BRPI0717515A2

BRPI0717515A2 - Detergentes de louças sem fosfatos

Info

Publication number: BRPI0717515A2
Application number: BRPI0717515-9A
Authority: BR
Inventors: Pieter Augustinus; Ayrookaran J Poulose; Amr Toppozada
Original assignee: Danisco Us Inc Genencor Div
Priority date: 2006-10-16
Filing date: 2007-10-12
Publication date: 2013-11-19
Also published as: JP2010507001A; CA2666457A1; US20100105598A1; MX2009003637A; WO2008048537A1; RU2009118412A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETERGEN- TES DE LOUÇAS SEM FOSFATOS".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US 60/852042, depositado em 16 de outubro de 2006, incorporado aqui a título de referência na íntegra.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à composições detergentes para lavar louças que não contêm fosfatos. A presente invenção também diz res-

peito a métodos para a produção e uso de tais detergentes.

Antecedentes da Invenção

Detergentes para máquinas de lavar louças são formulados co- mo misturas de ingredientes que agem para emulsificar e remover restos de comida de louças, inibir a espuma que alguns restos de comida produzem,

deixar a louça molhada para minimizar ou eliminar manchas visíveis, remo- ver manchas (por exemplo, manchas de café e/ou chá), reduzir ou eliminar o embaçamento de talheres, prevenir que películas de sujeiras se acumulem na louça e/ou maximizar um tratamento delicado da louça.

Formulações para máquinas de lavar louças contêm tipicamente cerca de cinco ingredientes básicos, a saber, veículos de alcalinidade, agen- tes complexantes, agentes alvejantes, bioagentes (por exemplo, enzimas) e agentes molhantes. Essas formulações normalmente também contêm sais de fosfatos inorgânicos como builders que seqüestram íons de cálcio e mag- nésio da água. Esse seqüestro ajuda a minimizar a formação de filme na louça. Entretanto, devido às considerações ambientais associadas ao uso de fosfatos como builders, várias formulações que não contém fosfatos e/ou cloro têm sido desenvolvidas. Geralmente, formulações que não contêm fos- fatos contêm sais de ácidos inorgânicos de baixo peso molecular (por exem- plo, citrato de sódio) como builders. Visto que o citrato não é tão eficaz como o fosfato, outros aditivos (por exemplo, polímeros de ácido acrílico) são tam- bém incluídos para minimizar o aumento das manchas e formação de filme que tipicamente ocorrem com o uso de formulações detergentes sem fosfa- tos.

De fato, muitos esforços têm sido feito no sentido de substituir todos ou pelo menos alguns fosfatos utilizados em detergentes para lavar louças por produtos químicos mais ecologicamente aceitáveis. Entretanto, 5 muito poucos produtos químicos forneceram resultados promissores. A mui- tos químicos falta a capacidade de limpeza desejada, enquanto a outros falta o efeito de builder do fosfato, outros são menos desejáveis ecologicamente que os fosfatos e alguns são demasiado caros para serem práticos.

Assim, necessita-se de detergentes para lavar louças que não 10 contenham fosfatos, mas que sejam tão eficazes quanto os detergentes que contêm fosfatos no que tange à remoção de sujeira de louças. Ademais, ain- da há uma necessidade por composições para lavar louças que sejam mais amigáveis ao meio ambiente e ao consumidor, e estejam em uma forma fácil de usar e rentável.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona composições detergentes para lavar louças que não contêm fosfatos. A presente invenção também propor- ciona métodos para a produção e uso de tais detergentes. A adição de enzi- mas ou o uso de enzimas mais ativas pode superar os efeitos negativos de 20 limpeza encontrados em formulações que não contêm fosfatos. A presente invenção proporciona composições de detergente para louças que não con- têm fosfatos. A presente invenção também proporciona métodos para a pro- dução e o uso de tais detergentes. Em algumas modalidades particularmen- te preferidas, a presente invenção proporciona composições de detergente 25 de louças que contêm de cerca de 2 a 3 vezes a concentração de enzimas de limpeza encontrada em detergentes comumente utilizados.

A presente invenção também proporciona detergentes para lavar louças que não contêm fosfatos, em que os detergentes compreendem pelo menos uma protease, em que tal protease é uma protease com um desem- 30 penho específico maior que duas vezes o da enzima de protease PROPE- RASE®, e em que o detergente fornece um pH para solução de limpeza en- tre cerca de 7 e cerca de 10,5. Em algumas modalidades preferidas, a pro- tease é uma protease de subtilisina. Em algumas outras modalidades, a pro- tease compreende pelo menos cerca de 0,02% do dito detergente. Em al- gumas modalidades ainda mais preferidas, o detergente também compreen- de agentes alvejantes ou ativadores de alvejamento. Em algumas modalida- 5 des preferidas adicionais, o detergente também compreende pelo menos uma enzima selecionada de proteases (incluindo, mas sem limitação, àque- las proteases classificadas em EC 3.4.21), metaloproteases (incluindo, mas sem limitação, àquelas classificadas em EC 3.2.24), carboidrases, oxido- redutases, lipases, pectinases, mananases, amilases, hemicelulases, este- 10 rases, transferases e perhidrolases.

Em algumas modalidades mais preferidas, os detergentes da presente invenção compreendem de cerca de 0,13% a cerca de 0,39% de proteína ativa (em outras palavras, enzima de limpeza). Entretanto, não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer porcentagem 15 de proteína ativa particular, já que qualquer concentração de proteína ativa que proporcione o benefício de limpeza desejado em um detergente, que não contém fosfatos, pode ser utilizada na presente invenção.

Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima de limpeza é a protease PROPERASE®, ao passo que em algumas outras 20 modalidades preferidas, a enzima de limpeza é uma subtilisina tipo selva- gem ou qualquer outra enzima do tipo subtilisina adequada. De fato, não se pretende que a presente invenção esteja limitada à enzima PROPERASE®, já que outras enzimas podem ser utilizadas na presente invenção.

Também se pretende que qualquer modalidade aqui descrita possa ser utilizada em qualquer combinação adequada. Assim, pretende-se que o escopo da presente invenção englobe todas as combinações de traba- lho das modalidades aqui descritas.

