WO2006093022A1

WO2006093022A1 - 免疫機能調整剤

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Publication number: WO2006093022A1
Application number: PCT/JP2006/303295
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Sashihara; Makoto Yamaguchi; Yoshitaka Nakamura; Shuji Ikegami; Seiko Narushima; Katsunori Kimura; Shinya Nagafuchi; Masaki Terahara
Original assignee: Meiji Dairies Corporation
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2006-09-08
Also published as: US20090269321A1; KR101260533B1; JPWO2006093022A1; EP1880726A1; TW200642692A; KR20130020737A; CA2599909A1; EP1880726B1; AU2006219475A1; HK1115067A1; KR101312745B1; TWI359668B; CN101171019B; KR20070110115A; AU2006219475B2; JP4974881B2; EP1880726A4; AU2006219475B8; CA2599909C; CN101171019A

Abstract

　ヒト成人の糞便より独自に分離したLactobacillus属乳酸菌から、（１）胃酸・胆汁酸耐性が高く、（２）マウス由来脾臓細胞からのIL-12産生促進活性およびTh1/Th2バランス改善効果が高く、（３）BALB/cマウスに卵白アルブミンを腹腔内投与することで誘導される抗原特異的IgE産生の阻害能が高く、（４）C57BL/6Nマウスに食物抗原を経口的に投与することで誘導される抗原特異的IgE産生の阻害能が高く、（５）ナチュラルキラー細胞の活性化能が高く、（６）卵白アルブミンで免疫したマウス由来の脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞に対するIL-12産生促進活性およびTh1/Th2バランス改善効果が高く、（７）スギ花粉抽出抗原で誘発される好酸球増多の抑制能が高い菌株から選抜されたプロバイオティクス乳酸菌を見出し、本発明を完成した。

Description

免疫機能調整剤

技術分野

[oooi] 本発明は、アレルギー予防および Zまたは治療剤、またはこれらを含有するアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物に関する。

背景技術

[0002] 気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患はここ数十年で急激な増加が認められ、現在、少なくとも人口のおよそ 1/5程度が何らかのァレルギ一疾患に罹患して、ると考えられて、る。現在のアレルギー治療薬の多くは対症療法的なものであり、罹患患者数の増大や長期使用に伴う副作用の点からも、より効果的な治療法が望まれて、る (非特許文献 1)。

[0003] 乳酸菌は好ま、香味物質を産生すると共に乳酸やバクテリオシン等の抗菌性物質産生能を有して、ることから、古来より発酵乳等を介して世界各地で食されてきたため極めて安全性の高い微生物である。近年、二重盲検プラセボ試験において乳酸歯の一種で ¾>る Lactobacillus rnamnosus uG^ (Lactobacillus rhamnosus ATCC ΐ>ό 103株）の投与がハイリスク児におけるアトピー疾患の発症を約半分に抑制することが示されており（非特許文献 2)、乳酸菌の使用は副作用を伴わずアレルギーを予防および Ζまたは治療するための手軽で有効な方法と言える。

[0004] これまでに各種の乳酸菌を用いたアレルギー予防および Ζまたは治療剤が提案されている。しかしながら、例えば特許文献 1に開示された乳酸菌（Lactobacillus plant arum CCRC 12944株、 Lactobacillus acidophilus CCRC 14079株）については、乳酸菌株の選定に際して培養細胞からのインターフェロン- γ産生能を評価して、るものの、実際に動物が摂取した場合のアレルギー予防および Ζまたは治療効果は検討されていない。また、プロノくィォテイクスは安全性の問題力もヒトから単離されたものが望ましいとされるが (非特許文献 3)、特許文献 2および特許文献 3に記載された乳酸菌（ラタトコッカスラクテイスサブスピーシーズラクテイス G50株、 Lactobacillus par acasei KW3110株）については、乳酸菌株の選定に際して菌株がヒト由来のラタトバチルス属乳酸菌であることが考慮されてヽなヽ。特許文献 2および特許文献 4に記載された乳酸菌（ラタトコッカスラクテイスサブスピーシーズラクテイス G50株、ラクトバチルス'ァシドフィラス CP 1613株、ラクトバチルス ·ァシドフィラス L 92株、ラタトバチルス'フアーメンタム CP 34株）については、乳酸菌株の選定に際して、プロバイオティタスとしての特性である、胃内の低 pH下での環境や腸管内の胆汁酸に耐性を有するという特性が考慮されていない (特許文献 2、特許文献 4)。また、特許文献 3に開示された乳酸菌（Lactobacillus paracasei KW3110株）は、抗原をマウス腹腔内に投与することで誘導された全身性免疫における抗原特異的 IgE抗体の産生を指標として選抜されている（特許文献 3)。しかし食物アレルギーに対する治療効果は、全身性免疫における抗体産生を指標としたのでは適切に評価できな、と考えられる。経口的に摂取される食物は、腸管によって吸収されると同時に、腸管付属リンパ組織 (gutas sociated lymphatic tissue; GALT)と呼ばれる、全身性免疫系とは異なる腸管独自の免疫系によって認識され、通常であれば、経口免疫寛容を誘導する力一方で、 IgE 抗体産生を誘導して、食物アレルギーを発症させる場合もある。本来免疫寛容を誘導するはずの食物が、食物アレルギーを誘発する発症機構は未だ十分に解明されて!、な、が、少なくとも腸管免疫系と全身性免疫系との双方が食物アレルギー発症に絡んで!/ヽると考えられ、全身性免疫系を使用してアレルギー予防効果を評価した場合、食物アレルギーに対する治療効果が反映されているとは考えにくい。

このように既存の乳酸菌では、目的とするアレルギー予防および Zまたは治療剤、またはアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を調製するには未だ改良の余地が多く残されて、るのが現状である。

特許文献 1：特開 2004-91491号公報

特許文献 2：特開 2004-18469号公報

特許文献 3：特許第 3585487号公報

特許文献 4：特開 2004-26729号公報

非特許文献 1 :赤星光輝，玉利真由美，白川太郎、「アレルギー疾患における最近の話題」、最新医学、 58(2)、 pp.7- 14(2003)

非特干文献 2： Kalliomaki M, balminen ¾, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P, Isolaun E.ゝ「Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo- contr oiled trial. J , Lancet, 357(9262)、 pp.1076- 1079 (2001)

非特許文献 3 : Naidu AS, Bidlack WR, Clemens RA、「Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB).」、 Critical Reviews in Food science and Nutritionゝ 39(1)、 pp.13— 126 (1999)

