JP2005298644A - ナノゲル工学によるハイブリッドゲルの調製とバイオマテリアル応用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、重合性自己組織化ナノゲル(ナノジェロマー)の合成と新規ハイブリッドナノゲルの合成およびナノゲルを架橋点とする階層的ゲルの合成と生理活性物質リザーバーシステムとしての機能、さらにナノゲルーリポソーム複合体を架橋点とするリポソームネットワークゲルの合成を主要な特徴とする。
Description
Akiyoshi, K.; Deguchi, S.; Moriguchi, N.; Yamaguchi, S.; Sunamoto, J. Macromolecules 1993, 26, 3062. 2) Kuroda, K.; Fujimoto, K.; Sunamoto, J.; and Akiyoshi, K. Langmuir 2002, 10, 3780.
つまり本発明は以下よりなる;
1.親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、これに機能性モノマーと共重合をおこす工程を含む多糖類と合成高分子とのハイブリッドゲルの調製方法。
2.共重合反応を、多糖類によるナノゲル間の架橋反応を抑えることが可能な重合反応物の濃度の条件で行うことにより、多糖類によるナノゲルをシード(種)として、その周りを他の機能性高分子で被ったナノゲルを調製する前項1に記載のハイブリッドナノゲルの調製方法。
3.共重合反応を、全体がゲル化可能な重合反応物濃度の条件でマクロゲルを調製する前項1に記載のハイブリッドマクロゲルの調製方法。
4.親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、この物質でリポソームの表面を被覆した後に、さらに機能性モノマーと共重合をおこす工程を含むハイブリッドマクロゲルの調製方法。
5.前項1〜4のいずれか一に記載の調製方法によって調製された生理活性物質担持機能を保持するハイブリッドゲル。
6.前項5のハイブリッドゲルを利用する生理活性物質の以下の少なくとも1の機能的制御方法;
1)生理活性物質の生体内運搬、
2)生理活性物質の保存・安定化、
3)生理活性物質の精製、
4)生理活性物質の反応性の抑制。
7.前項6のいずれか一つに記載の制御がなされた生理活性物質担持ハイブリッドゲルを含有する製剤。
8.前項7に記載の製剤の製造方法。
その基盤物質は、親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物として調製される。親水性多糖類は、分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類である。具体的な多糖類は、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群より選択される1種以上である。導入される疎水性基は、炭素数12〜50の炭化水素基、ステリル基等が好適に例示される。この疎水性基は、親水性多糖類における100単糖あたり整数値に限定されない1〜5個より好ましくは1〜3個の疎水性基が導入されている。この疎水性基含有多糖類の調製法は、例えばWO00/12564に開示がある。それによると、第1段階反応は、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、OCN-R1-NCO(式中、R1は炭素数1〜50の炭化水素基である。)で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。第2段階反応は、前記第1段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。この第2段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。
疎水性基含有多糖類は、ついでその100単糖あたり整数値に限定されない2〜20個より好ましくは5〜8個の重合性基を導入される。重合性基とは、メタクリロイル基やアクリロイル基が好適に例示される。この重合性基の導入方法は、実施例1にその詳細な例示を説明した。このようにして調製された重合性多糖類は、水に分散させ、膨潤させた後に、超音波処理を行うと、疎水性基含有多糖類によって調製されるものと同様のナノゲル(実施例によると会合数3.9、慣性半径17.2nmが例示)が形成される。そして、実施例では、このナノゲル一つは、重合性基を約160個有することが確認された。
