PL209405B1

PL209405B1 - Bakteriobójczy wodny preparat i sposób hamowania rozwoju mikroorganizmów

Info

Publication number: PL209405B1
Application number: PL369008A
Authority: PL
Inventors: Shimshon Ben-Yehoshua
Original assignee: Israel State
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2011-08-31
Also published as: NO330037B1; EP1434486B2; ZA200402693B; KR20040068540A; DE60216944T2; IL145767A; DE60216944T3; DE60216944D1; PL369008A1; ATE348524T1; CN1283156C; AU2002341368B2; HK1067277A1; CA2462511A1; MA26288A1; HUP0402501A3; CN1592578A; CA2462511C; MXPA04003172A; HUP0402501A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest bakteriobójczy wodny preparat i sposób hamowania rozwoju mikroorganizmów.

Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy preparatów i sposobów hamowania rozwoju mikroorganizmów atakujących nietrwałe produkty rolne, w gospodarstwie domowym i u ludzi.

Rozkład nietrwałych produktów rolniczych powodowany jest przez mikroorganizmy. Zazwyczaj produkty rolnicze przechowywane są przez dostatecznie długi okres, w warunkach, które umożliwią rozprzestrzenianie się różnych mikroorganizmów. W wyniku tego bardzo często duży procent produkcji ulega zakażeniu. Oprócz oczywistych zasadniczych strat finansowych spowodowanych gniciem (rozkładem), niektóre mikroorganizmy produkują toksyczne i karcynogenne metabolity, które są szkodliwe dla ludzi.

Ograniczenie zakażeń patogenami nietrwałych produktów rolnych głównie prowadzi się dziś stosując egzogenne nanoszenie syntetycznych fungicydów i/lub środków bakteriobójczych. Jednakże, te syntetyczne środki chemiczne pozostawiają toksyczne związki na produktach rolnych. Ponadto, stwierdzono również obecność opornych szczepów mikroorganizmów. W wyniku tego pewne fungicydy i środki bakteriobójcze zostały przez uprawnione organy wycofane z użycia. Utrzymująca się toksyczność i ewentualne stopniowe wycofywanie poszczególnych środków stanowiło bodziec do opracowania alternatywy dla syntetycznych środków chemicznych obecnie stosowanych do zapobiegania gniciu.

Poniżej opisano kilka alternatywnych rozwiązań. Na przykład, napromieniowywanie produktów rolnych światłem ultrafioletowym (Ben-Yehoshua S., Rodov V., Kim J. J. i Carmeli S., 1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enchancement of decay resistance by heat and ultrafiolet treatments. w J. Agric. Food Chem., 40: 1217-1221; Rodov V., Ben-Yehoshua S., Kim J. J., Shapiro, B. i Ittah Y., 1992. Ultrafiolet illumination induces scoparone production in kumquat and orange fruit and improves decay resistance. J. Amer. Soc. Hortic. Sci., 117: 188-192) lub poddanie produktów działaniu antagonistycznych drożdży (Wilson C. L. i Chalutz E., 1989. Postharvest biocontrol of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria. Scientia Horticulturae, 40: 105-112). Jednakże, napromieniowanie UV może być fitotoksyczne, a kontrola biologiczna antagonistycznymi drożdżami nie jest nadal ogólnie akceptowana komercyjnie, prawdopodobnie ze względu na niedostateczne hamowanie rozwoju patogenów. Ponadto, sposoby te mają różne wady, z których część nie została zaaprobowana przez autorytety z dziedziny zdrowia.

Owoce cytrusowe, jak i różne inne rośliny, mają pewną endogenną odporność przeciwko patogenom, dzięki wytwarzaniu w tkankach roślinnych substancji skierowanych przeciwko mikroorganizmom (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V, Kim J. J. i Carmeli, S., (1992). Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food. Chem., 40: 1217-1221; Ben-Yehoshua, S. , Rodov, V., Fang, D. Q., i Kim, J. J., (1995). Preformed antifungal compounds of citrus fruit: effect of postharvest treatments with heat and growth regulators. J. Agric. Food Chem. 43: 1062-1066; Rodov V., Ben-Yehoshua S., Fang D. Q., i Kim J.J., (1995). Preformed antifungal compounds of lemon fruit: citral and its relation to disease resistance. J. Agric. Food Chem., 43: 1062-1066). Wcześniej wskazano, że te substancje obejmują składniki olejków eterycznych, które wykazują szeroki zakres aktywności przeciwko mikroorganizmom. W opisach patentów US nr 5 334 619 i nr 5 958 490 przedstawiono zastosowanie kilku naturalnie występujących olei, jako aktywnych środków zapobiegających rozkładowi w produktach rolniczych po zbiorze. Jednakże tylko kilka składników olejków eterycznych ma aktywność bakteriobójczą.

Cytral [3,7-dimetylo-2,6-oktadienal] jest składnikiem olejku eterycznego, który jest naturalnie produkowany w kilku rodzajach owoców cytrusowych, a także przez inne rośliny, takie jak traka cytrynowa i eukaliptus. Cytral jest nienasyconym aldehydem z serii terpenów i składa się z izomerycznej mieszaniny geranialu i neralu. Ze względu na jego intensywny aromat i smak cytrynowy, cytral był szeroko stosowany w przemyśle spożywczym i kosmetycznym. Cytral jest rozpoznawany jako bezpieczny pomocniczy środek spożywczy i jest akceptowany przez amerykański Urząd ds. żywności i leków (U. S. Food and Drug Administration) w zastosowaniach w artykułach spożywczych. Opisywano również, że cytral jest bardzo skuteczny i wykazuje szeroki zakres aktywności przeciwbakteryjnej i grzybobójczej. Faktycznie, Ben-Yehoshua i wsp. (1992), a także Rodov i wsp. (1995) przedstawili, że cytral jest najbardziej aktywnym konstytutywnym grzybobójczym związkiem pochodzącym z owocu cytryny.

PL 209 405 B1

Limonen, 1-metylo-4-(1-metyloetenylo)cykloheksen (znany również jako p-menta-1,8-dien) jest kolejnym przykładem składnika występującym w dużych ilościach w olejku eterycznym, który może być ekstrahowany z gruczołów flawedo (część mezokarpu) owoców cytrusowych.

W US nr 4 379 168 i US nr 5 951 992 opisano zastosowanie limonenu jako odpowiedniego środka owadobójczego i pestycydu. Jednakże w swojej czystej postaci ma on bardzo niską aktywność grzybobójczą. Chalchat i wsp. (Chalchat J. C., Chiron F., Garry R. Ph. i Lacoste (2000, J. Essent. Oil Res. 12, 125-134) ujawnili przeciwbakteryjną aktywność hydropeoksydu limonenu przeciwko patogenom ludzkim.

