JPWO2017195880A1 - カチオン性基および疎水性基が導入されたヒアルロン酸誘導体 - Google Patents

カチオン性基および疎水性基が導入されたヒアルロン酸誘導体 Download PDF

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Abstract

式（Ｉａ）で表される１以上の繰り返し単位、および式（Ｉｂ）で表される１以上の繰り返し単位を含む、特定のカチオン性基と特定の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体を提供する。

Description

本発明は、カチオン性基により修飾され、さらに疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体、該ヒアルロン酸誘導体および薬物を含む医薬組成物、および該ヒアルロン酸誘導体を有効成分として含む医薬組成物に関する。
体内には消化管粘膜、咽喉粘膜、口腔粘膜、鼻腔粘膜、耳腔粘膜、角膜粘膜、結膜粘膜、肺粘膜、膣粘膜、肛門粘膜などの粘膜が、外部環境や内部臓器に面するさまざまな部位に存在している。粘膜は粘弾性を有するゲルであり、乾燥・温熱などの物理化学的な刺激や、ウイルスや病原体といった外敵から身を守るバリアとして機能している。
医薬品の経粘膜投与は、全身用途もしくは局所用途で用いられるが、全身用途の場合は非侵襲であることからＱＯＬの観点において有益であり、また、局所用途の場合は目的組織への高暴露および全身毒性の低減が可能であることから有益である。しかしながら、多くの場合、投与された薬物の粘膜への接着性および透過性は低く、充分な効果が得られない。特に点眼投与においては、涙による排泄により、透過性が非常に低いことが知られている（非特許文献１）。
経粘膜用のドラッグデリバリー製剤としてリポソーム（非特許文献２〜４）や、表面修飾したナノサスペンジョン（非特許文献５）、ポリマーミセル（非特許文献６）が報告されている。しかしながら、これらの製剤は低分子薬物に適した技術であり、タンパク質、ペプチド医薬品に対しては、封入量が低い、変性が起こるなどの理由から適しておらず、低分子からペプチド、タンパク質まで汎用的に用いることができる技術とは言えない。
また、安全性の面から、製剤に用いる基材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならない。
近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告がある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグリコサミノグリカンの一種である。ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトもその代謝系を有しており、免疫性および毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。
上述の安全性という特性に加え、近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面も注目されている。更に製造の観点からも、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となっており、ヒアルロン酸を基剤として用いたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の研究が盛んに行われている。薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献４）、肝臓へのターゲティング（特許文献５）、抗原性の低減等（特許文献６）が達成できるという報告がなされている。また、生体内にはＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、ＬＹＶＥ−１（Ｌｙｍｐｈｅ Ｖｅｓｓｅｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＨＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）、ＨＡＲＥ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＡレセプターが存在することが報告されている（非特許文献１６および１７）。特にＣＤ４４やＲＨＡＭＭは多くの癌細胞において過剰発現しており、それゆえＨＡを癌ターゲティングキャリアの基材として用いる試みがなされている。その例として、パクリタキセル−ＨＡコンジュゲート（非特許文献１８〜２０および特許文献１１）、カンプトテシン−ＨＡコンジュゲート（特許文献１２）、ドキソルビシン−ＨＰＭＡ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］−ＨＡコンジュゲート（非特許文献２１）、酪酸−ＨＡコンジュゲート（非特許文献２２）、ドキソルビシン封入ＨＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノパーティクル（非特許文献２３）、ｓｉＲＮＡ封入ＨＡゲル（非特許文献２４）、ドキソルビシン封入ＨＡ被覆リポソーム（非特許文献２５）などが挙げられる。さらに、アミド結合により導入したエチレンジアミンリンカーを介してコール酸をコンジュゲートしたＨＡ誘導体について報告されている（非特許文献２６）。これらＨＡを基材としたキャリアは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ４４高発現細胞において効率良く取り込まれることが報告されている（例えば非特許文献１８）。また、ヒトの角膜や結膜にもＣＤ４４やＲＨＡＭＭが発現しており（非特許文献７）、ヒアルロン酸を用いて核酸の取り込みが亢進されることが報告されている（非特許文献８）。一方で、血中滞留性を高めるためにヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシを高度に修飾したヒアルロン酸が開発され、その有用性が示されてきた（特許文献７）。
その他、多糖由来の薬物担体として、コレステリル基などを導入したプルラン誘導体が、水溶液中においてナノサイズの微粒子を形成し、疎水性低分子、ペプチド、タンパク質などと複合化するホスト分子として機能することが報告されている（非特許文献１３）。タンパク質取り込み後の当該プルラン誘導体についての熱力学的評価により、取り込まれたタンパク質が、プルランのヒドロキシとの水素結合により安定化されることが示されている（非特許文献１４）。
また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（特許文献９）およびリノレイン酸を導入したキトサン（非特許文献１５）をタンパク質との複合体形成の材料として利用する報告もある。さらに、特許文献１０には、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、親水性多糖類誘導体の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される組成物が報告されており、特許文献１３には、疎水性基としてコレステリル基を有する基をヒアルロン酸に導入したヒアルロン酸誘導体が、水中で会合により微粒子を形成し、薬物と複合体を形成することが報告されている。特許文献１には、アミノ酸と疎水性基を有する基をヒアルロン酸に導入したヒアルロン酸誘導体が、水中で会合により微粒子を形成し、薬物と複合体を形成し、かつ血中滞留性が高いことが報告されている。
カチオン性多糖であるキトサンに疎水性基を導入し、薬物封入キャリアとして利用する報告（非特許文献９および１０）や、疎水化プルランをカチオン化した報告もある（非特許文献１１）。カチオン化したヒアルロン酸としては、アルギニンを導入した報告（非特許文献１２、特許文献８）や、４級アミンを導入した報告（特許文献２および３）がある。
一方、ヒアルロン酸のカルボキシとコハク酸モノトコフェロールエステルのカルボキシとが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、またはＨ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨを介して結合したヒアルロン酸誘導体が、水溶液中でミセルを形成し、水不溶性薬物を送達させるための担体として使用できることが知られている（特許文献１４）。
また、デキストラン等にスペルミンまたはそのアンモニウム塩を導入し、その一部にさらにコレステリルまたは長鎖アルキルアミンを導入したカチオン性多糖により、プラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率が向上したこと（特許文献１５）、低分子ヒアルロン酸のカルボキシに疎水性の長鎖アミンおよびカチオン性素子としてのスペルミンを導入したものがsiRNAとの複合体形成に有用であること（非特許文献２７）、商品としてのカチオン化されたセルロース：ポリオクタニウム１０（特許文献１６）、ヒアルロン酸のカルボキシとコール酸がエチレンジアミンを介して結合したものが薬物キャリアとして有用であること（特許文献１７）、ヒアルロン酸のカルボキシと脂溶性化合物であるトコフェロールのヒドロキシとがジアミンまたはヒドロキシアルキルアミンを介して結合したものが、薬物キャリアとして利用できること（特許文献１８）が、それぞれ知られている。
国際公開第２０１４／０３８６４１号 国際公開２００８／１３３２６７号 国際公開２００７／６３７２５号 国際公開９２／０６７１４号 特開２００１−８１１０３号公報 特開平２−２７３１７６号公報 国際公開２００６／０２８１１０号 国際公開２０１１／１４８１１６号 国際公開第２００２／０２２１５４号 国際公開第２００８／１３６５３６号 国際公開第２００４／０３５６２９号 国際公開第２００９／０７４６７８号 国際公開第２０１０／０５３１４０号 中国特許出願公開第１０４９４５５３８号明細書 米国特許第６９５８３２５号明細書 特表２０１３−５１６４９８号公報 中国特許出願公開第１０３１４３０２７号明細書 中国特許出願公開第１０４９４５５３８号明細書
Advanced Drug Delivery Reviews 第61巻、第158-171頁、2009年 Advanced Drug Delivery Reviews 第47巻、第39-54頁、2001年 European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 第86巻、第115-119頁、2014年 Journal of Controlled Release 第136巻、第247-253頁、2009年 Translational Vision Science and Technology 第４巻第３号 Ariticle 11、第1-12頁、2015年 International Journal of Nanomedicine 第10巻、第6027-6037頁、2015年 Histochemistry and Cell Biology 第137巻、第165-176頁、2012年 Gene Therapy 第15巻、第6685巻、第668-676頁、2008年 Advanced Drug Delivery Reviews 第62巻、第28-41頁、2010年 Biomaterials 第33巻、第3485-3493頁、2012年 Bioconjugate Chemistry 第19巻、第882-890頁、2008年 CARBOHYDRATE Polymers 第87巻、第2211-2216頁、2012年 Macromolecules 第26巻、第3062-3068頁、1993年 Colloids and Surfaces 第112巻、第91-95頁、1996年 Carbohydrate Polymers 第62巻、第293-298頁、2005年 MOLECULAR PHARMACEUTICS 第5巻、第474-486頁、2008年 Journal of Drug Targeting 第16巻、第91-107頁、2008年 Bioconjugate Chemistry 第10巻、第755-763頁、1999年 Clinical Cancer Research 第14巻、第3598-3606頁、2008年 Bioconjugate Chemistry 第19巻、第1319-1325頁、2008年 Pharmaceutical Research 第19巻、第396-402頁、2002年 Clinical Cancer Research 第10巻、第4822-4830頁、2004年 Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 第3巻、第246-257頁、2007年 Journal of Controlled Release 第119巻、第245-252頁、2007年 Neoplasia 第6巻、第343-353頁、2004年 Journal of Materials Chemistry 第19巻、第4102-4107頁、2009年 Carbohydrate Polymers 第77巻(第1号)、 第95-104頁、2009年
本発明が解決しようとする課題は、安全性と粘膜への接着性・粘膜透過性の両方を兼ね備えたヒアルロン酸誘導体を提供することである。また本発明が解決しようとするさらなる課題は、該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬組成物、特に、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体を提供することである。
本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、特定のカチオン性基と特定の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、安全性と粘膜への接着性・粘膜透過性を有すること、および該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体が医薬組成物として良好な特性を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、粘膜への接着性と粘膜透過性とを併せ持つヒアルロン酸誘導体、および、該ヒアルロン酸誘導体および薬理活性を有する化合物を含有する複合体に関する。さらに本発明は、該ヒアルロン酸誘導体の製造方法、ならびに薬物および該ヒアルロン酸誘導体を含む経粘膜投与に適した医薬組成物およびその製造方法に関する。
本発明の１つの側面において、以下の（１）〜（１５）のヒアルロン酸誘導体が提供される。
（１）式（Ｉａ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択され；
Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１６ａは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｑ−は、カウンターアニオンを表し；
ただし、Ｒ８が水素原子であり、かつＢ１が−ＮＲ１２Ｒ１３である時、ｉ）ｎ１は１〜３の整数かつＡ１は単結合であるか、またはｉｉ）ｎ１は１であり、Ａ１は−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−であり、かつｎ２が１〜３の整数である］
で表される１以上の繰り返し単位、および
式（Ｉｂ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲｂ−Ｚ３、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
Ｒ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｚ０は、以下の基：
Figure 2017195880
 から選択され（式中、「＊」は、酸素原子との結合位置を示し、「＊＊」は、Ｚ１またはＺ２との結合位置を示す）、
Ｚ１は、Ｃ１−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の基：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｄは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ｘ４）２、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
Ｙ３およびＹ４は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６ａ−を表し；
ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ２−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯＲａ、−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ３、−Ｚ１−Ｚ２、−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ０−Ｚ２であり；
Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択される］
で表される１以上の繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
（２）式（ＩＩ）
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘａは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる１以上の繰り返し単位をさらに含む、（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（３）式（ＩＩＩ）
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
Ｘ５は、−ＮＲ１７−Ｒ１８を表し、
Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、
Ｒ１８は、１以上のヒドロキシで置換されていてもよいＣ１−１０アルキルを表す］
で表される１以上の繰り返し単位をさらに含む、（１）または（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（４）Ｘ１が、以下の式：
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ１９およびＲ２０は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
から独立して選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（５）Ｘ５が、以下の式：
Figure 2017195880
 で表されるいずれか１つ以上の基である、（３）または（４）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（６）ステリル基が、以下の式：
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ２１は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表す］
のいずれかで表される、（１）〜（５）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（７）Ｘ２が、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２または−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２であるか、あるいは、Ｘ２が、−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２であり、Ｘ４が−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ３である、（１）〜（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（８）存在する二糖の繰り返し単位における、Ｘ２が−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２または−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合が、３〜５５％である、（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（９）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合が、１〜７５％である、（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（１０）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合、およびＸ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合の和が、３０〜１００％である、（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（１１）Ｒ８が、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０または−ＣＯ２Ｒ１１から選択されるか、または、
Ｂ１が、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択される、（１）〜（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、医薬組成物。
（１３）式（Ｉａ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択され；
Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１６ａは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
で表される１以上の繰り返し単位、および
式（Ｉｂ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−ＯＲａ、−ＮＲａＲ５ｚ、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲｂ−Ｚ３、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
Ｒ５ｚおよびＲ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択され；
Ｚ０は、以下の基：
Figure 2017195880
 から選択され（式中、「＊」は、酸素原子との結合位置を示し、「＊＊」は、Ｚ１またはＺ２との結合位置を示す）；
Ｚ１は、Ｃ１−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の基：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｄは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ｘ４）２、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ２−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯＲａ、−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ３、−Ｚ１−Ｚ２、−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ０−Ｚ２を表す］
で表される１以上の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を、薬物と複合化させる工程を含む、
粘膜透過性を向上させた医薬組成物の製造方法。
（１４）ヒアルロン酸誘導体が、（１）〜（１１）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体である、（１３）に記載の製造方法。
（１５）薬物と、
（１３）に記載のヒアルロン酸誘導体、
とを含む、
経粘膜投与に用いるための医薬組成物。
ここで、（１３）に記載のヒアルロン酸誘導体としては、（１）〜（１１）に記載のヒアルロン酸誘導体が好ましい。また、経粘膜投与に用いるための医薬組成物は、好ましくは、ドライアイ、ぶどう膜炎、結膜炎、加齢黄斑変性、緑内障、視神経保護、網膜色素変性症等の眼科疾患、呼吸器疾患、消化管疾患、耳鼻咽喉疾患、生殖器疾患、および口内炎の予防又は治療に使用される。なお、口内炎の予防又は治療に使用する場合、医薬組成物は、薬物を含まずに、（１３）に記載のヒアルロン酸誘導体を含んでいてもよい。
また、本発明の別の側面において、以下の（２−１）〜（２−１５）のヒアルロン酸誘導体が提供される。
（２−１）式（Ｉａ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む４〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択され；
Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、およびＲ１６は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｑ−は、カウンターアニオンを表し；
ただし、Ｒ８が水素原子であり、かつＢ１が−ＮＲ１２Ｒ１３である時、ｉ）ｎ１は１〜３の整数かつＡ１は単結合であるか、またはｉｉ）ｎ１は１であり、Ａ１は−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−であり、かつｎ２が１〜３の整数である］
で表される１以上の繰り返し単位、および
式（Ｉｂ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
Ｒ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の基：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
Ｙ３およびＹ４は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯＲａまたはＺ３であり；
Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択される］
で表される１以上の繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
（２−２）式（ＩＩ）
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘａは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる１以上の繰り返し単位をさらに含む、（２−１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−３）式（ＩＩＩ）
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
Ｘ５は、−ＮＲ１７−Ｒ１８を表し、
Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、
Ｒ１８は、１以上のヒドロキシで置換されていてもよいＣ１−１０アルキルを表す］
で表される１以上の繰り返し単位をさらに含む、（２−１）または（２−２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−４）Ｘ１が、以下の式：
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ１９およびＲ２０は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
から独立して選択される、（２−１）〜（２−３）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−５）Ｘ５が、以下の式：
Figure 2017195880
 で表されるいずれか１つ以上の基である、（２−３）または（２−４）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−６）ステリル基が、以下の式：
Figure 2017195880
 ［式中、Ｒ２１は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表す］
のいずれかで表される、（２−１）〜（２−５）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−７）Ｘ２が、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２、または−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２であり、Ｘ４が−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２である、（２−１）〜（２−６）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−８）存在する二糖の繰り返し単位における、Ｘ２が−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、または−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合が、３〜５５％である、（２−１）〜（２−７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−９）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合が、１〜７５％である、（２−１）〜（２−８）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−１０）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合、およびＸ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合の和が、３０〜１００％である、（２−１）〜（２−７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−１１）Ｒ８が、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０または−ＣＯ２Ｒ１１から選択されるか、または、
Ｂ１が、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、窒素原子を１〜４個含む４〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択される、（２−１）〜（２−１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（２−１２）式（Ｉａ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む４〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
Figure 2017195880
 から選択され；
Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
で表される１以上の繰り返し単位、および
式（Ｉｂ）：
Figure 2017195880
 ［式中、
Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−ＯＲａ、−ＮＲａＲ５ｚ、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
Ｒ５ｚおよびＲ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択され；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の基：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
Ｙ３およびＹ４は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯＲａまたはＺ３を表す］
で表される１以上の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を、薬物と複合化させる工程を含む、
粘膜透過性を向上させた医薬組成物の製造方法。
（２−１３）ヒアルロン酸誘導体が、（２−１）〜（２−１１）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体である、（２−１２）に記載の製造方法。
（２−１４）薬物と、
（２−１２）に記載のヒアルロン酸誘導体、
とを含む、
経粘膜投与に用いるための医薬組成物。