非特許文献 4 :伊勢渉、「食物アレルギー制御研究の進展腸管免疫系における食品アレルゲンの認識」、農林水産技術研究ジャーナル、 24(5), pp.9-14 (2001) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] すなわち、本発明が解決しょうとする課題は、食物アレルギーを始めとする抗アレルギー活性を有し、かつ投与後の生残性の高いヒト腸内由来乳酸菌を選抜し、該乳酸菌および Zまたは該乳酸菌の処理物を用いたアレルギー予防および Zまたは治療剤、またはこれを含有するアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を提供することである。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、目的とするアレルギー予防および Zまたは治療剤に用いる乳酸菌を選抜するに際し、次のような基準を新たに設定し、鋭意選定作業を行った。具体的には、本発明者らは、ヒト成人の糞便より独自に分離した Lactobacillus属乳酸菌 273菌株から、（1)胃酸 •胆汁酸耐性が高ぐ（2)マウス由来の脾臓細胞に対する IL-12産生促進活性および Thl/Th2バランス改善効果が高ぐ（3) BALB/cマウスに卵白アルブミンを腹腔内投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果が高ぐ（4) C57BL/6Nマウスに食物抗原 (カゼイン)を経口的に投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果が高ぐ（5)ナチュラルキラー細胞の活性ィ匕能が高ぐ（6)卵白アルブミンで免疫したマウス由来の脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞に対する IL-12産生促進活性および Thl/Th2バランス改善効果が高ぐ（7)スギ花粉抽出抗原で誘発される好酸球増多の抑制能が高、菌株の選定にっ、て鋭意研究を重ねた結果、これら条件に合致するプロバイオテイクス乳酸菌としてラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株（ Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号： NITE BP- 72)を見出し、本発明を完成した。

[0008] 前記（1)に記載の効果は、投与後の生残性に関与するものである。この効果を有するラクトバチルス'ガセリ OLL2809菌株（受託番号： NITE BP-72)は、アレルギー予防および Zまたは治療剤中に生菌として投与した場合、腸管腔での生残性が高ヽものとして期待できる。また、前記（2)〜（7)に記載の効果は、生体において Thl応答の増強または Th2応答の抑制に関与するものである。アレルギー疾患は、ヘルパー T 細胞の Thlと Th2のバランス崩壊が原因の一つと考えられて!/、る。上記（2)〜（7)の効果を有する本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤、またはアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物は Th2側に傾いた Thl/Th2バランスを総合的に改善し、免疫機能を調整する上で有用である。よって、本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、用いるラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株 (受託番号： NITE BP-72)が死菌体であってもアレルギー予防および Zまたは治療効果を奏し、さらに生菌として投与した場合は腸内細菌叢改善効果等の相乗効果が期待できるものである。特に前記 (4)に記載の効果は、食物アレルギーモデルを用いて評価したものであり、本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は食物アレルギーに対し治療効果が高いと期待できる。

[0009] すなわち、本発明は

[1]ラクトバチルス 'ガセリ（Lactobacillus gasseri)を有効成分とするアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[2]ラクトバチルス ·ガセリの処理物であって、当該乳酸菌の培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破碎物から選ばれる少なくとも 1つである乳酸菌処理物を有効成分とするアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[3]アレルギー予防および Zまたは治療が抗原特異的 IgE産生抑制によるものである上記 [1]〜[2]のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[4]アレルギー予防および Zまたは治療が IL-12産生促進および Thl/Th2バランス改善によるものである上記 [1]〜[2]のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Z または治療剤、

[5]アレルギー予防および Zまたは治療がナチュラルキラー細胞活性ィ匕によるものである上記 [1]〜[2]のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[6]アレルギー予防および Zまたは治療が好酸球の増多抑制によるものである上記 [ 1]〜[2]のいずれ力 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[7]アレルギー予防および Zまたは治療が抗原特異的 IgE産生抑制、 IL-12産生促進および Thl/Th2バランス改善、ナチュラルキラー細胞活性化、好酸球の増多抑制の少なくとも 1つによるものである上記 [1]〜[2]のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[8]ラクトバチルス.ガセリカ、受託番号 NITE BP-72で寄託されている、ラクトバチルス

•ガセリ OLL2809菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809)である、上記 [1]〜[7]のいずれ力 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤、

[9]上記 [1]〜[8]のいずれ力 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤の有効量を含有せしめたアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物、

[10]乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または発酵乳である上記 [8]記載のアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物、

[11]アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を製造するための上記 [1]〜

[8]のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤の使用、

[12]アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物が、乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または発酵乳である上記 11記載の使用、

[13]ラクトバチルス ·ガゼリまたはその処理物を投与することを特徴とする、アレルギ一予防および Zまたは治療方法、

[14]ラクトバチルス ·ガゼリまたはその培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破砕物から選ばれる少なくとも 1つである処理物を用いることを特徴とする、アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物の製造方法、 [15]受託番号 NITE BP-72で寄託されている、ラクトバチルス'ガセリ OLL2809菌株 (Lactobacillus gassen OLL2809)、

[16]受託番号 NITE BP-72で寄託されている、ラクトバチルス'ガセリ OLL2809菌株の処理物であって、当該乳酸菌の培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破砕物から選ばれる少なくとも 1つである乳酸菌処理物、

[17]上記 [15]記載のラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株または上記 [16]記載の乳酸菌処理物を含む、食品組成物または飲料、

[18]上記 [15]記載のラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株または上記 [16]記載の乳酸菌処理物を含む薬剤、

を提供するものである。

発明の効果

[ooio] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、後述する実施例において確認されるとおり低 pH環境および胆汁酸に耐性を有し、 IL- 12産生促進活性、 Thl/Th2バランス改善効果、血清中の食物抗原特異的 IgE産生阻害能、ナチュラルキラー細胞の活性ィ匕能および好酸球増多の抑制能を有することから、食物アレルギーを始めとする各種のアレルギーの予防および Zまたは治療に有効な、新たなアレルギー予防および Zまたは治療剤、またはこれを含有するアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を提供することが可能になった。

図面の簡単な説明

[0011] [図 l]BALB/c- OVA腹腔内投与アレルギーモデルへの胃酸耐性 ·胆汁酸耐性 Lacto bacillus属乳酸菌の経口投与による IgE抑制効果。対照群 (コントロール）、被検菌体投与群、比較対照群（L. crispatus JCM

L. plantarum JCM 1149^T、 L. gasseri JCM 1131^T)における抗 OVA特異的 IgE抗体濃度 (AU)の平均値士標準偏差 (n=10) を示す。 p〈0.05(vs.コントロール、 Fisherの PLSDテスト)。

[図 2]胃酸耐性 ·胆汁酸耐性 Lactobacillus属乳酸菌がマウス脾臓細胞のナチュラルキラー活性に与える影響。コントロール、被検菌体投与、陽性対照（L. rhamnosus ATC C 53103)における脾細胞の細胞障害活性率 (％)の平均値士標準偏差 (n=4)を示す。 *： p〈0.05(vs. L. gasseri OLL2809、 Dunnetの多重比較検定)。

