KR20010034776A - 인간 내에서 낮아진 알레르기 반응을 갖는 돌연변이단백질 및 이러한 단백질을 조립, 식별 및 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본발명은 단백질 돌연변이의 부모에 비해 안간 내에서 낮은 알레르기반응을 생성하는 신규의 향상된 단백질 돌연변이에 관한 것이다. 특히, 본발명은 에피토프를 인식하는 T-세포의 능력을 중화 또는 감소시켜 단백질에 대한 개인의 감작을 방지하는 것을 포함한다.

Description

인간 내에서 낮아진 알레르기 반응을 갖는 돌연변이 단백질 및 이러한 단백질을 조립, 식별 및 생산하는 방법{MUTANT PROTEINS HAVING LOWER ALLERGENIC RESPONSE IN HUMANS AND METHODS FOR CONSTRUCTING, IDENTIFYING AND PRODUCING SUCH PROTEINS}
산업적, 약제학적 및 상업적으로 사용되는 단백질은 그 보급이 증가하고 있다. 결과적으로, 이러한 보급으로 인한 증가된 노출로 인해 이러한 펩티드에 대한 특정인의 감작으로 인한 안전 위험이 생기고, 이에 의해 연속적인 노출은 유해하고 심지어 치명적일 수도 있는 극심한 알레르기 반응을 유발한다. 결과적으로, 산업, 예를 들면, 세탁용 세정제, 화장품, 직물 처리 등에서의 프로티아제의 유용성 및 예를 들면 세정 조건하에서의 더욱 효과적인 얼룩 제거를 갖는 향상된 프로티아제를 제공하기 위한 분야에서 수행되는 방대한 연구에도 불구하고, 산업에서의 프로티아제의 사용은 특정인에게 과민성 알레르기 반응을 생성하는 능력으로 인해 문제거리이다.
이러한 문제를 회피하기 위한 많은 연구가 행하여져 오고 있다. 프로티아제 사용으로 인한 면역학적 잠재성을 감소시키기 위한 여러 전략 중, 공기로 운반되는 프로티아제를 수반하는 먼지 입자 또는 에어로졸의 작업 공간을 조절하고 최소화시킴으로써 잠재적인 접촉을 감소시키는 향상된 생산 방법, 프로티아제 제품으로부터 실질적으로 생성된 먼지나 에어로졸의 양을 감소시키는 향상된 과립화 방법, 최종 제품에서의 잠재적 알레르기 오염원의 수준을 감소시키는 향상된 회수 방법이 연구되어 왔다. 그렇지만, 프로티아제 그 자체의 알레르기성을 감소시키는 노력은 비교적 성과가 나빴다. 택일적으로, 과민성 개인 내의 이뮤노글로불린 E(IgE)에 의해 인식되는 프로티아제 내의 에피토프를 마스크하거나(PCT 공개 번호 제 WO 92/10755 호) 또는 폴리머 또는 펩티드/단백질을 문제성 프로티아제에 부착시킴으로써 항원 결정요소의 성질을 확대 또는 변경시키는 노력이 행해져왔다.
적응성 면역 반응이 과장되거나 부적당한 형태로 일어날 때, 그 반응을 겪는 개인을 과민성이라고 부른다. 과민성 반응은 부적당하게 행해지는 통상의 유용한 면역 반응의 결과이고 어떤 경우 염증 반응 및 조직 손상을 일으킨다. 이들은 많은 항원에 의해 발생될 수 있다; 또한 과민성 반응의 원인은 개인마다 다르다. 과민성은 보통 항원과의 최초 접촉에 의해 나타나지 않고, 후속 접촉에 의해 보통 나타난다. 과민성의 일종은 IgE 반응이 꽃가루, 먼지-진드기 또는 동물 비듬과 같은 무해한 환경적 항원에 대항할 때 발생한다. IgE-감작된 마스트 세포에 의한 약물학적 매개자의 결과적인 방출은 천식 또는 콧물과 같은 증상을 갖는 급성 염증 반응을 일으킨다.
그럼에도 불구하고, IgE 부위를 변조하는 것을 포함하는 전략은 초기 감작 반응의 원인을 예방하는 면에서는 일반적으로 성공적이지 못하다. 따라서, 그러한 전략은 후속하는 과민성 반응의 정도를 감소시키는 반면, 실질적으로 감작된 사람의 수를 감소시킬 수는 없다. 예를 들면, 어떤 사람이 어떤 항원에 과민한 것으로 알려진 경우, 이러한 상황을 처리하는 일반적이고 유일하게 안전한 방법은 과민성인 사람을 가능한 완전히 항원으로부터 격리시키는 것이다. 실제로, 어떠한 다른 작용 경로도 과민한 개인의 건강에는 위험할 수 있다. 그러므로, 과민성 개인에게 위험한 특이적 단백질을 감소시키는 것이 중요한 반면, 단백질이 최초의 장소에서 과민성 반응을 개시할 수 없도록 만드는 것이 훨씬 중요할 것이다.
T-림프 세포(T-세포)는 면역 반응의 유도 및 조절 및 면역학적 효과기(effector)의 기능의 수행에 핵심 역할을 한다. 감염 시약 및 종양에 대한 특이적 면역은 이들 세포에 의존하는 것으로 알려져 있고 이들 세포가 상처의 회복에 기여하는 것으로 생각된다. 한편, 이들 반응을 조절하는데 실패하면 자기 공격을 초래할 수 있다. 일반적으로, 항원은 항원 제공 세포의 형태인 T-세포에게 제공되는데, 항원 제공 세포는 다양한 세포 표면 메카니즘을 통해 T-세포에 의해 항원 인식에 적합한 방법으로 항원 또는 부분 항원을 포획 및 디스플레이한다. T-세포의 표면 상의 수용체(T-세포 수용체)에 의한 특이적 에피토프의 인식에 의해, T-세포는 증식을 포함하는 일련의 복잡한 상호작용을 시작하여 B-세포에 의한 항체를 생산하게 된다. T-세포 및 B-세포는 모두 주어진 단백질 또는 펩티드 상에 존재하는 항원성 에피토프에 의해 활성화되는 반면, 이들 단일핵 세포에 의해 인식되는 실제적인 에피토프는 일반적으로 동일하지 않다. 사실, T-세포를 활성화하여 면역학적 다양성의 창조를 개시시키는 에피토프는 면역학적 반응의 도중에 B-세포에 의해 이후에 인식되는 에피토프와 그리 동일하지 않다. 그러므로, 과민성에 대해서는, T-세포 및 항원 사이의 특이적 항원 상호작용이 항원 노출에 대한 면역 반응의 개시에 있어서의 중요한 요소인 반면, 상호작용의 특이성, 즉 인식되는 에피토프는 흔히 완전 진행된 알레르기 반응의 후속적 진전과 관계가 없다.
PCT 공개 번호 제 WO 96/40791 호는 출발 물질로서 폴리알킬렌 옥사이드를 사용하는, 감소된 알레르기성을 갖는 폴리알킬렌 옥사이드-폴리펩티드 콘쥬게이트를 제조하는 방법을 개시한다.
PCT 공개 번호 제 WO 97/30148호는 공유적으로 결합된 두 개 이상의 폴리펩티드 분자를 갖는 하나의 중합체 담체 분자를 포함하는, 감소된 알레르기성을 갖는 폴리펩티드 콘쥬게이트를 개시한다.
PCT 공개 번호 제 WO 96/17929호는 1-30 개의 중합체 분자를 부모 폴리펩티드로 콘쥬게이트시키는 단계를 포함하는, 감소된 알레르기성을 갖는 폴리펩티드 생산 방법을 개시한다.
PCT 공개 번호 제 WO 92/10755 호는 동물 내에서 감소된 면역 반응을 일으키는 단백질 변이체를 생산하는 방법을 개시한다. 이 출원에서, 관심 대상 단백질인 일련의 프로티아제 및 그 변이체가 면역화된 래트(rat)에 사용되었다. 래트로부터의 혈청은 관심대상 단백질 및 그 변이체에 대해 면역화된 혈청 내에 이미 생성되었거나 존재하는 폴리클로날 항체의 반응성을 측정하는데 사용되었다. 이들 결과로부터, 조제물 내의 항체가 단백질 및 그 변이체에 대해 상대적으로 다소 반응성인지 아닌지를 결정할 수 있었고, 따라서, 단백질에 따라 변하는 분석을 허용하는 것은 결합하는 Ig의 능력을 감소시키거나 중화하기 쉽다. 래트에 대한 이들 테스트로부터, 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261에 상응하는 서브틸리신 309 잔기의 어떠한 변화는 면역학적 잠재성의 변화를 초래한다는 결론에 도달하였다.
