WO2012165476A1 - 人造ポリペプチド繊維及びその製造方法 - Google Patents

人造ポリペプチド繊維及びその製造方法 Download PDF

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artificial
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関山和秀
関山香里
石川瑞季
佐藤涼太
村田真也
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スパイバー株式会社
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
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    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/06—Wet spinning methods
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    • D01D5/16—Stretch-spinning methods using rollers, or like mechanical devices, e.g. snubbing pins
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    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin
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    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F6/00—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof
    • D01F6/58—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolycondensation products
    • D01F6/68—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof from homopolycondensation products from polyaminoacids or polypeptides

Definitions

  • the spider fiber is a fiber having high strength and toughness, and is known to have higher strength and toughness than high-strength steel, nylon 6 fiber, aramid fiber, carbon fiber and the like.
  • the raw material can be converted to biomass without using petroleum.
  • Some artificial spider silk fibers have also been proposed.
  • Patent Document 1 proposes that a synthetic protein spinning solution is extruded from a spinneret into a coagulation bath composed of 90% methanol at a rate of 5 to 10 ⁇ l / min to form fibers.
  • Patent Document 2 proposes a fiber having a diameter of 1 ⁇ m or more and a length of 5 mm or more and a tensile strength of 200 MPa or more.
  • the present invention provides an artificial polypeptide fiber having high stress and toughness, and a method for producing the same, in order to solve the conventional problems.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention is an artificial fiber having a polypeptide as a main component, and is characterized by having a stress of 350 MPa or more and a toughness of 138 MJ / m 3 or more.
  • the method for producing an artificial polypeptide fiber of the present invention is a method for producing an artificial polypeptide fiber obtained by spinning a spinning solution containing a polypeptide derived from a natural spider silk protein and at least two-stage drawing.
  • the at least two-stage stretching includes a first-stage stretching in wet heat and a second-stage stretching in dry heat.
  • the present invention can provide an artificial polypeptide fiber having high stress and toughness and a method for producing the same by stretching an unstretched fiber made of an artificial polypeptide in at least two stages of wet heat and dry heating. That is, an artificial polypeptide fiber having a stress of 350 MPa or more and a toughness of 138 MJ / m 3 or more can be realized. High stress and high toughness are advantageous for composite materials with metals, resins, rubbers, and the like.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing a manufacturing process in one embodiment of the present invention.
  • 2A and 2B are explanatory views showing the manufacturing process in another embodiment of the present invention,
  • FIG. 2A shows the spinning process-first stage stretching process
  • FIG. 2B shows the second stage stretching process.
  • FIG. 3 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 6 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 4 of the present invention.
  • FIG. 3 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 7 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Example 5 of the present invention.
  • FIG. 8 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Comparative Example 1.
  • FIG. 9 is a stress-displacement (strain) curve of the fiber obtained in Comparative Example 2.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention contains a polypeptide as a main component.
  • the main component means that 80% by mass or more is contained, more preferably 90% by mass or more, and still more preferably 95% by mass or more.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention may contain components other than the polypeptide as long as the effects of the present invention are not inhibited.
  • the polypeptide derived from the natural spider silk protein includes a mutant, analog or derivative of the natural spider silk protein.
  • the polypeptide is not particularly limited as long as it is derived from a natural spider silk protein.
  • the polypeptide is preferably a polypeptide derived from a large sputum bookmark thread protein produced in a spider large bottle-like line.
  • the large sputum bookmarker protein include large bottle-shaped spidroin MaSp1 and MaSp2 derived from the American spider spider (Nephila clavipes), and ADF3 and ADF4 derived from the Araneus diadematus.
  • the polypeptide derived from the large sputum bookmark thread protein includes a mutant, analog or derivative of the large sputum bookmark thread protein.
  • the units of the amino acid sequence represented by the formula (1): REP1-REP2 (1) may be the same or different.
  • the unit of the amino acid sequence represented by [REP1-REP2 (1)] is different when REP1 is different, when REP2 is different, and when both REP1 and REP2 are different.
  • the polypeptide derived from the large sputum bookmark thread protein preferably has a molecular weight of 300 kDa or less, more preferably 200 kDa or less, from the viewpoint of productivity when producing recombinant protein using a microorganism such as Escherichia coli as a host. More preferably, it is 150 kDa or less.
  • the REP1 corresponds to a crystal region forming a crystal ⁇ sheet in the fiber
  • the REP2 is an amorphous type which is more flexible in the fiber and largely lacks a regular structure.