（２−１５）ヒアルロン酸誘導体が、（２−１）〜（２−１１）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体である、（２−１４）に記載の医薬組成物。
Ｒ８が水素原子であり、Ｂ１が−ＮＲ１２Ｒ１３であり、かつ、Ａ１が単結合である時、ｎ１は１〜２であるのが好ましい。
Ｒ１８が、１以上のヒドロキシで置換されている時は、Ｃ２−１０アルキルであるのが好ましい。
ｎ３個あるｎａおよびｎ１３個あるｎ１４は、それぞれ、同一であっても、異なっていてもよい。
Ｘ４がＺ３である時、Ｚ３は、コラノイル基であるのが好ましい。
ｎ４は、０、１および２であるのが好ましく、０および１であるのが更に好ましく、１であるのがさらに好ましい。
本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化することにより得られる医薬組成物により、薬物の粘膜透過性を向上させることができる。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化することにより、薬物の粘膜付着性を向上させた医薬組成物、薬物の吸収性を向上させた医薬組成物、薬物のバイオアベイラビリティーを向上させた医薬組成物、薬物の毒性または副作用を低減させた医薬組成物、薬物の粘膜内滞留性を向上させた医薬組成物、薬物の眼内移行性を含む組織内移行性を向上させた医薬組成物、薬物の組織内滞留性を向上させた医薬組成物、薬物の化学的安定性を向上させた医薬組成物、薬物の物理安定性を向上させた医薬組成物、および薬物の薬効を向上させた医薬組成物など、性能を向上させた医薬組成物を製造することもできる。なお、これらの医薬組成物は、経粘膜投与に適している。また、安全な医用生体材料であるヒアルロン酸を原料とすることから、本発明のヒアルロン酸誘導体自体の安全性は、高いと言える。
薬物と（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体とを含む、経粘膜投与に用いるための医薬組成物においては、好ましくは、ａ）水溶液中において、（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体の自己会合により形成されたナノサイズ（１〜１，０００ｎｍ）の微粒子（ナノゲル）と薬物を混合することにより、薬物をナノゲル内に封入もしくはナノゲル表面に接着すること、ｂ）薬物を微粉砕化することで得られる粒子を（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体で被覆すること、ｃ）薬物を乾燥状態の（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体と混合または混和することなどにより、（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体と薬効を有する低分子化合物やタンパク質やペプチドなどの薬物とを複合化することができる。薬物の結晶やアモルファスの微粒子、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの他の基材と薬物との複合体を、本発明のヒアルロン酸誘導体で被覆することで、薬物を本発明のヒアルロン酸誘導体と複合化することもできる。乾燥状態の薬物と乾燥状態の本発明のヒアルロン酸誘導体を混合して複合化することもできる。これらの複合化により、粘膜透過性を向上させた医薬組成物や経粘膜投与に用いるための医薬組成物を製造することができる。
本発明のヒアルロン酸誘導体を用いることで、薬物、特に低分子化合物、核酸、および薬効を有するタンパク質やペプチドをその生物活性を維持したまま多量に封入した経粘膜投与用製剤を提供することが可能となる。また、本発明のヒアルロン酸誘導体は、同様にカチオン性を持つポリエチレンイミンと比較して安全性の面においても優れており、薬物の粘膜接着性・粘膜透過性と細胞毒性の双方において、医薬組成物の担体として特に優れた特性を有している。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を、それ自体を有効成分として、例えば、口内炎などの疾患の予防又は治療のために、口腔投与することができる。
実施例２−１で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２のＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＡｒｇＮＨ２の導入率：３１％）である。 実施例２−２で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＥＤＡの導入率：３７％）である。 実施例２−３で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１５％、ＤＥＴの導入率：６９％）である。 実施例２−３で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴのＤ２Ｏ中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１５％、ＤＥＴの導入率：６９％）である。 実施例２−４で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２のＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１６％、ＬｙｓＮＨ２の導入率：３６％）である。 実施例２−５で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：３８％、ＡｒｇＮＨ２の導入率：２２％、Ｍｅの導入率：１７％）である。 実施例２−６で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：３３％、ＥＤＡの導入率：３０％、Ｍｅの導入率：１０％）である。 実施例２−７で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＤＥＴの導入率：２９％、Ｍｅの導入率：４３％）である。 実施例２−７で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／ＭｅのＤ２Ｏ中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＤＥＴの導入率：２９％、Ｍｅの導入率：４３％）である。 実施例２−８で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：３７％、ＬｙｓＮＨ２の導入率：２２％、Ｍｅの導入率：１１％）である。 実施例２−１０で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＳＰＲ／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：２７％、ＳＰＲの導入率：３７％、Ｍｅの導入率：１６％）である。 実施例２−１１で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＴＭＡ／ＭｅのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：２９％、ＰＴＭＡの導入率：２９％、Ｍｅの導入率：３１％）である。 実施例２−１４で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰｒＯＨのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：３１％、ＰｒＯＨの導入率：１９％）である。 実施例２−１４で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＰｒＯＨのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：３１％、ＡｒｇＮＨ２の導入率：１１％、ＰｒＯＨの導入率：１９％）である。 実施例２−２５で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＥｔＯＨのＤＭＳＯ中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１６％、ＡｒｇＮＨ２の導入率：１６％、ＥｔＯＨの導入率：６９％）である。 実施例４−１−１で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＯＢＥＡのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＥＤＯＢＥＡの導入率：５２％）である。 実施例４−１−２で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＧのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＤＥＧの導入率：５１％）である。 実施例４−１−３で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡＧＭＴのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＡＧＭＴの導入率：６８％）である。 実施例４−１−４で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＩＭＤのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１６％、ＩＭＤの導入率：６７％）である。 実施例４−１−５で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＴのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１５％、ＤＰＴの導入率：６０％）である。 実施例４−１−６で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＢＡＥＡのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＢＡＥＡの導入率：６３％）である。 実施例４−１−７で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＡのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１７％、ＤＭＡの導入率：７６％）である。 実施例４−１−８で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＭＰＤのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１２％、ＭＰＤの導入率：５１％）である。 実施例４−２で調製したＨＡ−ＬｙｓＮＨ２／ＣＡのＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（ＬｙｓＮＨ２の導入率：９１％、ＣＡの導入率：２３％）である。 実施例５−２で調製したＨＡ−Ｃ３Ｈ６−ＯＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２のＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：２０％、ＬｙｓＮＨ２の導入率：２９％）である。 実施例５−４で調製したＨＡ−ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２のＤＣｌ／ＤＭＳＯ／Ｄ２Ｏ混液中１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：１３％、ＬｙｓＮＨ２の導入率：７０％）である。 ５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルに対してＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎面積推移を示したグラフである（Mean ± SE, n=10）。 ５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルに対してＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎面積のＡＵＣを示したグラフである（Mean + SE, n=10, p: t検定）。 ５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルに対してＧ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎面積推移を示したグラフである（Mean ± SE, n=６）。 ５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルに対してＧ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎面積のＡＵＣを示したグラフである（Mean + SE, n=６, p: Dunnett検定）。 放射線誘発ハムスター口内炎モデルモデルに対してＫＧＦ含有ＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎スコア推移を示したグラフである（Mean ± SE, n=６）。 放射線誘発ハムスター口内炎モデルモデルに対してＫＧＦ含有ＨＡ誘導体を局所投与した際の口内炎スコアＡＵＣを示したグラフである（Mean + SE, n=６, p: Dunnett検定, t検定）。 放射線誘発ハムスター口内炎モデルモデルに対してＫＧＦ含有ＨＡ誘導体を局所投与した際の体重推移を示したグラフである（Mean ± SE, n=６）。 実施例２および実施例４で得られたＨＡ誘導体が細胞増殖へ与える影響を細胞生存率で示したグラフである。
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明のヒアルロン酸誘導体は、カチオン性の部位を有する基Ｘ１を導入した式（Ｉａ）、および疎水性の部位を有する基Ｘ２を導入した式（Ｉｂ）で表される二糖単位（繰り返し単位でもある）をそれぞれ１以上含むヒアルロン酸誘導体である。
本発明の一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、上記式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）に加えて、式（ＩＩ）、基Ｘ５を導入した式（ＩＩＩ）、または式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される二糖単位をさらに含む。
本発明の一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（１）上記式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）、（２）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩ）、（３）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩＩ）、または（４）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば６５％以上が、好ましくは８０％以上が、より好ましくは９０％以上が式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の繰り返し単位である。本発明の一つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（１）上記式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）、（２）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩ）、（３）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩＩ）、または（４）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する特定の二糖単位の割合は、二糖単位を繰り返し単位とする多糖類である本発明のヒアルロン酸誘導体の一定量に含まれる全ての二糖単位に対する特定の二糖単位の割合を意味する。
本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉａ）および（Ｉｂ）において、Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘ、およびＲ４ｘ、ならびにＲ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙ、およびＲ４ｙは、好ましくはいずれも水素原子である。Ｒ５ｘおよびＲ５ｙは、好ましくは水素原子または（Ｃ１−６アルキル）カルボニルであり、さらに好ましくは水素原子またはアセチルであり、より好ましくはアセチルである。また、本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａ、ならびにＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、好ましくはいずれも水素原子である。Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、好ましくは水素原子または（Ｃ１−６アルキル）カルボニルであり、さらに好ましくは水素原子またはアセチルであり、より好ましくはいずれもアセチルである。
本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉａ）におけるＸ１、式（Ｉｂ）におけるＸ２、および／または式（ＩＩＩ）におけるＸ５に不斉中心が存在する場合は、それぞれの光学異性体およびそれらの混合物も、本発明の範囲に含まれる。
本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉａ）におけるカチオン性基Ｘ１の具体例としては、好ましくは以下の式：
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられる。ここで、「＊」は、結合位置を表す。
Ｘ１の具体例として、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（l）、（m）、（n）、（o）、（p）、（q）、（r）、（s）、（t）、（u）、（w）、（x）、（y）、（z）、（aa）、（ab）、（ac）、（ad）および（ah）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（m）、（n）、（s）、（t）、（u）、（y）、（z）および（ah）で表される基が挙げられる。これらのＸ１は、経粘膜投与に用いるための医薬組成物の観点でも好ましいものである。前記の観点でさらに好ましいＸ１としては、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（u）、（z）および（ah）で表される基が挙げられる。前記の観点で好ましいＸ１の導入率は、例えば３〜９５％であり、さらに好ましくは６〜８４％である。例えば、Ｘ１が式（a）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１０〜５０％であり、さらに好ましくは１９〜４５％である。Ｘ１が式（b）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜９０％であり、さらに好ましくは２８〜７４％である。Ｘ１が式（c）、（d）、（e）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１３〜７５％であり、さらに好ましくは２５〜６３％である。Ｘ１が式（f）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１０〜９０％であり、さらに好ましくは２２〜８４％である。Ｘ１が式（g）、（h）、（i）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは３〜６０％であり、さらに好ましくは６〜４６％である。Ｘ１が式（l）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８０％であり、さらに好ましくは２０〜７０％、さらに好ましくは４５〜６５％、さらに好ましくは５２〜５４％である。Ｘ１が式（m）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８０％であり、さらに好ましくは２０〜７０％、さらに好ましくは３５〜６７％、さらに好ましくは４５〜５７％、さらに好ましくは５０〜５２％である。Ｘ１が式（n）、（o）、（p）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８０％であり、さらに好ましくは２０〜７０％、さらに好ましくは４６〜９０％、さらに好ましくは５６〜８０％、さらに好ましくは６６〜７０％である。Ｘ１が式（q）、（r）、（s）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８５％であり、さらに好ましくは２０〜８５％、さらに好ましくは４５〜８５％、さらに好ましくは６７〜７１％ある。Ｘ１が式（t）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８５％であり、さらに好ましくは２０〜８５％、さらに好ましくは３８〜８２％、さらに好ましくは４８〜７２％、さらに好ましくは５８〜６２％である。Ｘ１が式（u）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは５〜８０％であり、さらに好ましくは８〜７０％、さらに好ましくは１０〜４３％、さらに好ましくは１５〜２７％である。Ｘ１が式（w）、（x）、（y）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは1５〜８０％であり、さらに好ましくは２０〜７０％、さらに好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６３％である。Ｘ１が式（z）、（aa）、(ab)で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜９５％であり、さらに好ましくは２０〜９５％、さらに好ましくは５０〜９５％、さらに好ましくは６０〜９０％、さらに好ましくは７４〜７８％である。Ｘ１が式（ac）、(ad)、（ah）で表される基である時、Ｘ１の導入率は、好ましくは１５〜８０％であり、さらに好ましくは２０〜７０％、さらに好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは３９〜６４％、さらに好ましくは４９〜５４％である。
点眼投与に適するヒアルロン酸誘導体の観点で好ましいＸ１としては、例えば式（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（l）、（m）、（n）、（o）、（p）、（q）、（r）、（s）、（t）、（u）、（z）、（aa）、（ab）、（ac）、（ad）および（ah）で表される基が挙げられ、式（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（l）、（m）、（n）、（q）、（r）、（s）、（t）、（u）、（z）、（ac）、（ad）および（ah）で表される基がさらに好ましく、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（m）、（n）、（s）、（u）、（z）および（ah）で表される基がさらに好ましく、式（a）、（b）、（c）、（h）、（s）、（u）および（ah）で表される基がさらに好ましく、式（a）、（b）、（c）、（h）、（s）および（ah）で表される基がさらに好ましい。
口内炎治療を含む、口腔投与に適するヒアルロン酸誘導体を製造するための、好ましいＸ１としては、例えば式（b）で表される基が挙げられる。
本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩＩ）における基Ｘ５の具体例としては、好ましくは以下の式：
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられ、さらに好ましくは式（ba）、（bb）、（bc）、（bd）および（bf）で表される基が挙げられる。また、式（ba）、（bb）、（bc）、（bd）および（be）で表される基も、別のさらに好ましい基として挙げられる。
点眼投与に適するヒアルロン酸誘導体においては、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位は、含んでいてもいなくてもよく、含んでいる場合は、基Ｘ５が式（ba）、（bd）および（be）で表される基である式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含むのが好ましく、基Ｘ５がｉ）式（ba）および（be）またはｉｉ）式（ba）および（bd）で表される基である式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含むのがさらに好ましい。
点眼投与に適するヒアルロン酸誘導体においては、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位は、含んでいるのが好ましく、基Ｘ５が式（ba）、（be）で表される基である式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含むのがさらに好ましい。Ｘ５の導入率は、５〜７０％であるのが好ましく、７〜６３％であるのがさらに好ましい。
経粘膜投与に用いるための医薬組成物の観点では、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位は、含まないか、基Ｘ５が式（ba）で表される基である式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含むのが好ましい。本発明のヒアルロン酸誘導体が式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含まない時、カチオン性の部位を有する基Ｘ１の導入率は、好ましくは１０〜９０％であり、さらに好ましくは１９〜８４％である。本発明のヒアルロン酸誘導体が式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含む時、Ｘ１の導入率は、好ましくは４〜６０％であり、さらに好ましくは６〜４６％である。また、Ｘ１の導入率とＸ５の導入率の組み合わせ（Ｘ１の導入率：Ｘ５の導入率）は、好ましくは（４〜６０％：２〜８０％）であり、さらに好ましくは（６〜４６％：４〜６７％）である。なお、Ｘ１の導入率とＸ５の導入率の和の上限は、９９％である。下限は６％以上であればよい。
本発明において「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、２−エチルブチルなどが含まれる。Ｃ１−２０アルキルには、炭素数が１〜１２の「Ｃ１−１２アルキル」、炭素数が１〜１０の「Ｃ１−１０アルキル」、炭素数が１〜６の「Ｃ１−６アルキル」も含まれる。同様に、「Ｃ８−５０アルキル」とは、炭素数８〜５０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味する。
本発明において「Ｃ８−５０アルケニル」とは、炭素−炭素二重結合を１以上含む炭素数８〜５０の直鎖状、分岐鎖状のアルケニル基を意味し、「Ｃ８−５０アルキニル」とは、炭素−炭素三重結合を１以上含む炭素数８〜５０の直鎖状、分岐鎖状のアルキニル基を意味する。Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルにおいては、Ｃ８−５０アルキルが好ましい。また、炭素数は、１０〜３０が好ましく、１０〜２０がより好ましい。具体例としては、ラウリル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基などが挙げられる。
本発明において「（Ｃ１−６アルキル）カルボニル」とは、アルキル部分がＣ１−６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−プロピルカルボニル、ｉ−プロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、ｓ−ブチルカルボニル、ｉ−ブチルカルボニル、ｔ−ブチルカルボニルなどが含まれる。
本発明において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に、１または複数個の、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子を含有する芳香族性の環の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、またはベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリールであってもよい。環を構成する原子の数は、例えば５〜１０である。ヘテロアリールの例としては、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられ、好ましくはイミダゾリルが挙げられる。
本発明において「窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール」とは、環を構成する５〜１０の原子中に、１〜４の窒素原子を含有するヘテロアリールを意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、インドリジニル、イミダピリジルなどが挙げられ、好ましくはイミダゾリルが挙げられる。
本発明において「Ｃ２−３０アルキレン」とは、炭素数２〜３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレンなどが含まれ、炭素数が２〜１０の「Ｃ２−１０アルキレン」、炭素数が２〜８の「Ｃ２−８アルキレン」も含まれる。
本発明において「Ｃ１−３０アルキレン」とは、炭素数１〜３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレンなどが含まれ、炭素数が２〜３０の「Ｃ２−３０アルキレン」も含まれる。
本発明において「Ｃ１−５アルキレン」とは、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイルなどが含まれる。
本発明において「アミノＣ２−２０アルキル」とは、置換基としてアミノを有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「アミノＣ２−１２アルキル」も含まれる。
本発明において「ヒドロキシＣ２−２０アルキル」とは、置換基としてヒドロキシを有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「ヒドロキシＣ２−１２アルキル」も含まれる。
本発明において「ステリル基」とは、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、デヒドロコレステロール、コプロステノール、コプロステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸（コラン酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、アポコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、グリココール酸、タウロコール酸）、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロンなどが挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基、コラノイル基、コロイル基などが挙げられ、好ましくは以下の式：
Figure 2017195880
 で表される基（ここで、Ｒ２１は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、「＊」は、結合位置を表す。）が挙げられ、さらに好ましくは式（ck）、（cl）および（cm）で表される基が挙げられ、さらに好ましくはコレステリル基（特に、下式で示されるコレスタ−５−エン−３β−イル基）、コラノイル基（特に、下式で示される５β−コラン−２４−オイル基）が挙げられる。
Figure 2017195880
本発明において「Ｃ２−８アルケニレン」とは、炭素数２〜８の直鎖状または分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の炭化水素基を意味し、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイル、オクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイルなどが含まれる。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体およびそれらの混合物も含まれる。
