ES2229703T3 - Procedimiento para la preparacion de mutantes de proteinas con una respuesta alergenica menor en seres humanos. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de mutantes de proteinas con una respuesta alergenica menor en seres humanos.Info
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Abstract
Un método para determinar epítopos de células T en una proteína, que comprende las etapas de: (a) obtener una solución de células dendríticas y una solución de células T ingenuas CD4+ y/o CD8+ de una única muestra de sangre humana; (b) estimular la diferenciación de la mencionada solución de células dendríticas; (c) combinar la mencionada solución de células dendríticas diferenciadas y las mencionadas células T ingenuas CD4+ y/o CD8+ con un péptido de interés; (d) medir la proliferación de células T en la mencionada etapa (c).
Description
Procedimiento para la preparación de mutantes de
proteínas con una respuesta alergénica menor en seres humanos.
La presente invención se refiere a un método para
proporcionar proteínas que producen una respuesta alergénica menor
en seres humanos expuestos a tales proteínas, y una prueba
predictiva de tal respuesta. Más específicamente, la presente
invención se refiere a la preparación de un nuevo mutante de
proteína mejorado que produce respuestas alergénicas muy bajas en
seres humanos sensibilizados a esta proteína mediante exposición
comparada con el precursor de tal mutante de proteína.
Cada vez predomina más la utilización de
proteínas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales.
Como resultado, la mayor exposición debida a esta predominancia ha
sido responsable de algunos riesgos relacionados con la seguridad
causados por la sensibilización de ciertas personas a esos péptidos,
con lo que la exposición subsiguiente causa reacciones alérgicas
extremas que pueden ser perjudiciales e incluso fatales. Por
ejemplo, se sabe que las proteasas causan una hipersensibilidad
peligrosa en algunos individuos. Como resultado, a pesar de la
utilidad de las proteasas en la industria, e.g. en detergentes para
ropa, cosméticos, tratamientos textiles, etc..., y la numerosas
investigaciones llevadas a cabo en el campo para proporcionar
proteasas mejoradas que tengan, por ejemplo, una eliminación más
eficaz de manchas bajo condiciones de detergencia, el uso de
proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad
para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos
humanos.
Se ha realizado mucho trabajo para paliar estos
problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el
potencial inmunogénico del uso de proteasas están los procedimientos
de producción mejorada que reducen el contacto potencial,
controlando y minimizando las concentraciones en el lugar de trabajo
de partículas de polvo o aerosol que llevan proteasas transportadas
por el aire, los procedimientos de granulación mejorados que reducen
la cantidad de polvo o aerosol producido en realidad a partir del
producto proteasa, y los procedimientos de recuperación mejorados
para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergénicos en
el producto final. Sin embargo, los esfuerzos para reducir la
alergenicidad de la proteasa, per se, han sido relativamente
poco fructíferos. Alternativamente, se han realizado esfuerzos para
ocultar epítopos en proteasas que se reconocen mediante
inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (Publicación
PCT Nº WO 92/10755) o para aumentar o cambiar la naturaleza de los
determinantes antígenos mediante la unión de polímeros o
péptidos/proteínas a la proteasa problemática.
Cuando ocurre una respuesta inmune adaptada en
forma exagerada o inapropiada, el individuo experimenta una reacción
denominada hipersensible. Las reacciones hipersensibles son
consecuencia de respuestas normalmente beneficiosas actuando
inapropiadamente y algunas veces causan reacciones inflamatorias y
daño de tejido. Estas pueden ser provocadas mediante muchos
antígenos; y la causa de la reacción hipersensible variará de un
individuo a otro. La hipersensibilidad en sí misma normalmente no se
manifiesta después del primer contacto con el antígeno, sino que
normalmente aparece después de contactos sucesivos. Una forma de
sensibilidad ocurre cuando una respuesta a IgE está dirigida contra
antígenos medioambientalmente inocuos, tales como polen, ácaros o
caspa animal. La producción resultante de mediadores farmacológicos
por parte de las células mástil sensibilizadas con IgE produce una
reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como el asma o la
rini-
tis.
tis.
De todas formas, una estrategia que comprenda
modificar los sitios de la IgE generalmente no será satisfactoria
para prevenir la causa de la reacción de sensibilización inicial. En
consecuencia, tales estrategias, aunque quizás neutralicen o
reduzcan la severidad de la reacción hipersensible subsiguiente no
reducirá el número de personas que en realidad están sensibilizadas.
Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensible a
cierto antígeno, la manera general y únicamente segura para tratar
esta situación es aislar la persona hipersensible del antígeno lo
más completamente posible. Ciertamente, cualquier otra acción podría
ser peligrosa para la salud del individuo hipersensible. Así,
mientras que es importante reducir el peligro de una proteína
específica para un individuo hipersensible, para los propósitos
industriales sería de mucho más valor convertir una proteína en
incapaz de iniciar la reacción hipersensible inicial.
Los linfocitos T (células T) son claves en la
inducción y regulación de las respuestas inmunes y en la ejecución
de las funciones efectoras inmunológicas. Se sabe que la inmunidad
específica contra agentes infecciosos y tumores depende de esas
células y se cree que contribuyen a la curación de heridas. Por otra
parte, un fallo en el control de estas respuestas puede conducir a
autoagresión. En general, el antígeno se presenta a las células T en
forma de células que presentan antígeno que, a través de una
variedad de mecanismos de superficie celular, capturan y exponen el
antígeno o antígeno parcial de manera adecuada para el
reconocimiento del antígeno por las células T. Después que los
receptores sobre la superficie de las células T (receptores de
células T) reconozcan un epítopo específico las células T comienzan
una serie de interacciones complejas, que incluyen la proliferación,
que dan como resultado la producción de anticuerpos por parte de las
células B. Mientras que las células T y las células B son ambas
activadas por epítopos antigénicos que existen sobre una proteína o
péptido dado, en realidad los epítopos reconocidos por estas células
mononucleares generalmente no son idénticos. De hecho, el epítopo
que activa una célula T para iniciar la creación de diversidad
inmunológica, frecuentemente no es el mismo etítopo que es
reconocido después por las células B en el curso de la respuesta
inmunológica. Así, con respecto a la hipersensibilidad, mientras que
la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno
es un elemento crítico en el inicio de la respuesta inmune a una
exposición antigénica, las especificidades de esa interacción, i.e.,
el epítopo reconocido, normalmente no es relevante para el
desarrollo subsiguiente de una reacción alérgica auténtica.
La patente Nº WO 96/40791 describe un
procedimiento para producir conjugados óxido de
polialquileno-polipéptido con una alergenicidad
reducida, utilizando óxido de polialquileno como material de
partida.
La patente Nº WO 97/30148 describe un conjugado
polipéptido con alergenicidad reducida que comprende una molécula
que transporta el polímero que tiene dos o más moléculas de
polipéptido acopladas a ella.
La patente Nº WO 96/17929 describe un
procedimiento para producir polipéptidos con alergenicidad reducida
que comprende la etapa de conjugación de 1 a 30 polimoléculas al
polipéptido padre.
