ES2338319T3 - Proteinas mutantes con menor respuesta alergenica en seres humanos para construir, identificar y producir dichas proteinas. - Google Patents
Proteinas mutantes con menor respuesta alergenica en seres humanos para construir, identificar y producir dichas proteinas. Download PDFInfo
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Abstract
Una variante de la proteasa subtilisina que comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Description
Proteínas mutantes con menor respuesta
alergénica en seres humanos para construir, identificar y producir
dichas proteínas.
La presente invención se refiere a proteínas que
producen una respuesta alergénica menor en seres humanos expuestos
a tales proteínas, y a una prueba predictiva de tal respuesta. Más
específicamente, la presente invención se refiere a un nuevo
mutante de proteína mejorado que produce respuestas alergénicas muy
bajas en seres humanos sensibilizados a esa proteína mediante
exposición, si se compara con el precursor de tal mutante de
proteína.
Cada vez predomina más la utilización de
proteínas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales.
Como resultado, la mayor exposición debida a esta predominancia ha
sido responsable de algunos riesgos relacionados con la seguridad
causados por la sensibilización de ciertas personas a esos péptidos,
con lo que la exposición subsiguiente causa reacciones alérgicas
extremas que pueden ser perjudiciales e incluso fatales. Por
ejemplo, se sabe que las proteasas causan una hipersensibilidad
peligrosa en algunos individuos. Como resultado, a pesar de la
utilidad de las proteasas en la industria, e.g. en detergentes para
ropa, cosméticos, tratamientos textiles, etc..., y la numerosas
investigaciones llevadas a cabo en el campo para proporcionar
proteasas mejoradas que tengan, por ejemplo, una eliminación más
eficaz de manchas bajo condiciones de detergencia, el uso de
proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad
para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos
humanos.
Se ha realizado mucho trabajo para paliar estos
problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el
potencial inmunogénico del uso de proteasas están los procedimientos
de producción mejorada que reducen el contacto potencial,
controlando y minimizando las concentraciones en el lugar de trabajo
de partículas de polvo o aerosol que llevan proteasas transportadas
por el aire, los procedimientos de granulación mejorados que
reducen la cantidad de polvo o aerosol producido en realidad a
partir del producto proteasa, y los procedimientos de recuperación
mejorados para reducir el nivel de contaminantes potencialmente
alergénicos en el producto final. Sin embargo, los esfuerzos para
reducir la alergenicidad de la proteasa, per se, han sido
relativamente poco fructíferos. Alternativamente, se han realizado
esfuerzos para ocultar epítopos en proteasas que se reconocen
mediante inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles
(Publicación PCT Nº WO 92/10755) o para aumentar o cambiar la
naturaleza de los determinantes antígenos mediante la unión de
polímeros o péptidos/proteínas a la proteasa problemática.
Cuando ocurre una respuesta inmune adaptada en
forma exagerada o inapropiada, el individuo experimenta una
reacción denominada hipersensible. Las reacciones hipersensibles son
consecuencia de respuestas normalmente beneficiosas actuando
inapropiadamente y algunas veces causan reacciones inflamatorias y
daño de tejido. Estas pueden ser provocadas mediante muchos
antígenos; y la causa de la reacción hipersensible variará de un
individuo a otro. La hipersensibilidad en sí misma normalmente no
se manifiesta después del primer contacto con el antígeno, sino que
normalmente aparece después de contactos sucesivos. Una forma de
sensibilidad ocurre cuando una respuesta a IgE está dirigida contra
antígenos medioambientalmente inocuos, tales como polen, ácaros o
caspa animal. La producción resultante de mediadores farmacológicos
por parte de las células mástil sensibilizadas con IgE produce una
reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como el asma o la
rinitis.
De todas formas, una estrategia que comprenda
modificar los sitios de la IgE generalmente no será satisfactoria
para prevenir la causa de la reacción de sensibilización inicial. En
consecuencia, tales estrategias, aunque quizás neutralicen o
reduzcan la severidad de la reacción hipersensible subsiguiente no
reducirá el número de personas que en realidad están
sensibilizadas. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es
hipersensible a cierto antígeno, la manera general y únicamente
segura para tratar esta situación es aislar la persona hipersensible
del antígeno lo más completamente posible. Ciertamente, cualquier
otra acción podría ser peligrosa para la salud del individuo
hipersensible. Así, mientras que es importante reducir el peligro de
una proteína específica para un individuo hipersensible, para los
propósitos industriales sería de mucho más valor convertir una
proteína en incapaz de iniciar la reacción hipersensible
inicial.
Los linfocitos T (células T) son claves en la
inducción y regulación de las respuestas inmunes y en la ejecución
de las funciones efectoras inmunológicas. Se sabe que la inmunidad
específica contra agentes infecciosos y tumores depende de esas
células y se cree que contribuyen a la curación de heridas. Por otra
parte, un fallo en el control de estas respuestas puede conducir a
autoagresión. En general, el antígeno se presenta a las células T
en forma de células que presentan antígeno que, a través de una
variedad de mecanismos de superficie celular, capturan y exponen el
antígeno o antígeno parcial de manera adecuada para el
reconocimiento del antígeno por las células T. Después que los
receptores sobre la superficie de las células T (receptores de
células T) reconozcan un epítopo específico las células T comienzan
una serie de interacciones complejas, que incluyen la
proliferación, que dan como resultado la producción de anticuerpos
por parte de las células B. Mientras que las células T y las
células B son ambas activadas por epítopos antigénicos que existen
sobre una proteína o péptido dado, en realidad los epítopos
reconocidos por estas células mononucleares generalmente no son
idénticos. De hecho, el epítopo que activa una célula T para
iniciar la creación de diversidad inmunológica, frecuentemente no
es el mismo etítopo que es reconocido después por las células B en
el curso de la respuesta inmunológica. Así, con respecto a la
hipersensibilidad, mientras que la interacción antigénica específica
entre la célula T y el antígeno es un elemento crítico en el inicio
de la respuesta inmune a una exposición antigénica, las
especificidades de esa interacción, i.e., el epítopo reconocido,
normalmente no es relevante para el desarrollo subsiguiente de una
reacción alérgica auténtica.
La publicación PCT Nº WO 96/40791 describe un
procedimiento para producir conjugados
polioxialquileno-polipéptido con una alergenicidad
reducida, utilizando óxido de polioxialquileno como material de
partida.
La publicación PCT Nº WO 97/30148 describe un
conjugado polipéptido con alergenicidad reducida que comprende una
molécula que transporta el polímero que tiene dos o más moléculas de
polipéptido acopladas a ella.
La publicación PCT Nº WO 96/17929 describe un
procedimiento para producir polipéptidos con alergenicidad reducida
que comprende la etapa de conjugación de 1 a 30 polimoléculas al
polipéptido padre.
La patente Nº WO 92/10755 describe un método
para producir variantes de proteína que provocan una respuesta
inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, se utilizaron
las proteínas de interés, una serie de proteasas variantes de
ellas, para inmunizar ratas. Entonces, el suero de las ratas se
utilizó para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales
producidos y presentes en el suero inmunizado frente a la proteína
de interés o sus variantes. A partir de estos resultados, fue
posible determinar si los anticuerpos en la preparación eran
comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus
variantes, permitiendo así un análisis de qué cambios en la
proteína tienen más posibilidad de neutralizar o reducir la
capacidad de unir Ig. A partir de estas pruebas sobre ratas, se
llegó a la conclusión que cambiando cualquiera de los 309 restos de
subtilisina correspondientes a las posiciones 127, 128, 129, 130,
131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169,
170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197,
247, 251, 261 dará como resultado un cambio en el potencial
inmunológico.