Descrição da Invenção

A presente invenção proporciona composições detergentes para lavar louças que não contêm fosfatos. A presente invenção também fornece métodos para a produção e uso de tais detergentes.

A menos que seja indicado o contrário, a prática da presente in- venção envolve técnicas convencionais, comumente utilizadas em biologia molecular, microbiologia, purificação de proteínas, engenharia de proteínas, proteínas e sequenciamento de DNA, campos de DNA recombinante e de- senvolvimento e uso de enzima industrial, todas conhecidas por um técnico 5 no assunto. Todas as patentes, pedidos de patentes, artigos e publicações aqui mencionados são, ambos supra e infra, expressamente incorporados a título de referência.

Ademais, as direções aqui fornecidas não são limitações aos vários aspectos e modalidades da invenção, que podem ser tomadas por 10 referência ao relatório descritivo como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente abaixo são mais bem definidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Não obstante, para facilitar o entendimen- to da invenção, as definições para uma variedade de termos são dadas a- baixo.

A não ser que aqui se indique o contrário, todos os termos técni-

cos e científicos possuem algum significado que é comumente entendido por um técnico no assunto. Por exemplo, Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology and MolecuIarBioIogy, 2a Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); e Hale e Margham, The Harper Collins Dictionary ofbiology, Harper and Pe- 20 rennial, NY (1991) fornecem aos técnicos no assunto dicionários gerais so- bre vários dos termos utilizados na invenção. Ainda que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser uti- lizados na prática da presente invenção, métodos e materiais preferíveis são descritos aqui. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente abaixo 25 são mais bem definidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Ademais, como aqui utilizados, os termos no singular “o”, “a”, “um”, “uma” incluem seus respectivos plurais a não ser que o contexto indique claramen- te o contrário. A não ser que seja indicado o contrário, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita em uma orientação 5' para 3'; seqüências 30 de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação carbó- xi, respectivamente. Deve ser entendido que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes descritos, já que esses podem variar conforme o contexto de utilização por um técnico no assunto.

Pretende-se que cada limite numérico máximo dado neste rela- tório descritivo inclua cada limite numérico mínimo, como se tais limites nu- méricos inferiores estivessem expressamente escritos aqui. Cada limite nu- 5 mérico mínimo dado ao longo deste relatório descritivo incluirá cada limite numérico máximo, como se tais limites numéricos máximos estivessem ex- pressamente escritos aqui. Todas as faixas numéricas dadas ao longo deste relatório descritivo vão incluir todas as faixas numéricas mais estreitas que caiam dentro de tal faixa numérica mais larga, como se tais faixas numéricas 10 mais estreitas estivessem todas escritas aqui.

Como utilizado aqui, o termo “compatível” significa que os mate- riais da composição de limpeza não reduzem a atividade enzimática da(s) enzima(s) protease aqui fornecidas em tal extensão que a(s) protease(s) não seja(m) eficaz(es) como seria desejado em situações normais. Materiais da 15 composição de limpeza específicos são exemplificados em detalhes daqui em diante.

Como utilizado aqui, “quantidade eficaz de enzimas” refere-se à quantidade de enzimas necessárias para que se atinja a atividade enzimáti- ca exigida na aplicação específica. Tais quantidades eficazes são facilmente 20 determinadas por um técnico no assunto e são baseadas em vários fatores, tais como a variante de enzima, em particular, utilizada, a aplicação da lim- peza, a composição específica da composição de limpeza, e se uma compo- sição líquida ou seca (por exemplo, granular) é requerida e similar.

Como utilizada aqui, a frase “estabilidade do detergente” se refe- re à estabilidade de uma composição detergente. Em algumas modalidades, a estabilidade é avaliada durante o uso do detergente, ao passo que em ou- tras modalidades, o termo se refere à estabilidade de uma composição de- tergente durante a armazenagem.

Como utilizados aqui, os termos “purificado” e “isolado” se refe- rem à remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, uma enzi- ma de interesse é purificada através da remoção de proteínas contaminan- tes e outros compostos em uma solução ou preparação que não sejam a enzima de interesse. Em algumas modalidades, enzimas recombinantes de interesse são expressas em células bacterianas ou fungais e essas enzimas recombinantes de interesse são purificadas através da remoção de outros constituintes da célula hospedeira; a percentagem de enzimas recombinan- tes de polipeptídeos de interesse é assim aumentada na amostra.

Como utilizado aqui, o termo “proteína de interesse” se refere a uma proteína (por exemplo, uma enzima ou uma “enzima de interesse”), a qual está sendo analisada, identificada e/ou modificada. Proteínas de ocor- rência natural, bem como as recombinantes podem ser utilizadas nesta in- venção.

Como utilizado aqui, o termo “proteínas” se refere a qualquer composição que compreenda aminoácidos e reconhecida como proteína por um técnico no assunto. Os termos “proteína”, “peptídeo” e polipeptídeo são aqui utilizados de maneira intercambiável. No caso de um peptídeo ser uma 15 parte de uma proteína, os técnicos no assunto entendem o uso do termo no contexto.

Como utilizado aqui, proteínas funcionalmente e/ou estrutural- mente similares são consideradas “proteínas relacionadas”. Em algumas modalidades, essas proteínas são derivadas de um gênero e/ou espécie di- 20 ferentes, incluindo-se diferenças entre classes de organismos (por exemplo, uma enzima de bactéria ou uma enzima de fungo). Em modalidades adicio- nais, proteínas relacionadas são proporcionadas das mesmas espécies. De fato, não se pretende que a presente invenção seja limitada às proteínas relacionadas de qualquer fonte em particular. Ademais, o termo “proteínas 25 relacionadas” engloba homólogos estruturais terciários e homólogos de se- qüência primária (por exemplo, as enzimas da presente invenção). Em ou- tras modalidades, o termo engloba proteínas que são imunologicamente de reatividade cruzada.