PCT 공개 번호 제 WO 94/10191호는 올리고머가 실질적으로 그 활성을 유지하는, 부모 모노머 단백질의 올리고머 형을 포함하는 낮은 알레르기 단백질을 개시한다.
선행 기술은 특정 단백질의 알레르기성을 감소시키고 어떤 개인 내의 알레르기 반응을 일으키는 에피토프를 식별하는 방법 및 항원에 미리 노출된 혈청 내의 IgE 및 IgG 항체의 측정을 일반적으로 포함하는, 이들 에피토프의 식별에 사용되는 분석 방법을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 일단 Ig 반응이 개시되면, 감작은 이미 개시되었다. 따라서, 첫 번째 장소에서 감작을 일으키는 에피토프를 결정하는 방법이 필요한데, 이들 에피토프의 중화는 감작이 일어날 가능성을 상당히 감소시켜서 초기 감작의 가능성을 감소시키기 때문이다.
발명의 요약
전구체 단백질에 비해 인간 내에서 알레르기 반응을 일으킬 가능성이 적어진 단백질을 제공하는 것이 본발명의 목적이다.
세제 및/또는 펠팅(felting)을 방지하기 위한 울 처리, 고체 비누 또는 액체 비누 분야, 접시-보호 제제, 콘텍트렌즈 세정 용액 또는 제품, 펩티드 가수분해, 폐기물 처리, 안티-펠팅과 같은 직물 처리, 화장품 제제 및 피부 보호 제조, 또는 단백질 생산에서의 융합-절단 효소와 같은 통상의 프로티아제 응용 분야에서 유용성을 갖는 프로티아제 변이체를 제공하는 것이 본발명의 또다른 목적인데, 본 프로티아제 변이체는 감소된 알레르기 잠재성으로 인해 보다 안전하게 사용될 수 있다.
본발명에 따르면, 단백질 내의 T-세포 에피토프를 식별하는 방법이 제공된다. 본발명은 에피토프를 다음과 같이 식별하는 분석법을 제공한다: 항원 제공 세포가 순수(naive) 인간 T-세포 및 대상 펩티드와 결합된다. 본발명의 바람직한 구체예에서, 다음의 단계를 포함하는 T-세포 에피토프 인식방법에 제공된다: (a) 단일 혈액 공급원으로부터 수상돌기 세포의 용액 및 순수 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 용액을 얻는 단계; (b) 상기 수상돌기 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계; (c) 상기 분화된 수상돌기 세포 및 상기 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 용액을 대상 펩티드와 결합시키는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서의 증식을 측정하는 단계.
본발명의 또다른 구체예에 따르면, T-세포 에피토프가, 에피토프를 식별하는 T-세포의 능력을 감소 또는 바람직하게는 중화(제거)하도록 변조된 단백질이 제공된다. 그러므로, 감소된 알레르기성을 갖는 단백질이 제공되고, 여기서 상기 단백질은 T-세포 에피토프 이내인 것으로 인식된 아미노산 잔기의 치환 또는 결실을 포함하는 변조를 포함한다. 바람직한 구체예에 따르면, 에피토프는, T-세포에 의해 인식될 때 베이스라인보다 더 큰 T-세포 증식을 초래하는 단백질 또는 펩티드 내에서 결정된다. 이 T-세포 에피토프는 이후 변조되어, 에피토프를 포함하는 펩티드가 본발명의 분석법에서 분석될 때, 비변조된 에피토프를 포함하는 단백질에서 보다 더 작은 증식을 유도한다. 더욱 바람직하게는 변조되는 에피토프가 샘플 내의 베이스라인 T-세포 증식보다 세 배 이상을 생산한다. 변조될 때, 에피토프는 베이스 라인 T-세포 증식보다 세 배 미만, 바람직하게는 베이스라인 T-세포 증식의 두 배 미만, 가장 바람직하게는 샘플 내의 베이스라인 T-세포 증식과 실질적으로 동등하거나 미만을 생산한다.
바람직하게는, 에피토프가 다음 중의 하나의 방법에 의해 변조된다: (a) 에피토프의 아미노산 서열은 대상 단백질의 인간 상동체, 즉 푸린 또는 켁신과 같은 서브틸리신 유사 물질로부터 유래한 인간 서브틸리신 또는 또다른 인간 프로티아제로부터의 유사 서열로 치환된다(Methods in Enzymology, vol. 244, (1994) pp. 175 et seq; Roebroek 등, EMBO J., Vol. 5, No. 9, pp. 2197-2202(1986); Tomㅏinson 등, Biochem., Vol. 30, pp. 168-174(1991); Keifer 등, DNA and Cell Biol., Vol. 10, No. 10, pp 757-769(1991) 참조); (b) 에피토프의 아미노산 서열은 대상 단백질에 대한 비-인간 상동체로부터의 유사 서열에 의해 치환되는데, 이 유사 서열은 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성한다; (c) 에피토프의 아미노산 서열은 에피토프의 주요 삼차원 구조 특성을 실질적으로 모방하면서도 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 서열로 치환된다; 또는 (d)에피토프의 아미노산 서열은 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 어떠한 서열로 치환된다.
본발명의 특이적 구체예에서, BPN' 내의 잔기 170, 171, 172 및/또는 173에 상응하는 위치에서 최소한 하나의 아미노산 치환부위를 갖고, 이러한 치환은 잔기 170을 아스파르트산으로 변조하고, 잔기 171을 글루타민으로 변조하고, 잔기 172를 메티오닌으로 변조하는 것 및/또는 잔기 173을 아스파르트산으로 변조하는 것을 포함하는 프로티아제 변이체가 제공된다. 가장 바람직한 구체예에서, 치환은 잔기 170, 171 및 173을 아스파르트산, 글루타민 및 아스파르트산 각각으로 변조하는 것을 포함한다.
본발명의 또다른 구체예에서, 감소된 알레르기성을 갖는 본발명의 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 돌연변이 단백질이 전구체 단백질을 엔코드하는 DNA를 변조시킴으로써 제조되어 변조된 DNA가 본발명의 돌연변이 단백질을 엔코드한다.
본발명의 또다른 구체예에서, 돌연변이 단백질을 엔코드하는 DNA 서열뿐만 아니라 그러한 DNA 서열을 함유한 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공되고, 이 숙주 세포는 바람직하게는 이러한 DNA를 발현하여 세포 내 또는 세포 외에서 본발명의 돌연변이 단백질을 생성할 수 있다.
본발명의 돌연변이 단백질은 전구체 단백질이 유용하다고 일반적으로 알려진 어떠한 조성물 또는 방법에서도 유용하다. 예를 들면, 단백질이 프로티아제인 경우, 감소된 알레르기성 프로티아제는 세탁용 세정제 및 경질 표면 청소제와 같은 청소 제품에서의 성분으로서, 가죽 제조에서의 보조제로서, 펠팅을 감소시키기 위한 울 및/또는 실크와 같은 직물 처리에서, 퍼스널 케어, 화장품 또는 미용 크림 제품에서의 성분으로서, 및 사료의 영양가를 높이기 위한 가축 또는 애완동물 사료 내에서의 성분으로서 사용될 수 있다. 유사하게, 단백질이 아밀라제인 경우, 감소된 알레르기성 아밀라제는 식기세척 세정제에서의 성분으로서 전분의 액화, 직물의 풀 제거, 세탁용 세정제 또는 아밀라제가 유용하게 사용되는 기타 용도로서 사용될 수 있다.
본발명의 장점 중 하나는 T-세포 에피토프 인식에 기인한 T-세포의 증식을 측정함으로써, 개인의 초기 감작의 원인이 되는 에피토프를 함유한 펩티드를 식별할 수 있다. 즉, T-세포 에피토프 인식에 기인한 T-세포 증식은 그것을 함유한 펩티드 또는 단백질에 대한 개인의 감작을 유도한다. 그러한 "감작" T-세포 에피토프의 중화는 필연적으로 그 에피토프를 함유한 항원을 취급하거나 이에 노출된 사람에게 더 큰 안전성을 부여하는데, 왜냐하면 이들이 초기에 감작되지 않아서 항원에 대한 연속적인 노출에 의한 알레르기 반응의 대표적인 Ig 항체의 생성이 방지되기 때문이다.
본발명의 장점은 노출된 개인에 대해 상당히 덜 위험한 감작으로 사용될 수 있는 효소를 포함하는 단백질의 제조이다. 그러므로, 예를 들면, 본발명의 단백질은 미용 크림과 같은 화장품, 세탁용 세정제와 같은 세정제, 경질 표면 청소 조성물 및 예비-세척 조성물 또는 기타 사람의 노출이 필수적인 부산물인 효소를 포함하는 단백질의 용도에 보다 안전하게 사용될 수 있다.
