WO2010053140A1 - ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物 - Google Patents

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hyaluronic acid
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acid derivative
alkyl
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一成 秋吉
貴士 中井
泰 平倉
剛 下房地
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国立大学法人 東京医科歯科大学
中外製薬株式会社
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    • C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a novel hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced therein, a pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative, and particularly a pharmaceutical composition containing a medicinal protein and / or peptide.
  • the pharmacological activity of proteins and peptides is largely attributed to their higher order structures, and the pharmacological activity of proteins and peptides is impaired by denaturation and aggregation caused by external environments such as contact with organic solvents and air interfaces, pressure, temperature, and pH. It is known that It is also known that the risk of antigenicity is increased by administering a denatured or aggregated protein into the body. In sustained-release preparations containing protein or peptide as the active ingredient, the stability of the protein or peptide is ensured from the formulation process until the active ingredient is released in vivo after administration through the storage period of the preparation. Is required.
  • Non-patent Documents 1 and 2 Attempts to commercialize sustained-release preparations based on biodegradable polymers such as polylactic acid-polyglycolic acid copolymer (PLGA) have been widely made. Protein denaturation or aggregation due to the operation for (emulsification, drying, acidification, etc.) has been reported (Non-patent Documents 1 and 2).
  • the base material used for the preparation must be non-antigenic, non-mutagenic, non-toxic and biodegradable.
  • sustained-release preparations there are no known sustained-release preparations that have reached a practical level in the amount of protein or peptide encapsulated and the recovery rate.
  • HA hyaluronic acid
  • HA is considered to be preferable as a base material for a sustained-release preparation from the viewpoint of safety.
  • Many preparations using HA as a base material have been reported so far, with the aim of using modified HA for the purpose of improving blood retention (Patent Document 1) and improving the retention in the knee joint.
  • Patent Document 2 an HA derivative having an introduced alkyl chain
  • Patent Document 3 use of an in situ crosslinked HA gel for protein sustained release (Patent Document 3), hyaluronic acid ester for sustained release of bone morphogenetic protein (BMP)
  • BMP bone morphogenetic protein
  • Patent Document 5 As an example of a pharmaceutical preparation using a polyamino acid derivative as a base material, use of a polyglutamic acid into which tocopherol has been introduced has been reported (Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 3 Thermodynamic evaluation of the pullulan derivative after protein incorporation shows that the incorporated protein is stabilized by hydrogen bonding with the hydroxy group of pullulan (Non-patent Document 11).
  • Patent Document 6 carboxymethyl cellulose
  • Non-Patent Document 12 Non-Patent Document 12
  • Patent Document 8 published after the priority date of the present application discloses a composition containing a hyaluronic acid derivative having a crosslinkable group and a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group, the hyaluron having a crosslinkable group.
  • Compositions have been reported in which the acid derivative is prepared by a cross-linking reaction of hyaluronic acid or a derivative having a group capable of cross-linking in the presence of a hydrophilic polysaccharide derivative.
  • CD44 In vivo, CD44, RHAMM (Receptor for Hyaluronic Acid-Mediated Motility), LYVE-1 (Lymphe Vessel Endothelial HA Receptor-1), HARE (Hyperonic Receptor, etc.) are present. (Non-patent document 18 and Non-patent document 19).
  • CD44 and RHAMM are overexpressed in many cancer cells, and therefore, attempts have been made to use HA as a substrate for cancer targeting carriers.
  • Non-patent Documents 20 to 22 and Patent Document 9 examples thereof include paclitaxel-HA conjugate (Non-patent Documents 20 to 22 and Patent Document 9), camptothecin-HA conjugate (Patent Document 10), doxorubicin-HPMA [N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide] -HA. Conjugate (Non-patent document 23), Butyric acid-HA conjugate (Non-patent document 24), Doxorubicin-encapsulated HA-PEG-PLGA nanoparticles (Non-patent document 25), siRNA-encapsulated HA gel (Non-patent document 26), Doxorubicin encapsulated HA-coated liposome (Non-patent Document 27) and the like can be mentioned.
  • Non-Patent Document 28 published after the priority date of the present application reports on an HA derivative conjugated with cholic acid via an ethylenediamine linker introduced by an amide bond. It has been reported that these HA-based carriers are efficiently taken up in cells expressing CD44 in vitro (for example, Non-Patent Document 20). However, HA is known to be instantaneously taken up and metabolized by the HARE receptor present in the sinusoidal endothelium such as the liver when systemically administered, and rapidly disappears from the blood (Non-Patent Documents 29 to 31). ). Therefore, efficient cancer targeting using an HA base material requires a carrier that suppresses uptake in the liver and has improved blood retention.
  • a carrier that can encapsulate proteins, peptides, small molecules, and nucleic acids as drugs and that can be used as a sustained release carrier or targeting carrier in blood, particularly a carrier that has excellent retention in blood.
  • An object of the present invention is to provide a substrate for a pharmaceutical preparation excellent in safety, and when a protein or peptide having a medicinal effect is used as a drug, many drugs can be efficiently used while maintaining pharmacological activity.
  • a carrier that can be encapsulated and a substrate that can be used as a sustained-release carrier in blood and a targeting carrier with excellent retention in blood, and can also be a topical (for example, subcutaneous) sustained-release carrier capable of sustained sustained drug release It is to be.
  • a hyaluronic acid derivative having a specific hydrophobic group introduced therein contains an aqueous solution while encapsulating a large amount of a drug, particularly a protein or peptide having pharmacological activity. I found that they would meet spontaneously. In addition, it has been found that there is a range in which the amount of hydrophobic group introduced causes significant aggregation and precipitation under physiological salt concentration, and a range in which stable fine particles are formed even under physiological salt concentration and stably dispersed in water. It was. Furthermore, the inventors have found that the retention in blood of a hyaluronic acid derivative using HA having a specific molecular weight as a raw material is remarkably improved, and completed the present invention.
  • the present invention spontaneously associates in an aqueous solution and can efficiently encapsulate drugs, particularly proteins and peptides having medicinal properties while maintaining their biological activity, and significantly aggregates under physiological salt concentration. (Or disperse even under physiological salt concentration) and good blood retention, hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced therein, a method for producing the same, and a drug containing the drug and the hyaluronic acid derivative
  • the present invention relates to a composition and a method for producing the same.
  • a hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced therein which has the formula (I): [Wherein R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues;
  • X 1 has the following formula: -NR b -R, —NR b —COO—R, —NR b —CO—R, —NR b —CO—NR c —R, -COO-R, -O-COO-R, -SR, -CO-Y a -SR, —O—CO—Y b —S—R, —NR b —CO—Y b —S—R, and —S—S—R,
  • R g is selected from a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl or hydroxy C 2-20 alkyl, wherein the alkyl portion of the group is 1-3 selected from —O— and —NH— Groups may be inserted;
  • Y a is C 1-5 alkylene;
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene;
  • m is an integer selected from 1 to 100]
  • the hyaluronic acid derivative comprising one or more repeating units represented by is provided.
  • a hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced therein which is represented by the formula (Ia): [Wherein R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; X is a hydrophobic group represented by —NR a —Y—NR b —COO—R; R a and R b are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl; R is a steryl group; Y is C 2-30 alkylene, or — (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —, m is an integer selected from 1 to 100]
  • the hyaluronic acid derivative comprising one or more repeating units represented by is provided.
  • the repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative may be modified at a position other than the repeating unit of formula (I).
  • the hydroxy group has —O (C 1-6 alkyl), —O (formyl) and —O (C 1 -6 alkylcarbonyl) and the like, and the carboxy group may be converted to an amide or ester, or may form a salt.
  • the group —ZN (R a ) Y—X 1 of formula (I) above has the following formula: —NH— (CH 2 ) mz —NH—R; —NH— (CH 2 ) mz —NH—COO—R; —NH— (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —NH—COO—R; —NH— (CH 2 ) mz —COO—R; —NH— (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —COO—R, —NH— (CH 2 ) mz —O—COO—R; —NH— (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —O—COO—R, —NH— (CH 2 ) mz —S—R; —NH— (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —S—R; —NH— (CH 2 ) mz —S—R; —NH—
  • Z is a direct bond.
  • X 1 is —NR b —COO—R.
  • Y include —CH 2 CH 2 O—CH 2 CH 2 —SS—CH 2 CH 2 O—CH 2 CH 2 —, — (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 —.
  • Y a is preferably —CH 2 — and —CH 2 —CH 2 —.
  • Y b includes —CH 2 —CH 2 —, —CH (CH 3 ) CH 2 —, 2-butene-1,4-diyl, hepta-2,4-diene-1,6-diyl and octa-2. , 4,6-triene-1,8-diyl is preferred, and —CH 2 —CH 2 — and —CH (CH 3 ) CH 2 — are more preferred.
  • Z is a peptide linker represented by —NH— [CH (—Z a ) —CONH] n ⁇ 1 —CH (—Z a ) —CO—, wherein n Is an integer of 2 to 30, and Z a each independently represents a substituent in an ⁇ -amino acid represented as H 2 N—CH (—Z a ) —COOH.
  • the peptide linker binds to the carboxy group of the glucuronic acid moiety at the N-terminus and to the group —N (—R a ) —Y—X 1 at the C-terminus.
  • amino acids that can be used as amino acid residues of the peptide linker include ⁇ -amino acids such as alanine, arginine, asparagine (Asn), aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine (Gly), histidine, isoleucine, leucine (Leu). ), Lysine, methionine, phenylalanine (Phe), proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, etc.
  • -Amino acids can be used.
  • examples of Z a include —CH 3 , H 2 NC (NH) NH (CH 2 ) 3 —, H 2 NCOCH 2 —, and the like.
  • the n Zs may be the same or different.
  • n is an integer of 2 to 30, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 4.
  • Preferable examples of the peptide linker include -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, Phe-Gly- and the like.
  • Specific examples of the group —ZN (R a ) Y—X 1 include —NH— (CH 2 ) 2 —NH—CO—cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 4 —NH— (CH 2 ) 3 —NH— (CH 2 ) 3 —NH—COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 3 —NH— (CH 2 ) 4 —NH— (CH 2 ) 3 —NH—COO-cholesteryl, —NH— ( CH 2 ) 4 —NH— (CH 2 ) 3 —NH—COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 4 —N (— (CH 2 ) 3 —NH 2 ) —COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 3 —NH— (CH 2 ) 4 —N (— (CH 2 ) 3 —NH 2 ) —COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 3 —NH— (CH 2
  • R a , R b and R c are hydrogen atoms and Y is a linear C 2-30 alkylene or — (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 — and Y a is linear C 1-5 alkylene or Y b is linear C 2-8 alkylene or linear C 2-8 Alkenylene.
  • the repeating unit represented by formula (I) and formula (II) wherein R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; X a is selected from hydroxy and —O ⁇ Q + ; where Q + is a counter cation]
  • the hyaluronic acid derivative containing the repeating unit represented by these is provided.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention contains two or more repeating units represented by the formula (II), the repeating units may be the same or different.
  • the present invention provides a hyaluronic acid derivative substantially consisting of a repeating unit represented by formula (I) and a repeating unit represented by formula (II).
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with a carboxy group in water.
  • counter cations include metal ions such as lithium ion, sodium ion, rubidium ion, cesium ion, magnesium ion, calcium ion; formula: N + R j R k R l R m (where R j , R k , R 1 and R m are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl), preferably sodium ion, potassium ion, tetraalkylammonium ion ( For example, tetra n-butylammonium ion).
  • R j , R k , R 1 and R m are preferably the same group selected from C 1-6 alkyl, and preferably an n-butyl group.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 , and R 1a , R 2a , R 3a, and R 4a are preferably all hydrogen atoms. Moreover, it is preferable that both R a and R b are hydrogen atoms.
  • the hyaluronic acid derivative is substantially composed of repeating units of the formulas (I) and (II).
  • the hyaluronic acid derivative is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% of the disaccharide repeating units composed of D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine contained in the derivative.
  • the above is the repeating unit of formula (I) or (II). In one embodiment of the present invention, it is composed of only the repeating units represented by the above formulas (I) and (II).
  • Y defined in formula (I) is, for example, — (CH 2 ) na — (wherein na is selected from an integer of 2 to 20, preferably 2 to 15, more preferably 2 to 12). at best, preferably, - (CH 2) 2 - , - (CH 2) 6 -, - (CH 2) 8 - and - (CH 2) 12 - a, and still more preferably - (CH 2) 6 -.
  • Y are preferable from the viewpoints of precipitation formation and stable dispersion described later.
  • a hyaluronic acid derivative as defined herein, wherein the hyaluronic acid derivative is characterized by forming fine particles by association in water.
  • the particle diameter of the fine particles is not particularly limited, but is, for example, 1 ⁇ m or less, preferably 500 nm, more preferably 200 nm or less, still more preferably 100 nm or less, and even more preferably 50 nm or less.
  • the introduction rate of the hydrophobic group is expressed by the following formula: Is calculated by
  • a repeating unit of the formula (I) in which a carboxy group is converted to an amide group and a hydrophobic group is introduced, and a hydrophobic group are introduced.
  • Not repeating units of formula (II), (III) and (IV) are included.
  • the introduction rate can be controlled by reaction conditions, for example, the ratio of reagents, and can be determined by, for example, NMR measurement.
  • a hyaluronic acid derivative introduced with a hydrophobic group as defined herein, wherein the introduction rate of the hydrophobic group with respect to the disaccharide repeating unit present in the derivative is
  • the hyaluronic acid derivative is provided at 7-15%.
  • the introduction rate is in the above range, the hyaluronic acid derivative has a property that it significantly aggregates in a solution having a salt concentration equal to or higher than a certain value (for example, under physiological salt concentration) to form a precipitate.
  • the group-introduced hyaluronic acid derivative is combined with a drug and administered into the body (for example, subcutaneously), whereby a precipitation-type sustained-release preparation taking advantage of the characteristics of aggregation after administration can be obtained.
  • a hyaluronic acid derivative introduced with a hydrophobic group as defined herein, wherein the introduction ratio of the hydrophobic group to the repeating unit of the disaccharide present in the derivative is The hyaluronic acid derivative is provided that is 18-42%.
  • the introduction rate is within the above range, the hyaluronic acid derivative has the property of forming stable fine particles even in a solution having a salt concentration above a certain level (for example, under physiological salt concentration) and stably dispersing in water.
  • the hyaluronic acid derivative having the introduction rate is combined with a drug and administered into the body (for example, intravenously), it can be a sustained-release preparation in blood and a target preparation for target tissues or cells.
  • a hyaluronic acid derivative introduced with a hydrophobic group as defined herein, wherein the introduction rate of the hydrophobic group with respect to the disaccharide repeating unit present in the derivative
  • the hyaluronic acid derivative is provided in which is 2 to 50%.
  • the introduction rate in the above range is preferable from the viewpoint of improving the retention in blood, more preferably 8 to 35%, and further preferably 15 to 22%.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing one or more repeating units represented by formula (I) is preferably hyaluronic acid or a derivative thereof substantially consisting of repeating units represented by formula (II), more preferably It is synthesized from hyaluronic acid or a derivative thereof composed only of the repeating unit represented by (II).
  • the weight average molecular weight of the raw material is preferably 27 kilodaltons (kDa) or less, and more preferably 18 kDa or less, from the viewpoint of improving retention in blood.
  • the lower limit of the molecular weight may be 5 kDa or more.
  • the preferred range of the molecular weight is 5 to 27 kDa, more preferably 5 to 18 kDa.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention uses, as a raw material, hyaluronic acid or a derivative thereof substantially consisting of a repeating unit represented by the formula (II) having a weight average molecular weight of 27 kDa or less. Can be manufactured.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a hyaluronic acid derivative substantially composed of repeating units of formula (I) and (II).
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention in which a hydrophobic group is introduced at the introduction rate using the hyaluronic acid having a molecular weight or a derivative thereof, is compared with the case of using hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 27 kDa or a salt thereof, or Compared to the case of modification with a group other than the hydrophobic group, the blood retention property is remarkably improved.
  • a systemic administration type particularly an intravenous administration type sustained-release preparation in blood, and a targeting preparation for target tissues or cells are provided. it can.
  • Y in the formula (I) is — (CH 2 ) n1 — and — (CH 2 CH 2 O) m1 —CH 2 CH 2 — (where n1 is 2 to 15, preferably 2 -12, more preferably an integer of 2-6, and m1 is an integer of 1-4.
  • — (CH 2 ) 2 —, — (CH 2 ) 6 —, — (CH 2 ) 12 — and — (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 — are preferred, and — (CH 2 ) 2 —, — (CH 2 ) 6 — and — (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 — are more preferred.
  • hydrophobic group that is X in the formula (I) examples include —NH— (CH 2 ) 2 —NH—COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 6 —NH—COO-cholesteryl, —NH— (CH 2 ) 12 —NH—COO-cholesteryl and —NH— (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 —NH—COO-cholesteryl are preferred, —NH— (CH 2 ) 2 —NH—COO-cholesteryl, More preferred are —NH— (CH 2 ) 6 —NH—COO-cholesteryl and —NH— (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 —NH—COO-cholesteryl.
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X b represents —NR e —Y b —R d ;
  • R e is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group;
  • R d is a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl group or a group —CO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ;
  • Y b represents —CH 2 — (CHR 5 ) 1 -2 —CH 2 —NH—, —CH 2 — (CHR 6 ) p-2 —CH 2 —O—, — (CH 2 ) j —S—, -CH 2 -CH 2 - (Y 3 -CH 2 -CH 2) z -S -, - CH 2 -CH 2 -
  • the hyaluronic acid derivative is preferably hyaluronic acid composed of only a repeating unit represented by the formula (II) having a weight average molecular weight of 27 kDa or less, more preferably 18 kDa or less, from the viewpoint of improving retention in blood.
  • the derivative can be used as a raw material.
  • the minimum of the weight average molecular weight of a raw material should just be 5 kDa or more.
  • the preferred range of the molecular weight is 5 to 27 kDa, more preferably 5 to 18 kDa.
  • the ratio of the repeating unit represented by the formula (II) to the repeating unit of the disaccharide present is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and further preferably 20% or less.
  • the lower limit of the ratio may be 0% or more.
  • 50% or more of the carboxy groups of the hyaluronic acid derivative are modified with —ZN (R a ) —Y—X 1 and X b or the like.
  • the ratio of the repeating unit represented by the formula (II) is used as a raw material as described above, a part or most of the carboxy group is modified with the hydrophobic group, so that other than the hydrophobic group Compared with the case where the carboxy group is modified only with a group, the blood retention property is remarkably improved.
  • the introduction ratio of the hydrophobic group to the repeating unit of the disaccharide present is preferably 2 to 70%, more preferably 5 to 35%, and further preferably 15 to 22%.
  • Xb may be the same or different.
  • Two amines that are —NH 2 (secondary amine) can be condensed with the carboxy group of the glucuronic acid moiety simultaneously or in series.
  • the hyaluronic acid derivative having a double bond introduced by a primary amine can be subjected to a crosslinking reaction with a crosslinking agent having a mercapto group at both ends of the alkylene group (for example, dithiothreitol: DTT).
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention can be gelled.
  • the other terminal amino group may be utilized for conjugating drugs by condensing a secondary amine, which is a diamine, with the carboxy group of the glucuronic acid moiety.
  • the amino group remaining without being used is treated with, for example, dicarboxylic anhydride such as succinic anhydride, maleic anhydride, glutaric anhydride and adipic anhydride, or maleic acid, glutaric acid and adipic acid.
  • dicarboxylic anhydride such as succinic anhydride, maleic anhydride, glutaric anhydride and adipic anhydride
  • maleic acid glutaric acid and adipic acid.
  • H 2 N—CH 2 —CH 2 —O—CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 primary amine
  • H 2 N—CH 2 —CH 2 —OH secondary amine
  • These amines may be condensed with the carboxy group of the glucuronic acid moiety simultaneously or sequentially.
  • the double bond introduced by the primary amine can be subjected to a crosslinking reaction in the same manner as described above, and the hyaluronic acid derivative modified with the secondary amine can be expected to improve blood retention.
  • a hyaluronic acid derivative having an amino group introduced therein and a crosslinking agent having succinimidyl ester or other imide ester at both ends of C 2-20 alkylene (for example, bis [ Cross-linking by condensation reaction with sulfosuccinimidyl] suberate (BS 3 ), ethylene glycol-bis [sulfosuccinimidyl] succinate (Sulfo-EGS), dimethyl adipimidate hydrochloride (DMA), etc .; HA -AM and a crosslinking agent having a formyl group at both ends of C 2-20 alkylene (eg, glutaraldehyde); a hyaluronic acid derivative (HA-ALD) into which formyl group is introduced, and C 2-20 alkylene Crosslinking with a crosslinking agent having amino groups at both ends (for example, ethylenediamine (EDA)) Oxidizing conditions
  • the chemical cross-linking structure possessed by the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention may be a cross-linking agent, a group capable of forming a cross-link introduced into a polymer, a bond mode, or the like that decomposes in vivo.
  • a group having an ester bond and a methacryloyl group may be used as a group for the crosslinking reaction.
  • a compound having an ester bond such as Sulfo-EGS or EDMA, or a compound having a peptide spacer that is degraded by an enzyme in a living body may be used.
  • a gel crosslinked by a disulfide bond formed by oxidation of a mercapto group is decomposed in a living body by a disulfide exchange reaction or a reduction reaction.
  • Preferred examples of X b include —NR i — (CH 2 ) n2 —OH (wherein R i is a hydrogen atom; n2 is an integer selected from 2 to 10), and Preferred are —NH— (CH 2 ) 2 —OH and —NH— (CH 2 ) 3 —OH.
  • a hyaluronic acid derivative consisting of a repeating unit represented by the formula (III) is disclosed in WO2006 / 028110.
  • a method for converting a carboxy group (—COOH) of hyaluronic acid into —COX a is described in the publication, or can be converted using a known condensation reaction.
  • R 2c , R 3c , and R 4c are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X c is selected from hydroxy and —O ⁇ Q + , wherein Q + is a counter cation;
  • R 1c is —CO—C (R 21 ) ⁇ CH 2 , —CH 2 CH (OH) —R 22 —Y 1 , —CH (CH 2 OH) —R 22 —Y 1 , -CONH-R 23 -Y 1 , -CO-R 23 -Y 1 , Selected from —CONH—CH 2 CH 2 — (X 21 —CH 2 CH 2 ) n3 —Y 1 , and —CO—CH 2 CH 2 — (X 21 —CH 2 CH 2 ) n4 —Y 1 ,
  • X 21 is selected from O and S: n3 and
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably made from hyaluronic acid or a derivative thereof having a weight average molecular weight of 27 kDa or less and comprising only a repeating unit represented by the formula (II).
  • the hyaluronic acid derivative substantially consisting of the repeating unit represented by formula (I), the repeating unit represented by formula (II) and the repeating unit represented by formula (IV); Hyaluron consisting essentially of a repeating unit represented by formula (I), a repeating unit represented by formula (II), a repeating unit represented by formula (III) and a repeating unit represented by formula (IV) Acid derivatives are provided.
  • R 1c is a hydroxy substituent at the 6-position of the N-acetylglucosamine moiety, and is mainly a crosslinkable group.
  • —CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 —CO—CH ⁇ CH 2 , —CH 2 CH (OH) —CH 2 CH 2 —O—CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 , —CONH—CH 2 CH 2 —O—CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 , —CONH—CH 2 CH 2 — (O—CH 2 CH 2 ) 2 —O—CO—CH ⁇ CH 2
  • —CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 —CO—CH ⁇ CH 2
  • —CO—CH ⁇ CH 2 —CO—CH ⁇ CH 2
  • —CO—CH ⁇ CH 2 —CO—CH ⁇ CH 2
  • —CH 2 CH (OH) —CH 2 CH 2 —O—CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 —CONH—CH
  • the ratio of the repeating unit represented by the formula (IV) to the existing disaccharide repeating unit is preferably 10 to 40%.
  • a hyaluronic acid derivative comprising a repeating unit represented by the formula (IV) is disclosed in WO2008 / 136536, and the conversion of hydroxy (—OH) at the 6-position of the N-acetylglucosamine moiety of hyaluronic acid to —OR 1c , WO 2008/136536 (Patent Document 8) and JP-A-2005-298644 and Biomacromolecules Vol. 6, pp. 1829-1834, 2005 (Non-Patent Document 9) cited therein. be able to. Moreover, it can also convert by well-known esterification reaction and etherification reaction.
  • a pharmaceutical composition comprising a hyaluronic acid derivative as defined herein as a carrier.
  • the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be, for example, a protein and / or peptide, polysaccharide, nucleic acid, low molecular weight compound and the like.
  • a pharmaceutical composition comprising a hyaluronic acid derivative as defined herein as a carrier together with a protein or peptide having pharmacological activity.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is characterized by forming a complex with a drug in water.
  • the formed complex of the hyaluronic acid derivative and the drug may be a dispersible fine particle or a precipitate.
  • Dispersible microparticles can be used as a base material for systemically administered, particularly intravenously administered blood sustained-release preparations and targeting preparations for target tissues or cells, and precipitates are used for locally administered sustained-release preparations. It can be used as a substrate.
  • a hyaluronic acid derivative as defined herein which is complexed with a drug present in the system by spontaneous association in the aqueous solution by hydrophobic interaction of the hydrophobic group.
  • Said hyaluronic acid derivative forming a body is provided.
  • the drug is a protein or peptide.
  • a hyaluronic acid derivative-drug conjugate in which one or more drugs are bound to the hyaluronic acid derivative defined herein.
  • the drug is a protein or peptide, or a nucleic acid or small molecule compound.
  • a method for producing a pharmaceutical composition comprising the step of forming a hyaluronic acid derivative-drug complex as defined herein in water.
  • the following steps (A) producing a hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group as defined herein; (B) a step of dissolving or dispersing the obtained hyaluronic acid derivative in an aqueous phase; (C) a step of adding a drug to the obtained aqueous solution or dispersion of a hyaluronic acid derivative to form drug-carrying fine particles;
  • a method for producing a pharmaceutical composition is provided.
  • a step of adding a salt substance to precipitate the drug-carrying fine particles may be added.
  • Each of the above steps may be performed in a discontinuous phase such as in a W / O emulsion or spray droplets.
  • the fine particles formed in the aqueous phase in the step (c) or the precipitate obtained in the step (d) are dried and solidified (for example, by spray drying or freeze drying), and further pulverized, dried and washed as necessary.
  • the target pharmaceutical composition may be obtained as a solid by performing a process or the like.
  • hyaluronic acid derivative of the present invention By using the hyaluronic acid derivative of the present invention, it becomes possible to provide a sustained-release preparation encapsulating a large amount of a drug, particularly a protein or peptide having medicinal properties while maintaining its biological activity.
  • Hyaluronic acid derivatives are also excellent in safety, and are particularly excellent as a carrier for pharmaceutical preparations.
  • the retention of the drug in the blood can be improved by using a conjugate in which the drug is bound to the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • FIG. 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride prepared in Example 1-1.
  • FIG. 2 is an example of the 1 H-NMR spectrum of cholesteryl 2-aminoethylcarbamate hydrochloride prepared in Example 1-2.
  • FIG. 3 is an example of 1 H-NMR spectrum of cholesteryl 8-aminooctylcarbamate hydrochloride prepared in Example 1-3.
  • FIG. 4 is an example of the 1 H-NMR spectrum of cholesteryl 12-aminododecylcarbamate hydrochloride prepared in Example 1-4.
  • FIG. 5 shows an example of 1 H-NMR spectrum of tetrabutylammonium hyaluronate salt prepared in Example 2-2 and starting from 50 kDa sodium hyaluronate salt.
  • FIG. 6 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 6 -Chol) into which cholesteryl 6-aminohexyl carbamate prepared in Example 2-3-1 was introduced.
  • FIG. 7 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 2 -Chol) into which cholesteryl 2-aminoethyl carbamate prepared in Example 2-3-2 was introduced.
  • FIG. 6 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 6 -Chol) into which cholesteryl 6-aminohexyl carbamate prepared in Example 2-3-1 was introduced.
  • FIG. 7 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 2 -Chol)
  • FIG. 8 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 8 -Chol) into which cholesteryl 8-aminooctylcarbamate prepared in Example 2-3-3 was introduced.
  • FIG. 9 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 12 -Chol) into which cholesteryl 12-aminododecyl carbamate prepared in Example 2-3-4 was introduced.
  • FIG. 10-1 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-1 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It is an example of a chart.
  • FIG. 10-1 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-1 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It is an example of a chart.
  • FIG. 10-2 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-2 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It is an example of a chart.
  • FIG. 10-3 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-4 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It is an example of a chart.
  • FIG. 10-4 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-3 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It is an example of a chart.
  • FIG. 10-3 shows the results (Example 3) in which the HA derivative obtained in Example 2-3-4 was subjected to size exclusion chromatography and the formation of aggregates of the HA derivative was observed from the change in retention time. It
  • FIG. 11-1 shows the change in retention time when hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) was added and the sample obtained in Example 2-3-1 was subjected to size exclusion chromatography. It is an example of the chart showing the result (Example 4) which observed the decay
  • FIG. 11-2 shows the change in retention time when hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) was added and the sample obtained in Example 2-3-2 was subjected to size exclusion chromatography. It is an example of the chart showing the result (Example 4) which observed the decay
  • FIG. 11-3 shows the change in retention time when hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) was added and the sample obtained in Example 2-3-4 was subjected to size exclusion chromatography. It is an example of the chart showing the result (Example 4) which observed the decay
  • FIG. 11-4 shows the change in retention time when hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) was added and the sample obtained in Example 2-3-3 was subjected to size exclusion chromatography. It is an example of the chart showing the result (Example 4) which observed the decay
  • FIG. 12 is an example of a chart showing the results of size exclusion chromatography performed in Examples 5 and 6.
  • FIG. 13 is a graph in which the residual ratio of the HA derivative in the solution calculated in Example 7-1 is plotted against the hydrophobic group introduction ratio of the HA derivative.
  • FIG. 14 is a graph in which the residual ratio of the HA derivative in the solution calculated in Example 7-2 is plotted against the NaCl concentration.
  • FIG. 15 is a chart of size exclusion chromatography measured in Example 8.
  • FIG. 16 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the hydrochloride salt of cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctylcarbamate (Chol-EO2) prepared in Example 9-1.
  • FIG. 17 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-EO2-Chol) into which cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctylcarbamate prepared in Example 9-2 was introduced.