Como utilizados aqui, os termos “composição detergente” e “formulação detergente” se referem a misturas, as quais se pretendem utili- zar em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em modalida- des preferidas, o termo é utilizado para se referir aos detergentes utilizados para lavar louças, talheres, etc (por exemplo, “detergentes de louça” ou “de- tergentes para lavar louças”). Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composição detergente em particular. O que de fato se presente é que, além dos detergentes que contêm pelo me- 5 nos uma protease da presente invenção, o termo englobe detergentes que contenham tensoativos, tranferases, enzimas hídrolíticas, oxido redutases, builders, agentes alvejantes, ativadores de alvejamento, agentes azulantes ou tintas fluorescentes, inibidores de aglutinamento, agentes mascaradores, ativadores de enzimas, antioxidantes e solubilizadores.

Como utilizado aqui, o termo “composição para lavar louças” se

refere a todas as formas de composições para lavar louças, incluindo talhe- res e incluindo, mas não se limitando a formas granulares e líquidas. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer tipo ou composi- ção de louças em particular. De fato, a presente invenção pode ser utilizada 15 para a limpeza de louças (por exemplos, louças, incluindo-se, mas sem limi- tação, pratos, canecas, copos, tigelas, etc.) e talheres (por exemplo, utensí- lios incluindo-se, mas sem limitação, colheres, facas, garfos, utensílios para servir comida, etc) de qualquer material, incluindo-se, mas sem limitação, cerâmicas, plásticos, metais, porcelana chinesa, vidros, acrílicos, etc. O ter- 20 mo “louças” é utilizado aqui para se referir tanto a louças quanto a talheres.

Como utilizado aqui, “detergentes para lavar louças que não contém fosfatos” são detergentes que contêm não mais que 0,5% de fósforo (em outras palavras, o fósforo é um elemento em traços).

Como utilizado aqui, “desempenho de lavagem” de uma protea- se mutante se refere à contribuição de uma enzima protease mutante à la- vagem de louças, fornecendo desempenho de limpeza adicional ao deter- gente sem a adição de protease mutante à composição. O desempenho de lavagem é comparado sob condições de lavagem relevantes.

O termo “condições de lavagem relevantes” é aqui utilizado para indicar as condições, em particular a temperatura de lavagem, tempo, mecâ- nica de lavagem, concentração da espuma de sabão, tipo de detergente e dureza da água, realmente utilizadas nas casas em um segmento de merca- do de detergentes de louças.

O termo “desempenho de lavagem aperfeiçoado” é utilizado para indicar que um melhor resultado final é obtido na retirada de manchas de louças e/ou de talheres sob condições de lavagem relevantes, ou para indi- 5 car que uma protease menos mutante é, com base em peso, necessária pa- ra que se obtenha o mesmo resultado final em relação à enzima tipo selva- gem correspondente.

O termo “desempenho de lavagem retido” é utilizado para indicar que o desempenho de lavagem de uma enzima protease mutante é, basea- do em peso, pelo menos 80% relativo à enzima tipo selvagem corresponden- te, sob condições de lavagem relevantes.

O desempenho de lavagem das proteases é convenientemente medido por sua capacidade de remover certas manchas representativas sob condições de teste apropriadas. Nesses sistemas de teste, outros fatores relevantes tais como a composição do detergente, a concentração de sujei- ra, a dureza da água, a mecânica da lavagem, o tempo, o pH e/ou a tempe- ratura podem ser controlados de tal forma que as condições típicas de uma aplicação caseira em certo segmento de mercado sejam imitadas. O sistema de teste de aplicação em laboratório aqui descrito é representativo de apli- cações caseiras quando utilizado em enzimas proteolíticas modificadas via mutagênese de DNA. Assim, os métodos aqui fornecidos facilitam o teste de grandes quantidades de diferentes enzimas e a seleção daquelas enzimas que são particularmente adequadas a um tipo específico de aplicação de detergente. Dessa forma, enzimas “sob medida” para uma aplicação especí- fica são facilmente selecionadas.

Como utilizados aqui, os termos “protease” e “atividade proteolí- tica” se referem a proteínas ou peptídeos que exibem a capacidade de hidro- Iisar peptídeos ou substratos que contêm ligações peptídicas. Existem mui- tos procedimentos bastante conhecidos para a medição da atividade proteo- 30 lítica. Em algumas modalidades, por exemplo, a atividade proteolítica é de- tectada por ensaios comparativos que analisam a capacidade da respectiva protease de hidrolisar um substrato comercial. Substratos exemplares, úteis na análise da atividade da protease ou proteolítica, incluem, sem limitação, di-metii caseína, colágeno bovino, elastina bovina e queratina bovina. Enasi- os colorimétricos que utilizam esses substratos são bem conhecidos no es- tado da técnica (ver, por exemplo, WO 99/34011 e a Patente US 6.376.450, ambos aqui incorporados a título de referência). O ensaio de pNA (ver, por exemplo, Del Mar et ai, Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) também pode ser utilizado na determinação da concentração de enzimas ativas por fra- ções coletadas durante eluição com gradiente. Esse ensaio mede a taxa que a p-nitroanilina é liberada na medida em que a enzima hidrolisa o substrato sintético solúvel, sucinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nítroanilida (sAAPF-pNA). A taxa de produção da cor amarela da reação de hidrólise é medida em 410 nm em um espectrofotômetro e é proporcional à concentra- ção das enzimas ativas. Ademais, medições de absorbância em 280 nm po- dem ser utilizadas para determinar a concentração total de proteínas. A ra- zão de enzimas ativas/proteína total dá a pureza da enzima.