La patente Nº WO 92/10755 describe un método para
producir variantes de proteína que provocan una respuesta
inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, se utilizaron
las proteínas de interés, una serie de proteasas variantes de ellas,
para inmunizar ratas. Entonces, el suero de las ratas se utilizó
para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales producidos
y presentes en el suero inmunizado frente a la proteína de interés o
sus variantes. A partir de estos resultados, fue posible determinar
si los anticuerpos en la preparación eran comparativamente más o
menos reactivos con la proteína y sus variantes, permitiendo así un
análisis de qué cambios en la proteína tienen más posibilidad de
neutralizar o reducir la capacidad de unir Ig. A partir de estas
pruebas sobre ratas, se llegó a la conclusión que cambiando
cualquiera de los 309 residuos de subtilisina correspondientes a las
posiciones 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154,
161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176,
186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 dará como resultado un
cambio en el potencial inmunológico.
La patente Nº WO 94/10191 describe proteínas poco
alergénicas que comprenden formas oligoméricas de las proteínas
monoméricas padre, en donde el oligómero sustancialmente ha retenido
su actividad.
Gundlach, B.R. et al. (1996), Journal of
Inmunological Methods 192, 149-155, describe la
determinación de epítopos de células T con librerías de péptidos
aleatorias.
Los antecedentes en la técnica han proporcionado
métodos para reducir la alergenicidad de ciertas proteínas y la
identificación de epítopos que causan reacciones alérgicas en
algunos individuos, los ensayos utilizados para identificar estos
epítopos generalmente implican la medida de anticuerpos IgE y IgG en
el suero sanguíneo expuesto al antígeno. De todas formas, una vez se
ha iniciado una reacción Ig, la sensibilización ya ha ocurrido. En
consecuencia, existe una necesidad de un método para determinar
epítopos que causan sensibilización en un primer lugar, ya que la
neutralización de estos epítopos dará como resultado una
significativa menor posibilidad para que pueda ocurrir la
sensibilización, reduciendo así las posibilidades de sensibilización
inicial.
Uno de los objetivos de la invención es
proporcionar un método para producir una proteína que tenga un
potencial reducido para causar una respuesta alergénica en seres
humanos, comparado con una proteína precursora.
Un objetivo adicional de la presente invención es
proporcionar un método para producir una variante de proteasa que
tenga una actividad útil en aplicaciones de proteasas comunes, tales
como detergentes y o el tratamiento de lana para prevenir el
apelmazamiento, en aplicaciones como jabones líquidos o en pastilla,
formulaciones para el cuidado de la vajilla, soluciones o productos
para limpieza de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos,
tratamiento de aguas residuales, aplicaciones textiles tales como
anti-apelmazante, en formulaciones cosméticas y para
el cuidado de la piel, o como enzimas de
fusión-ruptura en la producción de proteínas, cuya
variante de proteasa pueda ser utilizada de manera más segura debido
a su potencial alergénico disminuido.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para identificar los epítopos de células T
dentro de una proteína, donde un epítopo de célula T es reconocido
mediante las siguientes etapas de: (a) obtener a partir de una única
muestra de sangre humana una solución de células dendríticas y una
solución de células T ingenuas CD4+ y/o CD8+; (b) estimular la
diferenciación en la mencionada solución de células dendríticas; (c)
combinar la mencionada solución de células dendríticas diferenciadas
y la mencionadas células T ingenuas CD4+ y/o CD8+ con un péptido de
interés; (d) medir la proliferación de células T en la mencionada
etapa (c).
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, una proteína en la cual se ha identificado un epítopo de
célula T se modifica para reducir o preferiblemente neutralizar
(eliminar) la capacidad de la célula T para identificar aquel
epítopo. La proteína tiene una alergenicidad reducida, y
preferiblemente comprende una modificación que comprende la
sustitución o eliminación de residuos aminoácidos que son
identificados dentro del epítopo de célula T. De acuerdo con una
realización preferida, se determina un epítopo en una proteína o
péptido que, cuando es reconocido por una célula T, da como
resultado una proliferación de células T que es mayor que la línea
base. Entonces, aquel epítopo de célula T se modifica de manera que
cuando el péptido que comprende el epítopo es analizado en el ensayo
de esta invención, da como resultado una menor proliferación que la
proteína que comprende el epítopo no modificado. Más
preferiblemente, el epítopo que debe modificarse produce una
proliferación de células T en la muestra mayor que tres veces la
línea base. Cuando es modificado, el epítopo produce una
proliferación de células T menor de tres veces la línea base,
preferiblemente una proliferación de células T menor que dos veces
la línea base y más preferiblemente una proliferación de células T
en la muestra menor que o sustancialmente igual a la línea base.
Preferiblemente, el epítopo se modifica según una
de las siguiente maneras: (a) la secuencia de aminoácido del epítopo
se sustituye con una secuencia análoga que proviene de un homólogo
humano de la proteína de interés, i.e., subtilisina humana u otra
proteína humana derivada de subtilisisa como moléculas tales como
furina o las kexinas (ver e.g., Methods in Enzymology, Vol.
244, (1994) pp. 175 et seg; Roebroek et al., EMBO
J., Vol. 5, No. 9, pp. 2197-2202 (1986);
Tomkinson et al., Biochem. Vol. 30, pp.
168-174 (1991); Keifer et al., DNA and
Cell Biol.. Vol. 10, No. 10, pp. 757-769
(1991)); (b) la secuencia de aminoácido del epítopo se sustituye con
una secuencia análoga procedente de un homólogo no humano de la
proteína de interés, cuya secuencia análoga produce una menor
respuesta alergénica debida al reconocimiento de células T que la
proteína de interés; (c) la secuencia de aminoácido del epítopo se
sustituye con una secuencia que sustancialmente imita la estructura
terciaria principal atribuida al epítopo, pero que produce una menor
respuesta alergénica debida al reconocimiento de células T que la
proteína de interés; o (d) con cualquier secuencia que produzca una
menor respuesta alergénica debida al reconocimiento de células T que
la proteína de interés.
Una proteína mutante que tiene un epítopo
modificado puede prepararse por modificación del ADN que codifica la
proteína precursora de tal manera que el ADN modificado codifique la
proteína mutante de la invención.
La proteína mutante es útil en cualquier
composición o procedimiento en los que se sabe que la proteína
precursora es generalmente útil. Por ejemplo, cuando la proteína es
una proteasa, la proteasa con alergenicidad reducida puede emplearse
como componente en productos de limpieza tales como detergentes para
la ropa y productos de limpieza para superficies duras, como ayuda
en la preparación del cuero, en el tratamiento de tejidos tales como
la lana y/o la seda para reducir el apelmazamiento, como componente
en productos para el cuidado personal, producto cosmético o crema
facial, y como componente en alimentos para animales domésticos para
mejorar el valor nutritivo del alimento. De manera similar, cuando
la proteína es una amilasa, la amilasa de alergenicidad reducida se
puede emplear en la licuefacción del almidón, como componente en un
detergente de lavavajillas, para la deformación de los tejidos, en
un detergente para la ropa o cualquier otro uso para el cual una
amilasa es útil.
Una ventaja de la presente invención es que
mediante la medida de la proliferación de células T como
consecuencia del reconocimiento del epítopo de célula T, es posible
identificar péptidos que contienen epítopos responsables de la
sensibilización inicial de un individuo. Es decir, la proliferación
de células T como consecuencia del reconocimiento del epítopo de la
célula T da lugar a la sensibilización de un individuo a este
péptido o a una proteína que lo contiene. La neutralización de
tales epítopos de células T "sensibilizadores" dará
inevitablemente como resultado un mayor grado de seguridad para los
que manipulan o que son expuestos de otra manera al antígeno que
contiene el epítopo porque no serán sensibilizados inicialmente,
impidiendo de esta manera la producción de los típicos anticuerpos
Ig de una reacción alérgica después de una exposición ulterior al
antígeno.