Ｑ＋はカルボキシと水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシと塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１−６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ−ブチルであるのが好ましい。
Ｑ−はアンモニウム塩と塩を形成するカウンターアニオンであれば特に限定されない。カウンターアニオンの例としては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲンイオンおよびヒドロキシイオンなどが挙げられる。
本発明のヒアルロン酸誘導体は薬物担体として使用することができる。当該薬物担体は好ましくは生分解性である。また、本発明のヒアルロン酸誘導体は粘膜透過性が向上したものであり、薬物と複合化することで、薬物の粘膜透過性を向上させることができる。
ここで粘膜透過性が向上するとは、哺乳動物、特にマウス、ラット、ウサギ、ブタおよび／またはヒトに経粘膜投与後、粘膜層を透過し、上皮層もしくはさらに内部の組織への到達度合が増すことを意味する。「上皮層もしくはさらに内部の組織への到達度合」は、例えば、蛍光標識した本発明のヒアルロン酸誘導体もしくは蛍光標識した薬物の上皮層中、内部組織中での存在度合を顕微鏡で確認することにより評価できる。経口投与の場合は、薬物や本発明のヒアルロン酸誘導体の血中濃度を定量することによっても評価できる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する場合は、角膜などの粘膜を産生している多層細胞を透過する度合を評価する方法や、粘膜無産生細胞上に粘膜成分を重層し、その粘膜成分を、本発明のヒアルロン酸誘導体や薬物が透過する度合を評価する方法を用いることができる。
本発明において、「経粘膜投与」としては、結膜または角膜上への点眼、鼻腔を覆っている粘膜を経由する経鼻吸入、肺胞の粘膜を経由する経肺吸入、気管粘膜や気管支粘膜に対する吸入、口腔内の粘膜を経由する口腔投与や舌下投与、膣内の粘膜を経由する経膣投与、胃、十二指腸、小腸、結腸および直腸を含む大腸などの消化管粘膜を経由する経口投与や直腸投与、ならびに中耳粘膜に対する中耳投与などが挙げられる。好ましい投与は、点眼、経鼻吸入、経肺吸入、気管または気管支吸入、口腔投与、舌下投与および経口投与であり、さらに好ましい投与は、点眼、経鼻吸入、経肺吸入、気管または気管支吸入、口腔投与および舌下投与である。
本発明の別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する、カチオン性の部位を有する基Ｘ１（−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１：式中、Ｒ７、Ｒ８、ｎ１、Ａ１、およびＢ１は本明細書に既に定義されたとおりである）を有する式（Ｉａ）の繰り返し単位の割合（基Ｘ１の導入率）が例えば１〜７５％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する、疎水性の部位を有する基Ｘ２（−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、または−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２である場合：式中、Ｚ３、Ｚ１、Ｚ２、およびＲ６は本明細書に既に定義されたとおりである）を有する式（Ｉｂ）の繰り返し単位の割合（疎水性の部位を有する基Ｘ２の導入率）が例えば３〜５５％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する、疎水性の部位を有する基Ｘ２（−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２または−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である場合：式中、Ｚ３、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ０、Ｒ６、Ｒ３１、Ｒ３２、ｎ１１、Ａ３およびＢ２は本明細書に既に定義されたとおりである）を有する式（Ｉｂ）の繰り返し単位の割合（疎水性の部位を有する基Ｘ２の導入率）が例えば３〜５５％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する、基Ｘ１の導入率、および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である基Ｘ２（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、ｎ１１、Ａ３、およびＢ２は本明細書に既に定義されたとおりである）を有する式（Ｉｂ）の繰り返し単位の割合の和が例えば３０〜１００％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。 カチオン性の部位を有する基Ｘ１の導入率は、例えば１〜９０％、好ましくは１〜７５％であり、具体的には、１、２．５、６、７．４、１１、１７、２１、２８、３５、４４、５３、６１、６５、７０、７３、または７５％である。また、好ましい基Ｘ１の導入率は、２〜９０％でもあり、具体的には、３、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５２、５４、６０、６３、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７５、７６、７９または８５％でもある。
点眼投与に適するヒアルロン酸においては、好ましい基Ｘ１の導入率は、２〜８０％、さらに好ましくは３〜７６％であり、さらに好ましくは１３〜６７％であり、具体的には、３、１１、１３、１７、２２、２４、、２８、３１、４１、４３、４６、５１、５２、６７、６８、７５または７６％、好ましくは、１３、１７、２４、２８、３１、４１、４３、４６、５１または６７％である。
口腔投与に適するヒアルロン酸においては、好ましい基Ｘ１の導入率は、５〜５０％、さらに好ましくは１０〜３０％であり、具体的には、１６、２０および２８％である。
疎水性の部位を有する基Ｘ２の導入率は、例えば３〜５５％であり、具体的には、３、８、１２、１６、２１、２５、３０、３４、３９、４３、４８、５１、または５５％である。Ｘ２がこれらの導入率である時、Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、および−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２であるのが好ましい。さらに、Ｘ２がこれらの基である時、Ｘ１の導入率とＸ２の導入率の和は、１００％以下である。例えば、Ｘ２の導入率が５５％である時、Ｘ１の導入率は４５％以下である。
点眼投与および口腔投与に適するヒアルロン酸においては、Ｘ２は、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２であるのが好ましく、その導入率は、点眼投与では、例えば８〜５０％、好ましくは１２〜４４％であり、口腔投与では、例えば５〜４０％、好ましくは１０〜２０％である。具体的な導入率としては、１２、１５、１６、１７、１８、２６、３９および４４％が挙げられる。
−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２において、Ｚ１と結合するＺ２中の原子が酸素原子または窒素原子である場合、Ｃ１−３０アルキレンであるＺ１は、Ｃ２−３０アルキレンであるのが好ましい。同様に、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２において、Ｚ１と結合する、Ｚ０およびＺ２中の原子が、それぞれ酸素原子または窒素原子である場合、Ｃ１−３０アルキレンであるＺ１は、Ｃ２−３０アルキレンであるのが好ましい。Ｚ１がＣ１アルキレン（−ＣＨ２−）である時、その炭素原子は、ヒドロキシまたはＣ１−６アルキルで修飾されていてもよく、あるいは、−ＣＨ２−は、アミノ酸残基に置き換えられてもよい。例えば、−ＣＨ２−は、セリン残基である−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−に置き換えられてもよい。
基Ｘ２の一例である基−ＮＲｂ−Ｚ３の具体例としては、例えば、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられる。
基Ｘ２の一例である基−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２としては、例えば、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられる。Ｒｙは、後述する、式（ca）、（cb）、（cc）、（cd）、（ce）、（cf）および（cg）で表される基である。基−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２としては、好ましくは、それぞれＲｙが（ca）である式（daa）、（dba）、（dca）および（dda）で表される基、ならびにそれぞれＲｙが（cg）である式（daa）、（dba）および（dda）で表される基が挙げられ、さらに好ましくは、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられる。
基Ｘ２の一例である基−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２および−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２としては、例えば、以下の式
Figure 2017195880
 および
Figure 2017195880
 で表される基が挙げられる。Ｒｙｂは、後述する式（ck）、（cl）および（cm）で表される基である。−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２および−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２としては、式（ec）、（ee）、（ep）、（eq）、（er）、（ef3）、（eg3）および（ez）で表される基が好ましく、（eq）、（ef3）、（eg3）および（ez）で表される基がさらに好ましい。また、式（ea）、（eb）、（ec）、（ed）、（ee）、（en）、（ep）、（er）、（es）、（ef3）、（eb2）、（ec2）、（ed2）、（ee2）、（ef2）、（eg2）、（eh2）、（ek2）および（eq2）で表される基においては、Ｒｙｂは、（cl）および（cm）であるのが好ましく、式（ef）、（eg）、（eh）、（ei）、（ej）、（ek）、（el）、（em）、（eo）、（eq）、（et）、（eu）、（ev）、（ew）、（ex）、（ey）、（eg3）、（ez）、（ea2）、（ei2）、（ej2）、（el2）、（em2）、（en2）、（eo2）、（ep2）、（er2）、（es2）、（et2）、（eu2）、（ev2）、（ew2）、（ex2）、（ey2）、（ez2）、（ea3）、（eb3）、（ec3）、（ed3）および（ee3）で表される基においては、Ｒｙｂは、（ck）であるのが好ましい。−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２および−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２としては、Ｒｙｂが（cl）および（cm）である式（ef3）で表される基、ならびに、Ｒｙｂが（ck）である式（eq）、（eg3）および（ez）で表される基が好ましく、Ｒｙｂが（ck）である式（eg3）および（ez）で表される基がさらに好ましい。
Ｘ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である場合、その導入率は、例えば３〜５５％であり、具体的には、３、４、８、１２、１６、１８、２１、２３、２５、３０、３４、３９、４３、４７、４８、５１、または５５％である。
基Ｘ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である場合、基Ｘ１、および基Ｘ２の導入率の和は、例えば３０〜１００％であり、具体的には、３０、３６、４１、４４、４９、５６、６１、６６、７０、７５、７９、８３、８８、９２、９６、または１００％である。
ここで、基Ｘ２の導入率は、例えば３、８、１２、１６、２１、２５、３０、３４、３９、４３、４８、５１、または５５％であり、基Ｘ１の導入率は、例えば１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、７２、８４，９５または９７％である。
基Ｘ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である場合、Ｒ３２は−ＣＯＮＨ２、Ａ３は、単結合、Ｂ２は、−ＮＨ−Ｘ４、Ｘ４は−Ｚ３、−ＣＯ２−Ｚ３および−ＣＯ−（Ｃ２−６アルキレン）−ＣＯＯ−Ｚ３であるのが好ましく、具体例としては、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基であるのが好ましい。 基Ｘ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である場合、基Ｘ１と基Ｘ２の組み合わせは、Ｘ１が、式（a）で表される基であり、Ｘ２が、式（fa）、（fb）および（fc）で表される基であるのがさらに好ましく、Ｘ１が、式（a）で表される基であり、Ｘ２が、式（fa）で表される基であるのがさらに好ましい。該基の組み合わせは、経粘膜投与に用いるための医薬組成物の観点で好ましい組み合わせである。Ｘ１の導入率とＸ２の導入率の組み合わせ（Ｘ１の導入率：Ｘ２の導入率）は、好ましくは（３０〜９０％：２〜７０％）であり、さらに好ましくは（４２〜８３％：３〜５０％）である。
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、基Ｘ１を有する式（Ｉａ）および基Ｘ２を有する式（Ｉｂ）に加えて、さらに基Ｘａ（ヒドロキシまたは−Ｏ−Ｑ＋：Ｑ＋は、カウンターカチオンを表す）を有する式（ＩＩ）、または基Ｘａを有する式（ＩＩ）および基Ｘ５（−ＮＲ１７−Ｒ１８：式中、Ｒ１７およびＲ１８は本明細書に既に定義されたとおりである）を有する式（ＩＩＩ）で表される二糖の繰り返し単位を含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する、基Ｘ５を有する式（ＩＩＩ）の繰り返し単位の割合（Ｘ５の導入率）は、例えば０〜９０％であり、好ましくは０および１〜９０％であり、より好ましくは０および４〜６２％である。
ここで、基Ｘ１の導入率、基Ｘ２の導入率、または基Ｘ５の導入率は、以下の式：
Figure 2017195880
 により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
本発明のヒアルロン酸誘導体を製造するための原料としては、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩を使用することができる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）を挙げることができ、例えば、医薬品として繁用されているナトリウム塩をテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩などのテトラアルキルアンモニウム塩に変換して使用することができる。ＨＡまたはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社等から）入手することも可能である。
原料として用いられる、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量は、例えば１ｋＤａ〜２，０００ｋＤａである。薬物の粘膜透過性の観点では、好ましくは３ｋＤａ〜１０００Ｄａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ〜２００ｋＤａであり、より好ましくは５ｋＤａ〜１５０ｋＤａであり、さらに好ましくは１０ｋＤａ〜１００ｋＤａである。粒子径や粘度をより小さくする、または溶解性を高める場合には、該重量平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａが好ましく、５ｋＤａ〜２００ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａがさらに好ましい。粘度を大きくする、または皮下や関節腔内、眼内、耳内、鼻腔内、膣内、口腔内での滞留性を高める場合には、該重量平均分子量は、４５ｋＤａ〜２０００ｋＤａが好ましく、５０ｋＤａ〜２０００ｋＤａがさらに好ましく、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましく、２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましい。重量平均分子量の具体例としては、例えば、１ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７８ｋＤａ、８９ｋＤａ、９２ｋＤａ、９９ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１２ｋＤａ、１２６ｋＤａ、１３４ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６８ｋＤａ、１８２ｋＤａ、２００ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２７１ｋＤａ、３１４ｋＤａ、３７９ｋＤａ、４２３ｋＤａ、４６８ｋＤａ、５００ｋＤａ、６５１ｋＤａ、７８６ｋＤａ、８２４ｋＤａ、９１５ｋＤａ、１０００ｋＤａ、１０５８ｋＤａ、１２６５ｋＤａ、１３５５ｋＤａ、１４１２ｋＤａ、１５００ｋＤａ、１６１７ｋＤａ、１７６８ｋＤａ、１８５３ｋＤａ、１９４５ｋＤａおよび２０００ｋＤａが挙げられる。「ｋＤａ」は「キロダルトン」の略号である。
なお、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量とは、本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖構造を保持したまま、式（ＩＩ）における、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの全てを水素原子とし、Ｒ５ａをアセチルとし、かつ、Ｘａを−Ｏ−Ｎａ＋として換算した場合の重量平均分子量を意味する。従って、例えば、実際に用いる原料における一部または全ての二糖単位においてＸａが−Ｏ−（テトラｎ−ブチルアンモニウムイオン）であり、その重量平均分子量を上記に従って換算して算出された値が前記の重量平均分子量の範囲に含まれる場合は、本発明の好ましい１態様に含まれることになる。
本発明の１つの側面において、本発明のヒアルロン酸誘導体に主鎖構造が対応する誘導体化されていないヒアルロン酸の重量平均分子量が１ｋＤａ〜２，０００ｋＤａである。ここで誘導体化されていないヒアルロン酸は、既に定義した式（ＩＩ）においてＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａが水素原子であり、Ｒ８ａがアセチルであり、Ｘａが−Ｏ−Ｎａ＋である繰り返し単位のみからなるヒアルロン酸である。薬物の粘膜透過性の観点では、好ましくは３ｋＤａ〜１０００Ｄａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ〜２００ｋＤａであり、より好ましくは５ｋＤａ〜１５０ｋＤａであり、さらに好ましくは１０ｋＤａ〜１００ｋＤａである。粒子径や粘度をより小さくする、または溶解性を高める場合には、該重量平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａが好ましく、５ｋＤａ〜２００ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａがさらに好ましい。粘度を大きくする、または皮下や関節腔内、眼内、耳内、鼻腔内、膣内、口腔内での滞留性を高める場合には、該重量平均分子量は、４５ｋＤａ〜２０００ｋＤａが好ましく、５０ｋＤａ〜２０００ｋＤａがさらに好ましく、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましく、２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましい。該重量平均分子量の具体例としては、例えば、１ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７８ｋＤａ、８９ｋＤａ、９２ｋＤａ、９９ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１２ｋＤａ、１２６ｋＤａ、１３４ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６８ｋＤａ、１８２ｋＤａ、２００ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２７１ｋＤａ、３１４ｋＤａ、３７９ｋＤａ、４２３ｋＤａ、４６８ｋＤａ、５００ｋＤａ、６５１ｋＤａ、７８６ｋＤａ、８２４ｋＤａ、９１５ｋＤａ、１０００ｋＤａ、１０５８ｋＤａ、１２６５ｋＤａ、１３５５ｋＤａ、１４１２ｋＤａ、１５００ｋＤａ、１６１７ｋＤａ、１７６８ｋＤａ、１８５３ｋＤａ、１９４５ｋＤａおよび２０００ｋＤａが挙げられる。
なお、一般的に、ヒアルロン酸（塩を含む）は単一品として得ることが難しいため、その分子量は、数平均分子量または重量平均分子量として算出する。本発明においては、重量平均分子量として算出している。重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４−０６−１５３３１０−Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。従って、原料として用いられるヒアルロン酸（塩を含む）や本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量も、重量平均分子量として算出されることになる。分子量を明示して市販されているヒアルロン酸（塩を含む）を使用する場合は、その明示された数値を分子量とすることもできる。
本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、粘膜透過性が求められる場合には粘度および分子量の低いヒアルロン酸が好ましく、投与部位での滞留性が求められる場合には、粘度および分子量の高いヒアルロン酸が好ましい。
本発明において、式（Ｉａ）で表される二糖単位におけるカチオン性の部位を有する基Ｘ１は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドに変換することにより導入することができる（工程１）。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩を、式：ＨＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１（式中、Ｒ７、Ｒ８、ｎ１、Ａ１、およびＢ１は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物と反応させる方法が挙げられる。
本発明において、式（Ｉｂ）で表される二糖単位における疎水性の部位を有する基Ｘ２は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドまたはエステルに変換することにより導入することができる（工程２）。
アミドへの変換は、例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩を、式：ＨＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２（式中、Ｒ６、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミン、または、式：ＨＮＲｂ−Ｚ３、式：ＨＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２もしくは式：ＨＮＲａＲ５ｚ（式中、Ｒｂ、Ｚ３、Ｒ３１、Ｒ３２、ｎ１１、Ａ３、Ｂ２、ＲａおよびＲ５ｚは本明細書で既に定義したとおりである）で表されるアミンと反応させる方法が挙げられる。
エステルへの変換は、例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：Ｈａｌ−Ｚ３、Ｈａｌ−Ｒａ、Ｈａｌ−Ｚ１−Ｚ２、Ｈａｌ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２またはＨａｌ−Ｚ０−Ｚ２（式中、Ｚ３、Ｒａ、Ｚ０、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌはハロゲン原子を表す）で表される疎水性基を導入したハライドとを反応させる方法（方法１）、または原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、必要に応じてテトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換後、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式ＨＯ−Ｚ３、ＨＯ−Ｒａ、ＨＯ−Ｚ１−Ｚ２、ＨＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２またはＨＯ−Ｚ０−Ｚ２（式中、Ｚ３、Ｒａ、Ｚ０、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアルコールとを反応させる方法（方法２）が挙げられる。
本発明において、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位における基Ｘ５は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドに変換することにより導入することができる（工程３）。例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩を、式：ＨＮＲ１７−Ｒ１８（式中、Ｒ１７、およびＲ１８は本明細書で既に定義したとおりである）で表される基を導入したアミンと反応させる方法が挙げられる。
式（Ｉａ）における基Ｘ１、式（Ｉｂ）における基Ｘ２、および式（ＩＩＩ）における基Ｘ５は、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式で表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。また、式（ＩＩ）における基Ｘａも、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。
上記のアミドへの変換反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
特に、限定はされないが、ＤＭＴ−ＭＭは水および有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ−ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノとカルボキシによるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシと反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシとヒドロキシとが、分子内もしくは分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
上記のアミドへの変換反応において用いる溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジオキサン（例えば１，４−ジオキサン）、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。出発物質、修飾物および生成物の溶解性と、縮合剤の反応性の観点からは、ＤＭＳＯ単独もしくは水／ＤＭＳＯ混合溶媒を使用するのが好ましい。修飾物であるアミノ−カルボン酸の種類によっては、それをメタノール溶液やジオキサン溶液として反応に用いてもよい。
上記のエステルへの変換反応において用いる縮合剤としては、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができ、好ましくは、ＤＭＴ−ＭＭを挙げることができる。
上記のエステルへの変換反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。
アミドへの変換反応は、基Ｘ２が−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２である場合は、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護および脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）またはその塩を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシから変換される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯＺ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＯＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＣＯＯＨ ＋ ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＯＣＯ−Ｈａｌ ＋ ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＯＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＯＣＯＯＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＯＣＯ−Ｈａｌ ＋ ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＣＯ−Ｚａ−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｚ３
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＣＯ−Ｚａ−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ６−Ｚ１−ＳＨ ＋ ＨＳ−Ｒ、
（式中、Ｒ６、Ｚ１、Ｒｂ、ＲｃおよびＺ３は本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す）。
反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体または反応物がカルボキシを有する場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
また、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシに、２−アミノエチル ２−ピリジル ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法を挙げることもできる。
さらに、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシにスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法を挙げることもできる。具体例の一部は上述したが、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシに、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法を挙げることもできる。このとき、一方のメルカプトを２−メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプトと置換させることもできる。
エステルへの変換反応は、Ｘ２が−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２である場合は、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護および脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から変換される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂ−ＣＯＯＨ ＋ ＨＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂ−ＣＯＮＲｃＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ２ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＯＨ ＋Ｈａｌ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＯＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＯＣＯＯＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＯＣＯ−Ｈａｌ ＋ ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＣＯ−Ｚａ−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＣＯ−Ｚａ−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ−Ｚ３、および