このように調製された基盤物質は、これを利用して機能性モノマーとの共重合反応をおこさせる。機能性モノマーとは、水溶性モノマーであって、たんぱく質等の吸着が極めて少ない等の生体適合性に優れた特性を有する化合物が選択される。この機能性モノマーの導入は、その導入条件によって最終製剤の性質に様々の効果をもたらし、特に重合化物の硬さ、柔らかさ等の物理的な効果をもたらす。この機能性モノマーとしては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、N-イソプロピルアクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アクリル酸、N-ビニルピロリドン、アクリアミド、2-アミノエチルメタクリレート等が好適に例示される。この機能性モノマーとの共重合反応をおこすことで、前記重合性多糖類は、多糖類と合成高分子とのハイブリッドゲルとして調製される。このハイブリッドゲルは、以下に説明する調製条件による多様な性質をもち、目的に合わせた性質の生体対応物質の調製を可能とする。
例えば、重合性多糖類によって調製されたナノゲルを6mg/ml以上の濃度で、重合性基に対して機能性モノマーを6倍モル濃度以上〔例えば、MPC 32mg/ml(メタクロイル基に対してMPC6倍のモル濃度以上)〕の存在下で重合を行うとマクロなゲルが形成した。ナノゲルが架橋剤(nanogel macro cross-linker)として機能している事を示している。機能性モノマー例えばMPCを一定(例えば32mg/ml)として、重合性多糖類によって調製されたナノゲル濃度を増加させるとゲルの膨潤度が低下して堅いゲルが形成した(実施例参照)。ゲル密度の高いナノゲルの架橋ドメインの増加を反映している。このゲルは電子顕微鏡観察からナノゲル構造が機能性モノマー鎖例えばMPC鎖で架橋されたような構造を有していることが分かった。ナノゲル間の平均の距離は、例えばナノゲル:機能性モノマーの配合量が30mg/ml:32mg/mlであるCM30-32(実施例参照)では83nm、同10mg/ml:32mg/mlであるCM10-32(実施例参照)では289nm、同6mg/ml:32mg/mlであるCM6-32(実施例参照)では552nmと計算された。架橋点構造の明確な、ナノゲルドメインを有する新規なゲルが調製できた。このゲルは、ナノゲル内の10nm以下のネットワークとナノゲル間の数100mのネットワークという二つの階層を有するゲルである。また、それぞれの階層の特性を疎水化多糖の構造および重合性モノマーの選択により、独立に自在に制御可能である。
1〕生理活性物質の生体内運搬、
2〕生理活性物質の保存・安定化、
3〕生理活性物質の精製、
4〕生理活性物質の反応性の抑制。
ハイブリッドゲルへの生理活性物質の取り込みは、リポソームを使う系の場合は、予めリポソーム中に目的生理活性物質を包埋しておくが、それ以外の場合は、天然蛋白質あるいは変性状態の蛋白質とハイブリッドゲルを接触させ行う。例えば、無細胞蛋白質合成系を利用した系においては、mRNAの存在する相にハイブリッドゲルを共存させる。例えば、mRNAの約1〜1000μgに対して0.01〜1mgのハイブリッドゲルを添加する。但し、この添加量は、蛋白産生量との比率、取込み効率を考慮し、随時変更可能である。細胞蛋白質合成系においては、分泌型であればそのまま或は化学的変性剤との共存下でナハイブリッドゲルと接触させる。また、非分泌型或は細胞内での凝集体化がおこるものであれば、細胞を破壊し、凝集体等を化学的変性剤で可溶化した後、ハイブリッドゲルと接触させる。その使用適量は、対象蛋白質等の量・分子量によって適宜実験的繰り返しにより決定されるが、一般的には、対象蛋白質等の重量:ハイブリッドゲル重量=1:0.1〜10の比率で、好適には1:1〜5である。
これは、所謂、ターゲティング治療に関する。目的生理活性物質を、ハイブリッドゲル内に包埋し、経口或は注射によって生体内に生理活性物質等包埋ハイブリッドゲルを投与し、粒子を目標組織、目標細胞、癌細胞等に移動させ、目標部位に到着後、粒子構造を変化させ、包埋生理活性物質等を遊離させ、蛋白質であればリフォールディング後に生物活性を発揮させるというものである。この方法で、生理活性物質或いは活性蛋白質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。簡便には、腸内の特別の部位での生理活性物質或いは蛋白質等の活性化のために経口投与し、そしてそれに続く腸内のターゲット部位での活性化を達成する。注射薬としては、ハイブリッドゲルの表面を目標組織・細胞との親和性を考慮した修飾を施し、例えばモノクローナル抗体等、その親和性により目標部位に生理活性物質或いは蛋白質等包埋ハイブリッドゲルを集積させ、その後ハイブリッドゲル構造を変化させ、包埋生理活性物質或いは蛋白質等を遊離させ、蛋白質であればリフォールディング後に、生物活性を発揮させるというものである。この方法で、生理活性物質或いは活性蛋白質の生体内移動中の失活或は副作用が制御可能である。
