CN104840455A

CN104840455A - 反式类胡萝卜素、其合成、制剂和用途

Info

Publication number: CN104840455A
Application number: CN201510128602.XA
Authority: CN
Inventors: 约翰·L·盖纳; 马克·兰茨
Original assignee: Diffusion Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Diffusion Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2015-08-19
Also published as: KR101315904B1; IL185460A; ZA200707712B; EA200701799A1; CA2598882C; JP2015108001A; JP2012051896A; JP2010077154A; US20180271979A1; US20160199490A1; IL185460A0; EP1853544A2; KR20070106567A; US20060194973A1; WO2006104610A2; US9950067B2; AU2006229688A1; NZ561664A; US20120095099A1; CA2598882A1

Abstract

本发明涉及反式类胡萝卜素、其合成、制剂和用途。本发明涉及反式类胡萝卜素化合物和其盐以及其组合物、制备其的方法和其用途。这些化合物可用于提高包括人类在内的哺乳动物的红细胞和体组织间的氧的扩散能力。

Description

反式类胡萝卜素、其合成、制剂和用途

本申请是分案申请，其原申请的申请号为200680013663.0，申请日为2006年2月24日，发明名称为“反式类胡萝卜素、其合成、制剂和用途”。

本申请要求2005年2月24日提交的临时申请60/655,422的利益，在此以参考的方式将其全部内容引入本申请。

本发明的完成得到了美国海军研究处授予的合同号N00014-04-C-0146的政府资助。政府在本发明中享有某些权利。

本发明包括：制备反式类胡萝卜素、双极性反式类胡萝卜素(BTC)(包括双极性反式类胡萝卜素盐(BTCS)如反式藏花酸钠(TSC))、化合物自身的改进的化学合成方法，其配制和给药的方法以及使用它们的方法。

背景技术

类胡萝卜素是一类由类异戊二烯单元组成的碳氢化合物，所述类异戊二烯单元以相对于分子中心呈反转排列的方式连接。分子的主链(骨架)由共轭的碳-碳双键和单键组成，也可以含有侧基。虽然一度认为类胡萝卜素的骨架含有40个碳，但是早已证实类胡萝卜素也可以具有少于40个碳原子的碳骨架。围绕碳-碳双键的四个单键都处于同一平面。如果侧基都在碳-碳双键的同一侧，这些基团被定义为顺式；如果侧基分别在碳-碳键的相反侧，则其被定义为反式。因为有大量双键，类胡萝卜素有极大的可能发生几何(顺/反)异构，并且异构化容易在溶液中出现。在类胡萝卜素的许多特性等方面已有一系列的很好的参考书(“Carotenoids”,G.Britton,S.Liaaen-Jensen和H.Pfander编辑，Birkhauser Verlag，巴塞尔,1995，在此以参考的方式引入其全部内容)。

许多类胡萝卜素是非极性的，并因此不溶于水。这些化合物极端疏水，使得难以制备其生物用途的制剂，因为，为了溶解它们，就必须使用有机溶剂而不是水性溶剂。另一些类胡萝卜素是单极性的，具有表面活性剂的特征(一个疏水部分和一个亲水极性基)。因此，这些化合物被吸引在水溶液的表面而不是溶解于本体液体中。存在少量的天然双极性类胡萝卜素化合物，这些化合物包含中心疏水部分以及各自位于分子一端的两个极性基团。据报道(“Carotenoids”,Vol.1A,p.283)，类胡萝卜素硫酸酯具有“至多0.4mg/ml的显著的水溶解度”。其他可能被认为是双极性的类胡萝卜素在水中也不太溶解。这包括二醛和二酮。也报道了藏花酸的双吡啶盐，但在室温下其水溶解度小于1mg/ml。双极性类胡萝卜素的其他例子是藏花酸和藏花素(都是在香料藏红花中发现的)。然而，藏花酸只是少量溶于水。实际上，在所有的天然双极性类胡萝卜素中，只有藏花素显示出显著的水溶解性。

美国专利4,176,179；4,070,460；4,046,880；4,038,144；4,009,270；3,975,519；3,965,261；3,853,933和3,788,468(在此以参考的方式引入每一个专利的所有内容)涉及藏花酸的各种用途。

美国专利6,060,511涉及反式藏花酸钠(TSC)和其用途。通过将天然存在的藏红花与氢氧化钠反应，然后提取而制得TSC。专利6,060,511包括制备双极性反式类胡萝卜素盐(反式藏花酸钠)的提取方法、经纯化的提取所得组合物和该组合物的各种用途如提高氧扩散能力和治疗出血性休克。

PCT申请US03/05521涉及制备双极性反式类胡萝卜素盐的化学合成方法和使用其的方法。

下图表示PCT申请US03/05521中所描述的TSC的化学合成过程的最后几步。

如PCT申请所述，TSC的全合成过程通过下面两图所示的多步合成步骤得到了关键中间体“化合物A”和“化合物B”。

非所需二醛向所需二醛的异构化：

对恶性肿瘤或癌症的通常治疗方式是放射疗法。所用的放射线是电磁波或带电或中性粒子的形式。电磁波以X射线或伽马射线为代表。带电的粒子采取电子、质子或重离子的形式，而中子是中性粒子的例子。在治疗过程中，可以通过外部光束、组织间插植或两者的组合来施用放射线。对于放射，拉德(rad)和戈瑞(Gray)是常用的测量单位。1拉德任何形式的放射剂量导致每克靶组织100尔格(erg)的能量吸收，1戈瑞等于100拉德。因此1厘戈瑞(cGy)等于1拉德。对于头和颈部的大部分小肿瘤而言，为时6～6.5周的6000～6500cGy的放射治疗一般就够了。而控制大一些的肿瘤可能需要为时6.5～7.5周的6500～7000cGy的剂量，对于大体积的病变，则需要更高的剂量。已知为时5周的5000cGy的剂量可以控制90-95％病人的亚临床疾病。

活的肿瘤细胞是具有无限分裂的能力的细胞。肿瘤细胞必须失去其再生能力，才可以认为是被杀死了。放射疗法的肿瘤控制是通过消灭肿瘤内的所有活细胞来实现的，并且伴随着每次治疗，既定剂量的放射会导致一定比例(而非大量)的活细胞的死亡。因此，肿瘤体积越大，肿瘤控制所需的总放射剂量就越大。已被放射疗法杀灭或杀死的肿瘤细胞不一定发生形态学的改变，而是通常在有丝分裂期(细胞分裂)显示细胞死亡。重要的是，应注意该死亡可能并不随着放射后的第一次细胞分裂而发生。在细胞死亡变得特别显著前，可能存在几次显然成功的细胞周期，但仍认为该细胞不再存活，因为其无限再生能力已丧失。

肿瘤细胞的放射敏感性受许多因素影响。不久前，据认为肿瘤组织学和定位学在用放射疗法进行肿瘤的潜在控制方面起了重要作用。毫无疑问，某些肿瘤比较难以用放射疗法控制，但不再觉得组织学重要。肿瘤内的活肿瘤细胞的数目和乏氧(缺氧)细胞的比例是决定放射敏感性的主要因素，它们都随特定肿瘤的大小而变。

多年来显而易见的是，氧在肿瘤对放射疗法的敏感性中起着重要作用。已明确确定乏氧肿瘤细胞更有耐放射性。虽然未完全了解该现象的机理，但认为氧的存在可将放射损伤固定在细胞内，否则易变的细胞将会修复。放射敏感性的最大的改变出现在0-20mm Hg范围内，该值明显低于静脉氧压。在实验的实体瘤中，证实有显著的缺氧，且显著的间接证据也表明了人肿瘤内的缺氧状况。缺氧状况会发展，因为肿瘤经常过度生长而不再适应其现有的血液供应。

化学疗法是用于治疗癌症的另一个方法。所施用的药物的实例有例如卡莫司汀(BCNU)、替莫唑胺(TMZ)、顺铂、甲氨蝶呤等，这些药物会导致肿瘤细胞的最终死亡或不再生长。已注意到，像放射疗法一样，化学疗法对乏氧细胞不太成功，而乏氧细胞经常出现在肿瘤中。

每四个美国人中就有一个患有高血压(high blood pressure)或高血压症(hypertension)。这种潜在威胁生命的病症可以在实际上没有症状的情况下存在。血压由两个值表示：收缩压和舒张压。高血压通常定义为收缩压高于140mm Hg或舒张压高于90mm Hg；然而，这些定义已有变化，一些内科医师认为，无论是自然状态下还是在使用抗高血压药物的情况下，人一生的血压都应该维持在120/70。

一些人中，调节血压的系统出了故障：遍布全身的微动脉保持收缩，使得大血管中的压力上升。持续的高血压——根据大多数专家的说法，是高于140/90mm Hg——被称之为高血压症。高血压人群中约90％具有现在所称的“本态性”高血压——该术语是指其没有可确认的病因。在剩余的10％的情况中，血压的升高是因为肾病、糖尿病或其他潜在的紊乱。

发明内容

本发明涉及多种新型的反式类胡萝卜素化合物，以及包含反式胡萝卜素化合物的许多组合物，包括含有反式类胡萝卜素和环糊精的组合物。

本发明也包括合成具有下述结构式的类胡萝卜素化合物的方法：

YZ-TCRO-ZY

其中：

Y＝H或非氢阳离子

Z＝与Y相连的极性基团，和

TCRO＝对称或不对称的反式类胡萝卜素骨架，

所述方法包括下述步骤：使含有共轭碳-碳双键的二醛与维蒂希(Wittig)试剂偶合，并选择性地将偶合步骤的产物皂化。

在其他实施方式中，本发明涉及治疗哺乳动物的肿瘤的方法，该方法包括给哺乳动物施用：i)反式类胡萝卜素，和ii)放射或化学疗法，并涉及治疗哺乳动物的高血压症、心室纤维性颤动或心动过速、或高脂症的方法，该方法包括给需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的反式类胡萝卜素。

附图说明

图1为研究A结果。

图2为研究B结果。

图3为分别施用TSC和进行放射的结果。

具体实施方式

本发明涉及制备反式类胡萝卜素、双极性反式类胡萝卜素(BTC)、包括反式藏花酸钠(TSC)在内的双极性反式类胡萝卜素盐(BTCS)的改进的化学合成方法、这些化合物本身、将这些化合物配制成制剂的方法和使用这些化合物的方法。在此所用的术语“双极性”表示具有各自位于分子的一端的两个极性基团。

在此所述的本发明的新的合成方法是如上所述的合成方法(即，美国申请10/647,132)的改进，在此以参考的方式引入其全部内容。在本发明中，用化合物D代替化合物B。所得的合成通过新的倒数第二个中间体(化合物E)推进到最终产物(如，反式藏花酸钠)(如下图所示)。

在该新的、改进的合成方法中，化合物A(2,7-二甲基八-2,4,6-三烯-1,8-二醛)与化合物D(2-(乙氧羰基)-2-丁烯-4-基-三苯基-溴化鏻即C5维蒂希酯的卤化物)化合。二者反应形成了藏花酸二乙酯或化合物E(2,6,11,15-四甲基-十六碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E-七烯-1,16-二羧酸二乙酯)。然后将化合物E皂化(通过利用氢氧化钠/乙醇)以形成最终的所需产物反式藏花酸钠。

