantwort von 16 Proben von peripherem mononukleärem Blut auf Peptide, die der Protease von Bacillus lentus entsprechen. Das Peptid E05 umfasst die Region umfassend Reste, die den Resten 170-173 in der Protease von Bacillus amyloliquefaciens entsprechen.
Die 5 zeigt die additive T-Zellantwort von 10 Proben von peripherem mononukleärem Blut auf Peptide, die dem humanen Subtilisinmolekül entsprechen. Die Peptide F10, F9, F8 und F7 enthalten alle die Aminosäuresequenz DQMD, die der Region entspricht, die Reste umfasst, welche den Resten 170-173 in der Protease von Bacillus amyloliquefaciens in dem Sequenz-Alignment von 3 entsprechen.
Die 6A und 6B/6C zeigen Aminosäurefolgen, die Peptiden entsprechen, die jeweils von der Sequenz von der Protease von Bacillus lentus und einem humanen Subtilisin abgeleitet sind.
Die 7 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem Subtilisin (SEQ ID Nr. 6).
Die 8 zeigt ein Aminosäuresequenz-Alignment von BPN' (Bacillus amyloliquefaciens) Protease, SAVINASE (Bacillus lentus) Protease und humanem Subtilisin (S2HSBT).
Die 9 zeigt die T-Zellantwort auf Peptide, die von der Protease von Bacillus lentus abgeleitet sind, in einer Probe, die einem Individuum entnommen wurde, von dem bekannt ist, dass es gegen die Protease von Bacillus lentus hypersensibel ist. Das Peptid E05 stellt die Region dar, die den Resten 170-173 in der Protease von Bacillus amyloliquefaciens entspricht.
Die 10 zeigt die T-Zellantwort auf verschiedene Alaninsubstitutionen in dem E05 Proteasepeptid von Bacillus lentus in einer Probe, die von einem Individuum genommen wurde, von dem bekannt ist, dass es gegen die Protease von Bacillus lentus hypersensibel ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von T-Zellepitopen bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung stellt ein Assay bereit, das Epitope wie folgt identifiziert: differenzierte dendritische Zellen werden mit naiven humanen CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen und mit einem Peptid von Interesse kombiniert. Insbesondere wird ein Verfahren bereitgestellt, worin ein T-Zellepitop erkannt wird, umfassend die Schritte von: (a) Erhalten aus einer einzelnen humanen Blutprobe eine Lösung von dendritischen Zellen und eine Lösung von naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen, (b) Promoten der Differenzierung in dieser Lösung von dendritischen Zellen, (c) Kombinieren der Lösung von differenzierten dendritischen Zellen und der naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen mit einem Peptid von Interesse, (d) Messen der Proliferation von T-Zellen im Schritt (c).
Das Peptid von Interesse, das gemäß dem Assay der vorliegenden Erfindung analysiert werden soll, ist von einem Protein oder einem Enzym abgeleitet, für welches eine reduzierte Allergenität erwünscht oder erforderlich ist. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Lokalisierung eines Epitops, das in einem Individuum oder einer Probe von Individuen eine Sensibilisierung verursachen kann, genau zu identifizieren. Gemäß einer besonders wirksamen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden eine Reihe von Peptidoligomeren hergestellt, die dem gesamten oder einem Teil des Proteins oder Enzyms entsprechen. Beispielsweise wird eine Peptidbibliothek produziert, die den relevanten Teil oder das gesamte Protein abdeckt. Eine besonders geeignete Art und Weise zur Herstellung der Peptide besteht darin, Überschneidungen in die Peptidbibliothek einzuführen, z. B. Herstellen eines ersten Peptids, das der Aminosäuresequenz 1-10 des betreffenden Proteins entspricht, eines zweiten Peptids, das der Aminosäuresequenz 4-14 des betreffenden Proteins entspricht, eines dritten Peptids, das der Aminosäuresequenz 7-17 des betreffenden Proteins entspricht, eines vierten Peptids, das der Aminosäuresequenz 10-20 des betreffenden Proteins entspricht, etc. ... bis repräsentative Peptide erzeugt worden sind, die dem gesamten Molekül entsprechen. Durch individuelle Analyse jedes der Peptide in dem Assay, das in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, ist es möglich, die Lokalisierung von Epitopen, die durch T-Zellen erkannt werden, genau zu identifizieren. In dem vorstehend angegebenen Beispiel ermöglicht die Reaktion von einem bestimmten Peptid, die größer ist als jene eines benachbarten Peptids, die Identifizierung der Epitop-Ankerregion innerhalb von drei Aminosäuren. Nach Bestimmen der Lokalisierung dieser Epitope ist es möglich, die Aminosäuren innerhalb jedes Epitops zu verändern, bis das Peptid eine weniger signifikante T-Zellantwort auslöst.
"Antigen-präsentierende Zelle", wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen eingesetzt wird, steht für eine Zelle des Immunsystems, die Antigen auf ihrer Oberfläche präsentiert, das durch Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen erkannt werden kann. Beispiele für Antigen-präsentierende Zellen sind dendritische Zellen, interdigitierende Zellen, aktivierte B-Zellen und Makrophagen.
"T-Zell-Proliferation", wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, steht für die Anzahl von T-Zellen, die während der Inkubation von T-Zellen mit den Antigen-präsentierenden Zellen produziert werden, mit oder ohne Antigen.
"Basislinien-T-Zell-Proliferation", wie sie in der vorliegenden Beschreibung angewendet wird, steht für die T-Zell-Proliferation, die normalerweise in einem Individuum als Antwort auf die Exposition gegenüber Antigen-präsentierenden Zellen in Abwesenheit von Peptid- oder Proteinantigen beobachtet wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurde das Level der Basislinien-T-Zell-Proliferation (baseline T-cell proliferation) auf der Grundlage jeder Probe für jedes Individuum als die Proliferation von T-Zellen als Antwort auf Antigen-präsentierende Zellen in Abwesenheit von Antigen bestimmt.