[図 3]Lactobacillus属乳酸菌を経口投与した BALB/c-OVA腹腔内投与アレルギーモデルマウスカ調製した脾細胞および腸間膜リンパ節細胞のサイト力イン産生。コントロール (対照)群、比較対照群 (L. crispatus JCM 1185T)、および被検菌体投与群（ L. gasseri OLL2809, L. gasseri MEP170413)における各サイト力インの平均値士標準偏差（n=10)を示す。 * : p〈0.05 (vs.コントロール、 Fisherの PLSDテスト)。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0013] 本発明は、乳酸菌を有効成分として含有するアレルギー予防および Zまたは治療剤を提供する。本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、乳酸菌として Lac tobacillus gasseriを含有する。アレルギー予防 Zまたは治療効果を有する限り、 Lact obacillus gasseriであればいずれも使用することができる力体内投与後の生残性の高い種類が好ましい。本発明に使用可能な Lactobacillus gasseriの具体例として、 La ctobacillus gasseri OLL2809菌株を挙げることができる。今回、ヒト成人の糞便より独自に分離した Lactobacillus属乳酸菌 273菌株から、（1)胃酸'胆汁酸耐性試験、 (2) マウス由来の脾臓細胞に対する IL-12産生促進効果、および Thl/Th2バランス改善効果評価試験、 (3) BALB/cマウスに卵白アルブミンを腹腔内投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果評価試験、（4) C57BL/6Nマウスに食物抗原 (カゼイン)を経口的に投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果評価試験、 (5)ナチュラルキラー細胞の活性化能評価試験、 (6)卵白アルブミンで免疫したマウス由来の脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞に対する IL-12産生促進効果評価試験および Thl/Th2バランス改善効果評価試験、 (7)スギ花粉で誘発される好酸球増多抑制能評価試験を用いて検討し、いずれの項目においても高い活性を示すことを特徴とするアレルギー予防および Zまたは治療効果を有する乳酸菌としてラタトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号： NITE BP- 7 2、以降し gasseri OLL2809ともいう）を選抜した。したがって、該乳酸菌を使用することで食物アレルギーを含めた各種のアレルギーの予防および Zまたは治療に有効な、新たなアレルギー予防および Zまたは治療剤、またはこれを含有するアレルギー予防および zまたは治療用食品糸且成物を提供することが可能になった。

[0014] 本発明者らは、この菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。

[0015] 本発明者らは、 Lactobacillus gasseri OLL2809株を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。

(1)寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター

(2)連絡先： τ 292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2_5-8

電話番号 0438- 20- 5580

(3)受託番号： NITE BP-72

(4)識別のための表示： Lactobacillus gasseri OLL2809

(5)原寄託日：平成 17年 (2005年） 2月 1日

(6)ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：2006年 1月 18日

[0016] Lactobacillus gasseri OLL2809株（受託番号： NITE BP-72)は、グラム陽性桿菌であり、 Lactobacilli MRS Agar, Difco上でのコロニー形態は円形、淡黄色、扁平状である。生理学的特徴としては、ホモ乳酸発酵形式、 45°Cでの発育性、グルコース、マンノース、フノレクトース、ガラクトース、シュクロース、セロビオース、ラタトース、トレノヽロースに対する発酵性を有する。

[0017] Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)を培養するための培地としては乳酸菌の培地に通常用いられる培地が使用される。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能である。炭素源としてはラタトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉カロ水分解物、廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤として肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が用いられる。

[0018] 培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよい。嫌気培養には炭素ガス気層下で培養する方法などの公知の手法を適用することができる力他の方法でも力まわない。培養温度は一般に 30 〜40°Cが好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養中の培地の pHは 6.0〜7.0に維持することが好ましいが、菌が生育する温度であれば他の pH条件でもよい。また、ノツチ培養条件下で培養することもできる。培養時間は通常 10〜24時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。

[0019] 本発明に使用可能なその他の Lactobacillus gasseriも、グラム陽性桿菌である点や、その他の生理学的特徴について、 Lactobacillus gasseri OLL2809と同様の特徴を示す。このような Lactobacillus gasseriは、当業者であればヒト糞便等から生理学的特徴に基づいて分離することができる。アレルギー予防 Zまたは治療効果は、 IL-12産生促進効果、および Thl/Th2バランス改善効果評価試験、抗原特異的 IgE産生抑制効果評価試験 (抗原腹腔内投与、経口投与)ナチュラルキラー細胞の活性化能評価試験、好酸球増多の抑制能評価試験実施例によって確認することができ、具体的には実施例に示す方法によって確認できる。また、体内投与後の生残性は、胃酸'胆汁酸耐性試験によって確認でき、具体的には実施例記載の方法によって確認可能である。培養も、 Lactobacillus gasseri OLL2809について上述したのと同様の方法によつて可能である。

[0020] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、上記 Lactobacillus gasseiを種々の状態で含むことができ、例えば乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物 (菌体、培養上清液 (培地成分を含む)）、乳酸菌発酵物 (乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等)、等の状態で含むことができる。

[0021] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、上記 Lactobacillus gasseriをそのまま含んでもよく、または、 Lactobacillus gasseriに何らかの処理を施した乳酸菌処理物として含んでもよ!、。本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤に用いられる乳酸菌処理物としては、例えば乳酸菌、乳酸菌含有物、発酵乳の濃縮物、ベースト化物、乾燥物 (噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物力選ばれる少なくともひとつ）、液状物、希釈物、破砕物等が挙げられる。また、乳酸菌としては生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。殺菌すなわち加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、または破砕処理等を施した死菌体であってもよい。粉ミルクなど生物学的規格を有する医薬品および Zまたは飲食品においても添加することも可能であり、医薬品および Zまたは飲食品の形態などによらず様々な医薬品および Zまたは飲食品に応用できる。

本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、単独、または医薬品や食品に通常使用されうる他の成分と混合して経口投与したり、他の抗アレルギー活性を有する化合物や微生物等と併用することにより、ヒトおよび動物におけるアレルギー予防、およびアレルギー症状の軽減 (治療）に有効である。アレルギー予防および zまたは治療に使用できる。アトピー性皮膚炎やアレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患は

、 Thl/Th2バランスが Th2側に偏っていることが原因の 1つであることが明らかになつ TV、o (Hopkin, J. M. 2002. The rise of atopy ana links to infection. Allergy 57:5-9.

Prescott, S. L., C. Macaubas, T. Smallacombe, B. J. Holt, P. D. Sly, and P. G. Ho It. 1999. Development of allergen-specific T— cell memory in atopic and normal child ren. Lancet 353: 196—200. Shirakawa, T., T. Enomoto, S. Shimizu, and J. M. Hopki n. 1997. The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder. Science 275:77-79.)。本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、アレルギ一モデル動物力得た細胞において、（1)榭状細胞力産生され、 Thlヘルパー細胞への分化をする働きのある、 IL-12の産生を高め、（2) Th2サイト力イン（IL-4)の産生を抑制する効果があるため、 Th2側に偏った Thl/Th2バランスを Thl側に修正する効果が期待できる。また、 NK細胞は Thlサイト力イン (IL-2)および IL-12によって活性化される性質を有するが、本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、 NK細胞の活性化作用を有することが示されており、この点力もも、 Thl/Th2バランス改善効果が実証されている。さらに、本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、好酸球増多抑制効果がある点からも、アレルギー予防および Zまたは治療に効果があることを説明できる。好酸球は、 I型アレルギーで炎症細胞の一つとして増加する白血球であり、寄生虫感染でも増加することが知られている。好酸球が高値を示す疾患としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、外来蛋白に対する過敏症、寄生虫感染症、突発性肺好酸球増加症候群等が知られている（Howanitz JH、 Howanitz PJ 編著者、河野均也監訳、「L aboratory Medicine臨床検査の選択と解釈」、医歯薬出版、 pp.583(1995))。また、 I 型アレルギーでは IgE産生も高まるため、好酸球増多や IgE産生を抑制する効果のある本発明品は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、外来蛋白に対する過敏症、アナフィラキシー反応等の症状を軽減する効果が期待できる。本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤を適用可能なアレルギーの種類、症状、疾患は特に限定されないが、例えば、 I型〜 IV型アレルギー、食物アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、アナフィラキシー反応、薬物ァレルギ一、じんましん、血清病、溶血性貧血、接触性皮膚炎、重症筋無力症、グッドパスチェア症候群、糸球体腎炎等を挙げることができる。アレルゲンも特に限定されないが、例えば食品（小麦、大麦、オーツ麦、ライ麦、そば、卵、乳、チーズ、落花生、米、トウモロコシ、ァヮ、キビ、ヒェ、大豆、じやがいも、やまいも、にんにく、たまねぎ、ニンジン、パセリ、セロリ、トマト、オレンジ、もも、りんご、キウイフルーツ、メロン、イチゴ、バナナ、くるみ、ゴマ、まつたけ、あわび、いか、いくら、えび、力に、さけ、さば、ァジ、イワシ、タラ、イカ、タコ、ホタテ、牛肉、鶏肉、豚肉、ゼラチン等）、動物 (ィヌ、ネコ、マウス、ラット、ハト等やその皮膚、体毛、糞、羽毛等)、昆虫 (蛾、蝶、、ュスリカ、スズメバチなど、およびこれら昆虫の分泌物、鱗粉）、ダニ、寄生虫（ァ -サキス、回虫など）、草木 (スギ、ヒノキ、ブタクサ、イネ科植物、ョモギ、ウルシ、ハンノキ等やこれら草木の花粉、榭液等)、かび、ほこり、ノヽウスダスト、ゴム、金属、化学物質、医薬品、等を挙げることができる。