  • [REP1-REP2] corresponds to a repetitive region (repetitive sequence) composed of a crystal region and an amorphous region, and is a characteristic sequence of a bookmark thread protein.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identical to the amino acid sequence consisting of 50 amino acids at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the sequence
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identical to the amino acid sequence obtained by removing 20 residues from the C-terminal, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has 29 residues removed from the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is identical to the amino acid sequence.
  • Formula 1 A unit of an amino acid sequence represented by REP1-REP2 (1) and a C-terminal sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 or any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence for example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be used.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) consisting of an initiation codon, His10 tag and HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 7 an amino acid sequence consisting of an initiation codon, His10 tag and HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the first to thirteenth repetitive regions were increased so as to be approximately doubled, and the translation was mutated to terminate at the 1154th amino acid residue.
  • the C-terminal sequence is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence comprising the unit of the amino acid sequence represented by the above formula 1: REP1-REP2 (1) and the C-terminal sequence is represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, or any one of SEQ ID NOs: 1 to 3
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown
  • one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted, deleted, inserted and / or added.
  • a protein having an amino acid sequence and a repeating region consisting of a crystalline region and an amorphous region can be used.
  • the polypeptide can be produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding the polypeptide.
  • the gene production method is not particularly limited, and a gene encoding a natural spider silk protein is cloned from a spider-derived cell by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemically synthesized.
  • the chemical synthesis method of the gene is not particularly limited. For example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) based on the amino acid sequence information of the natural spider silk protein obtained from the NCBI web database. Oligonucleotides automatically synthesized by a company) can be synthesized by ligation by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N terminus of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • a plasmid, phage, virus or the like capable of expressing a protein from a DNA sequence can be used.
  • the plasmid type expression vector is not particularly limited as long as it can express the target gene in the host cell and can be amplified by itself.
  • a pET22b (+) plasmid vector when Escherichia coli Rosetta (DE3) is used as a host, a pET22b (+) plasmid vector, a pCold plasmid vector, or the like can be used. Among these, it is preferable to use a pET22b (+) plasmid vector from the viewpoint of protein productivity.
  • the host for example, animal cells, plant cells, microorganisms and the like can be used.
  • the spinning solution is prepared by adding a solvent to the polypeptide and adjusting the viscosity to allow spinning. Any solvent may be used as long as it can dissolve the polypeptide.
  • a solvent for example, hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA), formic acid, urea, guanidine, sodium dodecyl sulfate (SDS), lithium bromide, calcium chloride, lithium thiocyanate
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFA hexafluoroacetone
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • lithium bromide calcium chloride
  • lithium thiocyanate A suitable amount is added to adjust the solution viscosity to 100 to 10,000 cP (centipoise). This is the spinning solution.
  • the coagulation liquid used for wet spinning may be any solution as long as it can be desolvated.
  • the solvent is HFIP
  • the coagulating liquid is preferably a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, 2-propanol or acetone.
  • the temperature of the coagulation liquid is preferably 0 to 30 ° C. If it is the said range, spinning will be stabilized.
  • An undrawn yarn is obtained by extruding the spinning solution into a coagulating solution.
  • the extrusion speed is preferably 0.2 to 2.4 ml / h per hole. Within this range, spinning is stable. A more preferable extrusion rate is 0.6 to 2.2 ml / h per hole.
  • the length of the coagulation liquid tank is preferably 200 to 500 mm, the undrawn yarn take-up speed is preferably 1 to 3 m / min, and the residence time is preferably 0.01 to 0.15 min. If it is this range, solvent removal can be performed efficiently. Stretching (pre-stretching) may be performed in the coagulating liquid, but considering the evaporation of the lower alcohol, it is preferable to keep the coagulating liquid at a low temperature and take it off in the state of unstretched yarn.
  • the at least two-stage stretching includes first-stage stretching in wet heat and then second-stage stretching in dry heat.
  • the first-stage stretching with wet heat may be performed in the coagulation liquid.
  • a method such as dividing the first stage of wet heat into two stages and / or dividing the second stage of dry heat into two stages can be employed.
  • the wet heat of the first stage stretching may be in warm water or steam heating. An organic solvent or the like may be added to the warm water.
  • a stretching method other than wet heat or dry heat may be added to any stage of the stretching process.
  • the undrawn yarn is preferably drawn 2 to 8 times with hot water at 50 to 90 ° C. In this way, stable stretching can be performed.
  • the second stage drawing it is preferable to draw 1.25 to 3 times by dry heat of 170 ° C. to 270 ° C. Thereby, a high toughness drawn yarn can be obtained.
  • the undrawn yarn is drawn with warm water of 75 to 85 ° C. More preferably, the draw ratio of the first stage drawing is 2.3 to 7 times.
  • the second stage stretching is more preferably dry heat of 180 ° C. to 230 ° C.