Como utilizado aqui, o termo “desempenho comparativo” no con- texto da atividade de limpeza se refere a pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da atividade de limpeza de uma subtilisina pro- 20 tease comparativa (por exemplo, proteases comercialmente disponíveis), incluindo, mas sem limitação, a protease OPTIMASE® (Genencor), produtos de protease PURAFECT® (Genencor), protease SALVINASE® (Novozy- mes), Variantes BPN1 e variantes GG36 (ver, por exemplo, a Patente US Re 34.606, proteases RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE®, KANNASE™ 25 (Novozymes), MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, e PURAMAX™ (Genencor; ver também as Patentes US Re 34.606, US 5.700.676, US 5.801.038, US 5.955.340, US 5.972.682, US 6.218.165, US 6.287.841, US 6.312.936, US 6.465.235, US 6.482.628, US 6.586.221, US 6.815.193, US 7.129.076, EP 130756, EP 328 229, EP 571 049 e EP 723 590) e os produ- 30 tos de protease variante B. Ientus [por exemplo, aqueles descritos em WO 92/21760, WO 95/23221 e/ou WO 97/07770 (Henkel). Variantes de subtilina proteases exemplares incluem, sem limitação, aquelas que possuem substi- tuições ou deleções em posições de resíduo equivalentes às posições 76, 87, 101, 103, 104, 118, 120, 129, 130, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248 e/ou 252 de BPN' (por exemplo, a protease PROPERA- SE® compreende a seqüência de protease GG36 conforme é conhecido na 5 técnica, com as substituições 87N, 101G e 104N, utilizando a numeração BPN1 como é conhecido na técnica). Em algumas modalidades, o desempe- nho de limpeza é determinado pela comparação das proteases da presente invenção com aquelas subtilisina proteases em vários ensaios de limpeza a respeito de manchas sensíveis a enzimas como determinado pela espectro- 10 fotometria ou metodologias analíticas habituais após condições de ciclo de lavagem padrão.

Como utilizado aqui, o termo “desempenho específico” se refere à limpeza de manchas específicas por unidade de proteína ativa. Em algu- mas modalidades preferidas, o desempenho específico é determinado utili- 15 zando-se manchas como gema de ovo, ovo/leite, carne moída, chá, leite, mingau, etc. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a protea- se utilizada no detergente para lavar louças sem fosfatos da presente inven- ção tem pelo menos o dobro do desempenho específico em relação à prote- ase PROPERASE® (Genencor) comercialmente disponível.

Como utilizado aqui, o termo “desinfetante” se refere a remover

de contaminantes das superfícies, assim como a inibir ou matar micróbios nas superfícies dos artigos. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer superfície, artigo ou contaminates ou micróbios a serem removidos em particular.

Algumas serina proteases bacterianas são referidas como “subti-

lisinas”. Subtilisinas compreendem as serina proteases da Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaeiens (“subtilisina BPN”) e Bacillus Iieheniformis (“subti- lisina Carlsberg”) (ver, por exemplo, Markland e Smith, em Boyer (ed.), Enzymes, The (Boyer, ed.) vol. 3, pp. 561-608, Academic press, New York, 30 [1971]). Cepas de Bacillus tais como as cepas de Bacillus alcalofílicos pro- duzem outras proteases. Exemplos dessa última categoria incluem serina proteases tais como a protease MAXACAL® (também referida aqui como “protease PB92”, isolada de Bacillus nov. spec. PB92) e a proteases SAVI- NASE®. Proteases adicionais incluem, sem limitação, a proteases PROPE- RASE®.

Em algumas modalidades, o detergente para lavar louças da 5 presente invenção contêm concentrações variáveis de enzimas. EXPERIMENTAL

Os seguintes exemplos são fornecidos para que se demonstre e ilustre, sem limitação, certas modalidades e aspectos preferidos da presente invenção.

Na descrição experimental que se segue, as seguintes abrevia-

ções são aplicadas: 0C (graus Celsius); rpm (rotações por minuto); H2O (á- gua); HCI (ácido clorídrico); aa (aminoácido); bp (par de bases); (par de qui- lobases); kD (quilo-Daltons); g (gramas); pg (microgramas); mg (miligramas); ng (nanogramas); pL (microlitros); mL (mililitros); mm (mililitros); nm (nanô- 15 metros); pm e um (micrômetros); M (molar); mM (milimolar); μΜ (micromo- lar); U (unidades); V (volts); MW (peso molecular); s (segundos); min(s) (mi- nuto(s)); h (hora ou horas); a.p ou ap (proteína ativa); MgCb (cloreto de magnésio); NaCI (cloreto de sódio); OD2so (densidade óptica a 280 nm); OD6Oo (densidade óptica a 600); PAGE (eletroforese com gel de poliacrilami- 20 da); EtOH (etanol); PBS (soro de fosfato tamponado [ NaCI 150mM, tampão de fosfato de sódio 10mM, pH 7,2]); SDS (dodecil sulfato de sódio); Tris (tris(hidroxímetil)amino-metano); TAED (Ν,Ν,Ν',Ν’-tetraacetil-etileno- diamina); w/v (peso por volume; v/v (volume por volume); MS (espectrosco- pia de massa); TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); 25 AATCC (American Association of Textile and coloring Chemists); SR (remo- ção de manchas ou sujeiras); STPP (tripolifosfato); MGDA (ácido metil- gliceno-diacético); TNC (citrato trissódico); WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Alemanha); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arling- ton Heigths, IL); ICN (ICN pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce 30 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Amersham (Amer- sham Bíosciences, Inc., Piscataway, NJ); Becton Dickinson (Beckton Diekin- son Labware, Lincoln Park, NJ); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, Ml); GIBCO BRL ou Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Novagen (Novagen, Inc., Madison, Wl); Qiagen (Qiagen, Inc., valencia, CA);

Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Finnzymes (Finnzymes Oy, Es- poo, Finlândia); Macherrey-Nagel (Macherey-Nagel, Easton, PA); Merieux (Institut Merieux, Codex, França); Kelco (CP Kelco, Atlanta, GA); Genaissan- ce (Genaissance pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT); DNA 2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); MIDI (MIDI Labs, Newark, DE); InvivoGen (InvivoGen, San 10 Diego, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Sorvall (Sorvall Ins- truments, uma subsidiária da DuPont Co., Biotechnology Systems, Wilming- ton, DE); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffman La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilen (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwo- 15 od, NY); Henkel, GmbH, Düsseldorf, Alemanha); Cognis (Cognis Corp, USA, Cíncinatti, OH); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia); Reckitt Benc- kiser (Berks, Reino Unido); BASF (BASF Corp., Florham Park, NJ) e WFK (Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Alemanha).