본발명은 낮아진 알레르기 반응을 생성하는 단백질에 노출된 사람 내에서의 낮아진 알레르기 반응을 생성하는 단백질, 및 이러한 반응을 예측하는 평가 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본발명은 노출을 통해 신규의 향상된 단백질 돌연변이로 감작된 인간 내에서 매우 낮은 알레르기 반응을 생성하는 신규의 향상된 단백질에 관한 것이다.
도 1A, B1, B2 및 B3는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신(BPN')의 DNA 서열(서열 식별번호 1) 및 아미노산 서열(서열 식별번호 2) 및 이 유전자의 부분 제한 지도를 예시한다.
도 2는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(서열 식별번호 3) 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)(야생형)(서열 식별번호 4)로부터의 서브틸리신 중의 보존된 아미노산 잔기를 예시한다.
도 3A 및 3B는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(BPN'), 고초균(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)(서열 식별번호 5) 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 서브틸리신형 프로티아제의 아미노산 서열 정렬(alignment)을 예시한다.
도 4는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)프로티아제에 상응하는 펩티드에 대한 16 개의 말초 단핵 혈액 샘플의 부가적 T-세포 반응을 예시한다.
도 5는 인간 서브틸리신 분자에 상응하는 펩티드에 대한 10 개의 말초 단핵 혈액 샘플의 부가적 T-세포 반응을 예시한다. 펩티드 F10, F9, F8 및 F7 모두는 도 3의 서열 정렬의 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 프로티아제 내의 170-173에 상응하는 잔기를 포함하는 영역에 상응하는 아미노산 서열 DQMD를 함유한다.
도 6A 및 6B/6C는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제 및 인간 서브틸리신 각각의 서열로부터 유래된 펩티드에 상응하는 아미노산 스트링을 예시한다.
도 7은 사람 서브틸리신으로부터의 아미노산 서열(서열 식별번호 6)을 예시한다.
도 8은 BPN'(바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)) 프로티아제, SAVINASE(바실루스 렌투스(Bacillus lentus)) 프로티아제 및 사람 서브틸리신(S2HSBT)의 아미노산 정렬을 예시한다.
도 9는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)프로티아제에 과민성인 것으로 알려진 개인으로부터 채취한 샘플 내의 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제로부터 유래한 펩티드에 대한 T-세포 반응을 예시한다. 펩티드 E05는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)으로부터의 프로티아제 내의 170-173에 상응하는 영역을 나타낸다.
도 10은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)프로티아제에 과민성인 것으로 알려진 개인으로부터 채취한 샘플 내에 설정된 E05 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제 펩티드 내의 다양한 알라닌 치환에 대한 T-세포 반응을 예시한다.
본발명에 따르면, T-세포 에피토프를 식별하는 방법이 제공된다. 본발명은 다음과 같이 에피토프를 식별하는 분석법을 제공한다: 분화된 수상돌기 세포가 순수 인간 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 및 대상 펩티드와 조합된다. 다음의 단계를 포함하는 T-세포 에피토프가 인식되는 방법이 제공된다: (a) 단일 혈액 공급원으로부터 수상돌기 세포의 용액 및 순수 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 용액을 얻는 단계; (b) 상기 수상돌기 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계; (c) 상기 분화된 수상돌기 세포 및 상기 CD4+ 및/또는 CD8+T-세포의 용액을 대상 펩티드와 결합시키는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서의 증식을 측정하는 단계.
본발명에 따른 분석법에 따라 분석되는 대상 펩티드는 감소된 알레르기성이 바람직하거나 요구되는 단백질 또는 효소로부터 유래한다. 본발명의 수행에 있어서, 개인 또는 개인의 샘플링 내에서 감작을 유발할 수 있는 에피토프의 위치를 정확히 식별하는 것이 가능하다. 본발명의 특히 유효한 구체예에서, 단백질 또는 효소의 모두 또는 일부에 상응하는 일련의 펩티드 올리고머가 제조된다. 예를 들면, 단백질의 관련 부분 또는 모두를 커버하는 펩티드 라이브러리가 생성된다. 펩티드를 생성하는 특히 유용한 방법 중 하나는 펩티드 라이브러리에 오버랩을 도입하는 것으로서, 예를 들면 대상 단백질의 아미노산 서열 1-10에 상응하는 제 1 펩티드, 대상 단백질의 아미노산 서열 4-14에 상응하는 제 2 펩티드, 대상 단백질의 아미노산 서열 7-17에 상응하는 제 3 펩티드, 대상 단백질의 아미노산 서열 10-20에 상응하는 제 4 펩티드 등....을, 모든 분자에 상응하는 대표 펩티드가 제조될 때까지 생성한다. 제공된 분석법에서 펩티드 각각을 개별적으로 분석함으로써, T-세포에 의해 인식된 에피토프의 위치를 정확히 식별하는 것이 가능하다. 상기 실시예에서, 하나의 특이적 펩티드가 그 이웃에 비해 더 큰 반응을 하는 것은 세 개의 아미노산 내의 에피토프 앵커 영역의 식별을 촉진할 것이다. 이들 에피토프의 위치를 결정한 후, 펩티드가 덜 중요한 T-세포 반응을 생성할 때까지 각 에피토프 내의 아미노산을 변경하는 것이 가능하다.
본명세서에서 "항원 부여 세포"는 T-세포의 표면상의 수용체에 의해 인식가능한 항원을 그 표면에 부여하는, 면역 시스템의 세포를 의미한다. 항원 부여 세포의 예는 수상돌기 세포, 지상돌기 세포, 활성화된 B-세포 및 대식세포이다.
본명세서에서 "T-세포 증식"은 항원 부여 세포와, 항원, 또는 항원 없이 T-세포의 배양 도중 생성된 T-세포의 수를 의미한다.
본명세서에서 "베이스라인 T-세포 증식"은 펩티드 또는 단백질 항원 부존재하에서 항원 부여 세포에 노출되어 반응하는 개인에게서 통상 보여지는 T-세포 증식을 의미한다. 본명세서의 목적을 위해, T-세포 증식 수준은 항원 부존재하에서 항원 부여 세포에 반응하는 T-세포의 증식에 따라 각 개인에 대해 샘플 기준으로 결정된다.
"T-세포 에피토프"는 항원을 포함하는 펩티드에 대한 면역학적 반응의 개시에서 T-세포 수용체에 의해 인식되는 펩티드 또는 단백질의 특징을 의미한다. T-세포에 의한 T-세포 에피토프의 인식은 항원 부여 세포 상에 발현된 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성(MHC) 분자에 결합된 항원의 펩티드 단편을 인식하는 메카니즘을 경유하는 것으로 생각된다(Moeller, G.ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses, Immunological Review, Vol. 98, p. 187(Copenhagen; Munksgaard)(1987) 참조).
본명세서에서 제공된 분석법에 따라 결정된 에피토프는 이후 대상 단백질의 알레르기 잠재성을 감소시키기 위해 변조된다. 바람직한 구체예에서, 변조되는 에피토프는 샘플 내에서 베이스라인 T-세포 증식보다 큰 T-세포 증식 수준을 생성한다. 변조될 때, 에피토프는 베이스라인 증식의 세 배보다 작은 증식을 생성하고, 바람직하게는 베이스라인 증식의 두 배보다 작고, 가장 바람직하게는 샘플 내의 베이스라인 증식보다 작거나 실질적으로 동등한 증식을 생성한다.
바람직하게는, 에피토프가 다음의 방법 중 한 가지로 변조된다: (a) 에피토프의 아미노산 서열은 대상 단백질의 인간 상동체로부터 유사 서열로 치환된다;(b) 에피토프의 아미노산 서열은 대상 단백질에 대한 비-인간 상동체로부터의 유사 서열에 의해 치환되는데, 이 유사 서열은 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성한다; (c) 에피토프의 아미노산 서열은 에피토프의 주요 삼차원 구조 특성을 실질적으로 모방하면서도 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 서열로 치환된다; 또는 (d)에피토프의 아미노산 서열은 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 어떠한 서열로 치환된다.
본명세서에서 "샘플"은 순수한, 즉 문제의 항원에 감작되지 않은 단핵 세포를 포함한다.
