CN115137727A - 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗 - Google Patents

一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗 Download PDF

Info

Publication number
CN115137727A
CN115137727A CN202210767013.6A CN202210767013A CN115137727A CN 115137727 A CN115137727 A CN 115137727A CN 202210767013 A CN202210767013 A CN 202210767013A CN 115137727 A CN115137727 A CN 115137727A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
tumor
prodrug
gsh
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210767013.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李春锋
黄斯玮
周现锋
翟蔓瑜
王禺昆
李凯旋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao University of Science and Technology
Original Assignee
Qingdao University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao University of Science and Technology filed Critical Qingdao University of Science and Technology
Priority to CN202210767013.6A priority Critical patent/CN115137727A/zh
Publication of CN115137727A publication Critical patent/CN115137727A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明提供了式(Ⅰ)所示的化合物在水溶液中自组装，自行表现出纳米级特性，该氧化还原刺激响应型两性离子纳米前药的制备方法及应用。所述纳米前药具有被动靶向性、优异的肿瘤抑制效果和安全性高的优势，在癌症和皮肤病的诊断和治疗方面具有广阔前景。

Description

一种GSH/H2O2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应 用于癌症化疗
技术领域
本发明涉及一种新型的两性离子荧光探针与抗肿瘤药物相连制备的两性离子的前药化合 物及其应用，具体通过二硫键连接两性离子罗丹明(RhB)和喜树碱(CPT)，构建了一种肿 瘤异质性激活前药物，该药物可基于其两亲结构在水中自组装成稳定的纳米前药，属于化学 制药领域。
背景技术
近年来，癌症的发病率呈上升趋势，对人们的生命健康有着重大威胁。现有的治疗技术 手术治疗、化疗和放疗方法都有一定局限性需要进一步改进。如常规化疗存在生物利用度差、 非特异性选择性导致肿瘤部位药物积累低等局限性。为了精确诊断和治疗癌症，基于荧光探 针的前药物应用于治疗癌症逐渐走进人们的视野，这是一种具有临床应用前景的癌症治疗方 法。荧光可追踪的前药物可视化活细胞和整个动物，具有微创、时空可控性和高分辨率成像 的优势，大大降低了患者的痛苦。
在针对实体肿瘤治疗中，EPR效应被认为是肿瘤靶向化疗的里程碑式原理。通过纳米技 术将小分子药物包裹在纳米载体内，制备出纳米级别的药物，再通过EPR效应选择性的穿过 肿瘤组织细胞间隙并在肿瘤部位富集，从而发挥出抗肿瘤疗效。另外，肿瘤微环境和正常细 胞相比存在很大的区别，比如pH值低，炎症反应性，酶表达异常，不仅如此，肿瘤细胞在 许多方面还具有异质性。目前的前药分子大多都是亲水荧光团与疏水药物分子偶联，它们在 血液循环中会发生复杂的反应，例如去蛋白结合或者受pH影响，导致成像不稳定。设计两 性离子荧光探针的前药用来实现低血清结合和低非特异性组织保留。
两性离子特征和响应性连接键是构建强效前药的重要途径，因此，研究具有刺激反应性 的两性离子前药物用于精准治疗癌症具有重要意义。
发明内容
本发明就是针对现有技术中存在的问题，提供了一类新型两性的肿瘤异质性激活前药化 合物及其在化疗中的应用。该两性离子前药化合物在水中能够自组装成稳定的纳米结构，减 小和蛋白等相互作用，从而不影响荧光成像，并且能够实现对正常组织较小的毒性和良好的 代谢能力，可以应用于体内癌症诊断治疗。