本发明的化合物

本发明涉及反式类胡萝卜素(包括反式类胡萝卜素二酯、二醇、二酮和二酸、双极性反式类胡萝卜素(BTC)和双极性反式类胡萝卜素盐(BTCS)化合物)以及具有下述结构的这些化合物的合成：

YZ-TCRO-ZY

其中：

Y(在两端可以相同或者不同)＝H或非氢阳离子，优选Na⁺或K⁺或Li⁺。Y优选是单价金属离子。Y也可以是有机阳离子，如R₄N⁺、R₃S⁺，其中R是H或C_nH_2n+1，其中n是1～10，优选是1～6。例如，R可以是甲基、乙基、丙基或丁基。

Z(在两端可以相同或者不同)＝与H或阳离子相连的极性基团。该基团选择性地包括类胡萝卜素(或类胡萝卜素的相关化合物)的末端碳，该基团可以是羧基(COO^-)或CO基(如酯、醛或酮基)，或羟基。该基团也可以是硫酸基(OSO₃ ^-)或单磷酸基(OPO₃ ^-)、(OP(OH)O₂ ^-)、双磷酸基、三磷酸基或其组合。该基团也可以是酯基COOR，其中R是C_nH_2n+1。

TCRO＝反式类胡萝卜素或类胡萝卜相关骨架(优选少于100个碳)，其是直链的骨架，有侧基(定义如下)，并代表性地包括“共轭”或交替的碳-碳双键和单键(在一个实施方式中，TCRO像在番茄红素中那样并未完全共轭)。侧基(X)代表性地是甲基，但也可以是如下讨论的其他基团。在一个优选实施方式中，骨架单元以相对于分子中心呈反转排列的方式连接。环绕碳-碳双键的4个单键都处于同一平面。如果侧基在碳-碳双键的同一侧，则被称为顺式(也称之为“Z”)；如果侧基分别在碳-碳双键的相反侧，则被称为反式(也称之为“E”)。全文中，异构体指的是顺反异构体。

本发明的化合物是反式的。顺式异构体一般是不利物质，其不能导致扩散能力的提高。在一个实施方式中，当骨架保持直链时，顺式异构体可被使用。侧基的布置相对于分子的中心点可以对称，也可以不对称，使得分子的左侧与分子的右侧在侧基类型或其相对于中心碳的空间关系上显得不相同。

侧基X(可以相同或不同)是氢(H)原子；或直链或支化的烃基，该烃基具有的碳为10个以下，优选是4个以下(选择性地包含卤素)；或卤素。X也可以是酯基(COO^-)或乙氧/甲氧基。X的例子是甲基(CH₃)、乙基(C₂H₅)、环上有或没有侧基的苯基或单芳香环结构、含卤素的烷基(C1-C10)如CH₂Cl，或卤素如Cl或Br或甲氧基(OCH₃)或乙氧基(OCH₂CH₃)。侧基可以相同或不同，但所用侧基必须使骨架保持直链。

虽然自然界中存在许多类胡萝卜素，但不存在类胡萝卜素盐。共有的美国专利6,060,511涉及反式藏花酸钠(TSC)，在此以参考的方式引入其全部内容。通过将天然存在的藏红花与氢氧化钠反应，随后进行主要选择反式异构体的提取，而制得TSC。

类胡萝卜素或类胡萝卜素盐的顺式和反式异构体的存在可以通过观察溶于水溶液中的类胡萝卜素样品的紫外-可见光谱来确定。在得到光谱的情况下，将出现在可见光的波长范围380-470nm内的最高峰的吸收值(波长值取决于所用溶剂和BTC或BTCS的链长。侧基的加入或链长的不同都会改变该吸收峰，但本领域技术人员将识别出可见光范围内对应于这些分子的共轭主链结构的吸收峰的存在)除以出现在UV波长范围220-300nm内的峰的吸收值，所得的值可以用来确定反式异构体的纯度水平。当反式类胡萝卜素二酯(TCD)或BTCS溶于水时，可见光波长范围的最高峰在380～470nm(取决于确切的化学结构、骨架长度和侧基)，UV波长范围的峰在220～300nm。按照M.Craw和C.Lambert,Photochemistry and Photobiology,Vol.38(2),241-243(1983)(在此以参考的方式引入其全部内容)，计算结果(在分析藏花酸时)为3.1，纯化后提高到6.6。

利用为UV和可见光波长范围设计的比色杯，对共有美国专利6,060,511的藏花酸的反式钠盐(通过将天然存在的藏红花与氢氧化钠反应，随后进行主要选择反式异构体的提取，而制得TSC)进行Craw和Lambert分析，所得值平均为约6.8。对本发明的合成TSC进行该测试，比值大于7.0(如7.0-8.5)，优选大于7.5(如7.5-8.5)，最优选大于8。合成的材料是“更纯的”或高度纯化的反式异构体。

不对称化合物

不对称化合物的一些例子包括但不限于下述化合物：

1)来自实施例6——化合物P的合成

(2,4,9-三甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二乙酯)

(2,4,9-三甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二钠)

2)来自实施例8——化合物U的合成

(2,6,11-三甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二乙酯)

(2,6,11-三甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二钠)

3)来自实施例9——化合物W的合成

(2,4,9,13-四甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二乙酯)

(2,4,9,13-四甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二钠)

本领域技术人员公知，不对称性可以通过侧基的空间位置以及TCRO链的长度，或者通过改变分子一端或两端的侧基类型来获得。此外，如同对称反式类胡萝卜素分子的情况，不对称反式类胡萝卜素分子可以有不同的阳离子、极性端基和链长。

中间化合物

在制备类胡萝卜素化合物和其盐时，得到最终产物前合成了某些中间化合物。

例如，在TSC的合成中，本发明方法中的化合物A和D偶合后的关键中间体如下所示。首先是藏花酸二乙酯。也可以用藏花酸二甲酯替代藏花酸二乙酯，也可以是化合物的二丁酯等形式。一些中间体(用于本文的实施例中提供的大量的BTCS分子)的结构如下所示：

藏花酸二乙酯

(2,6,11,15-四甲基-十六碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E-七烯-1,16-二羧酸二乙酯)

(4,9-二甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二乙酯)

(2,4,9-三甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二乙酯)

(2,4,9,11-四甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二乙酯)

(2,6,11-三甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二乙酯)

(4,8,13,17-四甲基-二十碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E-九烯-1,20-二羧酸二乙酯)

(2,4,8,13,17,19-六甲基-二十碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E-九烯-1,20-二羧酸二乙酯)

本发明的化合物的合成

本发明的一个实施方式涉及对共有的PCT申请US03/05521和美国申请10/647,132所述方法的最后几步所作出的改进。在新发明中，通过一步或两步偶合反应将用于合成长链类胡萝卜素的C10二醛(前文表示为化合物A)或C20二醛与维蒂希盐反应(C2、C3、C5、C10、C15或其他)以形成一个中间体或两个中间体(每个偶合步骤各形成一个)。然后将最终中间体皂化以形成所需链长的、对称的盐式BTCS。

具体地说，在TSC(在本文的实施例1和2中详细描述)的合成中，本发明涉及导致产生了倒数第二个中间体即化合物E的包括化合物A和化合物D(而不是化合物B)的偶合反应。然后通过与氢氧化钠的皂化反应将化合物E转化为TSC。在本发明中，形成的TSC产物与在先的共有申请中所述的产物相比具有更高的产率和纯度(在组成上和异构体方面)。

产生更高产率和纯度的对类胡萝卜素如反式藏花酸钠(TSC)的合成的改进

1)反应体系所用的四氢呋喃溶剂

本发明中，化合物A和D的偶合反应发生在四氢呋喃溶剂体系中。用四氢呋喃/甲苯作为偶合反应的反应媒介。该步的产率通常在55-60％之间。比较起来，PCT申请US03/05521中所述的合成用苯作为类似的偶合反应(化合物A和B之间)的媒介，该步的产率为33％。

用四氢呋喃溶液作为偶合反应的溶剂是因为它对维蒂希反应是pH中性溶剂体系。pH中性体系是有利的，因为1)在pH中性环境中没有盐产生，2)抑制或消除了醇类的产生，和3)抑制了最终化合物的沉淀。另外，四氢呋喃和极高纯原料(化合物A和D)的应用使得不需要为磷叶立德转换而用NaOH进行二次反应步骤(如PCT申请中所述)。本发明的偶合步骤因此减少为一步反应，提高了产物总产率。

其他可用于此步骤的溶剂包括二氯甲烷/氢氧化钠和乙醇钠或甲醇钠。

2)皂化步骤中的乙醇

在新合成方法的第二步中，二酯(化合物E)皂化为TSC是以乙醇为溶剂而进行的。将乙醇/氢氧化钠媒介用于反应混合物使得此步的产率为92.0％(未校正)，校正产率为80％。这里报道的是纯化后的产率。观察到反应物的完全转换。

二乙酯(化合物E)难溶于水和PCT申请US03/05521的合成方法中所用的溶剂如THF。因此，本发明中采用了对二乙酯更有利的溶剂乙醇，显著减少了反应时间并最终导致更高的产率。本步骤的其他合适的替代物是异丙醇或甲醇。

对合成过程所做的改变的结果总结在下表中，该表显示了本发明方法和PCT申请US03/05521及美国申请10/647,132方法之间的纯度和产率的不同。重要的是，应注意本方法在倒数第二步经由藏花酸二乙酯(化合物E)，而PCT申请US03/05521在同样的步骤经由藏花酸二甲酯(化合物C)。

两种方法合成的反式藏花酸钠的特征对比

改进的粒径分布

乙醇洗涤

在使用了乙醇洗涤步骤的实验中，产物的最终含水量较低(即0.5wt％)，与之相比，使用水洗涤步骤时最终产物的含水量是1.8wt％。使用乙醇洗涤降低了同批次内的粒径的易变性，使得分布更均匀。用PCT申请US03/05521的方法所制备的TSC的分布是双峰式的，而本发明显示单一的正态分布。这一改进特别重要，因为粒径可以影响溶解性，更均匀的分布可获得更均一的溶解性。

因此，本发明包括合成具有下式的反式类胡萝卜素化合物的方法：

YZ-TCRO-ZY

其中：

Z(在两端可以相同或者不同)＝与H或阳离子连接的极性基团，选择性地包括类胡萝卜素(或类胡萝卜素的相关化合物)的末端碳，该基团可以是羧基(COO^-)或CO基(如，酯、醛或酮基)，或羟基。该基团也可以是硫酸基(OSO₃ ^-)或单磷酸基(OPO₃ ^-)、(OP(OH)O₂ ^-)、双磷酸基、三磷酸基或其组合。该基团也可以是酯基COOR，其中R是C_nH_2n+1。

TCRO＝反式类胡萝卜素或类胡萝卜相关骨架(优选少于100个碳)，其是直链的骨架，有侧基(定义如下)，并代表性地包括“共轭”或交替的碳-碳双键和单键(在一个实施方式中，TCRO像在番茄红素中那样并未完全共轭)。侧基代表性地是甲基，但也可以是如下讨论的其他基团。在一个优选实施方式中，骨架单元以相对于分子中心呈反转排列的方式连接。环绕碳-碳双键的4个单键都处于同一平面。如果侧基在碳-碳双键的同一侧，则基团被称为顺式(也称之为“Z”)；如果侧基分别在碳-碳双键的相反侧，则被称为反式(也称之为“E”)。本发明的化合物是反式的。顺式异构体一般是不利物质，其不能导致扩散能力的提高。在一个实施方式中，当骨架保持直链时，顺式异构体可被使用。侧基的布置相对于分子中心点可以对称，也可以不对称，以使分子的左侧与分子的右侧在侧基类型或其相对于中心碳的空间关系上显得不相同。