Una ventaja de la presente invención es la
preparación de proteínas, incluyendo enzimas, que pueden emplearse
con apreciablemente menos peligro de sensibilización para los
individuos expuestos. Así, por ejemplo, las proteínas de la
invención pueden emplearse de manera más segura en cosméticos tales
como cremas faciales, detergentes como detergentes para la ropa,
composiciones limpiadoras de superficies duras y composiciones
prelavado para la limpieza de superficies duras o cualquier otro uso
de la proteína, incluyendo enzimas, en el cual la exposición humana
es una consecuencia secundaria necesaria.
Figs. 1A, B1, B2 y B3 ilustran la secuencia de
ADN (SEQ ID:NO 1) y aminoácidos (SEQ ID: NO 2) de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y un mapa parcialmente
restringido de este gen.
Fig. 2 ilustra los residuos de aminoácido que se
conservan en subtilisinas procedentes de Bacillus
amyloliquefaciens (SEQ ID: NO 3) y Bacillus lentus (tipo
nativa) (SEQ ID: NO 4).
Figs. 3A y 3B ilustran un alineamiento de
secuencia de aminoácidos de subtilisina de tipo proteasas
procedentes de Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), Bacillus
subtilis, Bacillus licheniformis (SEQ ID: NO 5) y Bacillus
lentus. El símbolo * indica la ausencia de un residuo de
aminoácido específico comparado con subtilisina BPN'.
La Fig. 4 ilustra la respuesta aditiva de células
T de 16 muestras de sangre mononuclear periféricas a péptidos que
corresponden con una proteasa Bacillus lentus. El péptido E05
incluye la región que comprende residuos correspondientes a
170-173 en proteasa procedente de Bacillus
amyloliquefaciens.
Fig. 5 ilustra la respuesta aditiva de células T
de 10 muestras de sangre mononuclear periféricas a péptidos
correspondientes a la molécula de subtilisina humana. Los péptidos
F10, F9, F8 y F7 todos contienen la secuencia de aminoácidos DQMD
que corresponde a la región que comprende residuos correspondientes
a 170-173 en proteasa procedente de Bacillus
amyloliquefaciens en el alineamiento de secuencia de la Fig.
3.
Fig. 6A y 6B/6C ilustra cadenas de aminoácidos
correspondientes a péptidos derivados de la secuencia de proteasa
procedente de Bacillus lentus y una subtilisina humana,
respectivamente.
Fig. 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de
subtilisina humana (SEQ ID: NO 6).
Fig. 8 ilustra un alineamiento de secuencia de
aminoácidos de proteasa BPN' (Bacillus
amyloliquefaciens),proteasa SAVINASE (Bacillus lentus) y
subtilisina humana (S2HSBT).
Fig. 9 ilustra la respuesta de células T a
péptidos derivados de proteasa procedente de Bacillus lentus
en una muestra cogida de un individuo que se sabe es hipersensible a
la proteasa procedente de Bacillus lentus. El péptido E05
representa la región correspondiente a 170-173 en
proteasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens.
Fig. 10 ilustra la respuesta de células T a
varias sustituciones de alanina en el péptido E05 de la proteasa
procedente de Bacillus lentus en una muestra cogida de un
individuo que se sabe es hipersensible a proteasa procedente de
Bacillus lentus.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para identificar epítopos de células T. La
presente invención proporciona una prueba que identifica epítopos de
la siguiente manera: se combinan células dendríticas diferenciadas
con células T ingenuas humanas CD4+ y/o CD8+ y con un péptido de
interés. Más específicamente, se proporciona un método donde un
epítopo de célula T se reconoce en las etapas de: (a) obtención de
una solución de células dendríticas y una solución de células T
ingenuas CD4+ y/o CD8+ de una única muestra de sangre humana; (b)
diferenciación promovida en la mencionada solución de células
dendríticas; (c) combinación de la mencionada solución de células
dendríticas diferenciadas y células T ingenuas CD4+ y/o CD8+ con un
péptido de interés; (d) medida de la proliferación de células T en
la mencionada etapa (c).
El péptido que interesa analizar de acuerdo con
el ensayo de la invención se deriva de una proteína o enzima para la
cual se desea o requiere una alergenicidad reducida. En la práctica
de la invención, es posible identificar con precisión la
localización de un epítopo que puede causar la sensibilización en un
individuo o muestra de individuos. En una realización
particularmente efectiva de la invención, se preparan una serie de
oligómeros peptídicos que corresponden a toda o una parte de la
proteína o enzima. Por ejemplo, se produce una librería de péptidos
que cubre una porción relevante o toda la proteína. Una manera
particularmente útil de producir los péptidos es introducir un
solapamiento en la librería de péptidos, por ejemplo, producir un
primer péptido que corresponde a una secuencia de los aminoácidos
1-10 de la proteína objetivo, un segundo péptido que
corresponde a la secuencia de los aminoácidos 4-14
de la proteína objetivo, un tercer péptido que corresponde a la
secuencia de los aminoácidos 7-17 de la proteína
objetivo, un cuarto péptido que corresponde a la secuencia de los
aminoácidos 10-20 de la proteína objetivo, etc...
hasta crear péptidos representativos que corresponden a toda la
molécula. Analizando cada uno de los péptidos individuales en la
prueba que se proporciona aquí, es posible identificar de manera
precisa la localización de los epítopos reconocidos por las células
T. En el ejemplo anterior, la reacción de un péptido específico en
mayor medida que lo hagan sus vecinos facilitará la localización de
la región anclaje del epítopo con una precisión de tres aminoácidos.
Después de determinar la localización de estos epítopos, es posible
alterar los aminoácidos dentro de cada epítopo hasta que el péptido
produzca una respuesta frente a células T menos significativa.
"Célula que presenta antígeno" como se
emplea aquí significa una célula del sistema inmunitario que
presenta antígeno en su superficie que es reconocible por receptores
en la superficie de células T. Ejemplos de células que presentan
antígeno son las células dendríticas, células interdigitadas,
células B activadas y macrófagos.
"Proliferación de célula T" como se emplea
aquí significa la cantidad de células T producidas durante la
incubación de células T con las células que presentan antígeno, con
o sin antígeno.
"Línea base de proliferación de células T"
como se emplea aquí significa la proliferación de células T que se
observa normalmente en un individuo en respuesta a su exposición a
células que presentan antígeno en ausencia de un antígeno peptídico
o proteínico. Para los presentes propósitos, el nivel de
proliferación de células T línea base se determinó, sobre la base de
una muestra por cada individuo, como la proliferación de células T
en respuesta a células que presentan antígeno en ausencia de
antígeno.
"Epítopo de célula T" significa una
secuencia de un péptido o una proteína que es reconocida por un
receptor de célula T durante la iniciación de la respuesta
inmunológica al péptido que comprende este antígeno. En general se
cree que el reconocimiento de un epítopo de célula T por una célula
T ocurre mediante un mecanismo en el cual la células T reconocen
fragmentos de péptido de antígenos que están unidos a moléculas de
mayor histocompatibilidad (MHC) de clase I o de clase II expresados
en células que presentan antígeno (ver e.g., Moeller, G. Ed.,
Antigenic Requirements for Activation of
MHC-Restricted Responses, Immunological
Review, Vol. 98, p. 187 (copenhagen; Munksgaard)(1987).