  • the draw ratio of the second stage drawing is more preferably 1.35 to 3 times.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing a manufacturing process in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows a continuous process.
  • the spinning drawing apparatus 10 includes an extrusion process 1, an undrawn yarn manufacturing process 2, a wet heat drawing process 3, and a dry heat drawing process 4.
  • the spinning solution 6 is stored in the storage tank 7 and pushed out from the gear pump 8 to the base 9.
  • the spinning solution may be filled into a cylinder and extruded from a nozzle using a syringe pump.
  • the extruded spinning solution has an air gap 19 or is directly supplied into the coagulating liquid 11 in the coagulating liquid tank 20 to remove the solvent.
  • the hot water 12 in the stretching bath 21 is supplied to the first stage to be stretched. Stretching is determined by the speed ratio between the supply nip roller 13 and the take-up nip roller 14. Next, it is supplied to the dry heat drawing device 17, and the second stage drawing is performed in the yarn path 22 to obtain the wound yarn body 5. Stretching is determined by the speed ratio between the supply nip roller 15 and the take-up nip roller 16. Reference numerals 18a to 18f denote thread guides.
  • the undrawn yarn 36 is supplied into the warm water 38 in the drawing bath 37, and the first-stage drawing is performed to obtain a wound body 39 of the first-stage drawn yarn.
  • Stretching is determined by the speed ratio between the supply nip roller 41 and the take-up nip roller 42.
  • the first-stage drawn yarn is pulled out from the wound body 39, supplied to the dry heat drawing device 43, and second-stage drawn in the yarn path 47. Stretching is determined by the speed ratio between the supply nip roller 45 and the take-up nip roller 46.
  • the drawn yarn is wound around the wound body 44.
  • An artificial polypeptide fiber is obtained as described above.
  • the obtained artificial polypeptide fiber has a stress of 350 MPa or more and a toughness of 138 MJ / m 3 or more.
  • Toughness is calculated from an integrated value of a stress-strain curve (SS curve) when measuring the strength and elongation of the fiber.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the toughness of the fiber obtained in one example of the present invention, and shows a stress-displacement (strain) curve and toughness (shaded portion). It can be seen that toughness is high when both stress and elongation at break are high.
  • the preferable stress of the artificial polypeptide fiber of the present invention is 400 MPa or more, more preferably 590 MPa or more, and particularly preferably 620 MPa or more.
  • the preferred elongation at break is 39% or more, more preferably 45% or more, and still more preferably 50% or more.
  • Preferred toughness is at 170 mJ / m 3 or more, more preferably 240 mJ / m 3 or higher, further preferably 260 mJ / m 3 or more.
  • the preferable initial elastic modulus of the artificial polypeptide fiber of the present invention is 8 GPa or more, more preferably 14 GPa or more, and further preferably 16 GPa or more.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention preferably has a diameter in the range of 5 to 100 ⁇ m. If it is the said range, a drawn fiber can be obtained stably. A more preferable fiber diameter is in the range of 7 to 30 ⁇ m, still more preferably in the range of 8 to 25 ⁇ m.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention preferably has a uniform fiber diameter and a fiber diameter variation rate of 5% or less. When calculating the fineness (unit: tex or deci tex), when the fiber cross section is a circle, it is calculated from the cross-sectional area, specific gravity, and length calculated from the fiber diameter.
  • the cross section is not necessarily circular but includes various shapes, and therefore the fiber diameter (average diameter) is the average diameter when the cross section is assumed to be circular. .
  • the polypeptide is preferably a polypeptide derived from ADF3, which is one of the two main dragline proteins of Araneus diadematus. This polypeptide is also advantageous in that it is basically high in elongation and toughness and easy to synthesize.
  • the birefringence ⁇ n ( ⁇ 1000) of the artificial polypeptide fiber is preferably 15.6 or more.
  • the birefringence and the birefringence are the same.
  • a birefringence ⁇ n ( ⁇ 1000) of 15.6 or more indicates that the molecular orientation is progressing.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention may be chemically cross-linked between the polypeptide molecules in the fibroin fiber after drawing.
  • functional groups that can be used for cross-linking in polypeptides include amino groups, carboxyl groups, thiol groups, and hydroxy groups, but are not limited thereto.
  • the amino group of the lysine side chain contained in the polypeptide can be cross-linked with an amide bond by dehydration condensation with the carboxyl group of the glutamic acid or aspartic acid side chain.
  • Crosslinking may be carried out by a dehydration condensation reaction under vacuum heating or by a dehydration condensation agent such as carbodiimide.
  • the crosslinking reaction may be performed with a crosslinking agent such as carbodiimide or glutaraldehyde.
