CN1302113C - 在人体内具有较低过敏原性反应的突变体蛋白质以及构建、鉴定和生产这些蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种经过改进的新型蛋白质，它与该突变体的亲代相比在人体内产生较低的过敏原反应。具体地说，本发明包括中和或降低T-细胞识别表位的能力并因此防止了个体对该蛋白质敏感。

Description

在人体内具有较低过敏原性反应的突变体蛋白质以及构建、 鉴定和生产这些蛋白质的方法
                    发明背景
A.发明领域
本发明涉及在接触这些蛋白质的人体内产生较低过敏原性反应的蛋白质，以及预测这类反应的试验。更具体地说，本发明涉及一种经过改良的新型蛋白质突变体，它与这类蛋白质突变体的前体相比，在通过接触被该蛋白质致敏的人体中产生非常低的过敏原性反应。
B.技术背景
将蛋白质用于工业、制药业和商业应用越来越盛行。结果，由于这种盛行，越来越多的接触致使一些人因对这些肽的致敏作用而产生了一些安全危险，因此随后的接触将导致严重的过敏反应，这可能是有害并且甚至是致命的。例如，已知蛋白酶在一些个体中产生危险的过敏症。结果，尽管蛋白酶在工业，例如在洗衣店洗涤剂、化妆品、纺织品处理等等方面有用，并且在该领域进行的大量研究证明经过改良的蛋白酶例如在去垢力条件下具有更有效的去污能力，但是在工业上使用蛋白酶的问题在于其能够在一些人体内产生过敏的过敏原性反应。
为了消除这些问题已做了大量工作。在探究降低蛋白酶使用的免疫原性潜能的策略中，已改进生产方法，通过控制车间载有气载蛋白酶的尘粒或气雾的浓度和使其最小化来减少潜在接触；改进造粒方法，降低实际由蛋白酶产品产生的粉尘或气雾的量；以及改进回收方法，降低最终产品中的潜在过敏原性污染物。然而，降低蛋白酶过敏原性的努力本身相当不成功。另外，已进行尝试以在过敏个体中掩蔽被免疫球蛋白E(1gE)识别的蛋白酶的表位(PCT公开号WO92/10755)或通过将聚合物或肽/蛋白质附着在有问题的蛋白酶上来扩大或改变抗原决定簇的性能。
当适应性免疫反应以夸大或不相称的形式发生时，经受该反应的个体被认为是过敏。过敏反应是正常有益免疫反应不适当作用的结果并且有时导致炎性反应和组织损害。它们可以通过许多抗原激发；并且过敏反应的产生一个个体与下一个个体之间不同。虽然在第一次与抗原接触时过敏反应未正常地表现出来，但是通常在以后的接触中出现。过敏反应的一种形式是当抵抗无害环境抗原，如花粉、尘螨或动物皮屑介导lgE反应时发生的。通过lgE致敏的肥大细胞的药物介质的最终释放产生伴随例如哮喘或鼻炎症状的急性炎性反应。
然而，包括修饰lgE位点的策略通常不能成功地防止最初致敏反应的发生。因此，这些策略，尽管可以中和或减轻以后过敏反应的严重程度，但是不会降低实际致敏的人数。例如，当已知一个人对某种抗原过敏时，处理这种情况的常规并且唯一安全的方式是尽可能地将该过敏人与该抗原分开。事实上，任何其它行为对过敏个体的健康都将是有害的。因此，尽管降低特定蛋白对过敏个体的危害是很重要的，但是为了工业目的提供一种首先不能引发过敏反应的蛋白质应更有价值。
T-淋巴细胞(T-细胞)在诱导和调节免疫反应以及执行免疫效应器功能中起着关键作用。已知抗传染性试剂和肿瘤的特异性免疫依赖这些细胞并且据信它们有利于伤口愈合。另一方面，缺乏对这些反应的控制可能导致自身攻击。通常，以抗原呈递细胞的形式向T-细胞呈递抗原，这些呈递细胞通过各种细胞表面机制以适宜抗原被该T-细胞识别的方式捕捉和显示抗原或部分抗原。通过这些T-细胞表面上的受体(T-细胞受体)对特异表位的识别，这些T-细胞开始一系列复杂的相互作用，包括增殖，它导致通过B-细胞产生抗体。尽管T-细胞和B-细胞都通过存在于给定蛋白质或肽上的抗原表位活化，但是通过这些单核细胞识别的实际表位通常不同。实际上，活化T-细胞以引发产生免疫多样性的该表位通常与后来在免疫反应过程中通过B-细胞识别的表位完全不同。因此，在过敏性方面，尽管在T-细胞和抗原之间的特异抗原相互作用是引发抗原接触的免疫反应的关键因素，但是相互作用的特异性，即所识别的表位经常与接下来的全面过敏反应的发展无关。
PCT公开号WO96/40791公开了一种使用聚烯化氧为原料生产具有降低的过敏原性的聚烯化氧-多肽共轭物的方法。
PCT公开号WO97/30148公开了一种具有降低的过敏原性的多肽共轭物，包括具有两个或多个多肽分子共价偶联于其上的聚合载体分子。
PCT公开号WO96/17929公开了一种生产具有降低的过敏原性的多肽的方法，包括将1-30个多分子共轭到亲代多肽上的步骤。
PCT公开号WO92/10755公开了一种在动物体内引起降低的免疫原性反应的蛋白质变异体的生产方法。在该申请中，使用感兴趣的蛋白质、一系列蛋白酶及其变异体免疫大鼠。然后使用这些大鼠的血清测定在免疫的血清中已经产生并存在其中的多克隆抗体对这些感兴趣的蛋白质和其变异体的反应性。由这些结果可以测定制品中的抗体是否相对或多或少地与该蛋白质和其变异体反应，因此对蛋白质的改变可能中和或降低该lg结合的能力进行分析提供可能。从对大鼠的这些试验中，在枯草杆菌蛋白酶309个残基上相应于127、128、129、130、131、151、136、151、152、153、154、161、162、163、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、186、193、194、195、196、197、247、251、261的任意变化将导致该免疫潜能的改变，由此得出结论。
PCT公开号WO94/10191公开了包括亲代单体蛋白质的低聚形式的低过敏原性蛋白质，其中该低聚体大致保留了其活性。
现有技术已提供了降低某些蛋白质的过敏原性和鉴定在某些个体内造成过敏反应的表位的方法，用于鉴定这些表位的试验通常包括测定预先接触该抗原的血清中lgE和lgG抗体。不过，一旦引发lg反应，就已发生致敏作用。因此，需要一种测定首先造成致敏作用的表位的方法，由于中和这些表位明显地几乎不可能引起致敏作用发生，因此降低了开始致敏作用的可能性。
                        发明简述
本发明的目的是提供一种与前体蛋白质相比具有造成人体中过敏原性反应的降低的潜能的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种在如洗涤剂和/或防止缩绒的毛织物处理的普通蛋白酶应用、条皂或液体皂应用、餐具护理剂、接触镜片清洗溶液或产品、肽水解、废物处理、如抗缩绒的纺织品应用、化妆品制剂和皮肤护理、或作为蛋白质生产中的融合-裂裂酶中具有有用活性的蛋白酶变异体，由于蛋白酶变异体的降低的过敏原性潜能，这使得它能够更安全地使用。