Entonces, se modifican los epítopos determinados
según la prueba proporcionada aquí para reducir el potencial
alergénico de la proteína de interés. En una realización preferida,
el epítopo a modificar produce un nivel de proliferación de células
T tres veces superior que la proliferación de célula T línea base en
una muestra. Cuando se modifica, el epítopo produce menos de tres
veces la proliferación de línea base, preferiblemente menos de dos
veces la proliferación de línea base y más preferiblemente menos o
sensiblemente lo mismo que la proliferación de línea base en una
muestra.
Preferiblemente, el epítopo se modifica en una de
las siguientes maneras: (a) se sustituye la secuencia de aminoácidos
del epítopo por una secuencia análoga de un homólogo humano de la
proteína de interés; (b) se sustituye la secuencia de aminoácidos
del epítopo por un secuencia análoga de un homólogo no humano de la
proteína de interés, cuya secuencia análoga produce una menor
respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células
T que la proteína de interés; (c) se sustituye la secuencia de
aminoácidos del epítopo por una secuencia que imita de manera
sustancial las características más importantes de la estructura
terciaria del epítopo, pero que produce una menor respuesta
alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células T que la
proteína de interés; o (d) por cualquier secuencia que produzca una
respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células
T menor que la proteína de interés.
"Muestra" como se emplea aquí comprende
células mononucleares que son ingenuas, i.e., no están
sensibilizadas al antígeno en cuestión.
"Homólogo" como se emplea aquí significa una
proteína o enzima que tiene una acción catalítica, estructura y/o
uso similar al de la proteína de interés. Es deseable encontrar un
homólogo que tenga una estructura terciaria y/o primaria similar a
la de la proteína de interés ya que la sustitución del epítopo de la
proteína de interés por un segmento análogo en el homólogo reducirá
el efecto perturbador del cambio. De este modo, enzimas
estrechamente idénticas proporcionarán la fuente más deseable de
sustituciones de epítopo. Alternativamente, si es posible, es
ventajoso buscar análogos humanos para una proteína dada. Por
ejemplo, la sustitución de un epítopo específico en un subtilisina
de origen bacteriano por una secuencia de un análogo humano de
subtilisina (i.e., subtilisina humana) debería dar como resultado
una menor alergenicidad en la proteína bacteriana.
Se debería determinar una secuencia
"análoga" asegurándose que la sustitución de los aminoácidos
muestra una función similar, y estructura terciaria de los residuos
conservados de aminoácidos en la proteína de interés en o cerca del
epítopo. Así, donde la región epítopa contiene, por ejemplo, una
estructura de alfa-hélice o una
lámina-beta, los aminoácidos sustituidos deberían
mantener esta estructura específica.
Mientras que la presente invención abarca todas
las proteínas para las que se desea reducir la alergenicidad, con
ánimo de simplificar, a continuación se describirá una realización
particularmente preferida de la invención, la modificación de
proteasa. Las proteasas son hidrolasas de carbonilo que generalmente
actúan rompiendo enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se
emplea aquí, "proteasa" significa una proteasa de origen
natural o una proteasa recombinante. Las proteasas de origen natural
incluyen \alpha-aminoacilpéptido hidrolasa,
peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serin
carbopeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa,
carboxilproteinasa y metaloproteinasa. Están incluidas las proteasas
de serina, metalo, tiol y ácidos, así como las endo y
exo-proteasas.
Las subtilisinas son proteasas bacterianas o
fúngicas que generalmente actúan rompiendo enlaces peptídicos de
proteínas o péptidos. Como se utiliza aquí, "subtilisina"
significa una subtilisina de origen natural o una subtilisina
recombinante. Se sabe fabricar una serie de subtilisinas de origen
natural, a menudo secretadas por varias especies microbianas. Las
secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son
completamente idénticos. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie
presentan el mismo tipo de actividad proteolítica o similar. Esta
clase de proteasas de serina comparten una secuencia de aminoácidos
común que define una tríada catalítica que las distingue de las
quimotripsinas, una clase de proteasas de serina relacionadas. Tanto
las subtilisinas como las quimotripsinas, proteasas de serina
relacionadas, tienen una tríada catalítica que comprende aspartato,
histidina y serina. En las proteasas relacionadas con subtilisina el
orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el grupo amino al
carboxilo terminal es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con quimotripsina el orden relativo, sin
embargo, es
histidina-aspartato-serina. Así,
subtilisina aquí se refiere a una proteasa de serina que tiene la
tríada catalítica de proteasas relacionadas con subtilisina. Los
ejemplos incluyen pero no se limitan a las subtilisinas
identificadas en la Fig. 3 de aquí. Generalmente, y para los
propósitos de la presente invención, la numeración de los
aminoácidos en proteasas corresponde a los números asignados a la
secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura
presentada en la Fig. 1.
"Subtilisina recombinante" o "proteasa
recombinante" se refieren a una subtilisina o proteasa en la que
la secuencia de ADN que codifica la subtilisina o proteasa se
modifica para producir una secuencia de ADN diferente (o mutante)
que codifica la sustitución, supresión o inserción de uno o más
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de origen natural. Los
métodos descritos en la patente US 4.760.025, patente US 5.204.015 y
patente US 5.185.258 son adecuados para producir tal modificación, y
pueden ser combinados con los descritos aquí.
Las "subtilisinas no humanas" y el ADN que
las codifica puede obtenerse a partir de diferentes organismos
procarióticos y eucarióticos. Ejemplos adecuados de organismos
procarióticos incluyen organismos gram negativo tales como E.
Coli o Pseudomonas y bacterias gram positivo tales como
Micrococcus o Bacillus. Ejemplos de organismos
eucarióticos a partir de los cuales pueden obtenerse subtilisina y
sus genes incluyen levaduras tales como Saccharomyces
cerevisiae, y hongos tales como Aspergillus sp.
"Subtilisina humana" significa proteínas de
origen humano que tienen una actividad catalítica de tipo
subtilisina, e.g., la familia de las kexinas de proteasas humanas.
En la Fig. 7 está representada la secuencia de un ejemplo de tal
proteína. Adicionalmente, para el propósito de esta invención se
consideran subtilisinas humanas derivados u homólogos de subtilisina
humana, que incluyen los de fuentes no humanas tales como ratón o
conejo, que retienen la capacidad esencial para hidrolizar enlaces
peptídicos y tienen al menos 50%, preferiblemente al menos 65% y más
preferiblemente al menos 80% de identidad con la proteína de la Fig.
7.
Una "variante de proteasa" tienen una
secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de
una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen
proteasas de origen natural y proteasas recombinantes. La secuencia
de aminoácidos de la variante de proteasa "deriva" de la
secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora mediante la
sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la
"secuencia del ADN precursor" que codifica la secuencia de
aminoácidos del la proteasa precursora más que la manipulación de la
enzima proteasa precursora per se. Los métodos adecuados para
tal manipulación de la secuencia del ADN precursor incluyen los
métodos descritos aquí, así como los métodos conocidos por los
expertos en la técnica (ver, por ejemplo, EP 0 328299, WO89/06279 y
las patentes y solicitudes a las que hacen referencia).