Aureli i wsp. (Aureli, P., Costantini, A. i Zolea, S., 1992. Antimicrobial activity of some plant essential oil against Listeria monocytogenes. J. Food Protection, 55: 344-348) wykazali, że pewne składniki olejków eterycznych wykazują silną aktywność przeciwko patogennym bakteriom, takim jak Listeria i sugerowano ich zastosowanie w zapobieganiu zakażeniu artykułów spożywczych przez bakterie Listeria.

Czyniono szereg prób w celu zastosowania cytralu do ograniczenia gnicia różnych produkcji rolniczych. Opisano, że cytral może ograniczać psucie się zaszczepionych grzybem Aspergillus nasion jęczmienia przy wysokiej wilgotności (Nandi B., Thomke S. i Fries, N., 1977. Presentation of high moisture barley grains with citral and allyl caproate and preliminary acceptability tests with piglets.

Acta Agric. Scand., 27: 105-109), surowych ziaren ryżu (Mallick A. K. i Nandi B., 1982. Deterioration of stored rough rice. IV. Presentation and palatability of citral and propionic acid treated grains. Acta

Agric.Scand., 32: 177-187) i pszenicy (Ghosh J. i Nandi B., 1985. Preservation of high moisture wheat by some fungicidal volatile compounds and palatability tests with rats. Acta Agric. Scand., 35: 245-254). Arora i Pandey (Arora R. i Pandey G. N., 1977. The application essential oilss and their isolates for blue mold decay control in Citrus reticulata Blanco. J Food Sci. i Tech. 14: 14-16) przedstawili, że cytral, geraniol i inne związki obecne w olejkach eterycznych obniżają rozkład owocu Citrus reticulata powodowany przez szarą pleśń. Twórca wynalazku (Ben-Yehoshua S., Rodov V., Kim J. J. i Carmeli S., 1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolettreatments. J. Agric. Food Chem., 40: 1217-1221) wykazał, że dostarczenie egzogennego cytralu do zaszczepionych Penicillium cytryn znacząco hamowało ich rozkład.

W większości przypadków wcześniejszego stosowania składników olejku eterycznego do zapobiegania rozkładowi produktów rolniczych, składnik olejku eterycznego był wykorzystany do produktów w postaci emulsji wodnej. Jednakże częściowe zapobieganie rozkładowi produktów uzyskiwane przez zastosowanie takich substancji, składników olejków eterycznych, włącznie z cytralem i geraniolem, nadal nie jest stosowane komercyjnie do hamowania rozkładu nietrwałych produktów rolniczych. Jednym z głównych powodów nie stosowania tych substancji jest to, że ich podawanie na nietrwałe produkty, w stężeniu skutecznym przeciwko rozwojowi mikroorganizmów, powoduje uszkodzenia tych produktów, które mogą w wyniku ulegać dalszemu rozkładowi. Na przykład, olejki eteryczne powodują uszkodzenie skórki owocu i zmiany koloru mięsa. To uszkodzenie może być dotkliwe i prowadzić do znaczącego rozkładu traktowanych produktów po stosunkowo krótkim czasie. Inne powody braku komercyjnego zastosowania związków jest ich niestabilność, gdyż wiele z olejków eterycznych jest niestabilnych i ma skłonność do rozkładu przed dostarczeniem ich bakteriobójczej aktywności.

Wynalazek jest oparty na fakcie, że składniki olejków eterycznych lub ich pochodne należą do środków z klasy spożywczych, otrzymane przez napromieniowanie światłem lub przez utlenianie, mogą być stosowane do hamowania rozwoju mikroorganizmów jako składnik aktywny w stabilnych skutecznych preparatach bakteriobójczych. Preparat zawierający składnik olejku eterycznego zapobiega uszkodzeniu fitotoksycznemu i zapewnia zwiększenie stabilności składnika olejku eterycznego lub jego pochodnej, prowadząc do uzyskania przyjaznej dla środowiska kompozycji bakteriobójczej.

Przedmiotem wynalazku jest bakteriobójczy wodny preparat zawierający:

(i) składnik olejku eterycznego, stanowiący cytral, przy czym stężenie cytralu wynosi od 0,1 do 1%;

(ii) przynajmniej jeden dodatkowy środek stabilizujący będący przeciwutleniaczem, wybrany z grupy obejmującej butylowany hydroksyanizol (BHA), kwas askorbinowy, butylowany hydroksytoluen (BHT), kwas izoaskorbinowy, α-tokoferol, β-karoten lub ich mieszaniny oraz (iii) imazalil w stężeniu od 5 ppm do 100 ppm.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób hamowania rozwoju mikroorganizmów, w którym podaje się skuteczną ilość wodnego preparatu według wynalazku.

Korzystnie, zgodnie ze sposobem według wynalazku zabezpiecza się owoce i warzywa przeciwko gniciu po zbiorze.

PL 209 405 B1

Zamiast składnika olejku eterycznego według wynalazku może być stosowany związek wybrany z grupy monoterpenowych węglowodorów, seskwiterpenów, natlenionych pochodnych terpenowych, pochodnych nie terpenowych takich jak aldehydy, alkohole, kwasy i fenole. Stężenie olejków eterycznych w wodnej bakteriobójczej kompozycji wynosi od około 0,1% do około 1% (obj/obj.). Stężenie pochodnej olejku eterycznego utworzonej w wyniku naświetlania wynosi od około 1000 pl/l do około 12000 pl/l. Kompozycja bakteriobójcza może również obejmować dodatkową ilość innego biocydu, w tak małej ilości, że ilość ta sama nie jest wystarczająca do hamowania rozwoju mikroorganizmów.

Preparat według wynalazku może być również stosowany do hamowania rozwoju mikroorganizmów w gospodarstwie domowym przez nanoszenie bakteriobójczego wodnego preparatu samego albo razem z typowo stosowanymi detergentami.

Preparat według wynalazku może być ponadto wprowadzony do stosowanych przez ludzi produktów do higieny. Preparat ten, razem z odpowiednimi dodatkowymi środkami może być dodany do kostki mydła, płynów do higieny i środków do mycia naczyń, odkażających płynów do płukania ust lub do zastosowań kosmetycznych.

Preparat według wynalazku może być również stosowany w preparatach bakteriobójczych, do łagodzenia lub leczenia niewielkich infekcji powodowanych przez mikroorganizmy, jak i w celu zapewnienia ludziom korzyści zdrowotnych.

Poniżej opisano korzystne rozwiązanie jedynie, aby wynalazek był zrozumiały oraz aby przedstawić możliwe realizacje wynalazku, jako nie ograniczający przykład, w odniesieniu do towarzyszącego rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia indukcję produkcji skoparonu w dojrzałej zielonej cytrynie przez iniekcję do albedo traktowanego promieniowaniem słonecznym limonenu, limonenu lub cytralu lub przez uwalnianie składników gruczołów olejowych w dojrzałych zielonych cytrynach.