根据本发明，提供了一种鉴定蛋白质内T-细胞表位的方法。本发明提供了一种如下鉴定表位的试验：将抗原呈递细胞与原初人T-细胞和感兴趣的肽混合。在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种方法，其中T-细胞表位的识别包括以下步骤：(a)从单一血源获得树突状细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(b)在所述树突状细胞溶液中启动分化；(c)将所述经过分化的树突状细胞溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液与感兴趣的肽混合；(d)测定所述步骤(c)中的T-细胞增殖。
根据本发明的另一实施方式，提供了一种蛋白质，其中为了降低或优选中和(消除)该T-细胞鉴定该表位的能力，对T-细胞表位加以修饰。因此，提供了一种具有降低的过敏原性的蛋白质，其中所述蛋白质包括将经鉴定为T-细胞表位内的氨基酸残基取代或缺失的修饰。根据一优选实施方式，在蛋白质和肽中测定表位，当通过T-细胞识别该肽时，使得T-细胞增殖大于其基线。然后对这种T-细胞表位进行修饰，以便当含有该表位的肽在本发明的试验中经过分析时，它比含未经过修饰的表位的蛋白质的增殖少。更优选地是，待修饰的表位产生大于样品中基线T-细胞增殖的3倍。当经过修饰时，该表位产生不到T-细胞基线3倍的增殖，优选不到T-细胞基线2倍的增殖和最优选低于或等于样品中T-细胞基线的增殖。
优选地是，该表位以以下方式之一进行修饰：(a)将该表位的氨基酸序列用来自感兴趣蛋白质的人同系物的类似序列替换，即人枯草杆菌蛋白酶或来自枯草杆菌蛋白酶样分子如弗林蛋白酶或kexin的另一人蛋白酶(参见例如Methods in Enzymology，第244卷(1994)第175页如下述；Roebroek等人，EMBO J.第5卷第9册第2197-2202页(1986)；Tomkinson等人，Biochem.第30卷第168-174页(1991)；Keifer等人，DNA and CellBiol.第10卷第10册第757-769页(1991))；(b)将该表位的氨基酸序列用来自感兴趣蛋白质的非人同系物的类似序列替换，由于T-细胞识别，因此该类似序列产生的过敏原反应比感兴趣的蛋白质少；(c)将该表位的氨基酸序列用大致模仿该表位的主要三级结构属性的序列替换，但是由于T-细胞识别，因此它产生的过敏原反应比感兴趣的蛋白质少；或(d)由于T-细胞识别，使用比感兴趣的蛋白质产生更小过敏原反应的任意序列。
在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种含有在BPN’内相应残基170、171、172和/或173的位点上至少一个氨基酸替换的蛋白酶变异体，其中这些替换包括将残基170修饰为天冬氨酸、将残基171修饰为谷酰胺、将残基172修饰为蛋氨酸和/或将残基173修饰为天冬氨酸。在一个最优选的实施方式中，该氨酸包括将残基170、171和173分别修饰为天冬氨酸、谷酰胺和天冬氨酸。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种生产具有降低的过敏原性的本发明的蛋白质的方法。优选地是，通过修饰编码前体蛋白质的DNA以便该经过修饰的DNA编码本发明的突变体蛋白质来制备突变体蛋白质。
在本发明的另一实施方式中，提供了编码突变体蛋白质的DNA序列，以及含有这些DNA序列的表达载体和用这些载体转化的宿主细胞，其中宿主细胞优选能够表达该DNA以在胞内或在胞外产生本发明的突变蛋白质。
将本发明的突变蛋白质用于通常已知该前体蛋白质所用的任意组合物或方法中。例如，如果该蛋白质为蛋白酶，可以将该降低了过敏原性的蛋白酶用作清洗产品如洗衣店洗涤剂和硬表面清洗剂中的组分，用作皮革制备中、织物如毛织物和/或丝织品的处理中减少缩绒的助剂，作为身体护理、化妆品或面霜产品中的组分，以及作为动物或宠物饲料中的组分以提高该饲料的营养价值。类似地，如果该蛋白质为淀粉酶，可以将该降低过敏原性的淀粉酶用于淀粉的液化作用，用作餐具洗涤剂中的组分，用于纺织品的脱浆，用于洗衣店洗涤剂或使用淀粉酶的任意其它用途。
本发明的一个优点在于通过测定因T-细胞表位识别的T-细胞增殖，可以鉴定含引起最初致敏个体的表位的肽。即，因T-细胞表位识别的T-细胞增殖使得个体对该肽或含其的蛋白质致敏。这些“致敏”T-细胞表位的中和将不可避免地使操作或否则接触含该表位的抗原的人群获得较大程度的安全性，这是因为他们最初没有被致敏，因此防止了因以后接触该抗原时产生以过敏反应为特点的lg抗体。
本发明的一个优点是包括酶的蛋白质的制备，可以在使所接触的个体致敏的危险性明显减少的情况下使用它。这样，例如可以更安全地将本发明的蛋白质用于例如面霜的化妆品、例如洗衣店洗涤剂的洗涤剂、硬表面清洗组合物和预洗涤组合物或蛋白质的任意其它用途，包括酶，其中人的接触不可避免。
                    附图简述
图1A、B1、B2和B3描述了解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(BPN’)的DNA(SEQ ID：NO 1)和氨基酸(SEQ ID：NO 2)序列和该基因的部分限制图。
图2描述了来自解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID：NO 3)和迟缓芽孢杆菌(野生型)(SEQ ID：NO 4)的枯草杆菌蛋白酶中保守的氨基酸残基。
图3A和3B描述了来自解淀粉芽孢杆菌(BPN’)、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(SEQ ID：NO 5)和迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶的氨基酸序列对比。符号*表示与枯草杆菌蛋白酶BPN’相比缺少特异氨基酸残基。
图4描述了16个外周单核血样对相应于迟缓芽孢杆菌蛋白酶的肽的加性T-细胞反应。肽E05含有包括相应于来自解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶内170-173的残基的区域。
图5描述了相应于人枯草杆菌蛋白酶分子的肽的10外周单核血样的加性T-细胞反应。肽F10、F9、F8和F7在图3的序列对比中都含有相应于包括相应于来自解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶内170-173的残基的区域的氨基酸序列DQMD。