  • the carbodiimide is represented by the general formula R 1 N ⁇ C ⁇ NR 2 (wherein R 1 and R 2 represent an organic group containing an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and a cycloalkyl group), and the specific compound is 1 -Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide, diisopropylcarbodiimide (DIC), etc.
  • EDC Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DCC N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC and DIC are preferable because they have a high amide bond forming ability of peptide chains and easily undergo a crosslinking reaction.
  • a cross-linking agent it is preferable to apply a cross-linking agent to the drawn yarn and perform cross-linking by vacuum heat drying.
  • a 100% product of the crosslinking agent may be applied to the fiber, or may be diluted with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a buffer solution and applied to the fiber at a concentration of 0.005 to 10% by mass.
  • the treatment conditions are preferably a temperature of 20 to 45 ° C. and a time of 3 to 42 hours. Due to the crosslinking treatment with the crosslinking agent, the artificial polypeptide stretched fiber has higher stress (strength).
  • ADF3Kai gene A partial amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287), one of the two major worm-coiled silkworm spider silk proteins, was obtained from the NCBI web database and started at the N-terminus of the same sequence.
  • a pUC57 vector (with an Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and an Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) into which the ADF3Kai gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 was introduced was obtained. Thereafter, the gene was treated with restriction enzymes with Nde I and EcoR I and recombined into a pET22b (+) expression vector.
  • a PCR reaction was performed using ADF3Kai as a template using a T7 promoter primer (SEQ ID NO: 11) and Rep Xba I primer (SEQ ID NO: 12), and the 5 ′ half of the ADF3Kai gene sequence
  • sequence A The sequence (hereinafter referred to as “sequence A”) was amplified, and the fragment was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and Xba I in advance using a Mighty Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Recombined.
  • the pUC118 vector into which the sequence A was introduced was treated with Nde I and Xba I
  • the pUC118 vector into which the sequence B was introduced was treated with restriction enzymes with Xba I and EcoR I, respectively, and the target DNA fragments of the sequences A and B were obtained by cutting out the gel.
  • the DNA fragments A and B and pET22b (+) previously treated with Nde I and EcoR I were subjected to a ligation reaction and transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • pET22b (+) expression vector containing the ADF3Kai-Large-NRSH1 gene sequence obtained above was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After culturing the obtained single colony in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours, 1.4 ml of the same culture solution was added to 140 mL of LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. and 200 rpm. The culture was continued until the OD 600 was 3.5. Then, OD 600 of the culture broth of 3.5, added with 50% glucose 140mL in 2 ⁇ YT medium 7L containing ampicillin, and further cultured until an OD 600 of 4.0.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the load cell capacity was 1N, and the gripping jig was a clip type.
  • Toughness [E / (r 2 ⁇ ⁇ ⁇ L) ⁇ 1000] (unit: MJ / m 3 )
  • E Breaking energy (Unit: J)
  • r Radius of fiber (unit: mm)
  • E The specific gravity of the fiber was measured according to the JIS L 1015 floatation method by requesting an outsourced analysis to the Kaken Test Center. The specific gravity of this fiber was 1.34.
  • Table 2 summarizes various physical property values. The stress-displacement (strain) curves of the fibers obtained in each Example and Comparative Example are shown in FIGS.
  • the artificial polypeptide fiber of the present invention can be suitably used for resin and metal reinforcing fibers, composite materials, injection molding and the like.
  • the application can be applied to transportation equipment members such as automobiles and reinforcing fibers for tires. It can also be applied to fishing lines, tennis and badminton guts, violin kites, violin bows, and artificial hair.
  • the form can be applied to yarn, cotton, woven fabric, knitted fabric, braided fabric, non-woven fabric, and the like.