"T-Zell-Epitop" steht für ein Merkmal eines Peptids oder Proteins, das durch einen T-Zell-Rezeptor bei der Initiierung einer immunologischen Antwort gegen das Peptid, das dieses Antigen umfasst, erkannt wird. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die Erkennung von einem T-Zell-Epitop durch eine T-Zelle über einen Mechanismus abläuft, worin T-Zellen Peptidfragmente von Antigenen erkennen, die an Klasse I oder Klasse II Haupt-Histokompatibilitäts-Moleküle (major histocompatability, MHC), welche auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert sind, gebunden sind (siehe z. B. Moeller, G. ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses, Immunolgical Review, Vol. 98, Seite 187 (Copenhagen; Munksgaard) (1987).
Die Epitope, die nach dem Assay bestimmt werden, der in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bereitgestellt wird, werden anschließend modifiziert, um das allergene Potential des Proteins von Interesse zu reduzieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform produziert das zu modifizierende Epitop ein Level der T-Zell-Proliferation von mehr als 3 mal der Basislinien-T-Zell-Proliferation in einer Probe. Nach Modifizierung löst das Epitop weniger als 3 mal die Basislinien-Proliferation aus, vorzugsweise weniger als 2 mal die Basislinien-Proliferation und am bevorzugtesten weniger als oder im wesentlichen gleich der Basislinien-Proliferation in einer Probe.
Vorzugsweise wird das Epitop nach einer der folgenden Arten modifiziert: (a) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine analoge Sequenz von einem humanen Homolog des Proteins von Interesse substituiert; (b) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine analoge Sequenz von einem nicht-humanen Homolog zu dem Protein von Interesse substituiert, wobei die analoge Sequenz eine geringere allergene Antwort infolge der T-Zell-Epitop-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst, (c) die Aminosäuresequenz des Epitops wird durch eine Sequenz substituiert, die im wesentlichen die Haupttertiärstrukturattribute des Epitops nachahmt, jedoch eine geringere allergene Antwort infolge der T-Zell-Epitop-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst, oder (d) mit einer beliebigen Sequenz, die eine geringere allergene Antwort infolge der T-Zell-Epitop-Erkennung als jene des Proteins von Interesse auslöst.
"Probe", wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, umfasst mononukleäre Zellen, die naiv sind, d. h. nicht sensibilisiert gegen das betreffende Antigen.
"Homolog", wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, steht für ein Protein oder Enzym, das eine ähnliche katalytische Wirkung, Struktur und/oder Verwendung wie das Protein von Interesse aufweist. Es ist wünschenswert, ein Homolog zu finden, das eine Tertiärstruktur und/oder Primärstruktur ähnlich mit jener des Proteins von Interesse besitzt, da der Austausch des Epitops in dem Protein von Interesse mit einem analogen Segment des Homologs die Störung (disruptiveness) der Änderung vermindern wird. Folglich stellen eng homologe Enzyme die am meisten bevorzugte Quelle für Epitop-Substitutionen dar. Alternativ dazu, sofern möglich, ist es vorteilhaft, nach humanen Analoga für ein bestimmtes Protein zu suchen. Zum Beispiel sollte die Substitution eines spezifischen Epitops in einem bakteriellen Subtilisin durch eine Sequenz von einem humanen Analog von Subtilisin (d. h. humanes Subtilisin) zu einer geringeren Allergenität in dem bakteriellen Protein führen.
Eine "analoge" Sequenz kann bestimmt werden, indem gewährleistet wird, dass die Austausch-Aminosäuren eine ähnliche Funktion, Tertiärstruktur und/oder konservierte Reste wie die Aminosäuren in dem Protein von Interesse am Epitop oder in der Nähe des Epitops besitzen. Sofern die Epitopregion z. B. eine Alpha-Helix-Struktur oder eine Beta-Faltblatt-Struktur besitzt, sollten folglich die Austausch-Aminosäuren diese spezifische Struktur beibehalten.
Während sich die vorliegende Erfindung auf alle Proteine erstreckt, für die eine Verminderung der Allergenität erwünscht wird, wird um der Einfachheit willen im folgenden eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beschrieben, die Modifikation einer Protease. Bei Proteasen handelt es sich um Carbonylhydrolasen, die im allgemeinen die Spaltung von Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden bewirken. Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, steht "Protease" für eine natürlich auftretende Protease oder eine rekombinante Protease. Natürlich auftretende Proteasen umfassen α-Aminoacylpeptid-Hydrolase, Peptidylaminosäure-Hydrolase, Acylamino-Hydrolase, Serin-Carboxypeptidase, Metallocarboxypeptidase, Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Serin-, Metallo-, Thiol- und Säure-Proteasen sind ebenfalls umfasst, wie auch Endo- und Exo-Proteasen.
Subtilisine sind bakterielle oder pilzliche Proteasen, die im allgemeinen die Spaltung von Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden bewirken. Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, steht "Subtilisin" für ein natürlich vorkommendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Es ist bekannt, dass eine Reihe von natürlich auftretenden Subtilisinen von verschiedenen mikrobiellen Spezies produziert und häufig sekretiert werden. Die Aminosäuresequenzen der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Jedoch weisen die Subtilisine in dieser Reihe die gleiche oder eine ähnliche Art der proteolytischen Aktivität auf. Diese Klasse von Serin-Proteasen hat eine gemeinsame Aminosäuresequenz gemeinsam, die eine katalytische Triade definiert, welche sie von der Chymotrypsin-verwandten Klasse von Serin-Proteasen unterscheidet. Die Subtilisine und Chymotrypsin-verwandten Serin-Proteasen besitzen beide eine katalytische Triade, die Aspartat, Histidin und Serin umfasst. In den Subtilisin-verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, beim Lesen vom Amino- zum Carboxy-Terminus, Aspartat-Histidin-Serin. In den Chymotrypsin-verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Folglich bezieht sich Subtilisin in der vorliegenden Anmeldung auf eine Serin-Protease mit der katalytischen Triade von Subtilisin-verwandten Proteasen. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die in der 3 in der vorliegenden Beschreibung identifizierten Subtilisine. Im allgemeinen und für die Anwendungszwecke gemäß der vorliegenden Erfindung entspricht die Nummerierung der Aminosäuren in Proteasen den Zahlen, die der reifen Subtilisitensequenz von Bacillus amyloliquefaciens in der 1 zugeordnet wurden.
