MXPA00009916A - Proteasa humana y uso para aplicaciones farmaceuticas y para reducir la alergenicidad de proteinas no humanas - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para producir un mutante novedoso de proteína mejorada el cual produce una respuesta alergénica baja en humanos, en comparación cona la secuencia parental deése mutante. Específicamente, la presente invención comprende neutralizar o reducir la alergenicidad de una proteína al introducir en la misma como sustitución o modificación de un epitopo en tal proteína, una secuencia de subtilisina humana.

Description

PROTEASA HUMANA Y USO PARA APLICACIONES FARMACÉUTICAS Y PARA REDUCIR LA ALERGENICIDAD DE PROTEÍNAS NO HUMANAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A. Campo de la Invención La presente invención se relaciona con una secuencia de proteína humana la cual se puede utilizar en varias aplicaciones. Específicamente, la secuencia novedosa de proteína humana se puede utilizar para diseñar proteínas las cuales producen una respuesta alergénica disminuida en humanos expuestos a tales proteínas mediante el uso de un ensayo de predicción.

B. Estado de la técnica Las serinas proteasas son un subgrupo de carbonilhidrolasas . Comprenden una clase diversa de enzimas qve tienen una gama amplia de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci . Amer.. 131:74-88. Pese a su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serinas proteasas se ha aproximado en por lo menos dos familias genéricamente distintas de enzimas: las subtilisinas y la quimiotripsina de mamífero relacionadas y la serina proteasa Ref: 123264 bacterianas homologas (por ejemplo tripsina y tripsina de S. gresius) . Estas dos familias de serina proteasas muestran mecanismos de catálisis notablemente, similares. Kraut, J. (1977), Ann. Rev. Biochem., 46:331-358. Además, aunque la estructura primaria no está relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas se unen en una triada catalítica conservada de aminoácidos que consiste (ie serina, histidina y aspartato. La subtilisina es una serina endoproteasa (PM 27,500) la cual es secretada en cantidades grandes por una amplia variedad de especies de Bacillue y otros microorganismos. Se ha determinado la secuencia proteínica de la subtilisina a partir de al menos cuatro especies diferentes de Bacill us . Markland, F.S., et al. (1983), Honne-Seyler ' s Z. Physio... Chem'. , 364: 1537-1540. La estructura cristalográfica tridimensional de la subtilisina de Bacill us amyloliquefaciens a una resolución de 2.5A también se ha reportado. Wright, C.S., et al. (1969), Nature. 221:235-242; Drenth, J., et al. (1972), Eur. J. Biochem. , 26:177-181. Estos estudios indican que aunque la subtilisina genéticamente no está relacionada con las serinas proteasas similares a quimiotripsina de mamífero, tiene una estructura de citoactivo similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de subtilisina contienen inhibidores peptídicos unidos covalentemente (Robertus, J.D. et al. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) o complejos de producto (Robertus, J.D. et al. (1976), J. Biol. Chemn . , 251:1097-1103) y también han proporcionado información respecto al sitio activo y sustrato putativo que se une a la hendidura de subtilisina. Además, se han reportado una gran cantidad de estudios de modificación cinética y química para subtilisina (Phillip, ... et al. (1983), Mol . Cell. Biochem.. 51:5-32; Svendsen, B. (1976), Carlsberg Res. Comm., 41:327-291; Markland, F.S. Id.) así como por lo menos un informe en donde la cadena lateral ele metionina en el residuo 222 de subtilisina se convierte por peróxido de hidrógeno a metionina-sulfóxido (Stauffer, D.C , et al. (1965), J. Biol. Chem.. 244:5333-5338) y la cadena lateral de serina en el residuo 221 se convierte a cisteína por modificación química (Polgar, et al. (1981), Biochimica et Biophysica Acta. 667:351-354). Las proteínas que presentan cierta similitud u homología con la subtilisina bacteriana también se he n detectado también en humanos (véase, por ejemplo, Keifer et al., DNA and Cell Biol.. Vol. 10, No. 10, p. 757-769 (1991); Smeekens et al., J. Biol . Chem. , Vol. 265, No. 6, p . 2997-3000 (1990); Tomkinson et al., Biochem.. Vol. 30, pp . 168-174 (1991) ) . La patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) describe la modificación de residuos aminoácidos de subtilisina que corresponden a las posiciones en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tirosina-1, aspartato +32, asparagina +155, tirosina +104, metionina +222, glicina +166, histidina +64, glicina +169, fenilalanina +189, serina +33, serina +221, tirosina +217, glutamato +156 y alanina +152. La patente de los Estados Unidos 5,182,204 describe la modificación del residuo aminoácido +224 en subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y posiciones equivalentes en otras subtilisinas las cuales se pueden modificar por medio de sustitución, inserción o supresión y las cuales se pueden combinar con modificaciones a los residuos identificados en la patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) para formar mutantes de subtilisina útiles o variantes. La patente de los Estados Unidos 5,155,033 describe subtilisinas mutante,. similares que tienen una modificación en una posición equivalente a +225 de subtilisina de B . amyloliquefaciens . Las patentes de los Estados Unidos 5,185,258 y 5,204,015 describen subtilisinas mutantes que tienen una modificación en las posiciones +123 o +274, o ambas. La patente de los Estados Unidos 5,182,204 describe la modificación de muchos residuos aminoácidos dentro de subtilisina, que incluyen específicamente: +99, +101, +103, +107, +126, +128, +135, +197 y +204. La patente de los Estados Unidos 4,914,031 describe ciertos: análogos de subtilisina, que incluyen una subtilisine modificada en la posición +76. ' Las proteínas, incluyendo proteasas, utilizadas er aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales cada vez prevalecen más. Como un resultado, la exposición aumentada debido a esta prevalencia ha sido la responsable de peligros en cuanto a seguridad, causados por . la sensibilización de ciertas personas a estos péptidos, por lo que una exposición subsecuente provoca reacciones alérgicas graves las cuales pueden ser peligrosas e incluso mortales. Por ejemplo, se sabe que las proteasas provocan hipersensibilidad peligrosa eu algunas personas. Como un resultado, pese a la utilidad de proteasas en la industria, por ejemplo en detergentes de lavandería, cosméticos, tratamientos textiles, etc..., y la costosa investigación realizada en el campo la cual se ha realizado para proporcionar proteasas mejoradas, por ejemplo, para una cepa más efectiva de remoción bajo condiciones d= detergencia, el uso de proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos humanos. Se ha realizado mucho trabajo con el fin de resolver estos problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el potencial inmunogénico del uso de proteasas ha habido procesos de producción mejorados los cuales reducen el contacto potencial al controlar y minimizar las concentraciones en e L lugar de trabajo de partículas de polvo o aerosol que transportan proteasas por el aire, procesos mejorados de granulación los cuales reducen la cantidad de polvo o aerosol producido en la realidad a partir de este producto de proteasa y un proceso mejorado de recuperación para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergénicos en el producto final . Sin embargo, los esfuerzos para reducir la alergenicidad de proteasa, per se, han sido relativamente poco exitosos. Alternativamente, se han realizado esfuerzos por enmascara:: epitopos en protesas los cuales son reconocidos por la inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (publicación PCT WO 92/10755) o para agrandar o cambiar la naturaleza de los determinantes antigénicos al unir polímeros o péptidos/proteínas a la proteasa problemática. Cuando se produce una respuesta inmune adaptable en una forma exagerada o inapropiada, se dice que la persona que. experimenta la reacción es hipersensible. Las reacciones de hipersensibilidad son el resultado de respuestas inmunes normalmente benéficas que actúan de manera inapropiada y algunas veces provocan reacciones inflamatorias y daño en el tejido. Se pueden provocar por muchos antígenos; y la causa de una reacción de hipersensibilidad variará de un individuo a_. siguiente. La hipersensibilidad normalmente no se manifiesta en sí misma sino hasta el primer contacto con el antígeno, pero habitualmente aparece por contacto subsecuente . Una forma de hipersensibilidad se presenta cuando se dirige una respuesta IgE contra antígenos ambientales inocuos, tales como polen, ácaros del polvo o residuos animales. La liberación resultante: de mediadores farmacológicos por células cebadas sensibilizadas por IgE producen una reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como asma o rinitis. No obstante, generalmente una estrategia q?e comprenda modificar los sitios de IgE no tendrá éxito en evita.r la causa de la reacción de sensibilización inicial. Ein consecuencia, tales estrategias, aunque tal vez neutralicen o reduzcan la gravedad de la reacción de hipersensibilidad subsecuente, no reducirán el número de personas sensibilidades en realidad. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensible a cierto antígeno, la única manera general y segura de tratar esta situación es aislar a la persona hipersensible tan completamente como sea posible. En realidad, cualquier otro curso de acción puede ser peligroso para la salud del individuo hipersensible. Por lo tanto, aunque es importante reducir el peligro de una proteína específica para un individuo hipersensible, para propósitos industriales sería mucho más útil volver a la proteína incapaz de iniciar la reacción de hipersensibilidad en primer lugar. Los linfocitos T (células T) son elementos clave en la inducción y regulación de respuestas inmunes y en la ejecución de funciones efectoras inmunológicas. La inmunidad específica contra agentes infecciosos tumores se sabe que depende de estas células y se considera que contribuye aL sanado de heridas. Por otra parte, una carencia de control de estas respuestas puede llevar a una autoagresión . En general, el antígeno se presenta a las células T en forma de células presentadoras de antígeno, las cuales, a través de una variedad de mecanismos de superficie celular, . capturan y exhiben l antígeno o un antígeno parcial de una manera adecuada para el reconocimiento del antígeno por la célula. Ante el reconocimiento de un epitopo específico por los receptores en la superficie de las células T (receptores de células T) , las células T comienzan una serie de interacciones complejas qje incluyen proliferación, lo que resulta en la producción de anticuerpo por células B. Aunque las células T y las células B son activadas ambas por epitopos antigénicos los cuales existen en una proteína o péptido dado, los epitopos reales reconocidos por estas células mononucleares en general no son idénticos. De hecho, el epitopo el cual activa a una célula T a iniciar la reacción de diversidad inmunológica con mucha frecuencia no es el mismo epitopo el cual es reconocido después por las células B en el desarrollo de la respues a inmunológica. Por lo tanto, con respecto a _ a hipersensibilidad, aunque la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno es un elemento crítico en el inicio de la respuesta inmune a la exposición antigénica, las especificidades de esta interacción, es decir, el epitopo reconocido, con frecuencia no es relevante para el desarrolLo subsecuente de una reacción alérgica completa.