Nos exemplos a seguir, a PROPERASE® (Genencor) foi a enzi- ma testada. A “dose 1x” utilizada foi de 0,13% de proteína ativa, já “dose 3x” foi de 0,39% de proteína ativa. Contempla-se que porcentagens de enzimas mais baixas também podem ser utilizadas na presente invenção, desde que o desempenho específico seja melhor que PROPERASE®. Por exemplo, em algumas modalidades, a enzima presente em um detergente é de cerca de 0,02% da formulação do detergente. Entretanto, não se pretende limitar a presente invenção a qualquer porcentagem particular de protease. Como utilizado aqui, o termo “desempenho específico” se refere à limpeza de man- chas específicas por unidade de proteína ativa. Em algumas modalidades preferidas, o desempenho específico é determinado utilizando-se manchas tais como de gema de ovo, ovo/leite, carne moída, chá, leite, mingau, etc. Exemplo 1

Comparação entre detergente que contém fosfatos e de detergente que não contém fosfatos

Neste exemplo, são descritos experimentos conduzidos para comparar o desempenho de formulações detergentes que contêm fosfatos e que não contêm fosfatos.

Os detergentes utilizados nestes experimentos são descritos abaixo. Esses detergentes foram obtidos da fonte sem a presença de enzi- mas, para permitir a análise das enzimas testadas nestes experimentos. Como indicado acima, a enzima utilizada nestes experimentos foi a protease PROPERASE® (Genencor).

Detergente Isento de fosfatos IEC-60436 WFK Tipo B (pH = 10,4 em 3g/L)

Componente % em peso

Diidrato de citrato de sódio (N 1560, Jungbunzlauer)

30,0

Sal de sódio de copolímero de ácido maléico/ácido acrílico (SOKALAN® 12,0

CP5, BASF)*

Monoidrato de perborato de sódio 5,0

TAED (Warwick) 2,0

Dissilicato de sódio (PORTIL® A; Cognis)

Etoxilato de álcool graxo linear (Plu- rafac LF 403, BASF)

Carbonato de sódio anidro (Soda Leicht, Matthes&Weber)

25.0

2.0

adicionar até atingir 100

*Uma alternativa é 20% de Norasol WL4/Norsohaas (30% ativo em carbona- to de sódio). Detergente Contendo fosfatos IEC-60436 WFK Tipo C (pH = 10,4 em 3g/L)

Componente Wt%

Tripolifosfato de sódio (Thermphos NW; Clariant)

Diidrato de citrato de sódio (N 1560, Jungbunzlauer)

23,0

22,3

Sal de sódio de copolímero de ácido maléico/ácido acrílico (SOKALAN® 4,0

CP5, BASF)*

Monoidrato de perborato de sódio 6,0

TAED (Warwick) 2,0

Dissilicato de sódio (não cristalino: (PROTIL® A; Cognis)

Etoxilato de álcool graxo linear (Plu- rafac LF 403, BASF)

Carbonato de sódio anidro (Soda Leicht, Matthes&Weber)

5.0

2.0

Adicionar até atingir 100

*Uma alternativa é 20% de Norasol WL4/Norsohaas (30% ativo em carbona- to de sódio).

Manchas de Gema de Qvo em Aco Inoxidável

As chapas de aço inox ( 10 x 15 cm; escovadas em um lado) 5 utilizadas neste experimento foram meticulosamente lavadas a 95°C em uma máquina de lavar louças de laboratório com um detergente comercial de alta alcalinidade (por exemplo, detergente ECOLAB®; Henkel) para for- necer chapas limpas e sem gordura. Essas chapas foram alisadas antes do primeiro uso. As chapas foram secadas por 30 minutos a 80°C em uma ca- 10 bine térmica antes de serem sujas com gema de ovo. As superfícies a serem escovadas não foram tocadas antes de serem sujas. Ademais, não foram permitidas manchas de água ou pêlos. As chapas resfriadas foram pesadas antes de serem sujas.

As gemas de ovo foram preparadas separando-se as gemas de aproximadamente 10 a 11 ovos (200 g de gema de ovo) das claras. As ge- mas foram batidas com um garfo em um copo para homogeneizar a suspen- são de gemas. As gemas foram então coadas (malha de aproximadamente 0,5 mm) para que remoção das partículas grossas e qualquer fragmento da 5 casca do ovo.

Uma escova plana (6,35 cm; 2,5”) foi utilizada para aplicar 1,0 ±

0,1 g da suspensão de gema de ovo tão uniformemente quanto possível so- bre uma área de 140 cm2 nos lados escovados de cada uma das chapas de aço inox, deixando uma margem de aproximadamente 1 cm de largura limpa 10 (fita adesiva foi utilizada quando necessário). As chapas sujas foram seca- das horizontalmente (para impedir a formação de gotas nas bordas das cha- pas) á temperatura ambiente por 4 horas (máximo 24 h).

Para desnaturação, as chapas foram imersas por 30 segundos em água desmineralizada em ebulição (utilizando-se um dispositivo para se- gurar, se necessário). Então, as chapas foram secadas novamente por 30 minutos a 80°C. Após secagem e resfriamento, as chapas foram pesadas. Após a pesagem, as chapas foram deixadas por pelo menos 24 horas (20°C, 40-60% de umidade relativa) antes de serem submetidas ao teste de lava- gem. Para que fossem atingidas as exigências de teste, somente a chapas com 500 ±100 mg/140 cm2 (gema de ovo após a desnaturação) foram utili- zadas no teste. Depois que os testes de lavagem foram realizados, as cha- pas foram secadas por 30 minutos a 80°C, na cabine térmica, e novamente pesadas após resfriamento. A porcentagem de desempenho de limpeza foi determinada dividindo-se (mg de gema de ovo liberada por limpeza x 100) por (mg de gema de ovo desnaturada aplicada).