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Abstract

　本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ３以上である。本発明の人造ポリペプチド繊維の製造方法は、天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む紡糸液（６）を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる前記人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸（３）と、乾熱における二段目延伸（４）を含む。これにより、応力と破断伸度が適度にあり、タフネスの高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供する。

Description

人造ポリペプチド繊維及びその製造方法
　本発明は合成タンパク質繊維の一種である人造ポリペプチド繊維及びその製造方法に関する。
　クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、高張力鋼、ナイロン６繊維、アラミド繊維、炭素繊維などよりも高い強度とタフネスを有することが知られている。加えて、石油を原料とせず、原料をバイオマス化できる利点もある。人工クモ糸繊維もいくつか提案されている。例えば、特許文献１には、合成タンパク質紡糸溶液を、５～１０μｌ／ｍｉｎの速度で紡糸口金から９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出して繊維とすることが提案されている。特許文献２には、１μｍ以上の直径および５ｍｍ以上の長さを有し、２００ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有する繊維が提案されている。非特許文献１には、メタノール浴と水浴で延伸倍率５倍で延伸することにより得られた強度１．９１～２．２６ｇ／ｄ、伸度４３．４～５９．６％の延伸糸が開示されている。非特許文献２には、延伸倍率を５倍とすることにより得られた応力６００ＭＰａ、伸度２５％の延伸糸が開示されている。非特許文献３には、スチーム中に５分間滞留させて５倍に延伸させることにより得られた応力２８０～３５０ＭＰａ、伸度３０～４０％の延伸糸が開示されている。
　しかし、従来の人造ポリペプチド繊維のタフネスはいまだ不足であり、さらに高い応力を有する強靭な繊維が望まれていた。
特表２００４－５０３２０４号公報 特表２００９－５２１９２１号公報
Anthoula Lazaris,et.al.,"Spider Silk Fiber Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells",Science,295,p472,2002年1月18日 Xiao-Xia Xia,et.al.,"Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coil results in a strong fiber",PNAS,vol.107,No.32,p14059-14063,2010年8月10日 M. Elice,et.al.,"Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk",Macromolecules,Vol. 44,No.5,p1166-1176,2011年4月2日
　本発明は、前記従来の問題を解決するため、応力及びタフネスが高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供する。
　本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ３以上であることを特徴とする。
　本発明の人造ポリペプチド繊維の製造方法は、天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、乾熱における二段目延伸を含むことを特徴とする。
　本発明は人造ポリペプチドからなる未延伸繊維を湿熱と乾式加熱の少なくとも２段で延伸することにより、応力及びタフネスが高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供できる。すなわち、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ３以上の人造ポリペプチド繊維を実現できる。応力が高く、タフネスが高いと、金属、樹脂、ゴムなどとの複合材料にとって有利である。
図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。 図２Ａ－Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を示す説明図であり、図２Ａは紡糸工程－一段目延伸工程、図２Ｂは二段目延伸工程を示す。 図３は本発明の実施例１で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図４は本発明の実施例２で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図５は本発明の実施例３で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図６は本発明の実施例４で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図７は本発明の実施例５で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図８は比較例１で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。 図９は比較例２で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線である。
（１）ポリペプチド
　本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする。本発明において、主成分とは、８０質量％以上含まれることを意味し、９０質量％以上含まれることがより好ましく、９５質量％以上含まれることがさらに好ましい。なお、本発明の人造ポリペプチド繊維は、本発明の効果を阻害しない範囲内において、ポリペプチド以外の他の成分を含んでもよい。本発明においては、原料として天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを用いることが望ましい。天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質に由来するものであればよく、特に限定されない。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。
　前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上含むポリペプチドが挙げられる。或いは、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式（１）：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。ここで、［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）］で示されるアミノ酸配列の単位が異なるとは、ＲＥＰ１が異なる場合、ＲＥＰ２が異なる場合、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２のいずれも異なる場合を含む。上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌などの微生物を宿主として組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が３００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは２００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１５０ｋＤａ以下である。