La publicación PCT No. WO 96/40791 describe an proceso para producir conjugados de óxido de polialquileno-polipéptido con alergenicidad reducida utilizando óxido de polialquileno como un material inicial. La publicación PCT No. WO 97/30148 describe un conjugado polipeptídico con alergenicidad reducida el cual comprende una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas polipeptídicas acopladas covalentemente al mismo. La publicación PCT No. WO 96/17929 describe un proceso para producir polipéptidos con alergenicidad reducida, que comprende la etapa de conjugar de 1 a 30 polimoléculas con un polipéptido parental. La publicación PCT No. 92/10755 describe un método para producir variantes de proteína que producen respuesta inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, las proteínas de interés, una serie de proteasas y variantes de La misma se utilizan para inmunizar ratas. Los sueros de las ratas después se utilizan para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales producidas de antemano y presentes en los sueros inmunizados a la proteína de interés y variantes de la misma. A partir de estos resultados, es posible determinar si los anticuerpos en la preparación son comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus variantes, por lo que se permite un análisis respecto a cuáles cambios en la proteína es probable que neutralicen o reduzcan la capacidad de la Ig a unirse. A partir de estas pruebas en ratas, se llega a :.a conclusión de que al cambiar cualquiera de los 309 residuos de subtilisina que corresponden a 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251,' 261 resultará en un cambio en el potencial inmunológico . La publicación PCT No. WO 94/10191 describe proteínas alergénicas bajas que comprenden formas oligoméricas de la proteína monomérica parental, en donde el oligómero tiere sustancialmente retenida su actividad. La técnica anterior ha proporcionado métodos para reducir la alergenicidad de ciertas proteínas y la identificación de epitopos los cuales causan reacciones alérgicas en algunos individuos, los ensayos utilizados para identificar estos epitopos generalmente involucran mediciones de anticuerpos IgE e IgG en sueros sanguíneos expuestos previamente al antígeno. No obstante, continúa la necesidad por métodos alternativos para preparar enzimas con poca alergenicidad. De igual manera, existe la necesidad por una disponibilidad aumentada de enzimas humanas las cuales pueden ser utilizadas en aplicaciones farmacéuticas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es proporcionar una proteasa humana la cual se puede utilizar en la industria como una sustitución para proteasas bacterianas y micóticas. Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para elaborar protesas utilizadas actualmente y exitosas, así como otras proteínas más seguras al integrar en sus secuencias derivadas de análogos de proteasa humana . Un objetivo adicional de la invención es proporcionar una proteasa humana la cual pueda tener aplicación en la industria farmacéutica. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para reducir la alergenicidad de una proteína n. humana, en donde se identifica y sustituye un epitopo con una región análoga dentro de una subtilisina humana. En una modalidad preferida, la proteína no humana es una enzima, de manera más preferible una proteasa. En otra modalidad preferida, el epitopo sustituido es un epitopo de célula T. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir la proteína de la invención que tiene alergenicidad reducida. Preferiblemente, la proteína mutante se prepara al modificar un ADN que codifica para una proteína precursora de manera que el ADN codificado codifica para la proteína mutante de la invención en donde se sustituye un epitopo con una región análoga de la subtilisina humana. En otra modalidad adicional de la invención, se proporcionan secuencias de ADN que codifican para la proteína mutante, así como vectores de expresión que contienen tales secuencias * e ADN y células huéspedes transformadas con talee vectores, células huéspedes las cuales preferiblemente son capaces de expresar tal ADN para producir la proteína mutant s de la invención ya sea intracelular o extracelularmente . La proteína mutante de la invención es útil e cualquier composición o proceso en el cual la proteína sea conocida generalmente como útil. Por ejemplo, cuando la proteína es una proteasa, la proteasa con alergenicidad reducida se puede utilizar como un componente en productos limpiadores tales como detergentes de lavandería y limpiadores de superficies duras, así como un auxiliar en la preparació de cuero, en el tratamiento de textiles tales como lana o seda, o ambos, para reducir el enfieltrado, como un componente en un cosmético o crema facial, y como un componente en alimento:. animales o de mascotas para mejorar el valor nutricional áel alimento. De manera similar, cuando la proteína es una amilasa, la amilasa con alergenicidad reducida se puede utilizar para su licuefacción de almidón, como un componente en detergentes para lavado de trastes, para desapresto de textiles, en un detergente de lavandería o en cualquier otro uso para el cual. pueda ser útil la amilasa, Similarmente, cuando la proteína es una composición farmacéutica, su uso se puede volver más seguro al reducir la posibilidad de reacción alérgica. En otra modalidad de la invención, se puede utilizar la subtilisina humana en aplicaciones farmacéuticas en donde se utiliza la proteasa para tratamientos ds desbridamiento.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1B-1B3 , ilustran las secuencias ds ADN (SEC. DE IDENT. NO : 1) y de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO : 2) de subtilisina de Bacillus a yloliquefaciens (BPN' ) y un mapa de restricción parcial de este gen, La figura 2 ilustra los residuos conservados ds aminoácidos entre subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus lentus (tipo silvestre) (SEC. DE IDENT. NO: 3 ) . Las figuras 3A y 3B Ilustran una alineación de secuencia de aminoácidos de proteasas tipo subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (BPN' ) , Bacillus subtilis, Bacillus lichenifoxmis (SEC. DB IDENT. NO: 4) y Bacillus lentus. El símbolo* indica la ausencia de residuos aminoácidos específicos en comparación con subtilisina BPN' . La figura 4 ilustra la respuesta aditiva de células T de 16 muestras de sangre mononuclear periférica a péptidos que corresponden a la proteasa de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la región que comprende los residuos que corresponden a 170-173 en la proteasa de B a c i l l u s amyloliquefaciens . La figura 5 ilustra la respuesta aditiva de células T de las 10 muestras de sangre mononuclear periférica a péptidos que corresponden a la subtilisina humana. La figura 6 ilustra la secuencia de aminoácidos de la subtilisina humana (SEC. DE IDENT. NO: 6) . La figura 7 ilustra las cadenas de aminoácidos que corresponden a los péptidos derivados de la secuencia de la proteasa de Bacillus lentus utilizada en el Ejemplo 2. Las figuras 8A y 8B ilustran las cadenas de aminoácidos que corresponden a los péptidos derivados de la secuencia de la subtilisina humana utilizada en el Ejemplo 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para reducir la alergenicidad de una proteína no humana, en donde se identifica un epitopo y se sustituye con una región análoga dentro de una subtilisina humana. En una modalidad preferida, la proteína no humana es una enzima, de manera más preferible una proteasa. En otra modalidad preferida, el epitopo sustituido es un epitopo de células T.