该方法包括将含有共轭碳-碳双键的对称二醛与维蒂希试剂偶合，维蒂希试剂例如：如[3-甲氧羰基-2-亚丁烯-1-基]三苯基正膦等三苯基正膦，或如C5维蒂希酯卤化物(诸如D(2-(乙氧羰基)-2-丁烯-4-基-三苯基-溴化鏻))等三苯基溴化鏻，或如三苯基膦酰乙酸酯等C2、C3或C5膦酰酯。维蒂希试剂也可以是三苯基氯化鏻或上述溴化物与氯化物的混合物。需要一步还是两步偶合反应取决于所需TCRO链的长度。链较长时需要多于一步的偶合反应，每一步所用的维蒂希试剂相同或不同，如本文的实施例所示。

有利的是，偶合反应在pH中性溶剂体系中进行，如四氢呋喃溶剂体系，该体系可选择性地包括甲苯；或二氯甲烷/氢氧化钠和乙醇钠或甲醇钠。

偶合步骤后是分离偶合反应的目标产物的步骤。

偶合步骤后，可以进行第二偶合反应步骤并如上所述将产物分离，或者将上述步骤分离出的产物皂化以形成BTCS化合物。如果包括第二偶合反应，则将来自第二步的产物分离然后皂化。产物可以利用NaOH、LiOH、KOH的溶液并以甲醇、乙醇或异丙醇作为溶剂进行皂化。

皂化步骤后，可以用乙醇或水洗涤所需产物。一些情况下，甲醇或异丙醇也是合适的洗涤溶剂。

本发明药用级别化合物和组合物的制剂和施用

在将包括BTCS如反式藏花酸钠(TSC)在内的反式类胡萝卜素与其他成分(赋形剂)配制成制剂时，有利的是：提高BTC的溶解性(增加活性剂(如TSC)在溶液中的浓度)、稳定性、生物利用率和等压平衡，降低水溶液的pH值，和/或提高水溶液的重量克分子渗透浓度。赋形剂应起到防止单体BTC单元在溶液中的自聚或防止BTC的过早沉淀的添加剂的作用。赋形剂的加入应有助于这些方面中的至少一个方面。双极性反式类胡萝卜素(BTC)分子可以以多种方式配制成制剂。一种基本制剂是BTC在无菌水中的混合物，该制剂通过静脉注射给药。该制剂可以通过包含各种药学赋形剂(包括环糊精)来进行改进。这种制剂也可以通过静脉注射给药。

上述各种液体制剂的任何一种都可以冷冻干燥(冻干)以形成具有更高溶解性和稳定性特征的干粉。这样的粉末剂型可重新构造以便于给药。一种方法是在液体如注射用盐水或无菌水中重新构造粉末，然后通过静脉注射给药。该方法可包括使用多室注射器，该注射器在一室包含粉末，在另一室包含液体。同样地，该产品可以装入针剂药水瓶，瓶中包含能将粉末与液体分离的隔离物。给药前，在静脉注射前将隔离物破坏并将各组分混合。

除了静脉注射，用于具体配制的反式类胡萝卜素分子的给药途径还包括肌内注射、吸入递药、口服和经皮给药。

环糊精

为了施用一些药物，需要添加另一种有助于提高活性药物成分(API)的吸收/溶解性/浓度的化合物。这样的化合物称为赋形剂，环糊精是赋形物的例子。环糊精是得自淀粉的环状糖链。它们之间的区别在于结构中吡喃葡萄糖单元的数目。母体环糊精含有六、七和八个吡喃葡萄糖单元，分别称为α-、β-和γ-环糊精。环糊精首次发现于1891年，作为药用制剂的一部分，其已被使用多年。

环糊精是环状(α-1,4)-连接的α-D-吡喃葡萄糖的寡糖，该寡糖含有相对疏水的中心空穴和亲水性外表面。在制药工业中，环糊精已主要用作络合剂以增加难溶于水的药物的水溶性和增加其生物利用度和稳定性。此外，环糊精可用以降低或防止对肠胃或眼睛的刺激，降低或消除不良气味或味道，防止药-药或药-添加剂的相互作用，或甚至将油状或液体的药物转化为微晶或无定形粉末。

虽然BTC化合物溶于水，但环糊精的使用能使溶解性进一步提高，使得可以施用更少体积的药物溶液来达到指定剂量。

许多环糊精可与本发明的化合物一起使用。参见例如，美国专利4,727,064，在此以参考的方式引入其全部内容。优选的环糊精是γ-环糊精，2-羟丙基-γ-环糊精和2-羟丙基-β-环糊精，或其他能增加BTC溶解性的环糊精。

将γ-环糊精与TSC一起使用能将TSC在水中的溶解性提高3-7倍。虽然这并不如用环糊精提高活性剂溶解性的其他一些情况下所见的因数那么大，但其重要性在于，可以以较小体积的剂量对人(或动物)进行非肠道给药。TSC和γ-环糊精的剂量已产生含有多达44毫克的TSC每毫升溶液的水溶液。该溶液无需等摩尔。γ-环糊精的掺入也使得TSC在肌内注射时可以被吸收到血流中。吸收较快，且可快速达到TSC的有效血液水平(如大鼠中所示)。

环糊精制剂可与其他反式类胡萝卜素和类胡萝卜素盐一起使用。本发明也包括非盐的类胡萝卜素(例如，酸式如藏花酸、藏花素或上面所注明的中间化合物)和环糊精的新型组合物。换句话说，非盐的反式类胡萝卜素可以与环糊精一起配制成制剂。为了重量克分子渗透浓度，可加入甘露醇，或者将环糊精-BTC混合物加入到等渗盐水中(参见下面)。

所用环糊精的量要能容纳反式类胡萝卜素，但不能太多，否则无法释放反式类胡萝卜素。

环糊精-甘露醇

反式类胡萝卜素如TSC可以与环糊精(如上所述)和非代谢糖如甘露糖(如，d-甘露糖，可调节渗透压使之与血液的渗透压相同)一起配制成制剂。含有多于20mgTSC/毫升溶液的溶液可用此方法制备。该溶液可以添加到等渗盐水或其他等渗溶液中以使其稀释并仍保持合适的渗透压。参见实施例12。

甘露醇-乙酸

BTCS如TSC可以与甘露醇如d-甘露醇和用来调节pH的弱酸如乙酸或柠檬酸一起配制成制剂。溶液的pH应该在8-8.5左右。该溶液应近似为等渗溶液，并且因此可以被直接注射到血流中。参见实施例13。

水+盐水

BTCS如TSC可以溶于水中(优选是可注射水)。然后可以将此溶液用水、标准盐水、林格氏(Ringer’s)乳酸盐或磷酸盐缓冲液稀释，且将所得混合物注入(infuse)或注射。

缓冲液

可以将缓冲液如甘氨酸或碳酸氢盐以约50mM的水平添加到制剂中，以稳定BCT如TSC。

TSC和γ-环糊精

TSC相对环糊精的比例以TSC:环糊精的溶解度数据为基础。例如，20mg/ml TSC，8％γ-环糊精，50mM甘氨酸，2.33％的甘露醇，且pH8.2±0.5；或10mg/ml TSC和4％环糊精，或5mg/ml TSC和2％环糊精。这些成分的比值可以稍有改变，这对本领域技术人员是显而易见的。

甘露醇可用于调节重量克分子渗透浓度，其浓度可根据其他成分的浓度而改变。甘氨酸保持恒量。TSC在较高pH下更稳定。为了稳定性和生理相容性，需要8.2±0.5左右的pH。甘氨酸的使用与冻干法相容。作为选择，可用50mM的碳酸氢盐缓冲液代替甘氨酸来配制TSC和环糊精。

γ-环糊精的内毒素的去除

市售的药用级别的环糊精具有不适于静脉注射的内毒素水平。必须降低内毒素水平以在用于静脉注射的BTC制剂中使用环糊精。

冻干法

可以用冻干法和其他结晶方法来干燥BTC药物。

本发明的化合物也可以根据美国申请10/647,132所述的配方部分来配制。

肺部给药

已证实，肺部给药后，TSC被吸收到血流中。γ-环糊精的掺入增加了TSC进入体循环的吸收——总体效果是提高了血浆清除率。并且，注射体积的增加导致更多的TSC吸收，且持续更长的时间。因此，同样剂量的更大体积的注射产生更高的生物利用度。已发现，通过肺部途径施用TSC可以成功治疗大鼠的出血性休克。

肺部吸收不需要环糊精。由pH'd去离子水中的TSC构成的肺部研究表明，其能成功地吸收到血流中。

肌内给药

将TSC简单地溶解在去离子水中时，其不能通过肌内途径吸收；但是，环糊精的加入(像在所配制的药物产品中那样)导致其能吸收到血流中。γ-环糊精和TSC一起施用，使其能成功吸收到体循环中。已发现，通过肌内注射方式施用TSC可以成功治疗大鼠的出血性休克。当通过肌内注射施用TSC时，TSC与丙二醇、聚乙二醇聚合物(PEG)和其他试剂的制剂也有助于其吸收到血流中。这些试剂也可以与用于肌内给药的其他BCT一起使用。

经皮给药

已证实，在大鼠中，TSC与环糊精一起配制成制剂时，在经皮给药后，TSC能被吸收到血流中。当经皮施用TSC时，TSC与丙二醇、聚乙二醇聚合物(PEG)、DMSO和其他试剂的制剂也有助于其吸收到血流中。这些试剂也可以与其他皮肤施用的BCT一起使用。

口服给药

已证实，口服给药后，TSC能被吸收到血流中。已发现环糊精如γ-环糊精与BCT如TSC的混合增强了TSC进入体循环的吸收。BCT与丙二醇、聚乙二醇聚合物(PEG)和其他试剂的制剂也增强其进入血流的口服吸收。

本发明的化合物和组合物的用途

本发明的化合物和组合物可被用于治疗包括人在内的哺乳动物的多种紊乱。本发明的上述化合物(包括中间化合物)可用于下面的用途，也可用于美国申请10/647,132中所述的用途。

反式类胡萝卜素和恶性肿瘤的放射

为了克服肿瘤细胞的缺氧(其产生耐放射性)，氧疗法是有用的。实际上，已进行定量，其被称为氧增强比(OER)。该值表明在缺氧条件下达到既定水平的细胞存活的放射剂量大于细胞富氧时的所述放射剂量，且二者之比为常数因子。在多数哺乳动物的细胞中，OER是2.5～3。换句话说，需要用杀灭富氧细胞所需放射剂量的2.5～3倍来杀灭乏氧细胞。因此，提高对肿瘤的氧输送使得可以用更低的放射剂量“杀灭”恶性细胞。这在多种肿瘤中都很重要。