　前記式（１）において、ＲＥＰ１は、アラニン及びグリシンから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が連続して２～２０残基並んでおり、より好ましくは３～１６残基、さらに好ましくは４～１２残基、最も好ましくは５～８残基並んでいるアミノ酸配列である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は、２～２００残基、より好ましくは１０～１５０残基、さらに好ましくは２０～１００残基、最も好ましくは２０～７５残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、かつ前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。
　大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号７）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列と同一である。
　また、前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するタンパク質を用いることができる。本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１～４０個、１～３５個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個を意味する。
　前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
（２）紡糸液
　紡糸液（ドープ液）は、前記ポリペプチドに溶媒を加え、紡糸できる粘度に調整して作製する。
溶媒は前記ポリペプチドを溶解することができるものであればどのようなものでも良い。例えば前記ポリペプチドがニワオニグモに由来する場合、一例としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、蟻酸、尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウムなどを含む水溶液などを溶媒とし、適量加えて溶液粘度を１００～１０，０００ｃＰ（センチポイズ）とする。これを紡糸液とする。
（３）紡糸
　紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ポリマーを溶解させた溶媒を除去し（脱溶媒ともいう）、未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒がＨＦＩＰの場合、凝固液はメタノール、エタノール、２－プロパノールなどの炭素数１～５の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。凝固液の温度は０～３０℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２～２．４ｍｌ／ｈが好ましい。この範囲であれば紡糸は安定する。さらに好ましい押し出し速度は１ホール当たり、０．６～２．２ｍｌ／ｈである。凝固液槽の長さは２００～５００ｍｍ、未延伸糸の引き取り速度は１～３ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は０．０１～０．１５ｍｉｎが好ましい。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸（前延伸）をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。
（４）延伸
（ａ）多段延伸の作用機能
　延伸は少なくとも２段で行う。もちろん３段以上の多段延伸も採用できる。本発明において、２段以上の多段延伸を採用する理由は、天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、どちらかというと分子が配向し難いため、多段で延伸することにより分子を多段で配向させ、トータル延伸倍率も高くすることができるため、結果としてタフネスの高い繊維が得られるためである。
（ｂ）多段延伸の内容
　前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、次に乾熱における二段目延伸を含む。湿熱における一段目延伸は前記凝固液中で行ってもよい。３段以上の多段延伸を採用する場合は、湿熱の一段目延伸を２段に分ける及び／又は乾熱の二段目延伸を２段に分けるなどの方法を採用できる。一段目延伸の湿熱は、温水中でも良いし、スチーム加熱でも良い。温水には有機溶剤などを加えても良い。本多段延伸は湿熱又は乾熱以外の延伸方法を延伸工程の任意の段階に追加しても良い。
（ｃ）一段目と二段目の延伸条件
　一段目延伸は未延伸糸を５０～９０℃の温水で２～８倍延伸することが好ましい。このようにすると安定した延伸ができる。二段目延伸は１７０℃～２７０℃の乾熱で１．２５～３倍延伸することが好ましい。これにより、高タフネスの延伸糸が得られる。前記において一段目延伸は未延伸糸を７５～８５℃の温水で延伸するのがさらに好ましい。一段目延伸の延伸倍率は２．３～７倍とすることがさらに好ましい。二段目延伸は１８０℃～２３０℃の乾熱がさらに好ましい。二段目延伸の延伸倍率は１．３５～３倍がさらに好ましい。延伸糸のタフネスを向上しかつ安定して延伸糸を得るためには、トータル延伸倍率は５倍を超え２０倍以下とするのが好ましく、さらに好ましくは６倍以上１１倍以下である。乾熱は一例として電気管状炉または熱板を使用する。
（ｄ）連続工程
　紡糸から延伸までは連続工程としても良いし、任意の工程に分けて実施しても良い。図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。図１は連続工程を示している。紡糸延伸装置１０は、押し出し工程１と、未延伸糸製造工程２と、湿熱延伸工程３と、乾熱延伸工程４を含む。紡糸液６は貯槽７に貯蔵され、ギアポンプ８から口金９に押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ１９を有するか又は直接、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給し、溶媒を除去する。次いで延伸浴槽２１内の温水１２内に供給し、一段目延伸する。延伸は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。次いで乾熱延伸装置１７に供給し、糸道２２内で二段目延伸し、巻糸体５とする。延伸は供給ニップローラ１５と引き取りニップローラ１６との速度比によって決まる。１８ａ～１８ｆは糸ガイドである。
（ｅ）分離工程
　図２Ａ－Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を分離した例の説明図である。図２Ａは紡糸工程３０及び一段目延伸工程４０、図２Ｂは二段目延伸工程５０を示す。それぞれの工程ごとに糸を巻き取るかまたは巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸工程３０においては、マイクロシリンジ３１内に紡糸液３２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル３３から紡糸液３２を押し出し、凝固液槽３４内の凝固液３５に供給し、未延伸糸３６とする。続いて一段目延伸工程４０においては、未延伸糸３６を延伸浴槽３７内の温水３８内に供給し、一段目延伸し、一段目延伸糸の巻糸体３９とする。延伸は供給ニップローラ４１と引き取りニップローラ４２との速度比によって決まる。次いで巻糸体３９から一段目延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置４３に供給し、糸道４７内で二段目延伸する。延伸は供給ニップローラ４５と引き取りニップローラ４６との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体４４に巻き取る。