Figura 2 przedstawia wpływ dojrzewania owoców cytryn na produkcję fitoaleksyn w dojrzałych owocach zielonych i żółtych cytryn.

Figura 3 przedstawia szybkość rozkładu grejpfruta zaszczepionego Penicillium, traktowanego przez zanurzenie w preparatach cytralu i geraniolu.

Figura 4 przedstawia szybkość rozkładu cytryn zaszczepionych Penicillium, traktowanych wodną emulsją cytralu stabilizowanego 25% etanolem, amif 72 (20% butylowany hydroksyanizol, 6% galusan propylu i 4% kwas cytrynowy w glikolu propylenowym), β-cyklodekstryną i monolaurynianem polioksyetylenosorbitanu (Tween 20) w porównaniu do rozkładu owocu tego samego typu traktowanego 5000 ppm Tween 20 bez etanolu.

Figura 5 przedstawia szybkość rozkładu szczepionych cytryn traktowanych wodną emulsją cytralu obejmującą alkohol oktylofenylopolieterowy (Tryton X100) i butylowany hydroksyanizol (BHA).

Figura 6 przedstawia szybkość rozkładu cytryn szczepionych Penicillium, traktowanych wodną emulsją cytralu, obejmującą monolaurynian polioksyetylenosorbitanu (Tween 20) i butylowany hydroksyanizol (BHA), w porównaniu do szybkości rozkładu, gdy dodany jest imazalil (imazalil jest środkiem grzybobójczym, który jest typowo stosowany w ochronie owoców i warzyw po zbiorze).

Figura 7 przedstawia szybkość rozkładu cytryn szczepionych Penicillium traktowanych 25% etanolowo wodną emulsją dichlorometanowego surowego ekstraktu z flawedo zielonej cytryny w porównaniu z imazalilem 1000 ppm i 25% roztworem etanolu.

Figura 8 przedstawia szybkość rozkładu cytryn szczepionych Penicillium, traktowanych 25% etanolowo wodnym roztworem różnych połączonych preparatów obejmującym cytral, 1-oktanol i dichlorometanowy surowy ekstrakt z flawedo cytryny w 25% etanolu, który przed użyciem był naświetlany światłem słonecznym przez 4 godziny.

Figura 9 przedstawia szybkość rozkładu cytryn szczepionych Penicillium, traktowanych 25% etanolowym roztworem 5000 ppm limonenu naświetlanego światłem słonecznym przez 3 godziny. Porównywano wpływ długości zanurzenia jak i liczbę zanurzeń.

Figura 10 przedstawia szybkość rozkładu cytryn szczepionych Penicillium, traktowanych wodnym roztworem 2500 ppm limonenu, który przed użyciem był naświetlany UV przez trzy godziny, a następnie rozpuszczony w 25% etanolu. Jednominutowe traktowanie przez zanurzenie w tym roztworze, (3UVL) porównywano z trzema kolejnymi jednominutowymi zanurzeniami w takim samym roztworze z jedną godziną odstępu pomiędzy tymi zanurzeniami (3UVL3). Wyniki takiego traktowania porównano z zanurzeniem w wodzie lub w 25% etanolu.

Figura 11 przedstawia wpływ wodorotlenku limonenu wytworzonego przez fotoutlenianie z różem bengalskim na procent rozkładu owocu cytryny szczepionego Penicillium digitatum.

PL 209 405 B1

Figura 12 przedstawia wpływ wodorotlenku limonenu uzyskanego z katalizatorem molibdenianowym na rozkład owocu cytryny szczepionego Penicillium digitatum.

Figura 13 przedstawia wpływ usunięcia katalizatora różu bengalskiego i dawkowania Tween 20 na fitotoksyczność owocu cytryny traktowanego nadtlenkiem hydroksylowym limonenu.

Figura 14 przedstawia wpływ preparatu cytralu na wzrost komórek gronkowca złocistego.

Figura 15 przedstawia wpływ cytralu i poddanego działaniu słońca limonenu na wzrost komórek Candida albicans.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak stwierdzono powyżej, wynalazek dostarcza przyjazny dla środowiska bakteriobójczy preparat, skuteczny do zapobiegania rozkładowi/gniciu produktów rolniczych, do stosowania w gospodarstwie domowym, w produktach do higieny stosowanych przez ludzi, a także jako kompozycja wspomagająca leczenie zakażeń. Wodny preparat bakteriobójczy obejmuje jako składnik aktywny, citral. Mogą być ewentualnie stosowane inne składniki olejku eterycznego lub jego pochodne otrzymane przez naświetlanie lub przez utlenianie, lub mieszaniny takich olejków eterycznych i/lub ich pochodnych i przynajmniej jeden dodatkowy środek stabilizujący wybrany z grupy obejmującej etanol w ilości od około 10% do około 50%, środek emulgujący, przeciwutleniacz lub środek kaspułkujący. Rolą środka stabilizującego jest stabilizacja składników olejków eterycznych przed rozkładem, zanim nastąpi ich bakteriobójcze działanie i/lub zapobieganie, i/lub obniżanie fitotoksyczności tych związków. Jako bakteriobójczy składnik olejku eterycznego może być stosowany związek wybrany z grupy obejmującej monoterpenowe węglowodory i seskwiterpeny, natlenione terpenowe pochodne i nie terpenowe pochodne, takie jak aldehydy (cytral lub nonanal), alkohole (oktanol, nonanol) i fenoplasty (krawakrol). Wodny, bakteriobójczy preparat może być stosowany do skutecznej kontroli i hamowania rozwoju mikroorganizmów.

Wszystkie składniki olejków eterycznych są dobrze znane jako składniki klasy spożywczej. Należy również pokreślić, że wszystkie składniki wodnego bakteriobójczego preparatu są klasy preparatów spożywczych i nie stanowią żadnego zagrożenia dla organizmu człowieka. Jednym szczególnie szerokim potencjalnym zastosowaniem jest ochrona nietrwałych produktów rolniczych przed rozkładem powodowanym przez mikroorganizmy. Produkty rolne mogą obejmować na przykład dowolną produkcję świeżych artykułów spożywczych, które mogą ulec zepsuciu w wyniku zakażenia mikroorganizmami, takie jak owoce, warzywa, mięso lub ryby. Inne możliwe zastosowania preparatu według wynalazku mogą obejmować każdy przypadek, w którym konieczna jest skuteczna ochrona przed mikrobami, takim jak zastosowania w gospodarstwie domowym, higienie lub środkach wspomagających. Do zastosowania w gospodarstwie domowym wodny bakteriobójczy preparat może być stosowany sam lub wraz z dostępnymi w handlu detergentami. Do zastosowania składników olejków eterycznych lub ich pochodnych do higieny przez ludzi, skuteczne ilości tych składników olejków eterycznych lub ich pochodnych mogą być wprowadzone do kostki mydła, preparatu czyszczącego, detergentów do mycia naczyń, płynów do płukania jamy ustnej lub kompozycji, lub roztworu, lub kompozycji dezodoryzującej.