图6A和6B/6C描述了相应于分别得自迟缓芽孢杆菌蛋白酶和人枯草杆菌蛋白酶的序列的肽的氨基酸链。
图7描述了人枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID：NO 6)。
图8描述了BPN’(解淀粉芽孢杆菌)蛋白酶、SAVINASE(迟缓芽孢杆菌)蛋白酶和人枯草杆菌蛋白酶(S2HSBT)的氨基酸序列对比。
图9描述了得自从已知对迟缓芽孢杆菌蛋白酶过敏的个体中取出的样品中的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的肽的T-细胞反应。肽E05代表相应于来自解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶中的170-173的区域。
图10描述了放置在从已知对迟缓芽孢杆菌蛋白酶过敏的个体中获得的样品中的该E05迟缓芽孢杆菌蛋白酶肽的不同丙氨酸替换的T-细胞反应。
                    发明详述
根据本发明，提供了一种鉴定T-细胞表位的方法。本发明提供了一种如下鉴定表位的试验：将经过分化的树突状细胞与原初人CD4+和/或CD8+T-细胞以及与感兴趣的肽混合。更具体地说，提供了一种方法，其中识别T-细胞表位包括步骤：(a)从单一血源获得树突状细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(b)在所述树突状细胞溶液中启动分化；(c)将所述经过分化的树突状细胞和所述原初CD4+和/或CD8+T-细胞的溶液与感兴趣的肽混合；(d)测定所述步骤(c)中的T-细胞增殖。
根据本发明的试验的待分析的感兴趣的肽来自希望或需要降低过敏原性的蛋白质或酶。在本发明的实践中，可以精确鉴定能够造成个体或个体样品致敏的表位的位置。在本发明的特别有效的实施方式中，制备了一系列相应于所有或部分蛋白质或酶的肽低聚物。例如，生产的肽文库覆盖相关部分或所有蛋白质。生产肽的一个特别有用的方式是将重叠序列引入肽文库中，例如，生产相应于主题蛋白质的氨基酸序列1-10的第一个肽，相应于主题蛋白质的氨基酸序列4-14的第二个肽，相应于主题蛋白质的氨基酸序列7-17的第三个肽，相应于主题蛋白质的氨基酸序列10-20的第四个肽等等，直到产生相应于整个分子的代表性肽。通过在本文提供的试验中各个地分析每个肽，可以精确地鉴定T-细胞所识别的表位的位置。在上面的实施例中，比邻居反应程度大的一个特异肽的反应将帮助鉴定三个氨基酸内的表位锚状区域。在确定这些表位的位置之后，可以改变每个表位中的氨基酸直到该肽产生明显小的T-细胞反应。
本文中所用的“抗原呈递细胞”意思是可通过T-细胞表面上的受体识别的表面上呈递抗原的免疫系统的细胞。抗原呈递细胞的例子有树突状细胞、交错突细胞、活化B-细胞和巨噬细胞。
本文中所用的“T-细胞增殖”意思是T-细胞与抗原呈递细胞在有或没有抗原的培养过程中产生的T-细胞数。
本文中所用的“基线T-细胞增殖”意思是在没有肽或蛋白质抗原的情况下响应接触抗原呈递细胞的个体中正常见到的T-细胞增殖。为此本文在每个个体的每个样品中测定基线T-细胞增殖水平为在没有抗原的情况下响应抗原呈递细胞的T-细胞的增殖。
“T-细胞表位”意思是在起动针对含该抗原的肽的免疫反应时T-细胞受体所识别的肽或蛋白质的特征。通过T-细胞的T-细胞表位的识别通常被认为是经过一种机制，其中T-细胞识别结合在抗原呈递细胞上表达的I型或II型主要组织相容性(MHC)分子上的抗原的肽片段(参见例如，Moeller，G.编辑的Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses，Immunological Review第98卷第187页(Copenhagen；Munksgaard)(1987))。
然后将根据本文提供的试验测定的表位经过修饰以降低感兴趣的蛋白质的过敏原潜能。在一个优选实施方式中，待修饰的表位产生的T-细胞增殖水平大于样品中基线T-细胞增殖3倍。当经过修饰时，该表位产生的T-细胞增殖水平不到基线增殖3倍，优选不到该基线增殖2倍并最优选低于或基本上等于样品中的基线增殖。
优选地是，以以下方式之一修饰该表位：(a)将该表位的氨基酸序列用来自感兴趣蛋白质的人同系物的类似序列替换；(b)将该表位的氨基酸序列用来自感兴趣蛋白质的非人同系物的类似序列替换，由于T-细胞表位识别，因此该类似序列产生比感兴趣的蛋白质的序列少的过敏原反应；(c)将该表位的氨基酸序列用大致模仿该表位的主要三级结构属性的序列替换，但是由于T-细胞表位识别，因此它产生比感兴趣的蛋白质少的过敏原反应；或(d)由于T-细胞表位识别，使用产生比感兴趣的蛋白质少的过敏原反应的任意序列。
本文所用的“样品”包括原初，即未被所述抗原致敏的单核细胞。
本文所用的“同系物”意思是具有与感兴趣的蛋白质相似的催化作用、结构和/或用途的蛋白质或酶。希望找到一种同系物，它具有与感兴趣的蛋白质相似的三级和/或一级结构，当用来自该同系物的类似片段替换感兴趣的蛋白质的表位时会降低这种变化的破坏性。因此，高度同源的酶会提供最想要的表位替换来源。或者，如果可能的话，有益是寻找对给定蛋白质的人类似物。例如，用来自枯草杆菌蛋白酶的人类似物(即人枯草杆菌蛋白酶)的序列将细菌枯草杆菌蛋白酶的特异表位替换应使细菌蛋白质中的过敏原性减少。
“类似”序列可以通过确保替换氨基酸在该表位或附近显示出与感兴趣的蛋白质中氨基酸相似的功能、三级结构和/或保守残基来测定。因此，在含表位区域的地方，例如α-螺旋或β-折叠结构，替换氨基酸会保留其特异结构。