본명세서에서 "상동체"는 대상 단백질과 유사한 효소 활성, 구조 및/또는 용도를 갖는 단백질 또는 효소를 의미한다. 대상 단백질 내의 에피토프를 상동체로부터의 유사 부분으로써 치환하는 것이 변화의 혼란을 감소하도록 대상 단백질과 유사한 3차원 및/또는 1차원 구조를 갖는 상동체를 발견하는 것이 요망된다. 그러므로, 가깝게 상동인 효소는 에피토프 치환의 가장 바람직한 공급원을 제공한다. 택일적으로, 가능하다면 주어진 단백질에 대한 인간 유사물을 찾는 것이 유리하다. 예를 들면, 박테리아 서브틸리신 내의 특이적 에피토프를 서브틸리신에 대한 인간 유사물(즉, 인간 서브틸리신)로부터의 서열로 치환하는 것은 박테리아 단백질 내의 감소된 알레르기성을 초래한다.
"유사"서열은 치환 아미노산이 에피토프 또는 에피토프 근처에서 대상 단백질 내의 아미노산에 대한 유사한 기능, 3차원 구조 및/또는 보존된 잔기를 나타내는 것을 보장함으로써 결정될 수 있다. 그러므로, 에피토프 영역이 예를 들면 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 함유하는 곳에서 치환 아미노산은 그 특이적 구조를 유지하여야 한다.
본발명은 알레르기성을 감소하는 것이 요망되는 모든 단백질에 확대하는 반면, 간편성을 위해, 다음은 본발명의 특히 바람직한 구체예인 프로티아제의 변조를 기술한다. 프로티아제는 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단하는 일반적인 역할을 하는 카보닐 가수분해 효소이다. 본명세서에서 사용된 바와 같이, "프로티아제"는 자연-발생적 프로티아제 또는 재조합 프로티아제이다. 자연-발생적 프로티아제는 α-아미노아실펩티드 가수분해 효소, 펩티딜아미노산 가수분해 효소, 아실아미노 가수분해효소, 세린 카르복시펩티다제, 메탈로카복시펩티다제, 티올 프로티나제, 카르복실프로티나제 및 메탈로프로티나제를 포함한다. 세린, 메탈로, 티올 및 산 프로티아제가 엔도 및 엑스-프로티아제와 더불어 포함된다.
서브틸리신은 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단하는 일반적인 역할을 하는 박테리아 또는 진균 프로티아제이다. 본명세서에서 사용된 바와 같이, "서브틸리신"은 자연-발생적 서브틸리신 또는 재조합 서브틸리신을 의미한다. 일련의 자연-발생적 서브틸리신이 다양한 미생물 종에 의해 생성되고 종종 분비된다는 것이 알려졌다. 이들 서브틸리신의 구성요소인 아미노산 서열이 완전히 상동인 것은 아니다. 그렇지만, 이들 서브틸리신은 단백질 분해 활성이 동일하거나 유사한 형태를 나타낸다. 이 부류의 세린 프로티아제는 카이모트립신 관련된 세린 프로티아제와 자신을 구별짓는 촉매 3조(catalytic triad)를 정의하는 공통 아미노산 서열을 공유한다. 서브틸리신 및 카이모트립신 관련 세린 프로티아제 모두는 아스파르테이트, 히스티딘 및 세린을 포함하는 촉매 3조를 갖는다. 서브틸리신 관련 프로티아제에서, 이들 아미노산의 상대적인 순서는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 읽었을 때 아스파르테이트-히스티딘-세린이다. 그렇지만, 카이모트립신 관련 프로티아제에서는, 상대적인 순서가 히스티딘-아스파르테이트-세린이다. 그러므로, 본명세서에서 서브틸리신은 서브틸리신 관련 프로티아제의 촉매 3조를 갖는 세린 프로티아제를 언급한다. 실시예는 도 3에서 식별된 서브틸리신을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 및 본발명의 목적을 위해, 프로티아제 내의 아미노산의 넘버링은 도 1에 나타낸 성숙한 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloiquefaciens) 서브틸리신 서열에 부여된 번호에 상응한다.
"재조합 서브틸리신" 또는 "재조합 프로티아제"는 서브틸리신 또는 프로티아제를 엔코드하는 DNA 서열이 자연-발생적 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 엔코드하는 변형(또는 돌연변이) DNA 서열을 생성하도록 변조된 서브틸리신 또는 프로티아제를 언급한다. 이러한 변조를 만드는 적절한 방법은 본 명세서에서 개시된 방법과 조합될 수 있으며, 미국 특허 제 4,760,025 호(RE 34,606), 미국 특허 제 5,204,015 호 및 미국특허 제 5,185,258호에 개시된 것을 포함한다.
"비-인간 서브틸리신" 및 이를 엔코드하는 DNA는 많은 원핵 및 진핵 유기체로부터 얻어질 수 있다. 원핵 유기체의 적절한 예는 대장균(E. coli) 또는 슈도모나스(Pseudomanas)와 같은 그람 음성 유기체 및 마이크로코커스(Micrococcus)또는 바실루스(Bacillus)와 같은 그람 양성 박테리아를 포함한다. 서브틸리신 및 이들의 유전자가 얻어질 수 있는 진핵 유기체의 예는 빵효모(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 이스트, 및 아스페르길루스(Aspergillus) 종과 같은 진균을 포함한다.
"인간 서브틸리신"은 서브틸리신형 촉매 활성을 갖는 인간 유래 단백질,예를 들면 인간 유래 프로티아제의 켁신(kexin) 군을 의미한다. 그러한 단백질의 예는 도 7 내의 서열에 의해 나타내어진다. 부가적으로, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 공급원으로부터의 것도 포함하고, 펩티드 결합을 가수분해하는 필수적 능력을 보유하고, 도 7의 단백질에 대해 최소한 50% 바람직하게는 최소한 65% 가장 바람직하게는 최소한 80%의 상동성을 가지는 사람 서브틸리신의 유도체 또는 상동체가 본발명의 목적을 위한 인간 서브틸리신으로서 고려된다.
"프로티아제 변이체"는 "전구체 프로티아제"의 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열을 갖는다. 전구체 프로티아제는 자연-발생적 프로티아제 및 재조합 프로티아제를 포함한다. 프로티아제 변이체의 아미노산 서열은 전구체 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 전구체 프로티아제 아미노산 서열로부터 "유래"된다. 그러한 변조는 전구체 프로티아제 효소 자체를 조작한다기보다는 전구체 프로티아제의 아미노산 서열을 엔코드하는 "전구체 DNA 서열"에 대한 것이다. 전구체 DNA 서열을 조작하는 적절한 방법은 본명세서에서 개시된 방법뿐만 아니라 당업자에게 공지된 방법을 포함한다(예를 들면, EP 0 328299, WO 89/06279 및 이미 인용된 미국특허 및 출원을 참조).
사용된 아미노산 번호는 도 1에 제시된 성숙한 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 서열에 부여된 것을 언급한다. 그렇지만, 본발명은 이 특정 서브틸리신의 돌연변이에 한정되는 것이 아니며, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)서브틸리신 내의 특히 확인된 잔기와 "동등한" 위치에서의 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 프로티아제에도 확대된다. 본발명의 바람직한 구체예에서, 전구체 프로티아제는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 서브틸리신이고, 치환, 결실 또는 삽입은 상기에서 나열한 것에 상응하는 바실루스 렌투스(B. lentus)내의 동등한 아미노산 잔기에서 만들어진다.
전구체 프로티아제의 잔기(아미노산)는 바tlf루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 내의 특이적 잔기 또는 그 잔기의 일부에 상동(즉, 1차 또는 3차 구조의 위치가 상응하는)이거나 db사인 경우(즉, 결합, 반응, 또는 화학적 상호작용하는 기능적 능력이 동일 또는 유사한) 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 잔기와 동등하다.
1차 구조의 상동성을 결정하기 위해, 전구체 프로티아제의 아미노산 서열은 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 1차 구조, 특히 서열이 공지되면서 서브틸리신 내에서 불변인 것으로 알려진 잔기 세트와 직접적으로 비교된다. 예를 들면, 도 2는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 서브틸리신 사이의 보존된 서열을 도시한다. 보존된 잔기를 정렬시킨 후, 정렬을 유지하기 위해 필요한 삽입 및 결실을 허용하고(즉, 임의적 결실 및 삽입을 통해 보존된 잔기가 제거되는 것을 회피), 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 1차 서열과 등등한 잔기가 정의된다. 보존된 잔기의 정렬은 바람직하게는 그러한 잔기를 100% 보존해야 한다. 그렇지만, 보존된 잔기의 75% 이상 또는 50%의 정렬도 동등한 잔기를 정의하는데 충분하다. 촉매 3조, Asp32/His64/Ser221의 보존은 유지되어야만 한다.