"Rekombinantes Subtilisin" oder "rekombinante Protease" beziehen sich auf ein Subtilisin oder eine Protease, worin die DNA-Sequenz, die für das Subtilisin oder die Protease codiert, modifiziert ist, um eine Variante (oder mutierte) DNA-Sequenz zu produzieren, die für die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz codiert. Geeignete Verfahren zur Herstellung solch einer Modifikation, und die mit jenen kombiniert werden können, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart sind, umfassen die im US Patent 4,760,025 (RE 34,606), US Patent 5,204,015 und US Patent 5,185,258 offenbarten.
"Nicht-humane Subtilisine" und die DNA, die für diese codieren, können aus vielen prokaryotischen oder eukaryotischen-Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele für prokaryotische Organismen umfassen gramnegative Organismen wie z. B. E. coli oder Pseudomonas und grampositive Bakterien wie z. B. Micrococcus oder Bacillus Beispiele für eukaryotische Organismen, aus denen Subtilisin und deren Gene erhalten werden können, umfassen Hefen wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pilze wie z. B. Aspergillus sp.
"Humanes Subtilisin" steht für Proteine menschlichen Ursprungs, die eine katalytische Aktivität vom Subtilisin-Typ aufweisen, z. B. die Kexin-Familie von Proteasen menschlicher Abstammung. Ein Beispiel für solch ein Protein ist durch die Sequenz in der 7 dargestellt. Ferner werden Derivate oder Homologe von humanem Subtilisin, einschließlich jenen aus nicht-menschlichen Quellen wie Maus oder Kaninchen, die die wesentliche Fähigkeit zur Hydrolyse von Peptidbindungen beibehalten und wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 65% und noch bevorzugter wenigstens 80% Homologie mit dem Protein der 7 aufweisen, als humane Subtilisine für den Verwendungszweck der vorliegenden Erfindung angesehen.
Eine "Protease-Variante" besitzt eine Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz einer "Vorläufer-Protease" abgeleitet ist. Die Vorläufer-Proteasen umfassen natürlich vorkommende Proteasen und rekombinante Proteasen. Die Aminosäuresequenz der Proteasen-Variante ist "abgeleitet" von der Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease durch Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz. Solch eine Modifizierung ist von der "Vorläufer-DNA-Sequenz", die für die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease codiert, statt einer Manipulation des Vorläufer-Protease-Enzyms per se. Geeignete Methoden zur Manipulierung der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen Methoden, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart sind, wie auch Methoden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. EP 0 328 299 , WO 89/06279 und die US Patente und Anmeldungen, auf die bereits vorstehend in der Beschreibung Bezug genommen wurde).
Die in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Aminosäurepositionsnummern beziehen sich auf jene, die der reifen Subtilisinsequenz von Bacillus amyloliquefaciens, die in der 1 dargestellt ist, zugeordnet wurden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieses speziellen Subtilisins beschränkt, sondern erstreckt sich auf Vorläufer-Proteasen, die Aminosäurereste an Positionen enthalten, die "äquivalent" zu den besonderen identifizierten Resten im Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Vorläufer-Protease um Subtilisin von Bacillus lentus und die Substitutionen, Deletionen oder Insertionen werden an dem äquivalenten Aminosäurerest in B. lentus vorgenommen, entsprechend den vorstehend angegeben.
Ein Rest (Aminosäure) einer Vorläufer-Protease ist äquivalent zu einem Rest des Subtilisins von Bacillus amyloliquefaciens, wenn es entweder homolog (d. h. der Position in entweder der primären oder der tertiären Struktur entsprechend) oder analog zu einem bestimmten Rest oder einem Teil dieses Rests in Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens ist (d. h. mit der gleichen oder einer ähnlichen funktionellen Kapazität zum Kombinieren, Reagieren oder chemisch-Wechselwirken).
Um eine Homologie im Hinblick auf die Primärstruktur festzustellen, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-Protease direkt mit der Primärsequenz von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens verglichen und insbesondere mit einem Set von Resten, die bekanntermaßen in Subtilisin invariant sind, und deren Sequenz bekannt ist. Beispielsweise zeigt die 2 in der vorliegenden Beschreibung die konservierten Reste zwischen Subtilisin von B. amyloliquefaciens und Subtilisin von B. lentus Nach einem Alignment der konservierten Reste, wobei die notwendigen Insertionen und Deletionen ermöglicht werden, um das Alignment beizubehalten (d. h. das Vermeiden der Eliminierung von konservierten Resten durch zufällige Deletion und Insertion), werden die Reste, die äquivalent zu bestimmten Aminosäuren in der Primärsequenz von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens sind, definiert. Das Alignment von konservierten Resten sollte vorzugsweise 100% solcher Reste konservieren. Jedoch ist auch ein Alignment von mehr als 75% oder so gering wie 50% der konservierten Reste ebenfalls geeignet, um äquivalente Reste zu definieren. Die Konservierung der katalytischen Triade, Asp32/His64/Ser221 sollte beibehalten werden.
Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) und Bacillus lentus einem Alignment unterzogen werden, um die maximale Menge an Homologie zwischen Aminosäuresequenzen bereitzustellen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, dass es eine Reihe von konservierten Resten gibt, die in jeder Sequenz enthalten sind. Die konservierten Reste zwischen BPN' und B. lentus sind in der 2 identifiziert.
Diese konservierten Reste können folglich verwendet werden, um die korrespondierenden äquivalenten Aminosäurereste von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens in anderen Subtilisinen wie z. B. Subtilisin von Bacillus lentus (PCT Veröffentlichung Nr. WO 89/06279, veröffentlicht Juli 13, 1989), dem bevorzugten Protease-Vorläufer- Enzym in der vorliegenden Beschreibung, oder dem Subtilisin, das als PB92 bezeichnet wird ( EP 0 328 299 ), das mit dem bevorzugten Subtilisin von Bacillus lentus hoch homolog ist, zu definieren. Die Aminosäuresequenzen von einigen dieser Subtilisine sind in den 3A und 3B mit der Sequenz von dem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens als Alignment dargestellt, um die maximale Homologie von konservierten Resten zu ergeben. Es ist festzustellen, dass es in der Sequenz von Bacillus lentus eine Reihe von Deletionen gibt im Vergleich zum Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens Beispielsweise handelt es sich bei der äquivalenten Aminosäure für Val165 im Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens in den anderen Subtilisinen um Isoleucin für B. lentus und B. licheniformis.