Los números de posición de los aminoácidos
utilizados aquí se refieren a los asignados a la secuencia de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada
en la Fig. 1. La invención, sin embargo, no se limina a la mutación
de esta subtilisina en particular, sino que abarca a proteasas
precursoras que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones
que son "equivalentes" a los residuos identificados en
particular en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
En una realización preferida de la presente invención, la proteasa
precursora es subtilisina de Bacillus lentus y se han hecho
sustituciones, eliminaciones o inserciones en los residuos de
aminoácidos equivalentes en B. lentus correspondientes a las
listadas anteriormente.
Un residuo (aminoácido) de una proteasa
precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens si es, bien homólogo (i.e., correspondiente en
posición bien en estructura primaria o terciaria) o análogo a un
residuo específico o porción de este residuo en subtilisina de
Bacillus amuloliquefaciens (i.e., que tiene la misma
capacidad funcional o similar para combinar, reaccionar o
interaccionar químicamente).
Con objeto de establecer la homología en la
estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteína
precursora se compara directamente con la secuencia primaria de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente a
un conjunto de residuos que se sabe no varían en subtilisinas, y
para los que se conoce la secuencia. Por ejemplo, la Fig. 2 muestra
los residuos conservados entre subtilisina de B.
amyloliquefaciens y subtilisina de B. lentus. Después de
alinear los residuos conservados, permitiendo las inserciones o
eliminaciones necesarias para mantener el alineamiento (i.e.,
evitando la eliminación de los residuos conservados mediante
eliminación e inserción al azar), se definen los residuos
equivalentes de aminoácidos particulares en la secuencia primaria de
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El alineamiento de
los residuos conservados preferiblemente debería conservar el 100%
de tales residuos. Sin embargo, también es adecuado para definir
residuos equivalentes el alineamiento de más del 75% o como poco 50%
de los residuos conservados. Debería mantenerse la conservación de
la tríada catalítica, Asp32/His64/Ser221.
Por ejemplo, puede alinearse la secuencia de
aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y
Bacillus lentus para proporcionar la máxima cantidad de
homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de
las secuencias indica que hay un número de residuos conservados
contenidos en cada secuencia. En la Fig. 2 están identificados los
residuos conservados entre BPN' y B. lentus.
Así, estos residuos conservados pueden utilizarse
para definir los correspondientes residuos de aminoácidos
equivalentes de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en
otras subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus
(PCT Nº. WO89/06279 publicada el 13 Julio, 1989), la enzima
precursora proteasa preferida aquí, o la subtilisina denominada PB92
(EP 0 328 299), que es altamente idéntica de la subtilisina
Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de
ciertas de estas subtilisinas están alineadas en las Figs. 3A y 3B
para producir la máxima homología de residuos conservados con la
secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Como
puede verse, existen un número de eliminaciones en la secuencia de
Bacillus lentus comparada con subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente
Val165 en subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las
otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B.
licheniformis.
Así, por ejemplo, el aminoácido en posición +170
es lisina (K) tanto en subtilisinas de B. amyloliquefaciens
como de B. licheniformis, y arginina (R) en Sabinasa. Sin
embargo, en una realización de las variantes de la proteasa de la
invención, el aminoácido equivalente del +170 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens está sustituido por ácido
aspártico (D). Las abreviaciones y los códigos de una letra para
todos los aminoácidos en la presente invención están conforme the
Patentin User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, p.101.
"Residuos equivalentes" se pueden definir
también mediante la determinación de la homología a nivel de
estructura terciaria de una proteasa precursora cuya estructura
terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los
residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las
coordenadas atómicas de dos o más átomos de la cadena principal de
un residuo aminoácido particular de la proteasa precursora y de la
subtilisina de Bacillus Amyloliquefaciens (N sobre N, CA
sobre CA, C sobre C y O sobre O) están a 0,13 nm y preferiblemente a
0,1 nm una de otra después de su alineamiento. El alineamiento se
consigue después que el mejor modelo se haya orientado y posicionado
para dar el máximo solapamiento de las coordenadas atómicas de los
átomos de la proteína que no son hidrógeno de la proteasa en
cuestión en relación con la subtilisina de Bacillus
Amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico
que da el factor R más bajo en los datos de difracción
experimentales a la mejor resolución disponible.
R\ factor=
\frac{\sum_{h}|Fo(h)|-|Fc(h)|}{\sum_{h}|Fo(h)|}
Los residuos equivalentes que son funcionalmente
análogos de un residuo específico de subtilisina de Bacillus
Amyloliquefaciens se definen como los aminoácidos de la proteasa
precursora que pueden adoptar una conformación tal que altere,
modifique o contribuya a la estructura de la proteína, la unión con
el sustrato o la catálisis de la manera definida y atribuida a un
residuo específico de subtilisina de Bacillus
Amyloliquefaciens. Además, están esos residuos de la proteasa
precursora (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria
por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga hasta
el punto que, aunque los átomos de la cadena principal de un residuo
dado puede no cumplir el criterio de equivalencia sobre la base de
ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al
menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo se
encuentran a 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena
lateral de subtilisina de Bacillus Amyloliquefaciens. Las
coordenadas de la estructura tridimensional de subtilisina de
Bacillus Amyloliquefaciens están expuestas en la publicación
EPO Nº. 0 251 446 (equivalente a la patente de EE.UU 5.182.204) y
pueden utilizarse como se ha mencionado anteriormente para
determinar los residuos equivalentes a nivel de estructura
terciaria.
Algunos de los residuos identificados para
sustitución, inserción o eliminación son residuos conservados
mientras otros no lo son. En el caso de los residuos que no se
conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos se limita a
sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de
aminoácidos que no corresponde a la encontrada en la naturaleza. En
el caso de los residuos conservados, tales sustituciones no deberían
dar como resultado una secuencia que se encuentra en la naturaleza.
Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen tanto
las formas maduras de las variantes de proteasa como las pro- y
preproformas de tales variantes de proteasa. Las
prepro-formas son la construcción preferida porque
facilita la expresión, secreción, y maduración de las variantes de
proteasa.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia de
aminoácidos unidos a la porción N-terminal de la
forma madura de una proteasa que cuando se elimina da lugar a la
aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas
proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos
proenzimas traslacionales y, en ausencia de un tratamiento
traslacional, se expresan de esta manera. Una prosecuencia
preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia
putativa de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque
se pueden emplear otras prosecuencias de proteasa.
Una "secuencia señal" o "prosecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unidos a la porción
N-terminal de una proteasa o a la porción
N-terminal de una proproteasa que puede participar
en la secreción de las forma madura o proforma de la proteasa. Esta
definición de secuencia señal es funcional, se supone incluye todas
esas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción
N-terminal del gen de la proteasa que participa en
la secreción de la proteasa bajo condiciones naturales. La presente
invención utiliza tales secuencias para efectuar la secreción de las
variantes de proteasa como se define aquí. Una secuencia señal
posible comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la
secuencia señal de subtilisina de Bacillus subtilis fusionada
al resto de la secuencia señal de subtilisina de Bacillus
lentus (ATCC 21536).
Una "preproforma" de una variante de
proteasa consiste en la forma madura de la proteasa que tiene una
prosecuencia unida de manera operable al extremo amino de la
proteasa y una secuencia "pre" o "señal" unida de manera
operable al extremo amino de la prosecuencia.
El "vector de expresión" se refiere al
fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida de
manera operable a una secuencia control adecuada capaz de efectuar
la expresión del mencionado ADN en un anfitrión adecuado. Tales
secuencias control incluyen un promotor para efectuar la
trascripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal
trascripción, una secuencia que codifica sitios de mARN ribosómico
adecuados y secuencias que controlan la terminación de la
trascripción y la traslación. El vector puede ser un plásmido, una
partícula fago, o simplemente una inserción genómica potencial. Una
vez transformado en un anfitrión adecuado, el vector puede
replicarse y funcionar independientemente del genoma anfitrión, o
puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la
presente especificación, "plásmido" y "vector" son a veces
utilizados indistintamente, ya que actualmente el plásmido es la
forma usualmente más utilizada de vector. Sin embargo, también
pueden utilizarse otras formas de vectores de expresión que sirven
para funciones equivalentes y que son, o se convierten en, conocidas
en la técnica.
Las "células anfitrión" utilizadas en la
presente invención generalmente son anfitriones procarióticos o
eucarióticos que preferiblemente han sido manipulados mediante los
métodos descritos en la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) para
convertirlos en incapaces de segregar endoproteasa enzimáticamente
activa. Una célula anfitrión preferida para expresar proteasa es la
cadena Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra y
proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activa. La
construcción de la cadena BG2036 se describe en detalle en la
patente EE.UU. 5.264.366. Otras células anfitrión para expresar
proteasa incluyen Bacillus subtilis 1168 (también descrita en
la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y la patente EE.UU.
5.264.366, así como cualquier cadena de Bacillus tales como
B. Licheniformis, B. Lentus, etc.
Las células anfitrionas transformadas o
transfectadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN
recombinante. Tales células anfitrionas transformadas son capaces de
replicar vectores que codifican las variantes de proteasa o expresar
la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que
codifican la pre- o preproforma de la variante de proteasa, tales
variantes, cuando se expresan, son segregadas típicamente por las
células anfitrionas en el medio de células anfitrionas.
"Unidas de manera operable", cuando se
describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente
significa que están relacionadas funcionalmente una a la otra. Por
ejemplo, un prosecuencia está unida operablemente a un péptido si
funciona como una secuencia señal, que participa en la secrección de
la forma madura de la proteína, lo más probablemente implicando una
rotura de la secuencia señal. Un promotor está unido operablemente a
la secuencia codificadora si controla la transcripción de la
secuencia; un centro de complejación ribosómico está unido
operablemente a una secuencia codificadora si se sitúa de tal manera
que permite la traslación.
Los genes que codifican la proteasa natural
pueden obtenerse de acuerdo con los métodos generales conocidos por
los expertos en la técnica. Los métodos normalmente comprenden
sintetizar muestras marcadas que tienen secuencias putativas que
codifican regiones de la proteasa de interés, preparar librerías
genómicas a partir de microorganismos que expresan la proteasa, y
chequear las librerías para el gen de interés mediante hibridación
de la muestra.
La proteasa clonada se utiliza entonces para
transformar una célula anfitriona con objeto de expresar la
proteasa. Entonces, el gen de proteasa se liga a un plásmido con un
gran número de copias. Este plásmido se replica en las anfitrionas,
en el sentido de que contiene los elementos necesarios bien
conocidos para la replicación del plásmido: un promotor unido de
manera operativa al gen en cuestión (que puede ser suministrado como
el promotor homólogo del propio gen si es reconocido; i.e.,
transcrito, por la anfitriona), una terminación de transcripción y
una región de poliadenilación (necesaria para estabilizar el ARNm
transcrito por la anfitriona a partir del gen de la proteasa en
ciertas células anfitrionas eucarióticas) que es exógeno o es
suministrado mediante la región del gen de la proteasa del
terminador endógeno y, deseablemente, una selección de genes tales
como un gen resistente a los antibióticos que permite un
mantenimiento del cultivo continuo de células anfitrionas infectadas
con plásmido mediante su crecimiento en medios que contienen
antibióticos. Los plásmidos con un gran número de copias también
contienen un origen de replicación para la anfitriona, por lo tanto
permitiendo que un gran número de plásmidos puedan generarse en el
citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, dentro del
alcance de la presente está integrar copias múltiples del gen de la
proteasa en el genoma anfitrión. Esto se facilita mediante
organismos procarióticos y eucarióticos que son particularmente
susceptibles a la recombinación homóloga.
En una realización, el gen puede se un gen
natural tal como el procedente de B. lentus o B.
Amyloliquefaciens. Alternativamente, puede fabricarse un gen
sintético que codifique una proteasa precursora natural o mutante.
En tal aproximación, se determina la secuencia del ADN y/o
aminoácidos de la proteasa precursora. Entonces, se sintetizan
múltiples fragmentos sintéticos de ADN de una sola hebra, que
solapan, los cuales después de hibridarse y ligarse producen un ADN
sintético que codifica la proteasa precursora. En el Ejemplo 3 de la
patente de EE.UU 5.204.015 se expone un ejemplo de construcción de
gen sintético.
Una vez que el gen de la proteasa precursora
natural o sintético se ha clonado, se realizan un gran número de
modificaciones para aumentar el uso del gen más allá de la síntesis
de la proteasa precursora natural. Tales modificaciones incluyen la
producción de proteasas recombinantes tal como se describe en la
patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y publicación EPO nº 0 251
446 y la fabricación de variantes de proteasas descritas allí.
El siguiente método de mutagénesis por inserción
de casete puede utilizarse para facilitar la construcción de
variantes de proteasa de la presente invención, aunque pueden
utilizarse otros métodos. En primer lugar, se obtiene el gen natural
que codifica la proteasa y se secuencia completamente o en parte.
Entonces, se escanea la secuencia para el punto en el que se desea
realizar una mutación (eliminación, inserción o sustitución) de uno
o más aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las secuencias
que están al lado de este punto por si hubiera sitios de restricción
para reemplazar un segmento pequeño del gen por una variedad de
oligonucleótidos, los cuales cuando se expresen codificarán las
diferentes mutantes. Tales sitios de restricción son preferiblemente
sitios únicos en el gen de la proteasa que facilitan la sustitución
del segmento del gen. Sin embargo, puede utilizarse cualquier sitio
de restricción conveniente que no sea demasiado redundante en el gen
de la proteasa, teniendo en cuenta que los fragmentos de gen
generados mediante digestión por restricción pueden reensamblarse
con la secuencia adecuada. Si no hay sitios de restricción en las
localizaciones a una distancia conveniente del punto seleccionado
(de 10 a 15 nucleótidos), se generan tales sitios mediante
nucleótidos de sustitución en el gen, del tal manera que no se
cambian ni el esqueleto lector ni los aminoácidos codificados en la
construcción final. Con objeto de cambiar su secuencia para
conformar la secuencia deseada, la mutación del gen se lleva a cabo
mediante extensión del M13 primer, de acuerdo con métodos
generalmente conocidos. La misión de localizar regiones flanqueantes
adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos
secuencias de sitios de restricción convenientes se hace de manera
rutinaria mediante el estudio de la redundancia del código genético,
un mapa de la restricción del enzima del gen y el gran número de
enzimas de restricción diferentes. Fíjense que si se dispone de un
sitio de restricción flanqueante conveniente, sólo es necesario
utilizar el método anterior en relación con la región flanqueante
que no contiene un sitio.
En un aspecto de la invención, el objetivo es
asegurar una proteasa variante que tenga el potencial alergénico
alterado comparado con el de la proteasa precursora, ya que la
disminución de tal potencial permite un uso más seguro de la enzima.