예를 들면 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 고초균(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis(carlbergensis)) 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 서브틸리신의 아미노산 서열은 아미노산 서열 사이의 최대량의 상동성을 부여하도록 정열될 수 있다. 이들 서열의 비교는 각 서열 내에 함유된 다수의 보존된 잔기가 있음을 보여준다. BPN' 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 사이의 보존된 잔기가 도 2에 나타나 있다.
이들 보존된 잔기는 그러므로 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 서브틸리신과 같은 기타 서브틸리신 내의 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 상응하는 동등한 아미노산 잔기를 정의하는데 사용될 수 있고(PCT 공개 번호 제 WO89/06279 호, 1989년 7월 13일에 공개됨), 여기서 바람직한 프로티아제 전구체 효소 또는 서브틸리신은 PB92는 (EP 0 328 299)로서 언급되어 있는데, PB92는 바람직한 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 서브틸리신에 매우 상동적이다. 이들 서브틸리신의 특정 아미노산의 서열은 보존된 잔기의 최대 상동성을 생성하도록 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 서열과 함께 도 3A 및 3B에 정렬되어 있다. 도면에서 알수 있는 바와 같이, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신에 비교하여 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)의 서열에는 다수 개의 결실이 있다. 그러므로, 예를 들면 기타 서브틸리신 내의 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 내의 Val165에 대한 동등한 아미노산은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 및 바실루스 리케니포르미스(B.licheniformis)에 대해서는 이소류신이다.
그러므로, 예를 들면, 위치 +170에서 아미노산은 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 및 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 서브틸리신 모두에서는 라이신(K)이고 Savinase 내에서는 아르기닌(R)이다. 그렇지만 본발명의 프로티아제 변이체의 한 구체예에서, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 내의 +170에 동등한 아미노산은 아스파르트산(D)으로 치환된다. 본발명에서 모든 아미노산에 대한 약칭 및 한자리 코드는 PatentIn User Maunal(GenBank, Mountain View, CA), 1990, p.101을 따른다.
"동등한 잔기"는 3차원 구조가 x-레이 결정학에 의해 결정된 전구체 프로티아제에 대한 3차원 수준에서의 상동성 결정에 의해 정의될 수도 있다. 동등한 잔기는 전구체 프로티아제 및 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 특정 아미노산 잔기의 두 개 이상의 주쇄의 분자 배위(N에 대한 N, CA에 대한 CA, C에 대한 C 및 O에 대한 O)가 정렬후 0.13nm, 바람직하게는 0.1nm이내인 것으로 정의된다. 정렬은 문제의 프로티아제의 비-수소 단백질 원자의 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신에 대한 원자 배위가 최대한의 오버랩을 부여하도록 최상의 모델이 배향되고 위치 설정된 후에 이루어진다. 최상의 모델은 최대 해상도에서 실험적 회절 데이타에 대해 최저의 R 인자를 부하는 결정학적 모델이다.
바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 특이적 잔기에 대해 기능적으로 유사한 동등 잔기는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 특이적 잔기에 대해 정의된 방법으로 단백질 구조, 기질 결합 또는 촉매분해를 변경, 변조 또는 기여하도록 하는 배열(conformation)을 채택하는 전구체 프로티아제의 아미노산에서와 같이 정의된다. 또한, 동등한 잔기는, 비록 주어진 잔기의 주쇄 원자가 상동적 위치를 점유하는 기준에 근거하여 동등의 기준을 만족시키지 않을 지라도, 잔기의 최소한 두 개의 측쇄 사슬의 분자 배위가 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 상응하는 측쇄 원자의 0.13nm이내에 놓여있는 정도로 유사 위치를 점유하는 전구체 프로티아제의 잔기이다(그 3차원 구조는 x-레이 결정학에 의해 얻어졌음). 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 3차원 구조의 배위는 EPO 공개 번호 제 0 251 446호(미국 특허 제 5,182,204호에 대응함, 그 내용은 참고문헌으로서 포함됨)에 규정되어 있고, 상기에 개괄된 바와 같이 사용되어 3차원 구조 수준에서 동등한 잔기를 결정할 수 있다.
치환, 삽입 또는 결실에 대해 확인된 잔기 중 일부는 보존된 잔기이고 일부는 아니다. 잔기가 보존되지 않은 경우, 하나 이상의 아미노산의 대체는 자연계에서 발견되는 것에 상응하지 않는 아미노산 서열을 갖는 변이체를 생성하는 치환에 한정된다. 보존된 잔기의 경우, 그러한 치환이 자연-발생적 서열을 유도하여서는 안된다. 본발명의 프로티아제 변이체는 성숙한 형태의 프로티아제 변이체 뿐만 아니라 그러한 프로티아제 변이체의 프로- 및 프리프로- 형도 포함한다. 프리프로-형이 바람직한 구조인데 이는 프로티아제 변이체의 발현, 분비 및 성숙을 촉진하기 때문이다.
"프로서열(prosequence)"은 성숙한 형태의 프로티아제의 N-말단에 결합되어 제거될 때 "성숙"형의 프로티아제의 외관이 유도되는 아미노산 서열이다. 많은 단백분해 효소가 번역 프로효소 생성물로서 자연계에서 발견되고, 포스트-번역 처리가 없는 경우, 이런 식으로 발현된다. 프로티아제 변이체를 생성하는 바람직한 프로서열은 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 추정 프로서열이지만, 기타 프로티아제 프로서열도 사용될 수 있다.
"신호 서열" 또는 "프리서열"은 프로티아제의 N-말단 부분 또는 프로프로티아제의 N-말단 부분에 결합되어 성숙 또는 프로 형의 프로티아제의 분비에 참여하는 아미노산 서열을 언급한다. 신호 서열의 이 정의는 기능적인 것으로서, 순수 조건하에서 프로티아제의 분비의 수행에 참가하는 프로티아제 유전자의 N-말단 분에 의해 엔코드된 모든 아미노산 서열을 포함한다. 본발명은 그러한 서열을 이용하여 본명세서에서 정의된 바와 같이 프로티아제 변이체의 분비를 수행한다. 가능한 신호 서열 중 하나는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지 부분에 융합되는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 첫 번째 7개의 아미노산 잔기를 포함한다(ATCC 21536).
프로티아제 변이체의 "프리프로"형은 프로티아제의 아미노 말단에 기능적으로 연결된 프로서열 및 프로서열의 아미노 말단에 기능적으로 연결된 "프리" 또는 "신호"서열을 갖는 성숙형의 프로티아제로 구성된다.
"발현 벡터"는 적절한 숙주 내에서 상기 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적절한 조절 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 함유한 DNA 구조물을 언급한다. 그러한 조절 서열은 전사를 수행하는 프로모터, 그러한 전사를 조절하는 임의적 작동 서열, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 엔코드하는 서열 및 전사 및 번역을 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순한 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적절한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 복제하여 숙주 게놈과 독립적으로 작용하고, 어떤 경우 게놈 그 자체 내로 통합할 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 어떤 경우 서로 혼용하여 사용되는데 플라스미드가 현재 벡터 형태로서 가장 통상적으로 사용되기 때문이다. 그렇지만, 본발명은 동등한 기능을 하고 업계에 공지된, 또는 공지되고 있는 기타 형태의 발현 벡터도 포함하는 의도이다.
본발명에서 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 원핵 또는 진핵 숙주로서, 바람직하게는 미국 특허 제 4,760,025호(RE 34,606)에 기재된 방법에 의해 조작되어 효소적으로 활성인 엔도프로티아제를 분비할 수 있게 해주는 것이다. 프로티아제를 발현시키는 바람직한 숙주 세포는 바실루스(Bacillus) 균주 BG2036으로서 효소적으로 활성인 중성 프로티아제 및 알칼리 프로티아제(서브틸리신)가 결핍된 것이다. 균주 BG2036의 축조는 미국 특허 제 5,264,366호에 상세히 기술되어 있다. 프로티아제를 발현시키기 위한 기타 숙주 세포는 고초균(Bacillus subtilis) I168(역시 미국특허 4,760,025(RE 34,606) 및 미국특허 5,264,366에 기술되어 있고, 본명세서에 참고문헌으로서 포함됨) 뿐만이나라 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 등과 같은 적절한 바실루스(Bacillus) 균주를 포함할 수 있다.
숙주 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 축조된 벡터로써 형질전환되거나 트랜스인펙션될 수 있다. 그러한 형질전환된 숙주 세포는 프로티아제 변이체를 엔코드하는 벡터를 복제하거나 또는 요망되는 프로티아제 변이체를 발현시킬 수 있다. 프로티아제 변이체의 프리- 또는 프리프로-형을 엔코드하는 벡터의 경우, 그러한 변이체는 발현될 때 숙주세포로부터 숙주 세포 배지 내로 대표적으로 분비된다.