Skuteczne ilości składnika olejku eterycznego według niniejszego wynalazku, zwłaszcza w przypadku olejków eterycznych wybranych z grupy obejmują cej cytral, alkohol perylowy lub limonen, mogą również stanowić część kompozycji stosowanej jako prozdrowotny produkt spożywczy (środek wspomagający). Taka kompozycja może rozwiązać dwa problemy, czyli chronić przeciwko infekcji mikroflorą i mikrofauną, jak i zapewniać dodatkowe działanie zdrowotne, np. wykazywać działanie przeciwnowotworowe. Stwierdzono, że preparaty obejmujące olejki eteryczne takie jak cytral, limonen, geraniol, mentol, karwon, alkohol perylowy, działają jako środki przeciwnowotworowe i obniżają poziom cholesterolu i LDL. Cytral i citronellal są znane jako środki uspokajające i rozładowujące emocje, i są pomocne przy przywracaniu właściwych funkcji trawiennych. Takie składniki olejków eterycznych są znane jako roślinne preparaty odżywcze lub żywność funkcjonalna.

Pewne składniki olejku eterycznego są znane w stanie techniki jako skutecznie zwalczające mikroorganizmy, zwłaszcza w produkcji rolniczej. Jednakże, składniki olejków eterycznych związane są z dwoma nieodłącznymi problemami, które do tej pory ograniczył y ich praktyczne zastosowanie. Jeden problem polega na ich ograniczonej stabilności, ze względu na procesy natleniania powodujące szybki rozkład olejków eterycznych w wyniku działania tlenu. Zatem, pomimo, że zastosowanie tych związków jako skutecznych mikrobiocydów było znane, skuteczne zastosowanie było ograniczone ze względu na krótki czas przydatności do użycia. Zastosowanie zasadniczo dużych ilości olejku eterycznego w celu przedłużenia jego bakteriobójczego wpływu prowadzi do drugiej niepożądanej jego wła6

PL 209 405 B1 ściwości: naniesienie na owoce olejku eterycznego w wysokim stężeniu, zwłaszcza jeśli mieszanina nie tworzy prawdziwego roztworu, powoduje uszkodzenie owoców.

Odkryto obecnie, że gdy składniki olejków eterycznych są stosowane jako aktywny składnik bakteriobójczej kompozycji wraz z przynajmniej jednym środkiem dodatkowym, który stabilizuje lub rozpuszcza składniki olejków eterycznych, otrzymywana jest stabilna i skuteczna bakteriobójcza kompozycja, która nie powoduje żadnego uszkodzenia produktów. Te dodatkowe środki są wybrane z grupy obejmującej etanol, przeciwutleniacz, środek emulgujący lub środek do kapsułkowania. Różny jest mechanizm zabezpieczania składników olejków eterycznych przez każdy z tych dodatkowych środków. Środek emulgujący utrzymuje tworzenie mikrokloidalnego roztworu, który pomaga w zapobieganiu fitotoksyczności składników olejku eterycznego. Środki emulgujące mogą zostać wybrane z grupy obejmującej alkohol alkiloarylopolieterowy (DX), monolaurynian polioksyetyleno sorbitanu (Tween 20), monooleinian polioksyetyleno sorbitanu (Tween 80), alkohol oktylofenylopolieterowy (Triton 100). Niektóre z tych środków emulgujących są z klasy produktów spożywczych, np. Tween 20. Stężenie środków emulgujących powinno wynosić powyżej 0,1% (procent masowy).

Przeciwutleniacz zmniejsza szybkość utleniania olejków eterycznych prowadzącą do ich rozkładu. Również obniża on występującą nieodłącznie fitotoksyczność olejku eterycznego. Przeciwutleniacz może zostać wybrany z grupy obejmującej związki, takie jak między innymi: butylowany hydroksyanizol (BHA), kwas askorbinowy, izokwas askorbinowy, α-tokoferol, butylowany hydroksytoluen (BHT), β-karoten lub ich mieszaniny.

Korzystne stężenia przeciwutleniacza w preparacie według wynalazku wynoszą od około 0,05% do około 0,8% (masa/obj.). Wpływ przeciwutleniacza na zmniejszenie fitotoksyczności olejku eterycznego w przypadku dodania BHA do cytralu przedstawiono w tabeli 1, przedstawiając wskaźnik skazy skórki, przy czym należy rozumieć, że sam BHA nie powoduje żadnej skazy.

Wskaźnik skazy skórki wyznaczono stosując wzór:

Wskaźnik = Σ (ocena X liczby owoców z daną oceną) / (całkowita liczba owoców)

Ocena skaz jest następująca: 0 = bez skaz; 1 = lekkie skazy; 2 = średnie skazy i 3 = dotkliwe skazy.

T a b e l a 1

Wpływ 1-minutowego zanurzenia w przeciwutleniaczu BHA na skazy na skórce owocu cytryny utrzymywanego w temperaturze 20°C przez 20 dni

Cytral (%)	BHA (%)	Wskaźnik skazy skórki
0,0	0,00	0,10
0,5	0,00	0,48
0,5	0,05	0,14
0,5	0,10	0,05
0,5	0,30	0,00
0,5	0,60	0,00
1,0	0,00	0,90
1,0	0,30	0,52

Środki kapsułkujące dodawane do preparatu, tworzą kompleksy ze składnikami olejków eterycznych, zapobiegając ich degradacji i wydłużając okres skutecznej bakteriobójczej aktywności tych związków. Jako środek kapsułkujący może być stosowany dowolny rodzaj ośrodka spożywczego lub polimeru z węglowodoru, lub białka, lub inne podłoże, takie jak między innymi: skrobia kukurydziana, maltodekstryna, β-cyklodekstryna, żel krzemionkowy, kazeina, chitosan i ich mieszaniny. Niskocząsteczkowy polietylen i różne woski również mogą działać jako materiały kapsułkujące. Faktycznie stwierdzono, że dodanie cytralu do różnych woskowych preparatów, które nie obejmują żadnych fungicydów wzmacniały skuteczność cytralu zarówno w ograniczaniu gnicia, jak i fitotoksyczności. Dodanie cyklodekstryny do cytralu prowadziło również do wydłużenia obecności cytralu na powierzchni

PL 209 405 B1 traktowanego owocu pomarańczy. Korzystne stężenia środka kapsułkującego w preparacie według wynalazku są w zakresie od około 0,1 do około 0,8% (masa/obj.).