Ferner ist beispielsweise die Aminosäure an Position +170 Lysin (K) in sowohl dem Subtilisin von B. amyloliquefaciens als auch dem Subtilisin von B. licheniformis, und Arginin (R) in Savinase. In einer Ausführungsform der Proteasevarianten gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedoch das Aminosäureäquivalent zu +170 in Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens durch Asparaginsäure (D) substituiert. Die Abkürzungen und Einbuchstabencodes für alle Aminosäuren in der vorliegenden Erfindung richten sich nach dem PatentIn User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, Seite 101.
"Äquivalente Reste" können auch definiert werden, indem die Homologie auf dem Niveau der Tertiärstruktur für eine Vorläufer-Protease bestimmt wird, deren Tertiärstruktur mittels Röntgenstrahlkristallographie bestimmt worden ist. Äquivalente Reste werden als jene definiert, für die die Atomkoordinaten von 2 oder mehr der Hauptkettenatome eines bestimmten Aminosäurerestes der Vorläufer-Protease und des Subtilisins von Bacillus amyloliquefaciens (N auf N, CA auf CA, C auf C und O auf O) innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm nach Alignment sind. Das Alignment wird erzielt, nachdem das beste Modell orientiert und positioniert worden ist, um die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der fraglichen Protease zum Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens zu ergeben. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Beugungsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung ergibt.
Äquivalente Reste, die funktionell analog zu einem bestimmten Rest vom Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens sind, werden als jene Aminosäuren der Vorläufer-Protease definiert, die eine solche Konformation annehmen können, dass sie die Proteinstruktur, die Substratbindung oder die Katalyse auf eine definierte Weise und zurückzuführen auf einen bestimmten Rest des Subtilisins von Bacillus amyloliquefaciens entweder verändern, modifizieren oder dazu beitragen. Ferner gibt es jene Reste der Vorläufer-Protease (für die eine Tertiärstruktur mittels Röntgenstrahlkristallographie erhalten worden ist), die eine analoge Position in dem Umfang besetzen, dass auch wenn die Hauptkettenatome des gegebenen Restes nicht die Kriterien der Äquivalenz auf der Basis des Besetzens einer homologen Position erfüllen, die Atomkoordinaten von wenigstens zwei der Seitenkettenatome des Restes innerhalb von 0,13 nm der entsprechenden Seitenkettenatome von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens liegen. Die Koordinaten der dreidimensionalen Struktur von Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens sind in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 251 446 (äquivalent zum US Patent 5,182,204) dargestellt und können wie vorstehend beschrieben verwendet werden, um die äquivalenten Reste auf dem Niveau der Tertiärstruktur zu bestimmen.
Einige der Reste, die für eine Substitution, Insertion oder Deletion identifiziert worden sind, sind konservierte Reste, während andere keine sind. Im Fall von Resten, die nicht konserviert sind, ist der Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren beschränkt auf Substitutionen, die eine Variante produzieren, die eine Aminosäuresequenz besitzt, die nicht einer in der Natur gefundenen entspricht. Im Fall von konservierten Resten sollten solche Austäusche nicht zu einer natürlich auftretenden Sequenz führen. Die Proteasevarianten gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die reifen Formen von Proteasevarianten, wie auch Pro- und Präpro-Formen solcher Proteasevarianten. Die Präpro-Formen sind die bevorzugten Konstruktionen, da dies die Expression, Sekretion und Reifung der Proteasevarianten erleichtert.
"Prosequenz" bezieht sich auf eine Sequenz von Aminosäuren, die am N-terminalen Teil der reifen Form einer Protease gebunden ist, und deren Entfernung zum Auftreten der "reifen" (mature) Form der Protease führt. Viele proteolytische Enzyme werden in der Natur als translationale Proenzymprodukte gefunden und werden in Abwesenheit von post-translationalem Processing auf diese Weise exprimiert. Eine bevorzugte Prosequenz zur Herstellung von Proteasevarianten ist die mutmaßliche Prosequenz vom Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens, auch wenn andere Protease-Prosequenzen verwendet werden können.
Eine "Signalsequenz" oder "Präsequenz" bezieht sich auf eine beliebige Sequenz von Aminosäuren, die an dem N-terminalen Teil einer Protease oder an dem N-terminalen Teil einer Proprotease gebunden ist, die an der Sekretion der reifen Form oder der Proform der Protease beteiligt sein kann. Bei dieser Definition von Signalsequenz handelt es sich um eine funktionelle, die alle jenen Aminosäuresequenzen umfassen soll, die durch den N-terminalen Teil des Protease-Gens codiert werden, die an der Ausführung der Sekretion der Protease unter nativen Bedingungen beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung verwendet solche Sequenzen zur Ausführung der Sekretion der Proteasevarianten, wie in der vorliegenden Beschreibung definiert. Eine mögliche Signalsequenz umfasst die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz von Subtilisin von Bacillus subtilis fusioniert mit dem Rest der Signalsequenz von Subtilisin von Bacillus lentus (ATCC 21536).
Eine "Präpro-Form" einer Proteasevariante besteht aus der reifen Form der Protease mit einer Prosequenz in funktionsfähiger Verknüpfung an den Aminoterminus der Protease und mit einer Prä- oder Signalsequenz in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Aminoterminus der Prosequenz.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer geeigneten Kontrollsequenz ist, welches in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt auszuführen. Solche Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor zur Durchführung der Transkription, eine optionale Operatorsequenz zur Kontrolle der Transkription, eine Sequenz codierend für geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation kontrollieren. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Phagen-Teilchen oder einfach um ein potentielles genomisches Insert handeln. Sobald in einem geeigneten Wirt transformiert, kann sich der Vektor replizieren und unabhängig von dem Wirtsgenom funktionieren, oder kann sich in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" zum Teil abwechselnd verwendet, da das Plasmid zur Zeit die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Jedoch können auch andere Formen von Expressionsvektoren, die äquivalenten Formen dienen und die im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden, ebenfalls verwendet werden.