尽管本发明延伸到希望降低过敏原性的所有蛋白质，为了简明起见，以下将描述本发明特别优选的实施方式，蛋白酶的修饰。蛋白酶为羰基水解酶，它通常起分开蛋白质或肽中肽键的作用。正如本文所用的，“蛋白酶”意思是天然存在的蛋白酶或重组蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括α-氨酰基肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰氨基水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、硫醇蛋白酶、羧蛋白酶和金属蛋白酶。还包括丝氨酸、金属、硫醇和酸性蛋白酶，以及内切和外切-蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶为细菌或霉菌蛋白酶，通常起分开蛋白质或肽的肽键的作用。正如本文所用的，“枯草杆菌蛋白酶”意思是天然存在的枯草杆菌蛋白酶或重组枯草杆菌蛋白酶。一系列天然存在的枯草杆菌蛋白酶的生产为已知并且经常通过各种微生物种分泌。该系列成员的氨基酸序列不完全同源。但是，该系列的枯草杆菌蛋白酶呈现出相同或相似类型的蛋白水解活性。这类丝氨酸蛋白酶具有限定催化三联体的共有氨基酸序列，该催化三联体将它们与胰凝乳蛋白酶相关类型的丝氨酸蛋白酶区分开。这些枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶都具有包括天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。在这些枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶中，这些氨基酸的相应顺序从氨基到羧基末端为天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。然而在胰凝乳蛋白酶相关的蛋白酶中，该相应顺序为组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。因此，本文的枯草杆菌蛋白酶是指具有枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。例子包括但不限于本文图3中描述的枯草杆菌蛋白酶。通常并为了本发明目的，蛋白酶中氨基酸的编号相应于图1中所示的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草芽孢杆菌序列指定的编号。
“重组枯草杆菌蛋白酶”或“重组蛋白酶”是指编码枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列经修饰以生产编码天然存在的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入的变异体(或突变体)DNA序列的枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶。产生这种修饰并且可以与本文公开的那些组合的适宜方法包括US4760025(RE34606)、US5204015和US5185258中公开的那些。
“非人枯草杆菌蛋白酶”和编码它们的DNA可以从许多原核和真核生物体中获得。原核生物体的适宜例子包括例如大肠杆菌或假单胞菌属的革兰氏阴性生物体和例如微球菌或来自杆菌属的革兰氏阳性菌。可以从其中获得枯草杆菌蛋白酶和其基因的真核生物的例子包括例如酵母属的酵母、例如曲霉属种的霉菌。
“人枯草杆菌蛋白酶”意思是具有枯草杆菌蛋白酶类催化活性的人起源的蛋白质，例如来自kexin人家族获得的蛋白酶。这种蛋白质的例子通过图7的序列表示。此外，人枯草杆菌蛋白酶的衍生物或同系物，包括例如小鼠或兔的非人源的那些，它们保留了水解肽键的必要能力并与图7的蛋白质具有至少50％，优选至少65％和最优选80％的同源性，被认为是用于本发明的人枯草杆菌蛋白酶。
“蛋白酶变异体”具有从“前体蛋白酶”的氨基酸序列获得的氨基酸序列。该前体蛋白酶包括天然存在的蛋白酶和重组蛋白酶。该蛋白酶变异体的氨基酸序列从前体蛋白酶氨基酸序列通过取代、缺失或插入前体氨基酸序列中的一个或多个氨基酸来“获得”。这种修饰是编码前体蛋白酶的氨基酸序列的“前体DNA序列”的而不是前体蛋白酶本身的操作。这种操作前体DNA序列的适宜方法包括本文公开的方法，以及本领域技术人员已知的方法(参见例如，EP0328299、WO89/06279和本文已经参考过的US专利和申请)。
本文中所用的氨基酸位置编号是指图1所示成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶序列所指定的编号。但是本发明并不限于该特定枯草杆菌蛋白酶的突变，而是可以延伸到在位置含有与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中具体鉴定的残基“等价”的氨基酸残基的前体蛋白酶。在本发明的一个优选实施方式中，该前体蛋白酶为迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，并且在迟缓芽孢杆菌的相应上面所列的等价氨基酸残基处进行取代、缺失或插入。
如果前体蛋白酶与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中的特异残基或部分残基或者为同源(例如，在一级或三级结构中的相应位置)或者类似(即，具有相同或相似的化学组合、反应或相互作用的功能能力)，那么其残基(氨基酸)与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的残基等价。
为了确立与一级结构同源，将前体蛋白酶的氨基酸序列直接与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶一级序列对比并特别与序列为已知的枯草杆菌蛋白酶中已知不变异的一组残基对比。例如，本文图2显示了解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶之间保守的残基。对比保守的残基之后，为了达到序列对比的目的允许必要的插入和删除(即，避免保守的残基通过文库删除或插入而消除)，在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中确定与特定氨基酸等价的残基。保守的残基的序列对比优选应保留100％的这些残基。但是，大于75％或小到50％的保守残基的序列对比也适宜确定等价残基。催化三联体Asp32/His64/Ser221的保留应保持。
例如，可以对比来自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列以在氨基酸序列之间提供最大量的同源性。这些序列的比较显示出每个序列中所含的保守残基的数目。BPN’和迟缓芽孢杆菌之间的保守残基描述在图2中。