  • FIG. 18 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-SS-Chol) into which 2-aminoethyl cholesteryl disulfide prepared in Example 10 was introduced.
  • FIG. 19 is an example of the 1 H-NMR spectrum of the HA derivative (HA-C 2 -Chol / AEMA) into which cholesteryl 2-aminoethyl carbamate and aminoethyl methacrylate prepared in Example 11 were introduced.
  • FIG. 20 shows the 1 H-NMR of the HA derivative (HA-C 6 -Chol / C 2 -OH / FL) into which 5-aminomethylfluorescein, cholesteryl 6-aminoheptylcarbamate and ethanolamine prepared in Example 13 were introduced. It is an example of a spectrum.
  • FIG. 21 is an example of a chart showing the results of measuring the particle size of the HA derivative (50k HA-C 6 -Chol-22% / FL) by a dynamic light scattering method (DLS).
  • DLS dynamic light scattering method
  • FIG. 22-1 is a graph showing the result of preparing a complex of a cholesteryl group-introduced HA derivative and lysozyme in Example 18-1, and the vertical axis represents (Lys weight in complex / HA derivative weight) ⁇ A value of 100 (% conjugation), the horizontal axis indicates the hydrophobic group introduction rate (%) per unit.
  • FIG. 22-2 is a graph showing the result of preparing a complex of exendin-4 with an HA derivative into which a cholesteryl group was introduced in Example 18-2, and the vertical axis represents (Ex-4 weight /% of complex). The value of HA derivative weight) ⁇ 100 (complexing%), and the horizontal axis represents the rate of introduction of hydrophobic groups per unit (%).
  • FIG. 22-3 is a graph showing the results of preparation of a complex of a HA derivative into which cholesteryl group was introduced and human growth hormone in Example 18-3, and the vertical axis represents (hGH weight in complex / HA derivative weight). ) ⁇ 100 value (complexation%), the horizontal axis indicates the hydrophobic group introduction rate (%) per unit.
  • FIG. 22-4 is a graph showing the results of preparation of a complex of a cholesteryl group-introduced HA derivative and erythropoietin in Example 18-4, and the vertical axis represents (EPO weight in complex / HA derivative weight) ⁇ A value of 100 (% conjugation), the horizontal axis indicates the hydrophobic group introduction rate (%) per unit.
  • FIG. 22-3 is a graph showing the results of preparation of a complex of a cholesteryl group-introduced HA derivative and erythropoietin in Example 18-4, and the vertical axis represents (EPO weight in complex
  • FIG. 23-1 is an example of a graph showing the release of erythropoietin from an HA derivative into which a cholesteryl group has been introduced in a bovine serum albumin (20 mg / mL) solution.
  • the vertical axis represents the amount of released erythropoietin
  • the horizontal axis represents Indicates elapsed time.
  • FIG. 23-2 is an example of a graph showing the release of erythropoietin from an HA derivative (HA-C 12 -Chol-7%) into which cholesteryl groups have been introduced in bovine serum albumin solutions having different concentrations, and the vertical axis represents the release.
  • the amount of erythropoietin applied and the horizontal axis represents the elapsed time.
  • FIG. 24 is an example of a graph showing the results of changes in plasma concentration of human growth hormone during subcutaneous and tail vein administration in rats.
  • FIG. 25 is a photograph of a preparation sample of the hGH / HA derivative complex used in Example 20-4.
  • FIG. 26-1 shows changes in plasma concentration of hGH up to 96 hours during administration of the hGH / HA derivative complex of Sample 20-1 to Sample 20-4 in Table 23-1, and plasma of the hGH solution of Comparative Example 1 It is a graph which shows medium density transition collectively.
  • FIG. 25 is a photograph of a preparation sample of the hGH / HA derivative complex used in Example 20-4.
  • FIG. 26-1 shows changes in plasma concentration of hGH up to 96 hours during administration of the hGH / HA derivative complex of Sample 20-1 to Sample 20-4 in Table 23-1, and plasma of the hGH solution of Comparative Example 1 It is a graph which shows medium density transition collectively.
  • FIG. 26-2 shows changes in the plasma concentration of hGH up to 24 hours at the time of administration of the hGH / HA derivative complex of Sample 20-1 to Sample 20-4 in Table 23-1, and the plasma of the hGH solution of Comparative Example 1 It is a graph which shows medium density transition collectively.
  • FIG. 27-1 shows changes in plasma concentration of hGH up to 96 hours during administration of the hGH / HA derivative conjugates of Sample 20-4 to Sample 20-6 in Table 23-1, and plasma of the hGH solution of Comparative Example 1 It is a graph which shows medium density transition collectively.
  • FIG. 27-2 shows changes in plasma concentration of hGH up to 24 hours at the time of administration of the hGH / HA derivative complex of Sample 20-4 to Sample 20-6 in Table 23-1, and the plasma of the hGH solution of Comparative Example 1 It is a graph which shows medium density transition collectively.
  • FIG. 28 is a graph showing the average residence time (MRT) of the hGH / HA derivative complexes of Sample 20-1 to Sample 20-6 in Table 23-1 and the hGH solution of Comparative Example 1.
  • FIG. 29 is a graph showing changes in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered with the fluorescently labeled HA derivative prepared in Comparative Examples 2-1 to 2-3.
  • 30-1 is a graph showing changes in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered with the fluorescently labeled HA derivative prepared in Example 12 and Example 15.
  • 30-2 is a graph showing the relationship between the molecular weight and the area extrapolated value (AUC ⁇ ) under the plasma concentration-time curve in Table 28.
  • the vertical axis represents AUC ⁇ , and the horizontal axis represents the molecular weight of the raw material HA-Na.
  • FIG. 31 is a graph showing changes in plasma concentration of fluorescently labeled HA derivatives in rats administered with fluorescently labeled HA derivatives of Samples 21-2, 21-8 and 21-9 in Table 29.
  • FIG. 32-1 is a graph showing changes in plasma concentrations of fluorescently labeled HA derivatives in rats administered with fluorescently labeled HA derivatives of Samples 21-2 and 21-10 in Table 31.
  • FIG. 32-2 is a graph showing changes in plasma concentrations of fluorescently labeled HA derivatives in rats administered with fluorescently labeled HA derivatives of Samples 21-5, 21-11 and 21-12 in Table 31.
  • FIG. 33 is a graph showing the change in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered with the fluorescently labeled HA derivative of Sample 21-13 in Table 33.
  • FIG. 34-1 shows changes in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered subcutaneously and intravenously with the fluorescently labeled HA derivative of Table 35 (10k HA-C 6 -Chol-22% / FL). It is a graph.
  • FIG. 34-2 shows the fluorescence-labeled HA derivative in rats administered subcutaneously and intravenously with the fluorescence-labeled HA derivative of Table 35 (10k HA-C 6 -Chol-19% / C 2 -OH / FL-95%). It is a graph which shows transition of the plasma concentration.
  • FIG. 34-1 shows changes in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered subcutaneously and intravenously with the fluorescently labeled HA derivative of Table 35 (10k HA-C 6 -Chol-22% / FL). It is a graph.
  • FIG. 34-2 shows the fluorescence-labeled HA derivative in rats administered subcutaneously and intravenously with the fluorescence-labeled HA derivative
  • 35-1 shows the change in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered intravenously with the fluorescently labeled HA derivative (10k HA-C 6 -Chol-22% / FL) in Table 37.
  • Sodium hyaluronate It is a graph which shows the experimental result which confirmed the influence of prior administration.
  • FIG. 35-2 shows the change in the plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative in rats administered subcutaneously and intravenously with the fluorescently labeled HA derivative of Table 34 (50k HA-C 6 -Chol-27% / FL). It is a graph which shows the experimental result which confirmed the influence of prior administration of sodium hyaluronate.
  • FIG. 36-1 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of sample 21-2 (sample from 5 minutes to 2 hours) after measurement in Example 21-1.
  • FIG. 36-2 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of sample 21-2 (sample from 1st to 4th) after measurement in Example 21-1.
  • FIG. 37-1 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of a urine sample collected from the rat (Comparative Sample 2-2) used in the pharmacokinetic test of Comparative Example 2-4.
  • FIG. 37-2 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of a urine sample collected from the rat (sample 21-2) used in the pharmacokinetic test of Example 21-1.
  • FIG. 37-3 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of a urine sample collected from the rat (sample 21-5) used in the pharmacokinetic test of Example 21-1.
  • FIG. 37-4 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of a urine sample collected from the rat (sample 21-6) used in the pharmacokinetic test of Example 21-1.
  • FIG. 37-5 is a chromatogram showing the results of SEC analysis of a urine sample collected from the rat (sample 21-7) used in the pharmacokinetic test of Example 21-1.
  • FIG. 38 is a graph in which the residual ratio of the HA derivative in the solution calculated in Example 22 is plotted against the hydrophobic group introduction ratio of the HA derivative.
  • FIG. 39 shows the results of observing the amount of free doxorubicin by mixing the HA derivative prepared in Example 2-3 and Example 14 and doxorubicin, and subjecting the ultrafiltered filtrate to reverse phase romatography (Example 23). ).
  • FIG. 40 is a photograph in which the Hilate-labeled HA derivative prepared in Example 16 and the 50k HA-Hilyte prepared in Example 24 were administered to xenograft mice, and the accumulation in the tumor was evaluated using an in vivo imaging apparatus.
  • FIG. 41 is a graph plotting the fluorescence intensity of tumors in xenograft mice administered with a Hyte-labeled HA derivative and 50k HA-Hilyte.
  • FIG. 42 is a photograph of a state in which the HA-Chol / AEMA prepared in Example 11 was cross-linked with DTT and gelled.
  • steryl group referred to in the present specification is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • Specific examples of steroids include cholesterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmasterol, coprostanol, stigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simarelenol, bile acids, testosterone, estradiol, pro Guestron, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, deoxycortisosterone and the like can be mentioned.
  • Examples of the steryl group include a cholesteryl group, a stigmasteryl group, a lanosteryl group, and an ergosteryl group, and a cholesteryl group (particularly, a cholester-5-en-3 ⁇ -yl group) is preferable.
  • C 1-20 alkyl means a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl. , n- butyl, s- butyl, i- butyl, it includes "C 1-4 alkyl” such as t- butyl, furthermore, n- pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethyl Examples include propyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • C 1-20 alkyl includes C 1-12 alkyl having 1 to 12 carbons and C 1-6 alkyl having 1 to 6 carbons.
  • C 1-6 alkylcarbonyl refers to an alkylcarbonyl group in which the alkyl moiety is a C 1-6 alkyl as already mentioned, eg, acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, i “C 1-4 alkylcarbonyl” such as -propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, s-butylcarbonyl, i-butylcarbonyl, t-butylcarbonyl and the like are included.
  • amino C 2-20 alkyl referred to herein means a linear or branched alkyl having 2 to 20 carbon atoms having an amino group as a substituent.
  • an amino group is an alkyl group. It may be located on the terminal carbon atom.
  • hydroxy C 2-20 alkyl referred to herein means a linear or branched alkyl group having 2 to 20 carbon atoms and having a hydroxy group as a substituent.
  • a hydroxy group is an alkyl group. It may be located on the terminal carbon atom of the group.
  • C 2-30 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, and includes, for example, ethylene, propylene and the like. , C 2-20 alkylene, C 2-8 alkylene, the group — (CH 2 ) n —, where n is 2-30, preferably 2-20 , more preferably 2-15 .
  • C 1-30 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, such as methylene, ethylene, propylene, etc. including.
  • C 2-8 alkenylene referred to in the present specification means a divalent saturated hydrocarbon group containing one or more double bonds of straight or branched chain having 2 to 8 carbon atoms.
  • geometric isomerism is present, the respective isomers and mixtures thereof are also included.
  • the “divalent C 2-50 hydrocarbon group” referred to in the present specification is not particularly limited, and examples thereof include linear, branched, cyclic and partially cyclic alkylene having 2 to 50 carbon atoms. Groups, alkenylene groups and alkynylene groups, which may be divalent aromatic rings or may include aromatic rings as part of the structure.
  • the “divalent C 2-50 polyalkyleneoxy” referred to in the present specification is not particularly limited, and the alkylene group of the repeating unit may be linear or branched.
  • Examples of “divalent C 2-50 polyalkyleneoxy” include divalent C 2-50 polyethyleneoxy group, C 3-48 polypropyleneoxy group, C 3-48 polybutyleneoxy group and the like. The group may be linked to another group through an oxygen atom or a carbon atom.
  • salt substance referred to in the present specification is not particularly limited as long as it is an inorganic substance soluble in water.
  • calcium salts such as calcium chloride and calcium phosphate
  • magnesium salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride
  • sulfuric acid Aluminum salts such as aluminum, aluminum chloride, potassium salts such as potassium sulfate, potassium carbonate, potassium nitrate, potassium chloride, potassium bromide, potassium iodide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium sulfate, sodium nitrate, sodium chloride, bromide
  • Sodium salts such as sodium, sodium iodide, sodium silicate, trisodium phosphate, disodium phosphate, sodium borate, sodium acetate, sodium citrate, lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium carbonate, etc.
  • Lithium salt It is preferably, sodium chloride, trisodium phosphate, disodium phosphate, potassium chloride, calcium chloride, and magnesium
  • hyaluronic acid As a raw material for producing the hyaluronic acid derivative of the present invention, hyaluronic acid, a salt thereof or a derivative thereof can be used.
  • the hyaluronic acid salt include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, and a particularly preferable salt is a sodium salt frequently used as a pharmaceutical product.
  • HA or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced using various known methods such as a method for extracting a biological product such as a chicken crown or a pig subcutaneous, or a biological fermentation method, or a commercially available product. It is also possible to purchase (for example, from Electrochemical Industry Co., Ltd., Shiseido Co., Ltd., Seikagaku Corporation, R & D system, etc.).
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited, but hyaluronic acid having a high viscosity and molecular weight is preferable when expecting a sustained release function derived from diffusion delay in local administration, and when the final dosage form is a solution formulation, Hyaluronic acid with low viscosity and molecular weight is preferred for smooth administration. Therefore, the molecular weight of the hyaluronic acid derivative is preferably 1 kDa to 1,000 kDa, more preferably 10 kDa to 300 kDa. In general, the molecular weight of the target product can be adjusted by using a raw material having a corresponding molecular weight.
  • the molecular weight of the raw material of the hyaluronic acid derivative of the present invention that is preferable from the viewpoints of precipitation formation and stable dispersion described above is 10 kDa to 500 kDa, more preferably 27 kDa to 230 kDa, further preferably 50 kDa to 230 kDa, and further Preferably, it is 50 kDa to 99 kDa.
  • the molecular weight of the raw material of the hyaluronic acid derivative of the present invention, which is preferable from the viewpoint of improving the blood retention, is 5 kDa to 27 kDa, more preferably 5 kDa to 18 kDa.
  • the molecular weight of the raw material of the hyaluronic acid derivative of the present invention that is preferable from the viewpoint of gelation is 5 kDa to 300 kDa, more preferably 5 kDa to 50 kDa, and further preferably 5 kDa to 27 kDa.
  • the molecular weight is calculated as a number average molecular weight or a weight average molecular weight.
  • the weight average molecular weight is calculated.
  • the method for measuring the weight average molecular weight for example, the light scattering method, the osmotic pressure method, the viscosity method, etc. described in Seiichi Nakahama et al., “Essential Polymer Science” (published by Kodansha, ISBN4-06-153310-X), etc.
  • the viscosity average molecular weight shown in the present specification can also be measured by a method usually used in the technical field to which the present invention belongs, such as using an Ubbelohde viscometer.
  • a method usually used in the technical field to which the present invention belongs such as using an Ubbelohde viscometer.
  • the specified numerical value can be used as the molecular weight.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention has a hydrophobic group introduced by converting the carboxy group of glucuronic acid, which is one of the disaccharides constituting the repeating unit, to an amide.
  • the carboxy group modification rate of the glucuronic acid portion of the hyaluronic acid derivative is low, for example, when 50% or less of the existing carboxy groups are modified, CD44 that is expressed in large quantities at inflammatory sites and tumor sites
  • CD44 that is expressed in large quantities at inflammatory sites and tumor sites
  • Targeting effects on the hyaluronic acid receptor and the liver and lymph systems, which are the main metabolic systems of hyaluronic acid, can be expected. For example, it can be expected to target inflamed synovial cells of patients with osteoarthritis and rheumatism, take up into cells by receptor-dependent endocytosis, and cure inflammation by releasing drugs inside the cells.
  • the carboxy group modification rate of the glucuronic acid moiety of the hyaluronic acid derivative is high, the binding to the hyaluronic acid receptor is suppressed, and the hyaluronic acid derivative becomes a drug carrier with a long staying property having a stealth effect in the body.
  • a targeting effect on tumor cells using the EPR effect can also be expected.
  • EPR effect Enhanced Permeation and Retention effect
  • target element examples include a target tissue-specific peptide, antibody, fragmented antibody, aptamer, RGD peptide for cancer cells, folic acid, anisamide, transferrin, galactose for liver, tocopherol, and the like.
  • the carboxy group modification rate of the glucuronic acid portion of the hyaluronic acid derivative may be low or high.
  • the rate of modification of the carboxy group of the glucuronic acid moiety of the hyaluronic acid derivative by the hydrophobic group is preferably 2 to 60% from the viewpoint of complex formation with a drug, preferably a protein, and 2 It is preferably ⁇ 50%, further 2 to 40%, further 5 to 20%, and more preferably 7 to 15%. From the viewpoint of precipitation formation as described above, 7 to 15% is preferable, and from the viewpoint of stable dispersion, 18 to 42% is preferable. From the viewpoint of improving blood retention, it is preferably 2 to 50%, more preferably 8 to 35%, and further preferably 15 to 22%. From the viewpoint of gelation, it is preferably 2 to 30%, more preferably 2 to 22%, further preferably 5 to 22%, and further preferably 7 to 22%.
  • the combination of the molecular weight of the raw material of the hyaluronic acid derivative of the present invention and the introduction rate of the hydrophobic group is preferably 27 kDa to 230 kDa and 7 to 15%, and 50 kDa to 230 kDa and 7 to 15% from the viewpoint of the above-described precipitation formation. More preferably, 50 kDa to 99 kDa and 7 to 15% are more preferable. From the viewpoint of stable dispersion, 27 kDa to 230 kDa and 18 to 42% are preferable, 50 kDa to 230 kDa and 18 to 42% are more preferable, and 50 kDa to 99 kDa and 18 to 42% are more preferable.
  • 5 kDa to 27 kDa and 2 to 50% are preferable, 5 kDa to 27 kDa and 8 to 35% are more preferable, 5 kDa to 18 kDa and 8 to 35% are further preferable, 5 kDa to 18 kDa and 8 to 8 to 35% is more preferable, and 5 kDa to 18 kDa and 15 to 22% are more preferable.
  • 5 kDa to 300 kDa and 2 to 30% are preferable, 5 kDa to 50 kDa and 2 to 22% are more preferable, 5 kDa to 27 kDa and 2 to 22% are further preferable, 5 kDa to 27 kDa and 7 to 22% are preferable. Further preferred.
  • a method for converting the carboxy group of glucuronic acid into an amide and introducing a hydrophobic group is, for example, a raw material hyaluronic acid or a derivative thereof, preferably represented by the formula (II)
  • Hyaluronic acid or a derivative thereof composed only of the represented repeating units is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (for example, tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronic acid is present in a solvent in the presence of a suitable condensing agent.
  • TSA tetrabutylammonium
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited.
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • benzotriazole-1-oxy -Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) benzotriazol-1-yl-oxy-tris (di Chiruamino) and the like phosphonium he
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent.
  • DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond between an amino group and a carboxy group while suppressing the formation of an ester bond in a system in which many hydroxy groups coexist.
  • the alcohol as a solvent reacts with the carboxy group of the hyaluronic acid moiety, or the carboxy group and hydroxy simultaneously present in the hyaluronic acid moiety are bonded within the molecule or between the molecules, It is possible to prevent the formation of unwanted crosslinks.
  • Examples of the solvent used in the hydrophobic group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixed solvents thereof. it can.
  • the introduction rate of the hydrophobic group is 18 to 42%
  • only DMSO is used as the reaction solvent from the viewpoint of suppressing precipitation of fine particles formed after the introduction of the hydrophobic group and dispersibility in the solvent. Is preferred.
  • the raw material hyaluronic acid or a derivative thereof is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (for example, tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronic acid salt is reacted with the spacer portion in a solvent in the presence of an appropriate condensing agent.
  • a tetraalkylammonium salt for example, tetrabutylammonium (TBA) salt
  • TSA tetrabutylammonium
  • the carboxy group (—COOH) of the raw material hyaluronic acid or its derivative may be converted and then reacted with an appropriate reagent.
  • TSA tetrabutylammonium
  • reaction mode examples include dehydrohalogenation reaction, condensation reaction, dehydration reaction, nucleophilic addition reaction such as Michael addition, oxidative disulfide formation reaction, etc., and these are well-known reactions and are appropriately selected by those skilled in the art. And it can carry out by finding preferable reaction conditions.
  • the converter or the reaction product may be reacted as an N-hydroxysuccinimide (hereinafter also referred to as “NHS”) ester.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group modified with a leaving group is introduced at the end by reacting the carboxy group of the raw material hyaluronic acid or its derivative with 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide is prepared.
  • a method of forming a disulfide bond by reacting thiocholesterol with a nucleophilic substitution reaction can also be mentioned.
  • a method in which a part of the spacer is introduced into the carboxy group of hyaluronic acid or its derivative and a part of the steryl group into which a part of the spacer is introduced are prepared and reacted.
  • Some of the specific examples have been described above.
  • a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group at the terminal is introduced into the carboxy group of hyaluronic acid;
  • a method may also be mentioned in which a steryl group having a mercapto group-terminated spacer introduced therein is prepared, and these are oxidatively reacted to form a disulfide bond. At this time, one mercapto group can be reacted with 2-mercaptopyridine to form a disulfide, and then substituted with the other mercapto group.
  • a substituent may be further introduced.
  • X z is a group —NH— (CH 2 ) p1 —O—CO—C (R 17 ) ⁇ CH 2 ; —NH— (CH 2 ) p1 —O—CO—CH (R 17 ) —CH 2 —S—CH 2 —CH (OH) —CH (OH) —CH 2 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—CO—C (R 17 ) ⁇ CH 2 ; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—C ( ⁇ NH)
  • the conditions may be appropriately selected.
  • the crosslinking conditions include crosslinking method, polymer concentration, crosslinking agent concentration, solvent, solvent pH, salt concentration, temperature, time and the like.
  • the cross-linking of the gel formed by increasing the polymer concentration during chemical cross-linking and the introduction rate of groups capable of cross-linking, for example, in the cross-linking reaction conditions It is possible to increase the density.
  • the concentration of the cross-linking agent in the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention is such that when the group having groups capable of forming a cross-link at both ends is used, the group can participate in the cross-linking reaction quickly without excess or deficiency. It is preferable to add.
  • MA group: SH group 3: 1 to 1: 3 is preferable, and 2: 1 to 1: 2 is particularly preferable.
  • the solvent in the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably one that can sufficiently dissolve the polymer and the cross-linking agent, and is not particularly limited, but water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMAc), It is preferable to use dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) and a mixed solvent selected from these. It is also possible to use a mixture of organic solvents that are miscible with these solvents. Although it does not specifically limit, As an organic solvent to mix, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, acetonitrile etc. are mentioned, for example.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention forms nanoparticles in an aqueous solution, it can form nano-sized particle gels by crosslinking under dilute conditions, and is used as a blood release carrier and targeting carrier. be able to.
  • the dilute condition is 10 mg / mL or less, preferably 5 mg / mL or less, more preferably 1 mg / mL or less.
  • a high concentration condition is 5 mg / mL or more, preferably 20 mg / mL or more, and more preferably 40 mg / mL.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention may be performed in bulk or in a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • an aqueous phase in which a polymer or a crosslinking agent is dissolved is emulsified in a solvent immiscible with water, and a gelation reaction may be carried out.
  • the solvent immiscible with water is not particularly limited, and examples thereof include hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, medium chain fatty acid triglyceride (MCT), liquid paraffin, and soybean oil.
  • a surfactant for stabilizing the emulsification may be added. Further, for example, it may be performed in a solvent capable of desolvation such as in supercritical carbon dioxide or PEG. In this case, the concentration of the polymer accompanying desolvation (solvent diffusion) is achieved by emulsifying and dispersing the aqueous phase or organic solvent phase in which the polymer or crosslinking agent is dissolved in the solvent of the previous example. It becomes possible to obtain a gel with a higher crosslinking density.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention and then the operation of stopping the crosslinking reaction and the operation of deactivating or washing the remaining crosslinkable functional groups may be performed.
  • Crosslinkable functional groups that were not involved in the reaction groups in which only one end of the crosslinker was bonded, residual crosslinkers, etc. were used for safety, storage stability, side reactions with encapsulated drugs, etc. It is preferable to remove from the viewpoint. Although not particularly limited, for example, when unreacted crosslinking agent remains, it may be removed by washing with excess water or the like.
  • a pulverization step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • Examples of the pulverization method include pulverization using a pestle and mortar and pulverization using a mill, but pulverization using a mill is preferred.
  • rotating disc type crusher such as centrifugal crusher (Nippon Seiki Seisakusho) and impact mill (Dalton Co., Ltd.), atomizer (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.), sample mill (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.) ), Bantam mill (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.), screen mill crusher such as SK mill (Tokken), jet crusher such as ultra-small lab jet mill (AO jet mill, Seishin company), and ultra-low temperature Linlex mill (Liquid Gas Co., Ltd.) and the like that can be pulverized with SK are preferable, but SK mill and Linlex mill are preferable.
  • SK mill and Linlex mill are preferable.
  • a drying step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • the drying method include ventilation drying, drying in a thermostatic bath, vacuum drying, hot air circulation drying and the like.
  • the wind speed, drying time, temperature, pressure and the like are appropriately selected within a range where the gel of the present invention does not decompose or deteriorate.
  • a pharmaceutical composition can be obtained by encapsulating a drug in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • Examples of the drug encapsulation method include a method of adding a drug solution to a pre-crosslinked hyaluronic acid derivative gel. In this method, first, the drug is absorbed by diffusion into the swollen gel, and the absorbed drug is held in the physical cross-linking domain by the hydrophobic interaction of the hyaluronic acid derivative gel, thereby encapsulating the drug.
  • conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, addition of a denaturant, and the like may be appropriately selected so that the drug is stably encapsulated in a high yield.
  • the swelling degree and density of the hyaluronic acid derivative gel change depending on the salt concentration and pH at the time of drug encapsulation, and the ionization state of the drug also changes. Therefore, appropriate conditions may be used depending on the combination.
  • Encapsulating drugs under low salt concentration makes use of electrostatic repulsion between carboxy groups of hyaluronic acid derivatives, reduces gel density, increases drug encapsulation, and encapsulates higher molecular weight drugs can do. After encapsulating the drug, by increasing the salt concentration, the electrostatic repulsion is weakened, the gel density is increased, and the gel network is made smaller than the drug size, so that the drug can be firmly held and the release can be delayed.
  • the salt concentration may be a physiological salt concentration.
  • a method for encapsulating a drug there is a method in which a drug is combined with the hyaluronic acid derivative of the present invention and then gelled by crosslinking.
  • conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, addition of denaturing agent, concentration of hydrophilic polysaccharide derivative, drug concentration, HP to drug ratio, etc. during the conjugation are stable. And may be appropriately selected so as to be combined with the nanogel in a high yield.
  • the free drug that has not been complexed may be separated and removed by dialysis or size exclusion chromatography (SEC).
  • SEC size exclusion chromatography
  • cross-linking it is preferable to use cross-linking conditions in which the encapsulated drug is not denatured.
  • the drug encapsulated in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention is released by simple diffusion in the gel of the drug, decomposition of the gel of the hyaluronic acid derivative, and substitution of the biological component with the drug.
  • the rate can be controlled by the cross-linking density of the gel, the amount of cross-linking domains, and the strength of the hydrophobicity.
  • gel decomposition include decomposition of a chemical cross-linking domain and decomposition of a skeleton of a hyaluronic acid derivative. These decompositions cause a decrease in crosslink density (increase in swelling rate).
  • a gel when a gel is administered into a living body such as subcutaneous or blood, plasma proteins such as albumin and lipids exist, and these are infiltrated and encapsulated in the gel. It means the case where the drug is released by substitution.
  • the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention can suppress substitution with a drug accompanying infiltration of a biological component by the chemical crosslinking as well as physical crosslinking by hydrophobic groups.
  • the rate of infiltration of biological components can be controlled by the crosslink density of the gel, the charge in the gel, and the like.
  • the encapsulation is performed so that the drug is easily absorbed into the gel at the time of encapsulation and infiltration of biological components is suppressed in vivo.
  • Conditions can be selected as appropriate.
  • the electrostatic repulsion between the hyaluronic acid derivative and the drug can be suppressed by performing the encapsulation step near the isoelectric point.
  • the negative charge of the gel can be weakened by performing the encapsulation step at a pKa (about 4.0) or less of the carboxylic acid derived from glucuronic acid contained in hyaluronic acid, the negative charge is charged under that condition.
  • the electrostatic repulsion with the protein is suppressed, and the encapsulation efficiency can be improved.
  • the gel swelling rate becomes higher than in the living body, so that the encapsulation becomes easy.
  • the gelation by chemical crosslinking of the hyaluronic acid derivative into which the hydrophobic group and the crosslinkable functional group of the present invention are simultaneously introduced can be performed in the presence of a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group.
  • a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group in which a hydrophobic group and a functional group having an unsaturated bond are introduced, and a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group are mixed and crosslinked to form a hydrophobic group.
  • a hyaluronic acid derivative gel can be prepared in which the hydrophilic polysaccharide derivative is physically encapsulated. The same process can be performed using HA-AM, HA-ALD, and HA-SH.
  • the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group is a hydrophilic polysaccharide obtained by introducing at least one or more hydrophobic groups per molecule of polysaccharide into the hydrophilic polysaccharide and its derivative.
  • the hydrophilic polysaccharide is not particularly limited, but is preferably pullulan, amylopectin, amylose, dextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, hyaluronic acid, dextrin, which are commercially available or according to methods described in the literature. Those having various average molecular weights can also be obtained.
  • hydrophilic polysaccharides are pullulan, hyaluronic acid and dextrin.
  • cluster dextrin (registered trademark) is preferable.
  • Cluster dextrin (registered trademark) can be purchased and used from Ezaki Glico Co., Ltd.