Dodanie środka emulgującego obniża naturalną fitotoksyczność olejku eterycznego. Ten wpływ przedstawiono jako wskaźnik skazy olejku eterycznego cytralu przez dodanie środka emulgującego jak przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Podsumowanie prób określających fitotoksyczność roztworów cytralu obejmujących środki emulgujące (stosunek 1:1 z cytralem)¹

	0,5% Cytral	1,0% Cytral
DX	0	0
Tween 80	0	0
Tween 20	0	0
Triton X 100	0	0
Żelatyna	1,0	1,4
Siarczan laurylowy sodu (SLS)	1,3	1,6
Guma arabska	1,2	1,9

¹ Owoc zanurzono na 1 minutę w emulsji, a następnie przechowywano przez miesiąc w temperaturze 20°C. Fitotoksyczność mierzono jak określono w tabeli 1

Należy zauważyć, że oprócz przynajmniej jednego składnika olejku eterycznego, jego pochodnych otrzymanych przez wystawienie na promieniowanie lub ich mieszanin, bakteriobójcza kompozycja może obejmować inne biocydy w bardzo niskim stężeniu. Takie niskie stężenie biocydu samo nie jest wystarczające do zapobiegania stratom powodowanym przez mikroorganizmy, jednakże razem z olejkami eterycznymi lub ich pochodnymi, może zapobiegać rozkładowi powodowanymi przez mikroorganizmy. Nie ograniczające przykłady takich biocydów mogą obejmować imazalil, tiabendazol, panoktynę, rowral, prochloraz, ortofenylofenolan sodu, metalaksyl, fosetylo-AI, kaptan, oksychinolinę, chlorek benzalkonium dikloranu, kanon, tiofanat-metyl, triforynę, karbendazym, triademinol, winklozolinę, etakonazol, lub ich mieszaniny. Stężenie takich dodatkowych pestycydów może wynosić od około 5 ppm do około 100 ppm. Zastosowanie kompozycji obejmujących połączenie składnika olejku eterycznego lub jego pochodnej otrzymanej przez wystawienie na promieniowanie światłem razem z małą ilością środka grzybobójczego będzie prowadziło do dwóch waż nych korzyś ci:

1. Zmniejszenie toksycznych pozostałości biocydu, co jest ważnym wymaganiem stawianym przez wszystkie autorytety w dziedzinie zdrowia dla wszystkich toksycznych fungicydów.

2. Kontrolowanie rozwoju odporności patogenu na biocyd. Ten szczególny punkt może być uzyskany przez zastosowanie nowego preparatu z lub bez biocydu. Faktycznie zastosowanie różnych biocydów, które mogą mieć różny sposób działania, nawet w stosunkowo krótkim czasie, uważa się za rekomendowany sposób wpływu na oporność populacji na biocydy.

Składniki olejków eterycznych według niniejszego wynalazku mogą być produkowane syntetycznie lub mogą stanowić ekstrakt roślinny, obejmujący wiele składników olejków eterycznych, to jest będący ich mieszaniną. Mogą to również być oczyszczane naturalne preparaty olejków eterycznych wzbogacone jednym składnikiem olejku eterycznego lub dowolnym ich połączeniem. Preparaty zawierające naturalne olejki eteryczne mogą być produkowane przez różne rośliny takie jak owoce cytrusowe, trawa cytrynowa i drzewa eukaliptusowe. Szczególnymi nie ograniczającymi przykładami związków olejku eterycznego są cytral, 1-oktanol, heptanol, nonanol, geraniol, oktanal, nonanal, dekanal, alkohol perylowy, alkohol perylowy, citronelol, citronelal, karwon, karweol, linalool, wanilina, aldehyd cynamonowy, kwas cynamonowy, eugenol, mentol, limonen, karwakrol, terpineol, tymol, wanilina i kamfora. W przypadkach, w których olejkiem eterycznym jest pochodna uzyskana przez naświetlanie, uzyskiwanie pochodnych może być przeprowadzone z syntetycznie wyprodukowanego olejku eterycznego, naturalnie ekstrahowanego olejku eterycznego lub dla surowego ekstraktu obejmującego wiele olejków eterycznych. W tym ostatnim przypadku, jeden lub więcej olejków eterycznych może być przeprowadzonych w pochodne, podczas gdy inne mogą pozostać nie zmienione. Ponadto, wysta8

PL 209 405 B1 wienie na działanie światła może być przeprowadzone zarówno przed ekstrakcją składników olejku eterycznego z ich naturalnego źródła, jak i po ich ekstrakcji.

Według wynalazku, mieszanina przynajmniej jednego składnika olejku eterycznego lub jego pochodnej otrzymanej przez napromieniowanie światłem ze środkiem emulgującym i przeciwutleniaczem może być bezpośrednio dodana jako przeciwbakteryjna kompozycja do produktów spożywczych, preparatów toaletowych i artykułów gospodarstwa domowego w celach bakteriobójczych. Również mieszanina może być wytworzona w postaci płynu lub jako aerozol przez dodanie nietoksycznych podłoży w odpowiednich iloś ciach według potrzeby i dodawana lub rozpylana w celach bakteriobójczych.

Stężenie przynajmniej jednego składnika olejku eterycznego potrzebne do uzyskania działania może w każdym przypadku być z łatwością wyznaczone przez specjalistę w dziedzinie i zależy od typu olejku eterycznego jak i od sposobu zastosowanego wytwarzania. W przypadku cytralu lub geraniolu, skuteczne ilości są w zakresie od około 0,1 do 1%, zwłaszcza 0,2-0,4%.

Preparat może być zastosowany na produkt, aby go chronić w różnych okresach przed i w czasie przechowywania. Gdy preparat został zastosowany na owoce, korzystnie będzie on zastosowany przed pakowaniem, to jest po zbiorze. Preparat według niniejszego wynalazku może być naniesiony na produkty dowolnym sposobem, który zapewni dostarczenie skutecznej ilości preparatu, to jest ilości, która będzie hamować zakażenie mikroorganizmami poprzez cały okres przechowywania. Przykłady sposobów obejmują zanurzenie, odymianie, natryskiwanie i traktowanie pianą owoców w miejscu pakowania. Inne sposoby obejmują włączenie tych materiałów do emulsji woskujących. Faktycznie, jak wspomniano, emulsje woskujące były odpowiednimi rozpuszczalnikami do traktowania kilku owoców cytrusowych.

Innym sposobem nanoszenia jest odymianie owocu w stosunkowo szczelnej komorze z wykorzystaniem lotności wielu aktywnych materiałów takich jak cytral.

Inny możliwy sposób stosowania obejmuje nanoszenie aktywnych materiałów na podłoże z żelu silikonowego stosowanego do środka wysuszającego lub jako absorbent. Materiał ten może absorbować ponad 10% swojej masy naszych aktywnych materiałów i utrzymywać je następnie jako środek otoczkowany. Jednakże, gdy wilgotność otoczenia tego materiału wzrasta, następuje uwalnianie aktywnych biocydów i zastąpienie ich przez wodę. Faktycznie, jest to sytuacja, w której owoc jest zamknięty w pomieszczeniu przechowalniczym lub w dowolnej komorze do przechowywania nietrwałych produktów rolniczych, które stale transpirują. Takie zastosowanie może zapewniać kontrolowane powolne uwalnianie środka grzybobójczego umożliwiającego dłuższą ochronę przed rozkładem.

Preparat może również być podawany w polimerach o długim czasie rozkładu, które podczas rozkładu wydzielają związek olejku eterycznego do produktów. Według wynalazku, pH preparatu olejku jest korzystnie kwaśne, lecz może również być zasadowe o wartości pH do 9.

Jak wspomniano, wodny bakteriobójczy preparat powinien obejmować środek stabilizujący w celu rozpuszczenia przynajmniej jednego składnika olejku eterycznego. W przypadku gdy ś rodek stabilizujący jest etanolem, wykazano, że cytral o stężeniu 0,2% był znacznie bardziej skuteczny do hamowania rozkładu nie szczepionego owocu pomarańczy Washington, gdy zastosowano go jako preparat zawierający 10-50% etanolu, niż gdy został zastosowany, w tym samym stężeniu w emulsji wodnej (tabela 3, patrz również przykład 4).

T a b e l a 3

Wpływ cytralu i 50% etanolu na procent rozkładu nie szczepionych pomarańczy Washington (liczby = % zgniłych owoców)

	Miesiące przechowywania
T raktowane	0,5	1	2	3	4
Nie traktowane	5,0	8	20	29	36
0,2% cytral, 0,02% środek emulgujący w wodzie	0,0	8	28	35	48
50% etanol w wodzie	0,0	4	14	20	23
0,2% cytral, 50% etanol w wodzie	0,0	0	2	3	5
Imazalil, 0,2% w wodzie	0,0	2	4	5	8

PL 209 405 B1

Ponadto, nie występuje znaczące uszkodzenie produktu, typowo związane z nanoszeniem olejku eterycznego. W obecności 10 do 50% etanolu olejek eteryczny nie powoduje uszkodzenia fitotoksycznego. Uszkodzenie nie występuje nawet, gdy olejki eteryczne są stosowane przy stosunkowo wysokich stężeniach (0,5 do 1%) znanych w stanie techniki jako powodujące znaczące uszkodzenie.

Wpływ takich preparatów na zmniejszenie rozkładu wykazano zatem dla wszystkich testowanych owoców cytrusowych w przedziale pakowalniczym (wyniki przedstawiono w tabelach 3 i 4) i stosując owoce mango i papryki słodkiej (dane nie przedstawione). Doświadczenie z papryką słodką wykazywały dobrą kontrolę głównych patogenów papryki w Izraelu: Botrytis cinerea i Alternaria alternata.

T a b e l a 4

Wpływ limonenu wystawionego na trzy godziny światła słonecznego na rozkład owocu kumkwatu po przechowywaniu przez 11 dni w temperaturze 10°C i stymulacji warunków na półce w temperaturze 20°C przez 6 dni

Traktowanie	Koniec przechowywania
Zanurzenie w wodzie	12,0	b
Etanol 25%	7,9	ab
Limonen¹	1,6	a

¹ 5000 μl I^-1 naświetlany światłem słonecznym przez 3 godziny w 25% etanolu + 5000 pl I^-1 TWEEN 20

Ilościowo, składnik olejku eterycznego, limonen, który należy do rodziny węglowodorowych monoterpenów, obejmuje około 85% składników olejku eterycznego z owocu cytrusowego. Sam limonen jednakże, nie jest wystarczająco aktywny. Mimo że jest on nieaktywny, odkryto, że limonen może służyć jako prekursor wielu aktywnych mikrobiocydów w wyniku wystawienia homogenizowanej skórki owocu na światło słoneczne, które następnie uzyskuje się przez ekstrakcję oleju organicznym rozpuszczalnikiem, zwłaszcza dichlorometanem, heksanem lub octanem etylu. Taki sam wpływ może być uzyskany przez napromieniowanie limonenu UV, po jego ekstrakcji (fig. 9 i 10). Analogicznie, w przypadku syntetycznie wyprodukowanego limonenu. Ponadto, limonen może również ulec utlenieniu tradycyjnymi środkami utleniającymi. Jeden szczególny nie ograniczający przykład stanowi heterogenna kataliza z solą molibdenianową. Zatem, preparat bakteriobójczy według wynalazku może obejmować limonen lub surowy ekstrakt olejków eterycznych obejmujący zasadniczą ilość limonenu, po naświetlaniu światłem. Należy podkreślić, że przeciwutleniacze nie powinny być stosowane, jeśli pochodne olejków eterycznych były wystawione na napromieniowanie światłem.

Takie poddanie limonenu napromieniowaniu prowadzi do gwałtownego fotoutleniania, które tworzy bardzo aktywny grzybobójczy materiał. Taki materiał może być scharakteryzowany jako składnik, który daje kolor fioletowy w teście wanilina-kwas sulfomoczowy (tutaj poniżej określony „test wanilinowy”) lub korzystnie przez błękitną fluorescencję otrzymaną w wyniku napromieniowania lampami UV. Pomimo, że odczynniki w teście mogą oddziaływać z innymi terpenami i ich pochodnymi, specyficzny produkt limonenu może być scharakteryzowany przez jego typowy kolor i szybkość retencji, Rf, na chromatogramie. Fotoutlenianie może być przeprowadzone zarówno przez napromieniowanie limonenu ultrafioletem lub białym światłem lub przez poddanie go działaniu światła słonecznego. We wszystkich trzech przypadkach otrzymany materiał wykazywał ten sam czas retencji w HPLC. Materiały te dają taki sam kolor fioletowy w teście wanilinowym i ten sam ślad na płytce chromatogramu cienkowarstwowego. Zatem można podsumować, że wszystkie trzy drogi napromieniowania prowadzą do takiego samego materiału. Odkryto, że chlorofil bierze udział w fotoutlenianiu limonenu do nowego produktu, który daje pozytywną odpowiedź jako fiolet w teście wanilinowym. Materiał ten wykazywał wysoce grzybobójczą aktywność w oznaczeniu biologicznym hamowania wydłużania konidii Penicillium digitatum. Uzyskana aktywność była znacznie wyższa, niż ta skoparonu lub skopoletyny, substancji znanych jako endogenne fitoaleksyny z owoców cytrusowych, lub niż aktywność cytralu, który był znany jako najbardziej aktywny konstytutywnie grzybobójczy materiał z owocu cytryny (Ben Yehoshua i wsp., 1992)

Inne obserwacje wykazały, że materiał ten indukuje odpornościowe mechanizmy owoców cytrusowych, takie jak wywoływanie akumulacji fitoaleksyn (fig. 1). Traktowane nieszczepionych cytryn iniekcją 5 pl fotoutlenionego limonenu do tkanki albedo, tuż poniżej flawedo, wywoływało w tych cytrynach produkcję skoparonu i skopoletyny do poziomów odpowiednich do ochrony owocu przed pato10