Bei den "Wirtszellen", die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, handelt es sich im allgemeinen um prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise nach den Verfahren manipuliert worden sind, die im US Patent 4,760,025 (RE 34,606) offenbart sind, um sie unfähig zu machen, enzymatisch-aktive Endoproteasen zu sekretieren. Eine bevorzugte Wirtszelle zur Expression von Protease ist der Bacillus-Stamm BG2036, der mangelhaft ist an enzymatisch aktiver neutraler Protease und alkalischer Protease (Subtilisin). Die Konstruktion vom Stamm BG2036 ist ausführlich im US Patent 5,264,366 beschrieben. Weitere Wirtszellen zur Expression von Protease umfassen Bacillus subtilis I168 (ebenfalls beschrieben im US Patent 4,760,025 (RE 34,606) und dem US Patent 5,264,366), wie auch ein beliebiger geeigneter Bacillus-Stamm wie z. B. B. licheniformis, B. lentus, usw.
Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert worden sind. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren, die für die Proteasevariante codieren, oder die gewünschte Proteasevariante zu exprimieren. Im Fall von Vektoren, die die Prä- oder Präpro-Form der Proteasevarianten codieren, werden solche Varianten, wenn sie exprimiert sind, üblicherweise von der Wirtszelle in das Wirtszellenmedium sekretiert.
"Funktionsfähig verknüpft", wenn es die Verbindung zwischen zwei DNA-Regionen beschreibt, bedeutet einfach, dass sie funktionell miteinander in Beziehung stehen. Beispielsweise ist eine Präsequenz in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Peptid, wenn sie als Signalsequenz funktioniert, die an der Sekretion der reifen Form des Proteins beteiligt ist, was am wahrscheinlichsten die Spaltung der Signalsequenz umfasst. Ein Promotor ist in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer codierenden Sequenz, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; eine Ribosomen-Bindungsstelle ist in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer codierenden Sequenz, wenn sie derart angeordnet ist, dass sie die Translation ermöglicht.
Die Gene, die für die natürlich auftretende Vorläufer-Protease codieren, können in Übereinstimmung mit den allgemeinen Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Diese Methoden umfassen im allgemeinen das Synthetisieren von markierten Sonden mit mutmaßlichen Sequenzen, die für Regionen der Protease von Interesse codieren, das Herstellen von genomischen Bibliotheken aus Organismen, die die Protease exprimieren, und das Screenen der Bibliotheken für das Gen von Interesse durch Hybridisierung der Sonden. Positiv hybridisierende Klone werden anschließend auf einer Karte dargestellt und sequenziert.
Die klonierte Protease wird dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, um die Protease zu exprimieren. Das Protease-Gen wird anschließend in ein "high-copy-number"-Plasmid legiert. Dieses Plasmid repliziert in Wirten in dem Sinne, dass es die wohlbekannten Elemente, die zur Plasmidreplikation notwendig sind, enthält: einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem betreffenden Gen (der als eigener homologer Promotor des Gens eingeführt werden kann, sofern er von dem Wirt erkannt, d. h. transkribiert wird), eine Transkription-Termination und Polyadenylierungsregion (notwendig für die Stabilität der mRNA, die durch den Wirt von dem Protease-Gen in gewissen eukaryotischen Wirtszellen transkribiert wird), die exogen ist oder durch die endogene Terminatorregion des Protease-Gens bereitgestellt wird und vorzugsweise; ein Selektionsgen wie z. B. ein Antibiotikaresistenzgen, das eine kontinuierliche Kulturerhaltung von Plasmid-infizierten Wirtszellen durch Wachstum in Antibiotika-enthaltenden Medien ermöglicht. "High-copy-number"-Plasmide enthalten auch einen Ursprung der Replikation für den Wirt, wodurch die Erzeugung von hohen Anzahlen von Plasmiden in dem Cytoplasma ohne chromosomale Beschränkungen ermöglicht wird. Es ist jedoch innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, multiple Kopien des Protease-Gens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert, die für eine homologe Rekombination besonders empfänglich sind.
Gemäß einer Ausführungsform kann es sich bei dem Gen um ein natürliches Gen wie z. B. jenes von B. lentus oder B. amyloliquefaciens handeln. Alternativ dazu kann ein synthetisches Gen, das für eine natürlich auftretende oder mutierte Vorläufer-Protease codiert, hergestellt werden. In solch einem Ansatz wird die DNA und/oder die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease bestimmt. Multiple, überlappende synthetische Einzelstrang-DNA-Fragmente werden anschließend synthetisiert, die nach Hybridisierung und Ligation eine synthetische DNA produzieren, die für die Vorläufer-Protease codiert. Ein Beispiel für eine synthetische Gen-Konstruktion ist im Beispiel 3 des US Patents 5,204,015 angegeben.
Sobald das natürlich vorkommende oder synthetische Vorläufer-Protease-Gen geklont worden ist, werden eine Reihe von Modifikationen durchgeführt, um die Verwendung des Gens über die Synthese der natürlich vorkommenden Vorläufer-Protease hinaus zu verbessern. Solche Modifikationen umfassen die Produktion von rekombinanten Proteasen, wie im US Patent 4,760,025 (RE 34,606) und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 251 446 offenbart, und die Herstellung von Proteasevarianten, wie sie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind.
Die folgende Kassetten-Mutagenese-Methode kann verwendet werden, um die Konstruktion der Proteasevarianten gemäß der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen, wenn auch andere Verfahren verwendet werden können. Als erstes wird das natürlich vorkommende Gen, das für die Protease codiert, erhalten, und insgesamt oder teilweise sequenziert. Anschließend wird die Sequenz für eine Stelle gescannt, an der es gewünscht ist, eine Mutation (Deletion, Insertion oder Substitution) von einer oder mehreren Aminosäuren in dem codierten Enzym durchzuführen. Die Sequenzen, die diese Stelle flankieren, werden auf das Vorliegen von Restriktionsschnittstellen zum Austausch eines kurzen Segments des Gens mit einem Oligonukleotid-Pool, der bei Expression für verschiedene Mutanten codiert, untersucht. Solche Restriktionsschnittstellen sind vorzugsweise einzigartige Stellen innerhalb des Protease-Gens, so dass der Austauch des Gensegments erleichtert wird. Es kann jedoch jede geeignete Restriktionsschnittstelle verwendet werden, die in dem Protease-Gen nicht übermäßig redundant ist, mit der Maßgabe, dass die Genfragmente, die durch den Restriktionsverdau erzeugt werden, in richtiger Reihenfolge wieder zusammengesetzt werden können. Wenn keine Restriktionsschnittstellen an Orten innerhalb einer geeigneten Distanz von der ausgewählten Stelle vorliegen (von 10 bis 15 Nukleotiden), werden solche Stellen durch Substituieren von Nukleotiden in dem Gen auf solche Art und Weise generiert, dass weder das Leseraster noch die codierten Aminosäuren in der Endkonstruktion verändert werden. Die Mutation des Gens zur Änderung von dessen Sequenz, um mit der gewünschten Sequenz überein zu stimmen, wird mittels M13-Primer-Extension in Übereinstimmung mit allgemein bekannten Methoden vorgenommen. Die Aufgabe, geeignete flankierende Regionen zu lokalisieren und die erforderlichen Änderungen festzustellen, um an zwei geeignete Restriktionsschnittsteüen-Sequenzen zu gelangen, wird durch die Redundanz des genetischen Codes, eine Restriktionsenzymmappe des Gens und die große Anzahl von verschiedenen Restriktionsenzymen zur Routine. Man beachte, dass wenn eine geeignete flankierende Restriktionsschnittstelle zur Verfügung steht, das vorstehend beschriebene Verfahren nur im Zusammenhang mit der flankierenden Region, die keine Schnittstelle enthält, verwendet werden muss.