[0023] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤としては培養終了後の乳酸菌培養液をそのまま、あるいは濃縮して濃縮物とするほか、濃縮物をさらに乾燥して使用できる。この菌体濃度は特に限定されないが、濃縮液で 4 X 10^1Q個/ g以上、乾燥物で 5 X 10¹¹個 Zg以上とするのが好まし、。

[0024] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤の医薬品または飲食品への配合量は形態、剤型、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、 0.001〜100 %(w/w)の含量で配合することができ、好ましくは 0.01 〜100%(w/w)、さらに好ましくは 0.1〜100%(w/w)の含量で配合することができる。

[0025] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤の医薬品または飲食品の一日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されない力あえて挙げるなら、 0.1〜10000mg/kg体重を摂取することができ、好ましくは 0.1〜 1000mg/kg体重を摂取することができる。

[0026] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤は、医薬品または飲食品、ずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、または特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種のアレルギーの予防および Zまたは治療をすることが期待される。また、各種飲食品（牛乳、加工乳、乳飲料、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、アイスクリーム、キャンディ、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に添加し、これを摂取してちょい。

本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤を含有する飲食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を混合して使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエー粉、ホエータンパク質、ホエータンパク質濃縮物、ホエータンパク質分離物、ひ一カゼイン、 β—カゼイン、 κ—カゼイン、 β—ラクトグロブリン、 _α一ラクトアルブミン、ラタトフヱリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物;バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエー、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖類、加工澱粉 (テキストリンのほか、可溶性澱粉、プリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等)、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂;パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミン Α、カロチン類、ビタミン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン5、ビタミン K群、ビタミン P、ビタミン Q、ナイァシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビォチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシゥム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クェン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤を含有する飲食品の製造において、これらの成分は、合成品であっても、天然由来品のいずれでもよぐおよび

/またはこれらを多く含む食品を原材料として用いてもよい。またこれらの成分は、 2 種以上を組み合わせて使用することができる。

[0027] 本発明のアレルギー予防 Zまたは治療剤を食品組成物や薬剤の製造に使用する場合、製造方法は当業者に周知の方法によって行うことができる。当業者であれば、本発明の Lactobacillus gasseri菌体または処理物を他の成分と混合する工程、成形工程、殺菌工程、発酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程等を適宜組み合わせ、所望の食品や薬剤を作ることが可能である。

[0028] また本発明の Lactobacillus gasseriを各種乳製品の製造に使用する場合も、当業者に周知の方法で所望の乳製品を製造できる。ヨーグルトの場合の一例を示せば、本発明の Lactobacillus gasseriを用いてスターターを調製する工程、該スターターを前処理した牛乳に加えて培養する工程、冷却工程、フレーバーリング工程、充填工程、等を経てヨーグルトを製造できる。チーズであれば、例えば、殺菌等の前処理をした牛乳に本発明の Lactobacillus gasseriをスターターとして添カ卩して乳酸発酵させるェ程、レンネットを添加してチーズカードを生成する工程、カード切断工程、ホエー排出工程、加塩工程、熟成工程などを経て製造可能である。あるいは、前記各種乳製品の製造において、本発明の Lactobacillus gasseriにおきかえて他の乳酸菌をスターターとして用い、製造工程中に本発明の Lactobacillus gasseri菌体または処理物を添カロしてちょい。

[0029] 本発明のアレルギー予防および Zまたは治療剤を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野にぉ、て通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0030] 以下、本発明を実施例を挙げて説明する力本発明はこれらにより限定されるものではない。

[0031] [実施例 1] (胃酸耐性試験および胆汁酸耐性試験）

ヒトの糞便から単離した Lactobacillus属乳酸菌 273菌株を試験に供した。

1)胃酸耐性試験

試験に供する乳酸菌菌体を生理食塩水で 2回洗浄し、乳酸菌懸濁液 lmlを、ろ過滅菌した人工胃液 [NaCl (0.2%)、ペプシン（1:5000、東京化成工業） (0.35%)] (pH 2 ) 9mlに添加した。 37°Cで 2時間、好気的に培養した後、この乳酸菌を含む人工胃液から lmlを取り、リン酸緩衝液 (67mM、 pH 6.5) 9mlに添カ卩して反応を停止させた。人ェ胃液に接触前および接触後の生菌数を Lactobacilli MRS Agar (DIFCO)を用いて計測し、生残率 (%)を算出して胃酸耐性 (%)とした。

2)胆汁酸耐性試験

Lactobacilli MRS Brothで 2回賦活培養（37°C、 18時間）した乳酸菌を、 0.9%の Bacto -Oxgall (DIFCO)を含む Lactobacilli MRS Broth5mlに 10 μ 1接種し、 37°Cで嫌気的に培養した。培養 18時間後に培地の波長 650nmの濁度 (OD650)を測定し、その値を胆汁酸耐性の指標とした。

[0032] 胃酸耐性試験および胆汁酸耐性試験の結果を表 1に示す。 273株の Lactobacillus 属乳酸菌の胃酸耐性および胆汁酸耐性を調べた結果、胃酸耐性が高!ヽ菌株は胆汁酸耐性が低ぐ胆汁酸耐性が高い菌株は胃酸耐性が低い傾向が認められ、菌種別にみると胃酸耐性は Lactobacillus gasseri (以降、 L. gasseriともいう）が高ぐ胆汁酸而ォ性は Lactobacillus plantarum (以降、 L. plantarumともいう）が高かった。胆汁酸而ォ性は多くの菌株カ^.0以下であった。胆汁酸耐性が高い菌株として、 L. plantarumを 6 株、 Lactobacillus cnspatus (以降、 L. cnspatusともヽっを 2株、 Lactobacillus amylovo rus (以降、 L. amylovorusと ¾ ヽっリを 2株、 Lactobacillus casei (以降、 L. caseiと ¾ ヽつ) を 1株および Lactobacillus brevis (以降、 L. brevisともいう）を 1株選択した。また、胃酸耐性は多くの菌株が 0.5%以下であった。胃酸耐性が高い（0.5%以上）菌株のうち、胆汁酸耐性の比較的高い（0.1以上）菌株として L. gasseriを 8株選択した。