据此，本发明一方面提供一种由具有式(I)所示结构的化合物，将两性离子荧光探针 和抗肿瘤药物通过二硫键连接，设计了一种氧化还原刺激响应型纳米前药物。
Figure RE-GDA0003807963510000021
由于肿瘤(特别是实体瘤)组织的血管丰富，并缺失淋巴回流系统，会造成本发明所述 的纳米前药在肿瘤位置被动高渗透性和滞留性。这种纳米结构在实体瘤组织的高通透效应和 滞留效应被称为EPR效应(enhanced permeability and retention effect)。这种被动靶向肿瘤的 能力，可以自组装形成稳定的纳米粒子，实现被动靶向肿瘤。
本发明提供了式(I)所示化合物将两性离子荧光探针与抗肿瘤药物相连制备出前药化 合物可以同时具有诊断和治疗双重作用，有利于我们对药物的释放进行实时监测，观察药物 在体内的分布情况。是一种对氧化还原敏感的纳米前药，可以有效应用于肿瘤的诊断治疗， 具备极大的市场价值和广阔的经济前景。
附图说明：
图1本发明纳米前药化合物I的合成路线；
图2不同浓度的化合物I在水溶液中的紫外吸收光谱图；
图3不同浓度的化合物I在水溶液中的荧光发射光谱图；
图4化合物I与GSH反应后的质谱图；
图5化合物I与H2O2反应后的质谱图；
图6不同浓度GSH和H2O2存在下化合物I的药物释放(P<0.05)；
图7 HeLa细胞与化合物I培育不同时间的共聚焦图像；
图8化合物I与HeLa细胞培育不同时间后的细胞毒性；
图9小鼠内脏在不同时间点的荧光成像图；
图10小鼠治疗20天后的图片；
图11不同组小鼠治疗后主要器官和肿瘤的H&E染色；
图12小鼠静脉注射化合物I和游离CPT后的药代动力学研究(P<0.05)。
具体实施方式：
本发明的方法与技术通常依据本领域已知的传统方法进行，除非另有说明。与本文中描 述的生物学、药理学、及医学与医药化学相关的命名法，及实验方法与技术是本领域已知且 常用的。化学合成法、化学分析法、医药制法、调配法与传送法，及检测或测试法均采用标 准技术。
除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通 常理解的含义。
本发明的化合物的实例如下述化合物I：
Figure RE-GDA0003807963510000031
如图1所示，化合物I的合成包括以下步骤：
1)化合物1的合成：将磺酰罗丹明B(1.16g，2mmol)加入三口烧瓶中，在氮气保护条件下用注射器将无水二氯甲烷(25mL)注入烧瓶，在0℃下搅拌10分钟。接着将草酰氯(860μL，10mmol)缓慢滴加到混合溶液中，再加入催化剂量的无水二甲基甲酰胺(12μL)。 移除冰浴，所得到的溶液在室温下搅拌16小时，溶液由浅红色变为深红色。然后用旋转蒸发仪除去剩余草酰氯和二氯甲烷，得到深红色固体产物，无须进一步纯化，在真空干燥箱(30℃) 中干燥过夜后，继续投下一步反应(产率为98％)。
2)化合物2的合成：在氮气保护下，将干燥后的化合物1加入三口烧瓶中，在冰浴下加 入无水二氯甲烷(20mL)搅拌。然后将N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(320mg，2mmol)、4-二甲氨基吡啶(12.2mg，0.1mmol)和三乙胺(840μL，6mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL) 中，通过恒压漏斗滴加入上述化合物1的溶液中。滴加完成后，移除冰浴，室温反应13小时， 经TLC点板确定反应完成后，用5％的盐酸溶液(50mL)和去离子水(50mL)分别洗涤一 次后用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂。溶剂蒸发后将得到的粗产物经柱色谱分离纯化， 洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(体积比80:1至20:1)，最终得到红色纯产物(600mg，产率为46％)。 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.40(s,1H),8.03(t,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.46 (d,J＝8.0Hz,1H),7.05-6.93(m,6H),6.87(t,1H),3.64(q,8H),3.01(q,2H),2.87(q,2H),1.37(s,9H),1.21(t,12H)。