Sobald die natürlich auftretende DNA oder synthetische DNA kloniert ist, werden die Restriktionsschnittstellen, die die zu mutierenden Positionen flankieren, mit den verwandten Restriktionsenzymen verdaut und eine Vielzahl von Endterminikomplementären Oligonukleotid-Kassetten werden in das Gen ligiert. Durch dieses Verfahren wird die Mutagenese vereinfacht, da alle Oligonukleotide derart synthetisiert werden können, dass sie die gleichen Restriktionsschnittstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker sind notwendig, um die Restriktionsschnittstellen zu erzeugen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht die Zielsetzung darin, eine abweichende Protease mit einem veränderten allergenen Potential im Vergleich zur Vorläufer-Protease bereitzustellen, da das Erniedrigen dieses Potentials eine sicherere Verwendung des Enzyms ermöglicht. Während die vorliegende Erfindung zur Erniedrigung des allergenen Potentials geeignet ist, können die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegebenen Mutationen in Kombination mit im Stand der Technik bekannten Mutationen verwendet werden, um zu einer veränderten thermischen Stabilität und/oder veränderten Substratspezifizität, einer modifizierten Aktivität oder einer veränderten alkalischen Stabilität im Vergleich zu dem Vorläufer zu führen.
Viele dieser Proteasevarianten gemäß der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Formulierung von verschiedenen Reinigungsmittelzusammensetzungen (detergent compositions). Eine Reihe von bekannten Verbindungen stellen geeignete oberflächenaktive Mittel dar, die in Zusammensetzungen, die die Proteasemutanten gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, geeignet sind. Diese umfassen nichtionische, anionische, kationische, anionische oder zwitterionische Detergentien wie in der US 4,404,128 von Barry J. Anderson und der US 4,261,868 von Jiri Flora, et al., beschrieben. Eine geeignete Detergensformulierung ist jene, die im Beispiel 7 von dem US Patent 5,204,015 beschrieben ist. Dem Fachmann sind die unterschiedlichen Formulierungen geläufig, die als Reinigungsmittelzusammensetzungen (cleaning compositions) verwendet werden können. Zusätzlich zu typischen Waschmittelzusammensetzungen können die Proteasevarianten gemäß der vorliegenden Erfindung selbstverständlich für jeden beliebigen Zweck eingesetzt werden, für den native oder Wildtyp-Proteasen verwendet werden. Folglich können diese Varianten z. B. in Seifenstücken oder Flüssigseifenanwendungen, Geschirrspülmitteln, Kontaktlinsenreinigungslösungen oder -produkten, Peptidhydrolyse, Abwasserbehandlung, Textilanwendungen, als Fusions-Spaltungs-Enzyme bei der Proteinherstellung usw. eingesetzt werden. Die Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung können zusätzlich zu der verminderten Allergenität eine verbesserte Leistungsfähigkeit in einer Reinigungsmittelzusammensetzung aufweisen (im Vergleich zu dem Vorläufer). Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, wird eine verbesserte Leistungsfähigkeit in einem Reinigungsmittel definiert als verbesserte Reinigung von gewissen Enzymempfindlichen Flecken wie Gras oder Blut, bestimmt mittels üblicher Auswertung nach einem Standard-Waschcyclus.
Die modifizierten Proteasen können zu bekannten pulverförmigen und flüssigen Reinigungsmitteln mit einem pH zwischen 6,5 und 12,0 mit Gehalten von etwa 0,01 bis etwa 5 Gew.-% (vorzugsweise 0,1 bis 0,5 Gew.-%) formuliert werden. Diese Reinigungswaschmittelzusammensetzungen können ferner weitere Enzyme wie z. B. bekannte Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Lipasen oder Endoglycosidasen enthalten, wie auch Builder und Stabilisatoren.
Die Zugabe von Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung zu konventionellen Reinigungsmittelzusammensetzungen führt zu keiner besonderen Anwendungsbeschränkung. In anderen Worten, jede Temperatur und jeder pH, der für das Reinigungsmittel geeignet ist, ist auch für die vorliegenden Zusammensetzungen geeignet, solange der pH in dem vorliegend angegebenen Bereich liegt und die Temperatur unter der Denaturierungstemperatur der beschriebenen Protease liegt. Ferner können Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Reinigungsmittel ohne Detergentien verwendet werden, entweder allein oder in Kombination mit Buildern oder Stabilisatoren.
Die abgewandelten Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung können in Tierfutter wie beispielsweise als Teil von Tierfutteradditiven wie z. B. in der US 5,612,055 , der US 5,314,692 und der US 5,147,642 beschrieben, eingeführt werden.
Eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Textils kann abgewandelte Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Zusammensetzung kann beispielsweise zur Behandlung von Seide oder Wolle eingesetzt werden, wie in Veröffentlichungen wie z. B. der RD 216,034 , EP 134,267 ; US 4,533,359 und EP 344,259 beschrieben.
Das Folgende ist beispielhaft beschrieben und ist nicht als eine Beschränkung des Schutzbereichs der Ansprüche auszulegen.