[0033] [表 1] 胃酸耐性 (％)胆汁酸耐性 (OD650)

L. plantarum EP170401 0.14 9.31

L. plantarum MEP170402 0.15 10.79

L plantarum MEP170403 0.02 8.7

L. plantarum EP170404 0.03 6.55

L plantarum MEP170405 0.03 4.42

L plantarum MEP170406 0.39 7.45

L. gasseri EP170407 22.41 0.13

L. gasseri EP170408 24.91 0.12

L. gasseri EP170409 (OLL2809) 0.86 0.31

L. gasseri MEP170410 2.10 0.24

L. gasseri EP17041 1 20.78 0.45

L gasseri MEP170412 0.80 0.43

L. gasseri EP170413 6.21 0.12

L gasseri EP170414 0.53 0.14

L crispatus MEP170 15 0.12 1.76

L. crispatus MEP170416 0.12 3.69

L. amylovorus MEP170417 0.06 2.71

L. amylovorus EP170418 0.04 2.49

L. brevis EP170419 0.00 1.48

L. casei EP170420 0.00 1.31

[0034] 表 1は、選抜された Lactobacillus属乳酸菌 20菌株の胃酸耐性（％) '胆汁酸耐性 (〇 D650)の結果を示す。

[0035] [実施例 2] (凍結乾燥乳酸菌体の調製）

実施例 1で選択した 20株の Lactobacillus属乳酸菌について、 Lactobacilli MRS Bro thで 2回、賦活培養 (37°C、 18時間）した。同培地に賦活化した菌体を 1%接種し、 37°C で 18時間培養した。集菌後、生理食塩水で 2回、滅菌蒸留水で 1回洗浄した。 75°Cで 60分間加熱して滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌末は以下の in vitroでの実験や動物投与試験に用いた。

[0036] [実施例 3] (マウス由来脾臓細胞からの IL- 12産生促進効果、および Thl/Th2バランス改善効果評価試験）

実施例 1で選択した胃酸耐性 ·胆汁酸耐性 Lactobacillus属乳酸菌 20菌株を以下の方法で評価した。

[0037] 6週齢の雄性、 BALB/cマウス（n=4、日本エスエルシー）に 20 gの卵白アルブミン（以降、 OVAともヽぅ：和光純薬工業)と 2mgの水酸ィ匕アルミニウム (和光純薬工業)を腹腔内投与し、その 8日後に脾臓を摘出した。赤血球を除去した脾細胞を、実施例 2により調製した 1 μ g/mlの乳酸菌加熱処理菌体と 100 μ g/mlの OVAを含む 10% FCS— R PMI 1640培地（ギブコ社）に 2.5 x 10⁶/mlとなるように懸濁し 5%COインキュベーター

2

で 6日間培養した。比較対照として、 Lactobacillus属乳酸菌の標準株（L. plantarum J CM 1149^T、 L. gasseri JCM 1131 '、 L. crispatus JCM 1185^T、 L. amylovorus JCM 112 6^T)、および他の菌の標準株（Bifidobacterium bifidum JCM 1255^T (以降、 B. bifidum J CM 1255^Tともいう）、 Bifidobacterium longum JCM 1217^T (以降、 B. bifidum longum JC M 1217^Tともいう）、 Lactococcus delbrueckii subsp. lactis JCM 1248^T (以降、 L. delbru eckii subsp. lactis JCM 1248^Tともいう)、 Enterococcus faecalis IFO 3971 (以降、 E. fa ecalis IFO 3971ともいう）、 Bacteroides vulgatus JCM 5826^T (以降、 B. vulgatus JCM 5 826^Tともいう）、 Eschericia coli JCM 1649^T (以降、 E. coli JCM 1649^Tともいう））を用いた。上記菌株のうち、菌株名に JCMと記載された菌株は独立行政法人理ィ匕学研究所ノィオリソースセンターの微生物材料開発室力も入手した基準株、菌株名に IFOと記載された菌株は、財団法人発酵研究所力も入手した基準株、菌株名に MEPと記載された菌株は明治乳業株式会社保有菌株である。また、微生物を添加しない点を除いては上記と同様に調製したものをコントロールとした。。培養液上清の IFN- γ、 IL-12 および IL- 4を ELISA法（BD OptEIATM ELISA set,ベタトンディッキンソン）により測定した。 Studentの t検定により対照群に対する有意差を 5%の危険率で検定した。結果を表 2に示す。

[0038] [表 2] IL-12 (pg/ ml) IFN- r (ng/ml) IL-4 (pg/r nl)

SD Average SD Average SD コントロール 0 0 0.4 0.2 265 75

L. plantarum JCM 1 149^T 39 26 10.6 * 3.4 102 * 53

L. plantarum MEP1 70401 4907 * 1 160 30.4 * 7.0 34 * 1 1

L plantarum EP1 70402 4723 * 971 26.9 * 10.4 35 * 6

L plantarum MEP170403 4602 * 869 20.5 * 4.5 36 * 1 1

L. plantarum EP 1 70404 4748 * 950 25.5 * 9.3 38 * 9

L. plantarum MEP 1 70405 4966 * 965 24.4 * 4.0 15 * 1 1

L plantarum MEP 1 70406 3407 * 602 27.8 * 7.3 27 * 9

L gassen JCM 1 131 ^T 3721 1338 28.0 * 5.2 43 * 14

L. gasseri MEP170407 4521 * 1 101 27.5 * 5.8 35 * 4

L. gasseri EP1 70408 1213 * 405 19.5 * 6.3 64 * 20

L gasseri MEP1 70409 (OLL2809) 2990 617 19.8 * 6.5 61 * 19

L. gasseri MEP1 70410 3039 * 627 30.9 * 3.6 35 * 9

L. gasseri MEP17041 1 1667 * 285 29.7 * 6.8 46 * 14

L gasseri MEP170412 43 77 7.8 * 1.1 140 31

L gasseri MEP170413 3662 * 582 24.8 * 3.0 40 * 12

L gasseri MEP1 70414 557 147 18.7 * 5.4 49 * 15

L crispatus JCM 1 185^T 41 47 2.7 * 0.7 169 43

L crispatus MEP170415 0 0 0.8 0.5 176 62

L. crispatus MEP170416 0 0 1.6 0.4 216 80

L amylovorus JCM 1 126^T 742 * 292 31.0 * 6.8 22 * 6

L. amylovorus MEP1 7041 7 0 0 5.6 * 1.2 259 156

L. amylovorus MEP1 70418 0 0 4.7 * 2.4 196 57

L. brevis EP1 70419 0 0 2.0 1.1 224 57

L casei MEP 1 70420 0 0 4.0 * 1.7 181 81

B. bi idum JCM 1255^T 0 0 0.2 0.2 200 69

B. longum JCM 121 7^T 0 0 1.8 * 0.7 362 * 1 10

L delbrueckii subsp. lactis JCM 1248^T 1032 * 234 17.1 * 2.4 34 * 16

E. faecalis IFO 3971 4816 * 1324 31.1 * 7.4 47 * 29

B. vulgatus JCM 5826^T 43 50 1.8 * 0.7 235 60

E. coli JCM 1649^T 225 * 120 18.0 * 1.6 46 * 21

： < 0.05 (対コントロール、 Student's t-test)

[0039] 表 2は、実施例 1で選抜された Lactobacillus属乳酸菌 20菌株が脾細胞のサイトカイン (IL-12、 IFN- γ、 IL-4)産生に与える影響を示す。各測定値の平均値士標準偏差を示す。 *： P〈0.05(vs.コントローノレ、 Student's t— test)。

[0040] L. plantarumや L. gasseriなどを中心に、 30株中 13株が IL- 12の産生を有意に（_P<0.

05)強く促進した。しかし、その IL-12誘導活性は同菌種でも強レ、ものと全くないものもあり、菌種によらず菌株特異的であった。また、 IFN— γおよび IL- 4は、 IL-12産生量との間にそれぞれ、正の相関（n=31, r=0.8047, p〈0.01)および負の相関（n=31, r=- 0. 6544, pく 0.01)が認められた。すなわち、 IL-12産生を強く誘導する菌株は、 IFN- γの産生促進効果および IL-4の産生抑制効果も高ぐ Thl/Th2バランスを改善した。以上の結果から、 L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NI TE BP- 72) )を含む L. gasseriや L. plantarum等に属す特定の株は、強い IL- 12産生促進活性と Thl/Th2バランス改善効果を有することが分力つた。

[0041] このようにして、 IL- 12産生促進活性と Thl/Th2バランス改善効果の高!、L. plantaru m MEP170402, L. gasseri MEP170407、 L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP- 72) )、 L. gasseri MEP170413の 4菌株を選択した。

[0042] [実施例 4] (BALB/cマウスに卵白アルブミンを腹腔内投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果評価試験）

実施例 3で選択した Lactobacillus属乳酸菌 4菌株を以下の方法で評価した。

[0043] 6週齢の雄性 BALB/cマウス（各群 n=10、日本エスエルシー）に 0.2 μ g/g-body mass の OVA (和光純薬工業)と 0.1mg/g-body massの水酸ィ匕アルミニウム（和光純薬工業）を腹腔内投与した (一次免疫)。 2週間後に同様の条件で OVAと水酸ィ匕アルミニウムを二次免疫した。一次免疫から二次免疫の 1週間後までの 21日間、マウスに実施例 2 により調製した種々の乳酸菌凍結乾燥粉末を 0.1%含む MF飼料 (オリエンタル酵母ェ業)を自由摂取させた。乳酸菌は、実施例 3の結果で IL-12誘導活性の低力つた L. cr ispatus JCM

L. plantarum JCM 1149^Tと IL- 12誘導活性の高かった L. gasseri JCM 1131^Tを乳酸菌の比較対照とし、 L. plantarum MEP170402, L. gasseri MEP170 407、 L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP- 72 ))、 L. gasseri MEP170413の抗 OVA特異的 IgE産生抑制効果を検討した。コントロールは MF飼料のみとした。二次免疫から 1週間後に採血を行い、血清中の抗 OVA特異的 IgE抗体濃度を ELISA法により測定した。抗 OVA特異的 IgE抗体濃度は、 6週齢の雄性 BALB/cマウス（日本エスエルシー）に 20 μ gの OVAと 2mgの水酸化アルミ-ゥムを 2週間の間隔で 2回腹腔内投与し、その 1週間後の血清中に含まれる抗 OVA特異的 IgE濃度を 10,000AUと定義した。抗 OVA特異的 IgE濃度の測定は Itoらの方法 (It 0, K., K. Inagaki— Ohara, b. Murosaki, H. Nishimura, T. Shimokata, S. Torn, T. Mat suda, and Y. Yoshikai、 Murine model of IgE production with a predominant Th2— res ponse by feeding protein antigen without adjuvants.、 Eur. J. Immunol. 27:3427-3437 ( 1997).)を改変し、ビォチン化ラット抗マウス IgEモノクローナル抗体（BD biosciences )およびストレプトアビジンホースラディッシュペルォキシダーゼ（BD biosciences) を用いて検出した。結果は一元配置分散分析を行い、さらに Fisherの PLSDテストにより 5%の危険率で多重検定を行った。結果を図 1に示す。

[0044] コントロールと比較して、 L. crispatus JCM 1185^τおよび L. plantarum JCM 1149^τに差は認められなかった。 in vitroで高い IL-12誘導効果を示した L. plantarum MEP170 402もコントロールとの差は認められなかった。試験を行った株の中で Lactobacillus g asseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株が最も抗 OVA特異的 IgE産生抑制作用が強ぐコントロールと比較して有意な（p〈0.05)低下が認められた。また、 L. gasseri J CM 1131^Tおよび L. gasseri MEP170407では抗原特異的 IgE誘導を抑制する傾向を示した（それぞれ p=0.072, p=0.064) o in vivoにおいては L. plantarumは IgE産生抑制効果を示さず、概して L. gasseriの効果が高かった。以上から、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株に強、抗 OVA特異的 IgE産生抑制効果があることが明らかになった。

[0045] [実施例 5] (C57BL/6Nマウスに食物抗原を経口的に投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生抑制効果評価試験）

[0046] 3週齢の雌性、 C57BL/6Nマウス（コントロール n=20、被検菌体投与群 n=10、日本クレア）に、実施例 2により調製した種々の乳酸菌凍結乾燥粉末を 0.1%添加した表 3に示す組成の飼料を 2週間自由摂取させた (被検菌体投与群)。コントロールには表 3 に示す組成の飼料を与えた。その後 7週間は、全ての群に MF飼料 (オリエンタル酵母)を与えた。さらに、被検菌体投与群には実施例 2により調製した種々の乳酸菌凍結乾燥粉末を 0.1%添加した表 3に示す組成の飼料を、対照群には表 3に示す組成の飼料を 2週間自由摂取させた。飼育終了後、全採血を行い、それぞれのマウスの血清を用いてラット皮内急性アナフィラキシー反応（以降、 PCA (passive cutaneous anap hylaxis)反応ともいう）試験を行い、抗カゼイン特異的 IgEの陽性率をコントロール、被検菌体投与群の間で比較した。

[0047] [表 3] 原料配合量（重量％)

カゼイン（ARACID、 NZMP社） 22.0%

ショ糖 5.0%

コンスターチ 60.3%

セルロース粉末 3.0%

大豆油 5.0%

AIN-76ビタミンミックス 1.0%

A1N-76ミネラルミックス 3.5%

重酒石酸コリン 0.2%

計 100.0%

[0048] 表 3に記載の AIN- 76ビタミンミックスおよび AIN-76ミネラルミックスは、米国国立栄養研究所 (AIN)から 1977年に発表された、マウスやラットにおける栄養研究用の標準精製飼料である AIN-76に配合されているビタミンミックスおよびミネラルミックスを指す

[0049] [PCA反応による IgE産生抑制効果の判定]