En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir la proteína de la invención que tiene alergenicidad reducida. Preferiblemente, la proteína mutante se prepara al modificar un ADN que codifica para una proteína precursora de manera que el ADN modificado codifica para la proteína mutante de la invención en donde se sustituye el epitopo con una región análoga de la subtilisina humana. En una modalidad adicional de la invención, se proporcionan secuencias de ADN que codifican para la proteína mutante, así como vectores de expresión que contienen tales secuencias de ADN y células huéspedes transformadas con tales vectores, células huéspedes las cuales preferiblemente son capaces de expresar tal ADN para producir la proteína mutante de la invención ya sea intracelular o extracelularmente . De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el epitopo que se va a sustituir en la proteína no humana de interés se identifica por el método de identificar los epitopos de células T. En una modalidad preferida de la invención, la presente invención proporciona un ensayo el cu.11 identifica epitopos como sigue: se combinan células dendrí icas diferenciadas con células T humanas CD4+ o CD8+ o ambas, no expuestas, y con un péptido de interés. De manera más específica, se proporciona un método en el que se reconoce el epitopo de células T, que comprende las etapas de: (a) obtener de una sola fuente de sangre una solución de células dendríticas y una solución de células T CD+4 o CD8+ o ambas, no expuestas; (b) promover la diferenciación en la solución de células dendríticas; (c) combinar la solución de células dendríticas diferenciadas y las células T CD4+ o CD8+ o ambas, no expuestas, con un péptido de interés; (d) medir la proliferación de células T en la etapa (c) . El péptido no humano de interés para ser analizado de acuerdo con el ensayo de la invención deriva en una proteína de enzima para la cual se requiere alergenicidad reducida. En la práctica de la invención, es posible identificar con precisión la posición de un epitopo el cual provoca sensibilización en un individuo o en una muestra de individuos . En una modalidad particularmente efectiva de la invención, se preparan una serie de oligómeros peptídicos los cuales corresponden a la totalidad o a una parte de la proteína o enzima. Por ejemplo, se produce una biblioteca peptídica que cubre una porción relevante de la totalidad de la proteína. Una manera particularmente útil para producir los péptidos es introducir la superposición dentro de la biblioteca peptídica, por ejemplo, al producir un primer péptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos 1-10 de tal proteína, un segundo péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 4-14 de la proteína del sujeto, un tercer péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 7-17 de la proteína objeto, un cuarto péptido corresponde a la secuencia de aminoácidos 10-20 de la proteína sujeto, etc... hasta que se hayan generado los péptidos representativos que corresponden a la totalidad de la molécula. Al analizar cada uno de los péptidos individualmente en el ensayo que se proporciona aquí, es posible identificar con precisión la posición de epitopos reconocidos por células T. En el ejemplo anterior, la reacción de un péptido específico a un grado mayor que sus vecinos facilitarán la identificación del ancla de epitopo al interior de tres aminoácidos. Después de determinar la posición de estos epitopos, es posible alterar los aminoácidos dentro de cada epitopo hasta que el péptido produzca una respuesta de células T menos significativa. Preferiblemente, el epitopo se modifica en una de las siguientes maneras: (a) preferiblemente la secuencia de aminoácidos del epitopo se sustituye con una secuencia análoga de la subtilisina humana de la invención para la proteína de interés, por ejemplo, cuando la proteína es una subtilisina, se puede arreglar la secuencia en la línea azul de manera que se encuentre en la región análoga en la molécula de subtilisina humana la cual no sustituye al epitopo pertinente en la subtilisina; (b) se sustituye la secuencia de aminoácidos deL epitopo con una secuencia de subtilisina humana de la invención, la cual imita sustancialmente a los atributos de la estructura terciaria principal del epitopo, pero la cual produce una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento del epitopo de células T en comparación con la proteína de interés; o (c) con cualquier secuencia de la subtilisina humana de la invención la cual produzca una respuesta alergénica menor debido al reconocimiento de epitopo de célula T en comparación con la proteína de interés . Como se utiliza en la presente, "célula presentadora de antígeno" significa una célula del sistema inmune la cual presenta un antígeno en su superficie, el cual reconocible por células T. Los ejemplos de células presentadoras de antígeno son células dendríticas, células interdigitadas, células B activadas y macrófagos. Como se utiliza aquí, el término "proliferación de células T" significa el número de células T producidas durante la incubación de células T con las células presentadoras de antígeno, con o sin antígeno. Como se utiliza aquí, "proliferación de células T de línea de base" significa proliferación de células T la cual ss observa normalmente en un individuo en respuesta a exposición a las células presentadoras de antígeno en ausencia del péptido o del antígeno proteínico. Para los propósitos en la presente, el nivel de proliferación de células T de línea de base se determina en una base por muestra para cada individuo como l.a proliferación de células T en respuesta a las células presentadoras de antígeno en ausencia de antígeno. El término "epitopo de célula T" significa una característica o un péptido o proteína el cual se reconoce por un receptor de células T en el inicio de una respuesta inmunológica al péptido que comprende ése antígeno. El reconocimiento de un epitopo de célula T por la célula T generalmente se considera que es vía un mecanismo en donde las células T reconocen los fragmentos peptídicos de antígenos los cuales están unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase I o clase II (MHC) expresadas en las células presentadoras de antígeno (véase, por ejemplo, Moeller, G. ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses, Immunological Review, Volumen 98, p 187 (Copenague; Munksgaard) (1987) . Los epitopos determinados de acuerdo con el ensayo proporcionados aquí después se modifican para reducir el potencial alergénico de la proteína de interés. En una modalidad preferida, el epitopo que se va a modificar al nivel de proliferación de células T de más de tres veces la proliferación de células T de línea de base en una muestra. Cuando se modifica, el epitopo produce menos de tres veces la proliferación de línea de base, preferiblemente menos de dos veces la proliferación de línea de base, y de manera mucho más preferible menos de, o sustancialmente igual a la proliferación de línea de base en una muestra. El término "muestra", como se utiliza en la presente, comprende células mononucleares las cuales son no expuestas, es decir, no han sido sensibilizadas al antígeno en cuestión.