−ＣＯＯ−Ｚ１−ＳＨ ＋ ＨＳ−Ｚ３、
（式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｒｂ、ＲｃおよびＺａは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す）。
反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体または反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
上記反応において用いられる保護基の具体例は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
ヒドロキシの保護基の例としては、（Ｃ１−６アルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル、（Ｃ１−６アルコキシ）Ｃ１−６アルキル、（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アリール（Ｃ１−６アルキル）、ヘテロアリール（Ｃ１−６アルキル）、（アリール（Ｃ１−６アルキル））アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、（（アミノＣ１−６アルキル）カルボニルオキシ）Ｃ１−６アルキル、不飽和ヘテロ環カルボニルオキシＣ１−６アルキル、アリールジ（Ｃ１−６アルキル）シリル、トリ（Ｃ１−６アルキル）シリルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシの保護基としては、アセチルなどが挙げられる。
−ＮＨ−またはアミノの保護基の例には、（Ｃ１−６アルキル）カルボニル、アリール（Ｃ１−６アルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル、（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アリール（Ｃ１−６アルキル）、ヘテロアリール（Ｃ１−６アルキル）、（アリール（Ｃ１−６アルキル））アミノカルボニルなどが含まれる。好ましいアミノの保護基としては、アセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどが挙げられる。また、アミノは保護されることにより、フタル酸イミド、コハク酸イミド、グルタル酸イミド、１−ピロリルなどの飽和または不飽和へテロ環基を形成していてもよい。
メルカプトの保護基としては、例えば、エチルチオおよびｔ−ブチルチオ等のＣ１−６アルキルチオ、２−ニトロフェニルチオおよび２−カルボキシフェニルチオ等の置換フェニルチオ、ならびに２−ピリジルチオ等のヘテロアリールチオが挙げられる。好ましい例は、２−ピリジルチオである。
カルボキシの保護基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、メチルチオ、エチルチオが挙げられる。好ましい例はエトキシである。
工程１、工程２および工程３の順番は問われない。また、工程３の有無も問われない。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２（式中、Ｒ６、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンと反応させ、次いで、適当な縮合剤存在下、溶媒中で、当該反応物と式：ＨＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１（式中、Ｒ７、Ｒ８、ｎ１、Ａ１、およびＢ１は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物と反応させてもよい。
式：ＨＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられ、好ましくは式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（t’）、（u’）、（v’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（d’）、（f’）、（h’）、（j’）、（k’）、（l’）、（m’）、（n’）、（o’）、（p’）、（s’）、（t’）、（u’）、（v’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（d’）、（f’）、（j’）、（k’）、（l’）、（m’）、（n’）、（o’）、（p’）、（s’）、（t’）、（v’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（d’）、（f’）、（j’）、（k’）、（l’）、（m’）、（n’）、（o’）、（p’）、（s’）、（t’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（t’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（t’）、（u’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（t’）、（u’）、（v’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（t’）、（u’）、（v’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（s’）、（u’）、（v’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（c’）、（f’）、（h’）、（l’）、（m’）、（o’）、（u’）、（v’）、（y’）、（z’）、（ae’）および（ah’）で表される化合物、式（a’）、（b’）、（j’）、（k’）、（n’）、（o’）および（p’）で表される化合物、式（c’）、（d’）、（l’）および（m’）で表される化合物、式（f’）、（t’）、（u’）および（v’）で表される化合物、式（q’）、（r’）、（s’）、（z’）、（aa’）、（ab’）、（ac’）、（ad’）、（ae’）、（af’）、（ag’）および（ah’）で表される化合物、式（g’）、（h’）および（i’）で表される化合物、ならびに式（w’）、（x’）および（y’）で表される化合物が、それぞれ挙げられる。
なお、式（b’）および（k’）で表される化合物には、その大部分が式（b）および（k）で表される基として原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシに導入されるが、一部は、グアニジノ中のアミノが原料のヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシと結合し、下記式で表される基として導入される場合がある。
Figure 2017195880
そのような繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体も本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれ、また、（１）上記式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）、（２）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩ）、（３）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩＩ）、または（４）上記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の繰り返し単位から実質的に構成されるヒアルロン酸誘導体にも含まれる。
式：ＨＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられる。Ｒｙは、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基である。式：ＨＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２で表される化合物としては、好ましくは、それぞれＲｙが（ca）である式（da）、（db）、（dc）および（dd）で表される化合物ならびにそれぞれＲｙが（cg）である式（da）、（db）および（dd）で表される化合物が挙げられる。
式：ＨＮＲｂ−Ｚ３、で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物が好ましい。
式：ＨＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられ、好ましくは式（a2）、（b2）、（c2）、（d2）、（f2）、（j2）、（k2）、（l2）、（m2）、（n2）、（o2）、（p2）、（t2）、（u2）、（v2）、（y2）および（ae）で表される化合物が挙げられ、さらに好ましくは式（a2）、（b2）、（c2）、（d2）、（f2）、（l2）、（m2）、（o2）、（t2）、（u2）、（v2）、（y2）および（ae）で表される化合物が挙げられる。Ｒｚは、以下の式
Figure 2017195880
 で表される基、あるいは（cc）、（ci）または（ch）で表される基を表す。Ｒｚａ、Ｒｚｂは、独立に、水素原子、（cc）、（ci）、（ch）または（cj）で表される基、あるいは水素原子、（cc）、（ci）または（ch）で表される基を表す。ただし、ＲｚａとＲｚｂが同時に水素原子であることはない。。
式：Ｈａｌ−Ｚ３で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられ、好ましくは式（cw）で表される化合物が挙げられる。Ｐ１およびＰ２は、独立に、水素原子またはヒドロキシの保護基を表し、Ｐ３は、ヒドロキシまたはカルボキシの保護基を表す。
式：Ｈａｌ−Ｚ１−Ｚ２で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられる。Ｒｙａは、式（ca）、（cb）、（cc）、（cd）、（cf）および（cg）で表される基である。式：Ｈａｌ−Ｚ１−Ｚ２で表される化合物としては、好ましくは、それぞれＲｙａが（ca）である式（da1）、（da2）、（db1）、（db2）、（dd1）および（dd2）で表される化合物ならびにそれぞれＲｙａが（cg）である式（da1）、（da2）、（db1）、（db2）、（dd1）および（dd2）で表される化合物が挙げられる。
さらに、式：Ｈａｌ−Ｚ１−Ｚ２、Ｈａｌ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２およびＨａｌ−Ｚ０−Ｚ２で表される化合物として、例えば以下の式
Figure 2017195880
 および
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられる。Ｒｙbは、は本明細書に既に定義されたとおりである。
式：ＨＯ−Ｚ１−Ｚ２で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられ、好ましくはそれぞれＲｙが（ca）である式（da’）、（db’）および（dd’）で表される化合物ならびにそれぞれＲｙが（cg）である式（da’）、（db’）および（dd’）で表される化合物が挙げられる。
さらに、式：ＨＯ−Ｚ１−Ｚ２、ＨＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２およびＨＯ−Ｚ０−Ｚ２で表される化合物として、例えば以下の式
Figure 2017195880
 および
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられる。Ｒｙbは、は本明細書に既に定義されたとおりである。
式：ＨＮＲ１７−Ｒ１８で表される化合物としては、例えば以下の式
Figure 2017195880
 で表される化合物などが挙げられ、好ましくは式（ba’）、（bb’）、（bc’）、（bd’）および（bf’）で表される化合物が挙げられる。
ヒアルロン酸のカルボキシに導入される置換基の種類が複数のときは、それらの置換基は、同時導入しても、順次に導入してもよい。
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、水中で会合により微粒子を形成することを特徴とする前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。特に限定はされないが、導入された基−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２、または、−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２の疎水性相互作用により水中において自発的会合が起こり、ナノスケールの微粒子を形成するという特性を有する。望まれるドラッグデリバリーシステムの構築のために、本発明のヒアルロン酸誘導体により形成されるナノ微粒子は非常に有力な手段の一つであり、形成される疎水ドメインに活性成分であるタンパク質、ペプチド、低分子化合物を保持したまま目的の部位に送達するカプセルとして使用することができる。また、薬物を本発明のヒアルロン酸誘導体に共有結合させてコンジュゲートとすることにより目的の部位に薬物を送達することができる。
ナノスケールの微粒子は、経粘膜投与、皮下投与、経皮投与、静脈内投与が可能であり、封入（複合化）した薬物の粘膜透過、組織透過、薬物徐放、また、標的臓器および細胞へ薬物を選択的にデリバリーさせる、ターゲティング用の担体として使用できる。ターゲティング用の担体として使用する場合、ターゲット素子を加えることにより各臓器および細胞へターゲティングすることもできる。ターゲット素子としては、例えば、標的組織特異的なペプチド、抗体、断片化抗体、アプタマー、がん細胞に対するＲＧＤペプチド、葉酸、アニサミド、トランスフェリン、肝臓に対するガラクトース、トコフェロールなどがある。血中での薬物の保持を強固にするために、さらにヒアルロン酸誘導体を化学架橋させることもできる。
ヒアルロン酸誘導体による微粒子は、水溶液中で自己会合により形成するので、固体のヒアルロン酸誘導体を水または塩水溶液に溶解することによって形成することができる。また、別の方法では、他の溶媒（例えばＤＭＳＯ）に溶解させたあと、水、または塩水溶液に置換することによっても微粒子を形成することができる。形成した微粒子のサイズを均一化するために超音波処理を行ってもよい。
ヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率が高くなるに従って、水への溶解性が減少する。そのため水溶液中で分散性の微粒子を形成させるためには、疎水性基の導入率は８０％以下であり、導入率が６０％以下になるように調製されたヒアルロン酸誘導体を用いることが好ましい。
本発明のヒアルロン酸誘導体は疎水性基を有するため、系中のイオン強度が高いほど、溶解性が低くなる。したがって、疎水性基の導入率をコントロールすることにより、低塩濃度下あるいは無塩条件下では溶解し、生理食塩濃度にて凝集・沈殿するヒアルロン酸誘導体の調製が可能であり、これは、皮下および局所での徐放製剤の基材となり得る。また、生理塩濃度下においても安定な微粒子を形成する程度の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、全身投与型の薬物担体となり得る。
本発明のヒアルロン酸誘導体を用いて、ＰＬＧＡや脂質といった添加剤、薬物の結晶粒子、アモルファス粒子と複合化させて新たな粒子を形成させることも可能である。
本発明のヒアルロン酸誘導体は、医薬組成物における薬物担体として使用することができ、本発明ヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む、医薬組成物を提供することができる。また、本発明のヒアルロン酸誘導体そのものを有効成分として含む、医薬組成物を提供することもできる。これらの医薬組成物中に含まれる本発明のヒアルロン酸誘導体は、（１）〜（１１）に記載のヒアルロン酸誘導体であり、医薬組成物を経粘膜投与に用いる場合は（１３）に記載のヒアルロン酸誘導体である。本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に薬物と複合体を形成できるため、特別な操作を必要とせず、当該ヒアルロン酸誘導体と薬物を水溶液中で混合し、インキュベートすることにより、担体−薬物の複合体を容易に形成させ、薬物を担持できる。複合体形成の駆動力は、主にヒアルロン酸誘導体の疎水性基と薬物との疎水性相互作用であるが、薬物が塩基性または酸性の場合、ヒアルロン酸誘導体のカルボン酸またはカチオン性基との静電的相互作用が寄与する場合がある。生体塩濃度では、静電的相互作用は弱く、疎水性相互作用は強くなるため、主に疎水性相互作用により複合体が形成すると考えられる。
上記式（Ｉｂ）において、Ｚ１がアルキレンの場合、アルキレンの炭素鎖が長いほど、当該基の疎水性が高くなり、強い疎水性相互作用により強固な微粒子を形成することができる。また、アルキレンが長いほど分子間での絡み合いが大きくなり、粘度を上昇させることができる。さらに、アルキレンの長さを変更することで、微粒子のサイズを制御することもできる。
疎水性基中のリンカー（スペーサー）部分がエステルまたはカーボネートである場合（例えば、Ｘ２に、−ＣＯＯ−Ｚ３または−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３が含まれる場合）、生体内においてエステルまたはカーボネートが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによってさらに生分解性が高まり、安全性の面から好ましい。また、腫瘍組織周辺ではｐＨが低下していることが知られており、このようなスペーサーを有している場合、目的薬物を担持した本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体は腫瘍周辺にて崩壊し、薬物を腫瘍周辺で放出することができる。
特に、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−のようなβチオカルボン酸エステル構造を有するリンカーの場合、わずかなｐＨの低下（ｐＨ６程度）においても分解が促進される。このため、通常のエステルよりもｐＨ応答がシャープである。また、細胞内への薬物の送達を目指す場合、エンドソームにおけるｐＨ低下にも応答し、細胞に取り込まれた後にのみ薬物を放出させることができる。
リンカー（スペーサー）部分がジスルフィド結合を有する場合（例えば、Ｘ２に、−Ｓ−Ｓ−Ｚ３が含まれる場合）、還元条件下においてリンカーが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによって本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体が崩壊する。細胞質は還元環境であることが知られているため、このリンカーを用いたヒアルロン酸誘導体に薬物を封入し、投与することによって、組織中および血中では薬物を放出せず、細胞質内でのみ薬物を放出させることができる。
担体−薬物複合体を形成するときの、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、用いる薬物により適宜変更することができる。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体は密度が変わるとともに、薬物もその電離状態などが変動する。使用する変性剤の例としては、尿素、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。変性剤を添加した場合は、複合体形成後に、過剰の水などで洗浄することにより余剰の変性剤を除去することができる。
特に限定されないが、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体とタンパク質の複合体を形成する場合、その等電点付近で複合体形成を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質の静電反発を抑制することが可能なため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシのｐＫａ（およそ４．０）以下の条件で複合体形成工程を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体が有する負電荷を弱めることができるので、タンパク質が当該条件下で負電荷に帯電している場合には静電反発を抑制することが可能であり、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。さらに、例えば生体内よりも低い塩濃度において複合体形成工程を行うことにより、水溶液中で形成されるヒアルロン酸誘導体の微粒子の密度が低下するため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、その状態で塩濃度を上げることにより微粒子の密度を向上させ、強固にタンパク質を封入することができる。
ヒアルロン酸誘導体とタンパク質との複合体形成は、タンパク質の分子量にも影響され得る。一般に、タンパク質が低分子量であるほど、当該タンパク質のヒアルロン酸誘導体の微粒子内部へ移行速度は高い。また、疎水性基の導入率に依存する微粒子の密度も、タンパク質との複合体形成の速度、および複合体に含まれるタンパク質の量に影響を与えうる。
ヒアルロン酸誘導体と核酸との複合体形成は、核酸の分子量や疎水性にも影響され得る。一般に二本鎖核酸よりも一本鎖核酸のほうが容易にヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する。また、ｓｉＲＮＡのような低分子二本鎖核酸よりもプラスミドのような高分子量二本鎖核酸のほうが容易にヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する。
ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体からの生体内における薬物放出は、複合体からの薬物の拡散に加えて、生体成分が薬物と置換することにより促進される。微粒子の密度を増減させて、この拡散や置換を制御することにより、薬物の徐放性を制御することが可能となる。
生体内には血漿タンパク質や脂質などの生体成分が存在し、ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体を皮下や血中などの生体内に投与した場合、この生体成分が複合体内の薬物と置換することにより薬物が放出される場合がある。当該置換を生じさせる主な生体内タンパク質としてアルブミンが想定される。
本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物担体として使用する方法としては、前述の水溶性液中で自発的に薬物と複合体を形成させる方法の他、薬物と本発明のヒアルロン酸誘導体とを共有結合などにより結合させたコンジュゲートにする方法を挙げることもできる。すなわち、本発明の別の側面において、式（Ｉａ）で表される二糖単位および式（Ｉｂ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体に、上記薬物の１以上が結合した、ヒアルロン酸誘導体−薬物コンジュゲートが提供される。この側面の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体として、（１）式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）、（２）式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩ）、（３）式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、および式（ＩＩＩ）、ならびに、（４）式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を用いることができる。
本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖の末端に存在するグルクロン酸４位およびアセチルグルコサミン１位のヒドロキシは、別の基に変換されていてもよく、例えば、Ｃ１−６アルコキシ、ホルミルオキシおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルオキシなどであってもよい。
本発明のヒアルロン酸誘導体と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーと薬物とのコンジュゲートの調製で使用されている方法を用いることができ、例えば、以下の反応を利用することができる。
ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシと、薬物のアミノ、ヒドロキシ、ヨード、ブロモまたは、薬物に導入したアミノ、ヒドロキシ、ブロモ、ヨードとの反応；
ヒアルロン酸誘導体のＮ−アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応；
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応；
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどに変換された薬物との反応；
薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、カルボニル、ＮＨＳエステルおよびエポキシドに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応；
ヒアルロン酸誘導体のアミノと、カルボニルを有するまたは導入された薬物（アルデヒドおよびケトンなど）とのシッフ塩基形成および還元的アミノ化反応；
薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりカルボニルが導入されたヒアルロン酸誘導体とのシッフ塩基形成および還元アミノ化反応；
ヒアルロン酸誘導体に導入したメルカプトと、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールである薬物または修飾により当該化合物に変換された薬物との反応；および
薬物に導入したメルカプトと、修飾により、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応。
さらに、前述の疎水性基をヒアルロン酸誘導体に導入する際に用いたエステルまたはカーボネート、βチオエステル、ジスルフィド、特定の部位で切断するペプチドを含むリンカー（スペーサー）を、薬物とのコンジュゲート用のリンカーとして使用することもできる。これらのリンカーは前述の通り、標的部位において切断され、薬物が放出される。
コンジュゲートの調製のためにヒアルロン酸誘導体または薬物の修飾に使用する試薬は、コンジュゲートの調製において不都合な反応を生じさせないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。
具体的には、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにアミノを有する薬物またはアミノを導入した薬物をＤＭＴ−ＭＭなどの縮合剤を用いて反応させ、アミド結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物と疎水性基、カチオン性基などの導入基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基、カチオン性基などの導入基を導入してもよい。
また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにヒドロキシを有する薬物またはヒドロキシを導入した薬物をＤＭＴ−ＭＭ、１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミト゛（ＤＣＣ）などの縮合剤を用いて反応させ、エステル結合によりヒアルロン酸誘導体に薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物と疎水性基、カチオン性基などの導入基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。しかし、エステル、アミドなどの加水分解を回避するためには、疎水性基、カチオン性基などの導入基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、パクリタキセルがヒアルロン酸にエステルで導入された報告（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ 第１９巻、第１３１９−１３２５項、２００８年）などを参考にして行うことができる。
また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらに臭化物もしくはヨウ化物である薬物または、修飾により臭化物もしくはヨウ化物に変換された薬物を反応させ、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシをエステルに変換することにより薬物をコンジュゲートすることができる。エステル、アミドなどの加水分解を回避するためには、疎水性基、カチオン性基などの導入基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。
本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにカルボキシを有する薬物またはカルボキシを導入した薬物をＮＨＳエステルとし、Ｎ−アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと反応させ、エステル結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、疎水性基、カチオン性基などの導入基をヒアルロン酸に導入した後に薬物を加えても、導入の前に加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基、カチオン性基などの導入基を導入してもよい。エステル結合、アミド結合などの加水分解を回避するためには、疎水性基、カチオン性基などの導入基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、カンプトテシンがヒアルロン酸にエステルで導入された報告（国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号）などを参考にして行うことができる。
１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成後、グルクロン酸部分のカルボキシをエチレンジアミンなどのジアミンと脱水縮合させ、アミノを導入することができる。エチレンジアミンなどのジアミンは、カチオン性基を導入するための式：ＨＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１で表される化合物の一部を利用してもよく、また、薬物をコンジュゲートするためのエチレンジアミンなどのジアミンの一部を、式：ＨＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１で表される化合物として利用してもよい。さらに、Ｎ−スクシンイミジル ヨードアセテート（ＰＩＥＲＣＥ社）やＮ−スクシンイミジル ［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＰＩＥＲＣＥ社）をアミノに反応させ、ヨードアセチルが導入されたヒアルロン酸誘導体を合成することができる。このヒアルロン酸誘導体に対して、メルカプトを有する薬物を、コンジュゲートすることができる。この方法はタンパク質、ペプチド、核酸などのアミノなどの反応性基を多く含む高分子薬物においてもメルカプト選択的にコンジュゲートできるため特に有効である。この際、薬物の導入は疎水性基、カチオン性基などの導入基をヒアルロン酸に導入する前でも後でもよい。
本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、ここで、ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシの一部を２−アミノエチル ２−ピリジル ジスルフィド塩酸塩と反応させる。このヒアルロン酸誘導体に対してメルカプトを有する薬物およびメルカプトを導入した薬物をジスルフィド結合交換反応、すなわち置換反応により導入することが可能である。
ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保つために、薬物とヒアルロン酸誘導体間のリンカーの長さを調節することもできる。また、生体内の特定部位にて酵素等で切断されるペプチドリンカーを導入することもできる。例えば、メトトレキセートがＨＡにペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００５／０９５４６４号）、ドキソルビシンがＨＰＭＡ（Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）およびペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００２／０９０２０９号）などを参考にして行うことができる。
また、抗体に低分子化合物をコンジュゲートさせたＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する報告（国際公開第ＷＯ２００９／０２６２７４号；Expert Opinion. 第15巻、第1087-1103頁、2005年；Bioconjugate Chem. 第19巻、第1960-1963頁、2008年；Bioconjugate Chem. in press、Bernhard Stumpら、Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies）が多数あり、これらを参考にして、ヒアルロン酸誘導体と低分子化合物とのコンジュゲートを調製することもできる。
本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とを含む医薬組成物、本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物との複合体または本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とが結合したコンジュゲートは、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、カプセル、錠剤、散剤、パッチ、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、またはフィルムの形態にあってよい。粉末は、凍結乾燥または噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
本発明の医薬組成物において、薬物は、ヒアルロン酸誘導体中に封入されていても、ヒアルロン酸誘導体に接着していても、ヒアルロン酸誘導体で被覆されていても、ヒアルロン酸誘導体と混合または混和されていてもよい。さらに、例えば口内炎の予防又は治療に使用する場合、ヒアルロン酸誘導体自体が薬物として、他の薬物を含んで又は含まずして、本発明の医薬組成物中に含まれていてもよい。
本発明の医薬組成物、複合体およびコンジュゲートは、経口、腸管外、鼻腔内、肺腔内、気管、気管支、膣内、直腸内、眼内、点眼、結膜下、テノン嚢下、耳内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、関節腔内、脳内または口腔内の経路を経て投与されてよいが、いずれの経路においても、粘膜を経由または透過させて投与されるのが好ましい。
本発明の医薬組成物、複合体およびコンジュゲートは、特に粘膜透過性を高めることを目的とした場合は、その溶解状態でのサイズは１μｍ以下であることが好ましく、５００ｎｍ以下であることが好ましく、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ以下であることが好ましい。
本発明の医薬組成物、複合体およびコンジュゲートは、粘膜付着性、もしくは徐放性を高めることを目的とした場合、その溶解状態でのサイズは２００μｍ以下であることが好ましい。粘膜付着性の観点からは、用いるヒアルロン酸誘導体のカチオン性基導入率は高い方が好ましい。
本発明の医薬組成物、複合体およびコンジュゲートは、注射投与による特定組織、器官への集積性を目的とする場合、そのサイズは５００ｎｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは２００ｎｍ以下、さらに１００ｎｍ以下であることが好ましい
本発明の医薬組成物、複合体およびコンジュゲートは、特にＣＤ４４をはじめとするヒアルロン酸レセプターへのターゲティングを目的とした場合、そのサイズは５μｍ以下であることが好ましい。
本発明のヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する薬物は、複合化可能な薬物であれば特に限定されない。また、本発明のヒアルロン酸誘導体と結合させる薬物は、コンジュゲートが調製可能であれば特に限定されない。当該薬物の例としては、タンパク質および／またはペプチド、多糖類、核酸類、低分子化合物などが挙げられ、好ましくは、タンパク質および／またはペプチド、低分子化合物が挙げられる。
低分子化合物の例としては、限定されるわけではないが、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、パクリタキセル等のアルカロイドなど）、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤など）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤など）などを挙げることができる。
タンパク質およびペプチドの例としては、限定されるわけではないが、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体などを挙げることができる。
核酸類の例としては、限定されるわけではないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、メッセンジャーＲＮＡなどを挙げることができる。また、また、ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ、メトキシメチル体およびＬＮＡ等の、前記核酸類を化学的に処理した核酸誘導体などを挙げることもできる。
薬物が低分子干渉ＲＮＡを含む核酸類である場合、薬物と複合体を形成するヒアルロン酸誘導体としては、（１）〜（１１）に記載のヒアルロン酸誘導体が好ましい。これらのヒアルロン酸誘導体を低分子干渉ＲＮＡなどの核酸類と複合化することで、核酸類を、標的とする細胞内に送達させることができる。
核酸類と複合体を形成するヒアルロン酸誘導体において、カチオン性の部位を有する基Ｘ１の好ましい具体例としては、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（m）、（s）、（t）、（u）、（y）、（z）および（ah）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（m）、（s）、（t）、（y）、（z）および（ah）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（f）、（h）、（l）、（m）および（s）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（f）、（l）、（m）および（s）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（l）、（m）および（s）で表される基、さらに好ましくは、式（a）、（b）、（c）、（l）および（m）で表される基、さらに好ましくは、式（b）、（c）および（m）で表される基が挙げられる。
核酸類と複合体を形成するヒアルロン酸誘導体において、Ｘ１の導入率は、好ましくは４〜８５％、さらに好ましくは６〜７８％である。疎水性の部位を有する基Ｘ２の導入率は、好ましくは１０〜６０％であり、さらに好ましくは１４〜４８％である。
核酸類と複合体を形成するヒアルロン酸誘導体において、Ｘ１の導入率とＸ２の導入率の組み合わせ（Ｘ１の導入率：Ｘ２の導入率）は、Ｘ１が式（b）で表される基である時、好ましくは（５〜８５％：１０〜５５％）であり、さらに好ましくは（１１〜７４％：１７〜４７％）である。Ｘ１が式（c）で表される基である時は、好ましくは（１０〜４５％：１５〜６５％）であり、さらに好ましくは（１９〜３１％：２９〜４８％）である。Ｘ１が式（m）で表される基である時は、好ましくは（５〜６５％：１０〜５０％）であり、さらに好ましくは（６〜５２％：１４〜１７％）である。なお、Ｘ１の導入率とＸ２の導入率の和の上限は、１００％である。下限は７％以上であればよい。
本発明のヒアルロン酸誘導体、ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体、またはヒアルロン酸誘導体−薬物コンジュゲートは、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、界面活性剤、脂質、基材などを含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明の医薬組成物は、スプレー、ドライパウダーインヘーラー、滴下、イオントフォレーシス、エレクトロポレーション、ソノフォレーシス（超音波）などのデバイスを用いる経粘膜または経皮投与方法や、マイクロカニューレ、マイクロニードル、無針注射、研磨などによる経粘膜または経皮投与方法により、投与できる。錠剤やタブレットによる経口投与、経膣投与、直腸投与もできる。注射器を用いた投与も可能である。クリームや軟膏、シップ剤も可能である。
本発明により、従来の医薬組成物では見られない、薬物を粘膜へ接着させ透過させて標的部位に到達させることが可能であり、薬物を長期間徐放することが可能であり、および／または、適切な生分解性を有する、安全性の高い医薬組成物を提供することが可能である。
以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。
以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸（ＨＡ）中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、日本電子製ＪＮＭ−ＥＣＸ５００IIを用いた。透析には再生セルロース製透析膜（スペクトラム社製、分子量５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア４：分画分子量１２ｋ〜１４ｋＤａ、分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア３：分画分子量３．５ｋＤａ、スペクトラポア７：分画分子量１ｋＤａもしくは２ｋＤａ）を用いた。
〔実施例１〕コレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成およびＨＡのＴＢＡ塩の調製
（実施例１−１）コレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の調製
ＷＯ２０１４／０３８６４１記載の方法に準じてコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ６）塩酸塩を合成した。
（実施例１−２）ＨＡのＴＢＡ塩の調製
分子量１０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ、資生堂製もしくはコンティプロ社製）を原料として用い、ＷＯ２０１４／０３８６４１記載の方法に準じてＨＡのＴＢＡ塩を調製した。
〔実施例２〕ＨＡ誘導体の合成
（実施例２−１）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩および４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）をＨＡユニットに対して以下の表１に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＡｒｇＮＨ２の導入率が３１％の生成物）を図１に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＡｒｇＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値を１／１したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（４．２ｐｐｍ）×１／１）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアルギニンアミドの導入率（ＡｒｇＮＨ２導入率）を算出した（表１）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−２）エチレンジアミン（ＥＤＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、モノＦｍｏｃエチレンジアミン塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＥＤＡの導入率が３７％の生成物）を図２に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＥＤＡ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、３．０ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるエチレンジアミンの導入率（ＥＤＡ導入率）を算出した（表２）。なおＥＤＡ中のメチレン由来のピークが含まれる３．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル ６−アミノヘキシルのメチレン由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、３．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を２／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（３．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×２／３）をＥＤＡ中のメチレンの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−３）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、ジエチレントリアミン（東京化成工業製）およびヘキサフルオロリン酸トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ、和光純薬工業製）をＨＡユニットに対して以下の表３に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）またはＤ２Ｏを用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１５％、ＤＥＴの導入率６９％の生成物）をそれぞれ図３−１、図３−２に示す。０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液でのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Ｄ２ＯでのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＤＥＴ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるジエチレントリアミンの導入率（ＤＥＴ導入率）を算出した（表３）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
なお、「導入率算出できず」とは、溶媒に対する溶解性が充分でなく、ＮＭＲ分析ができなかったことを指す。
（実施例２−４）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表４に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表４に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表４に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１６％、ＬｙｓＮＨ２の導入率が３６％の生成物）を図４に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＬｙｓＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値を１／２したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（２．８ｐｐｍ）×１／２）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるリジンアミドの導入率（ＬｙｓＮＨ２導入率）を算出した（表４）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−５）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表５に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表５に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表５に示す比率で加え、室温で２間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表５に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が３８％、ＡｒｇＮＨ２の導入率が２２％、Ｍｅの導入率が１７％の生成物）を図５に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表５）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＡｒｇＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値を１／１したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（４．２ｐｐｍ）×１／１）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアルギニンアミドの導入率（ＡｒｇＮＨ２導入率）を算出した（表５）。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭｅ由来のピーク（−ＣＨ３、２．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表５）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−６）エチレンジアミン（ＥＤＡｍ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表６に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、モノＦｍｏｃエチレンジアミン塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表６に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表６に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ／Ｍｅ）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表６に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が３３％、ＥＤＡの導入率が３０％、Ｍｅの導入率が１０％の生成物）を図６に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表６）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＥＤＡ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、３．０ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるエチレンジアミンの導入率（ＥＤＡ導入率）を算出した（表６）。なおＥＤＡ中のメチレン来のピークが含まれる３．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル ６−アミノヘキシルのメチレン由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、３．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を２／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（３．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×２／３）をＥＤＡ中のメチレンの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭｅ由来のピーク（−ＣＨ３、２．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表６）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−７）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡｍ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、ジエチレントリアミン（東京化成工業製）およびヘキサフルオロリン酸トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ、和光純薬工業製）をＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表７に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）またはＤ２Ｏを用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＤＥＴの導入率が２９％、Ｍｅの導入率が４３％の生成物）をそれぞれ図７−１、図７−２に示す。０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液でのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表７）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
 Ｄ２ＯでのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＤＥＴ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるジエチレントリアミンの導入率（ＤＥＴ導入率）を算出した（表７）。
Figure 2017195880
 ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭｅ由来のピーク（−ＣＨ３、２．８ｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表７）。なおＭｅ由来のピークが含まれる２．８ｐｐｍ付近のピークには導入されたＤＥＴのメチレン由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、ＤＥＴ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値を１／１したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（２．８ｐｐｍ）−積分値（２．９ｐｐｍ）×１／１）をＭｅの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
なお、「導入率算出できず」とは、溶媒に対する溶解性が充分でなく、ＮＭＲ分析ができなかったことを指す。
（実施例２−８）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表８に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表８に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表８に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。
反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２／Ｍｅ）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表８に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が３７％、ＬｙｓＮＨ２の導入率が２２％、Ｍｅの導入率が１１％の生成物）を図８に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表８）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＬｙｓＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値を１／２したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（２．８ｐｐｍ）×１／２）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるリジンアミドの導入率（ＬｙｓＮＨ２導入率）を算出した（表８）。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭｅ由来のピーク（−ＣＨ３、２．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表８）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−９）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ ）の合成
ＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液に対して、モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩、メチルアミン塩酸塩、Ｃｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩の順で添加し合成したこと以外は、実施例２−８と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表９に記載した。
実施例２−８と同様にして、コレステリル基導入率、ＬｙｓＮＨ２導入率、Ｍｅ導入率を算出した（表９）。
Figure 2017195880
（実施例２−１０）スペルミン（Ｈ−ＳＰＲ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＳＰＲ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１０に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１０に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、スペルミン（アルドリッチ社製）およびヘキサフルオロリン酸トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ、和光純薬工業製）をＨＡユニットに対して以下の表１０に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＳＰＲ／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１０に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が２７％、ＳＰＲの導入率が３７％、Ｍｅの導入率が１６％の生成物）を図９に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１０）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＳＰＲ由来のピーク（６Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＳＰＲ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値を６／２したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（２．１ｐｐｍ）×６／２）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＳＰＲ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるＳＰＲの導入率（ＳＰＲ導入率）を算出した（表１０）。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｍｅ中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、２．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表１０）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−１１）３−アミノプロピルトリメチルアザニウム（ＡｍＰＴＭＡ）、メチルアミン（ＭｅＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＴＭＡ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１１に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１１に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、３−アミノプロピルトリメチルアザニウムクロライド（ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｅｚ社製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１１に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＴＭＡ／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１１に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が２９％、ＰＴＭＡの導入率が２９％、Ｍｅの導入率が３１％の生成物）を図１０に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１１）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＰＴＭＡ由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＰＴＭＡ中のメチル由来のピーク（−Ｎ＋−（ＣＨ３）３、３．１ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値を２／９したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（３．１ｐｐｍ）×２／９）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＰＴＭＡ中のメチル由来のピーク（−Ｎ＋−（ＣＨ３）３、３．１ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおける３−アミノプロピルトリメチルアザニウムの導入率（ＰＴＭＡ導入率）を算出した（表１１）。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭｅ中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、２．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるメチルアミンの導入率（Ｍｅ導入率）を算出した（表１１）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−１２）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１２に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１２に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液を透析膜に移し、ＤＭＳＯで透析した。さらに、ＷＯ２０１４／０３８６４１記載の方法に準じて調製したＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂をＨＡユニットのモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５モル等量添加した。３０分間室温撹拌後、遠心し、上澄みを回収した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１２に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１２に記載した。