因此可以将这些保守的残基用于例如来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(1989年7月13日公开的PCT申请WO89/06279)，本文中优选的蛋白酶前体酶，或与优选迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶高度同源并称之为PB92的枯草杆菌蛋白酶(EP0328299)的其它枯草杆菌蛋白酶中以确定解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的相应等价氨基酸残基。其中这些枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的序列对比在图3A和3B中以产生保守残基的最大同源性。由此可以看出，与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相比，在迟缓芽孢杆菌的序列中有许多缺失。因此，例如在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中的Val165在其它枯草杆菌蛋白酶中的等价氨基酸对迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌来说是异亮氨酸。
因此，例如在解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中在位置+170的氨基酸都是赖氨酸(K)，在酒维奈斯中是精氨酸(R)。但是，在本发明的蛋白酶变异体的一个实施方式中，在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中与+170等价的氨基酸用天冬氨酸(D)替换。在本发明的所有氨基酸的缩写和字母代码与专利用户手册(GenBank，Mountain View，CA)1990第101页中一致。
“等价残基”也可以通过在已通过X-射线结晶分析法测定出三级结构的前体蛋白酶的三级结构水平下测定同源性来确定。等价残基被定义为其中前体蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定氨基酸残基的2个或多个主链原子的原子坐标(N-N、CA-CA、C-C和O-O)在序列对比之后在0.13nm以内并优选为0.1nm。在最好模型已定向和定位以获得正在讨论的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶中非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠之后完成对比。最好模型是在可获得的最高图形分辨率下获得试验衍射数据的最低R因子的结晶模型。
与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基功能相似的等价残基被定义为前体蛋白酶的那些氨基酸，它们可以采用一形态以便它们以确定和属于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基的方式或者改变、修饰或者对蛋白质结构、底物结合或催化有利。而且，它们是占据类似位置到一定程度的前体蛋白酶的那些残基(为此通过X-射线结晶分析法已获得三级结构)，尽管所给残基的主链原子不可能满足以占据同源位置为基础的等价标准，但是残基侧链原子中至少两个的原子坐标在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的相应侧链原子的0.13nm以内。解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的三维结构的坐标在EP0251446(与US5182204相同，将其公开的内容加入本文作为参考)中有阐述，并且如上所概括的可以用于测定在三级结构水平上的等价残基。
考虑到没有其它残基，被鉴定用于替换、插入或删除鉴定的一些残基是保留残基。在有未经过保留的残基的情况下，一个或多个氨基酸的替换被限制在产生具有与天然发现的不一致的氨基酸序列的变异体的替换上。在有经过保留的残基的情况下，这些替换不应获得天然存在的序列。本发明的蛋白酶变异体包括蛋白酶变异体的成熟形式，以及这些蛋白酶变异体的酶原-和酶原前体-形式。由于该酶原前体形式有利于蛋白酶变异体表达、分泌和成熟，因此它是优选结构。
“前序列”是指连接在蛋白酶成熟形式的N-末端部分的氨基酸序列，当除去时它获得蛋白酶“成熟”形式的外观。实际上发现许多蛋白水解酶为翻译酶原产品，并且在没有翻译后加工的情况下以这种方式表达。尽管可以使用其它蛋白酶前序列，但是生产蛋白酶变异体的一个优选前序列是解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的公认前序列。
“信号序列”或“前序列”是指连接到蛋白酶N-末端部分或连接到可以参与蛋白酶的成熟或酶原形式的分泌的蛋白酶原N-末端部分的任意氨基酸序列。信号序列的这种定义是功能性的，意思是包括在原初条件下参与蛋白酶分泌完成的蛋白酶基因的N-末端部分编码的所有这些氨基酸序列。本发明利用这些序列完成本文所定义的蛋白酶变异体的分泌。一种可行的信号序列包括融合到来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的剩余信号序列的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前7个氨基酸残基(ATCC 21536)。
蛋白酶变异体的“酶原前体”形式由具有可操作地连接到蛋白酶的氨基末端的前序列的蛋白酶的成熟形式和可操作地连接到前序列的氨基末端的“前段”或“信号”序列组成。
“表达载体”是指含有可操作地连接在能够在适宜宿主中完成所述DNA表达的适宜调控序列上的DNA序列的DNA构建体。这些调控序列包括完成转录的启动子，控制这种转录的选择性操纵基因序列，编码适宜mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。该载体可以是质粒、噬菌粒或简单地一种潜在基因组插入片段。一旦转化进适宜宿主中，该载体可以复制并且功能不依赖宿主基因组，或者在某些情况下自身可以整合进基因组。在本说明书中，当质粒为目前最常用的载体形式时，“质粒”和“载体”有时可互换地使用。但是，本发明意欲包括这类功能相当且在本领域中为已知的表达载体的其它形式。
本发明所用的“宿主细胞”通常为优选已通过US4760025(RE34606)中公开的方法处理使其不能分泌酶促活性内切蛋白酶的原核和真核宿主。表达蛋白酶的优选宿主细胞是杆菌属菌株BG2036，它缺少酶促活性中性蛋白酶和碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)。在US5264366中详细描述了菌株BG2036的结构。表达蛋白酶的其它宿主细胞包括枯草芽孢杆菌I168(也在US4760025(RE34606)和US5264366中有描述，将其公开的内容加入本文作为参考)，以及任意适宜的杆菌菌株如地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌等。