"기능적으로 연결된"은, 두 개의 DNA 영역 사이의 관계를 기술할 때, 단지 이들 DNA가 서로 기능적으로 관련되어 있음을 의미한다. 예를 들면, 프리서열은 신호 서열로서 작용하는 경우 펩티드에 기능적으로 연결되어 가장 바람직하게는 신호 서열의 절단을 수반하는 단백질의 성숙형의 분비에 참가한다. 프로모터는 코딩 서열의 전사를 조절하는 경우 코딩 서열에 기능적으로 연결된다; 리보솜 결합 부위는 번역을 허용하도록 위치설정된 경우 코딩 서열에 기능적으로 연결된다.
자연-발생적 전구체 프로티아제를 엔코드하는 유전자는 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 따라 얻어질 수 있다. 그 방법은 일반적으로 대상 프로티아제의 영역을 엔코드하는 가상 서열을 갖는 라벨된 프로브를 합성하는 단계, 프로티아제를 발현시키는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 단계 및 프로브에 대한 하이브리다이제이션에 의해 대상 유전자에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 양성적으로 하이브리다이즈하는 클론은 이후 지도화되고 서열화된다.
클로닝된 프로티아제는 이후 프로티아제를 발현하기 위하여 숙주 세포를 형질전환하는데 사용된다. 프로티아제 유전자는 이후 높은 복제 수 플라스미드내로 결찰된다. 이 플라스미드는 숙주 내에서 센스로 복제하여 플라스미드 복제에 필요한 널리-공지된 요소들을 함유한다: 프로모터는 문제의 유전자(인식될 때, 즉, 숙주에 의해 전사될 때 유전자 자신의 상동적 프로모터로서 공급될 수 있는), 외부적으로 공급되거나 프로티아제 유전자의 내생적 종결 유전자에 의해 공급될 수 있는 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역(특정 진핵 숙주 세포 내의 프로티아제 유전자로부터의 숙주에 의해 전사되는 mRNA의 안정화에 필요한), 및 요망스럽게는, 항생제-함유 배지 내에서의 성장에 의해 플라스미드-감염된 숙주 세포의 연속적인 배양 유지를 가능하게 하는 항생제 내성 유전자와 같은 선택 유전자에 기능적으로 연결된다. 높은 복제수 플라스미드는 또한 숙주에 대한 복제 기원을 함유하여, 염색체 제한없이 세포질 내에서 다수개의 플라스미드가 생성되는 것을 가능하게 한다. 그렇지만, 다수 개의 프로티아제 유전자 복제본을 숙주 게놈내로 통합시키는 것도 본 범위 내이다. 이는 상동적 재조합에 특히 민감한 원핵 또는 진핵 유기체에 의해 촉진된다.
일 실시예에서, 유전자는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 또는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 유전자와 같은 자연적 유전자일 수 있다. 택일적으로, 자연-발생적 또는 돌연변이 전구체 프로티아제를 엔코드하는 합성 유전자도 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서, 전구체 프로티아제의 DNA 및/또는 아미노산 서열이 결정된다. 다수개의 오버랩하는 합성 단일-가닥 DNA 단편은 이후 합성되고, 이는 하이브리다이제이션 및 결찰에 의해 전구체 프로티아제를 엔코드하는 합성 DNA를 생성한다. 합성 유전자의 축조의 예는 본출원에 참고문헌으로서 포함된 미국특허 제 5,204,015호의 실시예 3에 규정되어 있다.
일단 자연-발생적 또는 합성 전구체 프로티아제 유전자가 클로닝되면, 다수개의 변조가 수행되어 자연-발생적 전구체 프로티아제의 합성을 넘어서서 유전자의 용도를 향상시킨다. 그러한 변조는 미국 특허 제 4,760,025호(RE 34,606) 및 EPO 공개 번호 제 0 251 446 호에 기술된 바와 같은 재조합 프로티아제의 생산 및 이 문서에서 기술된 프로티아제 변이체의 생산을 포함한다.
다음의 카세트 돌연변이화 방법은, 비록 기타 방법이 사용될 수 있을지라도 본 발명의 프로타아제 변이체의 축조를 촉진하는데 사용될 수 있다. 먼저, 프로티아제를 엔코드하는 자연-발생적 유전자가 얻어지고 전체적 또는 부분적으로 서열화된다. 이후 서열은 엔코드된 효소 내의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이화(결실, 삽입 또는 치환)를 수행하는데 요망되는 지점에 대해 스캐닝된다. 이 지점의 측면에 위치한 서열은 발현될 때 다양한 돌연변이를 엔코드하는 올리고누클레오티드 풀(pool)로써 유전자의 짧은 단편을 복제시키기 위한 제한 부위의 존재를 평가하는데 사용된다. 그러한 제한 부위는 프로티아제 내의 바람직하게는 유일한 부위여서 유전자 단편의 복제를 촉진시킨다. 그렇지만, 프로티아제 유전자 내에서 지나치게 중복되지 않는 어떠한 편리한 제한 부위라도, 제한 소화에 의해 발생된 유전자 단편이 적절한 서열 내에서 재조립될 수 있다면 사용될 수 있다. 만약 제한 부위가 선택된 지점(10 - 15 누클레오티드)으로부터 편리한 위치 내에 존재하지 않는다면, 그러한 부위는 리딩 프레임이나 엔코드되는 아미노산 모두 최종 축조물에서 변경되지 않는 방식으로 유전자 내에서 누클레오티드를 치환시킴으로써 발생될 수 있다. 요망되는 서열과 일치시키도록 서열을 변경시키기 위한 유전자의 돌연변이화는 일반적으로 공지된 방법에 따라 M13 프라이머 확장에 의해 이루어진다. 적절한 측면 인접 영역을 위치설정하고 두 개의 편리한 제한 부위 서열에 도달하기 위해 필요한 변화를 평가하는 것은 유전자 코드의 중복, 유전자의 제한 효소 지도 및 다수 개의 서로 다른 제한 효소에 의해 일상적인 일이 된다. 만약 편리한 측면 인접 제한 영역이 사용가능하면, 부위를 포함하지 않는 측면 인접 영역과 관련되어서만 상기 방법이 필요함을 유의해야 한다.
일단 자연-발생적 DNA 또는 합성 DNA가 클로닝되면, 돌연변이화되는 위치에 측면 인접한 제한 부위는 동족 제한 효소에 의해 소화되고 다수개의 말단-상보적 올리고누클레오티드 카세트가 유전자 내로 결찰된다. 돌연변이화는 이 방법에 의해 간편화되는데 왜냐하면 모든 올리고누클레오티드는 동일한 제한 부위를 가지도록 합성될 수 있고, 제한 부위를 만드는데 어떠한 합성 링커도 필요하지 않기 때문이다.
본발명의 한 양상에서, 그 목적은 전구체 프로티아제와 비교하여 변경된 알레르기 잠재성을 갖는 변형 프로티아제를 달성하는 것인데, 그러한 잠재성을 감소시키는 것은 효소의 더욱 안전한 사용을 가능하게 하기 때문이다. 본발명은 알레르기 잠재성을 감소시키는데 유용한 반면, 본 문서에서 특정된 돌연변이화는 업계에 공지된 돌연변이화와 조합하여 사용되어 전구체와 비교하여 변경된 열 안정성 및/또는 변경된 기질특이성, 변조된 활성 또는 변경된 알칼리 안정성을 초래할 수 있다.
따라서, 본발명은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 내의 잔기 위치 170-173를 포함하는 T-세포 에피토프의 능력을 변경하여 T-세포 증식을 유도하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 R170D, Y171Q 및/또는 N173D 중의 하나 또는 모두를 변조시키는 것을 포함한다. 유사하게, 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 어떠한 프로티아제 내의 상응하는 잔기를 변조시키는 것은 그 프로티아제 내의 핵심 T-세포 에피토프의 중화를 초래하는 것으로 생각된다. 그러므로, 아미노산 잔기 170-173에 상응하는 영역에서의 현재 개시된 돌연변이와 조합하여, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, 및 T260A에 상응하는 위치로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서의 치환과 임의로 조합하여, N76D/S103A/V1041/G159D에 상응하는 위치에서의 치환이 본발명의 변형 프로티아제의 알레르기 잠재성을 감소시키는 것에 부가하여 효소의 전체적인 안정성 및/또는 단백분해 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 출원에서 제공된 치환은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 서브틸리신 내에서 아스파르테이트(D)에 대한 +76 위치와 동등한 위치에서 아스파라긴(N)에서의 돌연변이 및, 임의로 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, 및 T260A에 상응하는 위치로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환과 조합될 수 있어서, 얻어진 돌연변이 효소의 향상된 안정성 및/또는 향상된 활성을 생성한다.
