PT100712B

PT100712B - Processo para a preparacao de microesferas de material polimerico biodegradavel

Info

Publication number: PT100712B
Application number: PT100712A
Authority: PT
Inventors: Piero Orsolini; Frederic Heimgartner
Original assignee: Debio Rech Pharma Sa
Priority date: 1991-07-22
Filing date: 1992-07-21
Publication date: 1999-07-30
Also published as: CH683592A5; ES2037621B1; NZ243643A; AT408609B; GB2257909B; IL102590A0; AU2043692A; GR1001446B; NO922886L; ATA148992A; KR930702018A; JPH06172208A; NL194576C; GB9215480D0; AU2043792A; NO304057B1; CA2074320C; DE4223282A1; CN1054543C; CZ287585B6

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MICROESFERAS DE MATERIAL POLIMÊRICO BIODEGRADÁVEL

A presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de uma composição destinada à libertação prolongada e controlada de substâncias medicamentosas peptídicas, apresentando-se sob a forma de microesferas de material polimérico biodegradável incorporando a referida substância medicamentosa.

processo consiste em se converter primeiramente um péptido ou sal de péptido solúvel em água em um péptido, ou respectivamente um sal de péptido insolúvel em água, em se suspender depois o referido péptido, respectivamente sal de péptido, numa solução de material polimérico biodegradável, em se converter a referida suspensão numa emulsão do tipo óleo-na-água e, finalmente, em se isolar as microesferas de polímero biodegradável após transferência da emulsão óleo-na-água para um excesso de meio aquoso.

Foram propostas diversas soluções até hoje para a preparação de composições de libertação prolongada e controlada de substâncias medicamentosas, utilizadas no fabrico de implantes biodegradáveis, na microencapsulaçao ou na preparaçao de matrizes porosas biodegradáveis apresentando-se, por exemplo, sob a forma de microesferas ou micropartículas de diversas dimensões. A este propósito pode-se citar a patente de invenção europeia EP-A-0052510 para a microencapsulação mediante separação de fases de drogas hidrossolúveis e EP-A-0058481 ou norte-americana USA-A-3 976 071 para a preparação de implantes ou de matrizes porosas biodegra-

dáveis à base de polilactido ou co-polilactido-glicólido no essencial. Estas técnicas recorrem à dissolução prévia no seio de um dissolvente orgânico do polímero ou copolímero biodegradável utilizado como suporte, eventualmente à dissolução da própria substância medicamentosa.

Outras técnicas, levando igualmente à formação de microcápsulas ou de microesferas, recorrem a processos de emulsificaçao consistindo a fase essencial de tais processos na obtenção de uma emulsão do tipo óleo-na-água a partir de uma solução orgânica de material polimérico e de uma solução aquosa de péptido - a este propósito ver as patentes de invenção USA-A-4 384 975, 3 891 570, 4 389 330, 3 737 337, 4 652 441 ou WO-90/13361 -. Contudo em todos os casos, o especialista na matéria é obrigado a desenvolver técnicas complexas e difíceis de realizar, a fim de reduzir tanto quanto possível as perdas de ingredientes activos peptídicos eminentemente hidrossolúveis, como por exemplo a dupla emulsificação.

Tratando-se de realizar, durante um tal processo, a formação de uma emulsão do tipo óleo-na-água seguida da sua transferência para um meio aquoso, a presente invenção permite, contra tudo o esperado, ultrapassar com vantagem os defeitos das técnicas conhecidas até hoje.

Com efeito, procedendo primeiramente à conversão de um péptido ou derivado peptídico hidrossolúvel em um péptido, ou respectivamente um sal de péptido, insolúvel em água, a presente invenção oferece ao especialista na matéria um meio particularmente

Α original de tirar partido das solubilidades relativas dos ingredientes utilizados, mais particularmente dos dissolventes e não-dissolventes utilizados.

A presente invenção tem mais precisamente por objectivo um processo caracterizado pelo facto de:

a. se converter um péptido ou um sal de péptido solúvel em água em um péptido, ou respectivamente um sal de péptido i n s o lúve-1.. em água;

b. se promover a suspensão do referido péptido, respectivamente sal de péptido insolúvel em água, no seio de um meio orgânico contendo o material polimérico biodegradável dissolvido;

c. se dispersar a dita suspensão orgânica em um meio aquoso formando a fase contínua da emulsão resultante;

d. se transferir a dita emulsão para um excesso de meio aquoso e finalmente se separar da fase líquida as microesferas assim obtidas.