El término "homólogo", como se utiliza aquí, significa una proteína o enzima, la cual tiene una acción catalítica, estructura o uso similar, al de la proteína de interés. Es deseable encontrar un homólogo que tenga una estructura terciaria o primaria, o ambas, similares a la proteína de interés como sustitución del epitopo en la proteína de interés con un segmento análogo del homólogo para reduc:.r la interrupción del cambio. Por lo tanto, las enzimas que tienen una homología significativa proporcionarán el objetivo más deseable para las sustituciones de epitopo con secuenciais a partir de la subtilisina humana de la invención. Una secuencia "análoga" se puede determinar al asegurar que los aminoácidos de sustitución muestran una función similar, la estructura terciaria o los residuos conservados para los aminoácidos en la proteína de interé.s están en o cerca del epitopo. Por lo tanto, cuando la región de epitopo contiene, por ejemplo una hélice alfa o una estructura de lámina beta, los aminoácidos de sustitución debe:n mantener esta estructura específica. Aunque la presente invención se extiende a todas las proteínas para las cuales se desea reducir alergenicidad, por fines de sencillez, lo siguiente describirá una modalidad particularmente preferida de la invención, la modificación de proteasa. Las proteasas son carbonil hidrolasas las cuales generalmente actúan para separar enlaces peptídicos ce proteínas o péptidos. Como se utilizan aquí, el término "proteasa" significa una proteasa que se presenta de manera natural o una proteasa recombinante.- Las proteasas que se presentan de manera natural incluyen -aminoacilpéptido hidrolasa, peptidilaminoácido hidrolasa, acilaminohidrolasa, serina carboxilpeptidasa, metalocarboxipep idasa , tiol proteinasa, carboxilproteinasa y metaloproteinasa . Se incluyen la serina, metalo, tiol y ácido proteasas así como las endo y exoproteasas . Las subtilisinas son proteasas bacterianas o micóticas las cuales generalmente actúan para separar enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se utiliza en La presente, el término "subtilisina" significa una subtilisina que se presenta de manera natural o una subtilisina recombinante. Se sabe que una serie de subtilieinas que se presentan de manera natural se producen y con frecuencia se secretan por diversas especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de estas series no son completamente homólogos. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie muestran el mismo tipo o un tipo similar de actividad proteolítica. Esta clase de serinas proteasas comparten una secuencia de aminoácidos común que define una triada catalítica la cual las diferencia de las clases relacionadas de quimiotripsina de serinas proteasas. Las subtilisinas y quimiotripsinas relacionadas con serinas proteasas tienen ambas triadas catalíticas que comprenden aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con subtilisina, el orden relativo de estos aminoácidos, leído desde la parte amino a . '.a carboxi terminal, es aspartato-histidina- serina . En las proteasas relacionadas con quimiotripsina, el orden relativo, sin embargo, es histidina-aspartato-serina . Por lo tanto, :.a subtilisina aquí se refiere a una serina proteasa que tiene la triada catalítica de proteasas relacionadas con subtilisina . Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a las subtilisinas identificadas en la figura 3 aquí. Generalmente, y para propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponden con los números asignados a la secuencia de subtilisina de Ba ci l l u s a yloliquefaciens madura que se presenta en la figura 1. Los términos "subtilisinas recombinantes" o "proteasas recombinantes", se refieren a una eubtilisina o proteasa en la cual se modifica la secuencia de ADN que codifica para la subtilisina o proteasa, para producir uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que se presenta de manera natural. Los métodos adecuados para producir te.l modificación y los cuales pueden ser combinados con los descritos aquí incluyen aquéllos descritos en la patente de los Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606), patente de los Estados Unidos 5,204,015 y patente de los Estados Unidos 5,185,258.

Las "subtilisinas no humanas" y el ADN que las codifica se puede obtener de cualquier organismo procariótico y eucariótico. Los ejemplos adecuados de organismos procarióticos incluyen organismos gramnegativos tales corro E. coli o Pseudomonas y bacterias grampositivas tales corro Micrococcus o Bacill us . Los Ejemplos de organismos eucarióticos a partir de los cuales se pueden obtener las subtilisinas y sus genes incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevieiae , hongos tales como Aspergillus sp. El término "subtilisina humana" significa la proteína representada por la secuencia en la figura 6 derivado de la misma o modificaciones de la misma los cuales retienen su capacidad esencial de hidrolizar enlaces peptídicos. Una "variante de proteasa" tiene una secuencia de aminoácidos la cual se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora" . Las proteasas precursoras incluyen proteasas que se presentan de manera natural proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de proteasa precursora por sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la "secuencia de ADN precursora" la cual codifica para la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en vez de la manipulación de la enzima proteasa precursora per se.

Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluye métodos descritos aquí, as:l como métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, EP 0 328299, WO89/06279 y las patentes de los Estados Unidos y solicitudes a las que ya se haya hecho referencia ^aquí) . Estos números en posiciones de aminoácidos utilizados aquí se refieren a los asignados en la secuencia de subtilisinéi de Bacillus a yloliquefaciens madura que se presenta en la figura 1. Sin embargo, la invención no se limita a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extiende a proteasa.; precursoras que contienen residuos aminoácidos en las posiciones las cuales son "equivalentes" con residuos; identificados particulares en subtilisina de Ba ci l l u s amyloliquefaciens . En una modalidad preferida de la presente: invención, la proteasa precursora es subtilisina de Bacill us lentus y las sustituciones, supresiones o inserciones se: realizan en el residuo aminoácido equivalente en B . lentus , q e' corresponde a los incluidos antes . Un residuo (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de Ba ci l l us a yloliquefaciens ya sea que sea homólogo (es decir, que corresponde en posición ya sea a la estructura ya sea primaria o terciaria) , o análogo a un residuo específico o porción de ése residuo en la subtilisina de Bacill us amyloliquefaciens (ee decir, que tenga una capacidad funcional igual o similar para combinarse, reaccionar o interactuar químicamente) . Con el fin de establecer homología con la estructura primaria, se compara directamente la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora con la secuencia primaria de la subtilisina de Bacill us a yloliquefaciens y particularmente con un conjunto de residuos que se sabe son no variables en las subtilisinas para las cuales ee conocen secuencias. Por ejemplo, la figura 2 en la presente muestra los residuos conservados entre la subtilieina de B . amyloliquefaciens y subtilisina de B . lentus . Después de la alineación de los residuos conservados, que se permiten para las inserciones supresionee necesarias con el fin de mantener la alineación (es decir, evitar la eliminación de los residuos conservados a través de supresión e inserción arbitraria) , se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina de JBacíllus amyloliguefaciens. La alineación de los residuos conservados preferiblemente se debe conservar en 100% de tales residuos. Sin embargo, una alineación mayor de 75% o tan pequeña como 50% de los residuos conservados también es adecuada para definir residuos equivalentes . Se debe mantener la conservación de la triada catalítica Asp32/His64/Ser221. Por ejemplo, en la figura 6, la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Baci ll us a ylol iquefaci ens .

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergeneis) y Bacillus lentus se alinean para proporcionan una cantidad máxima de homología entre secuencias de aminoácidos . Una comparación de estas secuencias muestra que existen numerosos residuos conservados contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (por ejemplo como entre BPN' y B. lentus) se identifica en la figura 2. Por lo tanto, estos residuos conservados deben ser utilizados para definir los residuos aminoácidos equivalentes correspondientes de la subtilisina de Bacill us a yloliquefaciens en otras subtilisinas tales como la subtilisina de Bacillus lentus (publicación PCT WO89/06279 publicada el 13 de julio de 1989) , la enzima precursora de proteasa preferida en la presente, o la subtilisina a la que se hace referencia como PB92 (EP 0 328 299) , la cual es altamente homologa a la subtilisina de Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de algunas de estas subtilisinas se alinean en las figuras 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la homología máxima de los residuos conservados. Como se puede ver, existen numerosas supresiones en la secuencia de Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de Bacillus amylol ique faci ens . Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Vall65 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciene en las otras subtilisinas es isoleucina para B . lentus y B . licheni formi s. Así, por ejemplo, el aminoácido en la posición +170 es lisina (K) en ambas subtilisinas tanto de .3. amyloliquefaciene como B . licheniformis , y arginina (R) en Savinase-. En las variantes de proteasa de la invención, sin embargo, el aminoácido equivalente a +170 en la subtilisina de Bacillue amyloliquefaciene está suetituida con ácido aspártico (D) . Las abreviaturas y códigos de una letra para todos los aminoácidos en la presente invención se adaptan a Patentln User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, p. 101. El término "residuos equivalentes" también se puede definir al determinar la homología a nivel de estructura terciaria para una proteasa precursora cuya estructura terciaria haya sido determinada por cristalografía de rayos . Los residuos equivalentes se definen como aquéllos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de átomos de cadena principal de un residuo aminoácido particular de La proteasa precursora y subtilisina de Bacill ue amyloliquefacie.ie (N en N, CA en CA, C en C y O en 0) estén dentro de 0.13 nm, y preferiblemente 0.1 nm después de la alineación. La alineación se obtiene despuée de que se ha orientado el mejor modelo y se ha colocado para proporcionar la superposición máxima de coordenadas atómicas de átomos de proteína que no son hidrógeno de la proteasa en cuestión para la subtilisina de Bacill us amylol iquefaci ene . El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el menor factor R para los datos de difracción experimentales en la mayor resolución disponible.

Factor R = ?h| Fo (h) \ - \ Fc (h) \ lh \ F (h) \ Los residuos equivalentes los cuales son funcionalmente análogos a un reeiduo específico de subtilisina de Baci l l ue amyl ol i quefa ci ene se definen como aquéllos aminoácidos de la proteasa precursora la cual puede adoptar una conformación de manera que pueda alterar, modificar o contribuir a la estructura de proteína, la unión del sustrato o catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico en la subtilisina de Bacillue amyloliquefaciens . Además, eon aquélloe reeiduos de la proteasa precursora (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayoe x) la cual ocupa una poeición análoga al grado que, aunque los átomos de la cadena principal de un residuo dado, pueden no satisfacer los criterios de equivalencia en base en la ocupación de una posición homologa, las coordenadas atómicas de por lo menos dos de los átomos de cadena lateral del residuo se encuentran con 0.13 nm de los átomos de cadena lateral correspondientes de la subtilisina de Bacillue amyloliquefaciene . Las coordenadas de la estructura tridimensional de la subtilisina de Bacill ue amylol iquefaci ene que se establecen en la publicación EPO No. 0 251 416 (equivalente a la patente de los Estados Unidos 5,182,204, cu /a descripción se incorpora en la presente como referencia ) y se pueden utilizar como se indican antes para determinar los residuos equivalentes a nivel de estructura terciaria. Algunos de los residuos identificados para sustitución, inserción o supresión son residuos conservados, mientras que otros no. En el caso de residuos los cuales no están conservados, la sustitución de uno o más aminoácidos se limita a sustituciones las cuales producen una variante la cual tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a la que se encuentra en la naturaleza. En el caso de residuos conservados, tales sustituciones no deben resultar en una secuencia que se presenta de manera natural . Lae variantes de proteasa de la presente invención incluyen las formas maduras de variantes de proteasa, así como las formas pro y prepro de tales variantes de proteasa. Las formas prepro son el sitio de construcción preferido puesto que facilitan la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa. El término "prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la porción N terminal de la forma madura de una proteasa, la cual, cuando se remueve resulta en la aparición de la forma "madura" de la proteasa .

Muchas enzimas proteolíticas Jim encuentran en la naturaleza como productos de proenzima traduccional y, en ausencia de un procesamiento postraduccional, se expresa de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia putativa de subtilisina de B a c i l l u s amyl ol i qu e fa ci en s , aunque se pueden utilizar otras prosecuencias de proteasa. Una "secuencia de señal" o "presecuencia" se refiere. a cualquier secuencia de aminoácidos que se encuentran en la porción N terminal de una proteasa o en la porción N termina] de una proteasa la cual puede participar en la secreción de las formas madura o pro de la proteasa. Esta definición de una secuencia de señal es una funcional, lo que sign. fien q?o incluye que todas las secuencias de aminoácidos codificados po : la porción N terminal del gen de proteasa los cuales participan en la realización de la secreción de proteasa bajo condicionéis nativas. La presente invención utiliza tales secuencias para llevar a cabo la secreción de las variantes de proteaea como se definen aquí. Una posible secuencia de señal comprende los primeros siete residuos aminoácidos de la secuencia de seña] a partir de subtilisina de Bacillue eubtilie fusionado con el resto de la secuencia de señal de subtilisina de Bacill us lentus (ATCC 21536) . Una forma "prepro" de una variante de proteasa consiste de la forma madura de la proteasa que tiene una __^^_ __s¿_ prosecuencia unida operablemente a la parte amino terminal de la proteasa y una secuencia "pre" o "señal" unida operablemente a la parte amino terminal de la prosecuencia. El término "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN la cual está unida' operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de llevar a cabo la expresión del ADN en un huésped adecuado. Tales secuenciae de control incluyen un promotor para llevar a cabo la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal tranecripción, una eecuencia que codifica para loe eitios de unión de ribosoma de ARNm y secuencias las cuales controlan la terminación de transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformada en un huésped adecuado, el vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma del huésped, o, en algunos casos, se puede integrar al genoma mismo. En la presente especificación, algunas veces se utilizan intercambiablemente "plásmido" y "vector" pues los plásmidos son la forma más comúnmente utilizada del vector actualmente Sin embargo, se pretende que la invención incluya la totalidad de las demás formas de vectores de expresión los cuales proporcionan funciones equivalentes y los cuales sean, o se vuelvan conocidos en la técnica.