PCA反応は 7週齢の雄性、 SDラット（日本 SLC)の背部を除毛し、皮内にマウスの血清を 25 1ずつ注射した。マウスの血清の皮内注射より 24時間後、カゼインを 2mg/ml とエバンスブルー（和光純薬工業)を 1%含む溶液 0.5mlをラットの尾静脈に注射した。さらにカゼイン、エバンスブルーの静脈注射カゝら 30分後に、背部皮下のエバンスブル一色素の漏出の有無を目視判定し、色素漏出が認められたものを PCA反応陽性とした。各群中の PCA反応陽性数を求め、対照群と被検菌体投与群の PCA反応陽性数をカイ二乗検定により危険率 5%で有意差検定を行った。結果を表 4に示す。

[0050] [表 4]

[0051] 表 4は、実施例 1で選抜された Lactobacillus属乳酸菌 20菌株の経口投与が食物ァレルギ一マウスの IgE産生に与える影響を示す。 PCA反応陽性数/試験匹数を示す。 *： p〈0.05(vs.コントロール、カイ二乗検定)。

[0052] 対照群では 20匹中 18匹で陽性となった。一方、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株投与群およびし amylovorus MEP170417では陽性数が 10匹中 5匹と有意 (p〈0.05)に抑制された。その他の菌株では顕著な効果は認められなかつた o

[0053] 以上から、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP- 72)株はカゼインの経口投与で惹起する食物アレルギーモデルマウスへの経口投与にお！/、て他の菌株に比べ抗原特異的な IgE産生抑制効果が高いことが示された。

[0054] [実施例 6]けチュラルキラー細胞の活性ィ匕能評価試験）実施例 1で選択した胃酸耐性 ·胆汁酸耐性 Lactobacillus属乳酸菌 20菌株を以下の方法で評価した。

[0055] 10週齢の雌性、 BALB/cマウス（日本エスエルシー）カゝら脾臓細胞を採取した。標的細胞として、 YAC-1細胞株 (ナチュラルキラー細胞に高!ヽ感受性を示す細胞株）を用いた。 YAC-1細胞の蛍光標識として、 1 X 10⁶個/ mlの細胞に Calcein (Dojindo社）を最終濃度 20 /z Mで添カ卩して 1時間静置した後、洗浄した。 96ゥエルプレートにて 1ゥエル当たり脾細胞を液量 100 μ 1で 5 X 10⁵個、および実施例 2により調製した種々の乳酸菌凍結乾燥粉末を液量 50 μ 1で 0.20 μ g (最終濃度 1.3 μ g/ml)を添加して一晩培養した。その後、上述の蛍光標識した YAC-1細胞を液量 1で 1 X 10⁴個（脾細胞: YAC -1細胞 = 50 : 1の比率)加えて 3時間培養した。コントロールのゥヱルは、脾細胞に乳酸菌凍結乾燥粉末を添加せずに同様の操作を行った。また、陽性対照として L. rha mnosus ATCC 53103株（Lactobacillus rhamnosus GG株）を用いた。培養後、上清中の蛍光強度（Excitation : 485 nm、 Emission : 535 nm)を測定し、この値を Test測定値とした。さらに、脾細胞あるいは YAC-1細胞単独で培養したときの培養上清中の蛍光強度をそれぞれ脾細胞 Spontaneous測定値、 YAC-1 Spontaneous測定値とした。また、 YAC-1細胞のみを培養後、 Triton X100 (和光純薬工業)を加えて細胞を破壊したときの蛍光強度を Total測定値とした。これらの値を以下の式にあてはめて細胞傷害活性を計算した。統計処理は Dunnetの多重比較検定を行い、 5%の危険率で Lactoba cillus gasseri OLL2809 (受託番号： MTE BP-72)株に対する有意差検定を行った。結果を図 2に示す。

[0056] [数 1]

細胞傷害活性 (%)

_X100

[0057] 上記式中、 Testは Test測定値、 Totalは Total測定値、 Sは脾細胞 Spontaneous測定値、 Yは YAC- 1 Spontaneous測定値を示す。

[0058] 検討した 20菌株のうち、特に L. plantarumまたは L. gasseriに属する菌株を添カ卩した場合において細胞障害活性が高くなつた。また、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株を添加した検体は陽性対照の検体に対して有意に (pく 0.05 )高ヽ細胞傷害活性を示した。

[0059] 以上から、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP- 72)株は脾細胞を用いた系にお、て、ナチュラルキラー細胞活性ィ匕能が高、ことが示された。

[0060] 以上から、 (1)胃酸'胆汁酸耐性試験、（2)マウス由来脾臓細胞からの IL-12産生促進効果、および Thl/Th2バランス改善効果評価試験、（3) BALB/cマウスに卵白ァルブミンを腹腔内投与することで誘導される抗原特異的 IgEの抑制評価試験、（4) C5 7BL/6Nマウスに食物抗原を経口的に投与することで誘導される抗原特異的 IgE産生の阻害能評価試験、 (5)ナチュラルキラー細胞の活性化能評価試験の!/、ずれにおいても高い活性を示す乳酸菌として Lactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株が見出された。

[0061] [実施例 7] (OVAを腹腔内投与した BALB/cマウスを用いた脾細胞および腸間膜リンパ節細胞の Thl/Th2バランス改善効果評価試験）

実施例 3で選択した Lactobacillus属乳酸菌 2菌株を以下の方法で評価した。

[0062] 6週齢の雄性 BALB/cマウス（各群 n=10、日本エスエルシー）に 0.2 μ g/g- body mass の OVA (和光純薬工業)と O.lmg/g-body massの水酸ィ匕アルミニウム（和光純薬工業）を腹腔内投与した (一次免疫)。 2週間後に同様の条件で OVAと水酸ィ匕アルミニウムを二次免疫した。一次免疫から二次免疫の 1週間後までの 21日間、マウスに実施例 2 により調製した種々の乳酸菌凍結乾燥粉末を 0.1%含む MF飼料 (オリエンタル酵母ェ業)を自由摂取させた。二次免疫から 1週間後の各群のマウスカも脾細胞および腸間膜リンパ節細胞を調製した。脾細胞は赤血球を除去した後に 2.5x10 ゥエルの濃度で 24ゥエルプレートに、腸間膜リンパ節細胞は 1.25xl0⁶/ゥエルの濃度で 48ゥエルプレートに播種した。各細胞を 100 g/mlの OVAを含む 10% FCS-RPMI1640培地（ギブコ社、 1 ml/ゥエル）で 2日間または 6日間、 5%濃度の COインキュベーターで 37°Cで培

2

養した。それぞれ、 2日間の培養液上清中の IL-12 (p70)を、 6日間の培養液上清中の IFN- γおよび IL- 4濃度を ELISA法（BD OptEIATM ELISA set,ベタトンディッキンソン)で測定した。結果は一元配置分散分析を行い 5%の危険率で有意と認められた場合、さらに Fisherの PLSDテストにより 5%の危険率で多重検定を行った。乳酸菌は、実施例 3の結果で選択したし gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72 ) , L. gasseri MEP170413,および比較対照として IL- 12誘導活性の低かった L. crispa tus JCM 1185^Tを用いた。コントロールは MF飼料のみを摂取させた。結果を図 3に示す。