De acordo com a presente invenção, por substância medicamentosa peptídica define-se no essencial um polipéptido natural ou sintético, fisiologicamente activo, comportando entre 3 e 45 aminoácidos. Numerosos são os polipéptidos que se pode tratar de acordo com o processo da presente invenção, em particular a oxi-

tocina, a vasopressina, a corticotrofina, a calcitonina, o factor de crescimento epidérmico (EGF), a prolactina, a inibitina, o interferão, a somatostatina, a insulina, o glucagon, o factor natriurético auricular (ANF), a endorfina, um inibidor da renina, a hormona de libertação da buteinoestimulina (LHRH), a hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH), o péptido T ou um dos seus análogos ou homólogos sintéticos.

A título preferencial, pode-se citar polipeptidos tais como a LHRH ou a somatostatina, ou ainda um dos seus homólogos ou análogos sintéticos tais como

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH,

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Trp-NH₂/

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-N^,

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-N^,

AcPhe-Cys-Phe-D-Trp-.Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

AcPhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-N^, Ac-DNal-DpCl-Phe-DPal-Ser-Tyr-DCit-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂, (piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg“Pro-Gly-NH₂, (piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^, (piro) Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-NHR^, ou (piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp^Leu-Arg-Pro-NHR.] , (R^ = alquilo inferior).

Esta linha não é contudo exaustiva.

A primeira fase do processo consiste em se converter, por meio de técnicas usuais, um péptido ou um sal de péptido solúvel em água em um péptido, ou um sal de péptido respectivamente, insolúvel em água. Por solúvel em água, entende-se um péptido ou derivado peptídico possuindo uma solubilidade em água superior ou igual a 0,1 mg/ml a 25°C, de preferência superior ou igual a 1,0 mg/ml.

Por insolúvel em água entende-se um péptido ou derivado peptídico possuindo uma solubilidade em água inferior ou igual a 0,1 mg/ml a 25°C. Sais de péptidos tais como o pamoato, o tanato, estearato ou o palmitato respondem a esta definição.

Como material polimérico biodegradável, utiliza-se mais geralmente polímeros tais como um polilactido, um poliglicolido, um copolímero de ácidos láctico e glicólico, um poliéster tal como um polialquileno - fumarato ou succinato, ou ainda um poliortoéster, um poliacetal ou um polianidrido.

Como material polimérico preferencial, convém citar os copolímeros dos ácidos láctico e glicólico (PLGA), em particu-

lar os copolímeros do ácido L- ou D,L-láctico contendo entre 45 e 90% (mole %) de motivos de ácido láctico, respectivamente e entre 55 e 10% (mole %) de motivos de ácido glicólico.

Podem igualmente citar-se diversos polialquileno-fumaratos ou succinatos, particularmente o poli-1,4-butileno-succinato, o poli-2,3-butileno-succinato, o poli-1,4-butileno-fumarato ou o poli-2,3-butileno-fumarato. Estes polímeros preparam-se facilmente de acordo com a literatura ou podem obter-se no comércio especializado.

Como dissolvente do material polimérico escolhido, utiliza-se um dissolvente orgânico tal como o cloreto de metileno por exemplo, em qualquer caso um dissolvente que se comporte como um não dissolvente para o péptido ou sal de péptido retido.

De acordo com a presente invenção, uma vez o referido péptido ou sal colocado em suspensão no seio da solução orgânica de material polimérico, este é incorporado numa quantidade pré-determinada de um meio aquoso, mais geralmente água a que se adicionou um agente tensio-activo apropriado. O objectivo pretendido é a formação rápida de uma emulsão homogénea, do tipo óleo-na-água, fazendo o referido meio aquoso de fase contínua. Diversos factores intervêm na preparação de uma tal emulsão, que por seu lado condicionam o tamanho ou a estrutura das microesferas resultantes do processo. Um dos factores a ter em consideração é a velocidade de adição da solução orgânica ao meio aquoso; um outro pode ser a temperatura ou ainda a velocidade de agitação ou a energia de dispersão (sonicação), influenciando

1/ este último parâmetro particularmente o tamanho das microesferas finais. É da competência do especialista na matéria a utilização dos métodos e das condiçoes de emulsificação apropriados ao objectivo pretendido.

Durante a realização da dita emulsão, pode igualmente ser vantajoso modificar a relação volúmica das fases em presença, especialmente diminuir o volume inicial da fase orgânica em relação ao da fase aquosa. Segundo os casos, tendo em vista a volatilidade dos dissolventes orgânicos utilizados, o cloreto de metileno por exemplo, a evaporação que ocorre espontaneamente quando da agitaçao pode já revelar-se suficiente; nos outros, pode-se acelerar o fenómeno pretendido praticando uma evaporação parcial, sob pressão reduzida.

Uma vez a emulsão orgânica-aquosa estabilizada, transfere-se para uma quantidade excedentária de meio aquoso, mais geralmente água. Tal operação pretende aumentar o endurecimento das microesferas embrionárias formadas na emulsão, mediante extracçao do dissolvente orgânico ainda presente nas ditas microesferas. Esta operação pretende igualmente eliminar simultaneamente os vestígios ainda presentes de agente tensio-activo que podem subsistir na massa do polímero durante o endurecimento terminal. Verifica-se que a água é um não-dissolvente quer para o material polimérico biodegradável, tal como o PLGA por exemplo, como para o sal de péptido presente no seio das ditas microesferas. Esta situação favorece igualmente a extracção necessária do dissolvente residual do polímero, cloreto de metileno por exemplo.

Depois da transferência da referida emulsão para um excesso de meio aquoso, recolhe-se as microesferas endurecidas de acordo com as técnicas usuais, por exemplo a centrifugação, a filtração ou a decantação. Efectuam-se igualmente lavagens, purificações e secagens.

Uma das vantagens do processo de acordo com a presente invenção é que permite a obtenção de microesferas cujo tamanho se pode controlar com precisão, efectuando-se este controlo essencialmente quando da preparação da emulsão (velocidade de agitação por exemplo). Uma outra vantagem é a taxa de carga peptídica particularmente elevada que se pode obter, 5, 10 ou mesmo cerca de 20% em peso ou mais segundo os casos. Além disso, o rendimento da incorporação do péptido ou sal de péptido é particularmente elevado; isto é especialmente devido à prévia conversão do péptido retido de derivado hidrossolúvel em derivado insolúvel em água, tal .como um sal por exemplo.

As microesferas obtidas pelo processo de acordo com a presente invenção a partir dos ingredientes anteriormente mencionados são então utilizadas, depois de uma esterilização, adequada, para a preparação de suspensão destinadas a uma administração por via parenteral, por exemplo uma injecção intramuscular ou subcutânea.

A presente invenção é ilustrada por meio dos exemplos que se seguem. Tais exemplos não são em nenhum caso limitativos quanto às substâncias utilizadas ou condições operacionais de

realização.

Exemplo 1

Converte-se 3g de acetato de D-Trp6-LHRH de formula:

(piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Nl^ no pamoato correspondente, por meio de técnicas usuais. Finamente pulverizado, este sal apresenta-se sob a forma de micropartícuias de dimensão média igual a cerca de 10 micra, de estrutura amorfa. Solubilidade : inferior a 0,025 mg/ml em água a 40°C.

Em seguida, suspende-se 0,280 g de pamoato de D-Trp -LHRH em 20 ml de cloreto de metileno, suspensão esta que se adiciona depois a 20 ml de cloreto de metileno contendo no estado dissolvido 1,720g de copolímero dos ácidos D,L-láctico e glicólico (PLGA) 75:25 (mole %/viscosidade inerente 0,82 em HFIP). A mistura efectua-se à temperatura ambiente, sob agitação, de modo a obter-se uma suspensão perfeitamente homogénea.

Despeja-se, em seguida, a suspensão resultante de uma só vez em 500 ml de uma solução de metoxicelulose a 0,075% em água e continua-se a agitaçao da mistura reaccional durante cerca de 90 minutos à temperatura ambiente (velocidade de agitação 900 rotações /minuto ) . Segue-se a evolução da emulsão periodicamente, em média todos os 30 minutos, mediante colheita de uma amostra e exame das microesferas presentes ao microscópio.

-10Uma vez terminada a agitaçao (estabilização da redução do tamanho das microesferas), transfere-se a referida emulsão de uma sô vez para 2 litros de água mantida a cerca de 10°C, sendo a mistura agitada até à sua homogeneização.

Isolam-se as microesferas de PLGA da mistura reaccional e purificam-se mediante uma sucessão de centrifugações alternadas com lavagens com água e finalmente filtram-se e secam-se sob pressão reduzida. Obtém-se deste modo 1,25g (rendimendo 63%) de microesferas de PLGA comportando mais de 96% de partículas de diâmetro inferior a 100 micra (max. a 55-85 micra).

Após análise (dissolução da massa do PLGA, extracçao e determinação do pêptido mediante HPLC), verifica-se que a taxa de carga das microesferas em pamoato de D-Trp^-LHRH é de 9,05% em peso (teórico 10%).

Submetem-se em seguida as microesferas assim obtidas a uma esterilização por raios gama e suspendem-se num veículo estéril apropriado. Os testes in vivo (doseamento da taxa de testosterona sanguínea em ratos machos) confirmam a libertação regular da substância activa em pelo menos 21 dias, que se traduz por uma quebra da taxa de testosterona a valores de castração a contar do (injecção a Ώθ).


DURAÇÃO (dias)	TESTOSTERONA (ng/ml)
0	3,7
2	5,1
4	0,7
7	0,6
11	0,8
1 4	1 ,2
18	1 ,9
21	2,0
25	2,0

Exemplo 2

Procede-se exactamente de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, com excepção da utilização de 0,560 g de pa6 moato de D-Trp -LHRH que se substitui por 1,440 g de PLGA 75:25 (mole %).

Obtém-se deste modo 1 ,49 g (rendimento 75%) de microesferas de PLGA comportando mais de 90% de partículas de diâmetro inferior a 100 micra.

Taxa de carga: 16,3% em peso (teórico: 20%)

Exemplo 3

Procede-se de acordo com o processo descrito no Exemplo

1, a partir de 0,140 g de pamoato de D-Trp -LHRH e 0,860 g de poli-1,4-butileno-succinato (viscosidade inerente de cerca de 0,35 em HFIP).

Transfere-se a emulsão orgânica-aquosa resultante de uma só vez para 500 ml de água e submete-se a mistura resultante aos tratamentos sucessivos de centrifugação e lavagem com água, filtração e finalmente secagem sob pressão reduzida para se obter 0,52 g (rendimento 52%) de microesferas de polisuccinato.

Taxa de carga: 2,87% em peso (teórico: 10%)

Exemplo 4

Converte-se primeiramente o acetato de um análogo de somatostatina de fórmula

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH^ no pamoato correspondente de acordo com as técnicas usuais, para se obter partículas de dimensão média igual a 10 micra aproximadamente .

Utiliza-se, em seguida, 0,266 g do referido pamoato e

1,734g de PLGA 75:25 (mole %) de acordo com o processo descrito w

no Exemplo 1. Despeja-se depois a emulsão orgânico-aquosa em 2 litros de água a 10°C, homogeneíza, centrifuga-se depois e trata-se como anteriormente indicado para se obter 1 ,23g (rendimento 62%) de microesferas de PLGA comportando mais de 98% de partículas de diâmetro inferior a 100 micra (max. a 40-65 micra).

Taxa de carga: 8,7% em peso (teórico: 10%)

Exemplo 5

Procede-se exactamente de acordo com o processo descrito no Exemplo 4, mas utilizando 0,532g de pamoato de análogo de somatostatina para 1,468 g de PLGA 75:25.

Microesferas de PLGA: 1,21 g (rendimento 60%).

Taxa de carga: 17,5% em peso (teórico: 20%).

As microesferas assim obtidas, são esterilizadas por meio de raios gama e finalmente colocadas em suspensão em um veículo esteril apropriado. Os ensaios in vivo” (doseamento da quantidade do análogo de somatostatina no soro sanguíneo de ratos que foram injectados unicamente no ϋθ) confirmam uma libertação controlada de uma quantidade detectável de substância activa em um período de 20 dias (injecção intra-muscular).

DURAÇÃO (dias)	DOSAGEM DO PÉPTIDO (ng/ml)
0+3 horas	64,0
1	15,0
2	10,0
3	5,0
6	3,0
8	2,0
10	2,0
14	1 ,5
1 6	1 ,5
20	1 ,5

Exemplo 6

Converte-se 3g de acetato de um análogo de LHRH de fórmula

Ac-D-Nal-D-pCl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NI^ no pamoato correspondente de acordo com as técnicas usuais e trata-se de modo a obter-se partículas de dimensão média igual a cerca de 10 micra.

Trata-se, em seguida, 0,317g do referido pamoato e 1,683g de PLGA 75:25 (mole %) de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, para finalmente se obter 1,61g (rendimento 80%) de microesferas de PLGA comportando mais de 94% de partículas de diâmetro inferior a 100 micra (max. a 55-85 micra).

Taxa de carga: 9,05% em peso (teórico: 10%)

Exemplo 7

Procede-se exactamente de acordo com o processo descrito no Exemplo 6, mas utilizando 0,634g do pamoato do análogo de LHRH para 1,366g de PLGA 75:25.

Microesferas de PLGA: 1,70g (rendimento 85%).

Taxa de cargar 18,3% (teórico: 20%).

Submetem-se em seguida as microesferas assim obtidas a uma esterilização por raios gama e colocam-se em suspensão no seio de um veículo estéril apropriado. Os ensaios in Vivo (doseamento da taxa do análogo no soro sanguíneo em ratos machos) confirmam a libertação regular de uma quantidade biologicamente significativa de ingrediente activo em pelo menos 24 dias.

DURAÇÃO (dias)	DOSAGEM DO PÊPTIDO (ng/ml)
0+3 horas	47,1
1	48,9
2	52,2
3	46,9
6	50,4
8	40,1
10	42,1
14	29,8
16	33,5
20	33,0
24	25,6

Estes resultados são igualmente confirmados pelas análises feitas em sujeitos sacrificados no perda de peso dos testículos de pelo menos 80%, perda de peso das vesículas seminais de pelo menos 90%.

Claims

Procede-se de acordo com o processo descrito no Exemplo

1, a partir de 0,05g de pamoato de calcitonina de salmão e 1,0g de copolímero de ácido D,L-láctico/glicôlico 50:50 (mole %).

Os ensaios padrão in vivo confirmam uma libertação controlada do ingrediente activo em um período de cerca de 8 dias.

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de una composição destinada à libertação prolongada e controlada de substâncias me dicamentosas peptídicas, apresentando-se sob a forma de microesferas de material polimérico biodegradável incorporando a referida substância medicamentosa, caracterizado pelo facto de:

a) se converter um péptido ou um sal de péptido solúvel em água em um péptido, respectivamente um sal de péptido, insolúvel em água;

b) se suspender o referido péptido, respectivamente sal de péptido insolúvel em água em um meio orgâni.

co contendo o material polimérico biodegradável no estado dissolvido;

c) se dispersar a referida suspensão orgânica em um meio aquoso que forma a fase contínua da emulsão re sultante;

d) se transferir a referida emulsão para um excesso de meio aquoso e finalmente se separar da fase líquida as microesferas assim obtidas.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte2· rizado pelo facto de antes de 'se transferir a emulsão óleo-em-água para um excesso de meio aquoso, se proceder a uma evaporação parcial do dissolvente orgânico que constitui a fase óleo.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a substância medicamentosa peptídica ser um. polímero natural ou sintético comportando entre 3 e

45 aminoácidos.
4. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a

3, caracterizado pelo facto de se escolher' a substância medica mentosa entre a oxitocina, a vasopressina, a corticotrofina, a calcitonina, o factor de crescimento epidérmico (EGF), a prolactina,. a inibitina, α interferão, a somatostatina, a inso lina, o glucagon, o factor natriurético auricular (ANF), a endorfina, um inibidor da.renina, a hormona de libertação da luteinoestimulina (LHRH), a hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH), o péptido T ou um dos seus análogos ou homo logos sintéticos.
5. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a

4, caracterizado pelo facto de a substância medicamentosa ser a LHRH ou a somatostatina ou um dos seus análogos ou homólogos sintéticos escolhidos entre

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH,

II

D-Phe-Cys-Ph.e-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Trp-NH₂,

I1

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂,

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂,

II

AcPhe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂,

It

AcPhe-Cys-Tyr~D-Trp-Lys-Val~Cys-Trp-NH₂,

Ac-DNal-DpCl-Phe-DPal-Ser-Tyr-DCit-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂, (pyro) Glu-His-TrpSer-Tyr-D-Trp“Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, (pyro) Glu-His--Trp-Ser-Tyr-D-Ph.e-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, (pyro) Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-NHRp ou (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHRp (R^ = alquilo inferior).
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracte rizado pelo facto de o sal de péptido insolúvel em água ser um pamoato, tanato, estearato ou palmitato.
7. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o material polimérico biodegra davel ser um polilactido, um poliglicólido, um copolímero de áci dos láctico e glicólico, um poliéster tal como um polialqui- leno fumarato ou succinato, ou ainda um poliortoéster, um poliacetal ou um polianidrido.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto, de o copolímero dos ácidos láctico e glicôlico ser um copolíemro do ácido L- ou D,L-lactico comportando entre 45 e 90% (mole) de motivos de ácido láctico, respectivamente entre 55 e 10Z (mole) de motivos de ácido glicõlico.
9. - Processo de acordo com a reivindicação’ 8, caracterizado pelo facto de polialquileno fumarato ou succinato ser um poli-1,4-butileno-succinato, poli-2,3-butileno-succinato, poli-1,4-butileno-fumarato ou poli-2,3-butileho-fumarato.