Las "células huéspedes" utilizadas en la presente invención generalmente son huéspedes procarióticos o eucarióticos los cuales preferiblemente han sido manipulados por los métodos descritos en la patente de loe Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) para volverloe incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula huésped preferida para expresar proteasa es Bacill ue cepa BG2036 la cual es deficiente en la proteasa neutra enzimáticamente activa y proteasa alcalina (subtilisina) . La construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la patente de los Estadcs Unidos 5,264,366. Otras células huéspedes para expresar proteasa incluyen Bacillue eubtilie | 168 (también descrita en la patente de Estados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) y en la patente de Estados Unidos 5,264,366, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia) , así como cualquier cepa de Bacillue adecuada tal como B . licheniformie , B . len tus , etc. Las células huéspedes se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante. Tales células huéspedes transformantes son capaces ya sea de replicar vectores que codifican para las variantes de proteasa o para expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores los cuales codifican para la forma pre o prepro de la variante de proteasa, tales variantes, cuando se expresan, típicamente se secretan de la célula huésped dentro del medio de la célula huésped. El término "unido operablemente" cuando describen la relación entre dos regiones de ADN, simplemente significa que están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, una presecuencia está unida operablemente a un péptido que funciona como una secuencia de señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína que más probablemente involucre la separación de la secuencia de señal . Un promotor está unido operablemente a una secuencia codificante se controla la transcripción de la secuencia; un sitio de unión de riboeo a está unido operablemente a una secuencia codificante si se coloca de manera que se permite la traducción. Los genes que codifican para la proteasa precursora que se presenta de manera natural se pueden obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Los métodos generalmente comprenden sintetizar sondas etiquetadas que tengan regiones codificantes para secuencias putativas de la proteasa de interés, preparar bibliotecas genómicas de organismos que expresen la proteasa, y analizar las bibliotecas por el gen de interés mediante hibridación de las sondas. Las clonas que hibridicen positivamente despuée se mapean y secuencian. La proteasa clonada después se utiliza para transformar una célula huésped con el fin de expresar la proteasa. El gen de proteasa después se liga dentro de un plásmido con un número alto de copias. Este plásmido se replica en huéspedes en el sentido en que contiene elementos bien conocidos necesarios para la replicación del plásmido: un promotor unido operablemente al gen en cuestión (el cual se puede suministrar como el promotor homólogo propio del gen si es reconocido, es decir, tranecrito por el huéeped) , una terminación de tranecripción y una región de poliadenilación (necesaria para establecer el ARNm transcrito por el huésped a partir del gen de proteasa en ciertas células huéspedes eucarióticas) , el cual es exógeno o se suministra por la región terminadora endógena del gen de proteasa y, de manera deseable., un gen de selección tal como el gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento cultural continuo en las células huéspedes infectadas con plásmido por crecimiento en medio que contiene antibiótico. Los plásmidos con un número alto de copias también contienen un origen de replicación por el huésped, por lo que se permite que se generen en el citoplasma grandes cantidades de plásmidos sin limitacione?s cromoeómicae . Sin embargo, eetá dentro del alcance en la presente integrar copias múltiples del gen de proteasa en el genoma de huésped. Esto se facilita por organismos procarióticos y eucarióticos los cuales son particularmente susceptibles a recombinación homologa.

En una modalidad, el gen puede ser un gen natural tal como el de B . lentue o B . amyloliquefaciene . Alternativamente, se puede producir un gen sintético -que codifica para una proteasa precursora que se presenta de manera natural o mutante. En tal eolución, el ADN o la eecuencia de aminoácidos, o ambos, de la proteasa precursora se determinan. Los fragmentos de ADN de cadena sencilla sintética o superpuestos múltiples posteriormente se sintetizan, lo cual, ante La hibridación y ligación producen un ADN sintético que codifica para la proteasa precursora. Un ejemplo de construcción sintético se establece en el Ejemplo 3 de la patente de líos Estados Unidos 5,204,015, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Una vez que la proteasa precursora que se presenta de manera natural o sintética se ha clonado, se llevan a cabo muchas modificaciones para mejorar el uso del gen sobrepasando la síntesis de la proteasa precursora que se presenta de manera natural. Tales modificaciones incluyen la producción e proteasas recombinantes como se han descrito en la patente de loe Eetados Unidos 4,760,025 (RE 34,606) y la publicación EPO No. 0 251 446 y la producción de variantes de proteasas descritas aquí . Se puede utilizar el siguiente método de mutagénesás de cásete para facilitar la construcción de las variantes ele proteasa de la presente invención, aunque se pueden utilizar otros métodos. En primer lugar, se obtiene el gen que se presenta de manera natural que codifica para la proteasa y se secuencia en su totalidad o en parte. Despuée la eecuenc a es explorada buscando un punto en el cual se desee realizar una mutación (supresión, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las secuencias que flanquean a este punto para determinar la presencia de sitios de restricción para suetituir un eegmento corto del gen con un concentrado de oligonucleótidoe el cual, cuando ee exprese, codifique para divereoe mutantee . Talee eitioe de restricción preferiblemente son sitioe únicoe dentro del gen de proteaea de manera que ee facilita la euetitución del segmento del gen. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sitio de restricción conveniente el cual no se superponga de manera redundante en el gen de proteasa, con la condición de que los fragmentos del gen generados por digestión de; restricción se pueden volver a ensamblar en secuencia apropiada. Si los sitioe de reetricción no están presentee en posiciones dentro de una distancia conveniente desde el punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos) , tales sitios se generar. por nucleótidos sustituyentes en el gen de manera que el número del marco de lectura ni los aminoácidos que codifican se cambia en la construcción final. La mutación del gen con el fin de cambiar su secuencia para afectarse a la eecuencia deseada se lleva a cabo por la extensión del cebador M13, de acuerdo cor métodoe generalmente conocidoe . La tarea de localizar regiones flanqueantes adecuadas y evaluar la necesidad de cambios para llegar a dos secuenciae de eitioe de reetricción convenientes se puede realizar de manera sietemática por la redundancia del código genético, un mapa de enzima de restricción del gen y el número grande de diferentes enzimas de restricción. Nótese que; si está disponible un sitio de restricción flanqueante; conveniente, el método anterior necesita eer utilizado únicamente en relación con la región flanqueante la cual no contiene un eitio. Una vez que la clona de ADN se presente de manera natural o ADN sintético, los sitios de restricción que; flanquean las posiciones que se van a mutar se digieren con las enzimas de restricción conjuntas, y una pluralidad de casetes oligonucleotídicos complementarios en la parte terminal se; ligan en el gen. La mutagéneeis se simplifica por este método debido a que la totalidad de los oligonucleótidos se pueden sintetizar de manera que tengan los mismos sitios de: restricción, y no son necesarios tales enlazantes sintéticos para crear los sitios de restricción. En un aspecto de la invención, el objetivo ee para, asegurar una proteasa variante que tenga un potencial alergénico alterado en comparación con la proteasa precursora, puesto que disminuye tal potencial permite un uso más segure de la enzima. Aunque la presente invención es útil para. disminuir el potencial alergénico, las mutaciones especificadas en la presente se pueden utilizar en combinación con mutaciones conocidas en la técnica que resultan en estabilidad térmica alterada o en especificidad ae sustrato alterada, actividad modificada o estabilidad alcalina alterada en comparación con el precursor. Por lo tanto, en combinación con las mutaciones de la presente invención, las sustitucionee en las posiciones que corresponden a N76D/S103A/V104I/G159D opcionalmente en combinación con una o más euetitucionee que ee seleccionan del grupo que consiste de posicionee que corresponden a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de eubtilisina de Bacill us amyloliquefaciene se pueden utilizar, además de disminuir el potencial alergénico de la proteasa variante que la invención para modular la estabilidad o actividad proteolítica total de; la enzima. De manera natural, las suetituciones que se; proporcionan aquí se pueden combinar con mutación en asparagina (N) en subtilisina de Ba ci l l ue l en t ue en una posición equivalente a +76 a aspartato (D) en combinación con las mutaciones S103A/V104I/G159D y opcionalmente en combinación con una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que; consiste de posiciones que corresponden a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de subtilisinas de B a c i l l u e amyl ol i quefa ci en e para producir estabilidad mejorada o actividad mejorada, o ambae, de la enzima mutante reeultante.