La publicación PCT Nº WO 94/10191 describe
proteínas poco alergénicas que comprenden formas oligoméricas de
las proteínas monoméricas padre, en donde el oligómero
sustancialmente ha retenido su actividad.
La técnica anterior ha proporcionado métodos
para reducir la alergenicidad de ciertas proteínas y la
identificación de epítopos que causan reacciones alérgicas en
algunos individuos, donde los ensayos utilizados para identificar
estos epítopos generalmente implican la medida de anticuerpos IgE y
IgG en el suero sanguíneo expuesto al antígeno. De todas formas,
una vez se ha iniciado una reacción Ig, la sensibilización ya ha
ocurrido. En consecuencia, existe una necesidad de un método para
determinar epítopos que causan sensibilización en un primer lugar,
ya que la neutralización de estos epítopos dará como resultado una
posibilidad significativamente menor de que pueda ocurrir la
sensibilización, reduciendo así las posibilidades de sensibilización
inicial.
Uno de los objetivos de la invención es
proporcionar una proteína que tenga un potencial reducido para
causar una respuesta alergénica en seres humanos, en comparación
con una proteína precursora.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una variante de proteasa que tenga una actividad
útil en aplicaciones de proteasas comunes, tales como detergentes y
o el tratamiento de lana para prevenir el apelmazamiento, en
aplicaciones como jabones líquidos o en pastilla, formulaciones para
el cuidado de la vajilla, soluciones o productos para limpieza de
lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de aguas
residuales, aplicaciones textiles tales como
anti-apelmazante, en formulaciones cosméticas y para
el cuidado de la piel, o como enzimas de
fusión-ruptura en la producción de proteínas, donde
dicha variante de proteasa puede ser utilizada de manera más segura
debido a su potencial alergénico disminuido.
La invención proporciona una variante de la
proteasa subtilisina, que comprende al menos una sustitución
aminoacídica en una posición en el seno de una proteasa subtilisina
precursora correspondiente a los restos 170 y/o 173 en BPN', en
donde tales sustituciones comprenden reemplazar el resto 170 por
ácido aspártico y/o reemplazar el resto 173 por ácido aspártico. En
una realización muy preferida, la sustitución comprende reemplazar
los restos 170, 171 y 173 por ácido aspártico, glutamina y ácido
aspártico, respectivamente.
Un método para producir la proteína de la
invención puede implicar la modificación de un ADN que codifica una
proteína precursora de tal manera que el ADN modificado codifique la
proteína mutante de la invención.
En otra realización adicional de la invención,
se proporcionan las secuencias de ADN que codifican la proteína
mutante, así como los vectores de expresión que contienen tales
secuencias de ADN y las células hospedantes transformadas con tales
vectores, donde dichas células hospedantes son, preferiblemente,
capaces de expresar dicho ADN para producir la proteína mutante de
la invención, ya sea intracelular o extracelularmente.
La proteína mutante de la invención es útil en
cualquier composición o procedimiento en los que se sabe
generalmente que la proteína precursora es útil. Por ejemplo, la
proteasa subtilisina con alergenicidad reducida puede emplearse
como componente en productos de limpieza tales como detergentes para
la ropa y productos de limpieza para superficies duras, como ayuda
en la preparación del cuero, en el tratamiento de textiles tales
como la lana y/o la seda para reducir el apelmazamiento, como
componente en productos para el cuidado personal, producto
cosmético o crema facial, y como componente en piensos para animales
domésticos para mejorar el valor nutritivo del pienso. De manera
similar, cuando la proteína es una amilasa, la amilasa de
alergenicidad reducida se puede emplear en la licuefacción del
almidón, como componente en un detergente de lavavajillas, para
suavizar textiles, en un detergente para la ropa o cualquier otro
uso para el cual una amilasa es útil.
Una ventaja de la presente invención es que
mediante la medida de la proliferación de células T como
consecuencia del reconocimiento del epítopo de célula T, es posible
identificar péptidos que contienen epítopos responsables de la
sensibilización inicial de un individuo. Es decir, la proliferación
de células T como consecuencia del reconocimiento del epítopo de la
célula T da lugar a la sensibilización de un individuo a este
péptido o a una proteína que lo contiene. La neutralización de
tales epítopos de células T "sensibilizadores" dará
inevitablemente como resultado un mayor grado de seguridad para los
que manipulan o que son expuestos de otra manera al antígeno que
contiene el epítopo porque no serán sensibilizados inicialmente,
impidiendo de esta manera la producción de los típicos anticuerpos
Ig de una reacción alérgica después de una exposición ulterior al
antígeno.
Una ventaja de la presente invención es la
preparación de proteínas, incluyendo enzimas, que pueden emplearse
con apreciablemente menos peligro de sensibilización para los
individuos expuestos. Así, por ejemplo, las proteínas de la
invención pueden emplearse de manera más segura en cosméticos tales
como cremas faciales, detergentes como detergentes para la ropa,
composiciones limpiadoras de superficies duras y composiciones
prelavado para la limpieza de superficies duras o cualquier otro uso
de la proteína, incluyendo enzimas, en el cual la exposición humana
es una consecuencia secundaria necesaria.
Figs. 1A, B1, B2 y B3 ilustran la secuencia de
ADN (SEQ ID:NO 1) y aminoácidos (SEQ ID: NO 2) de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y un mapa parcialmente
restringido de este gen.
Fig. 2 ilustra los restos de aminoácido que se
conservan en subtilisinas procedentes de Bacillus
amyloliquefaciens (SEQ ID: NO 3) y Bacillus lentus (tipo
nativa) (SEQ ID: NO 4).
Figs. 3A y 3B ilustran un alineamiento de
secuencia de aminoácidos de subtilisina de tipo proteasas
procedentes de Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (SEQ ID: NO 5) y
Bacillus lentus. El símbolo * indica la ausencia de un resto
de aminoácido específico comparado con subtilisina BPN'.
La Fig. 4 ilustra la respuesta aditiva de
células T de 16 muestras de sangre mononuclear periféricas a
péptidos que corresponden con una proteasa Bacillus lentus.
El péptido E05 incluye la región que comprende restos
correspondientes a 170-173 en proteasa procedente de
Bacillus amyloliquefaciens.
Fig. 5 ilustra la respuesta aditiva de células T
de 10 muestras de sangre mononuclear periféricas a péptidos
correspondientes a la molécula de subtilisina humana. Los péptidos
F10, F9, F8 y F7 todos contienen la secuencia de aminoácidos DQMD
que corresponde a la región que comprende restos correspondientes a
170-173 en proteasa procedente de Bacillus
amyloliquefaciens en el alineamiento de secuencia de la Fig.
3.
Fig. 6A y 6B/6C ilustra cadenas de aminoácidos
correspondientes a péptidos derivados de la secuencia de proteasa
procedente de Bacillus lentus y una subtilisina humana,
respectivamente.
Fig. 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de
subtilisina humana (SEQ ID: NO 6).
Fig. 8 ilustra un alineamiento de secuencia de
aminoácidos de proteasa BPN' (Bacillus amyloliquefaciens),
proteasa SAVINASE (Bacillus lentus) y subtilisina humana
(S2HSBT).