Carne Moida em Pratos de Porcelana

Para esses experimentos, pratos de sobremesa (Arzberg, porce- lana lustrada, branca) conforme EN 50242, formulário 1495, No. 0219, de 19 cm de diâmetro foram utilizados. Um total de 225 g de carne suína magra e 30 bovina (meio a meio) foi finamente cortada e resfriada, depois da remoção de gorduras visíveis. Passou-se a mistura por um moedor por duas vezes. Temperaturas acima de 35°C foram evitadas. A seguir, 225 g de carne moída foram misturados com 75 g de ovo (gema e clara misturadas). A preparação foi então congelada por até 3 meses a -18°C antes do uso. Se a carne suína não estava disponível, carne bovina era utilizada, já que são intercambiá- veis.

A mistura de carne moída e ovo (300 g) foi trazida até a tempe-

ratura ambiente e misturada com 80 mL de água sintética. A mistura foi en- tão homogeneizada utilizando-se um misturador de cozinha de mão por 2 min. A seguir, um garfo foi utilizado para espalhar 3 g da mistura de carne moída/ovo/água em cada prato de porcelana branca, deixando uma margem 10 limpa de aproximadamente 2 cm de largura em volta da borda. A quantidade aplicada foi de 11,8 ± 0,5 mg/cm2. Os pratos foram secados por 2 horas a 120°C em uma cabine térmico pré-aquecido. Tão logo os pratos são resfria- dos, eles estavam prontos para utilização. Os pratos foram empilhados com toalhas de papel entre cada um.

Após a lavagem, uma solução com ninhidrina (1% de etanol) foi

espalhada sobre os pratos para melhor identificação dos resíduos de carne moída. Para promover a reação de coloração, os pratos foram aquecidos por min a 80°C na cabine térmica. A avaliação do desempenho de limpeza foi feita por inspeção visual das reações de cor dos resíduos de carne moída, utilizando-se o catálogo fotográfico IKW (IKW).

Manchas de Ovo/Leite em Aço Inoxidável

As chapas de aço inoxidável (10x15 cm; escovadas em um la- do) utilizadas neste experimento foram meticulosamente lavadas a 95°C em uma máquina de lavar louças de laboratório com um detergente comercial 25 de alta alcalinidade para remover gordura e limpar as chapas. As chapas foram polidas até ficarem secas com um pano de celulose. As superfícies a serem escovadas não foram tocadas antes de serem sujas. Ademais, não foram permitidas manchas de água ou pêlos. Antes de serem sujas, as cha- pas foram colocadas em uma cabine térmica a 80°C por 30 minutos. As cha- 30 pas resfriadas foram pesadas antes de serem sujas.

As gemas e claras de ovos de ovos crus inteiros (3 a 4 ovos; 160 g/ovo) foram colocadas em uma tigela e batidas com um batedor de ovos. A seguir, 50 mL de leite UHT semi-desnatado (1,5% de gordura, homogenei- zado em alta temperatura) foram adicionados à mistura. O leite e o ovo fo- ram misturados sem gerar espuma. Uma escova plana foi utilizada para apli- car 1,0 ± 0,1 g da mistura de ovo/leite sobre o lado escovado das chapas de 5 aço inoxidável, e uma balança foi utilizada para checar a distribuição. Uma margem de aproximadamente 1 cm de largura limpa foi deixada nos lados curtos das chapas. As chapas sujas foram secadas horizontalmente (para impedir a formação de gotas nas bordas das chapas) à temperatura ambien- te por 4 horas (máximo de 24 h).

A seguir, as chapas foram imersas por 30 segundos em água

desmineralizada em ebulição (utilizando-se um dispositivo para segurar, se necessário). Então, as chapas foram secadas novamente por 30 minutos a 80°C. Após secagem e resfriamento, as chapas foram pesadas. Após a pe- sagem, as chapas foram deixadas por pelo menos 24 horas (20°C, 40-60% 15 de umidade relativa) antes de serem submetidas ao teste de lavagem. Para que fossem atingidas as exigências de teste, somente chapas com 190 ± 10 mg de gema de ovo foram utilizadas.

Depois que os testes de lavagem foram efetuados, as chapas foram secadas por 30 minutos a 80°C, na cabine térmica e, novamente, pe- sadas após resfriamento. A porcentagem de desempenho de limpeza foi de- terminada dividindo-se (mg de ovo/leite liberado por limpeza x 100) por (mg de ovo/leite aplicado).

Manchas de Chá em Xícaras de Chá

Para preparar as manchas de chá, xícaras de chá com uma es- 25 pessura de 6 a 8 mm (por exemplo, Bauscher, Art. N0 6215/15) foram utiliza- das. Como a espessura da xícara determina a taxa de resfriamento do chá, foi importante utilizar consistentemente xícaras com esta espessura de pare- de. As xícaras foram meticulosamente lavadas ou em uma lavadora domés- tica a 65°C com detergente IEC A, ou em uma lavadora de louças de Iabora- 30 tório a 95°C com detergente comercial, antes de serem manchadas com chá. Para preparar cerca de 20 xícaras de chá, 2 litros de água com dureza intensificada (ou seja, água sintética com dureza aumentada para 3,00 mmols (Ca e Mg a 16,8° d, segundo o documento IEC 734, método B)) foram misturados com 0,1 ml_ de uma solução de sulfato férrico (ver abaixo) e le- vados a uma chaleira. A seguir, a água em ebulição foi vertida em 30 g de chá (por exemplo, Assan, Lipton) em um contêiner aberto e deixado por 5 5 minutos. O chá foi então coado (largura da malha de 0,5 mm) para outro va- so com temperatura controlada. Notou-se que o chá Assam foi particular- mente difícil de ser removido.

As xícaras limpas foram preenchidas com 100 mL de chá, de forma que a temperatura do chá nas xícaras era de 85°C. Atemperatura ini- 10 ciai do chá vertido era de cerca de 93°C. A cada 5 minutos, 20 mL eram re- movidos das xícaras com uma pipeta, até todos as xícaras estarem vazias (5 vezes). Esse processo foi repetido uma vez mais com chá recém-feito. Antes da lavagem, os copos sujos foram armazenados por pelo menos 3 dias em um ambiente em condições constantes (20°C, 60% de umidade relativa).