En base en los resultadoe de análieie obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones anotadas en subtilisina de Bacillue amyloliquefaciene son importantes para la actividad proteolítica, el funcionamiento o estabilidad de estas enzimas y la limpieza o el funcionamiento de lavado de tales enzimas variantes . > Muchas de las variantes de proteasa de la invención son útiles en formulaciones de diversas composiciones detergentee. Muchoe de loe compueetoe conocidoe eon tensioactivos adecuadoe útiles en composiciones que comprenden los mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, aniónicos o zwiteriónicos, como se describe en el documento de loe Estados Unidos 4,404,128 para Barry J. Anderson y el documento de los Estados Unidos 4,261,868 para Jiri Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es la que se describe en el Ejemplo 7 de la patente de loe Eetados Unidos No. 5,204,015 (incorporada previamente como referencia) . La técnica está familiarizada con diferentes formulaciones las cuales se pueden utilizar como composiciones limpiadoras. Además de las composiciones limpiadoras típicas, se entiende fácilmente que: las variantes de proteasa de la presente invención se pueden utilizar con cualquier propósito con el que se utilizan las proteasas nativas o de tipo silvestre. Por lo tanto, estas variantes se pueden utilizar, por ejemplo, en artículos del cuidado personal tales como lociones faciales y cosméticos, e;n aplicaciones de jabón en barra o líquido, formulaciones paira el cuidado de trastee, eolucionee o productos limpiadores de lentes de contacto, hidrólisie de péptidos, tratamientos de desperdicios, aplicaciones textiles como enzimas para separación > por fusión en producción de proteínas, etc. Las variantes de la presente invención pueden eetar constituidae de un funcionamiento mejorado en una compoeición detergente (e*n comparación con el precursor) . Como se utiliza aquí, m funcionamiento mejorado en un detergente se define como ura capacidad de limpieza aumentada de ciertas manchas sensibles a enzimas tales como grasa o sangre, determinado por ura evaluación habitual después de un ciclo de lavado estándar. Las proteasae de la invención ee pueden formular en detergentes pulverizados y líquidos conocidos que tengan pH entre 6.5 y 12.0 a concentraciones de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5% (preferiblemente de 0.1% a 0.5%) en pese. Estas composiciones limpiadoras de detergente también pueden incluir otras enzimas talee como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, así como mejoradores de detergencia y estabilizantes. La adición de proteasas de la invención a composiciones limpiadoras convencionales no generan ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente también es adecuado para las presentes composiciones en la medida en qae el pH esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura sea inferior a la temperatura de desnaturalización de las proteasas descritas. Además, las proteasas de la invención se pueden utilizar en composiciones limpiadoras sin detergentes, nuevamente > ya sea solas o en combinación con mejoradores y estabilizantes . Las proteasae variantee de la preeente invención se pueden incluir en alimentoe animalee talee como parte de aditivos de alimentación animales como se describen, por ejemplo, en el documento de los Estados Unidos 5,612,055; el documento de los Estadoe Unidoe 5,314,692; y el documento de los Estados Unidos 5,147,642. Un aspecto de la invención es una compoeición para el tratamiento de un textil que incluye variantes de proteasas de la presente invención. La composición se puede utilizar pa:ra tratar, por ejemplo, seda o lana como se describe en las publicaciones tales como RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359; y EP 344,259. Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no se debe considerar como limitación para el alcance de lae reivindicaciones . Todas lae publicaciones y patentes a las que se hace referencia en la presente se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Ensayo para la identificación de epitopos de células T peptídicas utilizando células T humanas no expuestas Se recolectan células sanguíneas periféricas humanéis freecae de humanoe "no expuestos", es decir, pereonas que no se sabe que hayan sido expueetas o sensibilizadas a proteaeia de Bacillus lentus, para determinación de epitopos antigénicos en proteasa de Bacill us len tue y subtilieina humana. Se pretende que loe humanos no expuestoe eignifique que el individuo no sabe que ha sido expuesto o que ha desarrollado una reacción a proteasa en el pasado. Se preparan para uso como sigue células eanguíneas mononucleares periféricas (almacenada.s a temperatura ambiente, como máximo 24 horas) : aproximadamente 30 ml de una solución de una preparación de cubierta amarilla de una unidad de sangre completa se lleva a 50 ml con solución amortiguada de fosfato de Dulbecco (DPBS) y se divide en dos tubos. Las muestras se colocan debajo con 12.5 ml de medio de separación de densidad lymphoprep a temperatura ambiente (Nycomed, densidad 1.077 g/ml). Los tubos se centrifugan durante treinta minutos a 600G. La interfase de las dos fasee ee recolecta, ee concentra y ee lava con DPBS. La densidad celular de la solución resultante se mide por hemocitómetro. Se mide la viabilidad por exclusión de azul de tripan. A partir de la solución resultante, se prepara -an cultivo de células dendríticas diferenciadas a partir de u.ia muestra de células mononucleares de eangre periférica que tenga una deneidad de 108 células por matraz de cultivo de 75 ml en una solución como sigue: (1) Se suplementan 50 ml de medio AIM V libre de suero (Gibco) con una dilución 1:100 de beta-mercaptoetanol (Gibco) . Los matraces se colocan planos durante dos horas a 37 °C en C02 5% para permitir la adherencia de monocitos a la pared del matraz . (2) La diferenciación de las células de monocito a células dendríticas es como sigue: se remueven células no adherentes y las células adherentes resultantes (monocitos) se combinan con 30 ml de AIMV, 800 unidades/ml de GM-CSF (Endogen) y 500 unidades/ml de IL-4 (Endogen) ; la mezcla resultante se cultiva durante 5 días bajo condicionee a 37 °C en CO., 5%. Deepués de cinco días, la citocina TNF ( ) (Endogen) se agrega a 0.2 unidades/ml, y se agrega la citosina IL-la (Endogen) hasta una concentración final de 50 unidades/ml, y la mezcla se incuba a 37 °C en C02 5% durante dos días adicionales. (3) En el séptimo día, se agrega mitomicina C a una concentración de 50 microgramos /ml para detener el crecimiento de un cultivo de células dendríticas diferenciadas. La solución ee incuba durante 60 minutos a 37°C en CO: 5%. Las células dendríticae se recolectan al raspar suavemente las células adherentes del fondo del matraz con un raspador de células . Las células adherentes y no adherentes se centrifugan después a 600G durante 5 minutos, se lavan en DPBS y se cuentan. (4) Las células dendríticas preparadas se colocan en un arreglo de fondo redondo de 96 pozos a 2 x lOVpozo en un volumen total de 100 microlitroe. Se preparan células T CD4+ a partir de alícuotas congeladas de las muestras de célula sanguínea periférica utilizada para preparar las células dendríticas utilizando el equipo Cellect CD4+ humano (Biotex) como lo indican las instrucciones de los fabricantes, c'on las siguientes modificaciones: las alícuotas se calientan y se lavan de manera que aproximadamente 10ß células se aplicarán por columna Cellect; las células se resuspenden en 4 ml de DPBS y 1 ml de reactivo Cell del equipo Cellect, la solución se mantiene a temperatura ambiente durante 20 minutos. La solución resultante se centrifuga durante 5 minutos a 600G a temperatura ambiente y el sedimento se resuepende en 2 ml de DPBS y se aplica a las columnas Cellect. El efluente de las columnas se recolecta en suero humano 2% en DPBS. La solución resultante de células CD4+ se centrifuga, se resuspende en medio AIM V y se cuenta la densidad.