已证实，使用双极性反式类胡萝卜素化合物如反式藏花酸钠可以增加到达缺氧组织的氧气量；因此，它是非常有效的放射敏化剂。它可以降低所用的放射剂量，或者增加放射的有效性并使得肿瘤消退和痊愈。其对目前使用放射的任何种类的癌症都有用。约60％的癌症患者在进行放射治疗，通常使用为时数周的约6000-6500cGy的放射剂量。BTC或BTCS如TSC可以与放射合并使用，以达到更高的治愈率。一个实施方式中，在每次放射剂量前，以0.02～2mg/kg施用TSC，优选是0.05～1mg/kg。

对于其他类型的剂量给药，要使用更高的剂量(如高3倍，因为以其他途径施用时TSC不能完全吸收)。

一个实施方式中，除了施用BTC化合物如TSC外，还采用了其他方法如使用高压氧、呼吸纯氧气体或施用其他化合物如米索硝唑，以提高放射的有效性。这些附加的方法也可以与下面论述的其他用法(如，化学疗法)一起使用。

随放射治疗一起使用的本发明的化合物可用于治疗多种类型的肿瘤，包括：鳞状细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、类肉瘤、骨肉瘤、与皮肤癌有关的肿瘤、乳癌、头部和颈部癌、妇科癌、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌(如结肠癌)、主消化腺/器官(如胃、肝、胰腺)癌、CNS(中枢神经系统)癌(包括脑癌如神经胶质瘤)和肺癌。

反式藏花酸钠(TSC)已成功用作移植到小鼠上的人癌症的放射敏化剂。已进行的研究表明0.07mg/kg～0.18mg/kg范围剂量的TSC可以增强对这些肿瘤类型的放射效果。

反式类胡萝卜素和化学疗法

已证实，反式类胡萝卜素化合物如反式藏花酸钠能提高到达缺氧组织的氧气的量；这使其可与癌症的化学疗法结合使用。这使得化学疗法有效性提高。其对现在使用化学疗法的各种类型的癌症都有用。大多数癌症患者在进行使用多种多样的试剂的化学治疗。BTC或BTCS如TSC可以与化学疗法结合使用以使肿瘤消退和达到更高的治愈率。在一个实施方式中，在每次静脉施用化学疗法的药剂之前、之中或之后，以0.02～2mg/kg施用TSC，优选是0.05～1mg/kg。如果通过其他途径进行剂量给药，因为生物利用度的降低，该剂量需要增加2～3倍。

本发明的化合物与化学疗法一起可用于治疗多种类型的肿瘤，包括：鳞状细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、类肉瘤、骨肉瘤、与皮肤癌有关的肿瘤、乳癌、头部和颈部癌、妇科癌、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌(如结肠癌)、主消化腺/器官(如胃、肝、胰腺)癌、CNS癌(包括脑癌如神经胶质瘤)和肺癌。

心室纤维性颤动

心脏在电信号通过时跳动。心室纤维性颤动(“V fib”)是心脏的电活动变得紊乱的一种病症。当这种病症发生时，心脏的下(泵)心室以快速、非同步的方式收缩(心室“颤动”而不是跳动)。心脏几乎不泵出血液。

心室纤维性颤动是一种很严重的病症。除非立即提供医疗帮助，否则几分钟内就会随之出现虚脱和突然心脏死亡。如果及时治疗，心室纤维性颤动和心动过速(极快速的心跳)可以转化为正常节律。对这种病症的现有疗法需要用称之为除颤器的装置来电击心脏。校正威胁生命的节律的另一个有效方法是利用称之为植入式心律转变器-除颤器的电子装置。如果心脏自身的电信号变得紊乱，这种装置可以电击心脏使心跳正常化。

心室纤维性颤动和心动过速都可利用本发明的化合物如反式藏花酸钠(TSC)来“校正”。在心肌梗塞的临床前研究过程中进行静脉注射TSC时，预防了心室纤维性颤动。此外，已证实，TSC能减轻患有出血性休克的大鼠的心动过速。

如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

高血压症

人的氧消耗随着衰老而下降。此外，高血压的发生率随着年龄而上升。虽然不希望局限于具体理论，但据信这两种因素是相关的，即，在组织的氧消耗下降后，血压会升高以给组织提供更多的氧。因此，如果以其他方式提供更多的氧，则血压会下降。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

如TSC等本发明的化合物可降低收缩压，也可降低舒张压。本发明的化合物也能使心率下降，从而使得脉率(高血压症患者的脉率经常升高)下降。

治疗高血压的TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。

高脂症

如TSC等本发明的化合物能降低包括甘油三酯和胆固醇水平在内的血浆脂质水平。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，剂量需要增加2～3倍。

用于早产婴儿

如TSC等本发明的化合物可用于早产婴儿，以避免心智技能迟钝。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

分娩期间使用

如TSC等本发明的化合物可在分娩期间用于胎儿或母亲以避免分娩过程中胎儿的缺氧。分娩过程中胎儿的缺氧会导致脑损伤或孤独症。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

烟雾吸入后使用

如TSC等本发明的化合物可在吸入大量烟雾后施用。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02～2mg/kg，更优选的是0.05～1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

纤维肌痛

如TSC等本发明的化合物可通过提高细胞内的氧水平而用于治疗纤维肌痛。如果静脉给药，TSC的优选剂量是0.02-2mg/kg，更优选的是0.05-1mg/kg。如果以其他途径给药，因为生物利用度降低，该剂量需要增加2～3倍。

下述实施例是说明性的，而不是对本发明的化合物、组合物和方法的限定。对本领域技术人员来说显而易见的通常遇到的各种条件和参数的其他适当的修改和调整，都包括在本发明的要旨和范围内。

实施例

实施例所用的缩略语表

a/a[％] 相对纯度％

AP 水层

Approx. 约

COA 分析证书

corr. 经校正的

d 天

DCM 二氯甲烷

DSC 差示扫描量热法

E-No. 每个单独化合物的参考号

Eq 当量

EtOAc 乙酸乙酯

FW 化学式量

GMP 药品生产质量管理规范(Good manufacturing principles)

h 小时

H-NMR 氢核磁共振

HPLC 高压液相色谱

HV Herstellungsvorschrift(合成过程)

IPC 过程控制

IT 内温

JT 夹套温度

LC-MS 液相色谱-质谱联用

MeOH 甲醇

min 分钟

ML 母液

MOR 批生产记录

nc 未校正

OP 有机层

RT 室温(约22℃)

sat. 饱和的

soln. 溶液

sm 原料

Temp. 温度

TFA 三氟乙酸

Th. 理论的

TPPO 三苯基氧化膦

TLC 薄层色谱

TSC 反式藏花酸钠(C-013229)

UV 紫外光谱

y. 产率

实施例1

165 g TSC的小规模合成

化学反应概述

化合物E(2,6,11,15-四甲基-十六碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E-七烯-1,16-二羧酸二乙酯)的合成

编号	试剂	分子量	当量	数量单位
					1	化合物A	164.20	1.0	130g
2	化合物D	444.01¹	3.0	1052g
					3	四氢呋喃			0.64L
4	甲苯			1.27L
					5	乙醇			0.15L
6	甲基环己烷			0.79L
					7	四氢呋喃			0.20L
8	甲苯			0.50L
					9	乙醇			0.10L
10	甲基环己烷			0.40L
					11	甲醇			1.00L

过程：

1.将烧瓶抽真空并用氮气净化。

2.JT＝20℃时将化合物A(1)和化合物D(2)加入该烧瓶中。

3.JT＝20℃时将四氢呋喃(3)和甲苯(4)加入该烧瓶中。将该烧瓶抽真空并用氮气净化两次。将反应混合物升温至JT＝100℃。得到均相溶液。

4.在JT＝100℃下将溶液搅拌6.5小时(IT约为93℃)。

5.取出IPC用样品

IPC1#2

没有检测到醛信号(¹H-NMR)，见注释1。

6.将混合物缓慢冷至IT＝20℃(15小时)。

7.形成了红色悬浮液。将悬浮液在2小时内冷至IT＝1℃。

8.在数分钟内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

9.用2℃的冷乙醇(5)冲洗烧瓶。将冲洗液转移到过滤干燥装置中。

10.在22℃下用甲基环己烷(6)洗涤滤饼。

11.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼5小时。

12.得到139.6g的红色固体化合物E。通过¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是93.68％a/a。此外，也观察到2.90+3.00％的顺式异构体。产率(nc)是45.9％。

13.将母液(约3L)浓缩至其体积的40％(仍为红色溶液)，并在JT＝100℃下搅拌15h。(IT约为100℃)。

14.形成了红色悬浮液。取出IPC用样品。

IPC2#1

很少或没有检测到顺式异构体(¹H-NMR)。

15.将混合物用四氢呋喃(7)和甲苯(8)稀释(仍是悬浮液)，并在3.5h内冷至IT＝2.9℃。

16.在10分钟内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

17.用2℃的冷乙醇(9)冲洗烧瓶。将冲洗液转移到过滤干燥装置中。

18.在18℃用甲基环己烷(10)洗涤滤饼。

19.在旋转蒸发仪上在50℃干燥滤饼15小时。

20.得到384.5g的红色固体粗产物。¹H-NMR显示除了所需产物外，有TPPO存在。

21.用甲醇(11)处理粗产物，并在JT＝60℃下搅拌30分钟。

22.将悬浮液在60分钟内冷至JT＝0℃。

23.在数分钟内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

24.用甲醇(11)冲洗烧瓶。将冲洗液转移到过滤干燥装置中。

25.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼2小时。

26.得到143.2g的红色固体粗产物。¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是96.99％a/a。此外，还观察到1.02+1.26％的顺式异构体。产率(nc)是47.0％。¹H-NMR显示有约11.5％的TPPO。

注释

1)2.5小时后取第一次的IPC。结果显示醛已完全消耗，并存在额外的顺式异构体。异构体的比例随着反应时间提高。

样品准备

过程控制(IPC)：	转化：取出约0.5ml的反应混合物，蒸发并用¹H-NMR或HPLC分析。
		纯度：	用HPLC分析6-7mg的产物；方法是HPLC-TSC-M1.1.
¹H-NMR	将5-10mg的产物溶在0.9ml CDCl₃(内标：TMS)中，用于NMR谱。

从化合物E合成TSC

过程：

1.将烧瓶抽真空并用氮气净化。

2.JT＝20℃时将化合物E(1)加入烧瓶中。

3.JT＝20℃时将乙醇(2)和30％NaOH(3)加入烧瓶中。将烧瓶抽真空并用氮气净化两次。将反应混合物升温至JT＝90℃。得到粘稠的橙色悬浮液。

4.在JT＝90℃下将溶液搅拌47小时(IT约为77℃)。

5.16小时内将混合物缓慢冷至IT＝21℃。取出IPC用样品

IPC1#1

98.2％的单酯转化为TSC(HPLC)；没有检测到二酯(化合物E)。

6.用水(4)稀释混合物。

7.在50分钟内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

8.用3℃的冷水(5)冲洗烧瓶并洗涤滤饼。

9.再用5℃和2℃的冷水(6+7)洗涤滤饼。

10.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼20小时。

11.得到164.9g的橙色固体TSC。¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是97.56％a/a。产率(nc)是92.0％。经检测，含水量为1.89％w/w，421nm相比254mn的UV比值为8.42。C₂₀H₂₂O₄Na₂-0.5H₂O-0.2NaOH的元素分析的计算值为：C,61.41；H,6.03；Na,12.93；O,19.63；测试值为：C,61.5；H,6.2；Na:13.0；O,19.8。