  • the hydrophobic group is not particularly limited, but is preferably a C 8-50 hydrocarbon group, a steryl group, a polylactic acid (PLA) group, a polylactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) group, or a group thereof. And particularly preferably a group containing a cholesteryl group, a C 8-30 linear or branched alkyl, or a group containing the group.
  • the hydrophobic group may be introduced via a spacer.
  • Hydrophilic polysaccharide derivatives having a hydrophobic group can be produced by various known methods.
  • a hydrophilic polysaccharide derivative in which N- [6- (cholesteryloxycarbonylamino) hexyl] carbamoyl group is introduced as a hydrophobic group into a hydroxy group of pullulan as a hydrophilic polysaccharide (hereinafter referred to as “cholesterol pullulan”, “ It is also possible to purchase a commercially available product (for example, Nippon Oil & Fat Co., Ltd.).
  • Hydrophilic polysaccharide derivatives having hydrophobic groups form fine particles (nanogels) having a nano-sized (1 to 1,000 nm) gel structure by spontaneously associating several molecules in aqueous solution by hydrophobic interaction. By doing so, it can be complexed with a hydrophobic drug or a protein or peptide having medicinal properties.
  • the molecular weight of the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 kDa to 1,000 kDa, more preferably 10 kDa to 300 kDa.
  • the hydrophilic polysaccharide derivative may be a pharmaceutically acceptable salt.
  • the hydroxy group contained in the hyaluronic acid derivative of the present invention and the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group can also be used as a group capable of forming a crosslink. That is, the hydroxy group of the hyaluronic acid derivative of the present invention and the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group is converted to a glycidyl ether at both ends of a specific cross-linking agent such as divinyl sulfone (DVS), carbodiimide, or C 2-20 alkylene. It can be crosslinked by a crosslinking agent having a group.
  • a specific cross-linking agent such as divinyl sulfone (DVS), carbodiimide, or C 2-20 alkylene. It can be crosslinked by a crosslinking agent having a group.
  • substituents introduced into the carboxy group of hyaluronic acid When there are a plurality of types of substituents introduced into the carboxy group of hyaluronic acid, these substituents may be introduced simultaneously or sequentially.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention has a characteristic of forming nanoscale fine particles by spontaneously associating in an aqueous solution by the hydrophobic interaction of the hydrophobic group.
  • the nanoparticle formed by the hyaluronic acid derivative of the present invention is one of the most effective means, and proteins and peptides that are active components in the hydrophobic domain formed inside , And can be used as a capsule to be delivered to a target site while retaining a low molecular weight compound.
  • the drug can be delivered to the target site by conjugating the drug.
  • Nano-scale microparticles can be administered systemically, particularly intravenously, and release the encapsulated (complexed) drug slowly in the blood, and selectively deliver the drug to target organs and cells. It can be used as a carrier for targeting to be delivered.
  • a targeting carrier when used as a targeting carrier, when the carboxy group of the glucuronic acid moiety of the HA derivative is not highly modified (for example, the modification rate is 54% or less), as described above, the hyaluronic acid receptor, CD44, RHAMM, LYVE-1, HARE It is possible to deliver drugs targeting In particular, targeting to CD44 and RHAMM enables targeting to a tumor.
  • the hyaluronic acid derivative can be further chemically crosslinked.
  • HA derivative when used as a carrier for sustained drug release or targeting in blood, it is instantaneously taken up and metabolized by the HARE receptor present in the sinusoidal endothelium such as the liver. There is a problem that it disappears rapidly from the blood.
  • the blood retention of the HA derivative of the present invention is dependent on the molecular weight, and the HA derivative using low molecular weight HA (5 kDa to 27 kDa) as a raw material has good blood retention performance, It can be used as a carrier for release and targeting.
  • polyethylene glycol which is a linear polymer similar to hyaluronic acid, has been reported to undergo renal excretion at a molecular weight of 40 kDa or less (Europian Journal of Cancer. Vol. 31, 766-770, (1995)), molecules below a certain size are known to undergo renal excretion. Therefore, hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives having the same molecular weight or less are also excreted by the kidneys and may disappear from the blood instantly.
  • the HA derivative into which the hydrophobic group of the present invention is introduced has a good retention in blood even when the PEG has a molecular weight or less that undergoes renal excretion regardless of the modification rate of the carboxy group. It can be used as a carrier for sustained release and targeting.
  • the fine particles of the hyaluronic acid derivative are formed by self-association in an aqueous solution, they can be formed by dissolving a solid hyaluronic acid derivative in water or an aqueous salt solution.
  • the fine particles can be formed by dissolving in another solvent (for example, DMSO) and then substituting it with water or a salt solution.
  • ultrasonic treatment may be performed.
  • the hyaluronic acid derivative has a carboxy group that is a dissociating group, the higher the ionic strength in the system, the lower the solubility. Therefore, by controlling the introduction rate, it is possible to prepare hyaluronic acid derivatives that dissolve under low salt concentrations or salt-free conditions and aggregate and precipitate at physiological saline concentrations. It can be the base material of the preparation.
  • a hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced so as to form stable fine particles even under physiological salt concentration can be a systemic administration type drug carrier.
  • the HA derivative of the present invention is shown to have a range of introduction of a hydrophobic group into a carboxy group that aggregates and precipitates under physiological salt concentration, and also encapsulates (complexes) a protein (erythropoietin) Was shown to be precipitated. Further, it was confirmed that when a pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative of the present invention encapsulated (complexed) and precipitated with human growth hormone was administered subcutaneously to rats, a sustained release effect was exhibited. In addition, it was confirmed that even when administered in a solution (dispersed) state, it was precipitated subcutaneously (under physiological salt concentration) and exhibited a sustained release effect.
  • the particle size of the formed fine particles is not particularly limited, but is preferably 200 ⁇ m or less, and more preferably 100 ⁇ m or less so that the needle can pass through without clogging during administration by injection.
  • the particle diameter is preferably 500 nm or less, and more preferably 200 nm or less in order not to block the peripheral blood vessel.
  • it is preferably 100 nm or less.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention can be used as a drug carrier in a pharmaceutical preparation. Since the hyaluronic acid derivative of the present invention spontaneously forms a complex with a drug in an aqueous solution, no special operation is required, and the hyaluronic acid derivative and the drug are mixed in an aqueous solution and incubated to obtain a carrier. -Drug complexes can be easily formed.
  • the driving force for complex formation is mainly the hydrophobic interaction between the hydrophobic group of the hyaluronic acid derivative and the drug, but when the drug is basic, the electrostatic interaction with the carboxylic acid of the hyaluronic acid derivative May contribute. At biological salt concentration, electrostatic interaction is weak and hydrophobic interaction is strong, so it is considered that a complex is formed mainly by hydrophobic interaction.
  • the linker (spacer) moiety in the hydrophobic group is an ester or carbonate (for example, when X 1 is —COO—R and —O—COO—R), the ester or carbonate decomposes in vivo,
  • the biodegradability is further increased by reducing the hydrophobicity of the hyaluronic acid derivative, which is preferable from the viewpoint of safety.
  • the pH is lowered around the tumor tissue.
  • the linker (spacer) moiety has a disulfide bond (for example, when X 1 is —S—S—R), the linker is decomposed under reducing conditions, and the hydrophobicity of the hyaluronic acid derivative is reduced.
  • the linker (spacer) moiety has a peptide that is cleaved in an enzyme-specific manner (for example, when the hydrophobic group is —Z—NR a —Y—NR b —COO—R), at the site where the enzyme is present Only when the linker is decomposed and a part of the hydrophobic group is eliminated, the aggregate of the hyaluronic acid derivative of the present invention is destroyed.
  • Gly-Phe-Leu-Gly is specifically cleaved in lysosomes.
  • the drug can be specifically released by the tumor.
  • linker moiety is not a linker that undergoes physicochemical cleavage such as an ester bond, carbonate bond, or disulfide bond, there is an advantage that the storage stability in the preparation is good.
  • Conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, and addition of a denaturant when forming a carrier-drug complex can be appropriately changed depending on the drug used.
  • the density of the hyaluronic acid derivative varies depending on the salt concentration and pH at the time of drug encapsulation, and the ionization state of the drug also varies.
  • the modifying agent used include urea, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate and the like.
  • the electrostatic repulsion of the hyaluronic acid derivative and the protein is suppressed by forming the complex near its isoelectric point.
  • the amount of protein contained in the complex can be increased.
  • the negative charge of the hyaluronic acid derivative can be weakened by performing the complex formation step under the condition of pKa (approximately 4.0) or less of the carboxy group of the glucuronic acid moiety. When the electric charge is charged, electrostatic repulsion can be suppressed, and the amount of protein contained in the complex can be increased.
  • the density of the fine particles of the hyaluronic acid derivative formed in the aqueous solution is reduced, so that the amount of protein contained in the complex is increased. Can do. Further, by increasing the salt concentration in this state, the density of the fine particles can be improved and the protein can be firmly encapsulated.
  • the complex formation between the hyaluronic acid derivative and the protein can be influenced by the molecular weight of the protein.
  • the lower the molecular weight of a protein the higher the rate of migration into the fine particles of the hyaluronic acid derivative of the protein.
  • the density of the fine particles depending on the introduction rate of the hydrophobic group can also affect the rate of complex formation with the protein and the amount of protein contained in the complex.
  • Biological components such as plasma proteins and lipids exist in the living body, and when a complex of hyaluronic acid derivative and drug is administered to the living body, such as subcutaneously or in blood, this biological component must replace the drug in the complex. May cause drug release.
  • Albumin is assumed as the main in vivo protein that causes this substitution.
  • the drug and the hyaluronic acid derivative of the present invention are combined.
  • a method for preparing a conjugated conjugate in addition to the method of spontaneously forming a complex with a drug in the aqueous solution described above, the drug and the hyaluronic acid derivative of the present invention are combined.
  • a method for preparing a conjugated conjugate in addition to the method of spontaneously forming a complex with a drug in the aqueous solution described above, the drug and the hyaluronic acid derivative of the present invention are combined.
  • a method for preparing a conjugated conjugate in addition to the method of spontaneously forming a complex with a drug in the aqueous solution described above.
  • a method for preparing a conjugate comprising a hyaluronic acid derivative of the present invention and a drug a method used for preparing a conjugate of a known polymer and drug can be used.
  • the following reaction can be used. Can do.
  • linker spacer containing an ester or carbonate, ⁇ thioester, disulfide, or a peptide that cleaves at a specific site used when introducing the hydrophobic group described above into the HA derivative is used as a linker for conjugation with a drug. It can also be used. These linkers are cleaved at the target site as described above to release the drug.
  • the reagent used for modification of the hyaluronic acid derivative or drug for the preparation of the conjugate is not particularly limited as long as it does not cause an adverse reaction in the preparation of the conjugate.
  • the compound is available as a reagent or may be synthesized with reference to methods known in the literature.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is synthesized, and a drug having an amino group or a drug having an amino group introduced is reacted using a condensing agent such as DMT-MM, and the drug is conjugated by an amide bond.
  • a condensing agent such as DMT-MM
  • the drug is conjugated by an amide bond.
  • the drug may be added together with cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride and the like, and a hydrophobic group may be simultaneously introduced.
  • the compound may be added after or before the drug.
  • the drug may be reacted after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is synthesized, and a drug having a hydroxy group or a drug into which a hydroxy group is introduced is reacted with a condensing agent such as DMT-MM, 1,3-dichlorohexadiimide (DCC),
  • DCC 1,3-dichlorohexadiimide
  • the drug can be conjugated to the hyaluronic acid derivative through an ester bond.
  • the drug may be added together with cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride and the like, and a hydrophobic group may be simultaneously introduced.
  • the compound may be added after or before the drug.
  • the above method can be performed with reference to, for example, a report that paclitaxel is introduced into HA as an ester (Bioconjugate Vol. 19, paragraphs 1319-1325, 2008).
  • the carboxy group of the glucuronic acid moiety is converted to an ester.
  • Drugs can be conjugated. In order to avoid hydrolysis of the ester, it is desirable to conjugate the drug after introducing the hydrophobic group.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is synthesized, and a drug having a carboxy group or a drug into which a carboxy group is introduced is used as an NHS ester, reacted with hydroxy at the 6-position of the N-acetylglucosamine moiety, and the drug is conjugated via an ester bond.
  • the drug may be added after introducing the hydrophobic group into the HA by cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride or the like, or may be added before the introduction.
  • the drug may be reacted after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the above-mentioned method can be performed with reference to, for example, a report in which camptothecin is introduced into HA as an ester (International Publication No. WO2009 / 074678).
  • the carboxy group of the glucuronic acid moiety can be dehydrated and condensed with a diamine such as ethylenediamine to introduce an amino group.
  • a diamine such as ethylenediamine
  • N-succinimidyl iodoacetate (PIERCE) or N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate (PIERCE) can be reacted with an amino group to synthesize a hyaluronic acid derivative introduced with an iodoacetyl group.
  • a drug having a thiol group can be conjugated to this hyaluronic acid derivative.
  • This method is particularly effective because it can be thiol-selectively conjugated even in a polymer drug containing many reactive groups such as amino groups such as proteins, peptides, and nucleic acids.
  • the drug may be introduced before or after the hydrophobic group derivative is introduced into the HA.
  • a hyaluronic acid derivative of the present invention in which X 1 is —NH 2 —COO—R is synthesized, wherein a part of the carboxy group of the glucuronic acid moiety is reacted with 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide hydrochloride. It is possible to introduce a drug having a mercapto group and a drug having a mercapto group introduced into the hyaluronic acid derivative by a disulfide bond exchange reaction, that is, a substitution reaction.
  • the length of the linker between the drug and the hyaluronic acid derivative can also be adjusted.
  • a peptide linker that can be cleaved with an enzyme or the like at a specific site in the living body can also be introduced.
  • methotrexate was introduced into HA through a linker containing a peptide (International Publication No. WO2005 / 095464)
  • doxorubicin was introduced through a linker containing HPMA (N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide) and a peptide And the like (International Publication No. WO2002 / 090209).
  • the pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative of the present invention and one or more drugs, and the conjugate in which the hyaluronic acid derivative of the present invention and one or more drugs are bonded are nano-particulates, micro-particulates, solutions, emulsions, suspensions. , Gels, micelles, implants, powders, or films.
  • the powder may be produced by pulverizing a solid obtained by freeze drying or spray drying, or may be produced from a dried precipitate.
  • compositions and conjugates of the invention are administered via the oral, parenteral, intranasal, intravaginal, intraocular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral or buccal route. It's okay.
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention are preferably 200 ⁇ m or less, and more preferably 100 ⁇ m or less, in order to allow the needle to pass through without clogging, particularly for the purpose of local sustained release. .
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention preferably have a size of 5 ⁇ m or less, particularly when targeting the hyaluronic acid receptor including CD44.
  • the hyaluronic acid derivative used in this case preferably has a hydrophobic group introduction rate of 10% or less so that binding to the hyaluronic acid receptor is not suppressed.
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention have a size of preferably 500 nm or less, more preferably 200 nm or less, particularly for the purpose of prolonging blood retention and accumulation in tumor tissue or inflamed tissue. It is. Moreover, in order to avoid uptake into the reticuloendothelial system and improve the blood retention, it is preferably 100 nm or less.
  • the hyaluronic acid derivative used in this case it is preferable to use a hyaluronic acid derivative in which most of the carboxy groups of the glucuronic acid moiety are converted so that the binding to the hyaluronic acid receptor is suppressed.
  • the size is preferably 200 ⁇ m or less. From the viewpoint of mucoadhesiveness, it is preferable that the hyaluronic acid derivative used has a lower hydrophobic group introduction rate.
  • the drug that forms a complex with the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as it is a drug that can be carried.
  • the drug to be bound to the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as a conjugate can be prepared.
  • the drug include proteins and / or peptides, polysaccharides, nucleic acids, and low molecular weight compounds, and preferably proteins and / or peptides.
  • low molecular weight compounds include, for example, anticancer agents (eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.), immunosuppressants, anti-inflammatory agents (eg, steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents), antirheumatic agents. And antibacterial agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.).
  • anticancer agents eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.
  • immunosuppressants eg, anti-inflammatory agents (eg, steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents)
  • antirheumatic agents e.g., antirheumatic agents.
  • antibacterial agents ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.
  • proteins and peptides include, for example, erythropoietin (EPO), granulosite colony stimulating factor (G-CSF), interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ , (INF- ⁇ , ⁇ , ⁇ ), thrombopoietin (TPO), Serial neutrophic factor (CNTF), Tumor necrosis factor (TNF), Tumor necrosis factor binding protein (TNFbp), interleukin-10 (IL-10), FMS-like tyrosine kinase (Flt-3), growth hormone (GH), insulin, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), platelet-derived growth factor (PDGF), interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Keratinocyte growth factor (KGF), stem cell factor (SCF), megacaryosite growth differentiation factor (MGDF), osteoprotegerin (OPG), leptin, parathyroid hormone (PTH), basic fibroblast growth factor (b-FGF)
  • nucleic acids examples include DNA, RNA, antisense, decoy, ribozyme, small interfering RNA, RNA aptamer and the like.
  • —NR a in formula (I) forms an amide bond with carbonyl (CO), and the hydrophobic group having a steryl group is obtained by converting the carboxy group of hyaluronic acid or a salt thereof into an amide. It has been introduced by converting.
  • a hydrophobic group can also be introduced by converting a carboxy group into an ester.
  • —COOH contained in hyaluronic acid or a salt thereof —COOA; -R, -Y-NR b -R, -Y-NR b -COO-R, -Y-NR b -CO-R, —Y—NR b —CO—NR c —R, -Y-COO-R, -YO-COO-R, -YSR, -Y-CO-Y a -SR, —Y—O—CO—Y b —S—R, —Y—NR b —CO—Y b —S—R, and —Y—S—S—R (R, Y, R b , R c , Y a and Y b are as defined above) Can also be converted.
  • a hydroxy group (—OH) of hyaluronic acid or a salt thereof is —OAa; where Aa is -R, -CO-Y-NR b -COO-R, -OCO-Y-NR b -COO-R, —CO—NR a —Y—NR b —COO—R, -CO-Y-COO-R, -OCO-Y-COO-R, —CO—NR a —Y—COO—R, -CO-Y-OCOO-R, -OCO-Y-OCOO-R, —CO—NR a —Y—OCOO—R, —CH 2 CH (OH) —O—R, —CH (CH 2 OH) —OR, and —CH 2 CHR h —SO 2 —OR (R, Y, R a and R b are as defined above, and R h is a hydrogen atom or C 1-6 alky
  • the HA unit in the following description means a repeating unit (1 unit) of N-acetylglucosamine-glucuronic acid in hyaluronic acid.
  • Example 1 Preparation of HA Derivatives Introduced with Cholesteryl Group (Example 1-1) Preparation of Cholesteryl 6-Aminohexyl Carbamate Hydrochloride Cholesteryl chloroformate (3.37 g, 7.5 mmol) in anhydrous dichloromethane (20 mL) To this solution, triethylamine (TEA, 1.05 mL) was added and stirred under an argon atmosphere. Under ice-cooling, 6- (t-butoxycarbonyl) amino-1-aminohexane (1.12 mL, 5 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred for 30 minutes under ice-cooling and then warmed to room temperature. Was stirred overnight.
  • TEA triethylamine
  • the reaction mixture was washed with ultrapure water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Example 1-3 Preparation of Cholesteryl 8-Aminooctylcarbamate Hydrochloride 8- (t-Butoxycarbonyl) amino-1-aminooctane (1.21 g, 5 mmol) in anhydrous dichloromethane (100 mL) and anhydrous toluene (200 mL) To this solution, TEA (0.7 mL) was added and stirred under an argon atmosphere. Under ice cooling, an anhydrous dichloromethane solution of cholesteryl chloroformate (2.66 g, 6 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred as it was for 30 minutes under ice cooling, then warmed to room temperature and stirred overnight.
  • cholesteryl chloroformate 2.66 g, 6 mmol
  • FIG. 3 shows the 1 H-NMR spectrum (JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd .; EtOH-d 6 ) of the product.
  • Example 1-4 Preparation of Cholesteryl 12-Aminododecyl Carbamate Hydrochloride 12- (t-Butoxycarbonyl) amino-1-aminododecane (1) instead of 6- (t-butoxycarbonyl) amino-1-aminohexane .59 g, 5 mmol) was used in the same manner as in Example 1-1 to obtain cholesteryl 12-aminododecylcarbamate (Chol-C 12 ) hydrochloride (1.0 g).
  • the 1 H-NMR spectrum JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd .; EtOH-d 6 ) of the product is shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of HA derivative having cholesteryl group introduced (Example 2-1) Tetrabutylammonium (TBA) cation exchange resin DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Aldrich) The resin was suspended in water, and the resin was washed about 3 times with ultrapure water by decantation. A 40 wt% tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution (TBA-OH) (manufactured by Aldrich) was added in an amount of about 1.5 times the molar equivalent of the cation exchange capacity of the resin and stirred for 30 minutes.
  • TAA-OH Tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution
  • Example 2-2 Preparation of HA TBA salt Hyaluronic acid sodium salt (HA-Na, manufactured by Shiseido Co., Ltd.) having molecular weights of 27 kDa, 50 kDa and 100 kDa was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg / mL.
  • Example 2-1 The suspension of the cation exchange resin that had been subjected to TBA salification in Example 2-1 was added in an amount equivalent to 5 times the molar amount of the HA unit (unit molecular weight 401.3) in terms of the ion exchange capacity of the resin. After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain a TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • HA-TBA TBA salt of hyaluronic acid
  • a 1 H-NMR spectrum JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd .; EtOH-d 6 ) of a product starting from 50 kDa HA—Na is shown in FIG.
  • the amount ratio of TBA to HA unit was calculated from the value, and the unit average molecular weight of HA-TBA was calculated from this ratio.
  • Example 2-3 Preparation of HA Derivative Introduced with Cholesteryl Group (Example 2-3-1) Preparation of HA Derivative Introduced with Cholesteryl 6-aminohexylcarbamate HA-Na prepared in Example 2-2 An anhydrous DMSO solution (10 mg / mL) of HA-TBA starting from (50 kDa) was prepared. Thereafter, Chol-C 6 hydrochloride prepared in Example 1-1 was added to each solution at a ratio shown in Table 1 below with respect to the HA-TBA unit.
  • FIG. 6 shows JNM-ECA500 (manufactured by JEOL Ltd.). From the integrated value of the peak derived from the acetyl group of glucosamine (COCH 3 , 1.6 to 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from the methyl group in the cholesteryl group (CH 3 , 0.7 ppm; 3H), The introduction rate of the cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated from the formula shown below (Table 1).
  • the peak around 1.6 to 2.0 ppm which includes the peak derived from the acetyl group of glucosamine, is overlapped with the peak (5H) derived from the cholesteryl group, so the integrated value of the peak around 1.6 to 2.0 ppm
  • Example 2-3-2 Preparation of HA Derivative Modified with Cholesteryl 2-Aminoethyl Carbamate HA-TBA prepared in Example 2-2 starting from HA-Na (50 kDa) at 10 mg / mL Dissolved in anhydrous DMSO. It was then added to each solution at a ratio showing the Chol-C 2 hydrochloride prepared in Example 1-2 in Table 2 below with respect to HA-TBA units. Next, DMT-MM was added to the HA-TBA unit at the ratio shown in Table 2 below, and the mixture was stirred overnight at room temperature. Sodium nitrate is added to the reaction solution to a concentration of 0.3 M, and isopropyl alcohol (IPA) is added to collect the precipitate.
  • IPA isopropyl alcohol
  • Example 7 shows the 1 H-NMR spectrum of the product (introduction rate 8%) measured under the same conditions as described in Example 2-3-1.
  • Table 2 shows the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1.
  • Example 2-3-3 Preparation of HA Derivative Modified with Cholesteryl 8-Aminooctyl Carbamate Using Chol-C 8 hydrochloride prepared in Example 1-3 instead of Chol-C 2 hydrochloride, the following HA-C 8 -Chol was obtained as a white solid in the same manner as in Example 2-3-2 except that Chol-C 8 hydrochloride and DMT-MM were added in the ratios shown in Table 3.
  • FIG. 8 shows the 1 H-NMR spectrum of the product (introduction rate 7%) measured under the same conditions as described in Example 2-3-1.
  • Table 3 shows the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1.
  • Example 2-3-4 using cholesteryl 12-Chol-C 12 hydrochloride as prepared in Example 1-4 in place of the amino prepared Chol-C 2 hydrochloride dodecyl carbamate HA derivatives modified by, the following HA-C 12 -Chol was obtained as a white solid in the same manner as in Example 2-3-2 except that Chol-C 12 hydrochloride and DMT-MM were added in the ratios shown in Table 4.
  • FIG. 9 shows the 1 H-NMR spectrum of the product (introduction rate: 7%) measured under the same conditions as described in Example 2-3-1. Further, Table 4 shows the introduction rate of cholesteryl groups with respect to the HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1.
  • Example 3 Confirmation of Aggregate Formation by PBS Size Exclusion Chromatography
  • the HA derivative obtained in Examples 2-3-1 to 2-3-4 was added to distilled water (ultra pure water) at a concentration of 1 mg / mL. Dissolved. Each was subjected to size exclusion chromatography (SEC), and aggregate formation was observed from the change in the retention time of the HA derivative (FIGS. 10-1 to 10-4). SEC conditions are shown below. Column: G3000SWXL (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: PBS (pH 7.4) Flow rate: 1 mL / min Injection volume: 50 ⁇ L Detection: differential refractive index.
  • Example 4 Confirmation of Aggregate Disintegration by Hydroxylpropyl- ⁇ -cyclodextrin-added PBS Size Exclusion Chromatography
  • the HA derivative obtained in Examples 2-3-1 to 2-3-4 Dissolved in distilled water (ultra pure water). Hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) in PBS (33 mM, 30 ⁇ L) was added to 70 ⁇ L each, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Each sample was subjected to size exclusion chromatography (SEC), and the decay of the HA derivative aggregate was observed from the change in retention time (FIGS. 11-1 to 11-4).
  • SEC size exclusion chromatography
  • the HA of the present invention is considered to form multimolecular associative microparticles in the aqueous solution similar to CHP using the hydrophobic interaction of cholesteryl groups as a driving force.
  • HA-C 6 -Chol is 18% or more (FIG. 11-1)
  • HA-C 2 -Chol is 16% or more (FIG. 11-2)
  • HA-C 12 -Chol is 19% or more (FIG. 11-3).
  • HA derivative of the present invention can form strong associative microparticles that do not completely disintegrate under the current HP- ⁇ -CD addition conditions. It is suggested that it is useful as a carrier for stably holding the drug.
  • Example 5 Preparation of complex of HA derivative introduced with cholesteryl group and protein (erythropoietin)
  • the HA derivative obtained in Examples 2-3-1 to 2-3-4 was distilled water at a concentration of 1 mg / mL. Dissolved in (ultra pure water).
  • HA-Na molecular weight: 50 kDa
  • CHP cholesteryl-introduced pullulan
  • Concentrated PBS 50 ⁇ L was added to an erythropoietin (EPO) aqueous solution (2 mg / mL, 50 ⁇ L) to a final concentration of 1 ⁇ PBS, and HA derivative (1 mg / mL, 100 ⁇ L) was further added. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, the mixture was centrifuged at 2000 G, and the supernatant containing all of free EPO and the dispersible complex was subjected to size exclusion chromatography. The amount of free EPO remaining in the aqueous solution without being incorporated into the complex was determined from the chromatographic result, and the amount of EPO contained in the complex was calculated.
  • EPO erythropoietin
  • transduction pullulan showed the introduction rate to each unit when the disaccharide of pullulan was considered as 1 unit for the comparison with a HA derivative.
  • the introduction rate was calculated from the number (1.38) of cholesteryl groups introduced per 100 monosaccharides indicated in the purchased product.
  • the value of% complexation of the HA derivative of the present invention was about 3 times higher than that of CHP, and it was confirmed that the HA derivative of the present invention efficiently forms a complex with EPO.
  • Example 6 Analysis of erythropoietin released from complex
  • a solution of hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) in PBS (50 mM, 50 ⁇ L) was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • Each sample was subjected to size exclusion chromatography.
  • Free EPO concentration including EPO released from the complex was calculated from EPO peak area, and recovery rate (%; free EPO weight / initial EPO weight ⁇ 100 ) Is shown in Table 6 below.
  • a typical chromatogram is shown in the lower part of FIG.
  • Example 7 Precipitation and Dispersibility of HA Derivatives Introduced with Cholesteryl Group (Example 7-1) Behavior under physiological salt concentration 6 mg / mL of the HA derivative obtained in Example 2-3-1 It dissolved in distilled water (ultra pure water) at a concentration. The concentrated buffer was added so that the final buffer composition was 10 mM PB (pH 7.4) and 150 mM NaCl, and the HA derivative concentration was 4.5 mg / mL. After incubating at 37 ° C. for 20 minutes, the mixture was centrifuged at 2000 G for 1 minute, and the supernatant was diluted twice with HP- ⁇ -CD / PBS solution (250 mM), incubated for 2 hours, and then subjected to SEC. The residual ratio of the HA derivative in the solution relative to the initial use amount was calculated from the detected peak area of the HA derivative. FIG. 13 shows a plot of the residual ratio versus the hydrophobic group introduction ratio of the HA derivative.
  • Example 7-2 Effect of NaCl Concentration on Dispersibility of HA Derivative
  • the HA derivative obtained in Example 2-3-1 was dissolved in distilled water (ultra pure water) at a concentration of 6 mg / mL.
  • Example 7-1 Concentrated buffer was added so that the final buffer composition was 10 mM PB, 0 mM NaCl, and 10 mM PB, 50 mM NaCl, and the HA derivative concentration was 4.5 mg / mL. After incubation at 37 ° C. for 20 minutes, the mixture was centrifuged at 2000 G for 1 minute, and the supernatant was diluted twice with HP- ⁇ -CD / PBS solution (250 mM), incubated for 2 hours, and then subjected to SEC. The residual ratio of the HA derivative in the solution relative to the initial use amount was calculated from the detected peak area of the HA derivative. FIG. 14 shows the residual ratio plotted for each HA derivative against the salt concentration. The SEC measurement conditions are the same as in Example 7-1.
  • HA derivatives with an introduction rate of 7% have a salt concentration-dependent behavior in which they are uniformly dispersed under conditions where the salt concentration is low (10 mM PB pH 7.4, 0 or 50 mM NaCl) and precipitate at physiological salt concentrations (150 mM). It was confirmed to show. This result suggests the possibility that the HA derivative of the present invention can be used as a carrier in a preparation that precipitates subcutaneously after administration by preparing a low salt concentration solution made isotonic with sugar or the like.