La suspensión de células T CD4+ se resuspende hasta una cuenta de 2 x l06/ml en medio AIM V para facilitar la manipulación eficiente de la placa de 96 pozos. Se prepara un antígeno peptídico a partir de una solución concentrada 1 M en DMSO por dilución en medio AIM V en una relación 1:10. Se colocan en cada pozo 10 microlitros de la solución concentrada de la placa de 96 pozos que contiene; células dendríticas diferenciadas. Se agregan adicionalmente; a cada pozo 100 microlitros de la solución de células T CD4-^ diluida como se prepara antes. Los controles útiles incluyen blancos de DMSO diluidos, y controles positivos de toxoides del tétanos . Las concentraciones finales en cada pozo, a 10 microlitros de volumen total, son como sigue: 2 x 105 de CD4+ 2 x 104 de células dendríticas (R:S de 10:1) 5 mM/104 de péptido E-j emplo 2 Identificación de epitopos de células T en proteasa de subtilisina de Bacillus lentus v subtilisina humana Se preparan péptidos para uso en el ensayo descrito en el Ejemplo 1 en base en la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacill ue l en tus y subtilisina humana. Loe antígenos peptídicoe ee diseñan como sigue. A partir de una secuencia de aminoácidos de longitud completa ya sea de subtilisina humana o de proteasa de Ba ci l l u e l en t u s proporcionada en la figura 1, se preparan sintéticamente cadenas de '15 unidades, cada cadena de 15 unidades se superpone con la cadena de 15 unidades previa y subsecuente, excepto po:r tres residuos . Los péptidos utilizadoe corresponden a las cadenas de residuos de aminoácidos en Ba ci l l us l en t us como se proporcionan en la figura 7, y los péptidos corresponden a loe residuoe de aminoácidos en subtilisina humana, como se; proporcionan en la figura 8. En la figura 10 se proporciona la clave para los resultados codificados. Todas las pruebas se; realizan por lo menos por duplicado. Todas las pruebas presentadas muestran respuestas de control positivo robusto para el toxoide de tétanos antigénico. Las respuestas se: promedian dentro de cada experimento, y después se normalizan con una respuesta de línea de base. Se registra un resultado positivo ei la respuesta es de por lo menos 3 veces la respuesta de línea de base. La respuesta inmunogénica (es decir, proliferación de células T) para los péptidos preparados a partir de; subtilisina humana y de Ba ci l l us l en t us se adapta y s e proporciona en lae figuras 4 y 5, respectivamente. La proliferación de células T se mide por el método de tritio incorporado. Los resultados que se muestran en las figuras 4 y 5 como una comparación de la respuesta aditiva inmunogénica en 10 individuos (figura 4) y en 16 individuos (figura 5) a les diversos péptidos. La respuesta está indicada como la respuesta agregada, en donde 1.0 es igual a la respuesta de línea de base para cada muestra. Por lo tanto, en la figura 4, una lectura de 10.0 o menoe es la respuesta de línea de base, y en la figura 5, una lectura de 16.0 o menos, es la respuesta de línea de base. Como se indica en las figuras 4 y 5, la respueet inmunogénica de muestras de sangre no expuesta de individuos no sensibilizados muestra una respuesta alergénica marcada en el fragmento peptídico de Bacill ue lentue que corresponde a los residuoe 170-173 de la proteaea de Bacill ue amylol iquefaci ene . Como se esperaba, el fragmento correspondiente en subtilisina humana induce únicamente una respuesta de línea de base. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, ee reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : .

1. Un método para reducir la alergenicidad de una proteína no humana en donde se identifica un epitopo y ee sustituye con una región análoga dentro de la subtilieina humana .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína no humana comprende una proteasa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el epitopo es sustituido es un epitopo de célula T.

4. Un método para producir proteína de la invención, que tiene alergenicidad reducida, caracterizado porque comprende, preparar una proteína mutante al modificar un ADN que codifica para una proteína precursora de manera que el ADN codificado codifica para la proteína mutante de la invención, en donde el epitopo es sustituido con una región análoga de subtilisina humana.

5. Una proteína mutante, caracterizada porque tiene alergenicidad reducida, producida de conformidad con el método de la reivindicación 4.

6. Un ADN, caracterizado porque codifica para la proteína- mutante de conformidad con la reivindicación 5.

7. Un vector de expresión, caracterizado porque contiene una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 6.

8 . Células huéspedee , caracterizadas porque eetán t rans f ormada s con l o s ve c t ore s de c onf ormidad c on l a reivindicación 7 .

9. Un método para producir una proteína que tiene alergenicidad reducida, en donde se cultivan las células huéspedes de conformidad con la reivindicación 8, bajo condiciones las cuales resultan en la expresión de la proteasa mutante.

10. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende subtilisina humana.

11. Un ADN, caracterizado porque codifica para subtilieina humana.

12. Un vector, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 11.

13. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 12.

14. Una subtilieina humana, caracterizada porque; produce por la célula huésped de conformidad con la reivindicación 12.