実施例２−５と同様にして、コレステリル基導入率、ＡｒｇＮＨ２導入率、Ｍｅ導入率を算出した（表１２）。
Figure 2017195880
コレステリル６−アミノヘキシルカーバメート、Ｌ−アルギニンアミド、メチルアミンの順で添加してもＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／Ｍｅが合成できることが明らかとなった。
（実施例２−１３）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１３に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にメチルアミン塩酸塩（東京化成工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１３に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液を透析膜に移し、ＤＭＳＯで透析した。さらに、ＷＯ２０１４／０３８６４１記載の方法に準じて調製したＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂をＨＡユニットのモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５モル等量添加した。３０分間室温撹拌後、遠心し、上澄みを回収した。次に、Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表１３に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／Ｍｅ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１３に記載した。
実施例２−５と同様にして、コレステリル基導入率、ＡｒｇＮＨ２導入率、Ｍｅ導入率を算出した（表１３）。
Figure 2017195880
（実施例２−１４）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、プロパノールアミン（ＰｒＯＨＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／ＰｒＯＨ）の合成
メチルアミン塩酸塩の代わりにプロパノールアミン塩酸塩を用いたこと以外は、実施例２−１３と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＰｒＯＨ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１４に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が３１％、ＰｒＯＨの導入率が１９％の生成物（中間体）と１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が３１％、ＡｒｇＮＨ２の導入率が１１％、ＰｒＯＨの導入率が１９％の生成物）をそれぞれ図１１−１と図１１−２に示す。図１１−２において、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１４）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＡｒｇＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値を１／１したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（４．２ｐｐｍ）×１／１）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアルギニンアミドの導入率（ＡｒｇＮＨ２導入率）を算出した（表１４）。
Figure 2017195880
図１１−１において、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＰｒＯＨ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２、１．６ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるプロパノールアミンの導入率（ＰｒＯＨ導入率）を算出した（表１４）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−１５）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２を実施例２−１と同様の方法で合成した（表１５）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１５に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−１６）エチレンジアミン（ＥＤＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡを実施例２−２と同様の方法で合成した（表１６）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１６に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−１７）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴを実施例２−３と同様の方法で合成した（表１７）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１７に記載した。
Figure 2017195880
なお、「導入率算出できず」とは、溶媒に対する溶解性が充分でなく、ＮＭＲ分析ができなかったことを指す。
（実施例２−１８）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２を実施例２−４と同様の方法で合成した（表１８）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１８に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−１９）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭｅＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／Ｍｅを実施例２−５と同様の方法で合成した（表１９）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表１９に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−２０）エチレンジアミン（ＥＤＡｍ）、メチルアミン（ＭｅＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＡ／Ｍｅを実施例２−６と同様の方法で合成した（表２０）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２０に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−２１）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡｍ）、メチルアミン（ＭｅＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＴ／Ｍｅを実施例２−７と同様の方法で合成した（表２１）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２１に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−２２）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２／Ｍｅを実施例２−８と同様の方法で合成した（表２２）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２２に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−２３）スペルミン（Ｈ−ＳＰＲ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＳＰＲ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＳＰＲ／Ｍｅを実施例２−１０と同様の方法で合成した（表２３）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２３に記載した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−２４）３−アミノプロピルトリメチルアザニウム（ＡｍＰＴＭＡ）、メチルアミン（ＭeＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＴＭＡ／Ｍｅ）の合成
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験用のＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＴＭＡ／Ｍｅを実施例２−１１と同様の方法で合成した（表２４）。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２４に記載した。
Figure 2017195880
（実施例２−２５）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、エタノールアミン（ＥｔＯＨＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／ＥｔＯＨ）の合成
メチルアミン塩酸塩の代わりにエタノールアミン塩酸塩を用いたこと以外は、実施例２−５と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＥｔＯＨ）を白色固体として得た。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２５に記載した。
測定溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ６を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１６％、ＡｒｇＮＨ２の導入率が１６％、ＥｔＯＨ基の導入率が６９％の生成物）を図１２に示す。図１２において、Ｎ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２５）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）と導入されたＡｒｇＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものとＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値を１／１したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３−積分値（４．２ｐｐｍ）×１／１）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＡｒｇＮＨ２中のメチン由来のピーク（−ＮＨ−ＣＨ(ＣＯＮＨ２)ＣＨ２−、４．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアルギニンアミドの導入率（ＡｒｇＮＨ２導入率）を算出した（表２５）。
Figure 2017195880
図１２において、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアミド由来のピーク（−ＮＨＣＯＣＨ３、７．４ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値と、導入されたＥｔＯＨ中のアミド由来のピーク（−ＣＯＮＨＣＨ２−、７．９ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるエタノールアミンの導入率（ＥｔＯＨ導入率）を算出した（表２５）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例２−２６）Ｌ−アルギニンアミド（Ｈ−ＡｒｇＮＨ ２ ）、エタノールアミン（ＥｔＯＨＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ ２ ／ＥｔＯＨ／ＦＬ）の合成
Ｃｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩を加える前に、５−アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩とＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニット１００に対してそれぞれ２、４モル等量加え、室温で２時間撹拌したこと以外は、実施例２−２５と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡｒｇＮＨ２／ＥｔＯＨ／ＦＬ）を黄色固体として得、導入率を算出した（表２６）。得られた黄色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２６に記載した。
Figure 2017195880
沈殿が確認されなかったサンプルは水溶性であり、薬物と水中で混合することにより複合化することが簡便にでき、有用である。なお、沈殿が確認されたサンプルについても、ＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶解し、その後、薬物と複合体を形成させ、水溶液に置換した組成物、もしくは投与可能なその他の溶媒で置換した組成物において粘膜透過性等の機能を有する可能性がある。
〔実施例３〕ＨＡ誘導体の粘膜透過性の確認
（実施例３−１）点眼による眼内移行性評価
実施例２−２６で合成した１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１７％／ＡｒｇＮＨ２−１０％／ＥｔＯＨ−６７％／ＦＬを５０ｍｇ／ｍＬとなるように１０％スクロース溶液に溶解し、３μＬずつマウスの両目に点眼した。１時間後に両目眼球を摘出し、凍結切片を作製し、共焦点顕微鏡にてＨＡ誘導体の分布を蛍光検出により確認したところ、ＨＡ誘導体は角膜表層の粘膜層を透過し、角膜中に存在することが確認された。また、結膜中、毛様体中にも存在することが確認された。一方、カルボキシフルオレセインを０．０５６８ｍｇ／ｍＬとなるように１０％スクロース溶液に溶解し、３μＬ点眼し、１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１７％／ＡｒｇＮＨ２−１０％／ＥｔＯＨ−６７％／ＦＬと同様の方法で確認したところ、カルボキシフルオレセイン由来の蛍光は角膜、結膜、毛様体を含む目のどの組織においても観察されなかった。
〔実施例４〕ＨＡ誘導体の合成２
（実施例４−１−１）２，２’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)（ＥＤＯＢＥＡｍ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＯＢＥＡ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２７に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、２，２’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表２７に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。この時、一部を分取し、２，２’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)およびＰｙＢＯＰを加えず以下同様に行い、導入率算出における比較対象としてＨＡ−Ｃｈｏｌを得た。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＥＤＯＢＥＡ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表２７に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２７に記載した。 以下、溶液状態の観察において、フィルターを通過した試料は水溶性であり、薬物と水中で混合することにより複合化することが簡便にでき、有用である。また、超音波処理を実施し、沈殿が確認されなかったサンプルは水溶性であり、薬物と水中で混合することにより複合化することが簡便にでき、有用である。なお、超音波処理を実施してもなお沈殿が確認されたサンプルについても、ＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶解し、その後、薬物と複合体を形成させ、水溶液に置換した組成物、もしくは投与可能なその他の溶媒で置換した組成物において粘膜透過性等の機能を有する可能性がある。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＥＤＯＢＥＡの導入率が５２％の生成物）を図１３−１に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２７）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＥＤＯＢＥＡ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ ２ −、２．９〜３．０ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおける２，２’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)の導入率（ＥＤＯＢＥＡ導入率）を算出した（表２７）。なお、２，２’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)中のメチレン由来のピークにはＨＡ由来のピークが重なっているため、比較対象として得たＨＡ−Ｃｈｏｌにおける２．９〜３．０ｐｐｍの積分値を除した値をＥＤＯＢＥＡの積分値として導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−２）２，２’−オキシビス(エチルアミン)（ＯＢＥＡ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＧ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２８に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、２，２’−オキシビス(エチルアミン)（東京化成工業製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表２８に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。この時、一部を分取し、２，２’−オキシビス(エチルアミン)およびＰｙＢＯＰを加えず以下同様に行い、導入率算出における比較対象としてＨＡ−Ｃｈｏｌを得た。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＥＧ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表２８に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２８に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＤＥＧの導入率が５１％の生成物）を図１３−２に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２８）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入された２，２’−オキシビス(エチルアミン)中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．９〜３．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおける２，２’−オキシビス(エチルアミン)の導入率（ＤＥＧ導入率）を算出した（表２８）。なお、ＤＥＧ中のメチレン由来のピークにはＨＡ由来のピークが重なっているため、比較対象として得たＨＡ−Ｃｈｏｌにおける２．９〜３．１ｐｐｍの積分値を除した値をＤＥＧの積分値として導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−３）アグマチン（Ｈ−ＡＧＭＴ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡＧＭＴ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２９に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、アグマチン二塩酸塩（Ａｒｋ ｐｈａｒｍａ製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２９に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。この時、一部を分取し、アグマチン二塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭを加えず以下同様に行い、導入率算出における比較対象としてＨＡ−Ｃｈｏｌを得た。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＡＧＭＴ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表２９に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表２９に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＡＧＭＴの導入率６８％の生成物）を図１３−３に示す。０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液でのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２９）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＡＧＭＴ中のエチレン由来のピーク（−ＣＨ２−ＣＨ２−、１．５〜１．６ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアグマチンの導入率（ＡＧＭＴ導入率）を算出した（表２９）。なお、ＡＧＭＴ中のエチレン由来のピークにはＣｈｏｌ由来のピークが重なっているため、比較対象として得たＨＡ−Ｃｈｏｌにおける１．５〜１．６ｐｐｍの積分値を除した値をＡＧＭＴの積分値として導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−４）ヒスタミン（ＨＩＳ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＩＭＤ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３０に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、ヒスタミン（ナカライテスク製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３０に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＩＭＤ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３０に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３０に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１６％、ＩＭＤの導入率が３６７％の生成物）を図１３−４に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３０）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＩＭＤ中のメチン由来のピーク（−ＣＨ＝、８．９〜９．０ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるヒスタミンの導入率（ＩＭＤ導入率）を算出した（表３０）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−５）ビス(３-アミノプロピル)アミン（ＢＡＰＡ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＴ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３１に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にビス(３-アミノプロピル)アミン（和光純薬工業製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３１に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＴ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３１に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３１に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１５％、ＤＰＴの導入率が６０％の生成物）を図１３−５に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３１）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＤＰＴ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．０〜２．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるビス(３-アミノプロピル)アミンの導入率（ＤＰＴ導入率）を算出した（表３１）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−６）トリス(２-アミノエチル)アミン（ＴＡＥＡ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＢＡＥＡ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３２に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、トリス(２-アミノエチル)アミン（和光純薬工業製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３２に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＢＡＥＡ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３２に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３２に記載した。フィルターを通過せず、超音波処理を実施していない試料は(×)と表３２に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＢＡＥＡの導入率が６３％の生成物）を図１３−６に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３２）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＢＡＥＡ中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．７ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるトリス(２-アミノエチル)アミンの導入率（ＢＡＥＡ導入率）を算出した（表３２）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−７）Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤＡ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＡ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３３に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（和光純薬工業製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３３に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＤＭＡ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３３に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３３に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１７％、ＤＭＡの導入率が７６％の生成物）を図１３−７に示す。０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液でのＮＭＲスペクトルにおいて、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３３）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＤＭＡ中のメチル由来のピーク（ＣＨ３−、２．８ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンの導入率（ＤＭＡ導入率）を算出した（表３３）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−１−８）２−（１−メチルピペリジン−４−イル）エタンアミン（ＭＰＥＡ）およびコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＭＰＤ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３４に示す比率で各溶液に添加し、室温で２時間以上撹拌した。次に、２−（１−メチルピペリジン−４−イル）エタンアミン（Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ製）およびＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３４に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＭＰＤ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３４に記載した。フィルターを通過しなかった試料については、凍結乾燥固体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３４に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１２％、ＭＰＤの導入率が５１％の生成物）を図１３−８に示す。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表３４）。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＭＰＤのメチル由来のピーク（−ＣＨ３、２．７０〜２．７５ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおける２−（１−メチルピペリジン−４−イル）エタンアミンの導入率（ＭＰＤ導入率）を算出した（表３４）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