PL 209 405 B1 genem. Podobne wyniki uzyskano przez iniekcję dichlorometanowego lub heksanowego surowego ekstraktu flawedo cytryny, który przedstawiono jako całkowicie zapobiegające rozkładowi (fig. 7). Podobnie, uszkodzenie gruczołów olejowych lub nastrzykiwanie limonenem tkanki albedo dojrzałych zielonych cytryn prowadziło do bardzo istotnego działania indukującego mechanizmy endogennej odporności owoców cytrusowych jak przedstawiono poprzez akumulację skoparonu na fig. 1. Takie uszkodzenia w przypadku żółtego owocu dały znacznie mniejszą odpowiedź wskazując, że dojrzewanie owocu wpływa na jego odpowiedź odpornościową i starszy owoc jest mniej chroniony (fig. 2). Faktycznie, mniejszą odporność żółtego owocu obserwowano w wielu innych doświadczeniach. Co ciekawe, wstrzykiwanie cytralu nie wywoływało takiej samej odpowiedzi ochronnej (fig. 1). Prawdopodobnie wstrzykiwanie cytralu inaczej niż limonenu nie indukowało produkcji substancji aktywnej pozytywnej względem waniliny. Ponadto, znacznie wyższe poziomy zarówno skoparonu (powyżej 1000 μg/g świeżej masy) i skopoletyny (ponad 200 μg/g świeżej masy) stwierdzono po zanurzeniu szczepionego owocu w surowym ekstrakcie w dichlorometanie, który zapobiegał rozkładowi (fig. 7). Stwierdzony poziom fitoaleksyny był kilkukrotnie wyższy od ilości koniecznej do pełnej kontroli patogenów. Zatem zrozumiałe jest, że utworzone wodorotlenki limonenu tworzą reaktywne cząstki tlenu, które indukują układ odpornościowy rośliny. Takie reaktywne cząstki tlenu wpływają również na patogen. Te reaktywne cząsteczki tlenu mają krótki czas życia i rozkładają się w znacznym stopniu zanim owoc zostanie dostarczony na rynek.

Ważnym aspektem nowego wynalazku jest to, że zapobieganie gniciu wywołanemu przez patogen uzyskuje się zarówno przez bezpośrednie hamowanie rozwoju patogenu, jak i przez indukowanie endogennych mechanizmów odpornościowych u roślin. Zatem, limonen po naświetlaniu światłem słonecznym lub promieniowaniem UV, lub surowy ekstrakt po naświetlaniu światłem słonecznym uzyskuje zarówno bezpośrednią grzybobójczą aktywność, jak i powoduje endogenną odporność rośliny.

Wcześniej opisywano (Schieberle, P., Maier, W., Firl, J. i Grosch, W., 1987, HRGC separation of hydroperoxides formed during the photosensitized oxidation of(R)-(+)-limonene. J. of High Resolution Chromatography & Chromatography Communications str. 588), bez odniesienia do aktywności grzybobójczej, że napromieniowanie limonenu prowadzi do wytworzenia różnych nadtlenków. Obecnie przedstawiono, że utworzony wodoronadtlenek, a w szczególności, 1-wodoronadltenek (1S,4R)-p-menta-2,8-dienu; 1-wodoronadltenek (1R,4R)-p-menta-2,8-dienu; 2-wodoronadltenek (2R,4R)-p-menta-6,8-dienu i 2-wodoronadltenek (2S,4R)-p-menta-6,8-dienu może być stosowany jako skuteczny biocyd w wodnym roztworze według wynalazku. Obecności tych wodoronadtlenków w naświetlanym limonenie według wynalazku potwierdzono badaniami spektrometrii mas z chromatografią gazową i jądrowym rezonansem jądrowym (dane nie przedstawione). W rozwiązaniu według wynalazku nowa procedura dająca wysokie stężenia wodoronadtlenku została opracowana z zastosowaniem różu bengalskiego jako katalizatora lub aktywatora, który podniósł poziom tlenu w reakcji do poziomu energetycznego singletowego tlenu. Wykorzystując opracowane procedury, prawie cały limonen ulega przekształceniu w wodoronadtlenek. Mieszanina tych wodoronadtlenków była bardzo skuteczna do kontrolowania rozkładu szczepionych cytryn nawet przy dawce 2500 ppm (fig. 11).

Przeprowadzone doświadczenia wyraźnie pokazały, że jeśli surowy ekstrakt ze skórki lub wyekstrahowany limonen nie był naświetlany ani poddany działaniu światła słonecznego, uzyskany roztwór limonenu faktycznie nie wykazywał wystarczającej aktywności, ani nie był zdolny, aby zahamować rozkład. Owoc w takich przypadkach ulegał rozkładowi, tak jakby owoc nie był poddany działaniu żadnego bakteriobójczego preparatu. Zatem, aktywność grzybobójcza, jak i indukcja mechanizmów odpornościowych, jak przedstawiono przez akumulację skoparonu jest związana z wodoronadtlenkami limonenu.

Naświetlanie światłem słonecznym lub napromieniowanie dichlorometanowego, lub heksanowego ekstraktu z flawedo cytryny powinno być przeprowadzone przez 3 do 6 godzin. Skuteczność preparatu ekstraktu wodoronadtlenkowego jako kompozycji do niszczenia mikroorganizmów wzrasta z długością okresu działania owocu na roztwór. Zanurzenie szczepionego owocu w roztworze wodoronadtlenku (limonen naświetlany 4 godziny światłem słonecznym) przez cztery kolejne okresy każdy po 1 minucie prowadziło do zapobiegania rozkładowi szczepionych cytryn utrzymywanych w temperaturze 20°C przez okres ponad trzech tygodni (fig. 9). Wpływ poddania limonenu przez 3 godziny działaniu światła słonecznego i jego skuteczność w zapobieganiu rozkładu w porównaniu do niepoddanych działaniu (zanurzenie w wodzie) lub poddanych działaniu etanolowego roztworu (25%) podsumowano w tabeli 4 w doświadczeniu typu komercyjnego z nie szczepionym owocem. Ponadto opryskiwanie sadu wodnym preparatem zawierającym 5000, 10000 lub 20000 ppm limonenu w 25% etaPL 209 405 B1 nolowym roztworze, który uległ w pełni przekształceniu, indukowało produkcję sloparonu i skopoletyny w owocu Valencia na drzewie (i poza), zmniejszony rozkład tego owocu, gdy po zbiorze został zaszczepiony P. digitatum (dane nie przedstawione). W oddzielnym doświadczeniu zarówno cytral, jak i traktowany promieniowaniem słonecznym limonen (rozpuszczono w 25% etanolu) wykazywał znaczące hamowanie działania innego patogenu Cladosporium herbarum hodowanego na szczepionej kolbie kukurydzy. Tradycyjny sposób kontrolowania rozkładu w pomieszczeniu do pakowania owoców cytrusowych obejmuje kilka związków, które są również przyjazne dla środowiska, lecz nie są obecne w niniejszym preparacie ze względów technicznych. Takie związki są to sole wapnia, kwas giberelnowy, acetaldehyd kwasu 2,4-dichlorooctowego, chitosan lub chitosan plus niskie stężenie metali, takie jak Zn lub Cu, pewne organiczne kwasy, takie jak kwas octowy, kwas propionowy, itp. Związki te mogą być częścią przyjaznego dla środowiska nowego preparatu według wynalazku. Faktycznie obecne dane wykazały taką aktywność. Faktycznie obniżenie pH preparatów do 2 lub 3 również pomagało w ograniczeniu działania patogenu w doświadczeniach na szczepionych owocach.