Fig. 9 ilustra la respuesta de células T a
péptidos derivados de proteasa procedente de Bacillus lentus
en una muestra cogida de un individuo que se sabe es hipersensible a
la proteasa procedente de Bacillus lentus. El péptido E05
representa la región correspondiente a 170-173 en
proteasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens.
Fig. 10 ilustra la respuesta de células T a
varias sustituciones de alanina en el péptido E05 de la proteasa
procedente de Bacillus lentus en una muestra cogida de un
individuo que se sabe es hipersensible a proteasa procedente de
Bacillus lentus.
Se describe un método para identificar epítopos
de células T. El método identifica epítopos de la siguiente manera:
se combinan células dendríticas diferenciadas con células T
indiferenciadas humanas CD4+ y/o CD8+ y con un péptido de interés.
Más específicamente, un epítopo de célula T es reconocido mediante:
(a) obtención de una solución de células monocíticas y una solución
de células T indiferenciadas CD4+ y/o CD8+ a partir de una sola
fuente de sangre; (b) diferenciación promovida en la mencionada
solución de las células monocíticas dando células dendríticas; (c)
combinación de la mencionada solución de células dendríticas y
células T indiferenciadas CD4+ y/o CD8+ con un péptido de interés;
(d) medida de la proliferación de células T en la mencionada etapa
(c).
El péptido que interesa analizar se deriva de
una proteína o enzima para la cual se desea o requiere una
alergenicidad reducida. Usando este método, es posible identificar
con precisión la localización de un epítopo que puede causar
sensibilización en un individuo o muestra de individuos. En una
versión particularmente efectiva del método de la invención, se
preparan una serie de oligómeros peptídicos que corresponden a toda
o una parte de la proteína o enzima. Por ejemplo, se produce una
librería de péptidos que cubre una porción relevante o toda la
proteína. Una manera particularmente útil de producir los péptidos
es introducir un solapamiento en la librería de péptidos, por
ejemplo, producir un primer péptido que corresponde a una secuencia
de los aminoácidos 1-10 de la proteína objetivo, un
segundo péptido que corresponde a la secuencia de los aminoácidos
4-14 de la proteína objetivo, un tercer péptido que
corresponde a la secuencia de los aminoácidos 7-17
de la proteína objetivo, un cuarto péptido que corresponde a la
secuencia de los aminoácidos 10-20 de la proteína
objetivo, etc... hasta crear péptidos representativos que
corresponden a toda la molécula. Analizando cada uno de los
péptidos individuales en la prueba que se proporciona aquí, es
posible identificar de manera precisa la localización de los
epítopos reconocidos por las células T. En el ejemplo anterior, la
reacción de un péptido específico en mayor medida que lo hagan sus
vecinos facilitará la localización de la región anclaje del epítopo
con una precisión de tres aminoácidos. Después de determinar la
localización de estos epítopos, es posible alterar los aminoácidos
dentro de cada epítopo hasta que el péptido produzca una respuesta
frente a células T menos significativa.
"Célula que presenta antígeno" como se
emplea aquí significa una célula del sistema inmunitario que
presenta antígeno en su superficie que es reconocible por
receptores en la superficie de células T. Ejemplos de células que
presentan antígeno son las células dendríticas, células
interdigitadas, células B activadas y macrófagos.
"Proliferación de célula T" como se emplea
aquí significa la cantidad de células T producidas durante la
incubación de células T con las células que presentan antígeno, con
o sin antígeno.
"Línea base de proliferación de células T"
como se emplea aquí significa la proliferación de células T que se
observa normalmente en un individuo en respuesta a su exposición a
células que presentan antígeno en ausencia de un antígeno peptídico
o proteínico. Para los presentes propósitos, el nivel de
proliferación de células T línea base se determinó, sobre la base
de una muestra por cada individuo, como la proliferación de células
T en respuesta a células que presentan antígeno en ausencia de
antígeno.
"Epítopo de célula T" significa una
secuencia de un péptido o una proteína que es reconocida por un
receptor de célula T durante la iniciación de la respuesta
inmunológica al péptido que comprende este antígeno. En general se
cree que el reconocimiento de un epítopo de célula T por una célula
T ocurre mediante un mecanismo en el cual la células T reconocen
fragmentos de péptido de antígenos que están unidos a moléculas de
mayor histocompatibilidad (MHC) de clase I o de clase II expresados
en células que presentan antígeno (ver e.g., Moeller, G. Ed.,
Antigenic Requirements for Activation of
MHC-Restricted Responses, Immunological
Review, Vol. 98, p. 187 (copenhagen; Munksgaard)(1987).
Entonces, se modifican los epítopos determinados
según la prueba proporcionada aquí para reducir el potencial
alergénico de la proteína de interés. Preferiblemente, el epítopo a
modificar produce un nivel de proliferación de células T tres veces
superior que la proliferación de célula T línea base en una muestra.
Cuando se modifica, el epítopo produce menos de tres veces la
proliferación de línea base, preferiblemente menos de dos veces la
proliferación de línea base y más preferiblemente menos o
sensiblemente lo mismo que la proliferación de línea base en una
muestra.
Preferiblemente, el epítopo se modifica de una
de las siguientes maneras: (a) se sustituye la secuencia de
aminoácidos del epítopo por una secuencia análoga de un homólogo
humano de la proteína de interés; (b) se sustituye la secuencia de
aminoácidos del epítopo por un secuencia análoga de un homólogo no
humano de la proteína de interés, cuya secuencia análoga produce
una menor respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo
de células T que la proteína de interés; (c) se sustituye la
secuencia de aminoácidos del epítopo por una secuencia que imita de
manera sustancial las características más importantes de la
estructura terciaria del epítopo, pero que produce una menor
respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células
T que la proteína de interés; o (d) por cualquier secuencia que
produzca una respuesta alergénica debida al reconocimiento del
epítopo de células T menor que la proteína de interés.
"Muestra" como se emplea aquí comprende
células mononucleares que no han sido estimuladas, i.e., no están
sensibilizadas al antígeno en cuestión.
"Homólogo" como se emplea aquí significa
una proteína o enzima que tiene una acción catalítica, estructura
y/o uso similar al de la proteína de interés. Es deseable encontrar
un homólogo que tenga una estructura terciaria y/o primaria similar
a la de la proteína de interés ya que la sustitución del epítopo de
la proteína de interés por un segmento análogo en el homólogo
reducirá el efecto perturbador del cambio. De este modo, enzimas
estrechamente idénticas proporcionarán la fuente más deseable de
sustituciones de epítopo. Alternativamente, si es posible, es
ventajoso buscar análogos humanos para una proteína dada. Por
ejemplo, la sustitución de un epítopo específico en un subtilisina
de origen bacteriano por una secuencia de un análogo humano de
subtilisina (i.e., subtilisina humana) debería dar como resultado
una menor alergenicidad en la proteína bacteriana.
Se puede determinar una secuencia "análoga"
asegurándose que la sustitución de los aminoácidos muestra una
función similar, y estructura terciaria de los restos conservados de
aminoácidos en la proteína de interés en o cerca del epítopo. Así,
donde la región epítopa contiene, por ejemplo, una estructura de
alfa-hélice o una lámina-beta, los
aminoácidos sustituidos deberían mantener esta estructura
específica.