（実施例４−２）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）および５β−コラン酸により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＬｙｓＮＨ ２ ／ＣＡ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３５に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的中間体（ＨＡ−ＬｙｓＮＨ２）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。
測定溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ６を用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）あるいはメチレンおよびメチン由来のピーク（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−、１．２〜１．７ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットにおけるリジンアミドの導入率（ＬｙｓＮＨ２導入率）を算出した（表３５）。
Figure 2017195880
ＨＡ−ＬｙｓＮＨ２の無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。５β−コラン酸およびＤＭＴ−ＭＭあるいはＰｙＢＯＰをＨＡユニットに対して以下の表３６に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−ＬｙｓＮＨ２／ＣＡ）を白色固体として得た。凍結乾燥前の透析液の溶液状態を孔径０．４５μｍあるいは５μｍのフィルターに通し、通過した試料は○と表３６に記載した。フィルター透過性を確認していない試料は−と表３６に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、ＬｙｓＮＨ２の導入率が９１％、ＣＡの導入率が２３％の生成物）を図１３−９に示す。ＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値と、導入されたＣＡ中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するＣＡの導入率を算出した（表３６）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
〔実施例５〕ＨＡ誘導体の合成３
（実施例５−１）Ｉ−Ｃ ３ Ｈ ６ −ＯＣＯＯ−Ｃｈｏｌ：１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル)−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル （３−ヨードプロピル）カーボネートの合成
Figure 2017195880
８，１０，１３−トリメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル カルボノクロリデート（１００ｍｇ，０．２２３ｍｍｏｌ)，３−ヨード−１−プロパノール（０．１７３ｍＬ，１．７８１ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．０２２ｍＬ，０．２６７ｍｍｏｌ）をトルエン（１ｍＬ）に溶解させて、室温で２４時間撹拌した。反応溶液をＰｒｅ−ＴＬＣ（１ｍｍシリカゲルプレート，展開溶媒：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１０／１）にて精製して、１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル （３−ヨードプロピル）カーボネート（１２８ｍｇ，収率９９％）を白色固体として得た。ＥＳＩ（ポジティブモード）ｍ／ｚ ６２１．２７７５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
（実施例５−２）ＨＡ−Ｃ ３ Ｈ ６ −ＯＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３７に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌し、ＤＭＳＯに対して透析した。実施例５−１で調製したＩ−Ｃ３Ｈ６−ＯＣＯＯ−ＣｈｏｌをＨＡユニットに対して以下の表３7に示す比率で各溶液に添加し、室温で１時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃ３Ｈ６−ＯＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３７に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が２０％、ＬｙｓＮＨ２の導入率が２９％の生成物）を図１４−１に示す。実施例２−８と同様にして、コレステリル基導入率、リジンアミド導入率を算出した（表３７）。
Figure 2017195880
（実施例５−３）Ｉ−ＣＨ ２ −ＣＯＯ−Ｃｈｏｌ：１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル ２−ヨードアセテートの合成
Figure 2017195880
Ｉ−ＣＨ２ −ＣＯＯ−Ｃｈｏｌ：１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル ２−ヨードアセテートは、既存の合成法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７（２０），８４２１〜８４４４）にて調製した。
（実施例５−４）ＨＡ−ＣＨ ２ −ＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ ２ の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表３８示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌し、ＤＭＳＯに対して透析した。実施例５−３で調製したＩ−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣｈｏｌをＨＡユニットに対して以下の表３８に示す比率で各溶液に添加し、室温で１時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｃｈｏｌ／ＬｙｓＮＨ２）を淡黄色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表３８に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（１０ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が１３％、ＬｙｓＮＨ２の導入率が７０％の生成物）を図１４−２に示す。実施例２−８と同様にして、コレステリル基導入率、リジンアミド導入率を算出した（表３８）。
Figure 2017195880
〔実施例６〕ウサギ点眼投与後のソラフェニブの眼内移行性評価によるＨＡ誘導体の粘膜透過性の確認
（実施例６−１）ソラフェニブ含有ＨＡ誘導体の調製
実施例２−２５で合成した１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１５％／ＡｒｇＮＨ２−２８％／ＥｔＯＨ−５６％を５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯ溶液に溶解し、さらにソラフェニブを加えた。透析キット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、分画分子量２Ｋ）に移し、超純水、１０％スクロース溶液に対して透析した。以下の条件による逆相クロマトグラフィー分析分析によりソラフェニブ濃度を定量し、終濃度１．０ｍｇ／ｍＬに調製し、投与溶液とした。動的光散乱（ＤＬＳ）法によりサイズ測定（マルバーン社、ゼータサイザーＺＳ）を行ったところ、直径４２．７ｎｍと算出された。
逆相クロマトグラフィー分析条件
分析カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ １０００Å（Ａｇｉｌｅｎｔ社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
注入量：５０μＬ
（比較例６−１）ソラフェニブマイクロ粒子の調製
２５ｍｇ／ｍＬ ソラフェニブメタノール溶液２００μＬを純水１２．５ｍＬに滴下したところ、安定な分散体が形成されたため、１０％スクロース２ｍＬ、０．０５％ｔｗｅｅｎ８０ ２ｍＬを加え、凍結乾燥した。２ｍＬの超純水にて再分散させ、実施例６−１に記載の逆相クロマトグラフィー分析分析によりソラフェニブ濃度を定量し、終濃度１．０ｍｇ／ｍＬに調製し、投与溶液とした。実施例６−１同様にサイズ測定を行ったところ、直径１５４９ｎｍと算出された。
（比較例６−２）ソラフェニブナノ粒子の調製
国際公開ＷＯ２０１３／１６６４３６号に従って、粘膜透過性粒子（ＭＰＰ）を調製した。具体的にはガラスチューブに、２００ｍｇの直径０．２ｍｍジルコニアボール（ニッカトー、ＹＴＺ−０．２）を入れ、さらに１１ｍｇのソラフェニブを加え、２００μＬのＦ１２７含有水溶液（５％ Ｆ１２７， ０．９％ ＮａＣｌ， ０．０５％ ＥＤＴＡ， ２．４％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに加えた。攪拌子を入れ、スターラーにて室温で、終夜撹拌した。０．８μｍフィルターを通し、実施例６−１に記載の逆相クロマトグラフィー分析分析によりソラフェニブ濃度を定量し、終濃度１．０ｍｇ／ｍＬに調製し、投与溶液とした。実施例６−１同様にサイズ測定を行ったところ、直径２７１ｎｍと算出された。
（実施例６−２）ウサギ点眼投与後のソラフェニブの眼内移行性評価（両目）
１５から１６週齢のニュージーランドホワイト種ＳＰＦウサギ（北山ラベス株式会社）を保定器で固定し、実施例６−１で調製したソラフェニブ含有ＨＡ誘導体、比較例６−１で調製したソラフェニブマイクロ粒子、比較例６−２で調製したソラフェニブナノ粒子（ＭＰＰ）を、それぞれ両眼（５０μL／眼）に単回点眼投与した。各群３匹（６眼球）で行った。ペントバルビタールナトリウム液（共立製薬株式会社）の静脈内投与による麻酔下で腹大動静脈切断により安楽致死させた後、眼球を摘出した。眼瞼結膜を採取し、その後、ドライアイス上で眼球を凍結させて、角膜、眼球結膜、 虹彩及び毛様体、硝子体、網膜及び脈絡膜を採材した。
破砕用ビーズを用いて眼組織ホモジネートを作成し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）にて組織中ソラフェニブ濃度を定量した（表３９）。
Figure 2017195880
いずれの眼組織においても、ソラフェニブ含有ＨＡ誘導体は、ソラフェニブマイクロ粒子およびソラフェニブナノ粒子（ＭＰＰ）と比較して、顕著にソラフェニブ濃度が高いことが示された。網膜及び脈絡膜、虹彩及び毛様体といった眼内部の組織においてソラフェニブ濃度が高いこと、また、角膜におけるソラフェニブ濃度が極めて高いことから、ＨＡ誘導体は粘膜に接着しソラフェニブを透過させる能力を有することが示された。
（実施例６−３）ウサギ点眼投与後のソラフェニブ後眼部移行性評価（片目）
実施例６−１と同様の方法で調製したソラフェニブ含有ＨＡ誘導体を投与液として用い、片眼（５０μＬ／眼、５匹）に単回点眼投与したこと以外は、実施例６−２と同じ方法で行った。結果を表４０に示す。
Figure 2017195880
網膜及び脈絡膜、虹彩及び毛様体といった眼内部の組織において、ソラフェニブ含有ＨＡ誘導体投与眼は、非投与眼と比較して、ソラフェニブ濃度が高いことが示された。このことにより、ソラフェニブは循環血経由で眼内に移行しているのではなく、眼表面を経由して眼内に移行していることが示された（循環血経由で眼内に移行しているのであれば、非投与眼および投与眼でソラフェニブ濃度は同じとなる）。
（実施例６−４）ウサギ点眼投与後のソラフェニブ眼内移行性評価（各種ＨＡ誘導体比較）
各種ＨＡ誘導体に対して、実施例６−１に記載の方法と同様に調製したソラフェニブ含有ＨＡ誘導体を投与液として用い、実施例６−２と同じ方法で実験を行った。
Figure 2017195880
すべてのＨＡ誘導体が、網膜及び脈絡膜、虹彩及び毛様体といった眼内部の組織にソラフェニブをデリバリーできることが示された。
〔実施例７〕ＨＡ誘導体の粘膜接着性および透過性評価
（実施例７−１）蛍光標識インスリン含有ＨＡ誘導体の調製
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ， Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ， ｍｉｘｅｄ ｉｓｏｍｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）中でインスリン（ウシ脾臓由来）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）と反応させ、脱塩カラムで精製、限外濾過により溶媒置換および濃縮し、蛍光標識インスリン水溶液を調製した。実施例２、実施例４および実施例５で得られたＨＡ誘導体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、これに水および１００ｍＭリン酸緩衝液、蛍光標識インスリン水溶液を加えた。終溶液組成としてＨＡ誘導体１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、蛍光標識インスリン５０μｇ／ｍＬにした。穏やかに撹拌した後、３７℃で終夜静置して、蛍光標識インスリン含有ＨＡ誘導体溶液を調製した。
（比較例７−１）キトサン誘導体（ＣＳ−Ｃｈｏｌ）の合成
キトサン１００ｍｇ（和光純薬製Ｃｈｉｔｏｓａｎ５、脱アセチル化率８２％、アセチル基率１８％）を５０ｍＭ 塩酸に溶解し、コハク酸水素コレステロール８７．９ｍｇ（東京化成工業）のＤＭＦ溶液、ＤＭＴ−ＭＭ ５５．１ｍｇ（国産化学）のＤＭＦ溶液を加え、室温で終夜撹拌した。反応溶液は、ＤＭＦ、５０ｍＭ 硝酸ナトリウム／ＤＭＦ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＣＳ−Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。
ＮＭＲ測定用にＣＳ−Ｃｈｏｌのｐ−トルエンスルホン酸塩を既存の調製法に従って（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０００， ２９（６）， ５９６）調製した。０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を測定溶媒として用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりコレステリル基導入率を算出した。キトサンにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、アセチル基に対するコレステリル基導入率を算出し、さらにアセチル基率１８％を用いて、下に示す式からキトサン単糖に対するコレステリル基の導入率を算出した。なおＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．７〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をキトサン由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
その結果、キトサン単糖あたりのコレステロール導入率は１０％と算出された。なお、ＨＡユニットは２単糖で構成されるため、キトサン単糖あたりのコレステロール導入率はＨＡユニットあたりの２０％に相当する。
（実施例７−２）蛍光標識インスリン含有ＨＡ誘導体の粘膜接着性および透過性評価
製品取扱説明書に従ってアッセイ培地で１時間以上培養したＬａｂＣｙｔｅ ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ（ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を粘膜産生角膜上皮細胞モデルとし、実施例７−１で調製した蛍光標識インスリン含有ＨＡ誘導体溶液を添加した。組織の自家蛍光補正用、比較対象としてそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）のみ、蛍光標識インスリン溶液のみを添加した。３７℃、ＣＯ２インキュベータ内に３０分間静置した後、添加した溶液を除去、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で３回リンスした。３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で約１６時間静置した後、パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ含有退色防止剤をマウント剤としてプレパラートを作製した。共焦点レーザー顕微鏡で粘膜産生角膜上皮層に接着・浸透した蛍光標識インスリン内包ＨＡナノゲルを観察した。各試料について３か所のｚスタック画像の蛍光強度から粘膜産生角膜上皮細胞層内に浸透した蛍光標識インスリンを定量した。粘膜産生角膜上皮細胞層内に浸透したＨＡ誘導体に含有された蛍光標識インスリンと粘膜産生角膜上皮細胞層内に浸透したＨＡ誘導体に内包されていない蛍光標識インスリンの量比をＨＡナノゲルが有する粘膜接着性および透過性を表す指標として表４２に示した。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
ＨＡ誘導体は蛍光標識インスリンの粘膜接着性および透過性を高めることが明らかとなった。一方、蛍光標識インスリンが、カチオン性の多糖であるキトサンにコレステリル基を導入したキトサン誘導体（ＣＳ−Ｃｈｏｌ）に内包された場合は、内包されていない場合と比較して、粘膜接着性および透過性は、低下した。
〔実施例８〕核酸含有ＨＡ誘導体の調製及び評価
（実施例８−１）核酸含有ＨＡ誘導体の調製
ＡｐｏＢ（センス鎖：５’−ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ−３’（配列番号１：塩基数２１）、アンチセンス鎖：３’−ＣＡＣＡＧＵＡＧＵＧＵＧＡＣＵＵＡＵＧＧＵＵＡ−５’（配列番号２：塩基数２３））をｓｉＲＮＡとして使用した。まず、０.５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの水溶液と０.１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を混ぜた。それに対し、Ｎ／Ｐ比が１０または２０となるように実施例２および実施例４で得られたＨＡ誘導体の６ｍｇ／ｍＬ水溶液を加え、ピペッティングすることで核酸含有製剤（ｓｉＲＮＡ終濃度８００ｎＭ、Ｈｅｐｅｓ終濃度１０ｍＭ）を調製した。
（比較例８−１）核酸含有ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰの調製
ＤＯＰＥ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、東京化成工業製）およびＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ、日油製）をクロロホルムに溶解し、混合後、窒素ガスにてガラス瓶にキャストした。超純水を加えて再膨潤し、ソニケーション処理することによりＤＯＰＥ（２．５ｍｇ／ｍＬ）／ＤＯＴＡＰ（２．５ｍｇ／ｍＬ）溶液とした。実施例８−１に記載のＡｐｏＢをｓｉＲＮＡとして使用し、ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ溶液と混合し、ピペッティングすることにより核酸含有ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ製剤を調製した。
（実施例８−２）核酸含有ＨＡ誘導体による遺伝子発現抑制効果と細胞毒性の評価
（実施例８−２−１）遺伝子発現抑制の評価
実施例８−１で得られた核酸含有ＨＡ誘導体の遺伝子発現抑制効果を評価するため、ＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクション実験を行った。核酸含有誘導体を含むスクロース溶液を９６ｗｅｌｌプレートに添加したのち、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに分散したＨｅｐＧ２細胞を添加し２４時間培養した。トランスフェクション時のｓｉＲＮＡ終濃度は２００ｎＭとした。ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ９６キットを用いてマニュアルに従いトータルＲＮＡを抽出精製した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ １Ｓｔｅｐキットを用いてマニュアルに従い、対象とするＡｐｏＢのｍＲＮＡ及びハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡについて以下のプライマーを用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。定量リアルタイムＰＣＲにはＱＩＡＧＥＮ社製Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑを使用した。ＧＡＰＤＨによる補正後のＡｐｏＢ発現量について、未処置群のＡｐｏＢ発現量を１とした時の各製剤処置群の相対発現量を表４３に示す。
なお、実験には、以下の市販のＡｐｏＢプライマーおよびＧＡＰＤＨプライマーを、使用した。
ＡｐｏＢプライマー：Ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ（ＦＡＭ／ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ）ＡｓｓａｙＩＤ Ｈｓ０１０７１２０５＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社
ＧＡＰＤＨプライマー：Ｈｕｍａｎ ＧＡＰＤ（ＧＡＰＤＨ）Ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＶＩＣ／ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ、ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、製品番号４３２６３１７Ｅ
（実施例８−２−２）細胞毒性の測定（Ｃｙｑｕａｎｔ）
実施例８−２−１のトランスフェクション実験と並行して核酸含有ＨＡ誘導体が細胞増殖へ与える影響をＣｙｑｕａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｏ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて評価した。この方法は細胞のＤＮＡ含量により細胞毒性を評価する方法である。核酸含有ＨＡ誘導体を含むスクロース溶液を９６ｗｅｌｌプレートに添加したのち、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに分散したＨｅｐＧ２細胞を添加し２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ終濃度が２００ｎＭとなるよう核酸含有ＨＡ誘導体を添加した。培地を除去したのちマニュアルに従いＣｙｑｕａｎｔ試薬を添加して暗所、室温にて３０分間インキュベートした。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いてＥｍ／Ｅｘ＝４８５／５３８ｎｍで蛍光強度を測定した。未処置群の蛍光強度を１とした時の各製剤処置群の相対強度を表４３に示す。
（実施例８−２−３）細胞毒性の測定（ＷＳＴ）
実施例８−２−１のトランスフェクション実験と並行して核酸含有ＨＡ誘導体が細胞の代謝活性へ与える影響をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＷＳＴ−８、同人化学研究所）を用いて評価した。この方法は、細胞の代謝活性により細胞毒性を評価する方法である。核酸含有ＨＡ誘導体を含むスクロース溶液を９６ｗｅｌｌプレートに添加したのち、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに分散したＨｅｐＧ２細胞を添加し２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ終濃度が２００ｎＭとなるよう核酸含有ＨＡ誘導体を添加した。培地を除去したのちマニュアルに従いＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８試薬を含む培地を添加して３７℃でインキュベートした。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。未処置群の吸光度を１とした時の各製剤処置群の相対強度を表４３に示す。
Figure 2017195880
Figure 2017195880
Figure 2017195880
核酸含有ＨＡ誘導体で処理した場合は、明らかにＡｐｏＢの発現が抑制されていた。また、核酸含有ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰではＷＳＴ法にて強い毒性が確認され、遺伝子発現抑制効率が測定できないほどであったが、核酸含有ＨＡ誘導体ではＣｙｑｕａｎｔおよびＷＳＴのいずれにおいても高い毒性は確認されなかった。なお、ｓｉＲＮＡ単独では遺伝子発現抑制効果がないことは自明である。
〔実施例９〕ＨＡ誘導体の口内炎モデル試験
（実施例９−１）ＨＡ誘導体単独製剤の調製
実施例２−２５で合成した１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＡｒｇＮＨ２−１６％／ＥｔＯＨ−６９％を１０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液に溶解し、ＨＡ誘導体群の投与製剤とし、４℃以下で保存した。また、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液をＶｅｈｉｃｌｅ群の投与製剤とした。
（実施例９−２）５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルを用いたＨＡ誘導体単独での効果の評価
６週齢のハムスター（Ｓｌｃ：Ｓｙｒｉａｎ、ＳＬＣ Ｊａｐａｎ， Ｉｎｃ．）にフルオロウラシル（５−ＦＵ，協和発酵キリン株式会社, ７０ ｍｇ／ｋｇ）を，Ｄａｙ０及びＤａｙ２に腹腔内投与した。Ｄａｙ１及びＤａｙ２に，イソフルラン麻酔下にて、左頬袋内側口腔粘膜をＷｉｒｅ Ｂｒｕｓｈ（ＦＣ４５７１， ＭＩＮＩＴＯＲ ＣＯ．，ＬＴＤ）で叩く操作（スクラッチ）を行った。Ｄａｙ２においては、スクラッチを実施した後に５−ＦＵを投与した。
Ｄａｙ３に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＨＡ誘導体群の２群（各群ｎ＝１０）に口内炎面積に偏りがないようにハムスターを割り付けた。Ｄａｙ３からＤａｙ７まで、１日１回、口内炎患部にＨＡ誘導体またはＶｅｈｉｃｌｅを３０μＬ滴下した。
口内炎面積は、ノギスで口内炎部位の短径及び長径を測定して算出した。短径及び長径は、面積が最少になる角度で口内炎部位に長方形を当てはめたときの短径及び長径とし、口内炎面積は長方形の面積として算出した。なお上記計測は、イソフルラン麻酔下にて実施した。
平均値と標準偏差の算出、及びグラフの作成は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１３を使用した。薬効評価は、Ｄａｙ３からＤａｙ６の口内炎面積の曲線下面積（ＡＵＣ）を、ｔ検定もしくはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定（ＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．２．１， ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）にて比較した。有意水準は両側５％とした。
口内炎面積推移を図１５−１に、口内炎面積ＡＵＣを図１５−２に示す。これらの結果より、ＨＡ誘導体自体に口内炎の治癒を促進する効果があることが見出された。
（実施例９−３）Ｇ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体製剤の調製
実施例２−２５で合成した１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＡｒｇＮＨ２−１６％／ＥｔＯＨ−６９％を４０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液に溶解し、Ｇ−ＣＳＦ溶液（中外製薬製）を加え、終濃度２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ誘導体および０．１ｍｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液とし、これをＧ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体製剤として、投与に用いた。
また、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液をＶｅｈｉｃｌｅ製剤とし、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液をＧ−ＣＳＦ製剤として、それぞ投与に用いた。
（実施例９−４）５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルを用いたＧ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体製剤の評価
実施例９−２に記載の方法で５−ＦＵ誘発性ハムスター口内炎モデルを調製し、実施例９−３で調製したＧ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体製剤、Ｖｅｈｉｃｌｅ製剤、Ｇ−ＣＳＦ製剤を投与した。
口内炎面積推移を図１６−１に、口内炎面積ＡＵＣを図１６−２に示す。これらの結果より、Ｇ−ＣＳＦ含有ＨＡ誘導体製剤には口内炎の治癒を促進する効果があることが見出された。
（実施例９−５）ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）含有ＨＡ誘導体製剤の調製
実施例２−２５で合成した１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１５％／ＡｒｇＮＨ２−２８％／ＥｔＯＨ−５６％および１０ｋ ＨＡ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＡｒｇＮＨ２−２１％／ＥｔＯＨ−５９％を４０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液に溶解し、ＫＧＦ溶液（ケピバンス、ＳＯＢＩ社）を加え、終濃度２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ誘導体および０．２ｍｇ／ｍＬ ＫＧＦの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液とし、ＫＧＦ含有ＨＡ誘導体製剤とし、投与に用いた。
また、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液をＶｅｈｉｃｌｅ製剤とし、０．２ｍｇ／ｍＬ ＫＧＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）含有１０％スクロース溶液をＫＧＦ製剤とし、それぞれ投与に用いた。
（実施例９−６）放射線誘発ハムスター口内炎モデルを用いたＫＧＦ含有ＨＡ誘導体製剤の評価
７週齢のハムスター（Ｓｌｃ：Ｓｙｒｉａｎ、ＳＬＣ Ｊａｐａｎ， Ｉｎｃ．）にペントバルビタールを６０ ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．で投与、麻酔し、口腔内から引き出した左頬袋の一部に下記の条件にてＸ線を照射した。
Ｘ線照射条件
Ｘ線照射装置：ＭＢＲ−１５２０Ｒ−４（日立）
電圧/電流：１５０ ｋＶ／２０ ｍＡ
フィルター： 1 ｍｍアルミニウム
線源からの距離：３８ｃｍ
照射線量：５０Ｇｙ（４．５Ｇｙ／ｍｉｎ）
投与