  • Example 8 Precipitation / dispersibility of HA derivative / protein (erythropoietin) complex
  • the HA derivative obtained in Example 2-3-1 shown in Table 7 was distilled water (ultra pure) at a concentration of 4 mg / mL. Dissolved in water).
  • Concentrated PBS (50 ⁇ L) was added to the erythropoietin aqueous solution (1 mg / mL, 25 ⁇ L) to a final concentration of 1 ⁇ PBS, and HA derivative (4 mg / mL, 25 ⁇ L) was further added. After incubation at 37 ° C.
  • the chromatograph is shown in FIG.
  • the HA derivative / protein complex is also a stable dispersible fine particle.
  • the residual rate was 32%, so that it was confirmed that the HA derivative / protein complex was precipitated. That is, it was confirmed that the precipitation / dispersion performance of the HA derivative of the present invention is maintained even after the complex formation with the protein.
  • Example 9 Preparation of HA derivative modified with cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctylcarbamate (Example 9-1) Preparation of cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctylcarbamate hydrochloride Cholesteryl To a solution of chloroformate (1.7 g, 4.7 mmol) in anhydrous dichloromethane (50 mL) was added triethylamine (TEA, 0.53 mL) and stirred under an argon atmosphere.
  • TEA triethylamine
  • FIG. 16 shows the 1 H-NMR spectrum of the product (JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd .; MeOH-d 4 ).
  • Example 9-2 Preparation of HA Derivative Modified with Cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctylcarbamate
  • Chol-EO2 hydrochloride prepared in Example 9-1 was used.
  • the HA-EO2-Chol was obtained as a solid in the same manner as in Example 2-3-1, except that Chol-EO2 hydrochloride and DMT-MM were added at the ratios shown in Table 8 below.
  • FIG. 17 shows the 1 H-NMR spectrum of the product (introduction rate: 7%) measured under the same conditions as described in Example 2-3-1.
  • Table 8 shows the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1.
  • Example 10 Preparation of HA derivative modified with 2-aminoethyl cholesteryl disulfide HA-Na (manufactured by Shiseido Co., Ltd.) having a molecular weight of 10 kDa was used as a raw material, and HA-TBA prepared in the same manner as in Example 2-2 An anhydrous DMSO solution (10 mg / mL) was prepared. Thereafter, 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide hydrochloride (Py-SS-AM, manufactured by Toronto) was added to each solution at a ratio shown in Table 9 below with respect to the HA-TBA unit.
  • 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide hydrochloride Py-SS-AM, manufactured by Toronto
  • Example 11 Preparation of HA derivative modified with cholesteryl 2-aminoethyl carbamate and aminoethyl methacrylate HA-TBA prepared in Example 2-2 starting from HA-Na (50 kDa) at 10 mg / mL Dissolved in anhydrous DMSO. It was then added to each solution at a ratio shown in Table 10 below Chol-C 2 hydrochloride prepared in Example 1-2 with respect to HA-TBA units. Next, DMT-MM was added to the HA-TBA unit at the ratio shown in Table 10 below, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • Example 2-3-1 aminoethyl methacrylate (AEMA, manufactured by Polysciences) hydrochloride and DMT-MM were added at the ratio shown in Table 10 below, and the mixture was stirred overnight at room temperature. Thereafter, the same treatment as in Example 2-3-1 was performed to obtain HA-C 2 -Chol / AEMA as a white solid.
  • the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 2-3-1 is shown in FIG. 19, and the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1.
  • Table 10 shows. Table 10 shows the introduction ratio of methacrylic groups with respect to the HA unit calculated from the average value of signals derived from methacryloyl groups at 5.6 ppm and 6.0 ppm by the following formula.
  • Example 12 Preparation of HA derivative modified with 5-aminomethylfluorescein and cholesteryl 6-aminoheptylcarbamate A low molecular weight compound was introduced into the HA derivative of the present invention by the following method to obtain a fluorescently labeled HA derivative. .
  • HA-TBA prepared in Example 2-2 and starting from HA-Na (50 kDa) was dissolved in anhydrous DMSO at 10 mg / mL. Thereafter, Chol-C 6 hydrochloride prepared in Example 1-1 was added to each solution at a ratio shown in Table 11 below with respect to the HA-TBA unit.
  • Example 11 shows the introduction rate of the cholesteryl group with respect to the HA unit calculated from the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 2-3-1 by the formula described in Example 2-3-1.
  • the introduction rate of fluorescein was calculated from a molar extinction coefficient at 494 nm of 80000 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 .
  • Labeling with FL was performed by forming an amide bond between the amino group of FL and the carboxy group of HA-TBA.
  • Example 13 Preparation of HA derivative modified with 5-aminomethylfluorescein, cholesteryl 6-aminoheptylcarbamate and ethanolamine or propanolamine Using HA-Na having a molecular weight of 10 kDa as a raw material, the same method as in Example 2-2 An anhydrous DMSO solution (10 mg / mL) of the prepared HA-TBA was prepared. Thereafter, Chol-C 6 hydrochloride prepared in Example 1-1 was added to each solution at a ratio shown in Table 12 below with respect to the HA-TBA unit. Next, DMT-MM was added to the HA-TBA unit at the ratio shown in Table 12 below, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • 5-aminomethylfluorescein (FL) hydrochloride and DMT-MM were added at the ratio shown in Table 12 below, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • ethanolamine (HO—C 2 ) hydrochloride, propanolamine (HO—C 3 ) hydrochloride and DMT-MM were added in the ratios shown in Table 12 below, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Thereafter, the same treatment as in Example 2-3-1 was performed to obtain HA-C 6 -Chol / C 2 -OH / FL or HA-C 6 -Chol / C 3 -OH / FL as a yellow solid. .
  • H-C 6 -Chol / C 2 —OH / FL shows a 1 H-NMR spectrum (JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd.) using DMSO-d 6 as a measurement solvent.
  • Introduction rate of cholesteryl group with respect to HA unit calculated by the formula described in Example 2-3-1, and amide of NHCO derived from amide group of glucosamine and Chol-C 6 , HO-C 2 or HO-C 3 , FL
  • the total introduction rate of Chol-C 6 , HO—C 2 or HO—C 3 , FL was calculated from the group-derived (NH). This is shown in Table 12.
  • Example 14 Preparation of HA derivatives obtained by modifying hyaluronic acid TBA salts of different molecular weights with various cholesteryl carbamates Modified with various cholesteryl carbamates using HA-TBA of various molecular weights under the same conditions as Example 2-3-1.
  • the prepared HA derivative was prepared.
  • Table 13-1-Table 13-2 shows the reagent usage and synthesis results of HA derivatives having a cholesteryl group introduced therein.
  • the raw material hyaluronic acid was all manufactured by Shiseido.
  • Example 15 Preparation of HA derivatives obtained by modifying hyaluronic acid TBA salts having different molecular weights with various cholesteryl carbamates and 5-aminomethyl fluorescein. HA derivatives modified with 5-aminomethylfluorescein (FL) were prepared. The amount of FL used was also the same as in Example 12. As the raw material hyaluronic acid, only 5 kDa used was manufactured by R & D Systems, and other products were manufactured by Shiseido.
  • Table 14 shows the reagent usage and synthesis results of the HA derivative having a cholesteryl group introduced therein.
  • Example 16 Preparation of HA derivative modified with Hilite Fluor TM 750 amine and 6-aminohexyl carbamate (for in vivo imaging)
  • the title HA derivative (HA-C 6 ) was prepared under the same conditions except that instead of 5-aminomethylfluorescein (FL) hydrochloride of Example 12, Hilyte Fluor TM 750 amine (Hyrite) TFA salt was used. -Chol / Hilyte) was prepared. The molar ratio added is shown in Table 15.
  • Hiyte Fluor TM 750 amine TFA salt ethanolamine hydrochloride was reacted in the same manner as in Example 13 to prepare HA-C 6 -Chol / C 2 -OH / Hyte.
  • the molar ratio added is shown in Table 15.
  • the introduction rate was calculated by the same method as in Example 12 and Example 13.
  • labeled by Hilyte Fluor TM 750 amine is an amino group of Hilyte Fluor TM 750 amine is performed by forming an amide bond with a carboxyl group of HA-TBA.
  • Example 17 DLS Measurement of HA Derivatives Introduced with Cholesteryl Group PBS solutions (0.25 mg / mL) of the HA derivatives synthesized in Example 12 and Example 15 were prepared, and the particle size was determined by dynamic light scattering method ( DLS). Zetasizer Nano ZS (manufactured by Malvern) was used as a measuring device. The z-average particle size is shown in Table 16. Further, FIG. 21 shows the size distribution of 50k HA-C 6 -Chol-22% / FL.
  • HA derivative formed very small fine particles of 50 nm or less in PBS.
  • Microparticles of the above size are suitable as drug carriers because they can avoid uptake from the reticuloendothelial system in vivo.
  • Example 18 Preparation of a complex of a HA derivative having a cholesteryl group and a protein (Example 18-1) Lysozyme Lysozyme (Lys: from lysozym from chicken white, manufactured by Sigma) Were complexed with the HA derivatives and CHP shown in Table 17.
  • Concentrated PBS 50 ⁇ L was added to the Lys aqueous solution (4 mg / mL, 25 ⁇ L) to a final concentration of 1 ⁇ PBS, and further HA derivative or CHP (4 mg / mL, 25 ⁇ L) was added. After incubation at 37 ° C.
  • the mixture was centrifuged at 6000 G, and the supernatant containing all of the free Lys and the dispersible complex was subjected to size exclusion chromatography. From the result of chromatography, the amount of free Lys remaining in the aqueous solution without being incorporated into the complex was determined, and the amount of Lys contained in the complex was calculated. Further, the amount of Lys contained in the complex per unit weight of the HA derivative and CHP (complex%; (Lys weight in complex / HA derivative weight) ⁇ 100) was determined. The results are shown in Table 17 below, and the graph is shown in FIG.
  • Measurement condition column for SEC G3000PWXL (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: 2 ⁇ PBS (pH 7.4) Flow rate: 1 mL / min Injection volume: 50 ⁇ L Detection: UV (280 nm).
  • the value of% complexation of the HA derivative of the present invention is about 5 to 12 times higher than that of CHP, and it was confirmed that the HA derivative of the present invention efficiently forms a complex with Lys.
  • Example 18-2 Exendin-4 Exendin-4 (Ex-4, manufactured by American Peptide) was combined with the HA derivative and CHP shown in Table 18 in the same manner as in Example 5.
  • Concentrated PBS (44.8 ⁇ L) was added to an Ex-4 aqueous solution (3.31 mg / mL, 30.2 ⁇ L) to a final concentration of 1 ⁇ PBS, and then HA derivative or CHP (4 mg / mL, 25 ⁇ L). was added. After incubation at 37 ° C.
  • SEC measurement condition column QC-PAK-GFC200 (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: PBS (pH 7.4) Flow rate: 1.2 mL / min Injection volume: 50 ⁇ L Detection: UV (280 nm).
  • the value of% complexation of the HA derivative of the present invention was about 3 to 11 times higher than that of CHP, and it was confirmed that the HA derivative of the present invention efficiently forms a complex with exendin-4.
  • Example 18-3 Human Growth Hormone In the same manner as in Example 5, human growth hormone (hGH: Genotropin (registered trademark) for injection), HA derivative and CHP shown in Table 19 were combined. hGH used was obtained by substituting Genotropin (registered trademark) with a phosphate buffer (10 mM, pH 7.4) by dialysis.
  • SEC measurement condition column QC-PAK-GFC300 (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: PBS (pH 7.4) Flow rate: 1.2 mL / min Injection volume: 30 ⁇ L Detection: UV (280 nm).
  • the value of% complexation of the HA derivative of the present invention is about 2 to 5 times higher than that of CHP, and it was confirmed that the HA derivative of the present invention efficiently forms a complex with hGH.
  • Example 18-4 EPO complex amount 2 of HA-modified product
  • the HA derivatives shown in Table 20 were subjected to EPO conjugation in the same manner as in Example 5, and the percent conjugation was calculated. The graph is shown in Fig. 22-4.
  • the value of% complexation of the HA derivative of the present invention is about 5 times higher than that of CHP, and it was confirmed that the HA derivative of the present invention efficiently forms a complex with EPO.
  • Example 19 EPO in vitro release (Example 19-1) Preparation of Alexa-EPO Alexa Fluor (registered trademark) 488 5-into an EPO aqueous solution substituted with a carbonate buffer (0.3 M, pH 9.0) 1 mg of TFP (manufactured by Invitrogen) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After gel filtration purification using a PD-10 column, dialysis purification (7000 MWCO dialysis membrane) was performed with a phosphate buffer (10 mM, pH 7.4), and EPO (Alexa-) fluorescently labeled with Alexa Fluor (registered trademark) 488 was used. An EPO) solution was obtained.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 488 Labeling with Alexa Fluor (registered trademark) 488 is achieved by an amide bond between the carboxy group of Alexa Fluor (registered trademark) 488 and the amino group of EPO.
  • Example 19-2 Alexa-EPO Sustained Release Effect of HA Derivatives The final concentration was 1 ⁇ PBS with respect to the Alexa-EPO solution (3.34 mg / mL, 10 ⁇ L) obtained in Example 19-1. Concentrated PBS (90 ⁇ L) was added to the mixture, and HA derivative (6 mg / mL, 100 ⁇ L) was further added.
  • HA-C 6 -Chol-7%, HA-C 6 -Chol-15% and HA-C 12 -Chol-7% were used as HA derivatives (the molecular weight of HA-Na used as a raw material is all 50 kDa).
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours and lyophilized as it was. 20 mg / mL bovine serum albumin (BSA: manufactured by Sigma) / PBS solution (200 ⁇ L) is added to the total amount of the lyophilized product, centrifuged over time, the supernatant (100 ⁇ L) is taken, and a fresh BSA / PBS solution (100 ⁇ L) is collected. ) was added.
  • BSA bovine serum albumin
  • the supernatant was diluted twice with an aqueous HP- ⁇ -CD solution (100 mM), incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to SEC to calculate the concentration of Alexa-EPO, and the amount of Alexa-EPO released was calculated.
  • the results are shown in FIG.
  • SEC analysis condition column G3000SWXL (manufactured by Tosoh Corporation) Eluent: 10 mM HP- ⁇ -CD / PBS (pH 7.4) Flow rate: 1 mL / min Injection volume: 50 ⁇ L Detection: Fluorescence detection 494/525 Been shown to be even sustained release effect in any of the HA derivative, an additional 15% more than the introduction rate of 7% cholesteryl group, the spacer clear that towards the C 12 than C 6 there is a sustained release effect became. (Example 19-3) Effect of BSA concentration in release solution Concentrated to a final concentration of 1 ⁇ PBS with respect to Alexa-EPO solution (3.34 mg / mL, 10 ⁇ L) obtained in Example 19-1.
  • the supernatant was diluted twice with an aqueous HP- ⁇ -CD solution (100 mM), incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to SEC to calculate the concentration of Alexa-EPO, and the amount of Alexa-EPO released was calculated.
  • the results are shown in FIG.
  • the SEC conditions are the same as in Example 19-2.
  • Example 20 Release of hGH in vivo (Example 20-1) Preparation of a precipitate freeze-dried product of complex of hGH and HA derivative HA derivative obtained in Example 2-3-1 and Example 14 (6 mg HGH (4.31 mg / mL, 0.940 mL) was added to / 375 mL) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, concentrated PBS (0.185 mL) was added so that the final concentration was 1 ⁇ PBS, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. Precipitation was confirmed.
  • HA derivative of the present invention efficiently encapsulates (complexes) hGH.
  • Example 20-2 Preparation of hGH / HA derivative complex (precipitate) HA-C 6 -Chol-14% (6 mg / mL, 0.583 mL; molecular weight of HA-Na used as raw material is 50 kDa)
  • hGH (4.84 mg / mL, 0.145 mL) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, concentrated PBS (0.147 mL) was added so that the final concentration was 1 ⁇ PBS, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. Precipitation was confirmed.
  • Example 20-3 Preparation of hGH / HA derivative complex (solution) HA-C 6 -Chol-14% (6 mg / mL, 0.583 mL; the molecular weight of HA-Na used as a raw material is 50 kDa) (4.84 mg / mL, 0.145 mL) and an aqueous sucrose solution (0.147 mL) were added so that the final concentration was 82 mg / mL, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. No precipitation was confirmed. Stored at 4 ° C.
  • This preparation is a preparation intended to be administered in a solution state and to cause precipitation by an increase in the ionic strength in the skin after administration.
  • Example 20-4 Sustained Release Test of hGH / HA Derivative Complex in Rats by Subcutaneous Administration
  • the hGH / HA derivative complex prepared in Examples 20-1 to 20-3 has a capacity of 25 G in the capacity shown in Table 23-1.
  • Normal rats SD, 6 weeks old, male
  • the lyophilized product prepared in Example 20-1 was suspended in PBS immediately before administration. The preparation before administration is shown in FIG.
  • FIGS. 26-1 to 27-2 show changes in plasma concentration of hGH at the time of administration of various hGH / HA derivative complexes—and changes in plasma concentration of the hGH solution of Comparative Example 1 together.
  • pharmacokinetic parameters extrapolated area under plasma concentration-time curve (AUC ⁇ ) and mean residence time (MRT) were measured using WinNonlin Ver. The analysis was performed according to 5.0.1 (manufactured by Pharsight), and the values are shown in Table 23-2. An MRT graph is shown in FIG.
  • the solution preparation (Sample 20-6) obtained in Example 20-3 can be sterilized by a 0.2 ⁇ m filter, and is less likely to clog a syringe needle, so that it is useful as a pharmaceutical preparation. .
  • Example 2-3-1 the product was treated in the same manner as in Example 2-3-1 to obtain the desired product (10k HA—C 2 —OH / FL) as a yellow solid.
  • NHCO derived from the amide group of glucosamine calculated from the 1 H-NMR spectrum (JNM-ECA500 manufactured by JEOL Ltd.) using DMSO-d 6 as a measurement solvent according to the formula described in Example 13, C 2 -OH,
  • the total introduction rate of C 2 -OH and FL was calculated from NHCO derived from the amide group of FL. This is shown in Table 24.
  • Example 2-3-1 Thereafter, the same treatment as in Example 2-3-1 was performed to obtain the target 10k HA—C 2 —OH / FL as a yellow solid.
  • the total introduction rate of C 2 —OH and FL was calculated in the same manner as in Comparative Example 2-2. This is shown in Table 25.
  • the sample using 10k HA-Na as a raw material is not only a HA derivative having a low introduction rate of C 2 -OH (Comparative Example 2-3) but also a highly modified HA derivative (Comparative Example 2- Also in 4), it was clarified that it disappeared from the blood instantly.
  • Example 21 Pharmacokinetic study of HA-Chol-FL (Example 21-1) Effect of HA molecular weight on plasma concentration transition Fluorescent label prepared in Examples 12 and 15 at the doses shown in Table 27
  • the HA derivative was administered into the tail vein of normal rats (SD, 6 weeks old, male) using a 25G needle. After administration, blood was collected from the jugular vein with a syringe that had been heparinized over time. The obtained blood was separated into plasma, diluted 2-fold with an HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0) solution, incubated at 37 ° C.
  • HP- ⁇ -CD 100 mM
  • Tris buffer 500 mM, pH 9.0
  • FIG. 30-1 The change in plasma concentration of the fluorescently labeled HA derivative is shown in FIG. 30-1.
  • pharmacokinetic parameters plasma concentration-time curve extrapolated value (AUC ⁇ )) were measured using WinNonlin Ver. The analysis was performed according to 5.0.1 (manufactured by Pharsight), and the values are shown in Table 28. A graph in which AUC ⁇ in Table 28 is plotted against the molecular weight of the raw material HA—Na is shown in FIG. 30-2.
  • HA-Chol of the present invention introduces only a maximum of 23% substituents (27% or less even if FL is taken into consideration), unexpectedly low molecular weight (5-18 kDa) hyaluronic acid is obtained. Only in the case of HA-Chol as a raw material, good blood retention was shown.
  • Example 21-2 Effect of linker on transition of plasma concentration
  • a fluorescently labeled HA derivative having a different linker prepared in Example 15 shown in Table 29 was subjected to a pharmacokinetic test in the same manner as in Example 21-1, and plasma The transition of medium concentration is shown in FIG. Further, the pharmacokinetic parameter (AUC ⁇ ) was calculated in the same manner as in Example 21-1, and the value is shown in Table 30.
  • Example 21-3 Effect of Chol Introduction Rate on Plasma Concentration Transition
  • Example 21-1 was applied to fluorescently labeled HA derivatives prepared in Example 12 and Example 15 shown in Table 31 and having different Chol introduction rates.
  • a pharmacokinetic test was conducted with and the changes in plasma concentration are shown in FIGS. 32-1 and 32-2. Further, the pharmacokinetic parameter (AUC ⁇ ) was calculated in the same manner as in Example 21-1, and the value is shown in Table 32.
  • Example 21-4 Plasma concentration transition (HA-Chol / C 2 -OH / FL) A pharmacokinetic test was carried out on the fluorescently labeled HA derivative highly modified with C 2 -OH and Chol prepared in Example 13 shown in Table 33 in the same manner as in Example 21-1, and the plasma concentration transition was shown in FIG. It was shown to. Further, the pharmacokinetic parameter (AUC ⁇ ) was calculated in the same manner as in Example 21-1, and the value is shown in Table 34.
  • Example 21-5 Changes in plasma concentration of HA derivative after subcutaneous administration
  • a pharmacokinetic test was conducted in the same manner as in Example 21-1, except that the fluorescently labeled HA derivative shown in Table 35 was administered subcutaneously. The changes in plasma concentration are shown in FIGS. 34-1 and 34-2. Further, pharmacokinetic parameters (AUC ⁇ ) were calculated in the same manner as in Example 21-1, and the values are shown in Table 36.
  • HA derivative can also be administered subcutaneously.
  • Example 21-6 Effect of plasma concentration transition by prior administration of hyaluronic acid 20 mg before administration, 30 mg of sodium hyaluronate (mixture containing 6 mg each of 1000 k, 300 k, 100 k, 50 k, 10 k) was administered from the tail vein Thereafter, a pharmacokinetic test was conducted in the same manner as in Example 21-1, except that the fluorescently labeled HA derivative shown in Table 34 was administered from the tail vein, and the plasma concentration transition was shown in FIGS. 35-1 and 35-. It was shown in 2. Further, pharmacokinetic parameters (AUC ⁇ , MRT) were calculated in the same manner as in Example 21-1, and the values are shown in Table 38.
  • Example 21-7 SEC analysis of plasma sample To sample 21-2 and 20 ⁇ L measured by the plate reader in Example 21-1, 80 ⁇ L of ultrapure water was added and SEC analysis was performed. The chromatograms are shown in FIGS. 36-1 and 36-2.
  • HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer solution (500 mM, pH 9.0) solution (50 ⁇ L) was added to 50 ⁇ L of urine sample, and incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by SEC analysis.
  • the chromatograms are shown in FIGS. 37-1 to 37-5.
  • Example 22 Precipitation and Dispersibility of HA Derivatives Introduced with Cholesteryl Group (Part 2)
  • the residual ratio was calculated by the same method as in Example 7, except that the HA derivative obtained in Examples 2-3-2 to 2-3-4 was used.
  • FIG. 38 shows a plot of the residual ratio versus the hydrophobic group introduction ratio of the HA derivative.
  • Example 23 Preparation of complex of HA derivative introduced with cholesteryl group and low molecular weight drug 10k HA-C 6 -Chol-15% prepared in Example 14 and prepared in Example 2-3-1. 50k HA-C 6 -Chol-15 % aqueous solution (6 mg / mL, 100 [mu] L) to, doxorubicin (DOX) solution (10 mg / mL, 4 [mu] L, manufactured by Wako pure Chemical) was added, a final concentration of 1 ⁇ PBS 96 ⁇ L of concentrated PBS solution was added. What added ultrapure water instead of DOX aqueous solution was set as control.
  • DOX doxorubicin
  • Measurement condition column for RP cadenza CD-C18 (manufactured by Intact) Eluent A: Ultrapure water, 0.1% TFA Eluent B: acetonitrile, 0.1% TFA Gradient: B5% ⁇ B95% (8 minutes) Flow rate: 0.75 mL / min Injection volume: 10 ⁇ L Detection: UV480 It was revealed that the HA derivative of the present invention was mixed with doxorubicin to form a complex.
  • HA-Chol in vivo imaging Nude mice (BALB-nu / nu, female, 7 weeks old) were transplanted with human breast cancer-derived MDA-MB-213 cell sections (2 mm x 2 mm x 2 mm) subcutaneously, and xeno A graft mouse was created. After 17 days, tumor size, grouped by body weight (analysis software: Antes, weighing 18.8 ⁇ 24.3 g, tumor size 215mm 3 ⁇ 360mm 3), Hilyte labeled HA derivative and 50k prepared in Example 16 HA- Hilite (prepared in the same manner as in Comparative Example 2-1 except that Hilite TFA salt was used instead of FL hydrochloride) was administered via the tail vein in the volume shown in Table 39.
  • FIG. 41 shows a graph of the amount of light obtained from the tumor.
  • Example 25 Gelation of HA derivative (HA-Chol / AEMA) into which cholesteryl group and methacryloyl group were introduced (50k) HA-C 2 -Chol-8% prepared in Example 11 / AEMA-27% was exceeded. Dissolve in pure water (40 mg / mL, 100 ⁇ L), add triethanolamine (TEA, 1.3 ⁇ L), mix, add dithiothreitol (DTT, 100 mg / mL, 2.0 ⁇ L), and add to a 500 ⁇ L tube. And incubated at 37 ° C. After 24 hours, when it was taken out from the tube, it was confirmed that it was gelled. This is shown in FIG.
  • HA-Chol / AEMA can be gelled by DTT, and it is possible to prepare a dual gel having both physical and chemical cross-linking by hydrophobic interaction with cholesteryl groups. Became clear. This dual gel is expected to have a function of holding the encapsulated drug more firmly than HA-Chol having only physical crosslinking.
  • HA-C 2 -Chol-8% / AEMA-27% gel was added to 2 mL of 0.93 mg / ml Cy TM 3 labeled hGH solution (red) and incubated at room temperature for 4 days.
  • TM3- labeled hGH solution was prepared according to the instructions using Cy3 Mono-Reactive Dye Pack (manufactured by GE Healthcare) and hGH solution.) It was confirmed that the gel was stained in a deeper red color than the surrounding solution ( Data not shown). From these results, it was shown that the HA-Chol / AEMA gel spontaneously encapsulates hGH after gelation.
  • the HA-Chol / AEMA gel is useful as a pharmaceutical substrate from the viewpoint of stably encapsulating proteins.
  • Example 26 Synthesis of hyaluronic acid derivative in which a cholesteryl group was introduced into the 6-position hydroxy group of the N-acetylglucosamine moiety of hyaluronic acid.
  • HA-Na (50 kDa) prepared in Example 2-2 was used as a starting material.
  • 68.26 mg of HA-TBA was dissolved in anhydrous DMSO.
  • Cholesteryl N- (6-isocyanatohexyl) carbamate (CHI, 4.15 mg) dissolved in dehydrated pyridine was added dropwise thereto, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 9.5 hours under nitrogen.
  • the reaction solution was reprecipitated with ethyl acetate and collected by centrifugation.
  • the obtained white solid was dissolved again in DMSO and dialyzed against 0.3 M NaCl solution, distilled water, 10 mM HCl solution and distilled water (Slide-A-Lyser, molecular weight cut off 3500 Da, manufactured by PIERCE) to obtain The resulting dialysate was lyophilized to obtain 50k HA—O—C 6 -Chol.
  • Table 40 shows the introduction rate of the cholesteryl group with respect to the HA unit calculated from the 1 H-NMR spectrum (manufactured by 500 MHz Bruker) using DMSO-d 6 as the measurement solvent by the formula described in Example 2-3-1.
  • Example 27 DLS measurement of a hyaluronic acid derivative in which a cholesteryl group was introduced into the 6-position hydroxy group of the N-acetylglucosamine moiety of hyaluronic acid 50 k HA-O-C 6 -Chol-1% 99k HA-O-C 6 using -Chol-2%, other dissolved in ultrapure water as a solvent was DLS measurement in the same manner as in example 17. The z-average particle size is shown in Table 41.