安定性に乏しい生理活性物質の安定化、たんぱく質の場合フォールディングされた状態で、安定性に乏しい蛋白質等の安定化のための手段としても好ましい結果を導く。生理活性物質或いは蛋白質等を主成分とする製剤には、医薬品、化粧品、食品等様々のものがある。目的とする生理活性物質或いは蛋白質等が、放置すれば不可逆的に変性・凝集を起こす場合、本ハイブリッドゲルの中に目的蛋白質等を閉じ込め、用事、目的生理活性物質或いは蛋白質等を遊離させ、目的の生理学的機能を発揮させる。
目的の蛋白質等が遺伝子工学的に生産される場合、蛋白質等の合成後、細胞外分泌されずインクリュージョンボディーの状態になる場合に有効である。細胞を溶解し変性剤で目的蛋白質等を変性させ、ハイブリッドゲル中に取込み、回収し、その後、適当な生理的条件下でハイブリッドゲルの構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。無細胞タンパク質合成手段或は分泌系の細胞内蛋白質合成手段にあっては、合成系にハイブリッドゲルを共存させ、合成されてくる蛋白質等をハイブリッドゲル内に連続的に取込み、その後、ハイブリッドゲルを分離回収して、適当な生理的条件下でハイブリッドゲルの構造を変化させ、目的蛋白質等をリフォールディングさせて回収することができる。
酵素又は基質を、ハイブリッドゲル内に包埋させておけば、酵素反応の制御が要時まで可能である。ハイブリッドゲル内に包埋された酵素又は基質は、不活性状態として、相手側との交差が制御される。例えば、試薬として一体化製剤として製品化した場合に、ハイブリッドゲルが構造を変化させ、包埋目的酵素又は基質を遊離させ、その結果、酵素反応が初めて開始できる系にしておけば、製剤の効率化・簡略化が達成できる。また、酵素の保存安定性の確保のためにハイブリッドゲル内に酵素を包埋しておき、要時目的酵素をハイブリッドゲルから遊離させて反応系におくことも可能である。
抗原又は抗体を、ハイブリッドゲル内に包埋しておけば、抗原・抗体反応の制御が可能である。抗原抗体反応を利用した試薬、医薬において、要時目的抗体又は抗原をハイブリッドゲルから遊離させて反応系におくことも可能である。
重合性ナノゲルの合成
CHP(分子量108,000、コレステロール基置換度;1.2個/100単糖)(WO00/12564)(Akiyoshi, K.; Deguchi, S.; Moriguchi, N.; Yamaguchi, S.; Sunamoto, J. Macromolecules 1993, 26, 3062. 2) Kuroda, K.; Fujimoto, K.; Sunamoto, J.; and Akiyoshi, K. Langmuir 2002, 10, 3780)に重合性基としてメタクリロイル基の導入を行った。CHPを30mLのDMSOに溶解後、グリシジルメタクリレート(GMA)、ジメチルアミノピリジン(DMAP)を加え、24時間室温にて撹拌し、反応させた。反応は無水系にて行った。 HCl添加により反応停止後、大過剰の水に対して7日間透析を行い、凍結乾燥することでCHPメタクリレート(CHPMA)を得た。1H-NMRによる構造解析から導入されたメタクリロイル基量を決定した。以下CHPMAの100単糖あたりに導入されたメタクリロイル基をXとしてCHPMAXと呼ぶ。
実験1の手法で得られたCHPMAと2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)とラジカル共重合を行うことで多糖-合成高分子ハイブリッドポリマーを合成した。CHPMA6.2を 200mgを蒸留水に対し1.0mg/mLとなるように溶解し、超音波処理(40W、15分:以後の超音波処理はこの条件下で行った)することでナノゲルを形成させ、0.45μmフィルターにて濾過した後、CHPMA6.2のメタクリロイル基に対してモル比で100倍ないし10倍のMPCを加え、水系の重合開始剤である2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン](VA-044)をモノマーに対して0.5mol%の割合で加え50℃にて5hr重合した。反応停止後、水に対してMWCO3,500の透析膜を用いて1週間透析して未反応モノマーを除去した後、凍結乾燥した。これを水に対して再溶解させ、MPCホモポリマー除去の目的でエタノールに対して再沈殿、減圧乾燥することで回収した。1H-NMRの結果から100倍量仕込みの場合、1メタクリロイルあたり14.3個のMPC導入量(CM14、収率23.9%)、10倍量仕込みの場合、1メタクリロイル基あたり6.1個のMPCが導入(CM6、収率58.0%)されていると算出された。これらの結果から分子量はCM14;297,000、CM6;188,000と算出した。
0.2 mg/mLに調整した各水溶液をフィルター濾過し、うち10μLをとりコロジオン支持膜を張り、親水化処理を行ったグリッド上に滴下、風乾後、2%酢酸ウラニル溶液にて30分ネガティブ染色を行った後、洗浄、カーボン蒸着してTEM観察を行った。その結果、CM6及びCM14共にナノサイズの微粒子が形成されていることが確認された。