使用用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这些经过转化的宿主细胞或者能够复制编码蛋白酶变异体的载体或者能够表达所需蛋白酶变异体。在有编码酶原-或酶原前体-形式的蛋白酶变异体的载体的情况下，当经过表达时，这些变异体典型地从宿主细胞分泌进宿主细胞培养基。
当描述两个DNA区域之间的关系时，“可操作地连接”简单地意思是它们在功能上彼此相关。例如，如果前序列起信号序列的功能，那么它可操作地与肽相连，参与最有可能涉及信号序列裂解的蛋白质的成熟形式的分泌。如果一启动子控制序列转录，那么它可操作地与编码序列相连；如果核糖体结合位点被定位以允许翻译，那么它可操作地与编码序列相连。
编码天然存在的前体蛋白酶的基因可以根据本领域技术人员已知的常规方法来获得。这些方法通常包括合成具有编码感兴趣蛋白酶区域的推定序列的标记探针，从表达蛋白酶的生物体中制备基因组文库，和通过杂交到探针上从该文库中筛选出感兴趣的基因。然后对阳性杂交克隆作图并测序。
为了表达蛋白酶，然后将克隆的蛋白酶用于转化宿主细胞。然后将该蛋白酶基因连接到高拷贝数质粒中。该质粒在宿主中复制，由于其含有质粒复制所需的已知元件：启动子，可操作地连接到正在讨论的基因上(如果它经宿主识别，即转录，那么它可以基因本身同源的启动子供应)，转录末端和聚腺苷酸化区域(在某些真核宿主细胞中为宿主从蛋白酶基因转录的mRNA的稳定所必需)，为外源的或由蛋白酶基因的内源终止子区域供应的，和所需的例如抗生素抗性基因的选择基因，该抗生素抗性基因能够通过在含抗生素的培养基中生长来保持质粒感染的宿主细胞连续培养维持。高拷贝数质粒还含有宿主的复制原点，因此使大量质粒能够在没有染色体限制的情况下在细胞质中产生。然而，将多拷贝的蛋白酶基因整合进宿主基因组也在本文的范围内。通过特别易于同源重组的原核和真核生物使其更便利。
在一个实施方式中，该基因可以是例如来自迟缓芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的天然基因。或者，可以生产编码天然存在的或突变体前体蛋白酶的合成基因。在这样一个试验中，测定前体蛋白酶的DNA和/或氨基酸序列。之后合成多个、重叠的合成单链DNA片段，它通过杂交和连接产生编码前体蛋白酶的合成DNA。合成基因构建体的例子在US5204015的实施例3中有陈述，将其公开的内容加入本文作为参考。
一旦克隆了天然存在或合成的前体蛋白酶基因，在合成天然存在的前体蛋白酶之外还经过大量修饰以提高该基因的用途。这些修饰包括产生US4760025(RE34606)和EP0251446中公开的重组蛋白酶并产生本文所述的蛋白酶变异体。
尽管可以使用其它方法，但是可以使用以下的序列盒诱变法容易地构建本发明的蛋白酶变异体。首先，获得编码蛋白酶的天然存在的基因并全部或部分测序。然后以希望在所编码的酶中在一个点上产生一个或多个氨基酸的突变(删除、插入或替换)来对该序列扫描。评价该点侧翼的序列限制位点的存在以便用表达时编码不同突变体的低聚核苷酸库替换该基因的短片段。这些限制位点优选在蛋白酶基因中为唯一位点以便容易替换该基因片段。然而，可以使用蛋白酶基因不过分冗长的任意适宜的限制位点，只要通过限制酶切消化产生的基因片段可以适当序列重装配。如果限制位点不在距离所选点适宜范围内的位置(10-15个核苷酸)，那么以最终构建体中既未改变阅读框也未改变所编码的氨基酸的形式通过替换基因中的核苷酸产生这些位点。根据一般已知的方法通过M13引物延伸实现为了改变其序列以符合所需序列的基因突变。通过遗传密码的丰余序列、基因的限制酶图谱和大量不同的限制酶常规地进行适宜侧翼区的定位和到达两个适宜限制位点序列所需的变化的评价的任务。应注明的是如果可获得常规侧翼限制位点的话，那么仅对不合该位点的侧翼区使用上述方法。
一旦克隆了天然存在的DNA或合成DNA，待突变的位点侧翼的限制位点用相关的限制酶消化，并且将大量末端互补的低聚核苷酸序列盒与该基因相连。由于可以合成所有低聚核苷酸以具有相同限制位点，并且产生限制位点不需要合成接头，因此通过该方法简化了该诱变。
在本发明的一个方面，目的是分泌与其前体蛋白酶相比具有改变的过敏原潜能的变异体蛋白酶，由于这种潜能降低，因此能够较安全地使用该酶。尽管本发明使用了较低的过敏原潜能，但是可以利用本文所述的突变与本领域已知的突变组合获得与前体相比改变了的热稳定性和/或改变了的底物特异性、改善了的活性或改变了的碱性稳定性。
因此，本发明旨在改变包括迟缓芽孢杆菌内的残基位置170-173的T-细胞表位诱导T-细胞增殖的能力。本发明的一个特别优选的实施方式包括对R170D、Y171Q和/或N173D中一个或者全部进行修饰。类似地，如上面详细讨论的，据信在任意蛋白酶中相应残基的修饰将导致蛋白酶中关键T-细胞位点中和。因此，与目前公开的在相当于氨基酸残基170-173的区域的突变组合，可以使用在相当于N76D/S103A/V104I/G159D的位置的替换与选择性地一个或多个选自由相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的V68A、T213R、A232V、Q236H、Q245R和T260A位置的组的替换组合，此外降低了本发明的变异体蛋白酶的过敏原潜能，调整了该酶的整体稳定性和/或蛋白水解活性。类似地，结合突变S103A/V104I/G159D并选择性地与一个或多个选自由相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的V68A、T213R、A232V、Q236H、Q245R和T260A位置的组的替换相结合，本文提供的替换可以与在迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中的等价位置+76的天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)组合。
本发明的最优选的实施方式包括相应解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的以下位置的特定替换残基的组合：
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/Q236H；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/Q236H/Q245R；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R；和