Mientras que la presente invención es útil para disminuir el
potencial alergénico, las mutaciones que se especifican aquí pueden
utilizarse en combinación con mutaciones conocidas en la técnica
para dar como resultado estabilidades térmicas alteradas y/o
especificidades por el sustrato alteradas, actividades modificadas o
estabilidades alcalinas alteradas comparadas con las de los
precursores.
Muchas de las variantes de proteasa de la
invención son útiles en la formulación de diversas composiciones
detergentes. Un gran número de compuestos conocidos son
tensioactivos adecuados, útiles en composiciones que comprende las
mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen detergentes no
iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwiteriónicos, tal como se
describe en la patente de EE.UU. 4.404.128 de Barry J. Anderson y la
patente de EE.UU. 4.261.868 de Jiri Flora, et al. Una
formulación detergente adecuada es la descrita en el Ejemplo 7 de la
patente de EE. UU. 5.204.015. La técnica es familiar con las
diferentes formulaciones que pueden utilizarse como composiciones
limpiadoras. Además de lo que tienen en común con las típicas
composiciones limpiadoras, se entiende fácilmente que las variantes
de proteasa de la presente invención pueden utilizarse para
cualquier propósito que utilice proteasas de tipo nativas o
salvajes. Así, estas variantes pueden utilizarse, por ejemplo, en
aplicaciones de jabones líquidos o en pastilla, formulaciones para
el cuidado de la vajilla, soluciones o productos limpiadores de
lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de residuos,
aplicaciones textiles, tales como enzimas de
fusión-rotura en producción de proteínas, etc. Las
variantes de la presente invención pueden comprender, además de una
alergenicidad reducida, una actuación mejorada en una composición
detergente (comparada con la de la precursora). Tal como se utiliza
aquí, la actuación mejorada en un detergente se define como limpieza
mejorada de ciertas manchas sensibles a los enzimas tales como
hierba o sangre, tal como se determina mediante la evaluación usual
después de un ciclo de lavado estándar.
Las proteasas modificadas pueden formularse como
detergentes conocidos en polvo y líquidos que tienen un pH entre 6,5
y 12,0 a niveles de aproximadamente .01 a aproximadamente 5%
(preferiblemente .1 a 5%) en peso. Estas composiciones detergentes
limpiadoras también pueden incluir otras enzimas tales como
proteasas conocidas, amilasas, celulasas, lipasas o
endoglicosidasas, así como builders y estabilizantes.
La adición de las proteasas de la invención a
composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación
de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH
adecuado para el detergente es también adecuado para las presentes
composiciones, siempre que el pH esté dentro del intervalo anterior,
y la temperatura esté por debajo de la temperatura de
desnaturalización de la proteasa descrita. Además, las proteasas de
la invención pueden utilizarse en composiciones limpiadoras son
detergentes, de nuevo solas o en combinación con builders y
estabilizantes.
Las proteasas variantes de la presente invención
pueden incluirse en alimentos para animales tales como parte de los
aditivos del alimento para animales, tal como se describe en, por
ejemplo, la patente de EE.UU. 5.612.055; patente de EE.UU 5.314.692;
y patente de EE.UU. 5.147.642.
Una composición para el tratamiento de un tejido
puede incluir proteasas variantes de la presente invención. La
composición puede utilizarse para tratar por ejemplo seda o lana,
tal como se describe en publicaciones tales como RD 216.034; EP
134.267; US 4.533.359 y EP 344.259.
Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no
pretende ser una limitación al alcance de las reivindicaciones.
La actividad proteolítica de las variantes puede
barrerse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.
Se colectaron células sanguíneas periféricas
humanas recientes procedentes de "ingenuas" humanas, i.e.,
personas que se sabía no habían sido expuestas o sensibilizadas a
proteasa de Bacillus lentus, para la determinación de los
epítopos antigénicos en la protasa procedente de Bacillus
lentus y subtilisina humana. Ingenuas humanas quiere decir que
el individuo no es conocido por haber sido expuesto a o haber
desarrollado una reacción a la proteasa en el pasado. Se prepararon
células sanguíneas mononucleares periféricas (almacenadas a
temperatura ambiente, de no más de 24 horas) para utilizarlas como
se explica a continuación: aproximadamente 30 mls de una solución de
preparación de capa leucocitaria procedente de una unidad de sangre
total se llevó a 50 ml con una solución tamponada de fosfato de
Dulbecco (DPBS) y se dividió en dos tubos. La capa de debajo de las
muestras se protegieron con 12,5 ml de un medio de separación por
densidad lymphoprep a temperatura ambiente (densidad Nycomed 1,077
g/ml). Los tubos se centrifugaron durante treinta minutos a 600G. Se
recogió la interfase de las dos fases, se juntaron y lavaron en
DPBS. La densidad de células de la solución resultante se midió con
un hemocitómetro. La viabilidad se midió mediante exclusión de
tripan azul.
A partir de la solución resultante se preparó un
cultivo de células dendríticas diferenciadas a partir de la muestra
de células mononucleares de sangre periférica con una densidad de
10^{8} células por 75 ml de matraz de cultivo en una solución tal
como se indica a continuación:
(1) 50 ml de medio sin suero AIM V (Gibco) se
complementaron con una dilución 1:100 de
beta-mercaptoetanol (Gibco). Los matraces se dejaron
en posición horizontal durante dos horas a 37ºC en 5% de CO_{2}
para permitir la adherencia de los monocitos a las paredes del
matraz.
(2) La diferenciación de las células monocito en
células dendríticas se hizo de la siguiente manera: se eliminaron
las células no adherentes y las células adherentes resultantes
(monocitos) se combinaron con 30 ml de AIM V, 800 unidades/ml de
GM-CSF (Endogen) y 500 unidades/ml de
IL-4 (Endogen); la mezcla resultante se cultivó
durante 5 días bajo condiciones de 37ºC en 5% CO_{2}. Después de
cinco días, se añadió la citokina TNF\alpha (Endogen) hasta 0,2
unidades/ml, y se añadió la citokina IL-1\alpha
(Endogen) hasta una concentración final de 50 unidades/ml y la
mezcla se incubó a 37ºC en 5% CO_{2} durante dos días más.
(3) El séptimo día se añadió Mitomicina C hasta
una concentración de 50 microgramos/ml para parar el crecimiento del
cultivo de las ahora diferenciadas células dendríticas. La solución
se incubó durante 60 minutos a 37ºC en 5% CO_{2}. Las células
dendríticas se recogieron raspando suavemente las células adherentes
del fondo del matraz con un raspador de células. Entonces, las
células adherentes y las no adherentes se centrifugaron a 600G
durante 5 minutos, se lavaron en DPBS y se contaron.
(4) Las células dendríticas preparadas se
colocaron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a
2x10^{4}/pocillo en 100 microlitros de volumen total de medio AIM
V. Las células T CD4+ se prepararon a partir de alícuotas congeladas
de las muestras de células sanguíneas periféricas utilizadas para
preparar las células dendríticas utilizando el kit Cellet CD4+
humano (Biotex) según las instrucciones del fabricante con las
modificaciones siguientes: las alícuotas se descongelaron y se
lavaron de tal manera que se aplicaron aproximadamente 10^{8}
células por columna Cellect; las células se suspendieron de nuevo en
4 ml de DPBS y 1 ml del reactivo Cell del Cellect Kit, la solución
se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 min. La solución
resultante se centrifugó durante cinco minutos a 600G a temperatura
ambiente y la bolita fue suspendida de nuevo en 2 ml de DPBS y se
aplicó a las columnas Cellect. Las aguas residuales de la columna
se recogieron en suero humano al 2% en DPBS. La solución de células
CD4+ resultante se centrifugó, suspendida de nuevo en medio AIMV y
se midió su densidad.