それぞれの試料を2mg/mLに調整、超音波処理を行い、0.45μmに続いて0.22μmのフィルターを2度通した後測定を行った。測定はCHP、CHPMA、CM6はTOSOH TSKgel G4000SWXLのカラムにより、CM14はSHODEXSB-806 HQ を用い、NaClの50mM水溶液を溶離液として流速0.5mL/minの条件下で行った。また、この溶離液にCDの10mM加えることでナノゲルの崩壊性について検討を行った。なおサンプルはCD添加後3時間放置してから測定を行った。表2にSEC-MALS 測定結果を示した。
酵素(Carbonic anhydrase II;CAB)溶液(0.015mg/mL)をナノゲル溶液(4.8mg/mL)と混合した後、熱変性させ、この混合溶液に10 mMのsCDを3時間作用させた場合と作用させなかった場合において、p-Nitrophenyl acetateを基質として用い、これから遊離するパラニトロフェノールの濃度増加を400nmの吸光度の時間変化を追跡することで酵素の活性回復率を見積もった。表3に熱変性させたCABの活性回復率を示した。
重合性ナノゲルを架橋点としたマクロゲルの調製とキャラクタリゼーション
CHPMAとMPCによるマクロゲルの調製について示す。
CHPMAおよび2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)を所定量(表4参照)加え、水系の重合開始剤である2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン](VA-044)をモノマー(系中の全メタクリロイル基)に対して0.5mol%の割合で加え、アルゴン脱気後、50℃、5hrの条件下で重合を行った。反応停止後、水中に1週間膨潤させることでモノマーを除去、凍結乾燥することで試料を得た。なおゲル化の確認はTilt法により行い、各組成におけるゲル化の可否から相関図を作製した。これよりCHPMA濃度が高くなることで粘度が上昇しマクロなゲル化が進行したと考えられる。この粘度上昇はCHPナノゲルが疎水性基を会合点とした物理架橋ゲルを形成しているためであり、CHPMAのコレステロール基が無い構造(つまりプルランメタクリレート:PULMA、メタクリロイル基置換度100単糖当たり5.1個)にてMPCとPULMA-MPC30-32の条件では粘度上昇が見られず、マクロなゲルは調製できない。その一方でCHPMAのみでは50mg/mLの条件においてもマクロなゲル化は確認されない。このためMPCが存在することでスペーサーとして機能し、マクロゲルを調製可能にしていると考えられた。
得られたCMマクロゲルを凍結乾燥後、また純水に対する平衡膨潤時(24h、室温)においてそれぞれ重量測定を行い下記の式から算出した。
(膨潤率)= (膨潤時重量)/(乾燥時重量)
この結果からマクロゲル中のCHPMA含量が多いほど膨潤率が低く、逆にスペーサーとしての役割を果たすMPC含量が多いほど膨潤率が高いことが明らかとなった。このことはCHPMAナノゲルが架橋点となっていることを示している(表4)。
純水にて膨潤させたCMマクロゲルに30%グリセリン溶液となるようにグリセリンを加え、液体窒素下で凍結割断法によりゲル断面を露出させた後、カーボン、白金を蒸着することでシャドーイングしてレプリカを作成し、TEM観察を行った。この結果CMマクロゲル中にCHPMAナノゲルが崩壊せずに形態を保持したまま、分散された構造を有していることが明らかとなり、CM30-32の場合そのナノゲル間距離は86.1nmであった。
各マクロゲルを10mgとり、PD-10カラム内で0.1M PBSにより室温で24h膨潤させた後、50μg/mLのFITC-Ins/0.1M PBS溶液をカラムに加えることでFITC-InsのCMマクロゲル中への取り込みを行った。各時間における取り込み量をカラム内の溶液を分取し、UV492nmにおける吸光度の減少とFITC-Insから作製した検量線を用いて算出した。この結果、CMマクロゲルの膨潤率が高いほどInsの取り込みが早く、またナノゲル1個あたりに取り込むInsの量も多いことが明らかとなった。また乾燥状態から膨潤させながらのFITC-Insの取り込みを試みたところ、平衡膨潤時からの場合と同様の取り込み挙動および量を示した。
取り込み実験で吸光度が平衡に達したマクロゲルをFITC-Ins/PBS溶液除去後、マクロゲルを含むカラムに0.1M PBS 5mLを加え、カラムを通すことで洗浄した。なおこの操作は2度行った。このマクロゲルから1) 0.1M PBS、2) 10mM sCDを含む0.1M PBS、3) 10 mg/mLのBSAを含む0.1M PBS、4) 10mM sCD 、10 mg/mLのBSAを含む0.1M PBS、5) 10%FBSを含む0.1M PBS、6) 10mM sCD 、10%FBSを含む0.1M PBSに対してのFITC-Insの放出挙動を各時間におけるUV492nmにおける吸光度から算出した。