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A。尽管可以在任意杆菌属蛋白酶中进行这些替换，但是优选在迟缓芽孢杆菌(重组或原初型)枯草杆菌蛋白酶中进行这些替换。
以用变异体蛋白酶获得的筛选结果为基础，在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中的如上所述的突变对蛋白水解活性、这些酶的性能和/或稳定性和这些变异体酶的清洗和洗涤性能是重要的。
本发明的许多蛋白酶变异体可用于配制各种洗涤剂组合物。许多已知的化合物是用于含有本发明的蛋白酶突变体的组合物的适宜的表面活性剂。这些包括非离子、阴离子、阳离子、阴离子或两性离子洗涤剂，如Barry J.Anderson的US44041128和Jiri Flora等人的US4261868中所公开的。适宜的洗涤剂制剂是US5204015(前面已引入作为参考)的实施例7中所描述的。本领域对可以用作清洗组合物的不同制剂是熟悉的。除了典型清洗组合物之外，应易于理解为本发明的这些蛋白酶变异体可以用于使用原初或野生型蛋白酶的任意目的。因此，可以将这些变异体用于例如条皂或液体皂应用、餐具护理剂、接触镜片清洗溶液或产品、肽水解、废物处理、织物应用、作为蛋白质生产中的融合-裂裂酶，等等。除降低的过敏原性之外，本发明的变异体可以包括在洗涤剂组合物中的提高的性能(与该前体相比)。正如本文所用的，在洗涤剂中提高的性能被定义为是对例如草或血液的某些酶敏感的染色清洁力增强，它是在标准洗涤循环之后通过常规评价进行测定的。
可以将本发明的蛋白酶配制成在约0.01-约5wt％(优选0.1-0.5％)的水平下具有6.5-12.0的pH的已知粉状或液体洗涤剂。这些洗涤剂清洗组合物还可以包括例如已知蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶或内切糖苷酶的其它酶，以及助洗剂和稳定剂。
将本发明的蛋白酶添加到传统清洗组合物中不会带来任何特别的使用限制。换句话说，只要pH在上面的范围内并且温度低于所述蛋白酶的变性温度，那么适宜洗涤剂的任意温度和pH对本组合物都是适宜的。此外，可以将本发明的蛋白酶单独或与助洗剂和稳定剂组合用于没有洗涤剂的清洗组合物中。
本发明的变异体蛋白酶可以包含在动物饲料中，例如US5612055、US5314692和US5147642中所述的动物饲料添加剂部分。
本发明的一个方面是用于处理织物的含有本发明的变异体蛋白酶的组合物。可以将该组合物用于处理例如RD216034、EP134267、US4533359和EP344259申请中所述的丝物和毛线。
以下通过实施例加以陈述但不构成对权利要求书范围的限制。
根据本领域中公知的方法通过蛋白水解活性筛选这些变异体。优选的蛋白酶变异体包括在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的以下位置的多重替换：
N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/Q236H；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/Q236H/Q245R；
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R；和
V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A。
因此将本文参考的所有出版物和专利全文加入作为参考。
                    实施例
                    实施例1
        使用原初人T-细胞鉴定肽T-细胞表位的试验
从“原初”人，即已知没有接触迟缓芽孢杆菌蛋白酶或由其致敏的人中收集新鲜的人外周血细胞，用于测定来自迟缓芽孢杆菌和人枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶中的抗原表位。原初人意思是已知该个体在过去没有接触或发生对蛋白酶的反应。使用以下步骤制备外周单核血细胞(室温贮藏，不超过24小时)：将由1单位的全血制成的约30ml的血沉棕黄层溶液带到50ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中并分成2个试管。用12.5ml室温lymphoprep密度分离培养基(1.077g/ml的Nycomed密度)将这些样品覆盖。在600G下将这些试管离心分离30分钟。收集两相的界面、混合并在DPBS中冲洗。通过血细胞计数器测定所得溶液的细胞密度。通过台盼蓝排斥术测定活力。
用所得溶液，由溶液中具有108个细胞/75ml培养瓶的密度的外周血单核细胞样品按如下制备经过分化的树突状细胞培养物：
(1)将50ml无血清的AIM V培养基(Gibco)用1∶100稀释的β-巯基乙醇(Gibco)补充。将这些培养瓶在37℃下在5％CO2中平放2小时以使单核细胞粘附到瓶壁上。
(2)按如下将该单核细胞分化成树突状细胞：除去未粘着的细胞并将所得粘附着的细胞(单核细胞)与30ml的AIM V、800U/ml的GM-CSF(Endogen)和500U/ml的IL-4(Endogen)混合；将所得混合物在37℃和5％CO2的条件下培养5天。5天后，将细胞因子TNFα(Endogen)添加到0.2U/ml，并将细胞因子IL-1α(Endogen)添加到50U/ml的最终浓度并将混合物在37℃和5％CO2下培养2天以上。
(3)在第7天，添加丝裂霉素C并使其浓度达到50μg/ml以使目前经过分化的树突状细胞培养物停止生长。在37℃和5％CO2下将该溶液培养60分钟。通过用细胞刮棒轻轻从瓶底刮下粘着的细胞以收集树突状细胞。然后在600G下将粘着或未粘着的细胞离心分离5分钟，在DPBS中冲洗并计数。
(4)将所制得的树突状细胞以2×104/孔在100微升总体积的AIM V培养基中放置进96孔圆底板中。由用以制备该树突状细胞的外周血细胞样品的冷冻等分试样使用人CD4+Cellect Kit(Biotex)按每个厂商指导通过以下修饰制备CD4+T细胞：将这些等分试样复苏并冲洗，以便每个Cellect柱上样约108个细胞；将这些细胞再悬浮到4ml DPBS和1ml来自该Cellect Kit的细胞试剂中，将该溶液在室温下保持20分钟。所得溶液在600G下在室温离心5分钟并将沉淀再悬浮到2ml的DPBS中并上样到Cellect柱上。将来自该柱的洗脱物收集在2％人血清的DPBS中。将所得CD4+细胞溶液离心分离，再悬浮在AIMV培养基中并计算密度。