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Abstract

　本発明により、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、式（Ｉ）： ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｚ、ｎ、Ｒａ、Ｙ、およびＸ１は、明細書中に定義されたとおりである］で表される繰り返し単位を１以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。

Description

ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
　本発明は、疎水性基を導入した新規ヒアルロン酸誘導体、当該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬組成物、特に薬効を有するタンパク質および／またはペプチドを含む医薬組成物に関する。
　近年、組み換え遺伝子技術や化学合成技術の発展により、タンパク質およびペプチドを活性成分とする製剤が実用化されており、その数は年々増え続けている。しかし、タンパク質やペプチドは消化管あるいは粘膜などからは吸収されにくく、また、体内では不安定で血中半減期が短い。そのため、タンパク質製剤およびペプチド製剤は注射による頻回投与が必要となっており、患者にも医療関係者にも負担が大きくなっている。薬理活性を損なうことなくタンパク質やペプチドをカプセル化するための徐放性ＤＤＳ基材が望まれている。また、投与の効率の観点から、基材に対してできるだけ多量のタンパク質、ペプチドが封入できることが望ましい。
　タンパク質やペプチドの薬理活性はそれらの高次構造に起因するところが大きく、有機溶媒や空気界面との接触、圧力や温度、ｐＨといった外部環境に起因する変性および凝集によりタンパク質やペプチドの薬理活性が損なわれることが知られている。また、変性や凝集したタンパク質を体内に投与することにより抗原性などのリスクが高まることも知られている。タンパク質またはペプチドを活性成分とする徐放性製剤においては、製剤化工程から、製剤の貯蔵期間を経て、投与後に生体内で当該活性成分が放出されるまで、タンパク質やペプチドの安定性を確保することが求められる。
　ポリ乳酸－ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子を基材にした徐放性製剤について実用化の試みが広く行われているが、基材の疎水性、および製剤化のための操作（乳化、乾燥、酸性化など）に起因するタンパク質の変性または凝集が報告されている（非特許文献１および２）。
　一方、親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放性製剤も報告されているが、ゲル化工程中のタンパク質安定性などの問題もあり、やはり実用化には至っていない。
　また、安全性の面から、製剤に用いる基材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならない。安全性に加えて、タンパク質またはペプチドの封入量および回収率の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放性製剤は知られていない。
　近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告がある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグリコサミノグリカンの一種である。ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトもその代謝系を有しており、免疫性および毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。近年、微生物による高分子量ＨＡの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品などの分野でも実用化されている。
　このように非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つことから、ＨＡは安全性の面から徐放性製剤の基材として好ましいと考えられる。これまでにも、ＨＡを基材として用いた製剤は数多く報告されており、血中滞留性向上を目的とした修飾したＨＡの使用（特許文献１）や、膝関節内滞留性向上を目的としたアルキル鎖を導入したＨＡ誘導体の使用（特許文献２）、タンパク質徐放のためのｉｎ　ｓｉｔｕ架橋ＨＡゲルの使用（特許文献３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の徐放のためのヒアルロン酸エステル固形物の使用（特許文献４）が報告されている。
　一方、有機溶媒を使用することなく水溶液中においてタンパク質やペプチドと自発的に複合化する基材はいくつか報告されており、それら基材は、主に、多糖またはポリアミノ酸を原料として製造されている。
　ポリアミノ酸誘導体を基材として使用した医薬製剤の例として、トコフェロールを導入したポリグルタミン酸の基材としての使用が報告されている（特許文献５）。
　多糖誘導体の基材に関しては、コレステリル基などを導入したプルラン誘導体が、水溶液中においてナノサイズの微粒子を形成し、疎水性低分子、ペプチド、タンパク質などと複合化するホスト分子として機能することが報告されている（非特許文献３）。タンパク質取り込み後の当該プルラン誘導体についての熱力学的評価により、取り込まれたタンパク質が、プルランのヒドロキシ基との水素結合により安定化されることが示されている（非特許文献１１）。
　また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（特許文献６）およびリノレイン酸を導入したキトサン（非特許文献１２）をタンパク質との複合体形成の材料として利用する報告もある。さらに、本願優先日以降に公開された特許文献８には、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、親水性多糖類誘導体の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される組成物が報告されている。
　生体内にはＣＤ４４やＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、ＬＹＶＥ－１（Ｌｙｍｐｈｅ　Ｖｅｓｓｅｌ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ＨＡ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１）、ＨＡＲＥ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＡレセプターが存在することが報告されている（非特許文献１８および非特許文献１９）。特にＣＤ４４やＲＨＡＭＭは多くの癌細胞において過剰発現しており、それゆえＨＡを癌ターゲティングキャリアの基材として用いる試みがなされている。その例として、パクリタキセル－ＨＡコンジュゲート（非特許文献２０～２２および特許文献９）、カンプトテシン－ＨＡコンジュゲート（特許文献１０）、ドキソルビシン－ＨＰＭＡ［Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］－ＨＡコンジュゲート（非特許文献２３）、酪酸－ＨＡコンジュゲート（非特許文献２４）、ドキソルビシン封入ＨＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノパーティクル（非特許文献２５）、ｓｉＲＮＡ封入ＨＡゲル（非特許文献２６）、ドキソルビシン封入ＨＡ被覆リポソーム（非特許文献２７）などが挙げられる。さらに本願優先日以降に公開された非特許文献２８には、アミド結合により導入したエチレンジアミンリンカーを介してコール酸をコンジュゲートしたＨＡ誘導体について報告されている。これらＨＡを基材としたキャリアは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ４４高発現細胞において効率良く取り込まれることが報告されている（例えば非特許文献２０）。しかし、ＨＡは全身投与した場合、肝臓などの類洞内皮に存在するＨＡＲＥレセプターにより瞬時に取り込まれ、代謝されることが知られており、急速に血中から消失する（非特許文献２９～３１）。したがって、ＨＡ基材を用いた効率の良い癌ターゲティングには肝臓での取り込みを抑え、血中滞留性を向上させたキャリアーが必要とされている。
国際公開第ＷＯ２００６／０２８１１０号 国際公開第ＷＯ２００６／０９２２３３号 国際公開第ＷＯ２００４／０５０７１２号 国際公開第ＷＯ２００３／０９９９９２号 国際公開第ＷＯ２００５／０５１４１６号 国際公開第ＷＯ２００２／０２２１５４号 特開昭６２－６４８０２号公報 国際公開第ＷＯ２００８／１３６５３６号 国際公開第ＷＯ２００４／０３５６２９号 国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号
J. Pharm. Sci. 第88巻、第166-173頁、1999年 J. Microencapsulation 第15巻、第699-713頁、1998年 Macromolecules 第26巻、第3062-3068頁、1993年 Macromolecules 第30巻、第857-861頁、1997年 Macromolecules 第27巻、第7654-7659頁、1994年 J.Am.Chem.Soc. 第118巻、第6110-6115頁、1996年 Bioconjugate Chem. 第10巻、第321-324頁、1999年 FEBS Letters 第533巻、第271-276頁、2003年 Biomacromolecules 第6巻、第1829-1834頁、2005年 J.Controlled Release 第54巻、第313-230頁、1998年 Colloids and Surfaces 第112巻、第91-95頁、1996年 Carbohydrate Polymers 第62巻、第293-298頁、2005年 Ki Young Cholら、"Hydrogel Nanoparticles Based on Hyaluronic Acid", 34th Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society, July 7-11, 2007, Long Beach, California USA, Poster Session I, No.244（学会発表予稿集ＣＤ） Polymer 第47巻、第2706-2713頁、2006年 Journal of Biomedical Materials Research Part A　第83A巻、第1号、第184-190頁、2007年 Biomacromolecules 第8巻、第2366-2373頁、2007年 Carbohydrate Polymers 第62巻、第293-298頁、2005年 MOLECULAR PHARMACEUTICS. 第5巻、第474-486頁、2008年 Journal of Drug Targeting. 第16巻、第91-107頁、2008年 Bioconjugate Chem.第10巻、第755-763頁、1999年 Clinical Cancer Research. 第14巻、第3598-3606頁、2008年 Bioconjugate Chem.第19巻、第1319-1325頁、2008年 Pharmaceutical Research. 第19巻、第396-402頁、2002年 Clinical Cancer Research. 第10巻、第4822-4830頁、2004年 Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 第3巻、第246-257頁、2007年） Journal of Controlled Release、第119巻、第245-252頁、2007年） Neoplasia 、第6巻、第343-353頁、2004年 Journal of Materials Chemistry.第19巻、第4029-4280頁、2004年 Cell and Tissue Research.第243巻、第505-510頁、1985年） THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY、第275巻、第37733-37741頁、2000年 The Biochemical journal、第200巻、第415-424頁、1981年
　タンパク質およびペプチドの徐放性製剤用基材として、これまでに報告された材料は、必ずしも充分な性能を有していなかった。例えば、生体外由来のポリグルタミン酸やキトサン、プルラン、ＣＭＣを原料とした基材を使用した場合、生体適合性、生分解性に不安がある。特に反復投与、多量投与が必要な場合、生体への影響が懸念される。また、コレステロール置換プルランは、コレステロールなどの疎水性基の導入量を増加させることにより、水に対する溶解性が低下するため、封入させるタンパク質の量を、より増加させた担体の出現が望まれている。
　また、薬物としてタンパク質、ペプチド、低分子、核酸を封入することができ、血中徐放キャリアまたはターゲティングキャリアとして用いることができる担体、特に、血中滞留性に優れた担体が望まれている。
　本発明の目的は、安全性に優れた医薬製剤の基材を提供することであり、特に薬効を有するタンパク質またはペプチドを薬物として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、および血中滞留性に優れた血中徐放キャリアならびにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（たとえば皮下）徐放キャリアにもなり得る基材を提供することである。
　本発明者は、かかる目的を達成する為に鋭意検討を進めたところ、特定の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、薬物、特に薬理活性を有するタンパク質またはペプチドを多量に封入しながら、水溶液中で自発的に会合することを見出した。また、疎水性基の導入率により生理塩濃度下で顕著に凝集して沈殿形成する範囲、および生理塩濃度下でも安定な微粒子を形成し、水中で安定に分散する範囲が存在することを見出した。さらに、特定の分子量のＨＡを原料としたヒアルロン酸誘導体の血中滞留性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドを、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができ、生理塩濃度下で顕著に凝集し（あるいは生理塩濃度下でも分散し）、なおかつ血中滞留性が良好であることを特徴とする、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体、その製造法、ならびに薬物および該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬組成物およびその製造方法に関する。
　本発明の１つの側面によれば、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｚは、直接結合、または２～３０個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、および
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
により表される基から選択される疎水性基であり；
　Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルおよびヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－および－ＮＲｆ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキルおよびヒドロキシＣ２－１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～２個の基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－および－Ｓ－Ｓ－から選択される１～５の基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルまたはヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレンまたはＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１～１００から選択される整数である］
で表される繰り返し単位を、１以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
　本発明の１つの側面において、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、式（Ｉａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基であり；
　ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、
　ｍは、１～１００から選択される整数である］
で表される繰り返し単位を、１以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
　本発明のヒアルロン酸誘導体に式（Ｉ）で表される繰り返し単位が２以上含まれる場合、当該繰り返し単位は同一であっても、異なっていてもよい。当該ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）の繰り返し単位以外の位置において修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は－Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｏ（ホルミル）および－Ｏ（Ｃ１－６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド、エステルに変換されていても、塩を形成していてもよい。
　本発明の別の側面によれば、上記式（Ｉ）の基－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１は、以下の式：　
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；　
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；および
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；
　－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（ここで、ｍｚは、２～３０の整数であり、Ｒ８は、水素原子またはメチル基であり、Ｒ、およびｍは、本明細書で既に定義したとおりである）
で表される基から選択される。当該基は、好ましくは、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；および
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、およびｍは、本明細書で既に定義したとおりである）
から選択される基である。
　本発明の好ましい態様において、Zは直接結合である。また、本発明の１つの態様において、Ｚがペプチドリンカーの場合、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒである。
　Ｙの具体例としては、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられる。
　Ｙａとしては、－ＣＨ２－および－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
　Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイルおよびオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－および－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がさらに好ましい。
　本発明の１つの態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであり、ここで、ｎは２～３０の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体などが挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－などが挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２～３０の整数であるが、２～１０が好ましく、２～４がさらに好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－などが挙げられる。
　基－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリルが挙げられる。基－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１の好ましい態様において、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、またはＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレンまたは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
　本発明の別の側面によれば、式（Ｉ）で表される繰り返し単位、および式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｘａは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体が提供される。本発明のヒアルロン酸誘導体に式（ＩＩ）で表される繰り返し単位が２以上含まれる場合、当該繰り返し単位は同一であっても、異なっていてもよい。１つの態様において、本発明は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位、および式（ＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体を提供する。
　ここで、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１－６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ－ブチル基であるのが好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４、並びにＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、全て水素原子であるのが好ましい。また、ＲａおよびＲｂは、いずれも水素原子であるのが好ましい。
　本発明の一態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）または（ＩＩ）の繰り返し単位である。本発明の１つの態様において、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
　式（Ｉ）で定義したＹは、例えば、－（ＣＨ２）ｎａ－（ここで、ｎａは２～２０、好ましくは２～１５、さらに好ましくは２～１２の整数から選択される）であってもよく、好ましくは、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－および－（ＣＨ２）１２－であり、さらに好ましくは－（ＣＨ２）６－である。これらのＹは、後述する、沈殿形成および安定な分散という観点で好ましいものである。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、水中で会合により微粒子を形成することを特徴とする前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。特に限定はされないが、導入された疎水性基の疎水性相互作用により水中において自発的会合が起こり、微粒子を形成すると考えられている。当該微粒子の粒子径は特に限定されないが、例えば、１μｍ以下、好ましくは５００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下である。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義した疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する疎水性基の導入率が７～４２％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
　ここで、疎水性基の導入率は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、カルボキシ基がアミド基に変換されて疎水性基が導入されている式（Ｉ）の繰り返し単位、および疎水性基が導入されていない式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
　本発明の上記側面の一つの態様によれば、本明細書に定義した疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する疎水性基の導入率が７～１５％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。導入率が前記範囲の場合、ヒアルロン酸誘導体は、塩濃度が一定以上の溶液中（例えば、生理塩濃度下）で顕著に凝集し、沈殿を形成するという性質を有する。前記基導入率のヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させて、体内に投与（例えば皮下）することにより、投与後に凝集する特徴を生かした沈殿型の徐放製剤となりうる。
　本発明の上記側面の別の態様によれば、本明細書に定義した疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する疎水性基の導入率が１８～４２％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。導入率が前記範囲の場合、ヒアルロン酸誘導体は、塩濃度が一定以上の溶液中（例えば、生理塩濃度下）であっても安定な微粒子を形成し、水中で安定に分散するという性質を有する。前記導入率のヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させて、体内に投与（例えば静脈内）することにより、血中徐放製剤および目的組織または細胞へのターゲティング製剤となりうる。
　本発明の上記側面のさらに別の態様によれば、本明細書に定義した疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する疎水性基の導入率が２～５０％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。前記範囲の導入率は、血中滞留性向上の観点で好ましく、さらに好ましくは８～３５％であり、さらに好ましくは１５～２２％である。
　式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上含む本発明のヒアルロン酸誘導体は、好ましくは式（ＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸またはその誘導体、さらに好ましくは、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として合成される。原料の重量平均分子量は、血中滞留性向上の観点では、２７キロダルトン（ｋＤａ）以下が好ましく、１８ｋＤａ以下がさらに好ましい。分子量の下限は５ｋＤａ以上あればよい。当該分子量の好ましい範囲は５～２７ｋＤａであり、さらに好ましくは５～１８ｋＤａである。本発明の別の側面によれば、本発明のヒアルロン酸誘導体は、重量平均分子量が２７ｋＤａ以下である、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として製造することができる。当該側面の１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体は式（Ｉ）および（ＩＩ）の繰り返し単位から実質的に構成されるヒアルロン酸誘導体である。
　前記分子量のヒアルロン酸またはその誘導体を用いて前記導入率で疎水性基を導入した本発明のヒアルロン酸誘導体は、重量平均分子量２７ｋＤａを超えるヒアルロン酸あるいはその塩を用いた場合と比較して、あるいは前記疎水性基以外の基で修飾した場合と比較して、血中滞留性が顕著に向上するという性質を有する。前記分子量のヒアルロン酸を原料としたヒアルロン酸誘導体を用いることにより、血中滞留性が良好な全身投与型、特に静脈内投与型の血中徐放製剤および目的組織または細胞へのターゲティング製剤が提供できる。
　ここで、前記式（Ｉ）中のＹは、－（ＣＨ２）ｎ１－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２～１５、好ましくは２～１２、さらに好ましくは２～６の整数であり、ｍ１は、１～４の整数である）であるのが好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）１２－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましく、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－がさらに好ましい。
　式（Ｉ）におけるＸである前記疎水性基としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルおよび－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルおよび－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがさらに好ましい。
　本発明の別の側面によれば、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｘｂは、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄを表し；
　Ｒｅは、水素原子またはＣ１－６アルキル基であり；
　Ｒｄは、水素原子、Ｃ１－６アルキル基または基－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２であり、
　Ｙｂは、－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２－（ＣＨＲ６）ｐ－２－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｊ－Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ３－ＣＨ２－ＣＨ２）ｚ－Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ４－ＣＨ２－ＣＨ２）ｔ－ＮＨ－または－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ５－ＣＨ２－ＣＨ２）ｙ－Ｏ－であり、
　ここで、ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１～２００から選択される整数であり、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に水素原子またはヒドロキシであり、Ｒ７は、水素原子またはメチル基であり、Ｙ３、Ｙ４およびＹ５は、それぞれ独立して、酸素原子または－ＮＨ－である］
で表される繰り返し単位をさらに含む、ヒアルロン酸誘導体が提供される。本発明の１つの態様において、上記式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体が提供され、さらに別の態様において、上記式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸誘導体が提供される。当該ヒアルロン酸誘導体は、血中滞留性向上の観点からは、好ましくは重量平均分子量が２７ｋＤａ以下、より好ましくは１８ｋＤａ以下の、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として製造されうる。原料の重量平均分子量の下限は５ｋＤａ以上あればよい。当該分子量の好ましい範囲は５～２７ｋＤａであり、さらに好ましくは５～１８ｋＤａである。
　存在する二糖の繰り返し単位に対する式（ＩＩ）で表される繰り返し単位の割合は、５０％以下であるのが好ましく、３０％以下がさらに好ましく、２０％以下がさらに好ましい。その割合の下限は０％以上であればよい。ここでは、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシ基の５０％以上が、－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１およびＸｂなどで修飾されているが、前記重量平均分子量のヒアルロン酸またはその誘導体を原料に用い、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位の割合を前記の通りとした場合、前記疎水性基でカルボキシ基の一部または大部分が修飾されることで、前記疎水性基以外の基のみでカルボキシ基が修飾された場合と比較して、血中滞留性が顕著に向上するという性質を有する。その、存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率は、２～７０％が好ましく、５～３５％がさらに好ましく、１５～２２％がさらに好ましい。
　Ｘｂは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。例えば、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２（第１アミン）およびＨ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）２－ＮＨ２（第２アミン）である２種類のアミンを、同時に、または相前後してグルクロン酸部分のカルボキシ基と縮合させることができる。第１アミンにより二重結合が導入されたヒアルロン酸誘導体は、アルキレン基の両端にメルカプト基を有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ）との架橋反応に供することができる。架橋反応を行うことで、本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化することができる。また、ジアミンである第２アミンをグルクロン酸部分のカルボキシ基と縮合させることにより、もう一方の末端アミノ基を、薬物を結合させるために利用してもよい。この時、利用されることなく残存したアミノ基は、例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで処理するか、マレイン酸、グルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシ基に戻してトータル電荷をアニオン性にすることもできる。
　あるいは、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２（第１アミン）およびＨ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨ（第２アミン）である２種類のアミンを、同時に、または相前後してグルクロン酸部分のカルボキシ基と縮合させてもよい。第１アミンにより導入される二重結合を前記と同様に架橋反応に供することができ、また、第２アミンにより修飾されたヒアルロン酸誘導体には血中滞留性の向上を期待することができる。　架橋反応の他の事例としては、アミノ基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＡＭ）と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤（例えば、ビス［スルフォスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコール－ビス［スルフォスクシンイミジル］スクシネート（Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳ）、ジメチルアジピミデート塩酸塩（ＤＭＡ）など）とので縮合反応による架橋；ＨＡ－ＡＭと、Ｃ２－２０アルキレンの両端にホルミル基を有する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）との架橋；ホルミル基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＡＬＤ）と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にアミノ基を有する架橋剤（例えば、エチレンジアミン（ＥＤＡ）など）との架橋；メルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ－ＳＨ）の酸化条件下（例えば、テトラチオネートナトリウム（ＳＴＴ）存在下など）での酸化反応による架橋；ＨＡ－ＳＨと、Ｃ２－２０アルキレンの両端にマレイミド（ＭＡＬ）基やメタクリロイル基などの不飽和結合を有する架橋剤（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン（ＢＭＢ）、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）など）とのマイケル付加反応による架橋；アルクロイル基およびメタクリロイル基などの不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体と各種重合開始剤（例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９など）とのラジカル重合による架橋；ジアミン化合物（例えば、ＥＤＡ、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）など）共存下、縮合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ-ＭＭ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）など）による架橋が挙げられる。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルが有する化学架橋構造は、架橋剤、ポリマーに導入した架橋形成が可能な基、結合様式などに、生体内で分解するものを用いてもよい。特に限定されないが、例えば架橋反応に供する基として、エステル結合およびメタクリロイル基を有する基を用いてもよい。また、架橋剤として、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳやＥＤＭＡなど、エステル結合を有する化合物、または生体内の酵素によって分解されるペプチドスペーサーを有する化合物を用いてもよい。また、メルカプト基の酸化によって形成するジスルフィド結合によって架橋したゲルは、ジスルフィド交換反応や還元反応によって生体で分解される。分解性の化学架橋構造を有することで、本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルの生体内での分解速度を制御することができ、これによって薬物の放出速度も制御することが可能である。
　Ｘｂの好ましい例としては、－ＮＲｉ－（ＣＨ２）ｎ２－ＯＨ（式中、Ｒｉは、水素原子であり；ｎ２は２～１０から選択される整数である）が挙げられ、さらに好ましくは－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨおよび－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＯＨであるのがが挙げられる。
　式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位からなるヒアルロン酸誘導体は、ＷＯ２００６／０２８１１０に開示されている。また、ヒアルロン酸のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を－ＣＯＸａに変換する方法は、当該公報に記載されており、または周知の縮合反応を利用して変換することもできる。
　本発明の別の側面において、式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｘｃは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋、から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンであり；
　Ｒ１ｃは、
　－ＣＯ－Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２、
　－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ２２－Ｙ１、
　－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）－Ｒ２２－Ｙ１、
　－ＣＯＮＨ－Ｒ２３－Ｙ１、
　－ＣＯ－Ｒ２３－Ｙ１、
　－ＣＯＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－（Ｘ２１－ＣＨ２ＣＨ２）ｎ３－Ｙ１、および
　－ＣＯ－ＣＨ２ＣＨ２－（Ｘ２１－ＣＨ２ＣＨ２）ｎ４－Ｙ１から選択され、
　Ｘ２１は、ＯおよびＳから選択され：
　ｎ３およびｎ４は、それぞれ１～５０の整数を表し；
　Ｙ１は、アミノ、メルカプト、ホルミル、－Ｘ１４－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１８）＝ＣＨ２から選択され、
　Ｒ２１は、水素原子またはＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒ２２およびＲ２３は、２価のＣ２－５０炭化水素基または２価のＣ２－５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２－５０炭化水素基は、１～１０個の－Ｏ－が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分が形成されていてもよく；
　Ｘ１４は、ＯおよびＮ（Ｒ１９）から選択され；
　Ｒ１８は水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
　Ｒ１９は水素原子またはＣ１－６アルキルである］
で表される繰り返し単位をさらに含む、本明細書で定義したヒアルロン酸誘導体が提供される。当該側面の１つの態様において、当該ヒアルロン酸誘導体は、上記式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＶ）で表される繰り返し単位のみから；または上記式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
　本発明のさらに別の側面によれば、本発明のヒアルロン酸誘導体は、好ましくは重量平均分子量２７ｋＤａ以下の、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として合成される。当該側面の１つの態様において、式（Ｉ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位および式（ＩＶ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体；または式（Ｉ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位および式（ＩＶ）で表される繰り返し単位から実質的になるのヒアルロン酸誘導体が提供される。
　Ｒ１ｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシの置換基であり、主に架橋性の基である。具体例としては、－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＯＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＯＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２などが挙げられる。存在する二糖の繰り返し単位に対する式（ＩＶ）で表される繰り返し単位の割合は、１０～４０％であるのが好ましい。式（ＩＶ）で表される繰り返し単位からなるヒアルロン酸誘導体はＷＯ２００８／１３６５３６に開示されており、ヒアルロン酸のＮ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシ（－ＯＨ）の－ＯＲ１ｃへの変換は、ＷＯ２００８／１３６５３６（特許文献８）の実施例１０および１４ならびにそれが引用する特開２００５－２９８６４４およびＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　第６巻、第１８２９－１８３４頁、２００５年（非特許文献９）を参考にして行うことができる。また、周知のエステル化反応およびエーテル化反応により変換することもできる。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体を担体として含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物に含まれる活性成分は特に限定されず、例えば、タンパク質および／またはペプチド、多糖類、核酸類、低分子化合物などであってもよい。当該側面の一つの態様において、薬理活性を有するタンパク質またはペプチドと共に、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体を担体として含む医薬組成物が提供される。本発明のヒアルロン酸誘導体は、水中で薬物と複合体を形成することを特徴とする。形成されたヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体は分散性微粒子であっても沈殿物であってもよい。　
　分散性微粒子は、全身投与型、特に静脈内投与型の血中徐放製剤やおよび目的組織または細胞へのターゲティング製剤の基材として用いることができ、沈殿物は局所投与型の徐放製剤の基材として用いることができる。
　本発明の別の側面によれば、本明細書で定義したヒアルロン酸誘導体であって、水溶液中において前記疎水性基の疎水性相互作用により自発的会合することで系中に存在する薬物と複合体を形成する前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。当該側面の一つの態様において、薬物はタンパク質またはペプチドである。
　本発明の別の側面によれば、本明細書で定義したヒアルロン酸誘導体に１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体が提供される。当該側面の一つの態様において、薬物はタンパク質またはペプチド、あるいは核酸類または低分子化合物である。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書で定義したヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体を水中で形成する工程を含む、医薬組成物の製造方法が提供される。当該側面の一つの態様によれば、以下の工程：
（ａ）本明細書で定義した疎水性基を有するヒアルロン酸誘導体を製造する工程；
（ｂ）得られたヒアルロン酸誘導体を水相に溶解または分散させる工程；
（ｃ）得られたヒアルロン酸誘導体水溶液または分散液に薬物を加え、薬物担持微粒子を形成させる工程；
　を含む、医薬組成物の製造方法が提供される。当該医薬組成物が沈殿物の場合は、さらに以下の工程：
（ｄ）塩物質を加え、薬物担持微粒子を沈殿させる工程
を加えてもよい。上記各工程は、Ｗ／Ｏエマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。工程（ｃ）において水相中で形成した微粒子または工程（ｄ）において得られた沈殿を乾燥して（例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥などによる）固化し、さらに必要に応じて粉砕、乾燥、洗浄工程などを行って、固体として目的の医薬組成物を得てもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を用いることで、薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドをその生物活性を維持したまま多量に封入した徐放性製剤を提供することが可能となる。また、ヒアルロン酸誘導体は安全性の面においても優れており、医薬製剤の担体として特に優れている。また、薬物と本発明のヒアルロン酸誘導体とを結合させたコンジュゲートにすることで、薬物の血中滞留性を向上させることができる。