3)化合物3的合成：在氮气保护下，将得到的纯化合物2(600mg，0.86mmol)溶解于无水二氯甲烷(30mL)并在冰浴环境下搅拌，然后向体系中缓慢滴加三氟乙酸(6mL，81mmol)。反应3小时后，点板确定化合物2已经反应完全，旋蒸除去有机溶剂，将残渣溶解 在二氯甲烷(60mL)中，用饱和碳酸钠溶液(30mL)洗涤两次，经无水硫酸钠干燥，除去 剩余二氯甲烷即可得到纯产物RhB-NH2，为深红色固体(360mg，产率为63％)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ(ppm):8.42(s,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.06-6.93(m,6H),3.65(q,8H),2.88(t,2H),2.64(t,2H),1.21(t,12H)。
4)化合物4的合成：氮气保护下，将亚二硫基二乙酸(1g，5.50mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，然后在冰浴下向体系中滴加草酰氯(525μL)。滴加完毕后，移除冰浴，在35℃ 下继续搅拌3小时，旋蒸出去二氯甲烷和草酰氯，得到黄色油状产物，无须纯化，直接进行 下一步反应。
5)化合物II-1的合成：氮气保护下，将化合物3和药物喜树碱(450mg，1.3mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，冰浴避光条件下搅拌。然后将含有4-二甲氨基吡啶(955mg，7.8mmol)的无水二氯甲烷(8mL)溶液滴加到上述混合溶液，溶液由淡黄色变为浅褐色， 持续冰浴反应4小时。点板确定反应完成后，旋蒸除去有机溶剂，将粗产物经柱色谱分离纯化，洗脱剂依次为纯二氯甲烷，二氯甲烷/甲醇(体积比200:1至80:1)，最终得到产物 CPT-SS-COOH，为淡黄色固体(400mg，产率为60％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.40(s,1H),8.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝8.4 Hz,1H),7.82(t,1H),7.66(t,1H),7.37(s,1H),5.74(m,2H),5.31(s,2H),3.61(s,2H),3.54(s, 2H),2.12(m,2H),0.93(t,3H)。
不同浓度的化合物I在水溶液中的紫外吸收光谱图及荧光发射光谱图分别如图2和图 3所示。
本发明化合物I与GSH和H2O2的响应性
将5μM的化合物I与1mM GSH在37℃的震荡环境下反应6小时，然后用基质辅 助激光解吸电离飞行时间质谱对溶液进行分析(图4)。1095.19处为化合物I的质荷比， 980.034为谷胱甘肽裂解二硫键并和探针结合后的质荷比，675.083为谷胱甘肽结合荧光探针 分子再次被还原断裂露出带有硫醇的探针的质荷比，613.179为两分子谷胱甘肽自身结合的质荷比。将5μM的化合物I与1mM H2O2在37℃的震荡环境下反应6小时，然后用基质 辅助激光解吸电离飞行时间质谱对溶液进行分析(图5)。1095.19，1117.298，1133.285处分 别为化合物I及其加钠加钾后的质荷比，1111.303为被H2O2氧化后生成的新的分子。
药物释放实验
分别选取0mM、1mM和10mM的GSH和H2O2与化合物I在37℃的震荡环境下 孵育，然后在不同的时间段，利用高效液相色谱测量所释放的药物吸收峰，从而进一步计算 出药物释放速率(图6)。
10mM的GSH和H2O2与化合物I孵育后药物的释放速率非常快，2个小时就达到甚 至超过了40％，在第12小时，GSH组药物释放达到了90％，H2O2组也接近于80％左右， 不添加GSH和H2O2时，药物基本没有释放，这证明了化合物I对氧化还原的敏感性和药 物的高效释放。
体外细胞摄取实验
采用激光共聚焦扫描显微镜对HeLa细胞的细胞摄取行为进行了研究。将HeLa细胞以每 孔1×105的密度接种于35mm共聚焦培养皿中，加入2mL完全培养基培育24小时。去除培养基，将细胞洗干净，再加入含有浓度为5μM的化合物I的培养基，在37℃下培育0.5 小时和2小时。然后去除培养基，用PBS溶液洗三次，然后用4％的甲醛室温下固定10分钟 后，再次用PBS洗涤细胞，接着对细胞核进行染色，洗净后用共聚焦显微镜对细胞进行观察。 在0.5小时，细胞对化合物I的摄取较少，只在细胞的周围有一点摄取，而2小时后，细 胞对化合物I的摄取量明显增多，每个细胞核的周围都有大量化合物I，这表明了细胞 对化合物I的摄取随时间逐渐增强。
细胞毒性实验