La suspensión de células T CD4+ se suspendió de
nuevo hasta una cuenta de 2x10^{6}/ml en medio AIMV para facilitar
el manejo eficaz de la placa de 96 pocillos.
El antígeno del péptido se prepara a partir de
una solución estándar 1M en DMSO mediante dilución en medio AIMV en
proporción 1:10. 10 microlitros de solución estándar se colocan en
cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células
dendríticas diferenciadas. Además, se añaden a cada pocillo 100
microlitros de la solución de células T CD4+ diluida preparada como
arriba. Controles útiles incluyen blancos de DMSO diluido, y
controles positivos de tétano toxoide.
Las concentraciones finales en cada pocillo, con
un volumen total de 210 microlitros son como se indica a
continuación:
2x10^{4} CD4+
2x10^{5} células dendríticas (R:S de 10:1)
5 mM péptido
Los péptidos empleados en el ensayo descrito en
el ejemplo 1 se prepararon basándose en la secuencia de aminoácidos
de Bacillus lentus y de subtilisina humana. Los antígenos
del péptido se diseñaron como se indica a continuación. A partir de
la secuencia de aminoácidos completa de proteasa bien de subtilisina
humana o proteasa de Bacillus lentus proporcionada en la
Figura 1, se prepararon sintéticamente 15mers, cada uno de los 15mer
solapándose con el anterior y el siguiente excepto para tres
residuos.
Los péptidos empleados corresponden a cadenas de
residuos de aminoácidos en Bacillus lentus como se
proporciona en Figura 8, y los péptidos corresponden a los residuos
de aminoácidos en subtilisina humana como se proporciona en Figura
7. Los péptidos empleados que corresponden a las proteasas se
proporcionan en la Figura 6. Todos los ensayos se llevaron a cabo
al menos en duplicado. Todos los ensayos presentados enseñan
respuestas de control positivas robustas al antígeno tétano toxoide.
Las respuestas se promediaron en cada experimento, entonces se
normalizaron respecto a la respuesta de la línea base. Se anotó un
suceso positivo cuando la respuesta era al menos 3 veces la
respuesta de la línea base.
Se ajustó la respuesta inmunogénica (i.e.
proliferación de células T) a los péptidos preparados a partir de la
subtilisina humana y Bacillus lentus y se proporciona en las
Figuras 4 y 5, respectivamente. La proliferación de células T se
midió mediante el método del tritio incorporado. Los resultados
mostrados en las Figuras 4 y 5 a modo de comparación de la respuesta
aditiva imunogénica a los diferentes péptidos en 10 individuos
(Figura 4) y 16 individuos (Figura 5). La respuesta se indica como
la respuesta aditiva en la cual 1,0 es igual a la respuesta de la
línea base para cada muestra. Así, en la Figura 4, una lectura de
10,0 o menos es la respuesta de la línea base y en la Figura 5 una
lectura de 16,0 o menos es la respuesta línea base.
Como se indica en la Figuras 4 y 5, la respuesta
imunogénica de las muestras de sangre ingenua de individuos no
sensibilizados muestra un respuesta alergénica marcada en el
fragmento peptídico procedente de Bacillus lentus que
corresponde a los residuos 170-173 de la proteasa de
Bacillus amyloliquefaciens. De manera esperada, el fragmento
correspondiente en subtilisina humana provoca meramente una
respuesta de línea base.
La Fig. 9 enseña la respuesta de células T a los
péptidos derivados de la proteasa de Bacillus lentus en una
muestra tomada a un individuo conocido por ser hipersensible a la
proteasa de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la
región correspondiente a 170-173 en la proteasa
procedente de Bacillus amyloloquefaciens. Como se muestra en
la Figura 9, el individuo hipersensible tuvo una respuesta fuerte al
epítopo de célula T representado por el péptido E05. Este resultado
confirma que, mediante la puesta en práctica del ensayo según la
invención, es posible predecir los principales epítopos
identificados mediante las células T de un individuo
hipersensible.
La Fig. 10 enseña la respuesta de células T a
varias sustituciones de alanina en el péptido E05 derivado de la
proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada a un
individuo conocido por ser hipersensible a la proteasa de
Bacillus lentus. La sustituciones de alanina se emplearon
como sustituciones con el fin de determinar el papel de cualquier
residuo específico dentro del epítopo. La leyenda de la Figura 10
se refiere a la posición del péptido en el cual una alanina fue
sustituida, i.e., en el péptido E06 (secuencia GSISYPARYANAMAV), G
hasta A = 2, S hasta A = 3, I hasta A = 4, S hasta A = 5, Y hasta A
= 6, P hasta A = 7, R hasta A = 8, Y hasta A = 9, N hasta A = 10, M
hasta A = 11 y V hasta A = 12. Como se indica en la Figura 10, la
sustitución de cualquiera de los residuos R170A, Y171A y/o N173A en
la proteasa de Bacillus lentus da como resultado una
respuesta espectacularmente reducida en la muestra de sangre del
individuo hipersensible.
A partir de estos resultados, parece que los
residuos 170, 171 y 173 dentro de este péptido son críticos para la
respuesta de células T. En consecuencia, además parece que estos
residuos son ampliamente responsables de la iniciación de la
reacción alergénica dentro de la proteasa procedente de Bacillus
lentus.
Claims (6)
1. Un método para determinar epítopos de células
T en una proteína, que comprende las etapas de:
(a) obtener una solución de células dendríticas y
una solución de células T ingenuas CD4+ y/o CD8+ de una única
muestra de sangre humana;
(b) estimular la diferenciación de la mencionada
solución de células dendríticas;
(c) combinar la mencionada solución de células
dendríticas diferenciadas y las mencionadas células T ingenuas CD4+
y/o CD8+ con un péptido de interés;
(d) medir la proliferación de células T en la
mencionada etapa (c).
2. Un método para reducir la alergenicidad de una
proteína que comprende, habiendo identificado un epítopo de células
T en la mencionada proteína mediante el método de la reivindicación
1, modificar la mencionada proteína para neutralizar el mencionado
epítopo de células T.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde el mencionado epítopo se modifica mediante:
(a) sustitución de la secuencia de aminoácidos
del epítopo por una secuencia análoga procedente de un homólogo no
humano de la proteína de interés;
(b) sustitución de la secuencia de aminoácidos
del epítopo por una secuencia análoga procedente de un homólogo no
humano de la proteína de interés, cuya secuencia análoga produce una
menor respuesta alergénica frente a células T que la de la proteína
de interés; o
(c) sustitución de la secuencia de aminoácidos
del epítopo por una secuencia que sustancialmente imita la
estructura terciaria principal atribuida al epítopo, pero que
produce una menor respuesta alergénica frente a células T que la de
la proteína de interés.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o
reivindicación 3, en donde la proteína es una proteasa.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4,
en donde la proteasa es subtilisina.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5
que depende de la reivindicación 3(a), en donde el mencionado
epítopo es modificado mediante sustitución de la secuencia de
aminoácidos del epítopo por una secuencia una secuencia procedente
de subtilisina humana, furina o una kexina.
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