Foi mostrado que quando água sintética com dureza suplemen-

tada apenas por íons Ca e Mg era utilizada, as xícaras de chá não adquiriam manchas escuras o suficiente. Por esse motivo, íons férricos foram adicio- nados à água sintética para produzir uma mancha de chá mais escura. Essa solução de estoque de sulfato férrico foi preparada através da dissolução de 20 5 g de Fea(SO4)3 e 1 mL de HCI (37%) em água desmineralizada e preen- chimento até 1 litro. Então 0,1 mL da solução de estoque foi adicionado a 2 litros de chá.

A avaliação do desempenho de limpeza foi feita por inspeção visual das reações de cor dos resíduos de chá, utilizando-se o catálogo foto- gráfico IKW (IKW).

LeiteAquecido em Micro-ondas

Essas manchas foram preparadas pelo aquecimento de leite UHT semi-desnatado (1,5%, leite homogeneizado e pasteurizado em ultra- alta temperatura) em aparelho de micro-ondas. O aparelho de micro-ondas 30 foi configurado para uma saída de 450 W. Para preaquecer o micro-ondas, seis béqueres curtos de vidro de 150 mL contendo 50 mL de água foram si- metricamente dispostos ao redor da borda do prato rotativo do micro-ondas. Os béqueres foram aquecidos por 10 minutos. A seguir, 10 mL de leite à temperatura ambiente foram colocados em cada um dos 6 béqueres de vi- dro, os béqueres foram posicionados da mesma maneira no prato rotativo e aquecidos. O tempo de cozimento foi de 10 minutos a 450 W. Como a saída 5 de fomos de micro-ondas pode se desviar do que foi configurado, os micro- ondas foram testados a cada 3 meses. Dependendo do grau do desvio, o tempo de cozimento era adaptado ou com um comutador independente ou, nos casos em que o forno de micro-ondas podia ser configurado com preci- são de segundos na faixa de 10 minutos, o comutador do próprio forno era 10 variado. O tempo de cozimento foi observado precisamente para garantir resultados reproduzíveis. O tempo exato de cozimento (em segundos) foi marcado no micro-ondas junto com sua data de validade. Após o cozimento, a sujeira de leite foi pós-tratada por 2 horas a 80°C em uma cabine térmica térmica com ar recirculante.

Mingau (Flocos de Aveia)

Estas manchas foram preparadas em uma porcelana branca po- lida de 23 cm de diâmetro (por exemplo, aquelas correspondentes ao padrão EN, louças de Arzberg ou similares). Para preparar os flocos de aveia, a a- veia para mingau (50 g de aveia para mingau; por exemplo, Peter Kõlln, flo- 20 cos tenros de Kõlln) foi misturada em 750 mL de água sintética gelada e 250 mL de leite pasteurizado 1,5%. A mistura foi uniformemente aquecida e fervi- da por 10 minutos, sendo constantemente agitada. Uma escova foi utilizada para espalhar uniformemente 3 g de mingau quente na superfície interna do prato com cuidado, para que se mantivesse a borda do prato livre. Aproxi- 25 madamente 10,6 ± 0,5 mg/cm2 foram aplicados por área do prato. Os pratos sujos foram secados por 2 horas a 80°C em uma cabine térmica. Após se- rem resfriados até a temperatura ambiente, os pratos estavam prontos para uso nos testes de lavagem. Após a lavagem, os restos de mingau foram ava- liados por inspeção visual utilizando-se o catálogo fotográfico. Para facilitar a 30 identificação da sujeira de mingau residual, os pratos foram imersos em uma solução de iodo preparada de acordo com DIN 44990.

Eguipamento e Condições de Lavagem Os testes de lavagem foram realizados em uma lavadora de lou- ças automática (Miele: G690SC) equipada com pratos e chapas de aço ino- xidável sujas, conforme descrito acima. Uma quantidade definida de deter- gente foi utilizada, conforme indicado na tabela de resultados abaixo. As 5 temperaturas testadas foram 45°C, 55°C e 65°C. A dureza da água foi 9o ou 21° GH (dureza alemã) (374 ppm de Ca).

Conforme indicado acima, após a lavagem, os pratos sujos com carne moída, chá, leite aquecido em forno de micro-ondas e flocos de aveia foram visualmente avaliados utilizando-se uma escala fotográfica de avalia- 10 ção de 0 a 10, em que “0” designava um prato completamente sujo e “10”, um prato limpo. Esses valores correspondem à capacidade de remoção de manchas ou sujeiras (SR) do detergente que contém enzimas.

Os pratos lavados de aço inoxidáveis sujos com gema de ovo e/ou gema de ovo e leite foram gravimetricamente analisados para determi- nar a quantidade de manchas residuais após a lavagem. A protease mutante PB92 e a protease PROPERASE® e outros mutantes foram testados em um nível entre 0 e 20,57 mg/proteína ativa por lavagem.

Os detergentes utilizados nesses experimentos são descritos abaixo. Esses detergentes foram obtidos na fonte sem que houvesse a pre- sença de enzimas, para permitir a análise das enzimas testadas nesses ex- perimentos.

Os resultados são mostrados nas Tabelas que seguem.

Tabela 1. Comparação de Detergentes que Não Contêm Fosfatos e que Contêm Fosfatos em Diferentes Concentrações Enzimáticas

Mancha pH

Sem fosfato + Com fosfatos Sem fosfato -» Enzimas 1x + Enzimas 1x Enzimas 3x

Gema de ovo (%SR) 10 35 ±0,3 48 ±0,1 52 ±1,8

Gema de ovo (%SR) 7 32 ± 1,2 32 ± 0,4 49 ± 2,0

Gema de ovo/Leite (%SR)

53 ±2,0 69 ±0,3 75 ±1,3 Tabela 1. Comparação de Detergentes que Não Contêm Fosfatos e que Contêm Fosfatos em Diferentes Concentrações Enzimáticas

^de0v07leite 7 46 ±2,0 42 ±2,9 62 ± 0,6

Carne Moída (SR) 10 5,5 ±1,5 7,7 ±1,5 8,0 ±0,5

Carne Moída (SR) 7 4,0 ± 1,0 5,8 ± 0,5 8,0 ± 0,5

Tabela 2. Comparação de Detergentes que Não Contêm Fosfato e que Contêm Fosfatos em Diferentes Concentrações Enzimáticas