　以上のようにして人造ポリペプチド繊維を得る。得られた人造ポリペプチド繊維は、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ３以上である。タフネスは繊維の強伸度を測定する際の応力－ひずみ曲線（ＳＳカーブ）の積分値から算出される。図３は本発明の一実施例で得られた繊維のタフネスの説明図であり、応力－変位（ひずみ）曲線とタフネス（斜線部）を示す。応力と破断伸度の両方が高いとタフネスも高いことがわかる。
　本発明の人造ポリペプチド繊維の好ましい応力は４００ＭＰａ以上であり、より好ましくは５９０ＭＰａ以上、特に好ましくは６２０ＭＰａ以上である。好ましい破断伸度は３９％以上であり、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは５０％以上である。好ましいタフネスは１７０ＭＪ／ｍ３以上であり、より好ましくは２４０ＭＪ／ｍ３以上、さらに好ましくは２６０ＭＪ／ｍ３以上である。本発明の人造ポリペプチド繊維の好ましい初期弾性率は８ＧＰａ以上、より好ましくは１４ＧＰａ以上，さらに好ましくは１６ＧＰａ以上である。
　本発明の人造ポリペプチド繊維は直径が５～１００μｍの範囲であることが好ましい。前記の範囲であれば安定して延伸繊維を得ることができる。より好ましい繊維直径は７～３０μｍの範囲、さらに好ましくは８～２５μｍの範囲である。また、本発明の人造ポリペプチド繊維は、繊維直径が均一であり、繊維直径の変動率が５％以下であることが好ましい。繊度（単位：ｔｅｘまたはｄｅｃｉ　ｔｅｘ）を算出する場合は、繊維断面が丸の場合は繊維直径から計算される断面積と比重と長さから算出する。なお、本発明の人造ポリペプチド繊維は湿式紡糸により得られるため、断面が円形とは限らず様々な形状を含むため、繊維直径（平均直径）は断面を円形と想定した場合の平均径をいう。
　前記ポリペプチドは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来のポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として上げられる。
　前記人造ポリペプチド繊維の複屈折率Δｎ（×１０００）は１５．６以上であることが好ましい。なお複屈折率と複屈折度は同一である。複屈折率はオリンパス社製の偏光顕微鏡でセナルモンというコンペンセータを使用して測定できる。測定範囲は０～５４６ｎｍ（０～１λ）、Δｎ＝Ｒ／直径の計算で求める。前記において、Ｒはセナルモンのコンペンセータで測定したレタデーション量（ｎｍ）である。複屈折率Δｎ（×１０００）が１５．６以上であることは、分子の配向が進んでいることを示す。
　本発明の人造ポリペプチド繊維は延伸後、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間について化学的に架橋させてもよい。ポリペプチドにおいて架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基などがあるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミドなどの脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼなどの酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどの架橋剤で架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１，Ｒ２は炭素数１～６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、延伸糸に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋するのが好ましい。架橋剤は１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１～５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５～１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０～４５℃で３～４２時間が好ましい。架橋剤による架橋処理により、人造ポリペプチド延伸繊維はさらに高い応力（強度）となる。
　以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１～５、比較例１～２）
　＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
　ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号７）を付加したアミノ酸配列（配列番号５）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号８で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
　ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１１）とＲｅｐ　Ｘｂａ　Ｉプライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ　Ｉ　Ｒｅｐプライマー（配列番号１３）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１４）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６　ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号９に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号６で示すとおりであった。
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
　上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号６）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１０に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号４で示すとおりであった。
　＜タンパク質の発現＞
　上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
　＜精製＞
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を７．５ＭＵｒｅａ　ＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で溶解し、スターラーで撹拌した後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
（４）紡糸液（ドープ液）
　凍結乾燥粉末の濃度が８．１質量％になるように、凍結乾燥粉末にヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を添加した。ローテーターで１４時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液（ドープ液）とした。
（５）紡糸工程－一段目延伸工程
　紡糸工程から延伸工程は図２Ａ－Ｂに示す方法を用いた。紡糸液をシリンダーに充填し、０．２ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い、１００質量％メタノール凝固液中に押し出して未延伸糸を作製した。押し出し速度を１．８ｍｌ／ｈ、凝固液槽の長さは４００ｍｍとした。続いて一段目延伸として、未延伸糸を８０℃の温水で２．３～７倍延伸し、巻き取り速度を２．３～３．６ｍ／ｍｉｎとした。
（６）二段目延伸工程
　二段目延伸として、１８０～２２０℃の乾熱板で１．４～２．９６倍延伸すると高タフネスの延伸糸が得られることがわかった。各実施例及び各比較例では下記表１の条件を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（７）物性測定