この結果よりいずれのマクロゲルにおいてもsCDを作用させることでFITC-Insの放出量を大きく増大させた。また添加後30min以内で(480min時点での)全体量の50%以上を放出していることからナノゲルの応答性の早さが現れている。その放出量はマクロゲル内部に取り込んだFITC-Ins量が多いほど増加した。24hr後での放出量(%)はそれぞれCM6-32; 61%、 CM10-32; 53%、 CM30-32;69%、 CM-20-20; 70%であった。またCM20-20においてはさらに5日後に80%以上の放出を確認している。一方でsCD未添加の場合、3時間までの初期放出段階ではゲル型のリリース曲線を、その後リザーバー型の放出を示すことが明らかとなった。これはCMマクロゲル中のMPCマトリックス内、もしくはCHPMAナノゲル表面に存在するInsの放出(〜3時間)と、CHPMAナノゲル内に取り込まれたInsの放出であると考えられた。sCD添加により急激な放出が見られたことからもCHPMAナノゲル内部にInsが取り込まれていたことが確認された。またBSA、FBS存在下においても同様の曲線が得られたことから、MPCが存在することでタンパク質の吸着を抑制し、放出を持続させられると考えられた。まとめるとこのCMマクロゲルはsCD応答性でかつタンパク質存在下においても持続放出可能なゲルであるといえる。
また分子量約6,000のInsに対し、約60,000の牛血清アルブミンについてもマクロゲル内に取り込み、sCD添加による放出制御が可能であった。
リン脂質リポソーム-重合性ナノゲル複合体を架橋点としたマクロゲルの調製とキャラクタリゼーション
実施例2において重合性ナノゲルがその形状、性質を保持したまま架橋点となったマクロゲルが調製できた。リン脂質リポソームを重合性ナノゲルにて被覆することで重合性ナノゲル被覆リポソームを架橋点に有した、つまりリポソームーナノゲルーマトリックスの3層を有したゲルを調製した。これはリポソームのサイズのみならず種類も選択できることから、3層おのおのの部分が独立に選択でき、それぞれの特徴を生かすことが期待できる新規なマテリアルの創製である。以下にCHPMA-MPC-ジパルミトイルホスファチジルコリン/コレステロール(DPPC:cholesterol)リポソームからなるマクロゲルの調製法を示す。
直径120nmに調製したリン脂質リポソーム(DPPC:Cholesterol = 3:1(mol:mol))水溶液2mg/mLにCHPMAナノゲルを3-30 mg/mLの濃度において添加し、リポソームを被覆後、MPC32mg/mLとなるように添加し、VA-044を開始剤として全メタクリロイル基に対して0.5mol%加え、アルゴン脱気後、50℃、5hrの条件下で重合を行った。ゲル化の確認はTilt法により行った。この結果CHPMAナノゲルが10mg/mL以上の条件でゲル化が進行することが確認された。
実験2.3と同様の手法にてサンプルを調製し、TEM観察を行った。この結果マクロゲル中にリポソームを単層に被覆したCHPMAナノゲル分散されており、リポソームは構造を保持したまま重合が進行したことが明らかとなった。
Claims (8)
- 親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、これに機能性モノマーと共重合をおこす工程を含む多糖類と合成高分子とのハイブリッドゲルの調製方法。
- 共重合反応を、多糖類によるナノゲル間の架橋反応を抑えることが可能な重合反応物の濃度の条件で行うことにより、多糖類によるナノゲルをシード(種)として、その周りを他の機能性高分子で被ったナノゲルを調製する請求項1に記載のハイブリッドナノゲルの調製方法。
- 共重合反応を、全体がゲル化可能な重合反応物の濃度の条件でマクロゲルを調製する請求項1に記載のハイブリッドマクロゲルの調製方法。
- 親水性多糖類に100単糖あたり1〜5個の疎水性基を導入して得られた分子量20,000〜200,000の水溶性多糖類に、さらに100単糖あたり2〜20個の重合性基を導入し得られた化合物を基盤物質とし、この物質でリポソームの表面を被覆した後に、さらに機能性モノマーと共重合をおこす工程を含むハイブリッドマクロゲルの調製方法。
- 請求項1〜4のいずれか一に記載の調製方法によって調製された生理活性物質担持機能を保持するハイブリッドゲル。
- 請求項5のハイブリッドゲルを利用する生理活性物質の以下の少なくとも1の機能的制御方法;
1)生理活性物質の生体内運搬、
2)生理活性物質の保存・安定化、
3)生理活性物質の精製、
4)生理活性物質の反応性の抑制。 - 請求項6のいずれか一に記載の制御がなされた生理活性物質担持ハイブリッドゲルを含有する製剤。
- 請求項7に記載の製剤の製造方法。
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