将该CD4+T-细胞悬浮液再悬浮到计数为2×106/ml的AIM V培养基中以便于在96孔板中有效操作。
在AIM V培养基中以1∶10的比例稀释从DMSO中的1M原液制备肽抗原。在含有分化过的树突状细胞的96孔板的每个孔中放置10微升的原液。再向每个孔中添加如上制备的100微升的稀释CD4+T-细胞溶液。有用的对照包括稀释DMSO空白和破伤风类毒素阳性对照。
在210微升总体积下每个孔中的最终浓度如下：
2×104CD+
2×105树突状细胞(R∶S为10∶1)
5mM的肽
                    实施例2
在来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶和人枯草杆菌蛋白酶中鉴定T-细胞表位
以迟缓芽孢杆菌和人枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列为基础制备用于实施例1中所述试验的肽。肽抗原的命名如下。由或者人枯草杆菌蛋白酶或者图1提供的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的全长氨基酸序列合成制备15聚体，除了3个残基之外将每个15聚体与前面或后面的15聚体重叠。
所用的肽相应于图8中提供的迟缓芽孢杆菌中的氨基酸残基链，并且肽相应于图7中提供的人枯草杆菌蛋白酶中的氨基酸残基。在图6中提供了相应于这些蛋白酶的所用的这些肽。至少以一式二份进行所有试验。报道的所有试验显示了针对抗原破伤风类毒素的强烈的阳性对照反应。在每个实验中将反应平均，然后对基线反应标准化。如果该反应为该基线反应的至少3倍，那么记录为阳性事件。
对来自人枯草杆菌蛋白酶和迟缓芽孢杆菌的经过制备的肽的免疫原性反应(即T-细胞增殖)经计数并分别提供在图4和5中。通过掺入氚的方法测定T-细胞增殖。图4和5中所示的结果是不同肽在10个个体(图4)和16个个体(图5)中的免疫原性加性反应的比较。反应示为加性反应，其中1.0等于每个样品的基线反应。因此，在图4中读数10.0或更少为基线反应并且在图5中读数16.0或更少为基线反应。
如图4和5所示，来自未致敏的个体的原初血样品的免疫原性反应在来自相应于解淀粉芽孢杆菌蛋白酶的残基170-173的迟缓芽孢杆菌的肽片段下显示出显著的过敏原反应。正如所希望的，人枯草杆菌蛋白酶中的相应片段仅引起基线反应。
图9显示了在从已知对迟缓芽孢杆菌蛋白酶过敏的个体获得的样品中来自迟缓芽孢杆菌蛋白酶的肽的T-细胞反应。肽E05代表了来自解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶中的相应于170-173的区域。如图9所示，过敏个体对该肽E05所代表的T-细胞表位的高度反应。该结果证明，通过进行根据本发明的该试验，可以预测通过过敏个体的T-细胞鉴定的主要表位。
图10显示了在从已知对迟缓芽孢杆菌蛋白酶过敏的个体获得的样品中来自迟缓芽孢杆菌蛋白酶的E05肽的不同丙氨酸替换的T-细胞反应。丙氨酸替换被用作为了测定表位中任意特定残基的作用的替换。图10的说明提到其中丙氨酸被替换的肽的位置，即在肽E06(序列GSISYPARYANAMAV)中，G-A＝2，S-A＝3，I-A＝4，S-A＝5，Y-A＝6，P-A＝7，R-A＝8，Y-A＝9，N-A＝10，M-A＝11和V-A＝12。如图10中所示，来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶中残基R170A、Y171A和/或N173A任一的替换导致过敏个体的血液样品中的反应大大降低。
由这些结果，很显然残基170、171和173在该肽中对T-细胞反应起着决定性作用。因此，显而易见的是这些残基是引发迟缓芽孢杆菌的蛋白酶内的过敏反应的主要原因。

Claims (10)

1.一种降低蛋白质的过敏原性的方法，包括下列步骤：
(a)通过下列方法鉴定所述蛋白质中的T-细胞表位；
(i)从单一血液样品获得树突状细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液，(ii)在所述树突状细胞溶液中启动分化；(iii)将所述经过分化的树突状细胞溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液与感兴趣的肽混合；(iv)测定所述步骤(iii)中的T-细胞增殖；
(b)修饰所述蛋白质以中和所述T-细胞表位。
2.权利要求1的方法，其中的蛋白质是蛋白酶。
3.根据权利要求1的方法，其中所述T-细胞表位是通过选自下列组的取代修饰的：
(a)用来自感兴趣的蛋白质的人同系物的类似序列取代所述T-细胞表位的氨基酸序列；
(b)用来自感兴趣的蛋白质的非人同系物的类似序列取代所述T-细胞表位的氨基酸序列；或
(c)用模仿该表位的三级结构特征的序列取代所述T-细胞表位的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的方法，其中所述T-细胞表位是通过用来自感兴趣的蛋白质的人同系物的类似序列取代T-细胞表位的氨基酸序列修饰的。
5.根据权利要求3的方法，其中所述T-细胞表位是通过用来自感兴趣的蛋白质的非人同系物的类似序列取代T-细胞表位的氨基酸序列修饰的。
6.根据权利要求3的方法，其中所述T-细胞表位是通过用模仿所述T-细胞表位的三级结构特征的序列取代该表位的氨基酸序列修饰的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白质是微生物的枯草杆菌蛋白酶。
8.根据权利要求7的方法，其中微生物的枯草杆菌蛋白酶衍生于芽孢杆菌。
9.根据权利要求8的方法，其中的芽孢杆菌选自迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
10.根据权利要求7的方法，其中所述微生物的枯草杆菌蛋白酶的T-细胞表位是通过下列方法修饰的：(a)将该表位的氨基酸序列用来自所述微生物的枯草杆菌蛋白酶的人同系物的类似序列替换；(b)将该表位的氨基酸序列用来自所述微生物的枯草杆菌蛋白酶的非人同系物的类似序列替换；或者(c)将该表位的氨基酸序列用模仿该表位的三级结构特征的序列替换。
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