用HeLa细胞通过Live/Dead实验评估了化合物I的细胞毒性，以游离药物CPT作为对照组。将HeLa细胞接种于96孔板中，每孔加入200μL培养基，细胞培育到一定的密集程 度且状态良好后，将游离CPT和化合物I在培养基中经过梯度稀释后(0.1μM至100μM) 与细胞分别培育24小时，48小时和72小时。未经处理过的细胞作为对照组，达到培育时间 后，去除培养基，用PBS洗涤两次，然后用含有calcein-AM和EthD-1染料的PBS继续培育 细胞30分钟。去除含有染料的培养基，继续用PBS洗涤一次，用荧光显微镜对细胞进行拍 摄(图8)。化合物对正常细胞的杀伤力是很小的，只会在癌细胞中激活药物来杀死肿瘤细胞， 对细胞具有很强的选择性。
小鼠肿瘤成像实验
首先我们需要构建荷瘤小鼠肿瘤模型。将3×106的4T1细胞通过皮下注射到雌性裸鼠侧 面，每天观察小鼠肿瘤的体积大小，当体积达到预期要求时即可进行体内实验。将化合物I 通过尾静脉注射到小鼠体内，我们分别在6小时，12小时，30小时，48小时将小鼠处死并 进行解剖，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，清理干净后，用小动物活体光学成像系 统进行拍摄。如图9所示，图片中的内脏从左到右依次为小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤。从图中我们可以观察到化合物I确实可以在荷瘤小鼠的肿瘤部位被动靶向积累，并且在不同的时间段，荧光强度是不同的。在尾静脉注射12小时后肿瘤部位是最亮的，说明此时前药胶束的富集量也是最多的。在注射48小时后，肿瘤部位亮度降到了最低值。
小鼠体内治疗实验
将4T1肿瘤细胞注射到小鼠右侧后腿位置，待肿瘤长到适当体积后将所有小鼠随机分为 3组，每组5只。这三组依次为生理盐水组，CPT组和化合物I组。从第一天开始，通过尾静脉向不同组的小鼠体内分别注射生理盐水、纯CPT药物和化合物I。此后每间隔两天 注射一次药物，一直到第20天停止实验。除此之外，我们要在整个实验过程中对不同组的每只老鼠进行标记和单独跟踪。每间隔一天需要对小鼠进行体重称量，肿瘤长度和宽度的测量 和肿瘤大小的拍照，一直持续到实验结束。到达第20天后将小鼠处死，取出小鼠肿瘤进行称 重和拍照。此外，将不同组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织用福尔马林固定，通过H&E 染色进行组织病理分析。如图10所示，通过对比明显看出，生理盐水组肿瘤在第20天已经 大面积破裂了。CPT组小鼠肿瘤虽然比生理盐水组的要小，但是也出现了小程度的破裂，说 明是有小部分游离药物进入了小鼠的肿瘤，但是含量可能不高，因此导致抑制效果也很一般。 而化合物I则表现出了非常有效的抑制作用，小鼠在第20天肿瘤体积稍有增加，但增加程 度远低于其它两组。这一结果和荧光成像结果也相互对应，说明化合物I可以大量富集在 肿瘤部位，并通过肿瘤微环境氧化还原刺激性响应来释放出高含量被激活的药物达到抑制肿 瘤生长的效果。如图11所示，小鼠的心肝脾肺肾没有看到明显的组织学变化，表明化合物I 对主要器官和正常组织的毒性几乎可以忽略不计，表现出了良好的安全性。然而，通过H&E 染色的肿瘤切片可以看出，化合物I组的肿瘤出现了明显的凋亡和坏死，显示出良好的抗 肿瘤作用。
体内药代动力学研究
将小白鼠随机分为两组，每组四只。实验开始前，将其禁食12小时，期间可以自由饮水。 然后通过尾静脉注射化合物I和游离CPT并在预先设置好的时间段内在小鼠尾部取血。每 次取血10μL，将其置于50μL的细胞裂解液中并在0℃环境下保存，15分钟后，取50μL的二甲基亚砜加入裂解液中，继续保存在0℃环境中。待样品全部采集完毕后，用酶标仪测量吸光度并在标准曲线中找到对应的值，做出药代动力学曲线图，如图12所示。
化合物I和游离CPT在血浆中随时间的分布图，由图可知化合物I在血液中以较高的浓度保持了24小时，而游离CPT在24小时后浓度仅为化合物I的七分之一。与游离 CPT相比，化合物I在血液中的停留时间更久，因此有更多的可能性可以进入肿瘤细胞并 富集在肿瘤内部，这一结果与体内荧光成像和体内治疗实验共同证明了化合物I对肿瘤的 有效被动靶向性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照实施例对本发 明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技 术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应 技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种由具有式(Ⅰ)所示结构的化合物，将两性离子荧光探针和抗肿瘤药物通过二硫键连接，设计了一种氧化还原刺激响应型两性离子纳米前药。
Figure RE-FDA0003807963500000011