Las proteasas son hidrolasas de carbonilo que
generalmente actúan rompiendo enlaces peptídicos de proteínas o
péptidos. Como se emplea aquí, "proteasa" significa una
proteasa de origen natural o una proteasa recombinante. Las
proteasas de origen natural incluyen
\alpha-aminoacilpéptido hidrolasa,
peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serin
carbopeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa,
carboxilproteinasa y metaloproteinasa.
Las subtilisinas son proteasas bacterianas o
fúngicas que generalmente actúan rompiendo enlaces peptídicos de
proteínas o péptidos. Como se utiliza aquí, "subtilisina"
significa una subtilisina de origen natural o una subtilisina
recombinante. Se sabe fabricar una serie de subtilisinas de origen
natural, a menudo secretadas por varias especies microbianas. Las
secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son
completamente idénticos. Sin embargo, las subtilisinas en esta
serie presentan el mismo tipo de actividad proteolítica o similar.
Esta clase de proteasas de serina comparten una secuencia de
aminoácidos común que define una tríada catalítica que las
distingue de las quimotripsinas, una clase de proteasas de serina
relacionadas. Tanto las subtilisinas como las quimotripsinas,
proteasas de serina relacionadas, tienen una tríada catalítica que
comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas
relacionadas con subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos,
leyendo desde el grupo amino al carboxilo terminal es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con quimotripsina el orden relativo, sin
embargo, es
histidina-aspartato-serina. Así,
subtilisina aquí se refiere a una proteasa de serina que tiene la
tríada catalítica de proteasas relacionadas con subtilisina. Los
ejemplos incluyen pero no se limitan a las subtilisinas
identificadas en la Fig. 3 de aquí. Generalmente, y para los
propósitos de la presente invención, la numeración de los
aminoácidos en proteasas corresponde a los números asignados a la
secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura
presentada en la Fig. 1.
"Subtilisina recombinante" o "proteasa
recombinante" se refieren a una subtilisina o proteasa en la que
la secuencia de ADN que codifica la subtilisina o proteasa se
modifica para producir una secuencia de ADN diferente (o mutante)
que codifica la sustitución, supresión o inserción de uno o más
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de origen natural. Los
métodos descritos en la patente US 4.760.025, patente US 5.204.015 y
patente US 5.185.258 son adecuados para producir tal modificación,
y pueden ser combinados con los descritos aquí.
Las "subtilisinas no humanas" y el ADN que
las codifica puede obtenerse a partir de diferentes organismos
procarióticos y eucarióticos. Ejemplos adecuados de organismos
procarióticos incluyen organismos gram negativo tales como E.
Coli o Pseudomonas y bacterias gram positivo tales como
Micrococcus o Bacillus. Ejemplos de organismos
eucarióticos a partir de los cuales pueden obtenerse subtilisina y
sus genes incluyen levaduras tales como Saccharomyces
cerevisiae, y hongos tales como Aspergillus sp.
"Subtilisina humana" significa proteínas de
origen humano que tienen una actividad catalítica de tipo
subtilisina, e.g., la familia de las kexinas de proteasas humanas.
En la Fig. 7 está representada la secuencia de un ejemplo de tal
proteína. Adicionalmente, para el propósito de esta invención se
consideran subtilisinas humanas derivados u homólogos de
subtilisina humana, que incluyen los de fuentes no humanas tales
como ratón o conejo, que retienen la capacidad esencial para
hidrolizar enlaces peptídicos y tienen al menos 50%, preferiblemente
al menos 65% y más preferiblemente al menos 80% de identidad con la
proteína de la Fig. 7.
Una "variante de proteasa" tienen una
secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de
una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen
proteasas de origen natural y proteasas recombinantes. La secuencia
de aminoácidos de la variante de proteasa "deriva" de la
secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora mediante la
sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la
"secuencia del ADN precursor" que codifica la secuencia de
aminoácidos del la proteasa precursora más que la manipulación de
la enzima proteasa precursora per se. Los métodos adecuados
para tal manipulación de la secuencia del ADN precursor incluyen los
métodos descritos aquí, así como los métodos conocidos por los
expertos en la técnica (ver, por ejemplo, EP 0 328299, WO89/06279 y
las patentes y solicitudes a las que hacen referencia).
Los números de posición de los aminoácidos
utilizados aquí se refieren a los asignados a la secuencia de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada
en la Fig. 1. La invención, sin embargo, no se limina a la mutación
de esta subtilisina en particular, sino que abarca a proteasas
precursoras que contienen restos de aminoácidos en las posiciones
que son "equivalentes" a los restos identificados en particular
en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. En una
realización preferida de la presente invención, la proteasa
precursora es subtilisina de Bacillus lentus y se han hecho
sustituciones, eliminaciones o inserciones en los restos de
aminoácidos equivalentes en B. lentus correspondientes a las
listadas anteriormente.
Un resto (aminoácido) de una proteasa precursora
es equivalente a un resto de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens si es, bien homólogo (i.e., correspondiente
en posición bien en estructura primaria o terciaria) o análogo a un
resto específico o porción de este resto en subtilisina de
Bacillus amuloliquefaciens (i.e., que tiene la misma
capacidad funcional o similar para combinar, reaccionar o
interaccionar químicamente).
Con objeto de establecer la homología en la
estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteína
precursora se compara directamente con la secuencia primaria de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente
a un conjunto de restos que se sabe no varían en subtilisinas, y
para los que se conoce la secuencia. Por ejemplo, la Fig. 2 muestra
los restos conservados entre subtilisina de B.
amyloliquefaciens y subtilisina de B. lentus. Después de
alinear los restos conservados, permitiendo las inserciones o
eliminaciones necesarias para mantener el alineamiento (i.e.,
evitando la eliminación de los restos conservados mediante
eliminación e inserción al azar), se definen los restos equivalentes
de aminoácidos particulares en la secuencia primaria de subtilisina
de Bacillus amyloliquefaciens. El alineamiento de los restos
conservados preferiblemente debería conservar el 100% de tales
restos. Sin embargo, también es adecuado para definir restos
equivalentes el alineamiento de más del 75% o como poco 50% de los
restos conservados. Debería mantenerse la conservación de la tríada
catalítica, Asp32/His64/Ser221.
Por ejemplo, puede alinearse la secuencia de
aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y
Bacillus lentus para proporcionar la máxima cantidad de
homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de
las secuencias indica que hay un número de restos conservados
contenidos en cada secuencia. En la Fig. 2 están identificados los
restos conservados entre BPN' y B. lentus.
Así, estos restos conservados pueden utilizarse
para definir los correspondientes restos de aminoácidos equivalentes
de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras
subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus (PCT
Nº. WO89/06279 publicada el 13 Julio, 1989), la enzima precursora
proteasa preferida aquí, o la subtilisina denominada PB92 (EP 0 328
299), que es altamente idéntica de la subtilisina Bacillus
lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de ciertas de
estas subtilisinas están alineadas en las Figs. 3A y 3B para
producir la máxima homología de restos conservados con la secuencia
de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Como puede
verse, existen un número de eliminaciones en la secuencia de
Bacillus lentus comparada con subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente
Val165 en subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las
otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B.
licheniformis.
Así, por ejemplo, el aminoácido en posición +170
es lisina (K) tanto en subtilisinas de B. amyloliquefaciens
como de B. licheniformis, y arginina (R) en Sabinasa. Sin
embargo, en una realización de las variantes de la proteasa de la
invención, el aminoácido equivalente del +170 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens está sustituido por ácido
aspártico (D). Las abreviaciones y los códigos de una letra para
todos los aminoácidos en la presente invención están conforme the
Patentin User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, p.101.
"Restos equivalentes" se pueden definir
también mediante la determinación de la homología a nivel de
estructura terciaria de una proteasa precursora cuya estructura
terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los
restos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las
coordenadas atómicas de dos o más átomos de la cadena principal de
un resto aminoácido particular de la proteasa precursora y de la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA
sobre CA, C sobre C y O sobre O) están a 0,13 nm y preferiblemente
a 0,1 nm una de otra después de su alineamiento. El alineamiento se
consigue después que el mejor modelo se haya orientado y
posicionado para dar el máximo solapamiento de las coordenadas
atómicas de los átomos de la proteína que no son hidrógeno de la
proteasa en cuestión en relación con la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico
que da el factor R más bajo en los datos de difracción
experimentales a la mejor resolución disponible.
Los restos equivalentes que son funcionalmente
análogos de un resto específico de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se definen como los aminoácidos de la proteasa
precursora que pueden adoptar una conformación tal que altere,
modifique o contribuya a la estructura de la proteína, la unión con
el sustrato o la catálisis de la manera definida y atribuida a un
resto específico de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Además, están esos restos de la proteasa
precursora (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria
por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga
hasta el punto que, aunque los átomos de la cadena principal de un
resto dado puede no cumplir el criterio de equivalencia sobre la
base de ocupación de una posición homóloga, las coordenadas
atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del
resto se encuentran a 0,13 nm de los correspondientes átomos de la
cadena lateral de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
Las coordenadas de la estructura tridimensional de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens están expuestas en la publicación
EPO Nº. 0 251 446 (equivalente a la patente de EE.UU 5.182.204 cuya
descripción se incorpora aquí por referencia) y pueden utilizarse
como se ha mencionado anteriormente para determinar los restos
equivalentes a nivel de estructura terciaria.
Algunos de los restos identificados para
sustitución, inserción o eliminación son restos conservados mientras
otros no lo son. En el caso de los restos que no se conservan, la
sustitución de uno o más aminoácidos se limita a sustituciones que
producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no
corresponde a la encontrada en la naturaleza. En el caso de los
restos conservados, tales sustituciones no deberían dar como
resultado una secuencia que se encuentra en la naturaleza. Las
variantes de proteasa de la presente invención incluyen tanto las
formas maduras de las variantes de proteasa como las pro- y
preproformas de tales variantes de proteasa. Las
prepro-formas son la construcción preferida porque
facilita la expresión, secreción, y maduración de las variantes de
proteasa.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia
de aminoácidos unidos a la porción N-terminal de la
forma madura de una proteasa que cuando se elimina da lugar a la
aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas
proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos
proenzimas traslacionales y, en ausencia de un tratamiento
traslacional, se expresan de esta manera. Una prosecuencia
preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia
putativa de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque
se pueden emplear otras prosecuencias de proteasa.
Una "secuencia señal" o "prosecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unidos a la porción
N-terminal de una proteasa o a la porción
N-terminal de una proproteasa que puede participar
en la secreción de las forma madura o proforma de la proteasa.
Esta definición de secuencia señal es funcional, se supone incluye
todas esas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción
N-terminal del gen de la proteasa que participa en
la secreción de la proteasa bajo condiciones naturales. La presente
invención utiliza tales secuencias para efectuar la secreción de
las variantes de proteasa como se define aquí. Una secuencia señal
posible comprende los primeros siete restos de aminoácidos de la
secuencia señal de subtilisina de Bacillus subtilis
fusionada al resto de la secuencia señal de subtilisina de
Bacillus lentus (ATCC 21536).
Una "preproforma" de una variante de
proteasa consiste en la forma madura de la proteasa que tiene una
prosecuencia unida de manera operable al extremo amino de la
proteasa y una secuencia "pre" o "señal" unida de manera
operable al extremo amino de la prosecuencia.
El "vector de expresión" se refiere al
fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida de
manera operable a una secuencia control adecuada capaz de efectuar
la expresión del mencionado ADN en un anfitrión adecuado. Tales
secuencias control incluyen un promotor para efectuar la
trascripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal
trascripción, una secuencia que codifica sitios de mARN ribosómico
adecuados y secuencias que controlan la terminación de la
trascripción y la traslación. El vector puede ser un plásmido, una
partícula fago, o simplemente una inserción genómica potencial. Una
vez transformado en un anfitrión adecuado, el vector puede
replicarse y funcionar independientemente del genoma anfitrión, o
puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la
presente especificación, "plásmido" y "vector" son a veces
utilizados indistintamente, ya que actualmente el plásmido es la
forma usualmente más utilizada de vector. Sin embargo, la invención
pretende incluir estas otras formas de vectores de expresión que
sirven para funciones equivalentes y que son, o se convierten en,
conocidas en la técnica.
Las "células anfitrión" utilizadas en la
presente invención generalmente son anfitriones procarióticos o
eucarióticos que preferiblemente han sido manipulados mediante los
métodos descritos en la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) para
convertirlos en incapaces de segregar endoproteasa enzimáticamente
activa. Una célula anfitrión preferida para expresar proteasa es la
cadena Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra y
proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activa. La
construcción de la cadena BG2036 se describe en detalle en la
patente EE.UU. 5.264.366. Otras células anfitrión para expresar
proteasa incluyen Bacillus subtilis 1168 (también descrita
en la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y la patente EE.UU.
5.264.366, cuya descripción se incorpora aquí por referencia) así
como cualquier cadena de Bacillus tales como B.
licheniformis, B. lentus, etc.
Las células hospedantes transformadas o
transfectadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN
recombinante. Tales células hospedantes transformadas son capaces de
replicar vectores que codifican las variantes de proteasa o
expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que
codifican la pre- o preproforma de la variante de proteasa, tales
variantes, cuando se expresan, son segregadas típicamente por las
células hospedantes en el medio de células hospedantes.
"Unidas de manera operable", cuando se
describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente
significa que están relacionadas funcionalmente una a la otra. Por
ejemplo, un prosecuencia está unida operablemente a un péptido si
funciona como una secuencia señal, que participa en la secrección de
la forma madura de la proteína, lo más probablemente implicando una
rotura de la secuencia señal. Un promotor está unido operablemente
a la secuencia codificadora si controla la transcripción de la
secuencia; un centro de complejación ribosómico está unido
operablemente a una secuencia codificadora si se sitúa de tal manera
que permite la traslación.
Los genes que codifican la proteasa subtilisina
precursora natural pueden obtenerse de acuerdo con los métodos
generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos
normalmente comprenden sintetizar muestras marcadas que tienen
secuencias putativas que codifican regiones de la proteasa de
interés, preparar librerías genómicas a partir de microorganismos
que expresan la proteasa, y chequear las librerías para el gen de
interés mediante hibridación de la muestra.