样品准备

过程控制(IPC)：	转化：取出约0.5ml的反应混合物，用HPLC分析。
		纯度：	用HPLC分析6-7mg的产物；方法是HPLC-TSC-M1.1.
¹H-NMR	将5-10mg的产物溶在0.9ml D₂O中，用于NMR谱。

实施例2

cGMP条件下大规模(2kg)TSC的制备

反应式概述：

原材料

对原料(化合物A和D)的品质进行检验，测试结果如下：

所有的材料都满足指定规格(化合物D：≥97.0％；化合物A：≥94.0％)。此外，所有的材料都是合成制备的，未使用任何动物成分或者得自动物产品的任何成分。

C-10二醛(化合物A)是黄色晶体状粉末。正膦(化合物D)是介于白色和黄色之间的粉末。结构经¹H-NMR确证。

化合物E的合成

编号	试剂	分子量	当量	数量单位
					1	化合物A	164.20	1.0	2.99 kg
2	化合物D	444.01³	3.0	24.04 kg
					3	四氢呋喃			15 L
4	甲苯			30 L
					5	四氢呋喃			9 L
6	乙醇			4 L
					7	甲基环己烷			18 L
8	甲醇			17.5 L
					9	四氢呋喃			3 L
10	甲苯			11 L
					11	四氢呋喃			7 L
12	甲苯			10 L
					13	甲基环己烷			7 L
14	甲醇			13 L
					15	甲醇			14 L

过程：

1.将100L的反应器抽真空并用氮气净化。

2.JT＝20℃时将化合物A(1)和化合物D(2)加入100L的反应器中。

3.JT＝20℃时将四氢呋喃(3)和甲苯(4)加入反应器中。将100L的反应器抽真空并用氮气净化两次。将反应混合物升温至JT＝100℃。得到均相溶液。

4.在JT＝100℃下将溶液搅拌4小时(IT约为98℃)。

5.在JT＝110℃下，轻度抽真空将溶液浓缩。除去9.0L的溶剂。混合物在JT＝110℃下搅拌13小时(IT约为105℃)。

6.将混合物用四氢呋喃(5)稀释并冷却到IT＝20℃(2.75小时)。形成红

色悬浮液。

7.取出IPC用样品

IPC1#1

没有检测到醛信号(¹H-NMR)，见注释1。

8.将混合物缓慢冷至IT＝0℃(80分钟)。

9.在100分钟内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

10.用冷乙醇(6)冲洗100L反应器。将冲洗液转移到过滤干燥装置中。

11.用甲基环己烷(7)洗涤滤饼。

12.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼4.5小时。

13.得到5.246kg的红色固体粗产物。¹H-NMR谱显示，除了所需产物外，还有实质量的TPPO(约25％～30％)存在。

14.将粗产物转移到过滤干燥器中并用甲醇(8)洗涤。

15.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼19小时。

16.得到3.787kg的红色固体化合物E(粗品3#1)。¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是93.70％a/a。此外，还观察到3.17+2.54％的顺式异构体。产率(nc)是54.1％。

17.在JT＝110℃下，在轻度真空下将母液(约81L)浓缩，除去30L的溶剂。将混合物在JT＝110℃下搅拌12.5小时。(IT约为105℃)。

18.将混合物用四氢呋喃(9)和甲苯(10)稀释并冷却到IT＝20℃(2.75小时)。形成红色悬浮液。

19.取出IPC用样品，冷至0℃并过滤。

IPC3#1

产物中仍有大量TPPO(¹H-NMR)。

20.将混合物用四氢呋喃(11)和甲苯(12)稀释，升温至JT＝60℃并再次冷却至

IT＝20℃。

21.取出过滤样品，并用甲醇洗涤。

IPC3#2

产物中TPPO的含量显著减少(¹H-NMR)。

22.在60分钟内将悬浮液冷却到1℃，并在60分钟内用过滤干燥器过滤。

23.用甲基环己烷(13)洗涤滤饼。

24.用甲基环己烷(14+15)洗涤滤饼。

25.在旋转蒸发仪上在55℃干燥滤饼4.5小时。

26.得到705g的红色固体粗产物(粗品2#1)。¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是90.01％a/a。此外，在HPLC上也注意到有3.83+5.34％的顺式异构体。产率(nc)是10.1％。总校正产率是63.0％。

注释

1)根据HPLC，异构体的比例是约60:40反式/顺式。

样品准备

过程控制(IPC)：	转化：取出约0.5ml的反应混合物，浓缩并用¹H-NMR或HPLC分析。
		纯度：	用HPLC分析6-7mg的产物；方法是HPLC-TSC-M1.1.
¹H-NMR	将5-10mg的产物溶在0.9ml CDCl₃(内标：TMS)中，用于NMR谱。

从化合物E合成TSC

编号	试剂	分子量	当量	数量单位
					1	化合物E	384.51	1.0	3.70 kg
2	乙醇			15.7 L
					3	30％NaOH			15.0 L
4	水			45 L
					5	乙醇			3.5 L
6	水			39 L
					7	水			39 L
8	水			38 L
					9	乙醇			39 L

过程：

1.将100L的反应器抽真空并用氮气净化。

2.JT＝20℃时将化合物E(1)加入100L反应器中。

3.JT＝20℃时将乙醇(2)和30％NaOH(3)加入100L反应器中。将100L反应器抽真空并用氮气净化两次。将反应混合物升温至JT＝90℃。得到粘稠的橙色悬浮液。

4.在JT＝90℃下将溶液搅拌63小时(IT为81℃)。

5.2小时内将混合物冷至IT＝21℃。取出IPC用样品

IPC1#1

98.7％的单酯转化为TSC(HPLC)；没有检测到二酯(化合物E)。

6.用水(4)稀释混合物。

7.在15小时内用过滤干燥装置过滤悬浮液。

8.用乙醇(5)冲洗100L反应器。

9.用0℃～5℃间的冷水(6、7和8)洗涤滤饼三次。

10.用乙醇(9)洗涤滤饼。

11.在旋转蒸发仪上在50℃干燥滤饼5小时。

12.得到2.186kg的橙色固体TSC。¹H-NMR证实了其结构。HPLC测得纯度是97.96％a/a。产率(nc)是61.2％；见注释1。经测定，含水量为1.58％w/w，421nm相比254 nm的UV比值为8.9。C₂₀H₂₂O₄Na₂-0.34H₂O的元素分析的计算值为：C,63.47；H,6.04；Na,12.15；O,18.35。测试值为：C,63.81；H,5.64；Na:12.21；O,18.34。

13.室温下，将2.184kg粗品#1在搅拌机中振摇4天。用杵将剩下的块状物轻松捣碎，得到2.183kg的橙色固体粗品2#1(对应为AA-013329-Batch-01-2004)。由HPLC得到纯度为98.76％a/a。DSC测定显示没有区别。

注释

1)产物溶于水。因此，此具体情况下过滤时间较长以及另外加水洗涤都会导致观测到的产率变低。进行第三次水洗的目的是为了满足产品中的所需钠含量。

样品准备

过程控制(IPC)：	转化：取出约0.5 ml的反应混合物，用HPLC分析。
		纯度：	用HPLC分析6-7mg的产物；方法是HPLC-TSC-M1.2.
¹H-NMR	将5-10mg的产物溶在0.9ml D₂O中，用于NMR谱。

分析

HPLC方法

流动相制备

溶液A：在H₂O/乙腈(90:10％v/v)中，0.1％的TFA

溶液B： CAN

样品制备：

HPLC参数

积分参数

无

下述HPLC描记线所用的识别表：

保留时间*[min]	分子量(g/mol)	可能结构(C数)	相对保留时间
				3.54	469	化合物D	0.51
4.47	164	化合物A	0.65
				4.99	278	C-009594	0.72
6.90	372	TSC	1.00
				14.30	384	化合物E	2.07

*柱LC-0402对G-1172的特征保留时间

UV方法

-该合成的改进方法

实施例3

反式藏花酸钾(2,6,11,15-四甲基-十六碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E-七烯-1,16-二羧酸二钾)的合成

在下面，反式藏花酸钾也称为TPC或化合物F。化学合成如下所示：

皂化反应(合成中的最后一步)按照与上述实施例1和2中所用的方法相类似的方式进行。二乙酯(化合物E)按照上述实施例1和2所述制备。

对于该实施例，在90℃将化合物E用在乙醇(EtOH,1.5ml/mmol)中的30％的氢氧化钾(KOH，1.5ml/mmol)处理4天。将混合物用乙醇稀释，因为在该过程中会有部分溶剂损失。室温下(22℃)过滤以分离橙色产物，然后用50％的乙醇水溶液洗涤(3次)。JT＝60℃时将产物在旋转蒸发仪上干燥5小时。这样得到86％的反应产率(12g实验)。¹H-NMR谱和LC-MS谱证实了目标产物是反式藏花酸钾。用上述实施例2中所述的HPLC方法，检测波长为421nm时，测得HPLC纯度为98.3％。

实施例4

反式藏花酸锂(2,6,11,15-四甲基-十六碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E-七烯-1,16-二羧酸二锂)的合成

在下面，反式藏花酸锂也称为TLC或化合物G。化学合成如下：

皂化反应按照与实施例1～3中所述相似的方法进行。但在这种情况下，将氢氧化锂用作皂化剂。在该实施例中，化合物E仍按照上述实施例1和2所述合成。90℃下，将化合物E用在乙醇(EtOH,1.5ml/mmol)中的10％的氢氧化锂(LiOH，2.8ml/mmol)处理4天。室温下(22℃)过滤深橙色悬浮液，并用50％的乙醇水溶液(3次)和纯乙醇洗涤。夹套温度(JT)＝60℃时将深橙色固体在旋转蒸发仪上干燥5小时。得到了9.5g的深橙色固体。

该化合物的HPLC分析显示，除了所需产物外仍有38％a/a的原料。有实质量原料残留可能是由该皂化反应中所用的碱液(LiOH)浓度较低引起的。在这种情况下，由于LiOH在水中的溶解性有限，使用了仅10％的LiOH水溶液。在其他实施例中(这里所述的1～3)，用的是30％的碱水溶液。

为了提高反应产率，将前一步骤分离的产物在95℃用在50％乙醇水溶液(2.9ml/mmol)中的固体LiOH(13当量)再处理2天。将第二次氢氧化锂处理所得的橙色产物在室温下过滤分离，并用50％的乙醇水溶液(3次)和纯乙醇洗涤。所得的固体在夹套温度＝60℃时在旋转蒸发仪上干燥3小时。这样得到了14g产物。因为该产率高于理论产率，所以又将其制成水(1.6ml/mmol)的浆液以除去过量的LiOH。将橙色产物在室温下过滤分离，并用50％的乙醇水溶液(3次)和纯乙醇洗涤。在夹套温度＝60℃时将产物在旋转蒸发仪上干燥2小时。这样得到了8.5g的产量，对应总反应产率67％(12g实验)。