CN202210767013.6A 2022-06-30 2022-06-30 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗 Pending CN115137727A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210767013.6A CN115137727A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210767013.6A CN115137727A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115137727A true CN115137727A (zh) 2022-10-04

Family

ID=83410651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210767013.6A Pending CN115137727A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115137727A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105833289B (zh) 一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用
US8758725B2 (en) Perylenequinone derivatives and uses thereof
CN110981870B (zh) 基于pH和GSH双重响应的β-咔啉-环烯酮衍生物及其用途
BRPI0712101A2 (pt) ácido beta-fenil-alfa-hidróxi propanóico substituìdo, método de sìntese e uso do mesmo
WO2023001317A1 (zh) 基于切伦科夫效应的酸响应纳米胶束及其制备方法和应用
CN111205276B (zh) 由有机小分子化合物自组装形成的微纳结构及其应用
CN112062797B (zh) 一种二聚体前药及其制备方法和应用
CN101181225A (zh) 纳米聚合物胶束药物传递系统和制备方法及应用
CN111205277A (zh) 有机小分子荧光化合物在光治疗中的用途
CN112279862B (zh) 近红外卟啉化合物及其制备方法和用途
EP3297675B1 (en) 5-ala derivatives
US20080279776A1 (en) Photosensitizers and MRI Enhancers
CN115137727A (zh) 一种gsh/h2o2双响应性的两性离子罗丹明-喜树碱纳米前药应用于癌症化疗
Biswas et al. Synthesis of ibuprofen conjugated molecular transporter capable of enhanced brain penetration
CN111285856A (zh) 光热效应优异的有机小分子化合物
CN114437128A (zh) 一种胆碱磷酸修饰的紫杉醇药物及其制备方法和应用
CN112028871B (zh) 一种溶酶体靶向光敏剂及合成方法和在生物成像上的应用
CN105198934B (zh) 具有近红外吸收的光动力学活性的铂类化合物、制备方法及其应用
CN111943954A (zh) 二氢卟吩衍生物及其相应的制备方法和用途
WO2023245857A1 (zh) 一种辣椒素衍生化光敏剂及其制备方法与应用
CN116410198A (zh) 一种硫/硒醚连接的两性离子喜树碱纳米前药应用于癌症诊疗
EP4201937A1 (en) Chlorin derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, preparation method therefor, use thereof, and combination thereof with ultrasound medical system
CN115337409B (zh) 白蛋白结合型近红外荧光探针-脂肪酸共轭物及其制备方法和应用
US20230414758A1 (en) Capsaicin-derived photosensitizer, and preparation method and use thereof
CN102690313B (zh) 胆酸-萘酰亚胺类化合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication