KR20130020737A

KR20130020737A - 면역기능 조정제

Info

Publication number: KR20130020737A
Application number: KR1020137003716A
Authority: KR
Inventors: 도시히로 사시하라; 마코토 야마구치; 요시타카 나카무라; 슈지 이케가미; 세이코 나루시마; 가쯔노리 기무라; 신야 나가후치; 마사키 데라하라
Original assignee: 가부시키가이샤 메이지
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2013-02-27
Also published as: CN101171019A; HK1115067A1; US20090269321A1; AU2006219475B8; AU2006219475A1; CN101171019B; KR101260533B1; KR20070110115A; TW200642692A; CA2599909A1; EP1880726B1; EP1880726A1; AU2006219475B2; KR101312745B1; JP4974881B2; EP1880726A4; WO2006093022A1; CA2599909C; TWI359668B; US9314041B2

Abstract

인간 성인의 분변으로부터 독자적으로 분리한 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로부터, (1) 위산·담즙산 내성이 높고, (2) 마우스 유래 비장세포로부터의 IL-12 생산 촉진활성 및 Th1/Th2 균형 개선효과가 높으며, (3) BALB/c 마우스에 난백알부민을 복강 내 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산의 저해능이 높고, (4) C57BL/6N 마우스에 음식물 항원을 경구적으로 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산의 저해능이 높으며, (5) NK세포의 활성화능이 높고, (6) 난백알부민으로 면역된 마우스 유래의 비장세포 및 장간막 림프절세포에 대한 IL-12 생산 촉진활성 및 Th1/Th2 균형 개선효과가 높으며, (7) 삼목 화분 추출 항원으로 유발되는 호산구증다의 억제능이 높은 균주로부터 선발된 프로바이오틱스 유산균을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

Description

면역기능 조정제{Immune function modulating agents}

본 발명은 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 이들을 함유하는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물에 관한 것이다.

기관지천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등의 알레르기 질환은 최근 수십년에 급격한 증가가 인정되어, 현재 적어도 인구의 약 1/5정도가 어떠한 알레르기 질환을 앓고 있는 것으로 생각되고 있다. 현재의 알레르기 치료제의 대부분은 대증요법적인 것으로, 앓고 있는 환자수의 증대나 장기사용에 수반하는 부작용의 측면으로부터도, 보다 효과적인 치료법이 요망되고 있다(비특허문헌 1).

유산균은 바람직한 향미물질을 생산하는 동시에 젖산이나 박테리오신 등의 항균성 물질 생산능을 가지고 있는 점으로부터, 예로부터 발효유 등을 통해 세계 각지에서 먹어왔으므로 극히 안전성이 높은 미생물이다. 최근, 이중 맹검 플라시보 시험에 있어서 유산균의 1종인 락토바실러스 람노서스 GG주(Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103주)의 투여가 고위험아에 있어서의 아토피 질환 발증을 약 절반으로 억제하는 것이 나타나 있어(비특허문헌 2), 유산균의 사용은 부작용을 수반하지 않고 알레르기를 예방 및/또는 치료하기 위한 손쉽고 유효한 방법이라고 할 수 있다.

지금까지 각종 유산균을 사용한 알레르기 예방 및/또는 치료제가 제안되고 있다. 그러나, 예를 들면 특허문헌 1에 개시된 유산균(Lactobacillus plantarum CCRC 12944주, Lactobacillus acidophilus CCRC 14079주)에 대해서는, 유산균주의 선정시에 배양세포로부터의 인터페론-γ 생산능을 평가하고 있으나, 실제로 동물이 섭취한 경우의 알레르기 예방 및/또는 치료효과는 검토되고 있지 않다. 또한, 프로바이오틱스는 안전성의 문제로부터 인간으로부터 단리된 것이 바람직한 것으로 여겨지고 있으나(비특허문헌 3), 특허문헌 2 및 특허문헌 3 기재의 유산균(락토코커스 락티스 서브스피시즈 락티스 G50주, Lactobacillus paracasei KW 3110주)에 대해서는, 유산균주의 선정시에 균주가 인간 유래의 락토바실러스속 유산균인 것이 고려되고 있지 않다. 특허문헌 2 및 특허문헌 4 기재의 유산균(락코코커스 락티스 서브스피시즈 락티스 G50주, 락토바실러스 아시도필루스 CP 1613주, 락토바실러스 아시도필루스 L 92주, 락토바실러스 퍼멘텀 CP 34주)에 대해서는, 유산균주의 선정시에 프로바이오틱스로서의 특성인, 위 내의 저 pH하에서의 환경이나 장관 내의 담즙산에 내성을 가진다고 하는 특성이 고려되고 있지 않다(특허문헌 2, 특허문헌 4). 또한, 특허문헌 3에 개시된 유산균(Lactobacillus paracasei KW 3110주)은, 항원을 마우스 복강 내에 투여하는 것으로 유도된 전신성 면역에 있어서의 항원특이적 IgE 항체의 생산을 지표로서 선발되고 있다(특허문헌 3). 그러나 음식물 알레르기에 대한 치료효과는, 전신성 면역에 있어서의 항체 생산을 지표로 한 것으로는 적절하게 평가할 수 없을 것으로 생각된다. 경구적으로 섭취되는 음식물은, 장관에 의해 흡수되는 동시에, 장관 부속 림프조직(gutassociated lymphatic tissue; GALT)이라고 불리는, 전신성 면역계와는 상이한 장관 독자의 면역계에 의해 인식되어, 통상의 경우, 경구면역관용을 유도하나, 한편으로, IgE 항체생산을 유도하여, 음식물 알레르기를 발증시키는 경우도 있다. 본래 면역관용을 유도해야 하는 음식물이 음식물 알레르기를 유발하는 발증 메커니즘은 아직 충분하게 해명되고 있지 않으나, 적어도 장관 면역계와 전신성 면역계의 쌍방이 음식물 알레르기 발증에 얽혀있는 것으로 생각되어, 전신성 면역계를 사용하여 알레르기 예방효과를 평가한 경우, 음식물 알레르기에 대한 치료효과가 반영되어 있다고는 생각하기 어렵다.

이와 같이 기존의 유산균으로는, 목적으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 조제하기에는 아직 개량의 여지가 많이 남겨져 있는 것이 현재 상황이다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 제2004-91491호 공보

특허문헌 2: 일본국 특허공개 제2004-18469호 공보

특허문헌 3: 일본국 특허 제3585487호 공보

특허문헌 4: 일본국 특허공개 제2004-26729호 공보

비특허문헌 1: 아카호시 미츠테루, 다마리 마유미, 시로카와 다로, 「알레르기 질환에 있어서의 최근의 화제」, 최신의학, 58(2), pp.7-14(2003)

비특허문헌 2: Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P, Isolauri E., 「Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial.」, Lancet, 357(9262), pp.1076-1079(2001)

비특허문헌 3: Naidu AS, Bidlack WR, Clemens RA, 「Probiotic spectra of lactic acid bacteria(LAB).」, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 39(1), pp.13-126(1999)

비특허문헌 4: 이세 와타루, 「음식물 알레르기 제어 연구의 진전; 장관 면역계에 있어서의 식품 알레르겐의 인식」, 농림수산 기술연구 저널, 24(5), pp.9-14(2001)

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

즉, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 음식물 알레르기를 비롯한 항알레르기 활성을 가지면서, 또한 투여 후의 생잔성이 높은 인간의 장 내 유래 유산균을 선발하고, 상기 유산균 및/또는 상기 유산균의 처리물을 사용한 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 이들을 함유하는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은 상기한 과제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 본 발명자들은 목적으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료제에 사용하는 유산균의 선발시에, 다음과 같은 기준을 새롭게 설정하고, 예의 선정작업을 행하였다. 구체적으로는, 본 발명자들은 인간 성인의 분변으로부터 독자적으로 분리한 Lactobacillus속 유산균 273균주로부터, (1) 위산·담즙산 내성이 높고, (2) 마우스 유래의 비장세포에 대한 IL-12 생산 촉진활성 및 Th1/Th2 균형 개선효과가 높으며, (3) BALB/c 마우스에 난백알부민을 복강 내 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과가 높고, (4) C57BL/6N 마우스에 음식물 항원(카제인)을 경구적으로 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과가 높으며, (5) 자연살세포(natural killer cell, NK세포)의 활성화능이 높고, (6) 난백알부민으로 면역된 마우스 유래의 비장세포 및 장간막 림프절세포에 대한 IL-12 생산 촉진활성 및 Th1/Th2 균형 개선효과가 높으며, (7) 삼목 화분 추출 항원으로 유발되는 호산구증다의 억제능이 높은 균주의 선정에 대해서 예의 연구를 거듭한 결과, 이들 조건에 합치하는 프로바이오틱스 유산균으로서 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(Lactobacillus gasseri OLL2809, 수탁번호: NITE BP-72)를 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

상기 (1) 기재의 효과는 투여 후의 생잔성에 관여하는 것이다. 이 효과를 가지는 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(수탁번호: NITE BP-72)는, 알레르기 예방 및/또는 치료제 속에 생균으로서 투여한 경우, 장관강에서의 생잔성이 높은 것으로서 기대할 수 있다. 또한, 상기 (2)~(7) 기재의 효과는, 생체에 있어서 Th1 응답의 증강 또는 Th2 응답의 억제에 관여하는 것이다. 알레르기 질환은 헬퍼 T세포의 Th1과 Th2의 균형 붕괴가 원인의 하나라고 생각되고 있다. 상기 (2)~(7)의 효과를 가지는 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물은 Th2측으로 기운 Th1/Th2 균형을 종합적으로 개선하고, 면역기능을 조정하는데 있어서 유용하다. 따라서, 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는, 사용하는 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(수탁번호: NITE BP-72)가 사균체여도 알레르기 예방 및/또는 치료효과를 나타내고, 더욱이 생균으로서 투여한 경우는 장내 세균총 개선효과 등의 상승효과를 기대할 수 있는 것이다. 특히 상기 (4) 기재의 효과는, 음식물 알레르기 모델을 사용하여 평가한 것이므로, 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 음식물 알레르기에 대한 치료효과가 높은 것으로 기대할 수 있다.

즉, 본 발명은

[1] 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 유효성분으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[2] 락토바실러스 가세리의 처리물로서, 해당 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물, 파쇄물로부터 선택되는 1개 이상인 유산균 처리물을 유효성분으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료가 항원특이적 IgE 생산 억제에 의한 것인 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[4] [1] 또는 [2]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료가 IL-12 생산 촉진 및 Th1/Th2 균형 개선에 의한 것인 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[5] [1] 또는 [2]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료가 NK세포 활성화에 의한 것인 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[6] [1] 또는 [2]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료가 호산구의 증다 억제에 의한 것인 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[7] [1] 또는 [2]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료가 항원특이적 IgE 생산 억제, IL-12 생산 촉진 및 Th1/Th2 균형 개선, NK세포 활성화, 호산구의 증다 억제의 1개 이상에 의한 것인 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 락토바실러스 가세리가 수탁번호 NITE BP-72로 기탁되어 있는 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(Lactobacillus gasseri OLL2809)인, 알레르기 예방 및/또는 치료제,

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 알레르기 예방 및/또는 치료제의 유효량을 함유시킨 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물,

[10] [9]에 있어서, 유아(乳兒)용 조제분유, 유아(幼兒)용 분유 등 식품, 수유부용 분유 등 식품, 보건기능 식품, 병자용 식품, 또는 발효유인 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물,

[11] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 제조하기 위한 알레르기 예방 및/또는 치료제의 사용,

[12] [11]에 있어서, 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물이, 유아용 조제분유, 유아용 분유 등 식품, 수유부용 분유 등 식품, 보건기능 식품, 병자용 식품, 또는 발효유인 사용,

[13] 락토바실러스 가세리 또는 그의 처리물을 투여하는 것을 특징으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료방법,

[14] 락토바실러스 가세리 또는 그의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물, 파쇄물로부터 선택되는 1개 이상인 처리물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물의 제조방법,

[15] 수탁번호 NITE BP-72로 기탁되어 있는, 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(Lactobacillus gasseri OLL2809),

[16] 수탁번호 NITE BP-72로 기탁되어 있는, 락토바실러스 가세리 OLL2809균주의 처리물로서, 해당 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물, 파쇄물로부터 선택되는 1개 이상의 유산균 처리물,

[17] [15]의 락토바실러스 가세리 OLL2809균주 또는 [16]의 유산균 처리물을 포함하는, 식품 조성물 또는 음료,

[18] [15]의 락토바실러스 가세리 OLL2809균주 또는 [16]의 유산균 처리물을 포함하는 약제,

를 제공하는 것이다.

발명의 효과

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는, 후술하는 실시예에 있어서 확인되는 바와 같이 저 pH 환경 및 담즙산에 내성을 가지고, IL-12 생산 촉진활성, Th1/Th2 균형 개선효과, 혈청 속의 음식물 항원특이적 IgE 생산 저해능, NK세포의 활성화능 및 호산구증다의 억제능을 가지는 점으로부터, 음식물 알레르기를 비롯한 각종 알레르기의 예방 및/또는 치료에 유효한, 새로운 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 이것을 함유하는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이 가능하게 되었다.

도면의 간단한 설명
도 1은 BALB/c-OVA 복강 내 투여 알레르기 모델으로의 위산 내성·담즙산 Lactobacillus속 유산균의 경구투여에 의한 IgE 억제 효과. 대조군(control), 피검균체 투여군, 비교대조군(L. crispatus JCM 1185^T, L. plantarum JCM 1149^T, L. gasseri JCM 1131^T)에 있어서의 항OVA 특이적 IgE 항체농도(AU)의 평균치 ± 표준편차(n=10)를 나타낸다. p < 0.05(vs. 대조, Fisher의 PLSD 테스트).
도 2는 위산 내성·담즙산 내성 Lactobacillus속 유산균이 마우스 비장세포의 NK 활성에 주는 영향. 대조, 피검균체 투여, 양성 대조(L. rhamnosus ATCC 53103)에 있어서의 비장세포의 세포 상해 활성율(%)의 평균치 ± 표준편차(n=4)를 나타낸다. * : p < 0.05(vs. L. gasseri OLL2809, Dunnet의 다중비교검정).
도 3은 Lactobacillus속 유산균을 경구투여한 BALB/c-OVA 복강 내 투여 알레르기 모델 마우스로부터 조제한 비장세포 및 장간막 림프절세포의 사이토카인 생산. 대조군, 비교대조군(L. crispatus JCM 1185T) 및 피검균체 투여군(L. gasseri OLL2809, L. gasseri MEP170413)에 있어서의 각 사이토카인의 평균치 ± 표준편차(n=10)를 나타낸다. * : p < 0.05(vs. 대조, Fisher의 PLSD 테스트).

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 유산균을 유효성분으로서 함유하는 알레르기 예방 및/또는 치료제를 제공한다. 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 유산균으로서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 함유한다. 알레르기 예방 및/또는 치료효과를 가지는 한, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)라면 어떤 것도 사용하는 것이 가능하나, 체내 투여 후의 생잔성이 높은 종류가 바람직하다. 본 발명에 사용 가능한 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)의 구체예로서, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) OLL2809균주를 들 수 있다. 이번에 인간 성인의 분변으로부터 독자적으로 분리한 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균 273균주로부터, (1) 위산·담즙산 내성시험, (2) 마우스 유래의 비장세포에 대한 IL-12 생산 촉진효과, 및 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험, (3) BALB/c 마우스에 난백알부민을 복강 내 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과 평가시험, (4) C57BL/6N 마우스에 음식물 항원(카제인)을 경구적으로 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과 평가시험, (5) NK세포의 활성화능 평가시험, (6) 난백알부민으로 면역된 마우스 유래의 비장세포 및 장간막 림프절세포에 대한 IL-12 생산 촉진효과 평가시험 및 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험, (7) 삼목 화분으로 유발되는 호산구증다 억제능 평가시험을 사용하여 검토하고, 어느 항목에 있어서도 높은 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 알레르기 예방 및/또는 치료효과를 가지는 유산균으로서 락토바실러스 가세리 OLL2809균주(Lactobacillus gasseri OLL2809, 수탁번호: NITE BP-72, 이후 L. gasseri OLL2809라고도 한다)를 선발하였다. 따라서, 상기 유산균을 사용하는 것으로 음식물 알레르기를 포함한 각종 알레르기의 예방 및/또는 치료에 유효한, 새로운 알레르기 예방 및/또는 치료제, 또는 이것을 함유하는 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이 가능하게 되었다.

본 발명자들은 이 균주를 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터에 기탁하였다. 이하에, 기탁을 특정하는 내용을 기재한다.

본 발명자들은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) OLL2809주를 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터에 기탁하였다. 이하에, 기탁을 특정하는 내용을 기재한다.

기탁기관명 : 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터

수탁번호 : NITE BP-72

수탁일자 : 200521

연락처: 우편번호 292-0818 치바켄 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8

전화번호 0438-20-5580

식별을 위한 표시: Lactobacillus gasseri OLL2809

원기탁일: 평성17년(2005년) 2월 1일

부다페스트 조약에 기초한 기탁으로의 이관일: 2006년 1월 18일

Lactobacillus gasseri OLL2809주(수탁번호: NITE BP-72)는 그람 양성 간균(Gram-positive bacillus)이고, Lactobacilli MRS Agar, Difco 상에서의 콜로니 형태는 원형, 담황색, 편평상이다. 생리학적 특징으로서는 호모젖산 발효형식, 45℃에서의 발육성, 글루코오스, 만노오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 수크로오스, 셀로비오스, 락토오스, 트레할로오스에 대한 발효성을 가진다.

Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)를 배양하기 위한 배지로서는 유산균의 배지에 통상 사용되는 배지가 사용된다. 즉 주 탄소원 외에 질소원, 무기물 기타 영양소를 적절하게 함유하는 배지라면 어떤 배지도 사용 가능하다. 탄소원으로서는 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 전분 가수분해물, 폐당밀 등이 사용균의 자화성(資化性)에 따라서 사용할 수 있다. 질소원으로서는 카제인의 가수분해물, 유청 단백질 가수분해물, 대두 단백질 가수분해물 등의 유기질소 함유물을 사용할 수 있다. 그 외에 증식촉진제로서 고기 추출물, 어육 추출물, 효모 추출물 등이 사용된다.

배양은 혐기조건하에서 행하는 것이 바람직하나, 통상 사용되는 액체정치배양 등에 의한 미호기조건하여도 된다. 혐기배양에는 질소가스층하에서 배양하는 방법 등의 공지의 수법을 적용하는 것이 가능하나, 다른 방법이어도 개의치 않는다. 배양온도는 일반적으로 30~40℃가 바람직하나, 균이 생육하는 온도라면 다른 온도조건이어도 된다. 배양 중의 배지의 pH는 6.0~7.0으로 유지하는 것이 바람직하나, 균이 생육하는 pH라면 다른 pH 조건이어도 된다. 또한, 배치 배양조건하에서 배양하는 것도 가능하다. 배양시간은 통상 10~24시간이 바람직하나, 균이 생육하는 것이 가능한 시간이라면 다른 배양시간이어도 된다.

본 발명에 사용가능한 기타의 Lactobacillus gasseri도, 그람 양성 간균인 점이나, 기타 생리학적 특징에 대해서, Lactobacillus gasseri OLL2809와 마찬가지의 특징을 나타낸다. 이와 같은 Lactobacillus gasseri는 당업자의 경우 인간 분변 등으로부터 생리학적 특징을 토대로 분리하는 것이 가능하다. 알레르기 예방/또는 치료 효과는 IL-12 생산 촉진효과, 및 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험, 항원특이적 IgE 생산 억제효과 평가시험(항원 복강 내 투여, 경구투여) NK세포의 활성화능 평가시험, 호산구증다의 억제능 평가시험 실시예에 의해 확인하는 것이 가능하고, 구체적으로는 실시예에 나타내는 방법에 의해 확인할 수 있다. 또한, 체내 투여 후의 생잔성은, 위산·담즙산 내성시험에 의해 확인할 수 있고, 구체적으로는 실시예 기재의 방법에 의해 확인 가능하다. 배양도, Lactobacillus gasseri OLL2809에 대해서 전술한 것과 마찬가지의 방법에 의해 가능하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 상기 Lactobacillus gasseri를 각종 상태로 포함하는 것이 가능하여, 예를 들면 유산균 현탁액, 유산균 배양물(균체, 배양 상청액(배지성분을 포함한다)), 유산균 발효물(유산균음료, 산유, 요구르트 등) 등의 상태로 포함하는 것이 가능하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는, 상기 Lactobacillus gasseri를 그대로 포함해도 되고, 또는 Lactobacillus gasseri에 어떤 처리를 실시한 유산균 처리물로서 포함해도 된다. 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제에 사용되는 유산균 처리물로서는, 예를 들면 유산균, 유산균 함유물, 발효유의 농축물, 페이스트화물, 건조물(분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물로부터 선택되는 하나 이상), 액상물, 희석물, 파쇄물 등을 들 수 있다. 또한, 유산균으로서는 생균체, 습윤균, 건조균 등이 적절하게 사용 가능하다. 살균 즉 가열살균처리, 방사선살균처리, 또는 파쇄처리 등을 실시한 사균체여도 된다. 분유 등 생물학적 규격을 가지는 의약품 및/또는 음식품에 있어서도 첨가하는 것도 가능하여, 의약품 및/또는 음식품의 형태 등에 상관없이 여러 가지의 의약품 및/또는 음식품으로 응용할 수 있다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 단독, 또는 의약품이나 식품에 통상 사용될 수 있는 다른 성분과 혼합하여 경구투여하거나, 다른 항알레르기 활성을 가지는 화합물이나 미생물 등과 병용하는 것에 의해, 인간 및 동물에 있어서의 알레르기 예방 및 알레르기 증상의 경감(치료)에 유효하다. 알레르기 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 아토피성 피부염이나 알레르기성 비염 등의 알레르기 질환은 Th1/Th2 균형이 Th2측으로 기울어져 있는 것이 원인의 하나인 것이 명백하게 되어 있다(Hopkin, J. M. 2002. The rise of atopy and links to infection. Allergy 57: 5-9. Prescott, S. L., C. Macaubas, T. Smallacombe, B. J. Holt, P. D. Sly, and P. G. Holt. 1999. Development of allergen-specific T-cell memory in atopic and normal children. Lancet 353: 196-200. Shirakawa, T., T. Enomoto, S. Shimizu, and J. M. Hopkin. 1997. The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder. Science 275: 77-79.). 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는, 알레르기 모델 동물로부터 얻은 세포에 있어서, (1) 수상세포(dendritic cell)로부터 생산되어, Th1 헬퍼세포로 분화하는 작용이 있는 IL-12의 생산을 높이고, (2) Th2 사이토카인(IL-4)의 생산을 억제하는 효과가 있으므로, Th2측으로 기운 Th1/Th2 균형을 Th1측으로 수정하는 효과를 기대할 수 있다. 또한, NK세포는 Th1 사이토카인(IL-2) 및 IL-12에 의해 활성화되는 성질을 가지나, 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 NK세포의 활성화 작용을 가지는 것이 나타내어져 있어, 이 점으로부터도 Th1/Th2 균형 개선효과가 실증되고 있다. 더욱이, 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는 호산구증다 억제효과가 있는 점으로부터도 알레르기 예방 및/또는 치료에 효과가 있는 것을 설명할 수 있다. 호산구는 I형 알레르기로 염증세포의 하나로서 증가하는 백혈구로, 기생충 감염으로도 증가하는 것이 알려져 있다. 호산구가 높은 수치를 나타내는 질환으로서는, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 기관지천식, 아토피성 피부염, 음식물 알레르기, 외래 단백에 대한 과민증, 기생충 감염증, 돌발성 폐 호산구증가증후군 등이 알려져 있다(Howanitz JH, Howanitz PJ 편저자, 고우노 긴야 감역, 「Laboratory Medicine 임상검사의 선택과 해석」, 이시야쿠 출판, pp.583(1995)). 또한, I형 알레르기에서는 IgE 생산도 높아지므로, 호산구증다나 IgE 생산을 억제하는 효과가 있는 본 발명품은 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 기관지천식, 아토피성 피부염, 음식물 알레르기, 외래 단백에 대한 과민증, 아나필락시 반응(anaphylatic reaction) 등의 증상을 경감하는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제를 적용 가능한 알레르기의 종류, 증상, 질환은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 Ⅰ형~Ⅳ형 알레르기, 음식물 알레르기, 화분증, 아토피성 피부염, 기관지천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기성 위장염, 아나필락시 반응, 약물 알레르기, 두드러기, 혈청병, 용혈성 빈혈, 접촉성 피부염, 중증 근무력증, 굿패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 사구체신염 등을 들 수 있다. 알레르겐도 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 식품(소맥, 대맥, 오트밀, 호밀, 메밀, 달걀, 우유, 치즈, 땅콩, 쌀, 옥수수, 조, 수수, 피, 대두, 감자, 참마, 마늘, 양파, 당근, 파슬리, 셀러리, 토마토, 오렌지, 복숭아, 사과, 키위, 멜론, 딸기, 바나나, 호두, 깨, 송이버섯, 전복, 오징어, 연어알, 새우, 게, 연어, 고등어, 전갱이, 정어리, 대구, 오징어, 문어, 가리비, 소고기, 닭고기, 돼지고기, 젤라틴 등), 동물(개, 고양이, 마우스, 랫트, 비둘기 등이나 그의 피부, 체모, 분, 깃털 등), 곤충(나방, 나비, 모기붙이, 말벌 등, 및 이들 곤충의 분비물, 인분), 진드기, 기생충(아니사키스, 회충 등), 초목(삼목, 노송나무, 호그위드, 벼과 식물, 쑥, 옻나무, 오리나무 등이나 이들 초목의 화분, 수액 등), 곰팡이, 먼지, 집먼지, 고무, 금속, 화학물질, 의약품 등을 들 수 있다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제로서는 배양 종료 후의 유산균 배양액을 그대로, 또는 농축하여 농축물로 하는 것 외에, 농축물을 추가로 건조하여 사용할 수 있다. 이 균체 농도는 특별히 한정되지 않으나, 농축액으로 4 × 10¹⁰ 개/g 이상, 건조물로 5 × 10¹¹ 개/g 이상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제의 의약품 또는 음식품으로의 배합량은 형태, 제형, 증상, 체중, 용도 등에 따라 상이하므로 특별히 한정되지 않으나, 굳이 든다면 0.001~100%(w/w)의 함량으로 배합하는 것이 가능하고, 바람직하게는 0.01~100%(w/w), 더욱 바람직하게는 0.1~100%(w/w)의 함량으로 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제의 의약품 또는 음식품의 1일당 섭취량은 연령, 증상, 체중, 용도 등에 따라 상이하므로 특별히 한정되지 않으나, 굳이 든다면 0.1~10000 ㎎/㎏ 체중을 섭취하는 것이 가능하고, 바람직하게는 0.1~1000 ㎎/㎏ 체중을 섭취하는 것이 가능하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제는, 의약품 또는 음식품 중 어느 형태로도 이용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 의약품으로서 직접 투여하는 것에 의해, 또는 특정 보건용 식품 등의 특별용도 식품이나 영양기능 식품으로서 직접 섭취하는 것에 의해 각종 알레르기의 예방 및/또는 치료를 하는 것이 기대된다. 또한 각종 음식품(우유, 가공유, 유음료, 청량음료, 발효유, 요구르트, 치즈, 빵, 비스킷, 크래커, 피자 크러스트, 아이스크림, 사탕, 조제분유, 유동식, 병자용 식품, 유아(幼兒)용 분유 등 식품, 수유부용 분유 등 식품, 영양식품 등)에 첨가하여, 이것을 섭취해도 된다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제를 함유하는 음식품에는 물, 단백질, 당질, 지질, 비타민류, 미네랄류, 유기산, 유기염기, 과즙, 플레이버류 등을 혼합하여 사용하는 것이 가능하다. 단백질로서는, 예를 들면 전지분유, 탈지분유, 부분탈지분유, 카제인, 유청분말, 유청 단백질, 유청 단백질 농축물, 유청 단백질 분리물, α-카제인, β-카제인, κ-카제인, β-락토글로불린, α-락토알부민, 락토페린, 대두 단백질, 계란 단백질, 고기 단백질 등의 동식물성 단백질, 이들 가수분해물; 버터, 유청 미네랄, 크림, 유청, 비단백태질소, 시알산, 인지질, 젖당 등의 각종 유(乳) 유래 성분 등을 들 수 있다. 당류, 가공전분(덱스트린 외, 가용성 전분, 브리티시 스타치(British starch), 산화전분, 전분 에스테르, 전분 에테르 등), 식물 섬유 등을 들 수 있다. 지질로서는, 예를 들면 라드, 어유 등, 이들의 분별유, 수소첨가유, 에스테르 교환유 등의 동물성 유지; 팜유, 홍화유, 옥수수유, 평지씨유, 야자유, 이들의 분별유, 수소첨가유, 에스테르 교환유 등의 식품성 유지 등을 들 수 있다. 비타민류로서는, 예를 들면 비타민 A, 카로틴류, 비타민 B군, 비타민 C, 비타민 D군, 비타민 E, 비타민 K군, 비타민 P, 비타민 Q, 나이아신, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴, 이노시톨, 콜린, 엽산 등을 들 수 있다. 미네랄류로서는, 예를 들면 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 나트륨, 구리, 철, 망간, 아연, 셀렌 등을 들 수 있다. 유기산으로서는, 예를 들면 말산, 구연산, 젖산, 주석산 등을 들 수 있다. 본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제를 함유하는 음식품의 제조에 있어서, 이들의 성분은 합성품이어도, 천연 유래품이어도 되고, 및/또는 이들을 다량 포함하는 식품을 원재료로서 사용해도 된다. 또한 이들의 성분은 2종 이상을 조합하여 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제를 식품 조성물이나 약제의 제조에 사용하는 경우, 제조방법은 당업자에게 주지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 당업자의 경우, 본 발명의 Lactobacillus gasseri 균체 또는 처리물을 다른 성분과 혼합하는 공정, 성형공정, 살균공정, 발효공정, 소성공정, 건조공정, 냉각공정, 조립(造粒)공정, 포장공정 등을 적절하게 조합하여, 목적하는 식품이나 약제를 만드는 것이 가능하다.

또한 본 발명의 Lactobacillus gasseri를 각종 유제품의 제조에 사용하는 경우도, 당업자에게 주지의 방법으로 목적하는 유제품을 제조할 수 있다. 요구르트 경우의 일례를 나타내면, 본 발명의 Lactobacillus gasseri를 사용하여 스타터를 조제하는 공정, 상기 스타터를 전처리한 우유에 첨가하여 배양하는 공정, 냉각공정, 플레이버링공정, 충전공정 등을 거쳐 요구르트를 제조할 수 있다. 치즈의 경우, 예를 들면 살균 등의 전처리를 한 우유에 본 발명의 Lactobacillus gasseri를 스타터로서 첨가하여 젖산발효시키는 공정, 렌넷을 첨가하여 치즈 커드를 생성하는 공정, 커드 절단공정, 유청 배출공정, 가염공정, 숙성공정 등을 거쳐 제조 가능하다. 또는 상기 각종 유제품의 제조에 있어서, 본 발명의 Lactobacillus gasseri에 치환하여 다른 유산균을 스타터로서 사용하고, 제조공정 중에 본 발명의 Lactobacillus gasseri균체 또는 처리물을 첨가해도 된다.

본 발명의 알레르기 예방 및/또는 치료제를 의약품으로서 사용하는 경우에는 각종 형태로 투여하는 것이 가능하다. 그 형태로서는, 예를 들면 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구투여를 들 수 있다. 이들의 각종 제제는, 통상적인 방법에 따라서 주제에 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 교취제, 용해보조제, 현탁제, 코팅제 등의 의약의 제제기술분야에 있어서 통상 사용할 수 있는 기지의 보조제를 사용하여 제제화하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.

[ 실시예 ]

이하, 본 발명을 실시예를 들어 설명하나, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] (위산 내성시험 및 담즙산 내성시험)

인간의 분변으로부터 단리한 Lactobacillus속 유산균 273균주를 시험에 제공하였다.

1) 위산 내성시험

시험에 제공하는 유산균 균체를 생리식염수로 2회 세정하고, 유산균 현탁액 1 ㎖를 여과 멸균한 인공위액[NaCl(0.2%), 펩신(1 : 5000, 도쿄 화성공업)(0.35%)](pH 2)9 ㎖에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 호기적으로 배양한 후, 이 유산균을 포함하는 인공위액으로부터 1 ㎖를 취해, 인산 완충액(67 mM, pH 6.5) 9 ㎖에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 인공위액에 접촉 전 및 접촉 후의 생균수를 Lactobacilli MRS Agar(Difco)를 사용하여 계측하고, 생잔율(%)을 산출하여 위산 내성(%)으로 하였다.

2) 담즙산 내성시험

Lactobacilli MRS Broth로 2회 부활 배양(37℃, 18시간)한 유산균을, 0.9%의 Bacto-Oxgall(Difco)을 포함하는 Lactobacilli MRS Broth 5 ㎖에 10 ㎕ 접종하고, 37℃에서 혐기적으로 배양하였다. 배양 18시간 후에 배지의 파장 650 ㎚의 탁도(OD650)를 측정하고, 그 값을 담즙산 내성의 지표로 하였다.

위산 내성시험 및 담즙산 내성시험의 결과를 표 1에 나타낸다. 273주의 Lactobacillus속 유산균의 위산 내성 및 담즙산 내성을 조사한 결과, 위산 내성이 높은 균주는 담즙산 내성이 낮고, 담즙산 내성이 높은 균주는 위산 내성이 낮은 경향이 인정되고, 균종별로 보면 위산 내성은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)(이하, L. gasseri라고도 한다)가 높고, 담즙산 내성은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)(이하, L. plantarum이라고도 한다)이 높았다. 담즙산 내성은 다수의 균주가 1.0 이하였다. 담즙산 내성이 높은 균주로서, L. plantarum을 6주, 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus)(이하, L. crispatus라고도 한다)를 2주, 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus)(이하, L. amylovorus라고도 한다)를 2주, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)(이하, L. casei라고도 한다)를 1주 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(이하, L. brevis라고도 한다)를 1주 선택하였다. 또한, 위산 내성은 다수의 균주가 0.5% 이하였다. 위산 내성이 높은(0.5% 이상) 균주 중, 담즙산 내성이 비교적 높은(0.1 이상) 균주로서 L. gasseri를 8주 선택하였다.

표 1은 선발된 Lactobacillus속 유산균 20균주의 위산 내성(%)·담즙산 내성(OD650)의 결과를 나타낸다.

[실시예 2] (동결건조 유산균체의 조제)

실시예 1에서 선택한 20주의 Lactobacillus속 유산균에 대해서, Lactobacilli MRS Broth로 2회 부활 배양(37℃, 18시간)하였다. 동 배지에 부활화한 균체를 1% 접종하고, 37℃에서 18시간 배양하였다. 집균 후, 생리식염수로 2회, 멸균증류수로 1회 세정하였다. 75℃에서 60분간 가열하여 멸균하고 동결건조하였다. 동결건조균 분말은 이하의 인 비트로(in vitro)에서의 실험이나 동물투여 시험에 사용하였다.

[실시예 3] (마우스 유래 비장세포로부터의 IL-12 생산 촉진효과 및 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험)

실시예 1에서 선택한 위산 내성·담즙산 내성 Lactobacillus속 유산균 20균주를 이하의 방법으로 평가하였다.

6주령의 웅성(雄性), BALB/c 마우스(n=4, 일본 SLC)에 20 ㎍의 난백알부민(이하, OVA라고도 한다: 와코 순약공업)과 2 ㎎의 수산화알루미늄(와코 순약공업)을 복강 내 투여하고, 그 8일 후에 비장을 적출하였다. 적혈구를 제거한 비장세포를, 실시예 2에 의해 조제한 1 ㎍/㎖의 유산균 가열처리 균체와 100 ㎍/㎖의 OVA를 포함하는 10% FCS-RPMI 1640배지(기브코사)에 2.5 × 10⁶ cells/㎖가 되도록 현탁하여 5% CO₂ 인큐베이터에서 6일간 배양하였다. 비교대조로서, Lactobacillus속 유산균의 표준주(L. plantarum JCM 1149^T, L. gasseri JCM 1131^T, L. crispatus JCM 1185^T, L. amylovorus JCM 1126^T) 및 다른 균의 표준주(Bifidobacterium bifidum JCM 1255^T(이하, B. bifidum JCM 1255^T라고도 한다), Bifidobacterium longum JCM 1217^T(이하, B. longum JCM 1217^T라고도 한다), Lactococcus delbrueckii subsp. lacits JCM 1248^T(이하, L. delbrueckii subsp. lacits JCM 1248^T라고도 한다), Enterococcus faecalis IFO 3971(이하, E. faecalis IFO 3971이라고도 한다), Bacteroides vulgatus JCM 5826^T(이하, B. vulgatus JCM 5826^T라고도 한다), Escherichia coli JCM 1649^T(이하, E. coli JCM 1649^T라고도 한다))를 사용하였다. 상기 균주 중에서 균주명에 JCM이라고 기재된 균주는 독립행정법인 이학연구소 바이오리소스 센터의 미생물 재료개발실로부터 입수한 기준주, 균주명에 IFO라고 기재된 균주는 재단법인 발효연구소로부터 입수한 기준주, 균주명에 MEP라고 기재된 균주는 메이지 데어리즈 코포레이션 보유 균주이다. 또한, 미생물을 첨가하지 않는 점을 제외하고는 상기와 마찬가지로 조제한 것을 대조로 하였다. 배양액 상청의 IFN-γ, IL-12 및 IL-4를 ELISA법(BD OptEIATM ELISA set, Becton Dickinson)에 의해 측정하였다. 스튜던트(student)의 t검정에 의해 대조군에 대한 유의차를 5%의 위험률로 검정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2는 실시예 1에서 선발된 Lactobacillus속 유산균 20균주가 비장세포의 사이토카인(IL-12, IFN-γ, IL-4) 생산에 주는 영향을 나타낸다. 각 측정치의 평균치 ± 표준편차를 나타낸다. * : P < 0.05(vs. 대조, Student's t-test).

L. plantarum이나 L. gasseri 등을 중심으로, 30주 중 13주가 IL-12의 생산을 유의하게(p < 0.05) 강하게 촉진하였다. 그러나, 이 IL-12 유도활성은 같은 균종에서도 강한 것과 전혀 없는 것도 있어, 균종에 상관없이 균주 특이적이었다. 또한, IFN-γ 및 IL-4는, IL-12 생산량과의 사이에 각각, 정의 상관(n = 31, r = 0.8047, p < 0.01) 및 음의 상관(n = 31, r = -0.6544, p < 0.01)이 인정되었다. 즉, IL-12 생산을 강하게 유도하는 균주는, IFN-γ의 생산 촉진효과 및 IL-4의 생산 억제효과도 높고, Th1/Th2 균형을 개선하였다. 이상의 결과로부터, L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72))를 포함하는 L. gasseri나 L. plantarum 등에 속하는 특정의 주는, 강한 IL-12 생산 촉진활성과 Th1/Th2 균형 개선효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

이와 같이 하여, IL-12 생산 촉진활성과 Th1/Th2 균형 개선효과가 높은 L. plantarum MEP170402, L. gasseri MEP170407, L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)), L. gasseri MEP170413의 4균주를 선택하였다.

[실시예 4] (BALB/c 마우스에 난백알부민을 복강 내 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과 평가시험)

실시예 3에서 선택한 Lactobacillus속 유산균 4균주를 이하의 방법으로 평가하였다.

6주령의 웅성 BALB/c 마우스(각 군 n = 10, 일본 SLC)에 0.2 ㎍/g-body mass의 OVA(와코 순약공업)와 0.1 ㎎/g-body mass의 수산화알루미늄(와코 순약공업)을 복강 내 투여하였다(1차 면역). 2주 후에 동일한 조건으로 OVA와 수산화알루미늄을 2차 면역하였다. 1차 면역으로부터 2차 면역의 1주 후까지의 21일간, 마우스에 실시예 2에 의해 조제한 각종 유산균 동결건조분말을 0.1% 포함하는 MF 사료(오리엔탈 효모 공업)를 자유섭취시켰다. 유산균은, 실시예 3의 결과에서 IL-12 유도활성이 낮았던 L. crispatus JCM 1185^T, L. plantarum JCM 1149^T와 IL-12 유도활성이 높았던 L. gasseri JCM 1131^T를 유산균의 비교대조로 하고, L. plantarum MEP170402, L. gasseri MEP170407, L. gasseri MEP170409(Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)), L. gasseri MEP170413의 항OVA 특이적 IgE 생산 억제효과를 검토하였다. 대조는 MF 사료만으로 하였다. 2차 면역으로부터 1주간 후에 채혈을 행하고, 혈청 속의 항OVA 특이적 IgE 항체 농도를 ELISA법에 의해 측정하였다. 항OVA 특이적 IgE 항체 농도는, 6주령의 웅성 BALB/c 마우스(일본 SLC)에 20 ㎍의 OVA와 2 ㎎의 수산화알루미늄을 2주 간격으로 2회 복강 내 투여하고, 그 1주 후의 혈청 속에 포함되는 항OVA 특이적 IgE 농도를 10,000AU라고 정의하였다. 항OVA 특이적 IgE 농도의 측정은 이토 등의 방법(Ito, K., K. Inagaki-Ohara, S. Murosaki, H. Nishimura, T. Shimokata, S. Torii, T. Matsuda, and Y. Yoshikai, Murine model of IgE production with a predominant Th2-response by feeding protein antigen without adjuvants., Eur. J. Immunol. 27: 3427-3437(1997).)을 개변하고, 비오틴화 랫트 항마우스 IgE 단일클론항체(BD biosciences) 및 스트렙트아비딘-호스라디시 퍼옥시다아제(BD biosciences)를 사용하여 검출하였다. 결과는 1원 배치 분산분석을 행하고, 추가로 피셔(Fisher)의 PLSD 테스트에 의해 5%의 위험률로 다중 검정을 행하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.

대조와 비교하여, L. crispatus JCM 1185^T 및 L. plantarum JCM 1149^T에 차이는 인정되지 않았다. 인 비트로(in vitro)에서 높은 IL-12 유도효과를 나타낸 L. plantarum MEP170402도 대조와의 차이는 인정되지 않았다. 시험을 행한 주 중에서 Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주가 가장 항OVA 특이적 IgE 생산 억제작용이 강하고, 대조와 비교하여 유의한(p < 0.05) 저하가 인정되었다. 또한, L. gasseri JCM 1131^T 및 L. gasseri MEP170407에서는 항원특이적 IgE 유도를 억제하는 경향을 나타내었다(각각 p = 0.072, p = 0.064). 인 비보(in vivo)에 있어서는 L. plantarum은 IgE 생산 억제효과를 나타내지 않고, 대체로 L. gasseri의 효과가 높았다. 이상으로부터, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주에 강한 항OVA 특이적 IgE 생산 억제효과가 있는 것이 명백해졌다.

[실시예 5] (C57BL/6N 마우스에 음식물 항원을 경구적으로 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산 억제효과 평가시험)

3주령의 자성(雌性), C57BL/6N 마우스(대조 n = 20, 피검균체 투여군 n = 10, 일본 CLEA)에, 실시예 2에 의해 조제한 각종 유산균 동결건조분말을 0.1% 첨가한 표 3에 나타내는 조성의 사료를 2주간 자유섭취시켰다(피검균체 투여군). 대조에는 표 3에 나타내는 조성의 사료를 주었다. 그 후 7주간은 모든 군에 MF 사료(오리엔탈 효모)를 주었다. 추가로, 피검균체 투여군에는 실시예 2에 의해 조제한 각종 유산균 동결건조분말을 0.1% 첨가한 표 3에 나타내는 조성의 사료를, 대조군에는 표 3에 나타내는 조성의 사료를 2주간 자유섭취시켰다. 사육종료 후, 전채혈을 행하고, 각각의 마우스의 혈청을 사용하여 랫트 피내 급성 아나필락시 반응(이하, PCA(passive cutaneous anaphylaxis)반응이라고도 한다)시험을 행하고, 항카제인 특이적 IgE의 양성율을 대조, 피검균체 투여군 사이에서 비교하였다.

표 3 기재의 AIN-76 비타민 믹스 및 AIN-76 미네랄 믹스는, 미국 국립 영양연구소(AIN)로부터 1977년에 발표된, 마우스나 랫트에 있어서의 영양 연구용 표준 정제사료인 AIN-76에 배합되어 있는 비타민 믹스 및 미네랄 믹스를 가리킨다.

[PCA 반응에 의한 IgE 생산 억제효과의 판정]

PCA 반응은 7주령의 웅성, SD 랫트(일본 SLC)의 등부를 제모하고, 피내에 마우스의 혈청을 25 ㎕씩 주사하였다. 마우스의 혈청의 피내 주사로부터 24시간 후, 카제인을 2 ㎎/㎖와 에반스 블루(와코 순약공업)를 1% 포함하는 용액 0.5 ㎖를 랫트의 꼬리 정맥에 주사하였다. 추가로 카제인, 에반스 블루의 정맥주사로부터 30분 후에 등부 피하의 에반스 블루 색소 누출의 유무를 육안으로 판정하고, 색소 누출이 인정된 것을 PCA 반응 양성으로 하였다. 각 군 중의 PCA 반응 양성수를 구해, 대조군과 피검균체 투여군의 PCA 반응 양성수를 카이 제곱 검정(chi-square test)에 의해 위험률 5%로 유의차 검정을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4는 실시예 1에서 선발된 Lactobacillus속 유산균 20균주의 경구투여가 음식물 알레르기 마우스의 IgE 생산에 주는 영향을 나타낸다. PCA 반응 양성수/시험 마릿수를 나타낸다. * : p < 0.05 (vs. 대조, 카이 제곱 검정).

대조군에서는 20마리 중 18마리에서 양성으로 되었다. 한편, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주 투여군 및 L. amylovorus MEP170417에서는 양성수가 10마리 중 5마리로 유의(p < 0.05)하게 억제되었다. 기타 균주에서는 현저한 효과는 인정되지 않았다.

이상으로부터, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주는 카제인의 경구투여로 야기되는 음식물 알레르기 모델 마우스로의 경구투여에 있어서 다른 균주에 비해 항원특이적인 IgE 생산 억제효과가 높은 것이 나타났다.

[실시예 6] (NK세포의 활성화능 평가시험)

10주령의 자성, BALB/c 마우스(일본 SLC)로부터 비장세포를 채취하였다. 표적 세포로서, YAC-1 세포주(NK세포에 높은 감수성을 나타내는 세포주)를 사용하였다. YAC-1 세포의 형광표지로서, 1 × 10⁶ 개/㎖의 세포에 칼세인(Calsein)(Dojindo사)을 최종농도 20 μM로 첨가하여 1시간 정치한 후 세정하였다. 96 웰 플레이트에서 1웰당 비장세포를 액량 100 ㎕로 5 × 10⁵개, 및 실시예 2에 의해 조제한 각종 유산균 동결건조분말을 액량 50 ㎕로 0.20 ㎍(최종농도 1.3 ㎍/㎖)를 첨가하여 하룻밤 배양하였다. 그 후, 전술의 형광표지한 YAC-1 세포를 액량 50 ㎕로 1 × 10⁴개(비장세포 : YAC-1 세포 = 50 : 1의 비율) 첨가하여 3시간 배양하였다. 대조의 웰은 비장세포에 유산균 동결건조분말을 첨가하지 않고 동일한 조작을 행하였다. 또한, 양성 대조로서 L. rhamnosus ATCC 53103주(Lactobacillus rhamnosus GG주)를 사용하였다. 배양 후, 상청 중의 형광강도(Excitation: 485 ㎚, Emission: 535 ㎚)를 측정하고, 이 값을 Test 측정치로 하였다. 추가로, 비장세포 또는 YAC-1 세포 단독으로 배양한 때의 배양 상청 중의 형광강도를 각각 비장세포 Spontaneous 측정치, YAC-1 Spontaneous 측정치로 하였다. 또한, YAC-1 세포만을 배양 후, Triton × 100(와코 순약공업)을 첨가하여 세포를 파괴한 때의 형광강도를 Total 측정치로 하였다. 이들의 값을 이하의 식에 적용하여 세포 상해 활성을 계산하였다. 통계처리는 Dunnet의 다중비교검정을 행하고, 5%의 위험률로 Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주에 대한 유의차 검정을 행하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.

상기 식 중, Test는 Test 측정치, Total은 Total 측정치, S는 비장세포 Spontaneous 측정치, Y는 YAC-1 Spontaneous 측정치를 나타낸다.

검토한 20균주 중, 특히 L. plantarum 또는 L. gasseri에 속하는 균주를 첨가한 경우에 있어서 세포 상해 활성이 높아졌다. 또한, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주를 첨가한 검체는 양성 대조의 검체에 대하여 유의하게 (p < 0.05) 높은 세포 상해 활성을 나타내었다.

이상으로부터, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주는 비장세포를 사용한 계에 있어서, NK세포 활성화능이 높은 것이 나타났다.

이상으로부터, (1) 위산·담즙산 내성시험, (2) 마우스 유래 비장세포로부터의 IL-12 생산 촉진효과 및 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험, (3) BALB/c 마우스에 난백알부민을 복강 내 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE의 억제 평가시험, (4) C57BL/6N 마우스에 음식물 항원을 경구적으로 투여하는 것으로 유도되는 항원특이적 IgE 생산의 저해능 평가시험, (5) NK세포의 활성화능 평가시험의 어느 것에 있어서도 높은 활성을 나타내는 유산균으로서 Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주가 발견되었다.

[실시예 7] (OVA를 복강 내 투여한 BALB/c 마우스를 사용한 비장세포 및 장간막 림프절세포의 Th1/Th2 균형 개선효과 평가시험)

실시예 3에서 선택한 Lactobacillus속 유산균 2균주를 이하의 방법으로 평가하였다.

6주령의 웅성 BALB/c 마우스(각 군 n = 10, 일본 SLC)에 0.2 ㎍/g-body mass의 OVA(와코 순약공업)와 0.1 ㎎/g-body mass의 수산화알루미늄(와코 순약공업)을 복강 내 투여하였다(1차 면역). 2주 후에 동일한 조건에서 OVA와 수산화알루미늄을 2차 면역하였다. 1차 면역으로부터 2차 면역의 1주 후까지의 21일간, 마우스에 실시예 2에 의해 조제한 각종 유산균 동결건조분말을 0.1% 포함하는 MF 사료(오리엔탈 효모 공업)를 자유섭취시켰다. 2차 면역으로부터 1주 후의 각 군의 마우스로부터 비장세포 및 장간막 림프절세포를 조제하였다. 비장세포는 적혈구를 제거한 후에 2.5 × 10⁶cells/well의 농도로 24웰 플레이트에, 장간막 림프절세포는 1.25 × 10⁶ cells/well의 농도로 48웰 플레이트에 파종하였다. 각 세포를 100 ㎍/㎖의 OVA를 포함하는 10% FCS-RPMI1640 배지(기브코사, 1 ㎖/well)에서 2일간 또는 6일간, 5% 농도의 CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 배양하였다. 각각, 배양 후 2일째의 배양액 상청 중의 IL-12(p70)를, 배양 후 6일째의 배양액 상청 중의 IFN-γ 및 IL-4 농도를 ELISA법(BD OptEIATM ELISA set, 벡톤 디킨슨)으로 측정하였다. 결과는 1원 배치 분산분석을 행해 5%의 위험률로 유의하다고 인정된 경우, 추가로 피셔(Fisher)의 PLSD 테스트에 의해 5%의 위험률로 다중검정을 행하였다.

유산균은 실시예 3의 결과에서 선택한 Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72), Lactobacillus gasseri MEP170413 및 비교대조로서 IL-12 유도활성이 낮았던 L. crispatus JCM 1185^T를 사용하였다. 대조는 MF 사료만을 섭취시켰다. 결과를 도 3에 나타낸다.

비장세포로부터의 IL-12(p70) 생산은 Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주 투여군에 있어서, 대조와 비교하여 유의한(p < 0.05) 증가가 인정되었다. 또한, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주 투여군에 있어서의 비장세포 및 장간막 림프절세포로부터의 IL-4 생산량도 대조와 비교하여 유의한(p < 0.05) 감소가 인정되었다.

Lactobacillus gasseri MEP170413에서는 비장세포로부터의 IL-12(p70) 생산량에 유의한(p < 0.05) 증가가 인정되었지만, IL-4 생산은 비장세포 및 장간막 림프절세포의 어느 쪽에 있어서도 영향은 인정되지 않았다. L. crispatus JCM 1185^T에서는, 이들 세포의 사이토카인 생산에 변화는 인정되지 않았다. 이상으로부터, Lactobacillus gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주는, OVA를 복강 내 투여한 BALB/c 마우스에 경구투여한 경우, 비장세포 및 장간막 림프절세포의 Th1/Th2 균형을 개선하는 효과가 있는 것이 발견되었다.

[실시예 8] (삼목 화분 추출 항원유발 호산구증다 모델을 사용한 호산구증다 억제효과 평가시험)

7주령의 자성 BALB/c 마우스(n = 9 또는 10/군, 일본 SLC)에 삼목 화분 추출 항원액(0.4 ㎍/㎖의 Cry j 1을 포함한다)을 0.2 ㎖/body씩, 실험개시로부터 0, 1, 6, 8, 14일째에 등부 피하에 투여하고, 항원 감작을 행하였다. 20일째에 동일한 방법으로 삼목 화분 추출 항원액을 투여하여 호산구의 증다를 유발하였다. 음성 대조군은 감작을 행하지 않고 유발만을 행하였다. 각 군에 물(대조) 또는 실시예 2에 의해 조제한 L. gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주를 각종 용량(0.5, 1.0, 2.0 ㎎)으로 실험개시로부터 21일간 매일, 강제 위 내에 투여하였다. 군 구성은 이하에 나타낸다. 21일째에 복강 내에 1%의 FCS를 포함하는 인산 완충 생리식염수를 5 ㎖ 주입하고, 복강세포를 채취하였다. 복강세포의 총 세포 농도를 자동 혈구계수장치(F-800, Sysmex사)로 측정 후, 집세포 원심장치(cell collection centrifuge)(Cytospin 3, Shandon사)를 사용하여 복강세포 도말표본을 제작하였다. 복강세포를 헤마컬러 신속염색 키트(머크사)로 염색을 행하고, 현미경으로 호산구수를 계측하였다. 호산구 억제율은 이하의 식에 의해 구하였다.

대조군에 있어서 삼목 화분 추출 항원으로 감작·유발시키는 것으로, 음성 대조군과 비교하여 복강 회수액 중의 총 세포 농도, 호산구 농도 및 호산구 비율(호산구수/총 세포수)은 유의하게(p < 0.01) 증가하였다. L. gasseri OLL2809(수탁번호: NITE BP-72)주를 투여한 군에서는 어떤 투여량에 있어서도 대조군과 비교하여 호산구 비율은 유의하게(p < 0.05 또는 0.01) 억제되었다. 또한, 모든 감작·유발을 행한 군에서 복강 회수액의 총 세포 농도에 유의한 차는 인정되지 않았으나, 2.0 ㎎ 투여군만에 있어서 대조군과 비교하여 호산구 농도는 유의한 낮은 수치를 나타내고(p < 0.05), 호산구의 증다는 약 44%로 유의하게( p < 0.05) 억제되었다.

이상의 결과로부터, OLL2809주는 호산구증다 모델 마우스로의 경구투여로, 호산구의 증다를 억제하는 것이 명백해졌다.

평균치 ± 표준오차. 대조군만 n = 9, 기타는 n = 10. *,**: p < 0.05, 0.01(vs 대조군, Dunnett의 다중비교검정). 세포농도는 복강 회수액 중의 농도를 나타낸다.

본 발명에 의해 새로운 알레르기 방지 및/또한 치료제가 제공되었다. 상기 알레르기 예방 및/또는 치료제는 유아(乳兒)용 조제분유, 보건기능 식품, 또는 병자용 식품에 그 유효량을 첨가하는 것에 의해 알레르기 예방 및/또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.

독립행정법인제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁센터

NITEBP-72

20050201

Claims

수탁번호 NITE BP-72로 기탁되어 있는 락토바실러스 가세리 OLL2809 균주(Lactobacillus gasseri OLL2809).
수탁번호 NITE BP-72로 기탁되어 있는, 락토바실러스 가세리 OLL2809균주의 처리물로서, 해당 유산균의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물, 파쇄물로부터 선택되는 1개 이상인 유산균 처리물.
제1항의 락토바실러스 가세리 OLL2809 균주 또는 제2항의 유산균 처리물을 포함하는, 식품 조성물 또는 음료.