¹H-NMR谱和LC-MS谱都证实，得到了所需产物反式藏花酸锂。用上述实施例1中所述的分析方法，检测波长为421nm时，测得HPLC纯度为99.7％

实施例5

TSC的C-14衍生物(4,9-二甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二钠)的合成

与TSC相比具有较短链长的对称化合物的合成需要使用不同的维蒂希试剂，而不是实施例1～4中所示的化合物B。链长较短的BPTC化合物用化合物A即前面所用的C-10二醛来合成。然后通过Horner-Emmons反应或维蒂希偶合反应利用市售的C2或C3膦酸酯或溴化鏻(化合物H)将将化合物A转化，分别形成相应的C14-或C16-酯。用NaOH/EtOH水解以完成反应，形成TSC的所需的C14或C16-衍生物。

TSC的C-14衍生物(化合物J)的合成是通过化合物A和化合物H(乙氧羰基-甲基-三苯基-溴化鏻)反应完成的。如下所示，化合物A和H反应以形成皂化步骤前的最终中间体即化合物I，然后进行皂化步骤而生成化合物J。

形成化合物I的偶合反应

形成化合物I的最佳方法包括使用C2溴化鏻(化合物H)。该偶合反应在如以上实施例1～4中所用的四氢呋喃/甲苯(2:1，0.7ml+1.4ml/mmol)中进行。在夹套温度＝100℃下与3当量的维蒂希试剂反应，得到了良好的产物形成。在0℃过滤分离出黄色产物，然后用甲基环己烷洗涤(两次)。该步的产率是56-61％(10g规模)。

检测波长为369nm时(11.5分钟)，使用HPLC测得纯度为83.4％a/a反式异构体。除了化合物I，HPLC描记线中还发现有三种化合物存在，推测其为化合物I的顺式异构体(1.0％a/a，10.5分钟；13.4％a/a，11.2分钟；2.0％a/a，11.9分钟)。

形成最终产物(化合物J)的皂化反应

将化合物I转变为化合物J的皂化反应以类似于实施例1～4所述的方式进行。在90℃，将二乙酯(化合物I)用在乙醇(4ml/mmol)中的30％的NaOH(2ml/mmol)处理3天。室温下通过过滤分离出黄色产物，然后用50％的乙醇水(5次)和纯乙醇(3次)洗涤。皂化反应的粗产率约为100％。为了提高纯度，在90℃将混合物用在乙醇(1ml/mmol)中的30％NaOH(0.5ml/mmol)浆化4小时。在0℃过滤悬浮液，并用EtOH洗涤(3次)，得到黄色产物，对应79％的未校正产率(10g规模)。¹H-NMR证实合成的是所需产物(化合物J)，检测波长设为383nm时，HPLC纯度为97.8％。

实施例6

TSC的C-15衍生物(2,4,9-三甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二钠)的合成

用化合物K(1-(乙氧羰基)-乙基三苯基溴化鏻，一种C3鏻盐/C3维蒂希酯溴化物)与化合物A反应以制备该反应次序中的第一个中间体即化合物M。作为选择，该第一步中，如果化合物A与化合物L(三乙基-2-膦酰丙酸酯，其为C3膦酯)反应可以得到同样的结果。

在第二步偶合反应中，用化合物H(乙氧羰基-甲基三苯基溴化鏻，其为C2鏻盐/C2维蒂希酯溴化物)与化合物M反应以形成倒数第二个中间体即化合物O。作为选择，化合物O可以通过化合物M和化合物N(三乙基-膦酰乙酸酯，其为C2膦酰酯)之间的反应来形成。

在最后的反应步骤中，化合物O进行皂化反应以形成TSC的C-15不对称衍生物(化合物P)。反应式列于下图：

C15衍生物需要依次使用两种不同的单偶合反应；第一个是同C3膦酰酯或溴化鏻反应，第二个是同C2溴化鏻反应。因为一些C16二乙酯的形成，用硅胶色谱对第一次单偶合反应的粗产物进行纯化。

形成化合物M的第一次偶合反应

将化合物A用1当量的C3溴化鏻(化合物K)在100℃处理1天。该偶合反应在四氢呋喃/甲苯(2:1，0.7ml+1.4ml/mmol)中进行，显示出好的产物形成。冷至室温而后冷至0℃时，没有发现沉淀。然后用硅胶(0.33g/mmol)过滤橙色混合物。用甲苯(1.7ml/mmol)洗涤滤饼。合并滤液并在JT＝45℃下蒸发至干，得到外观为橙色油状物的粗产物。

接下来，将反应混合物蒸发至干。残渣在MeOH中浆化以得到固体形式的粗产物，然后用MeOH洗涤(3次)。由于除了所需的C13单偶合产物化合物M外，还有C16二乙酯存在，使得所得粗产物的品质不佳。因此，用10:1甲基环己烷/EtOAc进行了硅胶纯化步骤。将粗产物溶于二氯甲烷中(0.3ml/克粗产物)。首先将C-16二乙酯(约7％)洗脱。一旦进行该步骤，产率为45％(20g实验)。规模较小时，产率高达70％。据测，品质最佳的产物在检测波长为383nm时(9.22分钟)含有98.1％a/a的反式异构体。有其他化合物存在(1.7％a/a，9.47分钟)，推测其为化合物M的顺式异构体。

形成化合物O的二次偶合反应

用1.5当量的C2溴化鏻(化合物H)在100℃处理化合物M。该偶合反应在四氢呋喃/甲苯(2:1，0.5ml+1.0ml/mmol)中进行，显示出好的产物形成。在0℃通过过滤分离出黄色产物，并用甲基环己烷洗涤两次。该步产率为36％。

为了提高产率，将母液浓缩到原始体积的约一半，并冷至0℃，以27％的产率得到第二批产物。两次产物加和，总产率为63％(13g规模)。

据测，质量最佳的产物(化合物O)在检测波长为383nm时(12.4分钟)含有87.0％a/a的反式异构体。此外，HPLC谱上记录的第二个化合物(11.3％a/a，11.8分钟)可能是化合物O的顺式异构体。

形成最终产物(化合物P)的皂化反应

在90℃，将二乙酯(化合物O)用在乙醇(4ml/mmol)中的30％的NaOH(2ml/mmol)处理3天。室温下通过过滤分离出黄绿色产物，然后用50％的乙醇水溶液(5次)和乙醇(3次)洗涤。皂化反应的产率为83％(6g规模)。

¹H-NMR证实了所需产物化合物P。检测波长为383nm时，化合物P的HPLC纯度为97.0％。此外，记录有对应为1.4％a/a+1.2％a/a的其他可能的顺式异构体。LCMS数据证实了指定结构。

实施例7

TSC的C-16衍生物(2,4,9,11-四甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二钠)的合成

用化合物L(三乙基-2-膦酰丙酸酯，其为C3膦酰酯)与化合物A反应以形成该合成中的关键中间体即化合物Q。作为选择，可以通过化合物A与化合物K(1-(乙氧羰基)-乙基三苯基溴化鏻，其为C3鏻盐/C2维蒂希酯溴化物)之间的反应来制备化合物Q。虽然起始反应物(化合物A、K和L)与实施例6所见相同，但此时所用的反应条件得到了不同的、对称的中间体即化合物Q。

在反应的最终步骤，化合物Q在皂化反应中与氢氧化钠和乙醇反应，生成了最终产物化合物R。化合物R(2,4,9,11-四甲基-十二碳-2E,4E,6E,8E,10E-五烯-1,12-二羧酸二钠)是TSC的C-16对称衍生物。反应式列于下图：

形成化合物Q的偶合反应(用化合物L作为反应物)

C16衍生物(化合物R)的合成按类似于实施例6中所示的方式(化合物A和化合物L之间的偶合反应)开始。在100℃，用化合物L在甲苯/四氢呋喃(2:1)中处理化合物A。不加入碱时没有观测到化学反应，此时，将混合物冷至0℃并加入NaOMe(3当量)。

将从C3磷酰酯(2×1.5当量)和NaOMe在DCM中两次制得的第二批试剂加入到反应混合物中。将反应混合物在JT＝65℃下搅拌，测得更高百分比的目标产物。HPLC谱表明只保留有小百分比的未反应的化合物A(2.3％a/a)。用水淬灭反应混合物，在含有水、饱和NaHCO₃溶液和50％饱和NaCl溶液的溶液中洗涤有机相。蒸发后得到36.4g的化合物Q。

用硅胶(甲基环己烷/EtOAc＝10:1)对化合物Q进行了纯化。得到0.26g浅黄色产物(化合物Q)和4.0g黄色固体(化合物M)。用MeOH作为溶剂以32％的产率分离出酯交换产物化合物Q(二甲酯而不是二乙酯)。醇溶剂也适于该偶合反应。总体来说，该步产物的质量优异，纯度为85.7％。HPLC实验显示主要杂质是化合物Q的顺式异构体。

形成化合物Q的偶合反应(用化合物K作为反应物)

在合成化合物Q的第二次实验时，在偶合反应中以化合物K替代化合物L。该替代显示了更好的总反应转化率。化合物A和化合物K之间的偶合反应是在四氢呋喃/甲苯(2:1，0.9ml+1.8ml/mmol)的混合物中进行的，在JT＝100℃下(22小时)与3当量维蒂希试剂反应显示出好的产物形成。在0℃通过过滤并用甲基环己烷洗涤两次分离出黄色产物。产率为61～62％(10g规模)。¹H-NMR显示，化合物Q的纯度为85.2％a/a反式异构体(波长369nm，13.3分钟)，主要杂质为顺式异构体。

形成最终产物的皂化反应(化合物R)

按照与实施例5所述类似的方式进行皂化反应以制备化合物R。在90℃，将二乙酯(化合物Q)用在乙醇(4ml/mmol)中的30％的NaOH(2ml/mmol)处理3天。室温下过滤并用50％的乙醇水溶液(3次)和EtOH(3次)洗涤后，皂化反应的产率为85％(12.5g规模)。¹H-NMR证实所需产物是化合物R。检测波长为383nm时，HPLC纯度为95.7％。此外，测得3.8％的顺式异构体。LCMS数据证实了指定结构。

实施例8

TSC的C17衍生物(2,6,11-三甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二钠)的合成

TSC的长链不对称衍生物的制备如实施例1～2一样采用化合物A和D作为原料来进行。但是，在这种情况下，改变反应条件，以使其有利于第一偶合用中间体即化合物S的形成。然后化合物S在第二偶合反应中与化合物H反应以生成化合物T。在该反应次序的最后步骤中，化合物T与氢氧化钠和乙醇发生皂化反应以形成最终所需产物化合物U。化合物U是TSC的C17衍生物，其二烯骨架周围的侧甲基的布置方式是不对称的。合成次序的详情列于下图：

形成化合物S的第一偶合反应

将化合物A用1当量的化合物D在100℃处理1天。偶合反应在如实施例1中所用的四氢呋喃/甲苯(2:1，0.44ml+0.88ml/mmol)中进行，显示出好的产物形成。在随后的0℃冷却步骤过程中，由最初的深红色溶液成为悬浮液。最后，在0℃通过过滤并用甲基环己烷洗涤(3次)分离出橙红色固体。经确证，该橙红色固体是前面实施例1～4中所述的化合物E。此时，化合物E的产率约为4％。