Die Varianten können nach im Stand der Technik wohlbekannten Methoden für die proteolytische Aktivität gescreent werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Assay für die Identifizierung von Peptid-T-Zell-Epitopen unter Verwendung von naiven humanen T-Zellen
Frische humane periphere Blutzellen wurden von "naiven" Menschen gesammelt, d. h. Personen, von denen nicht bekannt ist, dass sie gegenüber der Protease von Bacillus lentus ausgesetzt oder sensibilisiert sind, zur Bestimmung von antigenen Epitopen in der Protease von Bacillus lentus und humanem Subtilisin. "Naive Menschen" soll bedeuten, dass von dem Individuum nicht bekannt ist, dass es in der Vergangenheit gegenüber der Protease ausgesetzt war oder dagegen eine Reaktion entwickelt hat. Periphere mononukleäre Blutzellen (gelagert bei Raumtemperatur, nicht älter als 24 Stunden) wurden zur Anwendung wie folgt hergestellt: ungefähr 30 ml einer Lösung von einer Leukozytenfilm-Präparation aus einer Einheit Vollblut wurden zu 50 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Lösung (DPBS) gegeben und in zwei Röhrchen aufgespalten. Die Proben wurden mit 12,5 ml Lymphoprep Dichtetrennungsmedium unterlegt (Nycomed Dichte 1,077 g/ml). Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 600 G zentrifugiert. Die Grenzfläche der beiden Phasen wurde gesammelt, gepoolt und in DPBS gewaschen. Die Zelldichte der erhaltenen Lösung wurde mittels einem Hämocytometer gemessen. Die Lebensfähigkeit wurde mittels Trypanblau-Ausschluss gemessen.
Aus der erhaltenen Lösung wurde eine Kultur von differenzierten dendritischen Zellen aus der Probe von mononukleären Zellen des peripheren Blutes mit einer Dichte von 10⁸ Zellen pro 75 ml Kulturflasche in einer Lösung wie folgt hergestellt:

(1) 50 ml serumfreies AIM V Medium (Gibco) wurde mit einer 1:100 Verdünnung Beta-Mercaptoethanol (Gibco) supplementiert. Die Flaschen wurden für 2 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ flach hingelegt, um die Haftung von Monocyten an der Flaschenwand zu ermöglichen.
(2) Die Differenzierung der Monocytenzellen zu dendritischen Zellen war wie folgt: nichthaftende Zellen wurden entfernt und die resultierenden haftenden Zellen (Monocyten) wurden mit 30 ml AIM V, 800 Einheiten/ml GM-CSF (Endogen) und 500 Einheiten/ml IL-4 (Endogen) gemischt, die erhaltene Mischung wurde für 5 Tage unter Bedingungen von 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Nach 5 Tagen wurde das Cytokin TNFα (Endogen) mit 0,2 Einheiten/ml zugegeben, und das Cytokin IL-1α (Endogen) wurde in einer Endkonzentration von 50 Einheiten/ml zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C in 5% CO₂ für weitere 2 Tage inkubiert.
(3) Am siebten Tag wurde Mitomycin C in einer Konzentration von 50 Mikrogramm/ml zugegeben, um das Wachstum der jetzt differenzierten dendritischen Zellkultur zu stoppen. Die Lösung wurde für 60 Minuten bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Dendritische Zellen wurden gesammelt, indem die haftenden Zellen von dem Boden der Flasche mit einem Zellschaber vorsichtig abgeschabt wurden. Die haftenden und nicht-haftenden Zellen wurden anschließend bei 600 G für 5 Minuten zentrifugiert, in DPBS gewaschen und gezählt.
(4) Die hergestellten dendritischen Zellen wurden in einer 96 Wellplatte mit Rundböden bei 2 × 10⁴/Well in 100 Mikroliter Gesamtvolumen von AIM V Medium gegeben.

CD4⁺-T-Zellen wurden aus gefrorenen Aliquots der peripheren Blutzellenprobe hergestellt, die zur Verwendung der dendritischen Zellen eingesetzt worden waren, unter Verwendung des humanen CD4⁺ Cellect Kits (Biotex) nach den Herstelleranweisungen mit den folgenden Modifikationen: die Aliquots wurden aufgetaut und gewaschen, so dass ungefähr 10⁸ Zellen pro Cellect-Säule verwendet werden; die Zellen wurden in 4 ml DPBS und 1 ml des Cell-Reagens von dem Cellect-Kit resuspendiert, die Lösung wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die resultierende Lösung wurde für 5 Minuten bei 600 G bei Raumtemperatur zentrifugiert und das Pellet in 2 ml DPBS resuspendiert und auf die Cellect-Säulen aufgetragen. Der Abfluss aus den Säulen wurde in 2% humanem Serum in DPBS gesammelt. Die resultierende CD4⁺-Zelllösung wurde zentrifugiert, in AIM V Medium resuspendiert und die Dichte wurde gezählt.
Die CD4⁺-T-Zell-Suspension wurde in einer Dichte von 2 × 10⁶/ml in AIM V Medium resuspendiert, um eine effiziente Handhabung der 96 Wellplatte zu ermöglichen.
Das Peptidantigen wird aus einer 1 M Stocklösung in DMSO durch Verdünnung in AIM V Medium in einem Verhältnis von 1:10 hergestellt. 10 Mikroliter der Stocklösung werden in jedes Well der 96 Wellplatte enthaltend die differenzierten dendritischen Zellen eingeführt. 100 Mikroliter der verdünnten CD4+-T-Zell-Lösung, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wird zusätzlich zu jedem Well gegeben. Geeignete Kontrollen umfassen verdünnte DMSO-Blindproben und Tetanusimpfstoffpositive Kontrollen.
Die Endkonzentrationen in jedem Well bei 210 Mikroliter Gesamtvolumen sind wie folgt:
2 × 10⁴ CD4⁺
2 × 10⁵ dendritische Zellen (R:S von 10:1)
5 mM Peptid
Beispiel 2
Identifizierung von T-Zell-Epitopen in Protease von Bacillus lentus und humanem Subtilisin
Peptide zur Verwendung in dem in Beispiel 1 beschriebenen Assay wurden ausgehend von der Aminosäuresequenz von Bacillus lentus und humanem Subtilisin hergestellt. Die Peptid-Antigene wurden wie folgt konstruiert. Aus der Aminosäuresequenz in voller Länge von entweder humanem Subtilisin oder der Protease von Bacillus lentus, in der 1 bereitgestellt, wurden 15mere synthetisch hergestellt, wobei jedes 15mer mit dem vorhergehenden und dem nachfolgenden 15mer bis auf 3 Reste überlappt.