Ｄａｙ０（Ｘ線照射日）からＤａｙ２７まで１日１回、実施例９−５で調製した、投与用の各製剤５０ μＬを頬袋内に投与した。スコアリング実施日は、スコアリング終了後に麻酔下で投与し、それ以外の日は無麻酔下で投与した。
スコアリング
イソフルラン麻酔下にて左頬袋を引き出し、Ｓｏｎｉｓらの方法（以下、Ｕｌｃｅｒ ｓｃｏｒｅ）に準じてスコアリングを実施した。スコアリングは、Ｄａｙ６，８，１０，１２，１４，１６，１７，２０，２４，２８に実施した。
スコア基準を、以下に記載した。
潰瘍スコア
０：完全に健康な頬袋。ただれまたは血管拡張なし。
１：紅斑、しかし明らかな粘膜のびらんの形跡はなし。
２：重度の紅斑、血管拡張、および表在性びらん。
３：１以上の箇所での潰瘍形成、しかし頬袋の表面積の２５％を超えるには至らず。重度の紅斑および血管拡張。
４：頬袋の表面積の約５０％の累積的潰瘍形成。
５：頬袋粘膜の事実上完全な潰瘍形成。柔軟性の喪失。
統計学的解析方法
平均値、標準偏差の算出およびグラフの作成は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１３を使用した。
Ｄａｙ６からＤａｙ２８の口内炎スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）について、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定（ＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．２．１，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ.）で、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と，ＫＧＦ群及びＫＧＦ含有ＨＡ誘導体製剤群を比較し、ｔ検定（ＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．２．１，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ.）でＫＧＦ群とＫＧＦ含有ＨＡ誘導体製剤を比較した。各検定の有意水準は両側５％とした。
口内炎スコア推移を図１７−１に、口内炎スコアＡＵＣを図１７−２に、体重の推移を図１７−３に示す。
これらの結果より、ＫＧＦ含有ＨＡ誘導体製剤には口内炎の治癒を促進する効果があることが見出された。
〔実施例１０〕ＨＡ誘導体の毒性評価
実施例２および実施例４で得られたＨＡ誘導体が細胞増殖へ与える影響をＣｙｑｕａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｏ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて評価した。ＨｅｐＧ２細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで２４時間培養した。ＨＡ誘導体が終濃度で１５００、３００、６０、１２、２．４μｇ／ｍＬとなるよう新鮮培地と混合した溶液を準備し、プレートの培地と交換した。２４時間後、培地を除去したのちマニュアルに従いＣｙｑｕａｎｔ試薬を添加して暗所、室温にて３０分間インキュベートした。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いてＥｍ／Ｅｘ＝４８５／５３８ｎｍで蛍光強度を測定した。未処置群の蛍光強度を１００％とした時の各ＨＡ誘導体の相対強度を図１８に示す。
結果、ＨＡ誘導体はポリエチレンイミン（ポリサイエンス社製、分子量1万）よりも細胞毒性が低いことが明らかとなった。
〔実施例１１〕ＨＡ誘導体の合成４
（実施例１１−１）Ｌ−リジンアミド（Ｈ−ＬｙｓＮＨ ２ ）およびオクタデシルアミンにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃ １８ ／ＬｙｓＮＨ ２ ）の合成
実施例１−２で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。オクタデシルアミン（ＣＨ３（ＣＨ２）１７ＮＨ２、シグマアルドリッチ製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表４４に示す比率で各溶液に添加し、室温で３０分間以上撹拌した。次に、モノＦｍｏｃ−Ｌ−リジンアミド塩酸塩（渡辺化学工業製）およびＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表４４に示す比率で加え、室温で２時間以上撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、ＤＭＳＯ、純水、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃ１８／ＬｙｓＮＨ２）を白色固体として得た。なお、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液における透析により、Ｆｍｏｃ体の脱保護がなされた。得られた白色個体に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように水を加え、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施し、溶液状態を確認した。沈殿が確認された試料は×、確認されなかった試料は〇と表４４に記載した。
測定溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ ＤＣｌ Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりオクタデシル導入率およびＬｙｓＮＨ２導入率を算出した。ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたオクタデシル中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、０．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するオクタデシル導入率を算出した（表４４）。
なお、Ｎ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．７〜１．９ｐｐｍ付近のピークには導入されたＬｙｓＮＨ２由来のピーク（１Ｈ）が重なっているため、１．７〜１．９ｐｐｍ付近のピークの積分値からＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値を１／２したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．７〜１．９ｐｐｍ）−積分値（２．８ｐｐｍ）×１／２）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure 2017195880
 ＨＡにおけるＮ−アセチルグルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．７〜１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、導入されたＬｙｓＮＨ２中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ2−、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるリジンアミドの導入率（ＬｙｓＮＨ２導入率）を算出した（表４４）。
Figure 2017195880
Figure 2017195880

Claims (15)

  1. 式（Ｉａ）：
    Figure 2017195880
     ［式中、
    Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
    Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
    Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
    Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
    Figure 2017195880
     から選択され；
    Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
    ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
    Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
    Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１６ａは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｑ−は、カウンターアニオンを表し；
    ただし、Ｒ８が水素原子であり、かつＢ１が−ＮＲ１２Ｒ１３である時、ｉ）ｎ１は１〜３の整数かつＡ１は単結合であるか、またはｉｉ）ｎ１は１であり、Ａ１は−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−であり、かつｎ２が１〜３の整数である］
    で表される１以上の繰り返し単位、および
    式（Ｉｂ）：
    Figure 2017195880
     ［式中、
    Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲｂ−Ｚ３、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
    Ｒ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｚ０は、以下の基：
    Figure 2017195880
     から選択され、
    Ｚ１は、Ｃ１−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
    Ｚ２は、以下の基：
    −ＮＲｂ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −ＣＯＯ−Ｚ３、
    −ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −Ｏ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
    −Ｓ−Ｚ３、
    −ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
    −Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
    から選択され；
    ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
    Ｒｄは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
    Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
    Ｚ３は、ステリル基であり；
    Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
    Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
    Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
    Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
    Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ｘ４）２、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
    Ｙ３およびＹ４は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６ａ−を表し；
    ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
    Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
    Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ２−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯＲａ、−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ３、−Ｚ１−Ｚ２、−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ０−Ｚ２であり；
    Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択される］
    で表される１以上の繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
  2. 式（ＩＩ）
    Figure 2017195880
     ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｒ５ａは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｘａは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
    で表わされる１以上の繰り返し単位をさらに含む、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  3. 式（ＩＩＩ）
    Figure 2017195880
     ［式中、
    Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
    Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され、
    Ｘ５は、−ＮＲ１７−Ｒ１８を表し、
    Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、
    Ｒ１８は、１以上のヒドロキシで置換されていてもよいＣ１−１０アルキルを表す］
    で表される１以上の繰り返し単位をさらに含む、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. Ｘ１が、以下の式：
    Figure 2017195880
     ［式中、Ｒ１９およびＲ２０は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し、Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
    から独立して選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  5. Ｘ５が、以下の式：
    Figure 2017195880
     で表されるいずれか１つ以上の基である、請求項３または４に記載のヒアルロン酸誘導体。
  6. ステリル基が、以下の式：
    Figure 2017195880
     ［式中、Ｒ２１は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表す］
    のいずれかで表される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  7. Ｘ２が、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２または−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２であるか、あるいは、Ｘ２が、−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２であり、Ｘ４が−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 存在する二糖の繰り返し単位における、Ｘ２が−Ｏ−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２または−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合が、３〜５５％である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合が、１〜７５％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  10. 存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉａ）で表される繰り返し単位の割合、およびＸ２が−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２である式（Ｉｂ）で表される繰り返し単位の割合の和が、３０〜１００％である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  11. Ｒ８が、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０または−ＣＯ２Ｒ１１から選択されるか、または、
    Ｂ１が、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
    Figure 2017195880
     から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含む、医薬組成物。
  13. 式（Ｉａ）：
    Figure 2017195880
     ［式中、
    Ｒ１ｘ、Ｒ２ｘ、Ｒ３ｘおよびＲ４ｘは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｒ５ｘは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｘ１は、−ＮＲ７−ＣＨＲ８−（ＣＨ２）ｎ１−Ａ１−Ｂ１を表し；
    Ｒ７は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒ８は、水素原子、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０および−ＣＯ２Ｒ１１から選択され；
    Ａ１は、単結合、−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−および−（Ｙ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎａ）ｎ３−から選択され；
    Ｂ１は、−ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｎ＋Ｒ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｑ−、−Ｎ（−Ａ２−ＮＲ１２Ｒ１３）２、窒素原子を１〜４個含む５〜１０員のヘテロアリール、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および基
    Figure 2017195880
     から選択され；
    Ｙ１およびＹ２は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６−を表し；
    ｎ１は、１〜６の整数を表し、ｎ２およびｎ３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎａは、１または２の整数を表し、ｎ４は０〜３の整数を表し；
    Ａ２は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
    Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１６ａは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｑ−は、カウンターアニオンを表す］
    で表される１以上の繰り返し単位、および
    式（Ｉｂ）：
    Figure 2017195880
     ［式中、
    Ｒ１ｙ、Ｒ２ｙ、Ｒ３ｙおよびＲ４ｙは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｒ５ｙは、水素原子、ホルミルおよび（Ｃ１−６アルキル）カルボニルから選択され；
    Ｘ２は、−Ｏ−Ｚ３、−ＯＲａ、−ＮＲａＲ５ｚ、−Ｏ−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−Ｏ−Ｚ０−Ｚ２、−ＮＲｂ−Ｚ３、−ＮＲ６−Ｚ１−Ｚ２および−ＮＲ３１−ＣＨＲ３２−（ＣＨ２）ｎ１１−Ａ３−Ｂ２から選択され；
    Ｒ５ｚおよびＲ６は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒａは、Ｃ８−５０アルキル、Ｃ８−５０アルケニルおよびＣ８−５０アルキニルから選択され；
    Ｚ０は、以下の基：
    Figure 2017195880
     から選択され；
    Ｚ１は、Ｃ１−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
    Ｚ２は、以下の基：
    −ＮＲｂ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −ＣＯＯ−Ｚ３、
    −ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −Ｏ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
    −Ｓ−Ｚ３、
    −ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
    −Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
    −ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
    −Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
    から選択され；
    ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
    Ｒｄは、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
    Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
    Ｚ３は、ステリル基であり；
    Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
    Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
    Ｒ３１は、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｒ３２は、水素原子、−ＣＯＮＲ３３Ｒ３４および−ＣＯ２Ｒ３５から選択され；
    Ａ３は、単結合、−（Ｙ３−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ１２−および−（Ｙ４−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｎ１４）ｎ１３−から選択され；
    Ｂ２は、−ＮＲ３６−Ｘ４、−Ｎ（−Ｘ４）２、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６Ｒ３７）（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）、−Ｎ（−Ａ４−ＮＲ３６−Ｘ４）２および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ−Ｘ４から選択され；
    Ｙ３およびＹ４は、独立に、酸素原子または−ＮＲ１６ａ−を表し；
    ｎ１１は、１〜６の整数を表し、ｎ１２およびｎ１３は、独立に、１〜１０の整数を表し、ｎ１４は、１または２の整数を表し；
    Ａ４は、Ｃ２−１０アルキレンを表し；
    Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキルを表し；
    Ｘ４は、−ＣＯ２−Ｚ３、−ＣＯ２−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ２−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２、−ＣＯ−Ｚ０−Ｚ２、−ＣＯＲａ、−Ｚ３、−Ｏ−Ｚ３、−Ｚ１−Ｚ２、−Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２または−Ｚ０−Ｚ２を表す］
    で表される１以上の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を、薬物と複合化させる工程を含む、
    粘膜透過性を向上させた医薬組成物の製造方法。
  14. ヒアルロン酸誘導体が、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 薬物と、
    請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体、
    とを含む、
    経粘膜投与に用いるための医薬組成物。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7221211B2 (ja) * 2017-11-15 2023-02-13 中外製薬株式会社 ポリエチレングリコールにより修飾されたヒアルロン酸誘導体
TWI834948B (zh) * 2020-02-05 2024-03-11 日商旭化成股份有限公司 玻尿酸衍生物組合物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體組合物
CN118027246A (zh) * 2020-02-07 2024-05-14 旭化成株式会社 透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体
CZ202132A3 (cs) * 2021-01-26 2022-04-20 Contipro A.S. Prostředek pro hojení ran, způsob jeho výroby a použití
KR102441798B1 (ko) * 2021-07-15 2022-09-08 아주대학교산학협력단 히알루론산 복합체를 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN114561046B (zh) * 2022-02-28 2023-10-27 江南大学 一种胍基透明质酸型抗菌水凝胶及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008133267A1 (ja) * 2007-04-24 2008-11-06 Q.P. Corporation カチオン化ヒアルロン酸および／またはその塩、およびその製造方法、ならびにこれを用いた毛髪改質剤、キューティクル修復剤、皮膚改質剤および化粧料
KR20100037494A (ko) * 2008-10-01 2010-04-09 한국과학기술연구원 근적외선 형광체가 결합된 양친성 히알루론산 복합체 나노입자를 포함하는 암 진단용 조영제
WO2010053140A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
WO2014038641A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 中外製薬株式会社 アミノ酸およびステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL140844A0 (en) 2001-01-10 2002-02-10 Polygene Ltd Cationic polysaccharide compositions
JP4220513B2 (ja) 2005-12-01 2009-02-04 株式会社資生堂 カチオン化ヒアルロン酸
JP5443976B2 (ja) * 2007-05-01 2014-03-19 国立大学法人 東京医科歯科大学 化学架橋ヒアルロン酸誘導体を含むハイブリッドゲルおよびそれを用いた医薬組成物
US20110177017A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 Timothy Woodrow Coffindaffer Non-Aerosol Personal Care Compositions Comprising A Hydrophobically Modified Cationic Polysaccharide
WO2011148116A2 (fr) 2010-05-27 2011-12-01 Laboratoire Idenov Acide hyaluronique modifie, procede de fabrication et utilisations
CN103143027A (zh) 2013-02-28 2013-06-12 厦门大学 一种基于透明质酸的双靶向纳米复合物药物制备及其应用
CN104945538A (zh) 2015-06-25 2015-09-30 浙江大学 一种透明质酸维生素e衍生物及制备和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008133267A1 (ja) * 2007-04-24 2008-11-06 Q.P. Corporation カチオン化ヒアルロン酸および／またはその塩、およびその製造方法、ならびにこれを用いた毛髪改質剤、キューティクル修復剤、皮膚改質剤および化粧料
KR20100037494A (ko) * 2008-10-01 2010-04-09 한국과학기술연구원 근적외선 형광체가 결합된 양친성 히알루론산 복합체 나노입자를 포함하는 암 진단용 조영제
WO2010053140A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
WO2014038641A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 中外製薬株式会社 アミノ酸およびステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI, CHANGYONG ET AL.: "Preparation and Characterization of Deoxycholic Acid-Grafted Hyaluronic Acid as a Drug Carrier", POLYMER(KOREA), vol. 35, no. 2, JPN6017029241, 2011, pages 119 - 123, ISSN: 0004511895 *
DONG, XUEMENG ET AL.: "Preparation and Characterization of Self-Assembled Nanoparticles of Hyaluronic Acid-Deoxycholic Acid", JOURNAL OF NANOMATERIALS, JPN6017029240, 2010, pages 1 - 9, XP055436564, ISSN: 0004511894, DOI: 10.1155/2010/906936 *
LI, JING ET AL.: "Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-deoxycholic acid conjugates", BIOMATERIALS, vol. 33, JPN6017029238, 2012, pages 2310 - 2320, ISSN: 0004511892 *
MIAO, WENJUN ET AL.: "Cholesteryl hyaluronic acid-coated, reduced graphene oxide nanosheets for anti-cancer drug delivery", BIOMATERIALS, vol. 34, JPN6017029239, 2013, pages 9638 - 9647, XP055436560, ISSN: 0004511893, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2013.08.058 *

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