図１は、実施例１－１で調製したコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図２は、実施例１－２で調製したコレステリル　２－アミノエチルカーバメート塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図３は、実施例１－３で調製したコレステリル　８－アミノオクチルカーバメート塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図４は、実施例１－４で調製したコレステリル　１２－アミノドデシルカーバメート塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図５は、実施例２－２で調製した、５０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とするヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図６は、実施例２－３－１で調製したコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図７は、実施例２－３－２で調製したコレステリル　２－アミノエチルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図８は、実施例２－３－３で調製したコレステリル　８－アミノオクチルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ８－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図９は、実施例２－３－４で調製したコレステリル　１２－アミノドデシルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図１０－１は、実施例２－３－１で得られたＨＡ誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体形成を観察した結果（実施例３）を表すチャートの一例である。 図１０－２は、実施例２－３－２で得られたＨＡ誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体形成を観察した結果（実施例３）を表すチャートの一例である。 図１０－３は、実施例２－３－４で得られたＨＡ誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体形成を観察した結果（実施例３）を表すチャートの一例である。 図１０－４は、実施例２－３－３で得られたＨＡ誘導体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体形成を観察した結果（実施例３）を表すチャートの一例である。 図１１－１は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）を添加して、実施例２－３－１で得られた試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体の崩壊を観察した結果（実施例４）を表すチャートの一例である。 図１１－２は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）を添加して、実施例２－３－２で得られた試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体の崩壊を観察した結果（実施例４）を表すチャートの一例である。 図１１－３は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）を添加して、実施例２－３－４で得られた試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体の崩壊を観察した結果（実施例４）を表すチャートの一例である。 図１１－４は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）を添加して、実施例２－３－３で得られた試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体の崩壊を観察した結果（実施例４）を表すチャートの一例である。 図１２は、実施例５および６で行ったサイズ排除クロマトグラフィーの結果を表すチャートの一例である。 図１３は、実施例７－１で算出した溶液中のＨＡ誘導体の残存率をＨＡ誘導体の疎水性基導入率に対してプロットしたグラフである。 図１４は、実施例７－２で算出した溶液中のＨＡ誘導体の残存率をＮａＣｌ濃度に対してプロットしたグラフである。 図１５は、実施例８において測定したサイズ排除クロマトグラフィーのチャートである。 図１６は、実施例９－１で調製したコレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－ＥＯ２）の塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図１７は、実施例９－２で調製したコレステリル　８－アミノ－３、６－ジオキサオクチルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＯ２－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図１８は、実施例１０で調製した２－アミノエチル　コレステリル　ジスルフィドを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＳＳ－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図１９は、実施例１１で調製したコレステリル　２－アミノエチルカーバメートおよびアミノエチルメタクリレートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図２０は、実施例１３で調製した５－アミノメチルフルオレセイン、コレステリル　６－アミノヘプチルカーバメートおよびエタノールアミンを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 図２１は、ＨＡ誘導体（５０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ）の粒子サイズを、動的光散乱法（ＤＬＳ）にて測定した結果を表すチャートの一例である。 図２２－１は、実施例１８－１におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体とリゾチームとの複合体調製の結果を示すグラフであり、縦軸は（複合体中のＬｙｓ重量／ＨＡ誘導体重量）×１００の値（複合化％）、横軸はユニット当たりの疎水基導入率（％）を示す。 図２２－２は、実施例１８－２におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体とエキセンディン－４との複合体調製の結果を示すグラフであり、縦軸は（複合体中のＥｘ－４重量／ＨＡ誘導体重量）×１００の値（複合化％）、横軸はユニット当たりの疎水基導入率（％）を示す。 図２２－３は、実施例１８－３におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体とヒト成長ホルモンとの複合体調製の結果を示すグラフであり、縦軸は（複合体中のｈＧＨ重量／ＨＡ誘導体重量）×１００の値（複合化％）、横軸はユニット当たりの疎水基導入率（％）を示す。 図２２－４は、実施例１８－４におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体とエリスロポエチンとの複合体調製の結果を示すグラフであり、縦軸は（複合体中のＥＰＯ重量／ＨＡ誘導体重量）×１００の値（複合化％）、横軸はユニット当たりの疎水基導入率（％）を示す。 図２３－１は、ウシ血清アルブミン（２０ｍｇ／ｍＬ）溶液中におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体からのエリスロポエチンの放出を示すグラフの一例であり、縦軸はリリースされたエリスロポエチンの量、横軸は経過時間を示す。 図２３－２は、濃度の異なるウシ血清アルブミン溶液中におけるコレステリル基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌ－７％）からのエリスロポエチンの放出を示すグラフの一例であり、縦軸はリリースされたエリスロポエチンの量、横軸は経過時間を示す。 図２４は、ラットにおける皮下ならびに尾静脈投与時のヒト成長ホルモンの血漿中濃度推移の結果を示すグラフの一例である。 図２５は、実施例２０－４で使用したｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体の製剤サンプルの写真である。 図２６－１は、表２３－１のサンプル２０－１～サンプル２０－４のｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体投与時のｈＧＨの９６時間までの血漿中濃度推移と、比較例１のｈＧＨ溶液の血漿中濃度推移を併せて示すグラフである。 図２６－２は、表２３－１のサンプル２０－１～サンプル２０－４のｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体投与時のｈＧＨの２４時間までの血漿中濃度推移と、比較例１のｈＧＨ溶液の血漿中濃度推移を併せて示すグラフである。 図２７－１は、表２３－１のサンプル２０－４～サンプル２０－６のｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体投与時のｈＧＨの９６時間までの血漿中濃度推移と、比較例１のｈＧＨ溶液の血漿中濃度推移を併せて示すグラフである。 図２７－２は、表２３－１のサンプル２０－４～サンプル２０－６のｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体投与時のｈＧＨの２４時間までの血漿中濃度推移と、比較例１のｈＧＨ溶液の血漿中濃度推移を併せて示すグラフである。 図２８は、表２３－１のサンプル２０－１～サンプル２０－６のｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体と、比較例１のｈＧＨ溶液の平均滞留時間（ＭＲＴ）を示すグラフである。 図２９は、比較例２－１～２－３で調製した蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３０－１は、実施例１２ならびに実施例１５で調製した蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３０－２は、表２８の血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞）と分子量の関係を示すグラフである。縦軸はＡＵＣ∞、横軸は原料のＨＡ－Ｎａの分子量である。 図３１は、表２９のサンプル２１－２、２１－８および２１－９の蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３２－１は、表３１のサンプル２１－２および２１－１０の蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３２－２は、表３１のサンプル２１－５、２１－１１および２１－１２の蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３３は、表３３のサンプル２１－１３の蛍光標識ＨＡ誘導体を投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３４－１は、表３５の蛍光標識ＨＡ誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ）を皮下投与および静脈内投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３４－２は、表３５の蛍光標識ＨＡ誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％／Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ－９５％）を皮下投与および静脈内投与したラットにおける、蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３５－１は、表３７の蛍光標識ＨＡ誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ）を静脈内投与したラットでの蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移において、ヒアルロン酸ナトリウムの先行投与の影響を確認した実験結果を示すグラフである。 図３５－２は、表３４の蛍光標識ＨＡ誘導体（５０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２７％／ＦＬ）を皮下投与および静脈内投与したラットでの蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度の推移において、ヒアルロン酸ナトリウムの先行投与の影響を確認した実験結果を示すグラフである。 図３６－１は、実施例２１－１での測定後のサンプル２１－２（５分から２時間までの試料）についてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３６－２は、実施例２１－１での測定後のサンプル２１－２（１日から4日までの試料）についてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３７－１は、比較例２－４の薬物動態試験で用いたラット（比較サンプル２－２）から採取した尿サンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３７－２は、実施例２１－１の薬物動態試験で用いたラット（サンプル２１－２）から採取した尿サンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３７－３は、実施例２１－１の薬物動態試験で用いたラット（サンプル２１－５）から採取した尿サンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３７－４は、実施例２１－１の薬物動態試験で用いたラット（サンプル２１－６）から採取した尿サンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３７－５は、実施例２１－１の薬物動態試験で用いたラット（サンプル２１－７）から採取した尿サンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示すクロマトグラムである。 図３８は、実施例２２で算出した溶液中のＨＡ誘導体の残存率をＨＡ誘導体の疎水性基導入率に対してプロットしたグラフである。 図３９は、実施例２－３ならびに実施例１４で調製したＨＡ誘導体とドキソルビシンを混合し、限外ろ過したろ液を逆相ロマトグラフィーに供してフリーのドキソルビシン量を観察した結果（実施例２３）を表すチャートである。 図４０は、実施例１６で調製したＨｉｌｙｔｅ標識ＨＡ誘導体ならびに実施例２４で調製した５０ｋ　ＨＡ－Ｈｉｌｙｔｅをゼノグラフトマウスに投与し、腫瘍への集積をｉｎ ｖｉｖｏ　イメージング装置にて評価した写真である。 図４１は、Ｈｉｌｙｔｅ標識ＨＡ誘導体ならびに５０ｋ　ＨＡ－Ｈｉｌｙｔｅを投与したゼノグラフトマウスの腫瘍の蛍光強度をプロットしたグラフである。 図４２は、実施例１１で調製したＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡをＤＴＴにて架橋させ、ゲル化した状態を撮影した写真である。
　以下、本発明を更に具体的に説明する。
　本明細書で言及する用語「ステリル基」とは、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロンなどが挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基などが挙げられ、好ましくはコレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が挙げられる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－２０アルキル」とは、炭素数１～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチルなどの「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、および２－エチルブチルなどが含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１～１２のＣ１－１２アルキル、炭素数が１～６のＣ１－６アルキル基も含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルキルカルボニル」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓ－ブチルカルボニル、ｉ－ブチルカルボニル、ｔ－ブチルカルボニルなどの「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書で言及する用語「アミノＣ２－２０アルキル」は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。
　本明細書で言及する用語「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－３０アルキレン」とは、炭素数２～３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレンなどを含み、Ｃ２－２０アルキレン、Ｃ２－８アルキレン、基－（ＣＨ２）ｎ－（ここで、ｎは２～３０、好ましくは２～２０、さらに好ましくは２～１５）を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－３０アルキレン」とは、炭素数１～５の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレンなどを含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２～８の直鎖状または分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイルおよびオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルなどを含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体およびそれらの混合物も含まれる。
　本明細書で言及する「２価のＣ２－５０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数２～５０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が挙げられ、当該基は２価の芳香族環であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
　本明細書で言及する「２価のＣ２－５０ポリアルキレンオキシ」は特には限定されず、繰り返し単位のアルキレン基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。「２価のＣ２－５０ポリアルキレンオキシ」の例には、２価のＣ２－５０ポリエチレンオキシ基、Ｃ３－４８ポリプロピレンオキシ基、Ｃ３－４８ポリブチレンオキシ基などが含まれる。当該基は、酸素原子または炭素原子を介して他の基と連結していてよく、例えばＣ２－５０ポリエチレンオキシ基には、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１－２５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１－２５－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－２５－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１－２４－（ＣＨ２ＣＨ２）－などが含まれる。
　本明細書で言及する用語「塩物質」とは、水に可溶な無機物であれば特に限定されず、例えば、塩化カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩、硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム等のアルミニウム塩、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム等のカリウム塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、炭酸リチウム等のリチウム塩が挙げられ、好ましくは、塩化ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を製造するための原料としては、ヒアルロン酸またはその塩もしくはその誘導体を使用することができる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。ＨＡまたはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社等から）入手することも可能である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を期待する場合には粘度および分子量の高いヒアルロン酸が好ましく、最終剤形が溶液製剤の場合、スムーズな投与のため粘度および分子量の低いヒアルロン酸が好ましい。従って、ヒアルロン酸誘導体の分子量は、１ｋＤａ～１，０００ｋＤａが好ましく、１０ｋＤａ～３００ｋＤａがさらに好ましい。目的物の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。前述した、沈殿形成および安定な分散という観点で好ましい本発明のヒアルロン酸誘導体の原料の分子量は、１０ｋＤａ～５００ｋＤａであり、さらに好ましくは２７ｋＤａ～２３０ｋＤａであり、さらに好ましくは５０ｋＤａ～２３０ｋＤａであり、さらに好ましくは５０ｋＤａ～９９ｋＤａである。血中滞留性向上の観点で好ましい本発明のヒアルロン酸誘導体の原料の分子量は、５ｋＤａ～２７ｋＤａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ～１８ｋＤａである。ゲル化の観点で好ましい本発明のヒアルロン酸誘導体の原料の分子量は、５ｋＤａ～３００ｋＤａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ～５０ｋＤａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ～２７ｋＤａである。
　なお、一般的に、ヒアルロン酸およびその誘導体は単一品として得ることが難しいため、その分子量は、数平均分子量または重量平均分子量として算出する。本発明においては、重量平均分子量として算出している。重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４－０６－１５３３１０－Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。分子量を明示して市販されているヒアルロン酸およびその誘導体を使用する場合は、その明示された数値を分子量とすることもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位を構成する二糖の一つであるグルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、疎水性基を導入している。ヒアルロン酸誘導体の修飾の程度を調節することにより、当該誘導体を用いて製造する製剤の体内動態を制御することも可能である。
　ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基修飾率が低い場合、例えば、存在するカルボキシ基のうちの５０％以下が修飾されている場合、炎症部位や腫瘍部位に大量に発現しているＣＤ４４を始めとするヒアルロン酸レセプターや、ヒアルロン酸の主な代謝系である肝臓、リンパ系へのターゲティング効果を期待できる。例えば、変形性関節症やリウマチ患者の炎症を起こした滑膜細胞へのターゲッティング、レセプター依存型のエンドサイトーシスによる細胞内への取り込み、細胞内での薬物放出による炎症治癒が期待できる。
　また、ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基修飾率が高ければ、ヒアルロン酸レセプターへの結合が抑制され、当該ヒアルロン酸誘導体は体内でステルス効果をもつ滞留性の長い薬物担体となる。この場合、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）を利用した腫瘍細胞へのターゲッティング効果も期待できる。さらにヒアルロン酸誘導体にターゲット素子を導入することにより、各臓器ならびに細胞へターゲッティングすることができる。ターゲット素子としては、例えば、標的組織特異的なペプチド、抗体、断片化抗体、アプタマー、がん細胞に対するＲＧＤペプチド、葉酸、アニサミド、トランスフェリン、肝臓に対するガラクトース、トコフェロールなどがある。
　なお、ゲル化する場合は、ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基修飾率は、低くても、高くてもよい。
　ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基の疎水性基による修飾率、すなわち疎水性基の導入率は、薬物、好ましくはタンパク質との複合体形成の観点では、２～６０％が好ましく、さらに２～５０％、さらに２～４０％、さらに５～２０％、さらに７～１５％が好ましい。前述の沈殿形成の観点では、７～１５％が好ましく、安定な分散という観点では、１８～４２％が好ましい。血中滞留性向上の観点では、２～５０％が好ましく、８～３５％がさらに好ましく、１５～２２％がさらに好ましい。ゲル化の観点では、２～３０％が好ましく、２～２２％がさらに好ましく、５～２２％がさらに好ましく、７～２２％がさらに好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体の原料の分子量と疎水性基の導入率の組み合わせとしては、前述の沈殿形成の観点では、２７ｋＤａ～２３０ｋＤａかつ７～１５％が好ましく、５０ｋＤａ～２３０ｋＤａかつ７～１５％がさらに好ましく、５０ｋＤａ～９９ｋＤａかつ７～１５％がさらに好ましい。安定な分散という観点では、２７ｋＤａ～２３０ｋＤａかつ１８～４２％が好ましく、５０ｋＤａ～２３０ｋＤａかつ１８～４２％がさらに好ましく、５０ｋＤａ～９９ｋＤａかつ１８～４２％がさらに好ましい。血中滞留性向上の観点では、５ｋＤａ～２７ｋＤａかつ２～５０％が好ましく、５ｋＤａ～２７ｋＤａかつ８～３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ～１８ｋＤａかつ８～３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ～１８ｋＤａかつ８～３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ～１８ｋＤａかつ１５～２２％がさらに好ましい。ゲル化の観点では、５ｋＤａ～３００ｋＤａかつ２～３０％が好ましく、５ｋＤａ～５０ｋＤａかつ２～２２％がさらに好ましく、５ｋＤａ～２７ｋＤａかつ２～２２％がさらに好ましく、５ｋＤａ～２７ｋＤａかつ７～２２％がさらに好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を製造するために、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し疎水性基を導入する方法としては、例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体、好ましくは、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、ＮＨＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ、および－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、ＺおよびＲは本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンとを反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水および有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシとが、分子内もしくは分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　疎水性基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。例えば、疎水性基の導入率が１８～４２％の時は、疎水性基の導入後に形成する微粒子の沈殿の抑制および溶媒中での分散性の観点から、反応溶媒としてＤＭＳＯのみを使用するのが好ましい。
　あるいは、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＲ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ、
　－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ、
　－ＣＯＺ－ＯＨ　＋　ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、およびＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体または反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法を挙げることもできる。
　さらに、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法を挙げることもできる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法を挙げることもできる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、式（Ｉ）で表される繰り返し単位、および式（ＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１～９９．５％、好ましくは１０～４０％を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；および
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２～１０の整数、ｑは１～２００の整数、ｒは１～３の整数を、それぞれ表す）から選択される］
に変換することで、分子内あるいは他分子を含めた分子間で架橋させてゲル化することもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を、化学架橋によりゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、架橋方法、ポリマー濃度、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間などがある。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度および架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における架橋剤濃度は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような濃度で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル基を導入したポリマーをＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１～１：３が好ましく、２：１～１：２が特に好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ポリマーおよび架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中除放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油などが挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中など脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、およびその後に、架橋反応を停止する操作および残存した架橋性官能基を失活もしくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤などは、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応などの観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水などで洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイル基が残存する場合は、過剰のメルカプトエタノールなどを添加し、メタクリロイル基を失活させた後、過剰の水などで余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプト基が残存する場合は、過剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸などを添加し、メルカプト基を失活させた後、過剰の水などで余剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸を洗浄することで除去してもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）およびインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、およびＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ－Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミルおよびリンレックスミルが好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力などは本発明のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに薬物を封入することで医薬品組成物とすることができる。
　薬物封入方法として、あらかじめ架橋されたヒアルロン酸誘導体ゲルに薬物溶液を添加する方法が挙げられる。当該方法では、まず、膨潤したゲル内部へ拡散によって薬物が吸収され、吸収された薬物は、ヒアルロン酸誘導体ゲルの疎水性相互作用による物理架橋ドメインに保持されることによって薬物が封入される。特に限定されないが、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、薬物が安定でかつ高収率で封入されるように適宜選択してよい。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体ゲルの膨潤度や密度が変化し、薬物の電離状態なども変わるため、その組み合わせによって適宜、適した条件を使用すればよい。薬物の封入を低塩濃度下で行うことで、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシ基同士の静電反発を利用し、ゲル密度を減少させ、薬物封入量を増加させることや、より高分子量の薬物を封入することができる。薬物封入後、塩濃度を上昇させることにより静電反発を弱め、ゲル密度を上昇させ、ゲル網目を薬物サイズより小さくすることにより、強固に薬物を保持し、放出を遅らせることが可能となる。この際、塩濃度を生理塩濃度とすることもできる。
　また、薬物封入方法として、本発明のヒアルロン酸誘導体に薬物を複合化させた後、架橋することでゲル化させる方法が挙げられる。特に限定されないが、複合化の際の溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加、前記親水性多糖類誘導体濃度、薬物濃度、ＨＰと薬物の比率などの条件は、薬物が安定でかつ高収率でナノゲルと複合化されるように適宜選択してもよい。複合化されなかったフリーの薬物は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去すればよい。架橋の際は、封入された薬物が変性しない架橋条件を用いることが好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに封入された薬物は、薬物のゲル中における単純拡散、ヒアルロン酸誘導体のゲルの分解、および生体成分と薬物の置換によって放出される。薬物の拡散によって薬物放出がなされる場合には、ゲルの架橋密度、および架橋ドメインの量やその疎水性の強さによってその速度を制御することが可能である。ゲルの分解とは、例えば、化学架橋ドメインの分解、ヒアルロン酸誘導体の骨格の分解などがある。これらの分解により、架橋密度の低下（膨潤率の増大）が生じる。架橋密度が低下すると、ゲル中の薬物の拡散速度が加速されるため放出が促進され、また結合が切れることによっても放出が促進される。このため、化学架橋ドメインの分解性、ポリマー骨格の分解性、スペーサーの分解性などを制御することによって、薬物放出速度を制御することが可能である。
　生体成分との置換とは、例えば、ゲルを皮下や血中などの生体内に投与した場合、アルブミンなどの血漿タンパク質や脂質などが存在し、これらがゲル中に浸潤、封入されている薬物と置換されることにより薬物が放出される場合を意味する。本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルは、疎水性基同士による物理的な架橋だけでなく、前記の化学架橋により、生体成分の浸潤に伴う薬物との置換を抑制することが可能である。生体成分の浸潤は、ゲルの架橋密度、ゲル中の電荷などによってその速度を制御することが可能である。なお、前記の架橋によるゲルの形成後に薬物溶液を添加して薬物封入をする場合は、封入時に薬物はゲル中に吸収されやすく、生体内では生体成分の浸潤が抑制されるように、その封入条件を適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、タンパク質を封入する場合、その等電点付近で封入工程行うことで、ヒアルロン酸誘導体と薬物の静電反発を抑制することができる。また、ヒアルロン酸に含まれるグルクロン酸由来のカルボン酸のｐＫａ（およそ４．０）以下で封入工程を行うことで、ゲルが持つ負電荷を弱めることができるので、その条件で負電荷に帯電しているタンパク質との静電反発が抑制され、封入効率の向上が可能となる。また、例えば生体内よりも低い塩濃度において封入工程を行うことで、生体内よりもゲルの膨潤率が高くなるため、封入が容易となる。
　さらに、本発明の疎水性基と架橋性官能基を同時に導入したヒアルロン酸誘導体の化学架橋によるゲル化を、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の共存下で、行うことができる。具体的には、疎水性基および不飽和結合を有する官能基を導入した本発明のヒアルロン酸誘導体と、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を混合し、架橋することにより、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を物理的に封入した、ヒアルロン酸誘導体ゲルが調製できる。ＨＡ－ＡＭ、ＨＡ－ＡＬＤ、ＨＡ－ＳＨを用いても同様に行える。
　疎水性基を有する親水性多糖類誘導体とは、親水性多糖類およびその誘導体に、多糖１分子あたり少なくとも１分子以上の疎水性基を導入して得ることができる親水性多糖類である。親水性多糖類としては特に限定されないが、好ましくはプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストリンであり、これらは市販されているか、文献記載の方法に従い、種々の平均分子量を有するものを入手することもできる。親水性多糖類として特に好ましいものは、プルラン、ヒアルロン酸、デキストリンである。デキストリンとしてはクラスターデキストリン（登録商標）が好ましい。クラスターデキストリン（登録商標）は、江崎グリコ株式会社から販売されているものを購入して使用することができる。疎水性基としては特に限定されないが、好ましくはＣ８－５０の炭化水素基、ステリル基、ポリ乳酸（ＰＬＡ）基、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）基などの基またはこれらの基を含む基であり、特に好ましくはコレステリル基を含む基、Ｃ８－３０の直鎖または分岐アルキルまたは当該基を含む基である。疎水性基はスペーサーを介して導入されていてもよい。
　疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は各種公知の方法により製造することができる。また、親水性多糖類としてプルランのヒドロキシ基に、疎水性基としてＮ－［６－（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル］カルバモイル基を導入した水親水性多糖類誘導体（以下、「コレステロールプルラン」、「ＣＨＰ」とも称する）は、市販のものを購入して（例えば、日本油脂株式会社）入手することも可能である。疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、水溶液中において疎水性相互作用により数分子が自発的に会合することでナノサイズ（１～１，０００ｎｍ）のゲル構造を有する微粒子（ナノゲル）を形成することなどにより、疎水性薬物や薬効を有するタンパク質やペプチドと複合化することがきるものである。
　本発明に用いられる疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の分子量は、特に限定されないが、好ましくは１ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ～３００ｋＤａである。また前記親水性多糖類誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。
　さらに、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体に含まれるヒドロキシ基もまた架橋形成が可能な基として利用することができる。すなわち、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体のヒドロキシ基を、特定の架橋剤、例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、カルボジイミド、またはＣ２－２０アルキレンの両端にグリシジルエーテル基を有する架橋剤などによって架橋することができる。
　ヒアルロン酸のカルボキシ基に導入される置換基の種類が複数のときは、それらの置換基は、同時導入しても、順次に導入してもよい。
　　本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中において前記疎水性基の疎水性相互作用により自発的に会合することでナノスケールの微粒子を形成するという特性を有する。望まれるドラッグデリバリーシステムの構築のために、本発明のヒアルロン酸誘導体により形成されるナノ微粒子は非常に有力な手段の一つであり、内部に形成される疎水ドメインに活性成分であるタンパク質、ペプチド、低分子化合物を保持したまま目的の部位に送達するカプセルとして使用することができる。また、薬物をコンジュゲートすることにより目的の部位に薬物を送達することができる。
　ナノスケールの微粒子は、全身投与、特に静脈内投与が可能であり、封入（複合化）した薬物を血中で徐放する血中薬物徐放、また、標的臓器および細胞へ薬物を選択的にデリバリーさせる、ターゲティング用の担体として使用できる。ターゲティング用の担体として使用する場合、ＨＡ誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基を高度に修飾しない場合（例えば修飾率５４％以下）、前述の様にヒアルロン酸レセプター、ＣＤ４４やＲＨＡＭＭ、ＬＹＶＥ－１、ＨＡＲＥをターゲットとした薬物のデリバリーが可能となる。特に、ＣＤ４４やＲＨＡＭＭをターゲットとすることで、腫瘍へのターゲティングが可能となる。また、ＨＡ誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基を高度に修飾し（例えば修飾率５５％以上）、さらに前述の様なターゲット素子をくわえることにより各臓器ならびに細胞へターゲッティングすることもできる。血中での薬物の保持を強固にするために、さらにヒアルロン酸誘導体を化学架橋させることもできる。
　なお、高度に修飾されていないＨＡ誘導体を、血中薬物徐放やターゲティング用の担体として用いる場合、肝臓などの類洞内皮に存在するＨＡＲＥレセプターにより瞬時に取り込まれ、代謝されることが知られており、急速に血中から消失するという問題点がある。しかし、本発明のＨＡ誘導体の血中滞留性には分子量依存性があり、低分子量のＨＡ（５ｋＤａ～２７ｋＤａ）を原料としたＨＡ誘導体は、良好な血中滞留性能を有する、血中薬物徐放およびターゲティング用の担体として用いることができる。
　また、ヒアルロン酸と同様直鎖状のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、分子量４０ｋＤａ以下で腎排泄を受けることが報告されている（Europian Journal of Cancer. 第31巻、第766-770頁、1995年）など、ある一定の大きさ以下の分子は、腎排泄を受けることが知られている。よって、同程度以下の分子量のヒアルロン酸ならびにヒアルロン酸誘導体も腎排泄され、瞬時に血中から消失する懸念がある。しかし、本発明の疎水性基を導入したＨＡ誘導体は、カルボキシ基の修飾率に関わらず、ＰＥＧが腎排泄を受ける分子量以下であっても、血中滞留性が良好であるため、血中薬物徐放およびターゲティング用の担体として用いることができる。
　ヒアルロン酸誘導体による微粒子は、水溶液中で自己会合により形成するので、固体のヒアルロン酸誘導体をから水または塩水溶液に溶解することによって形成することができる。また、別の方法では、他の溶媒（例えばＤＭＳＯ）に溶解したあと、水、または塩水溶液に置換することによっても微粒子を形成することができる。形成した微粒子のサイズを均一化するために超音波処理を行ってもよい。
　ヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率が高くなるに従って、水への溶解性が減少する。そのため水溶液中で分散性の微粒子を形成させるためには、共有結合により導入する疎水性基は８０％以下、このましくは６０％以下になるように調製されたヒアルロン酸誘導体を用いることがこのましい。
　ヒアルロン酸誘導体は解離基であるカルボキシ基を有するため、系中のイオン強度が高いほど、溶解性が低くなる。したがって、導入率をコントロールすることにより、低塩濃度下あるいは無塩条件下では溶解し、生理食塩濃度にて凝集・沈殿するヒアルロン酸誘導体の調製が可能であり、これは、皮下での徐放製剤の基材となり得る。また、生理塩濃度下においても安定な微粒子を形成する程度の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、全身投与型の薬物担体となり得る。
　本発明のＨＡ誘導体は、生理塩濃度下中で凝集し沈殿形成する、カルボキシ基への疎水性基の導入範囲を持つことが示され、また、タンパク質（エリスロポエチン）を封入（複合化）した状態で沈殿させられることが示された。さらに、ヒト成長ホルモンを封入（複合化）し沈殿させた本発明のヒアルロン酸誘導体からなる医薬品組成物をラットの皮下に投与した場合、徐放効果を示すことが確認された。また、溶液（分散）状態で投与することによっても皮下（生理塩濃度下）で沈殿し、徐放効果を示すことが確認された。
　形成される微粒子の粒子径は特に限定されないが、注射による投与の際にニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。また、静脈投与の場合は、抹消血管を閉塞させないために粒子径５００ｎｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるために１００ｎｍ以下であることが好ましい。
　本発明ヒアルロン酸誘導体は、医薬製剤における薬物担体として使用することができる。本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に薬物と複合体を形成するため、特別な操作を必要とせず、当該ヒアルロン酸誘導体と薬物を水溶液中で混合し、インキュベートすることにより、担体－薬物の複合体を容易に形成することができる。複合体形成の駆動力は、主にヒアルロン酸誘導体の疎水性基と薬物との疎水性相互作用であるが、薬物が塩基性の場合、ヒアルロン酸誘導体のカルボン酸との静電的相互作用が寄与する場合がある。生体塩濃度では、静電的相互作用は弱く、疎水性相互作用は強くなるため、主に疎水性相互作用により複合体が形成すると考えられる。
　上記式（Ｉ）において、基－ＮＲａ－Ｙ－Ｘ１のＹがアルキレンの場合、アルキレンの炭素鎖が長いほど、当該基の疎水性が高くなり、強い疎水性相互作用により強固な微粒子を形成することができる。また、アルキレン基が長いほど分子間での絡み合いが大きくなり、粘度を上昇させることができる。さらに、アルキレン基の長さを変更することで、微粒子のサイズを制御することもできる。
　疎水性基中のリンカー（スペーサー）部分がエステルまたはカーボネートである場合（例えば、Ｘ１が、－ＣＯＯ－Ｒおよび－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒである場合）、生体内においてエステルまたはカーボネートが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによってさらに生分解性が高まり、安全性の面から好ましい。また、腫瘍組織周辺ではｐＨが低下していることが知られており、このようなスペーサーを有している場合、目的薬物を担持した本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体は腫瘍周辺にて崩壊し、薬物を腫瘍周辺で放出することができる。
　特に、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－のようなβチオエステル構造を有するリンカーの場合、わずかなｐＨの低下（ｐＨ６程度）においても分解が促進される。このため、通常のエステルよりもｐＨ応答がシャープである。また、細胞内への薬物の送達を目指す場合、エンドソームにおけるｐＨ低下にも応答し、細胞に取り込まれた後にのみ薬物を放出させることができる。
　リンカー（スペーサー）部分がジスルフィド結合を有する場合（例えば、Ｘ１が－Ｓ－Ｓ－Ｒである場合）、還元状況下においてリンカーが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによって本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体が崩壊する。細胞質は還元環境であることが知られているため、このリンカーを用いたヒアルロン酸誘導体に薬物を封入し、投与することによって、血中では薬物を放出せず、細胞質内でのみ薬物を放出させることができる。
　リンカー（スペーサー）部分が酵素特異的に切断されるペプチドを有する場合（例えば、疎水性基が－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒである場合）、その酵素が存在する部位でのみリンカーが分解し、疎水性基の一部が脱離することによって本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体が崩壊する。たとえば、ライソソームではＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙが特異的に切断される。また、腫瘍や炎症部位で発現しているペプチダーゼで切断されるペプチドがリンカー中に含まれる場合、腫瘍で特異的に薬物を放出することができる。
　リンカー部分が、エステル結合、カーボネート結合、ジスルフィド結合の様な物理化学的切断を受けるリンカーではない場合、製剤中における保存安定性が良好であるという利点がある。
　担体－薬物複合体を形成するときの、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、用いる薬物により適宜変更することができる。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体は密度が変わるとともに、薬物もその電離状態などが変動する。使用する変性剤の例としては、尿素、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。変性剤を添加した場合は、複合体形成後に、過剰の水などで洗浄することにより余剰の変性剤を除去することができる。
　特に限定されないが、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体とタンパク質の複合体を形成する場合、その等電点付近で複合体形成を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質の静電反発を抑制することが可能なため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、グルクロン酸部分のカルボキシ基のｐＫａ（およそ４．０）以下の条件で複合体形成工程を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体が有する負電荷を弱めることができるので、タンパク質が当該条件下で負電荷に帯電している場合には静電反発を抑制することが可能であり、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。さらに、例えば生体内よりも低い塩濃度において複合体形成工程を行うことにより、水溶液中で形成されるヒアルロン酸誘導体の微粒子の密度が低下するため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、その状態で塩濃度を上げることにより微粒子の密度を向上させ、強固にタンパク質を封入することができる。
　ヒアルロン酸誘導体とタンパク質との複合体形成は、タンパク質の分子量にも影響され得る。一般に、タンパク質が低分子量であるほど、当該タンパク質のヒアルロン酸誘導体の微粒子内部へ移行速度は高い。また、疎水性基の導入率に依存する微粒子の密度も、タンパク質との複合体形成の速度、および複合体に含まれるタンパク質の量に影響を与えうる。
　ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体からの生体内における薬物放出は、複合体からの薬物の拡散に加えて、生体成分が薬物と置換することにより促進される。微粒子の密度を増減させて、この拡散や置換を制御することにより、薬物の徐放性を制御することが可能となる。