[0063] 脾細胞からの IL-12 (ρ70)産生はし gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株投与群において、コントロールと比較して有意な (pく 0.05)増加が認められた。また、 L . gasseri OLL2809 (受託番号: NITE BP-72)株投与群における脾細胞および腸間膜リンパ節細胞力の IL-4産生量もコントロールと比較して有意な (pく 0.05)減少が認められた。

L. gasseri MEP170413では脾細胞からの IL-12 (p70)産生量に有意な（p〈0.05)増加が認められた力 IL-4産生は脾細胞および腸間膜リンパ節細胞のどちらにぉ、ても影響は認められなかった。 L. crispatus JCM 1185^Tでは、これらの細胞のサイトカイン産生に変化は認められなかった。以上から、 L. gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株は、 OVAを腹腔内投与した BALB/cマウスに経口投与した場合、脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞の Thl/Th2バランスを改善する効果があることが見出された。

[0064] [実施例 8] (スギ花粉抽出抗原誘発好酸球増多モデルを用いた好酸球増多抑制効果評価試験）

[0065] 7週齢の雌性 BALB/cマウス（n=9または 10Z群、日本エスエルシー）にスギ花粉抽出抗原液 (0.4 g/mlの Cry j 1を含む）を 0.2 ml/bodyずつ、実験開始力ら 0, 1, 6, 8, 14日目に背部皮下に投与し、抗原感作を行った。 20日目に同様の方法で Cry j 1を投与して好酸球の増多を誘発した。陰性対照群は感作を行わず、誘発のみを行った。各群に水（対照）または実施例 2により調製したし gasseri OLL2809 (受託番号: NIT E BP-72)株を種々の用量 (0.5、 1.0、 2.0mg)で実験開始力 21日間毎日、強制胃内投与した。群構成は以下に示す。 21日目に腹腔内に 1%の FCSを含むリン酸緩衝生理食塩水を 5 mL注入し、腹腔細胞を採取した。腹腔細胞の総細胞濃度を自動血球計数装置（F-800、シスメッタス社)で測定後、集細胞遠心装置（Cytospin 3、 Shandong )を用いて腹腔細胞塗沫標本を作製した。腹腔細胞をへマカラー迅速染色キット (メルク社)で染色を行い、顕微鏡で好酸球数を計測した。好酸球抑制率は以下の式により求めた。

[0066] [数 2]

好酸球抑制率（％) _

I (各群の好酸球数一陰性対照群の好酸球数）

(対照群の好酸球数陰性対照群の好酸球数）

[0067] 感作誘発 OLL2809投与量（ mg/b o d y /d a y ) 対照群 0 (水のみ）

陰性対照群 0 (水のみ）

0. 5 mg群

1 . 0 mg群

2. 0 mg群

[0068] 対照群においてスギ花粉抽出抗原で感作 ·誘発させることで、陰性対照群と比較して腹腔回収液中の総細胞濃度、好酸球濃度および好酸球比率 (好酸球数 Z総細胞数）は有意に (p〈0.01)増加した。 L. gasseri OLL2809 (受託番号： NITE BP-72)株を投与した群ではどの投与量においても対照群と比較して好酸球比率は有意に (Pく 0.05 または 0.01)抑制された。また、全ての感作 '誘発を行った群で腹腔回収液の総細胞濃度に有意な差は認められな力つた力 2.0 mg投与群のみにおいて対照群と比較して好酸球濃度は有意な低値を示し (Pく 0.05)、好酸球の増多は約 44%と有意に (pく 0.0 5)抑制された。

以上の結果から、 OLL2809株は好酸球増多モデルマウスへの経口投与で、好酸球の増多を抑制する事が明らかとなった。

[0069] [表 6] 群総細胞濃度好酸球濃度好酸球比率好酸球抑制率

( ) < 10⁵ ee l l/ml) ( X 10^δ eel l/ml) (%) (%) 対照群 16.7 + 2. 1 4.30±0.70 25.5土 1.6 0.0+17.0 陰性対照群 8.5 + 1.2 0. 18±0.05 1.9士 0.3 100.0士 1.2

0.5 mg群 18.7 + 2. 1 3.29±0.54 17.2±2.0" 24.7土 13.2

1.0 mg群 19.4+1.6 3.35 + 0.35 17.6± 1.9* 23.2土 8.5

2.0 mg群 15.8±1.7 2.48±0.35* 16.2± 1.6** 44.3土 8.6* 平均値士標準誤差.対照群のみ n=9、その他は n=10. *, **: p<0.05, 0.01 (vs対照群、 Dunnettの多重比較検定).細胞濃度は腹腔回収液中の濃度を示す。

産業上の利用可能性

本発明により新たなアレルギー予防および Zまたは治療剤が提供された。該アレルギー予防および Zまたは治療剤は乳児用調製粉乳、保健機能食品、または病者用食品にその有効量を添加することによりアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を提供する。

Claims

請求の範囲

[1] ラクトバチルス ·ガセリ（Lactobacillus gasseri)を有効成分とするアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[2] ラクトバチルス ·ガセリの処理物であって、当該乳酸菌の培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破碎物から選ばれる少なくとも 1つである乳酸菌処理物を有効成分とするアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[3] アレルギー予防および Zまたは治療が抗原特異的 IgE産生抑制によるものである請求項 1〜2のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[4] アレルギー予防および Zまたは治療が IL-12産生促進および Thl/Th2バランス改善によるものである請求項 1〜2のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[5] アレルギー予防および Zまたは治療がナチュラルキラー細胞活性ィ匕によるものである請求項 1〜2のいずれ力 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[6] アレルギー予防および Zまたは治療が好酸球の増多抑制によるものである請求項 1

〜2のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[7] アレルギー予防および Zまたは治療が抗原特異的 IgE産生抑制、 IL-12産生促進および Thl/Th2バランス改善、ナチュラルキラー細胞活性化、好酸球の増多抑制の少なくとも 1つによるものである請求項 1〜2のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[8] ラクトバチルス'ガセリカ、受託番号 NITE BP-72で寄託されている、ラクトバチルス' ガセリ OLL2809菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809)である、請求項 1〜7のいずれカ 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤。

[9] 請求項 1〜8の、ずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤の有効量を含有せしめたアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物。

[10] 乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または発酵乳である請求項 8記載のアレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物。

[11] アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物を製造するための請求項 1〜8 のいずれか 1項に記載のアレルギー予防および Zまたは治療剤の使用。

[12] アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物が、乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または発酵乳である請求項 11記載の使用。

[13] ラクトバチルス ·ガゼリまたはその処理物を投与することを特徴とする、アレルギー予防および Zまたは治療方法。

[14] ラクトバチルス ·ガゼリまたはその培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破砕物から選ばれる少なくとも 1つである処理物を用いることを特徴とする、アレルギー予防および Zまたは治療用食品組成物の製造方法。

[15] 受託番号 NITE BP-72で寄託されて!、る、ラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株（La ctobacillus gasseri uLL2809)。

[16] 受託番号 NITE BP-72で寄託されて!、る、ラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株の処理物であって、当該乳酸菌の培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破砕物から選ばれる少なくとも 1つである乳酸菌処理物。

[17] 請求項 15記載のラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株または請求項 16記載の乳酸菌処理物を含む、食品組成物または飲料。

[18] 請求項 15記載のラクトバチルス ·ガセリ OLL2809菌株または請求項 16記載の乳酸菌処理物を含む薬剤。