본발명의 가장 바람직한 구체예는 다음의 위치에 상응하는 치환된 잔기의 특이적 조합을 포함한다:
바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/236H/Q245R; 및
V68A/N76D//S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q235H/Q245R/T260A. 이들 치환은 비록 어떠한 바실루스(Bacillus) 프로티아제 내에서 행해질 수 있을 지라도 바람직하게는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)(재조합 또는 자연-형) 서브틸리신 내에서 행해진다.
변형 프로티아제로 얻어진 스크리닝 결과에 기초하여, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신 내의 상기한 돌연변이화는 단백분해 활성, 이들 효소의 능력 및/또는 안정성 및 그러한 변형 효소의 청소 또는 세척 능력에 중요하다.
본 발명의 많은 프로티아제 변이체가 다양한 세제 조성물을 제제화하는데 유용하다. 다수개의 공지된 화합물이 본발명의 프로티아제 돌연변이를 포함하는 조성물에서 유용한 적절한 계면활성제이다. 이들은 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽 이온성 세정제를 포함하고, Barry J. Anderson에 의한 US 4,404,128 및 Jiri Folra 등에 의한 US 4,261,868에 개시된 바와 같다. 적절한 세정제 제제는 미국 특허 제 5,204,015호(참고문헌으로서 이전에 포함됨)의 실시예7에 기술된 것이다. 본 업계에는 청소 조성물로서 사용될 수 있는 서로 다른 제제가 잘 알려져 있다. 전형적인 청소 조성물에 부가하여, 본 발명의 프로티아제 변이체는 자연 또는 야생형 프로티아제가 사용되는 어떠한 용도에도 사용될 수 있음을 이해해야만 한다. 그러므로, 이들 변이체는 예를 들면, 고체 비누 또는 액체 비누 분야, 접시-보호 제제, 콘텍트렌즈 세정 용액 또는 제품, 펩티드 가수분해, 폐기물 처리, 직물 처리, 단백질 생산에서의 융합-절단 효소 등으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체는 감소된 알레르기성에 부가하여, 세정 조성물에서의 향상된 성능(전구체에 비교하여)을 포함할 수 있다. 본명세서에서, 세정제에서의 향상된 성능은 풀(grass) 또는 혈액과 같은 특정의 효소 감응성 얼룩의 청소가 증가된 것으로서 정의되고, 표준 세척 사이클 후의 통상의 평가법에 의해 결정된다.
본 발명의 프로티아제는 0.1 - 5 중량%(바람직하게는 0.1 - 0.5%) 수준에서 6.5 내지 12.0의 pH를 갖는 분말 및 액체 세정제로서 제제화될 수 있다. 이들 세정 청소 조성물은 공지된 프로티아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제 또는 엔도글리코시다제와 같은 기타의 효소뿐만 아니라 빌더 및 안정화제도 포함할 수 있다.
종래의 청소 조성물에 본 발명의 프로티아제의 부가는 어떠한 특별한 용도 제한을 만들지 않는다. 다시 말하면, 세정제에 적합한 어떠한 온도 및 pH도 그 pH가 상기 범위 이내이고, 온도가 기술된 프로티아제의 변성 온도 이하인 한, 본 조성물에 사용될 수 있다. 부가하여, 본발명의 프로티아제는 세정제 없이 청소 조성물 내에서 빌더 및 안정화제 없이 또는 이들과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 변형 프로티아제는 예를 들면 US 5,612,055;US 5,314,692; 및 US 5,147,642에 기술된 동물 사료 첨가제의 일부로서 동물 사료 내에 포함될 수 있다.
본발명의 양상 중 하나는 본 발명의 변형 프로티아제를 포함하는 직물의 처리를 위한 조성물이다. 본 조성물은 RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359; 및 EP 344,259 같은 간행물에 기술된 바와 같이 예를 들면 실크 또는 울을 처리하는데 사용될 수 있다.
다음은 예시적 목적으로 제시되었고 청구범위에 대한 제한으로서 간주되지 않는다.
변이체는 널리 공지된 방법에 의해 단백분해 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 바람직한 프로티아제 변이체는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 다음에 상응하는 위치에서 다수개의 치환을 포함한다:N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/236H/Q245R; 및
V68A/N76D//S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q235H/Q245R/T260A.
인용된 모든 간행물과 특허는 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다.
실시예 1
순수 인간 T-세포를 이용한 펩티드 T-세포 에피토프의 식별을 위한 분석법
신선한 인간 말초 혈액 세포를 "순수" 인간, 즉, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제에 대해 노출된 적도 감작된 적도 없는 사람으로부터 수집하였는데, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 및 인간 서브틸리신으로부터 프로티아제 내의 항원성 에피토프의 결정용이다. 순수 인간은 과거에 프로티아제에 대한 반응에 노출된 적도 반응이 일어난 적도 없는 것으로 알려진 개인을 의미하려는 의도이다. 말초 단핵 혈액 세포(24시간이내에 실온에서 저장됨)는 다음과 같이 제조되었다: 전혈의 한 단위로부터의 대략 황갈색 피복 조제물의 용액 대략 30ml를 Dulbecco의 인산 완충 용액(DPBS) 50ml와 함께 넣고 두 개의 튜브로 분리시켰다. 샘플을 12.5 ml의 실온 림포프레프(lymphoprep) 밀도 분리 매체(Nycomed 밀도 1.077 g/ml)와 함께 두었다. 튜브를 30분 동안 600G에서 원심분리시켰다. 두 개의 상의 경계면을 수집하고, DPBS 내에서 세척시켰다. 결과의 용액의 세포 밀도는 헤모사이토미터에 의해 측정되었다. 생존능력은 트리판 블루 제거에 의해 측정되었다.
결과의 용액으로부터, 분화된 수상돌기 세포 배양물을 75ml 배양 플라스크당 108개 세포 밀도를 갖는 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터 용액 내에서 다음과 같이 제조하였다:
(1) 50ml의 혈청 없는 AIM V 배지(Gibco)를 1:100 희석 베타-머캅토에탄올(Gibco)로 보충하였다. 플라스크를 37℃에서 5% CO2내에서 2 시간 동안 수평으로 두어서 단핵세포가 플라스크 벽에 부착되도록 하였다.
(2) 단핵 세포가 수상돌기 세포로 분화되는 것은 다음과 같았다: 비부착성 세포가 제거되고 결과의 부착 세포(단핵세포)가 30 ml의 AIM V, 800 단위/ml의 GM-CSF(Endogen) 및 500 단위/ml의 IL-4(Endogen)과 함께 조합시켰다; 결과적인 혼합물을 5일 동안 37℃ 5% CO2내에서 배양시켰다. 5일 후, 시토킨 TNFα(Endogen)이 50 단위/ml의 최종 농도에 부가되었고 그 혼합물을 37℃에서 5% CO2내에서 2일 이상 배양시켰다.
(3) 7일째에, Mytomycin C를 50 마이크로그램/ml의 농도로 부가시켜 분화된 수상돌기 세포 배양물의 성장을 정지시켰다. 그 용액을 60분 동안 37℃에서 5% CO2내에서 배양시켰다. 수상돌기 세포는 부착된 세포를 플라스크의 바닥으로부터 세포 스크래퍼에 의해 부드럽게 긁음으로써 수집하였다. 부착 및 비-부착된 세포는 이후 600G에서 5분동안 원심분리되었고, DPBS 내에서 세척되었고 카운트되었다.
(4) 제조된 수상돌기 세포는 AIM V 배지의 100 마이크로리터 총부피 내에 2x104/웰에서 96 웰 둥근 바닥 배열 내로 두었다.
CD4+ T 세포는 인간 CD4+ Cellect Kit(Biotex)를 사용하여 수상돌기 세포를 제조하는데 사용된 말초 혈액 세포 샘플의 동결 부분표본으로부터 제조자의 지시에 따라 다음과 같은 변조와 함께 제조되었다: 부분표본을 녹히고 세척하여 대략 108세포가 Cellect 칼럼마다 적용되게 하였다; 세포를 4ml DPBS 및 Cellect Kit로부터의 4ml의 Cell 시약 내에 재현탁시키고, 용액을 실온에서 20분동안 유지시켰다. 결과의 용액을 5분동안 600G, 실온에서 원심분리시키고, 펠릿을 2ml의 DPBS 내에서 재현탁시키고 Cellect 칼럼에 적용시켰다. 칼럼으로부터의 용리액은 DPBS 내 2% 사람 혈청 내에 수집시켰다. 결과적인 CD4+ 세포 용액을 원심분리시켰고, AIMV 배지 내에서 지현탁시키고 밀도를 측정하였다.