　生体内には血漿タンパク質や脂質などの生体成分が存在し、ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体を皮下や血中などの生体内に投与した場合、この生体成分が複合体内の薬物と置換することにより薬物が放出される場合がある。当該置換を生じさせる主な生体内タンパク質としてアルブミンが想定される。本発明のヒアルロン酸誘導体の疎水性基の導入率を低くすることにより、グルクロン酸部分のカルボキシ基の負電荷を高くすることができ、負電荷を有するアルブミン（ｐＩ＝４．６）との置換を抑制することができる。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物担体として使用する方法としては、前述の水溶性液中で自発的に薬物と複合体を形成させる方法の他、薬物と本発明のヒアルロン酸誘導体とを結合させたコンジュゲートにする方法を挙げることもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーと薬物とのコンジュゲートの調製で使用されている方法を用いることができ、例えば、以下の反応を利用することができる。
　ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基と、薬物のアミノ基、ヒドロキシ基、ヨード基、ブロモ基または、薬物に導入したアミノ基、ヒドロキシ基、ブロモ基、ヨード基との反応；
　ヒアルロン酸誘導体のＮ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと、薬物のカルボキシ基または薬物に導入したカルボキシ基との反応；
　ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基と、薬物のカルボキシ基または薬物に導入したカルボキシ基との反応； 
　ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基と、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどに変換された薬物との反応；
　薬物のアミノ基または薬物に導入したアミノ基と、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、カルボニル、ＮＨＳエステルおよびエポキシドに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応；
　ヒアルロン酸誘導体のアミノ基と、カルボニル基を有するまたは導入された薬物（アルデヒドおよびケトンなど）とのシッフ塩基形成ならびに還元的アミノ化反応；
　薬物のアミノ基または薬物に導入したアミノ基と、修飾によりカルボニル基が導入されたヒアルロン酸誘導体とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；
　ヒアルロン酸誘導体に導入したメルカプト基と、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールである薬物または修飾により当該化合物に変換された薬物との反応；および
　薬物に導入したメルカプト基と、修飾により、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応。
　さらに、前述の疎水性基をＨＡ誘導体に導入する際に用いたエステルまたはカーボネート、βチオエステル、ジスルフィド、特定の部位で切断するペプチドを含むリンカー（スペーサー）を、薬物とのコンジュゲート用のリンカーとして使用することもできる。これらのリンカーは前述の通り、標的部位において切断され、薬物が放出される。
　コンジュゲートの調製のためにヒアルロン酸誘導体または薬物の修飾に使用する試薬は、コンジュゲートの調製において不都合な反応を生じさせないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。
　具体的には、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにアミノ基を有する薬物またはアミノ基を導入した薬物をＤＭＴ－ＭＭなどの縮合剤を用いて反応させ、アミド結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル　６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにヒドロキシ基を有する薬物またはヒドロキシ基を導入した薬物をＤＭＴ－ＭＭ、１，３－ジクロロヘキシルカルボジイミト゛（ＤＣＣ）などの縮合剤を用いて反応させ、エステル結合によりヒアルロン酸誘導体に薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル　６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。しかし、エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、パクリタキセルがＨＡにエステルで導入された報告（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　第１９巻、第１３１９－１３２５項、２００８年）などを参考にして行うことができる。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらに臭化物もしくはヨウ化物である薬物または、修飾により臭化物もしくはヨウ化物に変換された薬物を反応させ、グルクロン酸部分のカルボキシ基をエステルに変換することにより薬物をコンジュゲートすることができる。エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにカルボキシ基を有する薬物またはカルボキシ基を導入した薬物をＮＨＳエステルとし、Ｎ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと反応させ、エステル結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、コレステリル６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などにより疎水性基をＨＡに導入した後に薬物を加えても、導入の前に加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。エステル結合の加水分解を回避するためには、疎水性基誘導体を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、カンプトテシンがＨＡにエステルで導入された報告（国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号）などを参考にして行うことができる。
　１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成後、グルクロン酸部分のカルボキシ基をエチレンジアミンなどのジアミンと脱水縮合させ、アミノ基を導入することができる。さらに、Ｎ－スクシンイミジル　ヨードアセテート（ＰＩＥＲＣＥ社）やＮ－スクシンイミジル　［４－ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＰＩＥＲＣＥ社）をアミノ基に反応させ、ヨードアセチル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を合成することができる。このヒアルロン酸誘導体に対して、チオール基を有する薬物を、コンジュゲートすることができる。この方法はタンパク質、ペプチド、核酸などのアミノ基などの反応性基を多く含む高分子薬物においてもチオール選択的にコンジュゲートできるため特に有効である。この際、薬物の導入は疎水基誘導体をＨＡに導入する前でも後でもよい。
　Ｘ１が－ＮＨ２－ＣＯＯ－Ｒである、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、ここで、グルクロン酸部分のカルボキシ基の一部を２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィド塩酸塩と反応させる。このヒアルロン酸誘導体に対してメルカプト基を有する薬物ならびにメルカプト基を導入した薬物をジスルフィド結合交換反応、すなわち置換反応により導入することが可能である。
　　ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保つために、薬物とヒアルロン酸誘導体間のリンカーの長さを調節することもできる。また、生体内の特定部位にて酵素等で切断されるペプチドリンカーを導入することもできる。例えば、メトトレキセートがＨＡにペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００５／０９５４６４号）、ドキソルビシンがＨＰＭＡ（N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide）およびペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００２／０９０２０９号）などを参考にして行うことができる。
　また、抗体に低分子化合物をコンジュゲートさせたＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する報告（国際公開第ＷＯ２００９／０２６２７４号；Expert Opinion. 第15巻、第1087-1103頁、2005年；Bioconjugate Chem. 第19巻、第1960-1963頁、2008年；Bioconjugate Chem.  in press、Bernhard Stumpら、Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies）が多数あり、これらを参考にして、ヒアルロン酸誘導体と低分子化合物とのコンジュゲートを調製することもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とを含む医薬組成物および本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とが結合したコンジュゲートは、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、またはフィルムの形態にあってよい。粉末は、凍結乾燥または噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内または口腔内の経路を経て投与されてよい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に局所における徐放を目的とした場合、ニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特にＣＤ４４をはじめとするヒアルロン酸レセプターへのターゲティングを目的とした場合、そのサイズは５μｍ以下であることが好ましい。この際に用いるヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸レセプターへの結合が抑制されないように、疎水性基の導入率が１０％以下であることが好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に血中滞留性延長、ならびに腫瘍組織または炎症組織への集積性を目的とする場合、そのサイズは５００ｎｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは２００ｎｍ以下である。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるためには１００ｎｍ以下であることが好ましい。この際に用いるヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸レセプターへの結合が抑制されるように、グルクロン酸部分のカルボキシ基の多くが変換されたヒアルロン酸誘導体を用いることが好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、粘膜付着性を持ち非侵襲投与用途を目的とした場合、そのサイズは２００μｍ以下であることが好ましい。粘膜付着性の観点からは、用いるヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率は低い方が好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する薬物は、担持可能な薬物であれば特に限定されない。また、本発明のヒアルロン酸誘導体と結合させる薬物は、コンジュゲートが調製可能であれば特に限定されない。当該薬物の例としては、タンパク質および／またはペプチド、多糖類、核酸類、低分子化合物が挙げられ、好ましくは、タンパク質および／またはペプチドが挙げられる。
　低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイドなど）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤など）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤など）などを挙げることができる。
　タンパク質およびペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α、β、γ、（ＩＮＦ－α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ－３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ－ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体などを挙げることができる。
　核酸類の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどを挙げることができる。
　なお、本発明においては、式（Ｉ）における－ＮＲａは、カルボニル（ＣＯ）とアミド結合を形成しており、ステリル基を有する疎水性基は、ヒアルロン酸またはその塩のカルボキシ基をアミドに変換することにより導入されている。一方、カルボキシ基をエステルに変換することにより疎水性基を導入することもできる。具体的には、ヒアルロン酸またはその塩に含まれる－ＣＯＯＨを－ＣＯＯＡ；ここで、Ａは、
　－Ｒ、
　－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、
　－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｙ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、および
　－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（Ｒ、Ｙ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＹａおよびＹｂは、前記にて定義した通りである）
に変換することもできる。
　また、カルボキシ基ではなく、ヒアルロン酸またはその塩のヒドロキシ基（－ＯＨ）を－ＯＡａ；ここで、Ａａは、
　－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＯＣＯ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＯＣＯ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－ＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙ－ＯＣＯＯ－Ｒ、
　－ＯＣＯ－Ｙ－ＯＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－ＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）－Ｏ－Ｒ、
　－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）－ＯＲ、および
　－ＣＨ２ＣＨＲｈ－ＳＯ２－ＯＲ
（Ｒ、Ｙ、Ｒａ、Ｒｂは、前記にて定義した通りであり、Ｒｈは、水素原子またはＣ１－６アルキルである）
に変換することにより、ヒアルロン酸またはその塩にステリル基を有する疎水性基を導入することもできる。
　上記式（Ｉ）において、Ｚが、２～３０個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーである場合、基－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１を、基－Ｎ（Ｒａ）－Ｙ－ＮＲｂ－Ｚ－Ｘ１ａ
（Ｒａ、Ｙ、Ｒｂ、Ｒ、ＲｃおよびＹｂは明細書中に定義されたとおりであり、Ｘ１ａは、以下の式：
　－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｒ、
　－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、又は
　－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
を表す）
に変換することもできる。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にて基Ｘ１ａに結合する。
　以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。
　また、以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ－アセチルグルコサミン－グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。
〔実施例１〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の調製
（実施例１－１）コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の調製
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ６）の塩酸塩（１．２ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＥｔＯＨ－ｄ６）を図１に示す。
（実施例１－２）コレステリル　２－アミノエチルカーバメート塩酸塩の調製
　６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサンの代わりに２－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノエタン（０．７９ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を用い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーの溶離液に酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：２を用いたこと以外は実施例１－１と同様の方法で行い、コレステリル　２－アミノエチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ２）の塩酸塩（２．３ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＥｔＯＨ－ｄ６）を図２に示す。
（実施例１－３）コレステリル　８－アミノオクチルカーバメート塩酸塩の調製
　８－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノオクタン（１．２１ｇ、５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）および無水トルエン（２００ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、ＴＥＡ（０．７ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下、コレステリルクロロホルメート（２．６６ｇ、６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液を滴下し、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温に昇温して一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
　得られた残渣をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール：アンモニア水＝９：１：０．５）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。得られた残渣に４Ｎ塩酸／ジオキサンを加えて、さらに酢酸エチルを加えて生じた固体を回収し、酢酸エチルで洗浄し、減圧下乾燥し、コレステリル　８－アミノオクチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ８）の塩酸塩（０．５ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＥｔＯＨ－ｄ６）を図３に示す。
（実施例１－４）コレステリル　１２－アミノドデシルカーバメート塩酸塩の調製
　６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサンの代わりに１２－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノドデカン（１．５９ｇ、５ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は実施例１－１と同様の方法で行い、コレステリル　１２－アミノドデシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ１２）の塩酸塩（１．０ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＥｔＯＨ－ｄ６）を図４に示す。
〔実施例２〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の調製
（実施例２－１）カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（実施例２－２）ＨＡのＴＢＡ塩の調製
　分子量２７ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ、資生堂株式会社製）をそれぞれ１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。実施例２－１でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
　代表例として５０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とする生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＥｔＯＨ－ｄ６）を図５に示す。グルコサミンのアセチル基（ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＴＢＡの二つのメチレン（Ｎ（ＣＨ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ３）４、１．３～１．８ｐｐｍ；１６Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この比からＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量を算出した。例えば５０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの場合、ユニット平均分子量は６９２．５であった。
（実施例２－３）コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の調製
（実施例２－３－１）コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートを導入したＨＡ誘導体の調製
　実施例２－２で調製した、ＨＡ－Ｎａ（５０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１に示す比率で各溶液に添加した。次に、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。
　測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用いた生成物（導入率７％）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製）を図６に示す。グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６～２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１）。なおグルコサミンのアセチル基由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチル基の積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 （実施例２－３－２）コレステリル　２－アミノエチルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　実施例２－２で調製した、ＨＡ－Ｎａ（５０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡを１０ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、実施例１－２で調製したＣｈｏｌ－Ｃ２塩酸塩をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表２に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表２に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に０．３Ｍとなるように硝酸ナトリウムを加え、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を加えて生じた沈殿を回収し、ＩＰＡ、エタノール洗浄後に、超純水に溶解し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ－１４ｋＤａ）した。得られた透析液を凍結乾燥してＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌを白色固体として得た。なお、ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌは、上記反応溶液に、実施例２－３－１と同様の処理（０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析して得られた透析液を凍結乾燥すること）を施すことによっても得ることができる。実施例２－３－１に記載と同じ条件で測定した生成物（導入率８％）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図７に示す。また、実施例２－３－１記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 （実施例２－３－３）コレステリル　８－アミノオクチルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　Ｃｈｏｌ－Ｃ２塩酸塩の代わりに実施例１－３で調製したＣｈｏｌ－Ｃ８塩酸塩を用い、以下の表３に示す比率でＣｈｏｌ－Ｃ８塩酸塩ならびにＤＭＴ－ＭＭを添加したこと以外は実施例２－３－２と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｃ８－Ｃｈｏｌを白色固体として得た。実施例２－３－１記載と同じ条件で測定した生成物（導入率７％）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図８に示す。また、実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 （実施例２－３－４）コレステリル　１２－アミノドデシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　Ｃｈｏｌ－Ｃ２塩酸塩の代わりに実施例１－４で調製したＣｈｏｌ－Ｃ１２塩酸塩を用い、以下の表４に示す比率でＣｈｏｌ－Ｃ１２塩酸塩ならびにＤＭＴ－ＭＭを添加したこと以外は実施例２－３－２と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌを白色固体として得た。実施例２－３－１記載と同じ条件で測定した生成物（導入率７％）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図９に示す。また、実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
〔実施例３〕ＰＢＳ系サイズ排除クロマトグラフィーによる会合体形成の確認
　実施例２－３－１～２－３－４で得られたＨＡ誘導体を１ｍｇ/ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。それぞれをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供してＨＡ誘導体の保持時間の変化から会合体形成を観察した（図１０－１～１０－４）。
ＳＥＣの条件を以下に示す。
　カラム：Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出:示差屈折率。
〔実施例４〕ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン添加ＰＢＳ系サイズ排除クロマトグラフィーによる会合体崩壊の確認
　実施例２－３－１～２－３－４で得られたＨＡ誘導体を１ｍｇ/ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。それぞれ７０μＬに対してヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）ＰＢＳ溶液（３３ｍＭ、３０μＬ）加え、３７℃にて１時間インキュベートした。各試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供して、保持時間の変化からＨＡ誘導体の会合体の崩壊を観察した（図１１－１～１１－４）。
　ＳＥＣの条件を以下に示す。
　カラム：Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：示差屈折率
　ＨＡ誘導体の溶出が、ＰＢＳ系ＳＥＣ（実施例３）においては原料であるＨＡに比べて早く、ＨＰ－β－ＣＤ系ＳＥＣ（実施例４）においては一致していることから、本発明のＨＡ誘導体は水溶液中においてＣＨＰ同様にコレステリル基の疎水性相互作用を駆動力とした多分子会合性微粒子を形成していると考えられる。ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌでは１８％以上（図１１－１）、ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌでは１６％以上（図１１－２）、ＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌでは１９％以上（図１１－３）のＨＰ－β－ＣＤ系ＳＥＣにおいて溶出時間が早いピークが確認されるが、これは多分子性会合微粒子に対応するピークと考えられる。この結果から、本発明のＨＡ誘導体は、今回のＨＰ－β－ＣＤ添加条件では完全に崩壊しないほどの強固な会合性微粒子を形成しうることが確認され、当該微粒子が、血中ならびに皮下において薬物を安定に保持するための担体として有用であることが示唆される。
〔実施例５〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体とタンパク質（エリスロポエチン）との複合体の調製
　実施例２－３－１～２－３－４で得られたＨＡ誘導体を１ｍｇ／ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。また、比較例として、実施例２－２において原料として用いたＨＡ－Ｎａ（分子量：５０ｋＤａ）、ならびにプルラン（分子量１００ｋＤａ）の１００単糖あたり１．３８個の－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨＣＯＯ－コレステリル基が、そのヒドロキシに導入されているコレステリル導入プルラン（ＣＨＰ；商品名ＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ　ＣＰ－１００Ｔ、日本油脂株式会社製）を１ｍｇ／ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。
　エリスロポエチン（ＥＰＯ）水溶液（２ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（５０μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加えた。３７℃にて２４時間インキュベート後、２０００Ｇにて遠心分離し、フリーＥＰＯの全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーＥＰＯの量を求め、複合体に含まれるＥＰＯの量を算出した。さらに、ＨＡ誘導体の単位重量当たりの複合体に含まれるＥＰＯの量（複合化％；（複合体中のＥＰＯ重量／ＨＡ誘導体重量）×１００）を求めた。結果を以下の表５に示し、代表的なクロマトグラムを図１２上段に示す。
　　ＳＥＣの測定条件１
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）。
　　ＳＥＣの測定条件２
　カラム：ＱＣ－ＰＡＫ－ＧＦＣ３００（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１．２ｍＬ／分
　注入量：２０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　なお、コレステリル導入プルラン（ＣＨＰ）の導入率は、ＨＡ誘導体との比較のために、プルランの二糖を１ユニットとしてみたときの各ユニットへの導入率を示した。当該導入率は、購入品に示された１００単糖あたりに導入されたコレステリル基の数（１．３８個）から算出した。
　本発明のＨＡ誘導体の複合化％の値はＣＨＰに比べて約３倍程度高く、本発明のＨＡ誘導体が効率よくＥＰＯと複合体を形成することが確認された。
〔実施例６〕複合体から放出されたエリスロポエチンの分析
　実施例５において３７℃にて２４時間インキュベートした試料（２００μＬ）に対し、それぞれヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）ＰＢＳ溶液（５０ｍＭ、５０μＬ）加え、さらに３７℃にて１時間インキュベートした。各試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。複合体から放出されたＥＰＯを含むフリーＥＰＯ濃度（算出にはＥＰＯ標準試料から作成した検量線を用いた）をＥＰＯピーク面積から算出し、回収率（％；フリーＥＰＯ重量／当初ＥＰＯ重量×１００）を以下に示す表６に記載した。代表的なクロマトグラムを図１２下段に示す。
　　ＳＥＣの測定条件
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 　ＨＰ－β－ＣＤ添加によるＨＡ誘導体の会合性微粒子崩壊により放出されたＥＰＯがインタクトな状態であることがサイズ排除クロマトグラフィーにより確認された。したがって、本発明のＨＡ誘導体は、タンパク質を安定な状態に保ったまま、複合体を形成し、複合体中で保持し、その後放出することが確認された。
〔実施例７〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の沈殿性および分散性
（実施例７－１）生理塩濃度下中での挙動
　実施例２－３－１で得られたＨＡ誘導体を６ｍｇ／ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。最終緩衝液組成が１０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌとなるように濃縮緩衝液を加え、ＨＡ誘導体濃度を４．５ｍｇ／ｍＬとした。３７℃にて２０分間インキュベート後、２０００Ｇにて１分間遠心分離し、上澄みをＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ溶液（２５０ｍＭ）にて二倍希釈し、２時間インキュベート後、ＳＥＣに供した。検出されたＨＡ誘導体のピーク面積から当初使用量に対するＨＡ誘導体の溶液中の残存率を算出した。ＨＡ誘導体の疎水性基導入率に対して残存率をプロットしたものを図１３に示す。
　ＳＥＣの測定条件
　カラム：ＱＣ－ＰＡＫ－ＧＦＣ２００（東ソー株式会社製）
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１．２ｍＬ／分
　注入量：２０μＬ
　検出：示差屈折率
　疎水性基導入率が７～１５％であるＨＡ誘導体は、生理塩濃度にて凝集し、沈殿形成することが確認された。これは、当該ＨＡ誘導体が、生理塩濃度条件下で凝集することにより皮下において長時間存在し、タンパク質やペプチドを徐放する長期徐放性製剤の担体となりうることを示唆する。１８～４２％においては生理塩濃度条件下でも安定に分散していることが確認された。これは全身投与型のタンパク質担体となりうることを示す。
（実施例７－２）ＨＡ誘導体の分散性におけるＮａＣｌ濃度の影響
　実施例２－３－１で得られたＨＡ誘導体を６ｍｇ／ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。最終緩衝液組成が１０ｍＭ　ＰＢ、０ｍＭ　ＮａＣｌならびに１０ｍＭ　ＰＢ，５０ｍＭ　ＮａＣｌとなるように濃縮緩衝液を加え、ＨＡ誘導体濃度を４．５ｍｇ／ｍＬとした。３７℃にて２０分間インキュベート後、２０００Ｇにて１分間遠心し、上澄みをＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ溶液（２５０ｍＭ）にて二倍希釈し、２時間インキュベート後、ＳＥＣに供した。検出されたＨＡ誘導体のピーク面積から当初使用量に対するＨＡ誘導体の溶液中の残存率を算出した。塩濃度に対して残存率を各ＨＡ誘導体についてプロットしたものを図１４に示す。なお、ＳＥＣの測定条件は実施例７－１と同じである。
　導入率７％のＨＡ誘導体は、塩の濃度が低い条件（１０ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ７．４，　０または５０ｍＭ　ＮａＣｌ）では均一に分散し、生理塩濃度（１５０ｍＭ）では析出するという塩濃度依存的な挙動を示すことが確認された。この結果は、糖などにより等張化した低塩濃度溶液を調製することにより投与後皮下で沈殿する製剤において本発明のＨＡ誘導体が担体として使用されうる可能性を示唆する。
　一方、導入率２１％のＨＡ誘導体は、実施例７－１と同様、生理塩濃度でも沈殿せず、安定に分散していることが確認された。
〔実施例８〕ＨＡ誘導体／タンパク質（エリスロポエチン）複合体の沈殿・分散性
　表７に示した、実施例２－３－１で得られたＨＡ誘導体を、４ｍｇ／ｍＬ濃度で蒸留水（超純水）に溶解した。エリスロポエチン水溶液（１ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（５０μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体（４ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）を加えた。３７℃にて２時間インキュベート後、２０００Ｇにて遠心分離し、上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、上澄みに存在するＨＡ誘導体・ＥＰＯ複合体のピーク面積、および複合体に取り込まれなかったフリーのＥＰＯのピーク面積を求めた。さらに、本実験で添加したＥＰＯ単独のピーク面積およびＨＡ誘導体単独のピーク面積を求めるために、別途溶液を調製しサイズ排除クロマトグラフィーに付した。添加したＥＰＯ単独のピーク面積およびＨＡ誘導体単独のピーク面積の和に対する、上澄みに存在するＨＡ誘導体・ＥＰＯ複合体のピーク面積およびフリーのＥＰＯのピーク面積の和の割合を残存率として算出した（表７）。なお、この実験系においては、ＥＰＯは、フリーの状態では、遠心後でも、全て上澄み中に存在し、沈殿することはない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　クロマトグラフを図１５に示す。
　　ＳＥＣの測定条件
　カラム：ＱＣ－ＰＡＫ－ＧＦＣ３００（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１．２ｍＬ／分
　注入量：２０μＬ
　検出：ＵＶ（２１５ｎｍ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２％ならびにＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２１％においては残存率が約１００％であることから、ＨＡ誘導体／タンパク複合体も安定な分散性微粒子であり、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－７％においては残存率が３２％であることからＨＡ誘導体／タンパク複合体が沈殿性であることが確認された。すなわち、本発明のＨＡ誘導体の沈殿・分散性能はタンパク質との複合体形成後も維持されることが確認された。
〔実施例９〕コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
（実施例９－１）コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメート塩酸塩の調製
　コレステリルクロロホルメート（１．７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、０．５３ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、８－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－３，６－ジオキサオクチルアミン（０．５９ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：１)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて５回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－ＥＯ２）の塩酸塩（１．３ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製；ＭｅＯＨ－ｄ４）を図１６に示す。
（実施例９－２）コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩の代わりに実施例９－１で調製したＣｈｏｌ－ＥＯ２塩酸塩を用い、以下の表８に示す比率でＣｈｏｌ－ＥＯ２塩酸塩ならびにＤＭＴ－ＭＭを添加したこと以外は実施例２－３－１と同様の方法で行い、ＨＡ－ＥＯ２－Ｃｈｏｌを固体として得た。実施例２－３－１記載と同じ条件で測定した生成物（導入率７％）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１７に示す。また、実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
〔実施例１０〕２－アミノエチル　コレステリル　ジスルフィドにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　分子量１０ｋＤａのＨＡ－Ｎａ（資生堂社製）を原料とし、実施例２－２と同様の方法で調製したＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィド塩酸塩（Ｐｙ－ＳＳ－ＡＭ、トロント社製）をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表９に示す比率で各溶液に添加した。次に、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表９に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらに、チオコレステロール（Ｃｈｏｌ－ＳＨ、シグマアルドリッチ社製）を以下の表９に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に０．３Ｍとなるように硝酸ナトリウムを加え、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を加えて生じた沈殿を回収し、ＩＰＡ洗浄後、減圧乾燥し、目的物（ＨＡ－ＳＳ－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。実施例２－３－１に記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１８に示す。また、実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
〔実施例１１〕コレステリル　２－アミノエチルカーバメートおよびアミノエチルメタクリレートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　実施例２－２で調製した、ＨＡ－Ｎａ（５０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡを１０ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、実施例１－２で調製したＣｈｏｌ－Ｃ２塩酸塩をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１０に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１０に示す比率で加え、室温で４時間撹拌した。さらにアミノエチル　メタクリレート（ＡＥＭＡ、ポリサイエンス社製）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表１０に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡを白色固体として得た。実施例２－３－１に記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１９に示し、実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表１０に示す。また、５．６ｐｐｍと６．０ｐｐｍにおけるメタクロイル基由来のシグナルの平均値から下式により算出したＨＡユニットに対するメタクリル基の導入率を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
〔実施例１２〕５－アミノメチルフルオレセインおよびコレステリル　６－アミノヘプチルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　以下の方法により、本発明のＨＡ誘導体に低分子化合物を導入し、蛍光標識化ＨＡ誘導体を得た。実施例２－２で調製した、ＨＡ－Ｎａ（５０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡを１０ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１１に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１１に示す比率で加え、室温で４時間撹拌した。さらに５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表１１に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例２－３－１に記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表１１に示す。また、フルオレセインの導入率は４９４ｎｍにおけるモル吸光係数８００００Ｍ－１ｃｍ－１から算出した。なお、ＦＬによる標識は、ＦＬのアミノ基とＨＡ－ＴＢＡのカルボキシ基とのアミド結合形成により行われた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
〔実施例１３〕５－アミノメチルフルオレセイン、コレステリル　６－アミノヘプチルカーバメートおよびエタノールアミンもしくはプロパノールアミンにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　分子量１０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを原料とし、実施例２－２と同様の方法で調製したＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１２に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１２に示す比率で加え、室温で２時間撹拌した。さらに５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表１２に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらにエタノールアミン（ＨＯ－Ｃ２）塩酸塩もしくはプロパノールアミン（ＨＯ－Ｃ３）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表１２に示す比率で加え、室温で５時間撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨ／ＦＬもしくはＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｃ３－ＯＨ／ＦＬを黄色固体として得た。測定溶媒としてＤＭＳＯ－ｄ６を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製）を図２０（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ）に示す。実施例２－３－１に記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率ならびに、グルコサミンのアミド基由来ＮＨＣＯとＣｈｏｌ－Ｃ６、ＨＯ－Ｃ２もしくはＨＯ－Ｃ３、ＦＬのアミド基由来（ＮＨ）からＣｈｏｌ－Ｃ６、ＨＯ－Ｃ２もしくはＨＯ－Ｃ３、ＦＬの総導入率を算出した。これを表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
〔実施例１４〕分子量の異なるヒアルロン酸ＴＢＡ塩を各種コレステリルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　実施例２－３－１と同じ条件にて、各種分子量のＨＡ－ＴＢＡを用い、各種コレステリルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体を調製した。コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の試薬使用量と合成結果を表１３－１－表１３－２に示す。原料のヒアルロン酸は、すべて資生堂社製のものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
〔実施例１５〕分子量の異なるヒアルロン酸ＴＢＡ塩を各種コレステリルカーバメートおよび５－アミノメチルフルオレセインにより修飾したＨＡ誘導体の調製
　実施例１２と同じ条件にて各分子量のＨＡ－ＴＢＡを用い、各種コレステリルカーバメートと５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）により修飾したＨＡ誘導体を調製した。ＦＬの使用量も実施例１２と同様とした。原料のヒアルロン酸は、５ｋＤａのみＲ＆Ｄシステム社製を用い、それ以外は資生堂社製のものを用いた。
　コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の試薬使用量と合成結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
〔実施例１６〕Ｈｉｌｙｔｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ７５０　ａｍｉｎｅおよび６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体の調製（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ用）
　実施例１２の５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）塩酸塩の代わりにＨｉｌｙｔｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ７５０　ａｍｉｎｅ（Ｈｉｌｙｔｅ）ＴＦＡ塩を用いた以外は同様の条件にて操作を行い、標題のＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｈｉｌｙｔｅ）を調製した。添加したモル比は表１５に示す。また、Ｈｉｌｙｔｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ７５０　ａｍｉｎｅ　ＴＦＡ塩添加後に実施例１３と同様にエタノールアミン塩酸塩を反応させ、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨ／Ｈｉｌｙｔｅを調製した。添加したモル比は表１５に示す。導入率は実施例１２ならびに実施例１３と同様の方法にて算出した。なお、Ｈｉｌｙｔｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ７５０　ａｍｉｎｅによる標識は、Ｈｉｌｙｔｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ７５０　ａｍｉｎｅのアミノ基がＨＡ－ＴＢＡのカルボキシ基とアミド結合を形成することにより行われた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
〔実施例１７〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体のＤＬＳ測定
　実施例１２ならびに実施例１５で合成したＨＡ誘導体のＰＢＳ溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を調製し、粒子サイズを動的光散乱法（ＤＬＳ）にて測定した。測定装置にはゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いた。ｚ平均粒子サイズを表１６に示す。また、５０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬの サイズ分布を図２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
 　これにより、ＨＡ誘導体はＰＢＳ中において５０ｎｍ以下の非常に小さな微粒子を形成していることが確認された。上記サイズの微粒子は生体内において細網内皮系からの取り込みを回避できため、薬物キャリアとして適している。
〔実施例１８〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体とタンパク質との複合体の調製
（実施例１８－１）リゾチーム
　実施例５と同様にして、リゾチーム（Ｌｙｓ：Ｌｙｓｏｚｙｍ　ｆｒｏｍ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ、シグマ社製）を、表１７に示すＨＡ誘導体およびＣＨＰと複合化させた。Ｌｙｓ水溶液（４ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（５０μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体またはＣＨＰ（４ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）を加えた。３７℃にて２４時間インキュベート後、６０００Ｇにて遠心分離し、フリーＬｙｓの全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーＬｙｓの量を求め、複合体に含まれるＬｙｓの量を算出した。さらに、ＨＡ誘導体およびＣＨＰの単位重量当たりの複合体に含まれるＬｙｓの量（複合化％；（複合体中のＬｙｓ重量／ＨＡ誘導体重量）×１００）を求めた。結果を以下の表１７に示し、グラフを図２２－１に示す。
　　ＳＥＣの測定条件
　カラム：Ｇ３０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：２×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
 　本発明のＨＡ誘導体の複合化％の値はＣＨＰに比べて約５～１２倍程度高く、本発明のＨＡ誘導体が効率よくＬｙｓと複合体を形成することが確認された。
（実施例１８－２）エキセンディン－４
　実施例５と同様にしてエキセンディン－４（Ｅｘ－４、アメリカンペプタイド社製）と表１８に示すＨＡ誘導体およびＣＨＰを複合化させた。Ｅｘ－４水溶液（３．３１ｍｇ／ｍＬ、３０．２μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（４４．８μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体またはＣＨＰ（４ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）を加えた。３７℃にて２４時間インキュベート後、６０００Ｇにて遠心分離し、フリーＥｘ－４の全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーＥｘ－４の量を求め、複合体に含まれるＥｘ－４の量を算出した。さらに、ＨＡ誘導体およびＣＨＰの単位重量当たりの複合体に含まれるＥｘ－４の量（複合化％；（複合体中のＥｘ－４重量／ＨＡ誘導体重量）×１００）を求めた。結果を以下の表１８に示し、グラフを図２２－２に示す。
　　ＳＥＣの測定条件
　カラム：ＱＣ－ＰＡＫ－ＧＦＣ２００（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１．２ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
 　本発明のＨＡ誘導体の複合化％の値はＣＨＰに比べて約３～１１倍程度高く、本発明のＨＡ誘導体が効率よくエキセンディン－４と複合体を形成することが確認された。
（実施例１８－３）ヒト成長ホルモン
　実施例５と同様にしてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ：ジェノトロピン（登録商標）注射用）と表１９に示すＨＡ誘導体およびＣＨＰを複合化させた。ｈＧＨはジェノトロピン（登録商標）を透析によりリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶媒置換したものを用いた。ｈＧＨ水溶液（３．５ｍｇ／ｍＬ、１４．３μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（６０．４μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体またはＣＨＰ（４ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）を加えた。３７℃にて２４時間インキュベート後、６０００Ｇにて遠心分離し、フリーｈＧＨの全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーｈＧＨの量を求め、複合体に含まれるｈＧＨの量を算出した。さらに、ＨＡ誘導体の単位重量当たりの複合体に含まれるｈＧＨの量（複合化％；（複合体中のＥｘ－４重量／ＨＡ誘導体重量）×１００）を求めた。結果を以下の表１９に示し、グラフを図２２－３に示す。
　　ＳＥＣの測定条件
　カラム：ＱＣ－ＰＡＫ－ＧＦＣ３００（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１．２ｍＬ／分
　注入量：３０μＬ
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
 　本発明のＨＡ誘導体の複合化％の値はＣＨＰに比べて約２～５倍程度高く、本発明のＨＡ誘導体が効率よくｈＧＨと複合体を形成することが確認された。
（実施例１８－４）ＨＡ修飾物のＥＰＯ複合化量２
　実施例５と同様の方法にて表２０に示すＨＡ誘導体のＥＰＯ複合化を行い、複合化％を算出した。グラフを図２２－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
 　本発明のＨＡ誘導体の複合化％の値はＣＨＰに比べて最大５倍程度高く、本発明のＨＡ誘導体が効率よくＥＰＯと複合体を形成することが確認された。
〔実施例１９〕ＥＰＯ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏリリース
（実施例１９－１）Ａｌｅｘａ－ＥＰＯの調製
　炭酸緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ９．０）に緩衝液置換したＥＰＯ水溶液にＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８　５－ＴＦＰ（インビトロジェン社製）を１ｍｇ滴下し、室温にて１時間攪拌した。ＰＤ－１０カラムによるゲルろ過精製の後、リン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）にて透析精製（７０００ＭＷＣＯ透析膜）を行い、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８で蛍光標識されたＥＰＯ（Ａｌｅｘａ－ＥＰＯ）溶液を得た。なお、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８による標識は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８のカルボキシ基とＥＰＯのアミノ基がアミド結合することで達成されている。
（実施例１９－２）ＨＡ誘導体のＡｌｅｘａ－ＥＰＯ徐放効果
　実施例１９－１で得られたＡｌｅｘａ－ＥＰＯ溶液（３．３４ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（９０μＬ）を加え、さらにＨＡ誘導体（６ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加えた。ＨＡ誘導体にはＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－７％、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１５％およびＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌ－７％を用いた（原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量は、いずれも５０ｋＤａである）。３７℃にて２４時間インキュベートし、そのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品全量に対して２０ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）／ＰＢＳ溶液（２００μＬ）を加え、経時的に遠心後、上澄み（１００μＬ）を採り、フレッシュなＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（１００μＬ）を加えた。上澄みをＨＰ－β－ＣＤ水溶液（１００ｍＭ）にて二倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、ＳＥＣに供し、Ａｌｅｘａ－ＥＰＯの濃度を算出し、Ａｌｅｘａ－ＥＰＯのリリース量を計算した。結果を図２３－１に示す。
　ＳＥＣ分析条件
　カラム：Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出:蛍光検出４９４／５２５
　いずれのＨＡ誘導体においても徐放効果があることが示され、さらにコレステリル基の導入率は７％よりも１５％、スペーサーはＣ６よりもＣ１２の方が徐放効果があることが明らかとなった。
（実施例１９－３）リリース溶液のＢＳＡ濃度の影響
　実施例１９－１で得られたＡｌｅｘａ－ＥＰＯ溶液（３．３４ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）に対して最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（１３３．３μＬ）を加え、さらにＨＡ－Ｃ１２－Ｃｈｏｌ－７％（６ｍｇ／ｍＬ、１６．７μＬ）を加えた（原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量は、５０ｋＤａである）。３７℃にて２４時間インキュベートし、そのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品全量に対して２０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、０ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）／ＰＢＳ溶液（２００μＬ）を加え、経時的に遠心後、上澄み１００μＬを採り、フレッシュなＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（１００μＬ）を加えた。上澄みをＨＰ－β－ＣＤ水溶液（１００ｍＭ）にて二倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、ＳＥＣに供し、Ａｌｅｘａ－ＥＰＯの濃度を算出し、Ａｌｅｘａ－ＥＰＯのリリース量を計算した。結果を図２３－２に示す。ＳＥＣ条件は実施例１９－２と同じである。
　この結果より、本発明のＨＡ誘導体に封入（複合化）されたＥＰＯの放出速度は、ＢＳＡ濃度に依存することが明らかとなった。
〔比較例１〕ｈＧＨのラットにおける薬物動態試験
　表２１に示した用量で、ｈＧＨ溶液を２５Ｇ針を用いて正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の皮下ならびに尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行い、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンを加えた。得られた血液は血漿分離し、ｈＧＨ濃度をＥＬＩＳＡキット（ロシュアプライドサイエンス社製）にて測定した。皮下ならびに尾静脈投与時のｈＧＨの血漿中濃度推移を図２４に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞）および平均滞留時間（ＭＲＴ））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表２１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
〔実施例２０〕ｈＧＨ　ｉｎ　ｖｉｖｏリリース
（実施例２０－１）ｈＧＨとＨＡ誘導体との複合体の沈殿凍結乾燥品の調製
　実施例２－３－１および実施例１４で得られたＨＡ誘導体（６ｍｇ／ｍＬ、３．３７５ｍＬ）にｈＧＨ（４．３１ｍｇ／ｍＬ、０．９４０ｍＬ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。さらに最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（０．１８５ｍＬ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。沈殿が確認された。３０分間遠心後、上澄み（２．２５ｍＬ）を取り除き、スクロース水溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ、１．１２５ｍＬ）を加え、よく分散した後に凍結乾燥した。上澄みに含まれるフリーのｈＧＨ量をＳＥＣから算出し、複合化％を算出した。また、凍結乾燥品を一定量採り、そこに含まれるｈＧＨ量から回収率を算出した。結果を表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
 　この結果より、本発明のＨＡ誘導体は、効率良くｈＧＨを封入（複合化）することが明らかとなった。　
（実施例２０－２）ｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体（沈殿品）の調製
　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１４％（６ｍｇ／ｍＬ、０．５８３ｍＬ；原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量は５０ｋＤａ）にｈＧＨ（４．８４ｍｇ／ｍＬ、０．１４５ｍＬ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。さらに最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ（０．１４７ｍＬ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。沈殿が確認された。４℃にて保存した。
（実施例２０－３）ｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体（溶液）の調製
　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１４％（６ｍｇ／ｍＬ、０．５８３ｍＬ；原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量は５０ｋＤａ）にｈＧＨ（４．８４ｍｇ／ｍＬ、０．１４５ｍＬ）ならびに最終濃度が８２ｍｇ／ｍＬとなるようにスクロース水溶液（０．１４７ｍＬ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。沈殿は確認されなかった。４℃にて保存した。
　この製剤は溶液状態で投与し、投与後、皮下におけるイオン強度の上昇により沈殿を生じさせることを目的とした製剤である。
（実施例２０－４）ｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体のラット皮下投与での徐放試験
　実施例２０－１～２０－３で調製したｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体を表２３－１に示す容量で２５Ｇ針を用いて正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の皮下に投与した。実施例２０－１で調製した凍結乾燥品は、投与直前にＰＢＳに懸濁させて投与した。投与前の製剤を図２５に示す。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行い、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンを加えた。得られた血液は血漿分離し、ｈＧＨ濃度をＥＬＩＳＡキット（ロシュアプライドサイエンス社製）にて測定した。各種ｈＧＨ／ＨＡ誘導体複合体投与時のｈＧＨの血漿中濃度推移－および比較例１のｈＧＨ溶液の血漿中濃度推移を併せて図２６－１～２７－２に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞）および平均滞留時間（ＭＲＴ））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表２３－２に示した。またＭＲＴのグラフを図２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
 　この結果、ｈＧＨ／ＨＡ誘導体沈殿製剤からのｈＧＨ放出挙動はｉｎ　ｖｉｖｏにおいても徐放性を有するものであり、また、溶液製剤も皮下にて沈殿を形成することにより徐放性を示すことが確認された。特に実施例２０－３で得られた溶液製剤（サンプル２０－６）は０．２μｍのフィルターによる滅菌が可能であり、シリンジ針への目詰まりの可能性が低いことから医薬品製剤として有用である。
〔比較例２〕５－アミノメチルフルオレセインにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＦＬ）、および５－アミノメチルフルオレセインとエタノールアミンにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ）の薬物動態試験
（比較例２－１）１０ｋＤａおよび５０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを用いたＨＡ－ＦＬの調製
　分子量１０ｋＤａのＨＡ－Ｎａおよび分子量５０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを原料とし、実施例２－２と同様の方法で調製したＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対してそれぞれ４．４％、４．０％の比率（モル％）で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、目的物（１０ｋ　ＨＡ－ＦＬおよび５０ｋ　ＨＡ－ＦＬ）を、それぞれ黄色固体として得た。
（比較例２－２）１０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを用いたＨＡ－Ｃ２－ＯＨ／ＦＬの調製（その１）
　分子量１０ｋのＨＡ－Ｎａを原料とし、実施例２－２と同様の方法で調製したＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、エタノールアミン（ＨＯ－Ｃ２）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表２４に示す比率で加え、室温で４時間撹拌した。さらに、５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表２４に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、目的物（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ）を黄色固体として得た。測定溶媒としてＤＭＳＯ－ｄ６を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製）から実施例１３に記載の式にて算出したグルコサミンのアミド基由来ＮＨＣＯと、Ｃ２－ＯＨ、ＦＬのアミド基由来ＮＨＣＯからＣ２－ＯＨ、ＦＬの総導入率を算出した。これを表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
 （比較例２－３）１０ｋ　ＨＡ－Ｃ２－ＯＨ／ＦＬの調製（その２）
　分子量１０ｋのＨＡ－Ｎａを原料とし、実施例２－２と同様の方法で調製したＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表２５に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらにエタノールアミン（Ｃ２－ＯＨ）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭを以下の表２５に示す比率で加え、室温で５時間撹拌した。以降は実施例２－３－１と同様の方法によって処理し、目的の１０ｋ　ＨＡ－Ｃ２－ＯＨ／ＦＬを黄色固体として得た。比較例２－２と同様の方法にてＣ２－ＯＨ、ＦＬの総導入率を算出した。これを表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
 （比較例２－４）薬物動態試験
　表２６に示した用量で、比較例２－１～２－３で調製した蛍光標識ＨＡ誘導体を、２５Ｇ針を用いて正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図２９に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表２６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
 　この結果より、１０ｋのＨＡ－Ｎａを原料としたサンプルは、Ｃ２－ＯＨの導入率が低いＨＡ誘導体（比較例２－３）のみならず、高度に修飾されたＨＡ誘導体（比較例２－４）においても血中から瞬時に消失することが明らかとなった。
〔実施例２１〕ＨＡ－Ｃｈｏｌ－ＦＬの薬物動態試験
（実施例２１－１）血漿中濃度推移におけるＨＡ分子量の影響
　表２７に示した用量で、実施例１２ならびに実施例１５で調製した蛍光標識ＨＡ誘導体を２５Ｇ針を用いて正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図３０－１に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表２８に示した。表２８のＡＵＣ∞を原料のＨＡ－Ｎａの分子量に対してプロットしたグラフを図３０－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
 　カルボキシ基を高度に修飾していない（例えば修飾率５４％以下の）ＨＡ誘導体は分子量にかかわらず、静脈内投与時、瞬時に血中から消失することが知られている。本発明のＨＡ－Ｃｈｏｌは最大で２３％しか置換基を導入していないにもかかわらず（ＦＬを勘案しても２７％以下）、予想外にも低分子量（５ｋ～１８ｋＤａ）のヒアルロン酸を原料としたＨＡ－Ｃｈｏｌに限ってのみ良好な血中滞留性を示した。
（実施例２１－２）血漿中濃度推移におけるリンカーの影響
　表２９に示す実施例１５で調製したリンカーの異なる蛍光標識ＨＡ誘導体を実施例２１－１と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図３１に示した。また、実施例２１－１と同様の方法にて薬物動態パラメーター（ＡＵＣ∞）を算出し、その値を表３０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
 　リンカーの種類によらず低分子量のヒアルロン酸を原料としたＨＡ－Ｃｈｏｌは良好な血中滞留性を有することが明らかとなった。
（実施例２１－３）血漿中濃度推移におけるＣｈｏｌ導入率の影響
　表３１に示す実施例１２および実施例１５で調製したＣｈｏｌ導入率の異なる蛍光標識ＨＡ誘導体を実施例２１－１と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図３２－１、図３２－２に示した。また、実施例２１－１と同様の方法にて薬物動態パラメーター（ＡＵＣ∞）を算出し、その値を表３２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
 　コレステリル基の導入率はＨＡ－Ｃｈｏｌの血中滞留性に大きな影響を与えないことが明らかとなった。
（実施例２１－４）血漿中濃度推移（ＨＡ－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨ／ＦＬ）
　表３３に示す実施例１３で調製したＣ２－ＯＨとＣｈｏｌにて高度に修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体を実施例２１－１と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図３３に示した。また、実施例２１－１と同様の方法にて薬物動態パラメーター（ＡＵＣ∞）を算出し、その値を表３４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
 　Ｃ２－ＯＨのみで高度に修飾した（例えば修飾率９６％以上）１０ｋＨＡ－Ｃ２－ＯＨは比較的早く血中から消失するが、ほぼ同じ修飾率であっても、その一部にコレステリル基が導入されている本発明の１０ｋＨＡ－Ｃｈｏｌ／Ｃ２－ＯＨは意外にも良好な血中滞留性を示した。
　ヒアルロン酸のカルボキシ基を高度に修飾した場合、血中滞留性が向上することが知られている（特許文献８）が、１０ｋＤａ程度の低分子量のヒアルロン酸およびその誘導体（塩）を原料にした場合、血中滞留性（ＡＵＣ）を向上させることは困難であり（実施例２１－４；比較サンプル２－４）、それは、腎排泄によるものと推測される。同じ分子量のヒアルロン酸およびその誘導体（塩）を原料にし、同等の修飾率でヒアルロン酸のカルボキシ基を高度に修飾した場合であっても、その修飾が前記疎水性基を含んで行われた場合は、血中滞留性が顕著に向上し、低分子量のヒアルロン酸誘導体であっても、薬物の担体として実用性の高いものが供給できることが明らかとなった（実施例２１－４；サンプル２１－１３）。
（実施例２１－５）皮下投与後のＨＡ誘導体の血漿中濃度推移
　表３５に示す蛍光標識ＨＡ誘導体を皮下から投与したことを除くと実施例２１－１と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図３４－１、３４－２に示した。また、実施例２１－１と同様の方法にて薬物動態パラメーター（ＡＵＣ∞）を算出し、その値を表３６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
 　ＨＡ誘導体は皮下投与も可能であることが示唆された。
（実施例２１－６）ヒアルロン酸先行投与による血漿中濃度推移の影響
　投与する２０分前に３０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（１０００ｋ、３００ｋ、１００ｋ、５０ｋ、１０ｋをそれぞれ６ｍｇ含む混合物）を尾静脈から投与した後に、表３４に示す蛍光標識ＨＡ誘導体を尾静脈から投与したことを除くと実施例２１－１と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図３５－１および図３５－２に示した。また、実施例２１－１と同様の方法にて薬物動態パラメーター（ＡＵＣ∞、ＭＲＴ）を算出し、その値を表３８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
 　サンプル２１－２はＨＡによる動態への変化がほとんど確認されなかったことから、肝臓におけるＨＡ特有の代謝を回避していることが明らかになった。一方、サンプル２１－１２－３はＨＡのプレ投与により動態が改善したことから、ヒアルロン酸誘導体の消失にＨＡの代謝系が関与していることが明らかとなった。
（実施例２１－７）血漿サンプルのＳＥＣ分析
　実施例２１－１でプレートリーダー測定したサンプル２１－２、２０μＬに対し、超純水８０μＬを加え、ＳＥＣ分析を行った。クロマトグラムを図３６－１、図３６－２に示す。
　ＳＥＣの測定条件
　カラム：Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＨＰ－β－ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）　流速：０．５ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：蛍光４９４／５１５
　血漿サンプルのピークが投与前サンプルのピーク位置と同じであることから、プレートリーダーで検出された蛍光はＨＡ－Ｃｈｏｌ－ＦＬの分解物に由来するものではないことが示唆された。
（実施例２１－８）尿サンプルのＳＥＣ分析
　実施例２１－１ならびに比較例２－４のラット薬物動態試験と同時に尿サンプルも採取した。尿サンプル５０μＬに対し、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液（５０μＬ）を加え、３７℃にて１時間インキュベート後、ＳＥＣ分析を行った。クロマトグラムを図３７－１～３７－５に示す。
　ＳＥＣの測定条件
　カラム：Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　溶離液：ＨＰ－β－ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液
　流速：０．５ｍＬ／分
　注入量：５０μＬ
　検出：蛍光４９４／５１５
　尿サンプルのピークが投与前サンプルのピーク位置より後ろで溶出していることから、ＨＡ－Ｃｈｏｌ－ＦＬは何らかの経路によって、分解されていることが示唆された。よってＨＡ－Ｃｈｏｌ－ＦＬは生分解性かつ血中滞留性の良い粒子を形成することが示された。生分解性であることは安全性の観点から非常に有用である。
〔実施例２２〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体の沈殿性および分散性（その２）
　実施例２－３－２～２－３－４で得られたＨＡ誘導体を用いたほかは実施例７と同じ方法によって残存率を算出した。ＨＡ誘導体の疎水性基導入率に対して残存率をプロットしたものを図３８に示す。
　リンカーがＣ２、Ｃ８、Ｃ１２においてもＣ６と同様に沈殿する範囲と安定に分散する範囲があることが明らかとなった。
〔実施例２３〕コレステリル基を導入したＨＡ誘導体と低分子薬物との複合体の調製
　実施例１４で調製した１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１５％、ならびに実施例２－３－１で調製した５０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１５％の水溶液（６ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に対し、ドキソルビシン（ＤＯＸ）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、４μＬ、和光純薬製）を加え、最終濃度が１×ＰＢＳとなるように濃縮ＰＢＳ溶液を９６μＬ加えた。ＤＯＸ水溶液の代わりに超純水を加えたものをコントロールとした。室温にて１時間インキュベート後、限外ろ過器（マイクロコン、分画分子量１０，０００）にて遠心ろ過し、ろ液をＨＰＬＣ（逆相、ＲＰ）に供した。ＨＡ誘導体と複合化していないフリーのＤＯＸが検出される。クロマトグラムを図３９に示す。
　ＲＰの測定条件
　カラム：ｃａｄｅｎｚａ　ＣＤ－Ｃ１８（インタクト社製）
　溶離液Ａ：超純水、０．１％　ＴＦＡ
　溶離液Ｂ：アセトニトリル、０．１％　ＴＦＡ
　グラジエント：Ｂ５％→Ｂ９５％（８分）
　流速：０．７５ｍＬ／分
　注入量：１０μＬ
　検出：ＵＶ４８０
　本発明のＨＡ誘導体をドキソルビシンと混合することによって、複合体を形成することが明らかとなった。
　〔実施例２４〕ＨＡ－Ｃｈｏｌ　ｉｎ　ｖｉｖｏイメージング
　ヌードマウス（ＢＡＬＢ－ｎｕ／ｎｕ、メス、７週齢）にヒト乳癌由来ＭＤＡ－ＭＢ－２１３細胞切片（２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）を皮下移植し、ゼノグラフトマウスを作成した。１７日後、腫瘍サイズ、体重にて群分けし（解析ソフト：ＡＮＴＥＳ、体重１８．８～２４．３ｇ、腫瘍サイズ２１５ｍｍ３～３６０ｍｍ３）、実施例１６で調製したＨｉｌｙｔｅ標識ＨＡ誘導体および５０ｋ　ＨＡ－Ｈｉｌｙｔｅ（ＦＬ塩酸塩の代わりにＨｉｌｙｔｅ　ＴＦＡ塩を用いた以外は比較例２－１と同様の方法で調製）を表３９に示す容量で尾静脈投与した。Ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージング装置（ＮｉｇｈｔＯＷＬ９８３、ベルトールド社製）を用いて、６時間後にゼノグラフトマウスを撮影した（７００／７８０ｎｍ、０．５ｍｓｅｃ）。また２４時間後に腫瘍を取り出し、同様にＩｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ装置で撮影した。撮影したデータはすべて解析ソフト（Ｉｎｄｉｇｏ）にて解析した。６時間後のＩｎ　ｖｉｖｏ　イメージング図を図４０に示す。また、腫瘍から得られた光量をグラフ化したものを図４１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
 　この結果より、１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ（サンプル２４－２）は、修飾していないＨＡ（サンプル２４－１）もしくは５０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ（サンプル２４－３）と比べて、腫瘍に集積しやすい特性を有していることが明らかとなった。本発明のＨＡ誘導体に抗がん効果のある薬物を封入（複合化）もしくはコンジュゲートすることにより、腫瘍特異的なターゲティングが可能となる可能性が示された。
〔実施例２５〕コレステリル基とメタクロイル基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡ）のゲル化
　実施例１１で調製した（５０ｋ）ＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌ－８％／ＡＥＭＡ－２７％を超純水にて溶解し（４０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ、１．３μＬ）を加えて混合後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、１００ｍｇ／ｍＬ、２．０μＬ）を加え、５００μＬチューブにて３７℃でインキュベートした。２４時間後、チューブから取り出したところ、ゲル化していることが確認された。これを図４２に示す。
　この結果より、ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡは、ＤＴＴによりゲル化させることが可能であり、コレステリル基による疎水性相互作用による物理架橋と化学架橋の両方を有するデュアルゲルを調製することが可能であることが明らかとなった。このデュアルゲルは物理架橋のみのＨＡ－Ｃｈｏｌよりも封入した薬物をより強固に保持する機能を有することが予想される。
　なお、調製したＨＡ－Ｃ２－Ｃｈｏｌ－８％／ＡＥＭＡ－２７％ゲルを０．９３ｍｇ／ｍｌ　ＣｙＴＭ３標識ｈＧＨ溶液（赤色）２ｍＬ中に加え、室温にて４日間インキュベートしところ、（ＣｙＴＭ３標識ｈＧＨ溶液はＣｙ３　Ｍｏｎｏ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｄｙｅ　Ｐａｃｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とｈＧＨ溶液を用い、説明書に従い調製した。）ゲルが周囲の溶液よりも濃い赤色で染まっていることが確認された（データは示さず）。この結果より、ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡのゲルは、ゲル化後に自発的にｈＧＨを封入することが示された。ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＡＥＭＡのゲルは、タンパク質を安定に封入するという観点から医薬品基材として有用である。
〔実施例２６〕ヒアルロン酸のＮ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシ基にコレステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体の合成
　実施例２－２で調製した、ＨＡ－Ｎａ（５０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡ　６８．２６ｍｇを無水ＤＭＳＯに溶解した。そこに脱水ピリジンに溶解させたコレステリル　Ｎ－（６－イソシアネートヘキシル）カーバメート（ＣＨＩ、４．１５ｍｇ）を滴下し、窒素下、８０℃にて９．５時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルにて再沈殿後、遠心分離にて回収した。得られた白色固体を再度ＤＭＳＯに溶解し、０．３Ｍ　ＮａＣｌ溶液、蒸留水、１０ｍＭ　ＨＣｌ溶液、蒸留水に対して透析し（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ、分画分子量３５００Ｄａ、ＰＩＥＲＣＥ社製）、得られた透析液を凍結乾燥し、５０ｋ　ＨＡ－Ｏ－Ｃ６－Ｃｈｏｌを得た。測定溶媒としてＤＭＳＯ－ｄ６を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ　Ｂｒｕｋｅｒ社製）から実施例２－３－１記載の式にて算出したＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を表４０に示す。
　また、９９ｋＤａ　ＨＡ－ＴＢＡ（１０２．６８ｍｇ）を用い、４．９９ｍｇのＣＨＩを用いた他は同様の方法で合成した９９ｋ　ＨＡ－Ｏ－Ｃ６－Ｃｈｏｌを得た。コレステリル基の導入率を表４０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
〔実施例２７〕ヒアルロン酸のＮ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシ基にコレステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体のＤＬＳ測定
　実施例２６で調製した５０ｋ　ＨＡ－Ｏ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％および９９ｋ　ＨＡ－Ｏ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２％を用い、溶媒として超純水に溶解した他は実施例１７と同様の方法にてＤＬＳ測定を行った。ｚ平均粒子サイズを表４１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058

Claims (18)

  1. 　疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｚは、直接結合、または２～３０個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
    　Ｘ１は、以下の式：
    　－ＮＲｂ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
    　－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｓ－Ｒ、
    　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、および
    　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
    により表される基から選択される疎水性基であり；
    　Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルおよびヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－および－ＮＲｆ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキルおよびヒドロキシＣ２－１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～２個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｒは、ステリル基であり；
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－および－Ｓ－Ｓ－から選択される１～５の基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルまたはヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレンまたはＣ２－８アルケニレンであり；
    　ｍは、１～１００から選択される整数である］
    で表される繰り返し単位を１以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体。
  2. 　式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｘａは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋、から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである］
    で表される繰り返し単位さらに含む、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  3. 　存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が７～４２％である、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. 　存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が７～１５％、または１８～４２％である、請求項３に記載のヒアルロン酸誘導体。
  5. 　Ｙが、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、および－（ＣＨ２）１２－から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  6. 　重量平均分子量が２７ｋＤａ以下である、請求項２の式（ＩＩ）で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として製造することを特徴とする、請求項１～５に記載のヒアルロン酸誘導体。
  7. 　存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が２～５０％である、請求項６に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 　Ｙが、－（ＣＨ２）ｎ１－または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここでｎ１は２～１５の整数であり、ｍ１は１～４の整数である、請求項６または７に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｘｂは、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄを表し；　Ｒｅは、水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
    　Ｒｄは、水素原子、Ｃ１－６アルキルまたは基－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２であり；
    　Ｙｂは、－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２－（ＣＨＲ６）ｐ－２－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｊ－Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ３－ＣＨ２－ＣＨ２）ｚ－Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ４－ＣＨ２－ＣＨ２）ｔ－ＮＨ－または－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ５－ＣＨ２－ＣＨ２）ｙ－Ｏ－であり、
    　ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１～２００から選択される整数であり、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に水素原子またはヒドロキシであり、Ｒ７は、水素原子またはメチルであり、Ｙ３、Ｙ４およびＹ５は、それぞれ独立して、－Ｏ－または－ＮＨ－である］
    で表される繰り返し単位をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  10. 　Ｘｂが、－ＮＲｉ－（ＣＨ２）ｎ２－ＯＨであり、ここで、ＲＩは、水素原子であり、ｎ２は２～１０から選択される整数である、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体。
  11. 　存在する二糖の繰り返し単位に対する式（ＩＩ）で表される繰り返し単位の割合が５０％以下である、請求項９または１０に記載のヒアルロン酸誘導体。
  12. 　式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｘｃは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋、から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンであり；
    　Ｒ１ｃは、
    　－ＣＯ－Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２、
    　－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ２２－Ｙ１、
    　－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）－Ｒ２２－Ｙ１、
    　－ＣＯＮＨ－Ｒ２３－Ｙ１、
    　－ＣＯ－Ｒ２３－Ｙ１、
    　－ＣＯＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－（Ｘ２１－ＣＨ２ＣＨ２）ｎ３－Ｙ１、および
    　－ＣＯ－ＣＨ２ＣＨ２－（Ｘ２１－ＣＨ２ＣＨ２）ｎ４－Ｙ１から選択され、
    　Ｘ２１は、ＯおよびＳから選択され：
    　ｎ３およびｎ４は、それぞれ１～５０の整数を表し；
    　Ｙ１は、アミノ、メルカプト、ホルミル、－Ｘ１４－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１８）＝ＣＨ２から選択され、
    　Ｒ２１は、水素原子またはＣ１－６アルキルから選択され；
    　Ｒ２２およびＲ２３は、２価のＣ２－５０炭化水素基または２価のＣ２－５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２－５０炭化水素基は、１～１０個の－Ｏ－が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分が形成されていてもよく；
    　Ｘ１４は、ＯおよびＮ（Ｒ１９）から選択され；
    　Ｒ１８は水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
    　Ｒ１９は水素原子またはＣ１－６アルキルである］
    で表される繰り返し単位をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  13. 　式（Ｉ）で表される１以上の繰り返し単位；および式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）で表される１以上の繰り返し単位から実質的になる、請求項１～１２のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  14. 　水中で会合により微粒子を形成する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  15. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を担体として含む医薬組成物。
  16. 　薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体。
  18. 　薬物が、薬理活性を有するタンパク質またはペプチドである、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
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