Sem fosfatos Com fosfatos Sem fosfatos

Mancha pH

+ Enzimaslx +Enzimaslx + Enzimas 3x

Leite (SR) 10 3,6 ±0,5 4,6 ±0,5 4,0 ±0,5 Leite (SR) 7 3,0 ± 1,0 3,0 ± 1,0 3,0 ±1,0 Flocos de aveia (SR) 10 3,8 ±0,6 5,0 ±0,8 4,0 ±0,8 Flocos de aveia (SR) 7 2,0 ±0,2 5,5 ±0,5 4,0 ±0,8 Chá (SR) 10 4,0 ±0,0 5,0 ± 1,0 4,0 ± 1,0 Chá (SR) 7 3,5 ±0,0 2,0 ±0,5 2,5 ±1,0 Tabela 3. Comparação de Detergentes que Não Contêm fosfatos e que Contêm Fosfatos Sem Enzimas

Mancha PH Sem fosfatos Com fosfatos Leite (SR) 10 2,0 ±0,5 3,0 ±0,0 Leite (SR) 7 1,0 ±1,0 2,5 ±0,0 Flocos de aveia (SR) 10 4,0 ±0,5 4,5 ±0,5 Flocos de aveia (SR) 7 3,5 ±0,5 3,5 ± 1,0 Chá (SR) 10 4,0 ±0,0 6,0 ±0,5 Chá (SR) 7 3,5 ±0,5 2,0 ±0,0 Gema de ovo (%SR) 10 9,6 ±0,4 8,9 ±0,1 Tabela 3. Comparação de Detergentes que Não Contêm fosfatos e que

Contêm Fosfatos Sem Enzimas Gema de ovo (%SR) 7 12,3 ±0,8 11,0 ±0,6 Gema de ovo/Leite (%SR) 10 13,3 ±0,5 12,7 ± 1,0 Gema de ovo/Leite (%SR) 7 15,4 ± 1,9 12,3 ±1,5 Carne móida (SR) 10 1,5 ±0,0 1,0 ±0,0 Carne móida (SR) 7 1,0 ±0,0 2,0 ±0,0 Conforme indicado pelos resultados das Tabelas acima, deter- gentes não contendo fosfatos se saíram pior do que detergentes contendo fosfatos, particularmente em um pH igual a 10,0. Esses resultados se rela- cionam a sujeiras sensíveis às enzimas, bem como a sujeiras sensíveis aos 5 alvejantes. O resultado também indica que a adição de enzimas adicionais (em outras palavras, 3 x 0,13% de proteína ativa) aos detergentes que con- têm fosfatos, o desempenho é aperfeiçoado em níveis similares àqueles dos detergentes que contém fosfatos.

Esses resultados indicam que o desempenho de detergentes que não contêm fosfatos pode ser melhorado pela adição de 2 a 3x de enzi- mas.

Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório des- critivo são indicativas de o nível dos técnicos no assunto à qual essa inven- ção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas a título 15 de referência até à extensão como se cada publicação individual fosse es- pecífica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referên- cia.

Tendo-se descrito as modalidades preferidas da presente inven- ção, ficara claro para os técnicos no assunto que várias modificações pode- rão ser feitas às modalidades descritas, e o objetivo aqui é que tais modifica- ções se enquadrem no escopo da presente invenção.

Os técnicos no assunto prontamente apreciarão o fato de que a presente invenção está bem adaptada para realizar os objetos e obter os fins e vantagens mencionadas, bem como as inerentes a tais. As composições e métodos aqui descritos são representativos de modalidades preferidas, são exemplares e não têm por objetivo limitar o escopo da invenção. É pronta- mente aparente para um técnico no assunto que várias substituições e modi- ficações podem ser feitas na invenção aqui descrita sem que se saia do es- 5 pírito e escopo da invenção.

A invenção ilustrativamente representada aqui pode ser adequa- damente praticada na ausência de um ou mais elementos, uma ou mais limi- tações que não são especificamente reveladas aqui. Os termos e expres- sões empregados foram utilizados como termos de descrição e não de Iimi- 10 tação, e não se pretende a exclusão de quaisquer equivalentes das caracte- rísticas mostradas e descritas ou porções dessas pelo uso de tais termos e expressões, mas reconhece-se que várias modificações são possíveis den- tro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que em- bora a presente invenção tenha especificamente descrito modalidades prefe- 15 ridas e características opcionais, um técnico no assunto pode recorrer a mo- dificações e variações dos conceitos aqui revelados, e que se considera que tais modificações e variações estão dentro do escopo dessa invenção, con- forme definido nas reivindicações em anexo.

A invenção foi descrita aqui de forma ampla e genérica. Quais- 20 quer das espécies mais restritas e grupos subgenéricos que se enquadram na descrição genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descri- ção genérica da invenção com uma ressalva ou limitação negativa removen- do qualquer matéria do gênero, independente de se o material excisado é especificamente mencionado aqui ou não.

Claims

1. Detergente para lavar louças que não contém fosfatos, em que o dito detergente compreende pelo menos uma protease, em que a dita protease é uma protease com uma desempenho específico duas vezes mai- or que à da enzima de protease PROPERASE®, e em que o dito detergente fornece um pH para solução de limpeza entre cerca de 7 e cerca de 10,5.

2. Detergente para lavar louças que não contém fosfatos, de a- cordo com a reivindicação 1, em que tal protease é uma subtilisina protease

3. Detergente para lavar louças que não contém fosfatos, de a- cordo com a reivindicação 1, em que a dita protease compreende pelo me- nos cerca de 0,02% do dito detergente.

4. Detergente para lavar louças que não contém fosfatos, de a- cordo com a reivindicação 1, em que o dito detergente também compreende agentes alvejantes ou ativadores de alvejamento.

5. Detergente para lavar louças que não contém fosfatos, de a- cordo com a reivindicação 1, em que o dito detergente também compreende pelo menos uma enzima selecionada de proteases, carboidrases, oxidorre- dutases, lipases, pectinases, mananases, amilases, hemicelulases, estera- ses, transferases e perhidrolases.