La proteasa clonada se utiliza entonces para
transformar una célula hospedante con objeto de expresar la
proteasa. Entonces, el gen de proteasa se liga a un plásmido con un
gran número de copias. Este plásmido se replica en las hospedantes,
en el sentido de que contiene los elementos necesarios bien
conocidos para la replicación del plásmido: un promotor unido de
manera operativa al gen en cuestión (que puede ser suministrado como
el promotor homólogo del propio gen si es reconocido; i.e.,
transcrito, por la hospedante), una terminación de transcripción y
una región de poliadenilación (necesaria para estabilizar el ARNm
transcrito por la hospedante a partir del gen de la proteasa en
ciertas células hospedantes eucarióticas) que es exógeno o es
suministrado mediante la región del gen de la proteasa del
terminador endógeno y, deseablemente, una selección de genes tales
como un gen resistente a los antibióticos que permite un
mantenimiento del cultivo continuo de células hospedantes
infectadas con plásmido mediante su crecimiento en medios que
contienen antibióticos. Los plásmidos con un gran número de copias
también contienen un origen de replicación para la hospedante, por
lo tanto permitiendo que un gran número de plásmidos puedan
generarse en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin
embargo, dentro del alcance de la presente está integrar copias
múltiples del gen de la proteasa en el genoma anfitrión. Esto se
facilita mediante organismos procarióticos y eucarióticos que son
particularmente susceptibles a la recombinación homóloga.
En una realización, el gen puede se un gen
natural tal como el procedente de B. lentus o B.
amyloliquefaciens. Alternativamente, puede fabricarse un gen
sintético que codifique una proteasa precursora natural o mutante.
En tal aproximación, se determina la secuencia del ADN y/o
aminoácidos de la proteasa precursora. Entonces, se sintetizan
múltiples fragmentos sintéticos de ADN de una sola hebra, que
solapan, los cuales después de hibridarse y ligarse producen un ADN
sintético que codifica la proteasa precursora. En el Ejemplo 3 de la
patente de EE.UU 5.204.015, cuya descripción se incorpora aquí por
referencia, se expone un ejemplo de construcción de gen
sintético.
Una vez que el gen de la proteasa precursora
natural o sintético se ha clonado, se realizan cierto número de
modificaciones para aumentar el uso del gen más allá de la síntesis
de la proteasa precursora natural. Tales modificaciones incluyen la
producción de proteasas recombinantes tal como se describe en la
patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y publicación EPO nº 0 251
446 y la fabricación de variantes de proteasas descritas allí.
El siguiente método de mutagénesis por inserción
de casete puede utilizarse para facilitar la construcción de
variantes de proteasa de la presente invención, aunque pueden
utilizarse otros métodos. En primer lugar, se obtiene el gen
natural que codifica la proteasa y se secuencia completamente o en
parte. Entonces, se escanea la secuencia para el punto en el que se
desea realizar una mutación (eliminación, inserción o sustitución)
de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las
secuencias que están al lado de este punto por si hubiera sitios de
restricción para reemplazar un segmento pequeño del gen por una
variedad de oligonucleótidos, los cuales cuando se expresen
codificarán las diferentes mutantes. Tales sitios de restricción son
preferiblemente sitios únicos en el gen de la proteasa que
facilitan la sustitución del segmento del gen. Sin embargo, puede
utilizarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea
demasiado redundante en el gen de la proteasa, teniendo en cuenta
que los fragmentos de gen generados mediante digestión por
restricción pueden reensamblarse con la secuencia adecuada. Si no
hay sitios de restricción en las localizaciones a una distancia
conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), se
generan tales sitios mediante nucleótidos de sustitución en el gen,
del tal manera que no se cambian ni el esqueleto lector ni los
aminoácidos codificados en la construcción final. Con objeto de
cambiar su secuencia para conformar la secuencia deseada, la
mutación del gen se lleva a cabo mediante extensión del M13 primer,
de acuerdo con métodos generalmente conocidos. La misión de
localizar regiones flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios
necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción
convenientes se hace de manera rutinaria mediante el estudio de la
redundancia del código genético, un mapa de la restricción del
enzima del gen y el gran número de enzimas de restricción
diferentes. Fíjense que si se dispone de un sitio de restricción
flanqueante conveniente, sólo es necesario utilizar el método
anterior en relación con la región flanqueante que no contiene un
sitio.
Una vez que se ha clonado el ADN natural o ADN
sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a
ser mutadas se digieren con las enzimas de restricción afines y una
pluralidad de casetes oligonucleotídicas con extremos
complementarios se ligan en el gen. La mutagénesis se simplifica con
este método ya que todos los oligonucleótidos pueden ser
sintetizados de modo que tengan los mismos sitios de restricción, y
no se necesita ningún enlazador sintético para crear los sitios de
restricción.
El objetivo es asegurar una proteasa subtilisina
variante que tenga el potencial alergénico alterado comparado con
el de la proteasa subtilisina precursora, ya que la disminución de
tal potencial permite un uso más seguro de la enzima. Si bien las
variantes de la proteasa subtilisina de la presente invención son
útiles para disminuir el potencial alergénico, las mutaciones que
se especifican aquí pueden utilizarse en combinación con mutaciones
conocidas en la técnica para dar como resultado estabilidades
térmicas alteradas y/o especificidades por el sustrato alteradas,
actividades modificadas o estabilidades alcalinas alteradas
comparadas con las de los precursores.
Por consiguiente, la presente invención va
dirigida a alterar la capacidad del epítopo de las células T que
incluye las posiciones de los restos 170-173 en
Bacillus lentus para inducir proliferación de células T. Una
realización particularmente preferida de la invención comprende
hacer las tres modificaciones R170D, Y171Q y N173D. De modo
similar, como se ha discutido detalladamente más arriba, se cree que
la modificación de los correspondientes restos en cualquier
proteasa dará como resultado la neutralización de un epítopo de
célula T fundamental en esa proteasa. Así, en combinación con las
mutaciones aquí descritas en la región que corresponde a los restos
aminoacídicos 170-173, se pueden usar sustituciones
en posiciones que corresponden a N76D/S103A/V104I/G159D
opcionalmente en combinación con una o más sustituciones
seleccionadas del grupo que consiste en posiciones que corresponden
a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, y T260A de la subtilisina de
Bacillus amylofolyquefaciens, además de disminuir el
potencial alergénico de la proteasa variante de la invención, para
modular la estabilidad global y/o la actividad proteolítica de la
enzima. De manera similar, las sustituciones proporcionadas aquí se
pueden combinar con la mutación en la Asparagina (N) en subtilisina
de Bacillus lentus en la posición equivalente +76 a Aspartato
(D) en combinación con las mutaciones S103A/V104I/G159D y
opcionalmente en combinación con una o más sustituciones
seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones
correspondientes a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para producir un
aumento de la estabilidad y/o un aumento de la actividad de la
enzima mutante resultante.
Las realizaciones más preferidas de la invención
incluyen las siguientes combinaciones específicas de restos
sustituidos correspondientes a las posiciones:
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R;
y
V68A/N76D//S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A
de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Estas
sustituciones se hacen preferiblemente en la subtilisina de
Bacillus lentus (recombinante o natural), aunque las
sustituciones también se pueden hacer en cualquier proteasa de
Bacillus.
Sobre la base de los resultados de escrutinio
obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones indicadas más
arriba en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son
importantes para la actividad proteolítica, la eficacia y/o la
estabilidad de estas enzimas y la limpieza o eficacia del lavado de
estas enzimas variantes.