（ａ）走査型電子顕微鏡観察で表面構造を観察した。
（ｂ）分子の配向を調べるため、偏光顕微鏡でレタデーション、干渉色、複屈折度を求めた。オリンパス社製の偏光顕微鏡でセナルモンというコンペンセータを使用した。測定範囲は０～５４６ｎｍ（０～１λ）、Δｎ＝Ｒ／直径の計算で求める。前記において、Ｒはセナルモンのコンペンセータで測定したレタデーション量（ｎｍ）である。実施例１の繊維の複屈折率Δｎ（×１０００）は１５．６であった。実施例１の繊維は分子の配向が進んでいることが確認できた。
（ｃ）光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
（ｄ）温度２５℃、相対湿度６０％の雰囲気温度で引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ－Ｓ）を用いて繊維の強度（応力）、初期弾性率（２０点の最大傾きで測定した。具体的には、５０ｍｓｅｃ間隔で測定し、傾きの計算を２０点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。）、伸度（破断点変位、変位）を測定し、下記式によりタフネスを算出した。サンプルは厚紙で作製した型枠に貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。
タフネス＝［Ｅ／（ｒ２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ３）
但し、
Ｅ　破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ　繊維の半径（単位：ｍｍ）
π　円周率
Ｌ　引張り試験測定時のつかみ具間距離：２０ｍｍ
（ｅ）繊維の比重測定は一般財団法人カケンテストセンターに外注分析を依頼し、ＪＩＳ　Ｌ　１０１５　浮沈法に準じて測定した。本繊維の比重は１．３４であった。
　各種物性値を表２にまとめて示した。各実施例及び比較例で得られた繊維の応力－変位（ひずみ）曲線を図３～図９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から明らかなとおり、本発明の実施例品は応力、破断伸度は適度にあり、タフネスが高い人造ポリペプチド繊維であることが確認できた。
　表３には本発明の実施例１～５で得られた繊維と、既存の天然クモ糸繊維、炭素繊維、パラ系アラミド繊維との応力、伸度、タフネスをまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （備考）表２の「破断点変位（ひずみ）」と表３の「伸度」とは同一である。
　表３から明らかなとおり、本発明の実施例で得られた繊維の応力、伸度は適度にあり、タフネスは高いことが確認できた。
　本発明の人造ポリペプチド繊維は、樹脂や金属の強化繊維、複合材料、射出成形などに好適に使用できる。その用途は、自動車などの輸送機器部材、タイヤの補強繊維などに適用できる。さらに釣り糸、テニスやバドミントンのガット、バイオリンの絃、バイオリンの弓、人造毛髪などにも適用できる。形態としては糸、綿、織物、編物、組み物、不織布などに応用できる。
１　押し出し工程
２，３０　未延伸糸製造工程
３，４０　湿熱延伸工程（一段目延伸工程）
４，５０　乾熱延伸工程（二段目延伸工程）
５，３９，４４　巻糸体
６，３２　紡糸液
７　貯槽
８　ギアポンプ
９　口金
１０　紡糸延伸装置
１１，３５　凝固液
１２，３８　温水
１３，１５，４１，４５　供給ニップローラ
１４，１６，４２，４６　引き取りニップローラ
１７，４３　乾熱延伸装置
１８ａ～１８ｆ　糸ガイド
１９　エアギャップ
２０，３４　凝固液槽
２１，３７　延伸浴槽
２２，４７　糸道
３１　シリンジ
３３　ノズル
３６　未延伸糸
　配列番号１～７　　アミノ酸配列
　配列番号８～１０　　塩基配列
　配列番号１１～１４　プライマーシーケンス

Claims (15)

  1. 　ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、
    　応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ３以上であることを特徴とする人造ポリペプチド繊維。
  2. 　前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドであり、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、前記式（１）において、ＲＥＰ１は、アラニン及びグリシンから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が連続して２～２０残基並んでおり、ＲＥＰ２は、２～２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、かつ前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上である請求項１に記載の人造ポリペプチド繊維。
  3. 　前記ポリペプチドは、Ｃ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドである請求項２に記載の人造ポリペプチド繊維。
  4. 　前記繊維のタフネスは１７０ＭＪ／ｍ３以上である請求項１～３のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  5. 　前記繊維のタフネスは２４０ＭＪ／ｍ３以上である請求項１～４のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  6. 　前記繊維の応力は５９０ＭＰａ以上である請求項１～５のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  7. 　前記繊維の破断伸度は２６％以上である請求項１～６のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  8. 　前記繊維の初期弾性率は８ＧＰａ以上である請求項１～７のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  9. 　前記繊維直径の変動率が５％以下である請求項１～８のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  10. 　前記繊維の直径が５～１００μｍの範囲である請求項１～９のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
  11. 　天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、
    　前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、乾熱における二段目延伸を含むことを特徴とする人造ポリペプチド繊維の製造方法。
  12. 　前記一段目延伸の延伸条件が、７０～９０℃の温水中で２～８倍に延伸する請求項１１に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
  13. 　前記二段目延伸の延伸条件が、１７０～２３０℃の雰囲気温度で１．２５～３倍に延伸する請求項１１又は１２に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
  14. 　前記紡糸は、前記ポリペプチドを含む紡糸液を凝固液に押し出して未延伸糸とし、前記凝固液中で一段目延伸する請求項１０～１３のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
  15. 　前記繊維のトータル延伸倍率は５倍を超え２０倍以下である請求項１１～１４のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
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