Die verwendeten Peptide entsprechen den Aminosäureresteketten in Bacillus lentus, wie in der 8 bereitgestellt, und Peptide entsprechen den Aminosäureresten in humanem Subtilisin, wie in der 7 bereitgestellt. Die verwendeten Peptide, die den Proteasen entsprechen, sind in der 6 dargestellt. Alle Tests wurden mindestens zweifach durchgeführt. Alle beschriebenen Tests zeigten kräftige Positivkontrollen-Antworten gegen das Antigen Tetanusimpfstoff. Die Antworten wurden innerhalb jedes Experiments ermittelt, anschließend gegenüber einer Basislinienantwort normalisiert. Ein positives Vorkommnis wurde verzeichnet, wenn die Antwort wenigstens 3 mal die Basislinienantwort betrug.
Die immunogene Antwort (d. h. T-Zell-Proliferation) gegen die hergestellten Peptide aus humanem Subtilisin und Bacillus lentus wurde übereingestimmt und ist jeweils in den 4 und 5 dargestellt. Die T-Zell-Proliferation wurde mittels der inkorporierten Tritium-Methode gemessen. Die in den 4 und 5 dargestellten Ergebnisse als Vergleich der immunogenen additiven Antwort in 10 Individuen (4) und 16 Individuen (5) gegen verschiedene Peptide. Die Antwort ist als addierte Antwort dargestellt, wobei 1,0 der Basislinienantwort für jede Probe entspricht. Folglich steht in der 4 die Ablesung von 10,0 oder weniger für die Basislinienantwort und in der 5 steht eine Ablesung von 16,0 oder weniger für die Basislinienantwort.
Wie in den 4 und 5 dargestellt, zeigt die immunogene Antwort der naiven Blutproben von nichtsensibilisierten Individuen eine deutliche allergene Antwort gegen das Peptidfragment von Bacillus lentus entsprechend den Resten 170 bis 173 der Protease von Bacillus amyloliquefaciens Wie erwartet ruft das korrespondierende Fragment in humanem Subtilisin lediglich eine Basislinienantwort hervor.
Die 9 zeigt die T-Zell-Antwort gegen Peptide, die von der Protease von Bacillus lentus abgeleitet sind, in einer Probe, die von einem Individuum genommen wurde, das bekanntermaßen gegen die Protease von Bacillus lentus hypersensibel ist. Das Peptid E05 stellt die Region dar, die den 170 bis 173 in der Protease von Bacillus amyloliquefaciens entspricht. Wie in der 9 gezeigt, war das hypersensible Individuum hochreaktiv gegen das T-Zell-Epitop, das durch das Peptid E05 dargestellt wird. Dieses Ergebnis bestätigt, dass es bei der Ausführung des Assays gemäß der vorliegenden Erfindung möglich ist, die Hauptepitope, die durch die T-Zellen eines hypersensiblen Individuums identifiziert werden, vorherzusagen.
Die 10 zeigt die T-Zell-Antwort gegen verschiedene Alanin-Substitutionen in dem E05-Peptid, das von der Protease von Bacillus lentus abgeleitet ist, in einer Probe eines Individuums, das bekanntermaßen gegen die Protease von Bacillus lentus hypersensibel ist. Die Alanin-Substitutionen wurden als Substitutionen zum Zwecke der Bestimmung der Rolle von einem beliebigen spezifischen Rest innerhalb des Epitops eingesetzt. Die Legende von 10 bezieht sich auf die Position des Peptids, in dem ein Alanin substituiert wurde, d. h. in Peptid E06 (Sequenz GSISYPARYANAMAV), G zu A = 2, S zu A = 3, I zu A = 4, S zu A = S, Y zu A = 6, P zu A = 7, R zu A = 8, Y zu A = 9, N zu A = 10, M zu A = 11 und V zu A = 12. Wieinder 10 dargestellt, führt die Substitution von einem der Reste R170A, Y171A und/oder N173A in der Protease von Bacillus lentus zu einer dramatisch verringerten Antwort in der Blutprobe des hypersensiblen Individuums.
Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, dass die Reste 170, 171 und 173 für die T-Zell-Antwort innerhalb dieses Peptids entscheidend sind. Ferner ist es offensichtlich, dass diese Reste für die Initiierung einer allergischen Reaktion innerhalb der Protease von Bacillus lentus in hohem Maße verantwortlich sind.

Claims

Verfahren zum Bestimmen von T-Zell-Epitopen innerhalb eines Proteins umfassend die Schritte: (a) Erhalten einer Lösung von dendritischen Zellen und einer Lösung von naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen aus einer einzelnen Humanblutprobe; (b) Fördern der Differenzierung in der Lösung von dendritischen Zellen; (c) Vereinigen der Lösung von differenzierten dendritischen Zellen und der naiven CD4⁺- und/oder CD8⁺-T-Zellen mit einem Peptid von Interesse; (d) Messen der Proliferation von T-Zellen im Schritt (c).
Verfahren zum Reduzieren der Allergenität eines Proteins umfassend, nach Identifizierung eines T-Zell-Epitops in dem Protein nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1, das Modifizieren des Proteins, um das T-Zell-Epitop zu neutralisieren.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Epitop modifiziert wird durch: (a) Ersetzen der Aminosäuresequenz des Epitops durch eine analoge Sequenz aus einem humanen Homolog zum Protein von Interesse; (b) Ersetzen der Aminosäuresequenz des Epitops durch eine analoge Sequenz aus einem nicht-humanen Homolog zum Protein von Interesse, wobei die analoge Sequenz eine geringere allergene Antwort von T-Zellen als jene des Proteins von Interesse auslöst; oder (c) Ersetzen der Aminosäuresequenz des Epitops durch eine Sequenz, die die wesentlichen Tertiärstruktur-Attribute des Epitops im wesentlichen nachahmt, jedoch eine geringere allergene Antwort von T-Zellen als jene des Proteins von Interesse auslöst.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das Protein eine Protease ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Protease ein Subtilisin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, abhängig von Anspruch 3 (a), worin das Epitop durch Ersetzen der Aminosäuresequenz des Epitops durch eine Sequenz aus humanem Subtilisin, Furin oder einem Kexin modifiziert wird.