Muchas de las variantes de proteasa de la
invención son útiles en la formulación de diversas composiciones
detergentes. Un gran número de compuestos conocidos son
tensioactivos adecuados, útiles en composiciones que comprende las
mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen detergentes no
iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwiteriónicos, tal como se
describe en la patente de EE.UU. 4.404.128 de Barry J. Anderson y la
patente de EE.UU. 4.261.868 de Jiri Flora, et al. Una
formulación detergente adecuada es la descrita en el Ejemplo 7 de
la patente de EE. UU. 5.204.015 (previamente incorporada por
referencia). La técnica es familiar con las diferentes
formulaciones que pueden utilizarse como composiciones limpiadoras.
Además de lo que tienen en común con las típicas composiciones
limpiadoras, se entiende fácilmente que las variantes de proteasa de
la presente invención pueden utilizarse para cualquier propósito
que utilice proteasas de tipo nativas o salvajes. Así, estas
variantes pueden utilizarse, por ejemplo, en aplicaciones de jabones
líquidos o en pastilla, formulaciones para el cuidado de la
vajilla, soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto,
hidrólisis de péptidos, tratamiento de restos, aplicaciones
textiles, tales como enzimas de fusión-rotura en
producción de proteínas, etc. Las variantes de la presente
invención pueden comprender, además de una alergenicidad reducida,
una actuación mejorada en una composición detergente (comparada con
la de la precursora). Tal como se utiliza aquí, la actuación
mejorada en un detergente se define como limpieza mejorada de
ciertas manchas sensibles a los enzimas tales como hierba o sangre,
tal como se determina mediante la evaluación usual después de un
ciclo de lavado estándar.
Las proteasas de la invención pueden formularse
como detergentes conocidos en polvo y líquidos que tienen un pH
entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente .01 a aproximadamente
5% (preferiblemente .1 a 5%) en peso. Estas composiciones
detergentes limpiadoras también pueden incluir otras enzimas tales
como proteasas conocidas, amilasas, celulasas, lipasas o
endoglicosidasas, así como reforzantes y estabilizantes.
La adición de las proteasas de la invención a
composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación
de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH
adecuado para el detergente es también adecuado para las presentes
composiciones, siempre que el pH esté dentro del intervalo anterior,
y la temperatura esté por debajo de la temperatura de
desnaturalización de la proteasa descrita. Además, las proteasas de
la invención pueden utilizarse en composiciones limpiadoras son
detergentes, de nuevo solas o en combinación con reforzantes y
estabilizantes.
Las proteasas variantes de la presente invención
pueden incluirse en piensos para animales tales como parte de los
aditivos del pienso para animales, tal como se describe en, por
ejemplo, la patente de EE.UU. 5.612.055; patente de EE.UU
5.314.692; y patente de EE.UU. 5.147.642.
Un aspecto de la invención es una composición
para el tratamiento de un textil que incluye proteasas variantes de
la presente invención. La composición puede utilizarse para tratar
por ejemplo seda o lana, tal como se describe en publicaciones
tales como RD 216.034; EP 134.267; US 4.533.359 y EP 344.259.
Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no
pretende ser una limitación al alcance de las reivindicaciones.
Las variantes se pueden escrutar en busca de
actividad proteolítica de acuerdo con métodos bien conocidos en la
técnica. Variantes de proteasas preferidas incluyen las
sustituciones múltiples en posiciones correspondientes a:
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/D236H;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R;
y
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T2
60A de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colectaron células sanguíneas periféricas
humanas recientes procedentes de seres humanos no estimulados
previamente, i.e., personas que se sabía no habían sido expuestas o
sensibilizadas a proteasa de Bacillus lentus, para la
determinación de los epítopos antigénicos en la protasa procedente
de Bacillus lentus y subtilisina humana. Seres humanos no
estimulados previamente quiere decir que el individuo no es conocido
por haber sido expuesto a o haber desarrollado una reacción a la
proteasa en el pasado. Se prepararon células sanguíneas
mononucleares periféricas (almacenadas a temperatura ambiente, de no
más de 24 horas) para utilizarlas como se explica a continuación:
aproximadamente 30 mls de una solución de preparación de capa
leucocitaria procedente de una unidad de sangre total se llevó a 50
ml con una solución tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) y se
dividió en dos tubos. La capa de debajo de las muestras se
protegieron con 12,5 ml de un medio de separación por densidad
lymphoprep a temperatura ambiente (densidad Nycomed 1,077 g/ml). Los
tubos se centrifugaron durante treinta minutos a 600G. Se recogió
la interfase de las dos fases, se juntaron y lavaron en DPBS. La
densidad de células de la solución resultante se midió con un
hemocitómetro. La viabilidad se midió mediante exclusión de tripan
azul.
A partir de la solución resultante se preparó un
cultivo de células dendríticas diferenciadas a partir de la muestra
de células mononucleares de sangre periférica con una densidad de
10^{8} células por 75 ml de matraz de cultivo en una solución tal
como se indica a continuación:
- (1)
- 50 ml de medio sin suero AIM V (Gibco) se complementaron con una dilución 1:100 de beta-mercaptoetanol (Gibco). Los matraces se dejaron en posición horizontal durante dos horas a 37ºC en 5% de CO_{2} para permitir la adherencia de los monocitos a las paredes del matraz.
- (2)
- La diferenciación de las células monocito en células dendríticas se hizo de la siguiente manera: se eliminaron las células no adherentes y las células adherentes resultantes (monocitos) se combinaron con 30 ml de AIM V, 800 unidades/ml de GM-CSF (Endogen) y 500 unidades/ml de IL-4 (Endogen); la mezcla resultante se cultivó durante 5 días bajo condiciones de 37ºC en 5% CO_{2}. Después de cinco días, se añadió la citoquina TNF\alpha (Endogen) hasta 0,2 unidades/ml, y se añadió la citoquina IL-1\alpha (Endogen) hasta una concentración final de 50 unidades/ml y la mezcla se incubó a 37ºC en 5% CO_{2} durante dos días más.
- (3)
- El séptimo día se añadió Mitomicina C hasta una concentración de 50 microgramos/ml para parar el crecimiento del cultivo de las ahora diferenciadas células dendríticas. La solución se incubó durante 60 minutos a 37ºC en 5% CO_{2}. Las células dendríticas se recogieron raspando suavemente las células adherentes del fondo del matraz con un raspador de células. Entonces, las células adherentes y las no adherentes se centrifugaron a 600G durante 5 minutos, se lavaron en DPBS y se contaron.
- (4)
- Las células dendríticas preparadas se colocaron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a 2x10^{4}/poci- llo en 100 microlitros de volumen total de medio AIM V. Las células T CD4+ se prepararon a partir de alícuotas congeladas de las muestras de células sanguíneas periféricas utilizadas para preparar las células dendríticas utilizando el kit Cellet CD4+ humano (Biotex) según las instrucciones del fabricante con las modificaciones siguientes: las alícuotas se descongelaron y se lavaron de tal manera que se aplicaron aproximadamente 10^{8} células por columna Cellect; las células se suspendieron de nuevo en 4 ml de DPBS y 1 ml del reactivo Cell del Cellect Kit, la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 min. La solución resultante se centrifugó durante cinco minutos a 600G a temperatura ambiente y la bolita fue suspendida de nuevo en 2 ml de DPBS y se aplicó a las columnas Cellect. Las aguas residuales de la columna se recogieron en suero humano al 2% en DPBS. La solución de células CD4+ resultante se centrifugó, suspendida de nuevo en medio AIMV y se midió su densidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión de células T CD4+ se suspendió de
nuevo hasta una cuenta de 2x10^{6}/ml en medio AIMV para
facilitar el manejo eficaz de la placa de 96 pocillos.