将来自前述步骤的母液在JT＝45℃下蒸发至干，得到红色油状的粗品化合物S。所得粗品的质量不佳，因为除了所需产物化合物S外，还有一些化合物E存在。为了分离化合物S，用8:1甲基环己烷/EtOAc进行了硅胶纯化步骤。为此，首先将粗产物溶于二氯甲烷中(0.3ml/克粗产物)。从该混合物中首先洗脱的产物是C20二乙酯(化合物E)。残留级分含有化合物的混和体，其中包括所需化合物S。此步骤后，橙色固体的产率为46％(30g实验)。检测波长为369nm时(10.4分钟)时，HPLC测得纯度为71.2％a/a的反式异构体。此外，检测出另两个化合物(0％a/a+4.9％a/a)，可能是化合物S的顺式异构体。

形成化合物T的二次偶合反应

化合物S与1.5当量的化合物H在100℃反应。该偶合反应在四氢呋喃/甲苯2:1(0.6ml+1.2ml/mmol)中进行，显示出好的产物形成。在0℃通过过滤并用甲基环己烷洗涤两次分离出红色产物化合物T。产率是58％(10g规模)。检测波长为369nm时(10.4分钟)时，测得纯度为97.2％a/a的反式异构体。此外，检测出另两个化合物，推测其为化合物T的顺式异构体。

形成化合物U的皂化反应

皂化反应按照与实施例1～4相似的方式进行。在90℃，将化合物T用在乙醇(2ml/mmol)中的30％的NaOH(2ml/mmol)处理4天。2天后，用水(1ml/mmol)稀释混合物。室温下通过过滤然后用50％的乙醇水(2次)和乙醇(3次)洗涤分离出黄色产物化合物U。皂化反应的产率为93％(7g规模)。¹H-NMR证实所需产物是化合物U。检测波长为399nm时，HPLC纯度为98.4％，有一个0.7％的主要杂质。

实施例9

TSC的C18衍生物(2,4,9,13-四甲基-十四碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E-六烯-1,14-二羧酸二钠)的合成

TSC的C18衍生物即化合物W采用两步连续的单偶合反应来制备，如同本申请中的实施例6和8所示。第一偶合反应按实施例8进行，形成化合物S。在第二偶合反应中，化合物S与化合物K反应以形成倒数第二个中间体即化合物V。通过化合物V的皂化反应得到最终的所需产物化合物W。下式详细列出了合成次序：

形成化合物S的第一偶合反应

如上所列的形成化合物S的第一偶合反应已在前面的本申请的实施例8中进行了描述。本实施例中所用的方法与之相同。

形成化合物V的第二偶合反应

第二偶合反应通过将化合物S(也称为C15单酯)与1.5当量的化合物K(C3溴化鏻)在100℃反应而进行。该偶合反应在四氢呋喃/甲苯2:1(0.6ml+1.2ml/mmol)中进行，显示出好的产物形成。通过在0℃过滤和甲基环己烷中的两次洗涤步骤，分离出橙色产物。该步产率是56％(9g规模)。检测波长为369nm(14.2分钟)时，使用HPLC测定化合物V的纯度，结果为96.7％a/a的反式异构体。此外，据推测，检测出的主要杂质(1.7％a/a，13.6分钟)是化合物V的顺式异构体。

形成化合物W的皂化反应

皂化反应按照与前面的实施例相似的方式进行。在90℃，将化合物V用在乙醇中(3.4ml/mmol)的30％的NaOH(2.2ml/mmol)处理4天。2天后，用水(1.1ml/mmol)稀释混合物。通过室温下过滤和用50％的乙醇水溶液(2次)和乙醇(3次)洗涤，分离出黄色产物。皂化反应的产率为98％(6g规模)。¹H-NMR证实所得产物正是所需产物(化合物W)。检测波长为405nm时，HPLC分析显示化合物W的纯度为99.2％。此外，发现有0.3％a/a的杂质，相信其为化合物W的顺式异构体。

实施例10

TSC的C-24衍生物(4,8,13,17-四甲基-二十碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E-九烯-1,20二羧酸二钠)的合成

TSC的长链衍生物需要使用包括还原和氧化步骤的多步合成法。本实施例列举了TSC的C24衍生物(4,8,13,17-四甲基-二十碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E-九烯-1,20-二羧酸二钠)的合成。合成从化合物E开始，其是本申请已经描述的几个实施例的起点。将化合物E(二乙酯)通过还原步骤转化为化合物X(二醇)。反应次序中的第三步是用MnO₂氧化化合物X以形成化合物Y。下一步由形成化合物Z的与化合物H的偶合反应以及形成所需产物化合物AA(TSC的C24衍生物)的最终的皂化步骤所组成。反应次序如下：

形成化合物E的反应

化合物A和D之间形成化合物E的偶合反应在实施例1～4中已进行过描述。

形成化合物X的还原反应

将40g的二乙酯(化合物E)悬浮于甲苯中，并用DiBAl(6当量)在JT＝-70℃下处理。混合物在JT＝-70℃搅拌4.5小时。IPC显示转化完全。用2M HCl在-77℃淬灭混合物。

将混合物分成三部分。每一部分都用水和THF稀释。有机层用盐水洗涤3次。将合并的有机相在JT＝45℃下蒸发以得到30.63g的橙色固体，对应产率为98％。再次萃取水层，又得到1.48g橙色固体。

通过上述过程，得到橙色产物，HPLC测定其纯度为89.0％a/a。此外，检测到一个4.8％a/a异构体浓度的杂质，认为其为醛类副反应产物。

此外，进行单独研究以确定该还原反应用LAH(氢化锂铝)或NaBH₄能否进行。在0℃在THF中进行LAH还原(2当量)，与此同时在4小时内缓慢升至室温，1g实验中约有80％的产率，但纯度不如DiBAl-H方法高。但该试剂可作为对本步骤作进一步评价时的一个选择。相比之下，发现NaBH₄(2当量)在THF中的还原不适用于本步骤。此外，加入MeOH作为共溶剂未能改善该反应。

形成化合物Y的氧化反应

进行了两个实验来优化形成化合物Y的氧化反应。在第一个实验中，用丙酮中低浓度的化合物X(1.7％)和过量的MnO₂(30当量)来进行该氧化反应。反应在0℃开始，同时在1天的时间内升至室温。用硅藻土或硅胶过滤并蒸发以除去试剂，从而得到紫色固体产物，产率42～57％。检测波长为421nm时，HPLC测得产物的纯度为87.7％a/a。如HPLC所测，该方法得到高纯度产物。

作为进行该氧化反应的第二种方法，进行了小规模的实验，重点在于结晶过程。用比率为2:3(0.013g/ml)的丙酮/水混合物作为溶剂，得到该步骤的最佳结果。其他溶剂如二噁烷/甲基环己烷(1:2)、THF和EtOAc没有得到更好的结晶结果。确实改善结晶的一个参数是改变夹套温度。将夹套温度提高到75℃能显著提高向产物的转化，并将整体反应所需的MnO₂的量从30当量降低到10当量。在下面的段落中对此改进方法中所采用的步骤进行更详细的描述。

将5g化合物X悬浮在丙酮中，并用5当量的MnO₂在JT＝75℃下处理。混合物在75℃搅拌2天。IPC表明除了原料外还有二醛和单醛类物质的存在。因此，再加入5当量的MnO₂以使反应进一步完成。反应时间达8小时后，大部分原料和中间体耗尽。将混合物冷却，并依次用硅胶和硅藻土过滤。双重过滤步骤对于除去MnO₂是必要的。进行过膜的第三次过滤步骤。总体上，用THF洗涤滤饼得到了0.7g的红色产物，还得到含有痕量锰的1.95g+2.51g深褐色产物。反应的总产量为5.16g(99.6％)。IPC的HPLC：463nm时，61.0％+5.4％+19.3％(包括异构体)。

在氧化反应的第二种方法中，虽然产物产率高于第一种合成顺序，但HPLC纯度不高，在化合物Y产物中有残留量的氧化锰。

应注意，任何一种方法中，中间体(单醛)都必须消耗完全以得到好的产率和纯度。可以通过在过滤步骤前将溶剂换成热的THF或EtOAc来除去锰残留物。

形成化合物Z的偶合反应

C24二乙酯(化合物Z)的合成用化合物H按照与实施例5、6和8类似的方式进行。在100℃，将C20二醛(化合物Y)用化合物H在甲苯/四氢呋喃(2:1，1ml和0.5ml/mmol)中处理1天。冷至室温后，没有观察到沉淀。仍是透明的深红色溶液。

然后将混合物在JT＝40～50℃蒸发至干。用MeOH(1.25mmol/mmol)处理残渣并冷却到0℃。将悬浮液过滤，滤饼用甲醇洗涤两次。JT＝50℃下在旋转蒸发仪上干燥后，该步骤得到红褐色产物。

该反应的产率是19～22％。从母液中继续回收产物能提高该产率。检测波长为421nm时(16.8分钟)，测得的最佳纯度是92.4％a/a(化合物Z的)反式异构体。据信，HPLC谱中观测到的另外的化合物是化合物Z的顺式异构体。

形成化合物AA的皂化反应

皂化反应按照与本申请前面所述相似的方式进行。在90℃，将二乙酯(化合物Z)用在乙醇(3ml/mmol)中的30％的NaOH(3ml/mmol)处理3天。用水(6ml/mmol)和乙醇(3ml/mmol)稀释，在室温下过滤，用50％的乙醇水溶液(12ml/mmol)和乙醇(12ml/mmol)洗涤后，该皂化反应的产率为83％(0.8g规模)。463nm时，化合物AA的HPLC纯度为95.3％，此外有0.5％的顺式异构体。

实施例11

TSC的C26衍生物(2,4,8,13,17,19-六甲基-二十碳-2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E-九烯-1,20-二羧酸二钠)的合成

形成化合物Y的反应次序

形成化合物Y所需的反应次序已在前面的实施例10中描述过。此实施例中采用相同的次序。

形成化合物BB的偶合反应

C26二乙酯的合成从实施例9所述的化合物Y的产生开始。在100℃，将化合物Y用化合物K在甲苯/四氢呋喃(2:1，2ml和1ml/mmol)中处理1天。冷至室温时，没有观察到沉淀。仍是透明的深红色溶液。将混合物冷至0℃。过滤所得的悬浮液。随后用MeOH洗涤滤饼三次，JT＝45℃时在旋转蒸发仪上干燥后得到深紫色固体。

该步产率在17～26％之间。主要原因之一是一些产物残留在母液中。测定波长为463nm时，由HPLC测得的最佳纯度的产物含有83.9％a/a反式异构体。推测所检测到的其他化合物是化合物BB的顺式异构体。该实验以1.5g的规模进行。

形成化合物CC的皂化反应

皂化反应按照与实施例9所述相似的方式进行。在90℃，将二乙酯(化合物BB)用在乙醇(3ml/mmol)中的30％的NaOH(3ml/mmol)处理3天。用水(6ml/mmol)和乙醇(3ml/mmol)稀释，在室温下过滤，并用50％的乙醇水溶液(12ml/mmol)和乙醇(12ml/mmol)洗涤后，该皂化反应的产率为84％(0.8g规模)。¹H-NMR证实，得到了所需产物(化合物CC)。检测波长为460nm时，HPLC纯度为91.5％，此外检测到0.2％的顺式异构体。

实施例12

TSC与环糊精-甘露醇的制剂

1.配制含有等摩尔浓度的环糊精和TSC的溶液。含有超过20mg TSC/毫升溶液的溶液可以用此方法配制。首先，将环糊精加到可注射水中，然后将TSC加入到该溶液中。