CD4+ T-세포 현탁액은 AIM V 배지 내 2x108/ml의 수로 재현탁시켜 96 웰 플레이트의 효율적인 조작을 촉진시켰다.
펩티드 항원은 AIM V 배지내에서 1:10 비로 희석시킴으로써 DMSO 내의 1M 스톡 용액으로부터 제조되었다. 스톡 용액의 10 마이크로리터를 분화된 수상돌기 세포를 함유한 96 웰 플레이트의 각 웰 내에 두었다. 상기에서 제조된 희석된 CD4+ T-세포 용액 100 마이크로리터를 각 웰 내로 추가시켰다. 유용한 대조구는 희석된 DMSO 블랭크, 및 테타누스 톡소이드 양성 대조구를 포함한다.
210 마이크로리터 총부피에서, 각 웰 내의 최종 농도는 다음과 같다:
2x104CD4+
2x105수상돌기 세포(R:S는 10:1)
5mM 펩티드
실시예 2
바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 및 인간 서브틸리신으로부터의 프로티아제 내 T-세포 에피토프의 식별
실시예 1에서 기술된 분석법에 사용되는 펩티드는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 및 인간 서브틸리신 아미노산 서열에 기초하여 제조되었다. 펩티드 항원은 다음과 같이 설계되었다. 도 1에서 제공된 인간 서브틸리신 또는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제의 전 길이 아미노산 서열로부터, 15mer가 합성적으로 제조되었고, 각 15mer는 세 개의 잔기를 제외하고는 이전 및 연속하는 15mer와 오버랩한다.
사용된 펩티드는 도 8에서 제공된 바와 같은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 내의 아미노산 잔기 스트링에 상응하고, 펩티드는 도 7에서 제공된 바와 같은 인간 서브틸리신 내의 아미노산 잔기에 상응한다. 프로티아제에 상응하는 사용된 펩티드는 도 6에 제공된다. 모든 테스트는 최소한 이중으로 수행되었다. 보고된 모든 테스트는 항원 테타누스 톡소이드에 대해 강력한 양성 대조 반응을 나타내었다. 반응은 각 실험 내에서 평균내어졌고, 이후 베이스라인 반응에 대해 정규화되었다. 반응이 베이스라인 반응의 최소한 세배인 경우 양성 사건으로 기록되었다.
인간 서브틸리신 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터 제조된 펩티드에 대한 면역학적 반응(즉 T-세포 증식)이 기록되어 각각 도 4 및 5에서 제공된다. T-세포 증식은 첨합된 트리튬 방법에 의해 측정되었다. 다양한 펩티드에 대해 10명의 개인(도 4) 및 16명의 개인(도 5) 내에서의 면역학적 첨가 반응의 비교의 결과가 도 4 및 도 5에 도시되었다. 반응은 1.0이 각 샘플에 대한 베이스라인 반응과 같은 부가된 반응으로서 표시되었다. 그러므로, 도 4에서 10.0 또는 그 미만의 숫자는 베이스라인 반응이고, 도 5에서 16.0 또는 그 미만의 숫자는 베이스라인 반응이다.
도 4 및 5에서 표시된 바와 같이, 비감작된 개인으로부터의 순수 혈액 샘플의 면역학적 반응은 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 프로티아제의 잔기 170-173에 상응하는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 펩티드 단편에서 현저한 알레르기 반응을 나타내었다. 예상된 바와 같이, 인간 서브틸리신 내의 상응하는 단변은 단지 베이스라인 반응을 일으킨다.
도 9는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제에 대해 과민한 것으로 알려진 개인으로부터 채취한 샘플 내의 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제로부터 유래된 펩티드에 대한 T-세포 반응을 도시한다. 펩티드 E05는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 프로티아제 내의 170-173에 상응하는 영역을 나타낸다. 도 9에 도시된 바와 같이, 과민한 개인은 펩티드 E05에 의해 나타내어지는 T-세포 에피토프에 대해 매우 반응성이다. 이 결과는 본발명에 따른 분석법을 수행함으로써, 과민성인 개인의 T-세포에 의해 식별되는 주요 에피토프를 예상하난 것이 가능하다.
도 10은 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제에 과민한 것으로 알려진 개인으로부터 채취한 샘플내의 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 프로티아제로부터 유래된 E05펩티드 내의 다양한 알라닌 치환에 대한 T-세포 반응을 도시한다. 알라닌 치환은 에피토프 내의 특정 잔기의 역할을 결정하기 위한 목적의 치환으로서 사용되었다. 도 10의 기호는 알라닌이 치환된 경우의 펩티드의 위치를 언급하는데, 즉 펩티드 E06(서열 GSISYPARYANAMAV) 내에서, G 대 A=2, S 대 A=3, I 대 A=4, S 대 A=5, Y 대 A=6, P 대 A=7, R 대 A=8, Y 대 A=9, N 대 A=10, M 대 A=11 및 V 대 A=12이다. 도 10에서 표시된 바와 같이, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 프로티아제 내의 잔기 R170A, Y171A 및/또는 N173A의 치환은 과민성 개인의 혈액 샘플 내의 극적인 감소된 반응을 초래한다.이들 결과로부터, 잔기 170, 171 및 173이 이 펩티드 내의 T-세포 반응에 중요한 것이 명백하다. 따라서, 이들 잔기는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 프로티아제 내의 알레르기 반응의 개시의 원인이 됨이 명백하다.

Claims (16)

  1. 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 K170D, Y171Q 및/또는 S173D에 상응하는 전구체 프로티아제 내의 하나 이상의 위치에서 행해진 치환을 포함하는 프로티아제 변이체.
  2. 제 1항에 있어서, N76D, S103A, V1041, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, 및 T260A로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치와 동등한 전구체 프로티아제 내의 하나 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하는 프로티아제 변이체.
  3. 제 2항에 있어서, 바실루스(Bacillus) 서브틸리신으로부터 유래한 프로티아제 변이체.
  4. 제 3항에 있어서, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 서브틸리신 또는 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신으로부터 유래된 프로티아제 변이체.
  5. 제 1항의 프로티아제 변이체를 엔코드하는 DNA.
  6. 제 5항의 DNA를 엔코드하는 발현 벡터.
  7. 제 6항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  8. 제 1항의 프로티아제 변이체를 포함하는 청소 조성물.
  9. 제 1항의 프로티아제 변이체를 포함하는 동물 사료.
  10. 제 1항의 프로티아제 변이체를 포함하는 직물 처리용 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 바실루스 아밀로리크파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신으로부터의
    K170D/Y171Q/S173D;
    N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
    V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
    V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
    V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/236H/Q245R; 및
    V68A/N76D//S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q235H/Q245R/T260A에 상응하는 위치로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합된 치환 세트를 포함하는 프로티아제 변이체.
  12. (a) 단일 혈액 공급원으로부터 수상돌기 세포의 용액 및 순수 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 용액을 얻는 단계;
    (b) 상기 수상돌기 세포의 용액 내에서 분화를 촉진시키는 단계;
    (c) 상기 분화된 수상돌기 세포 및 상기 CD4+ 및/또는 CD8+T-세포의 용액을 대상 펩티드와 결합시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서의 증식을 측정하는 단계
    를 포함하는 인간 내 T-세포 에피토프를 결정하는 방법.
  13. (a) 단백질 내의 T-세포 에피토프를 식별하는 단계;
    (b) 단백질을 변조하여 상기 T-세포 에피토프를 중화시키는 단계
    를 포함하는 단백질의 알레르기성을 감소시키는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 에피토프는:
    (a) 에피토프의 아미노산 서열을 대상 단백질의 인간 상동체로부터 유사 서열로 치환시키는 단계;
    (b) 에피토프의 아미노산 서열을 대상 단백질에 대한 비-인간 상동체로부터의 유사 서열에 의해 치환시키고, 이 유사 서열은 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 단계; (c) 에피토프의 아미노산 서열을 에피토프의 주요 삼차원 구조 특성을 실질적으로 모방하면서도 T-세포 인식에 기인하여 대상 단백질의 알레르기 반응보다 더 작은 알레르기 반응을 생성하는 서열로 치환시키는 단계
    에 의해 변조되는 방법.
  15. 제 14항에 따른 방법에 의해 제조된 감소된 알레르기성을 갖는 단백질.
  16. 제 13항에서 제공된 분석법에 따라 T-세포 에피토프의 내부에 있는 것으로 식별된 아미노산 잔기의 치환 또는 결실을 포함하는 변조를 포함하는 감소된 알레르기성을 갖는 단백질.
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