El antígeno del péptido se prepara a partir de
una solución estándar 1M en DMSO mediante dilución en medio AIMV en
proporción 1:10. 10 microlitros de solución estándar se colocan en
cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células
dendríticas diferenciadas. Además, se añaden a cada pocillo 100
microlitros de la solución de células T CD4+ diluida preparada como
arriba. Controles útiles incluyen blancos de DMSO diluido, y
controles positivos de toxoide del tétanos.
Las concentraciones finales en cada pocillo, con
un volumen total de 210 microlitros son como se indica a
continuación:
2x10^{4} CD4+
2x10^{5} células dendríticas (R:S de 10:1)
5 mM péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos empleados en el ensayo descrito en
el ejemplo 1 se prepararon basándose en la secuencia de aminoácidos
de Bacillus lentus y de subtilisina humana. Los antígenos
del péptido se diseñaron como se indica a continuación. A partir de
la secuencia de aminoácidos completa de proteasa bien de subtilisina
humana o proteasa de Bacillus lentus proporcionada en la
Figura 1, se prepararon sintéticamente 15 mers, cada uno de los 15
mer solapándose con el anterior y el siguiente excepto para tres
restos.
Los péptidos empleados corresponden a cadenas de
restos de aminoácidos en Bacillus lentus como se proporciona
en Figura 8, y los péptidos corresponden a los restos de aminoácidos
en subtilisina humana como se proporciona en Figura 7. Los péptidos
empleados que corresponden a las proteasas se proporcionan en la
Figura 6. Todos los ensayos se llevaron a cabo al menos en
duplicado. Todos los ensayos presentados enseñan respuestas de
control positivas robustas al antígeno toxoide del tétanos. Las
respuestas se promediaron en cada experimento, entonces se
normalizaron respecto a la respuesta de la línea base. Se anotó un
suceso positivo cuando la respuesta era al menos 3 veces la
respuesta de la línea base.
Se ajustó la respuesta inmunogénica (i.e.
proliferación de células T) a los péptidos preparados a partir de
la subtilisina humana y Bacillus lentus y se proporciona en
las Figuras 4 y 5, respectivamente. La proliferación de células T
se midió mediante el método del tritio incorporado. Los resultados
mostrados en las Figuras 4 y 5 a modo de comparación de la
respuesta aditiva imunogénica a los diferentes péptidos en 10
individuos (Figura 4) y 16 individuos (Figura 5). La respuesta se
indica como la respuesta aditiva en la cual 1,0 es igual a la
respuesta de la línea base para cada muestra. Así, en la Figura 4,
una lectura de 10,0 o menos es la respuesta de la línea base y en
la Figura 5 una lectura de 16,0 o menos es la respuesta línea
base.
Como se indica en la Figuras 4 y 5, la respuesta
imunogénica de las muestras de sangre no estimulada previamente de
individuos no sensibilizados muestra una respuesta alergénica
marcada en el fragmento peptídico procedente de Bacillus
lentus que corresponde a los restos 170-173 de
la proteasa de Bacillus amyloliquefaciens. De manera
esperada, el fragmento correspondiente en subtilisina humana provoca
meramente una respuesta de línea base.
La Fig. 9 enseña la respuesta de células T a los
péptidos derivados de la proteasa de Bacillus lentus en una
muestra tomada a un individuo conocido por ser hipersensible a la
proteasa de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la
región correspondiente a 170-173 en la proteasa
procedente de Bacillus amyloloquefaciens. Como se muestra en
la Figura 9, el individuo hipersensible tuvo una respuesta fuerte al
epítopo de célula T representado por el péptido E05. Este
resultado confirma que, mediante la puesta en práctica del ensayo
según la invención, es posible predecir los principales epítopos
identificados mediante las células T de un individuo
hipersensible.
La Fig. 10 enseña la respuesta de células T a
varias sustituciones de alanina en el péptido E05 derivado de la
proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada a un
individuo conocido por ser hipersensible a la proteasa de
Bacillus lentus. La sustituciones de alanina se emplearon
como sustituciones con el fin de determinar el papel de cualquier
resto específico dentro del epítopo. La leyenda de la Figura 10 se
refiere a la posición del péptido en el cual una alanina fue
sustituida, i.e., en el péptido E06 (secuencia GSISYPARYANAMAV), G
hasta A = 2, S hasta A = 3, I hasta A = 4, S hasta A = 5, Y hasta A
= 6, P hasta A = 7, R hasta A = 8, Y hasta A = 9, N hasta A = 10, M
hasta A = 11 y V hasta A = 12. Como se indica en la Figura 10, la
sustitución de cualquiera de los restos R170A, Y171A y/o N173A en
la proteasa de Bacillus lentus da como resultado una
respuesta espectacularmente reducida en la muestra de sangre del
individuo hipersensible.
A partir de estos resultados, parece que los
restos 170, 171 y 173 dentro de este péptido son críticos para la
respuesta de células T. En consecuencia, además parece que estos
restos son ampliamente responsables de la iniciación de la reacción
alergénica dentro de la proteasa procedente de Bacillus
lentus.
Claims (16)
1. Una variante de la proteasa subtilisina que
comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una
proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
2. La variante de la proteasa subtilisina según
la reivindicación 1, que comprende además una sustitución en una o
más posiciones en una proteasa subtilisina precursora equivalente a
las seleccionadas del grupo que consiste en Y171Q, N76D, S103A,
V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, y T260A.
3. La variante de la proteasa subtilisina según
la reivindicación 2, que se deriva de una subtilisina de
Bacillus.
4. La variante de la proteasa subtilisina según
la reivindicación 3 que se deriva de subtilisina de Bacillus
lentus o de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens.
5. Un ADN que codifica una variante de la
proteasa subtilisina de la reivindicación 1.
6. Un vector de expresión que codifica el ADN de
la reivindicación 5.
7. Una célula hospedante transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 6.
8. Una composición de limpieza que comprende la
variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.
9. Un pienso que comprende la variante de la
proteasa subtilisina de la reivindicación 1.
10. Una composición para tratar un textil, que
comprende la variante de la proteasa subtilisina de la
reivindica-
ción 1.
ción 1.
11. Una variante de la proteasa subtilisina
según la reivindicación 1, que comprende los conjuntos de
sustitución combinada seleccionados del grupo que consiste en las
posiciones correspondientes a:
K170D/Y171Q/S173D;
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;
V68A/N76D/S103AN104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R;
y
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A
de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens.
12. Un método para reducir la alergenicidad de
una proteasa subtilisina, que comprende hacer una sustitución en
una proteasa precursora en al menos una o más posiciones que
corresponden a K170D, Y171Q y/o S173D de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, para producir una variante de la
proteasa subtilisina que tiene menor alergenicidad que la proteasa
subtilisina precursora.
13. Un método según la reivindicación 12, que
comprende además hacer una o más sustituciones en la proteasa
subtilisina precursora equivalente a las seleccionadas del grupo que
consiste en N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H,
Q245R y T260A.
14. Un método según la reivindicación 12 o la
reivindicación 13, en donde la proteína subtilisina precursora es
una subtilisina de Bacillus.
15. Un método según la reivindicación 14, en
donde la proteasa subtilisina precursora es subtilisina de
Bacillus lentus o subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, que comprende modificar un ADN que
codifica la proteasa subtilisina precursora para producir un ADN
modificado que codifica la variante de la proteasa subtilisina.
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