2.加入d-甘露醇，以使甘露醇在溶液中的最终浓度为约20～50mg/ml。

3.可以将此溶液加入到等渗盐水中，以将其稀释并仍维持合适的重量克分子渗透浓度。可以将该溶液加到盐水中，也可以将盐水加到该溶液中。

实施例13

TSC与甘露醇/乙酸的制剂

1.配制蒸馏水中的0.01M乙酸溶液。

2.将该溶液与可注射水以合适的比例混合，以使最终乙酸浓度为0.0005M。注：不要用太强的乙酸。例如，可以用0.0006M，但0.001M就不溶解TSC。

3.向TSC中缓慢加入0.0005M的乙酸溶液。最大溶解度为约6～6.5mg TSC/毫升溶液。

4.向上述溶液中以50mg/ml的浓度加入d-甘露醇，以得到合适的重量克分子渗透浓度。该溶液的pH为约8-8.5。其应该近似于等渗溶液，并因此能被直接注射到血流中。

实施例14

肺部给药

已证实，在大鼠中，将TSC肺部给药后，TSC能被吸收到血流中。此方法中，将大鼠插管，注入小体积的(通常为0.1ml)TSC溶液，然后充入两次3ml的空气。发现所给剂量的40～70％迅速出现在血流中(达到最大血浆浓度的时间少于5分钟)。

已经利用肺部给药进行了附加的研究，其中研究了注入气管的液体体积的影响以及以配制的药品形式使用TSC的效果。配制的药品含有8％的γ-环糊精、2.3％的甘露醇、50mM的甘氨酸和20mg/ml的TSC，所述TSC是在无菌水中重新构造的TSC。在这些研究中，将无菌盐水(0.9％)作为稀释剂加入以达到所需剂量。所有的大鼠按相同剂量(937μg/kg)给药。

发现γ-环糊精的掺入似乎能提高TSC进入体循环的吸收——具有提高血浆清除率的总体效果。并且，注射体积的提高导致更多的TSC吸收并持续更长的时间。因此，同样剂量的较大体积的注射能提高生物利用度。也应注意到，已发现大鼠的出血性休克能通过以肺部途径施用TSC来成功治疗。

实施例15

肌内给药

当简单地溶解到去离子水中时，TSC不能通过肌内途径吸收；但是，环糊精的加入(像在配制的药品中那样)使其能被吸收到血流中。将TSC与2-羟丙基-β-环糊精或γ-环糊精一起配制成制剂，并溶于水中，将其小体积(0.05ml)注入大鼠的每个大腿肌中。3347μg/千克体重(14mg 2-羟丙基-β-环糊精每千克体重)的肌内给药使得血浆TSC浓度峰值为4.8μg/ml，生物利用度为0.27。施用γ-环糊精和TSC时，也导致成功吸收到体循环中。通过以肌内注射施用TSC，成功地对大鼠的出血性休克进行了治疗。

实施例16

经皮给药

已证实，在大鼠中，经皮给药后，TSC能被吸收到血流中。为进行这些研究，将腹部和/或大腿外侧周围的选定区域剪毛和/或刮毛以暴露出皮肤的角质层。将配制的药品(8％γ-环糊精、2.3％甘露醇、50mM甘氨酸和20mg/ml TSC)施用于暴露的皮肤角质层，给药后15～30分钟时，血流中存在所给剂量的0.25～0.5％。

实施例17

口服给药

用PE-50管将配制的TSC制剂递送至大鼠的胃中，然后测试血浆浓度。大鼠在每次实验前禁食24小时。随意饮水，使用带有金属网底层的笼子来防止食粪。一次研究中，对大鼠施用TSC后允许随意进食；另一次研究中，对大鼠施用TSC后不许进食。两组所给的TSC的剂量都是55mg/kg，发现给药后15-30分钟时，血流中存在所述剂量的1～2％。

实施例18

γ-环糊精的内毒素的去除

从厂商处得到的市售药用级别的环糊精具有不适于静脉注射的内毒素水平。为了在用于静脉注射的TSC制剂中使用环糊精，必须降低内毒素水平。开发了将环糊精溶液通过内毒素滤除器(Millipore，0.22微米，Durapore过滤器)多次过滤的方法，该方法能使内毒素水平下降约10～30倍。环糊精的回收率达到90～100％。对8％γ-环糊精溶液使用该方法所得的结果的实例列于下表：

过滤步骤	内毒素水平(EU/毫克环糊精)
		预滤	0.226
1次过滤后	0.0246
		2次过滤后	0.0125
3次过滤后	0.0125

实施例19

冻干法

制备含水量低于3％的块状物的冻干过程如下：

步骤	温度(℃)	压力	时间(小时)
				填充	室温	n/a	n/a
冷冻	-30	n/a	1
				冷冻	-30	n/a	6
蒸发	-30	225um	n/a
				干燥	-30	225um	2
干燥	30	225um	15
				干燥	30	225um	4
干燥	30	50um	99

稀释剂

重量克分子渗透浓度经甘露醇调节的甘氨酸缓冲液稀释剂(如，含2～4％甘露醇的50mM甘氨酸缓冲液)可用作稀释剂。

实施例20

放射敏化性

在无胸腺的雄性小鼠(购买时6-7周，使用前需要生长2-3周)的后腿上生长经测定为0.25～0.35cm³之间的HCT116人结肠癌肿瘤。因为在放射治疗过程中患者一般不进行麻醉(麻醉会减少流向肿瘤的血液，使其更加缺氧)，该研究用非麻醉动物进行。

使用6个研究组，每组5只小鼠(共30只小鼠)，称为研究组1～6。对该研究中的所有小鼠连续5天静脉注射TSC剂量或者盐水对照物。如下所示，研究组1、2和3接受TSC剂量A、B和C，研究B中，三个剂量分别对应为0.07、0.14和0.28mg/kg，研究A中三个剂量分别对应为1.35、0.54和0.18mg/kg。

名称	N(无胸腺雄性小鼠)	剂量	放射治疗
				组1	5	TSC剂量A	是
组2	5	TSC剂量B	是
				组3	5	TSC剂量C	是
组4	5	盐水对照	是
				组5	5	TSC剂量B	否
组6	5	盐水对照	否

组4注射盐水对照物。连续5天的每一次注射后45分钟时，研究组1～4的肿瘤接受2Gy放射。研究组5仅接受TSC，研究组6仅接受盐水，研究组5和6都不接受放射。前四周内或直到肿瘤达到开始治疗时体积的四倍时，每周对所有研究组中的肿瘤体积进行测量。这些测定的结果列于附图1-3。图1为研究A结果。图2为研究B结果。图3为分别施用TSC和进行放射的结果。研究A的最佳剂量是0.18mg/kg，对于研究B，0.07和0.14mg/kg剂量作用相同。也研究了单独使用TSC的情况。结果列于下面，连同单独放射的效果一起(也列在下图中)。可以看出，单独使用TSC丝毫不能影响肿瘤的生长。

对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不背离所公开的发明的情况下对本发明的化合物和组合物以及相关的方法进行许多修改和添加。

Claims

1.双极性反式类胡萝卜素盐在制备用于在对肿瘤进行放射中治疗哺乳动物的肿瘤的药物的应用，其中，在所述放射之前、过程中或之后施用所述反式类胡萝卜素盐，所述双极性反式类胡萝卜素盐具有下式：

YZ-TCRO-ZY

其中：

Y＝相同或者不同的阳离子

Z＝与所述阳离子相连的相同或者不同的极性基团，和

TCRO＝直链的反式类胡萝卜素骨架，具有共轭的碳-碳双键和单键，并且具有侧基X，其中所述侧基X为相同或不同，是直链或支化的具有的碳为10个以下的烃基或卤素。

2.如权利要求1所述的应用，其中，放射以6000-6500cGy的剂量施用数周。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤选自由胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、类肉瘤、骨肉瘤、与皮肤癌有关的肿瘤、乳癌、头部和颈部癌、妇科癌、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌、主消化腺/器官癌、中枢神经系统癌和肺癌所组成的组。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤是脑瘤。

5.如权利要求1所述的应用，其中，所述双极性反式类胡萝卜素盐是具有以下结构的反式藏花酸钠：

6.如权利要求5所述的应用，其中，在所述放射之前，施用0.02～2mg/kg的反式藏花酸钠。

7.如权利要求1所述的应用，其中，所述哺乳动物是人。

8.如权利要求5所述的应用，其中，所述哺乳动物是人且在所述放射之前静脉注射施用0.02～2mg/kg的反式藏花酸钠。

9.双极性反式类胡萝卜素盐在制备用于在对癌症进行化学疗法中治疗哺乳动物的癌症的药物的应用，其中，在所述化学疗法之前、过程中或之后施用所述反式类胡萝卜素盐，所述双极性反式类胡萝卜素盐具有下式：

YZ-TCRO-ZY

其中：

Y＝相同或者不同的阳离子

Z＝与所述阳离子相连的相同或者不同的极性基团，和

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤选自由胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、类肉瘤、骨肉瘤、皮肤癌、乳癌、头部和颈部癌、妇科癌、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌、主消化腺/器官癌、中枢神经系统癌和肺癌所组成的组。

11.如权利要求9所述的应用，其中，所述癌症是脑癌。

12.如权利要求9所述的应用，其中，所述双极性反式类胡萝卜素盐是具有以下结构的反式藏花酸钠：

13.如权利要求12所述的应用，其中，在所述化学疗法之前，施用0.02～2mg/kg的反式藏花酸钠。

14.如权利要求9所述的应用，其中，所述哺乳动物是人。

15.如权利要求9所述的应用，其中，所述哺乳动物是人且在所述化学疗法之前施用0.02～2mg/kg的反式藏花酸钠。

16.如权利要求1或9所述的应用，其中，所述双极性反式类胡萝卜素盐与环糊精处于组合物的形式。

17.如权利要求1或9所述的应用，其中，Y是单价金属离子。

18.如权利要求1或9所述的应用，其中，Y是Na⁺或K⁺或Li⁺。

19.如权利要求1或9所述的应用，其中，Y是有机阳离子。

20.如权利要求1或9所述的应用，其中，Y选自由R₄N⁺和R₃S⁺组成的组，其中R是H或C_nH_2n+1，其中n是1～10。

21.如权利要求1或9所述的应用，其中，Z包括TCRO的末端碳。

22.如权利要求1或9所述的应用，其中，Z选自由羧基(COO^-)、CO基和羟基组成的组。

23.如权利要求22所述的应用，其中，所述CO基为酯、醛或酮基。

24.如权利要求1或9所述的应用，其中，Z选自由硫酸基(OSO₃ ^-)、单磷酸基(OPO₃ ^-)、(OP(OH)O₂ ^-)、双磷酸基和三磷酸基组成的组。

25.如权利要求1或9所述的应用，其中，Z是酯基COOR，其中R是C_nH_2n+1。

26.如权利要求1或9所述的应用，其中，TCRO少于100个碳。

27.如权利要求1或9所述的应用，其中，TCRO是对称的。

28.如权利要求1或9所述的应用，其中，所述侧基X为甲基。

29.如权利要求1或9所述的应用，其中，所述侧基X为相同或不同，是直链或支化的具有的碳为4个以下的烃基。

30.如权利要求1或9所述的应用，其中，所述侧基X为相同或不同，选自由甲基(CH₃)和乙基(C₂H₅)组成的组。