Wynalazek zostanie obecnie przedstawiony bardziej szczegółowo na poniższych przykładach z odpowiednimi odnośnikami do załączonego rysunku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Minimalne hamujące stężenie przeciwko P. digitatum i sposób działania olejków eterycznych w porównaniu do imazalilu.

Minimalne stężenie hamujące (MIC) dla ponad 50 związków, które stwierdzono gruczołach olejowych owoców cytrusowych określono (in vitro) przez ustalenie najniższego stężenia związku, przy którym nie wystąpił wzrost patogenu (in vitro) na szalkach Petriego. Tabela 5 podaje MIC najbardziej obiecujących związków (w porównaniu do imazalilu). Wskazaną ilość każdego ze związków, które były badane, rozpuszczono w 0,5 ml acetonu, dodano do sterylnej szalki Petriego (90 mm) zawierającej 15 ml stopionego agaru z dekstrozą z ziemniaka (PDA) (50°C) otrzymując końcowe stężenie 1 mg ml^-1. Szalkę łagodnie wytrząsano, aby zapewnić równe rozmieszczenie badanego związku i agar następnie pozostawiono do zestalenia. Szalki szczepiono stosując krążek grzybowy (8 mm) wycięty z szalkowej hodowli agarowej P. digitatum, które nie rozpoczęły jeszcze sporulacji. Krążki grzybowe umieszczano po środku każdej z testowych szalek a następnie szalki umieszczano w temperaturze 24°C. Hamowanie rozwoju grzybni monitorowano przez pomiar średnicy wzrostu strzępek grzybni po 7 dniach.

Przeprowadzono również oznaczenie (in vitro) w celu zbadania czy sposób działania był grzybobójczy czy hamujący rozwój grzyba; krążek grzybowy z inoculum z szalki testowej przeniesiono na szalkę zawierającą tylko PDA. Szalki następnie monitorowano pod kątem wzrostu przez następne 5 dni. Jeśli następowało odnowienie wzrostu, związek był klasyfikowany jako środek hamujący rozwój grzyba, a jeśli wzrost nie był wznawiany, związek był klasyfikowany jako środek grzybobójczy. Wyniki przedstawiono w tabelach 5 i 6.

T a b e l a 5

Minimalne stężenie hamujące (MIC) działanie P. digitatum i sposoby działania

Związek badany	MIC mg ml^-1 agar	Sposób działania
Imazalil	< 0,025	Środek grzybobójczy
Dekanol	0,05	Środek hamujący rozwój grzyba
Oktanol	0,1	Środek grzybobójczy
Nonanol	0,2	Środek hamujący rozwój grzyba
Cytra l	0,4	Środek grzybobójczy
Aldehyd cynamonowy	0,4	Środek grzybobójczy
Aldehyd perylowy	0,4	Środek grzybobójczy
Alkohol perylowy	0,4	Środek grzybobójczy
Citronellal	0,6	Środek hamujący rozwój grzyba
Terpineol	0,8	Środek grzybobójczy
Karweol	1,0	Środek hamujący rozwój grzyba

PL 209 405 B1

T a b e l a 6

Hamujące działanie różnych związków przeciwko 3 różnym gatunkom patogenów cytrusów w oznaczeniu in vitro dyfuzji w agarze. Obszar hamowania wzrostu patogenu¹ (cm²)

Związek	Geotrichum candidum	Penicillium italicum	Alternaria citri
Imazalil	8,3	Całkowite hamowanie	42,8
Aldehyd cynamonowy	24,2	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie
Octanal	3,6	2,6	5,3
Dekanol	0,95	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie
1-Oktanol	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie
Aldehyd perylowy	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie
Cytral	10,6	Całkowite hamowanie	Całkowite hamowanie

¹Całkowite hamowanie stanowi maksymalne hamowanie, które wynosi 62,3 cm²

Oznaczenie dyfuzji w agarze

Przygotowano i sterylizowano agar z dekstrozą ziemniaka (Difco). Pożywkę następnie schłodzono w łaźni wodnej do temperaturze 50°C przed szczepieniem, dodając zawiesinę spor P. digitatum w sterylnej wodzie, aby uzyskać koń cowe stężenie spor w poż ywce 10⁴ spor/ml. Pożywkę łagodnie mieszano, aby równomiernie zawiesić spory przed rozdzieleniem po 15 ml do każdej szalki Petriego o ś rednicy 90 mm. Pięć mg każdej substancji, która ma być badana odpipetowano na sterylny 13 mm antybiotykowy papierowy krążek Whatmana do analiz, który umieszczono centralnie na szczepionej szalce z agarem. Szalki inkubowano w temperaturze 24°C przez 3 dni. Grzybobójczą aktywność monitorowano przez pomiar szerokości strefy przeźroczystej od krawędzi papierowego krążka do obszaru wzrostu grzyba. Wartości przedstawiono jako promień (mm) strefy hamowania wzrostu patogenu na szalce Petriego. Całkowite hamowanie oznacza, że wzrost był całkowicie zahamowany.

W innych doś wiadczeniach (dane nie przedstawione) odkryto, ż e cytral i inne preparaty olejków eterycznych były skuteczne w kontrolowaniu wzrostu grzybów P. digitatum i bakterii Erwinia carotovora, głównego patogenu produkcji rolniczej.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 2

Grejpfruty bez wad zebrano z sadu i tego samego dnia przesortowano ponownie w laboratorium, aby usunąć uszkodzone owoce. Grejpfruty przemyto bieżącą wodą i wysuszono na powietrzu. Każdy owoc następnie szczepiono przez przebijanie jego tkanki flawedo w głąb 1,5 mm narzędziem zawierającym trzy igły w trzech różnych miejscach. Przed każdym przebiciem, narzędzie zanurzano w zawiesinie spor Penicillium digitatum (10⁶ spor/ml).

Szczepione grejpfruty utrzymywano w temperaturze 17°C i 85% względnej wilgotności przez 24 godziny, po czym grejpfruty podzielono na sześć grup i grejpfruty z każdej grupy traktowano przez zanurzenie na dwie minuty w: (a) wodzie; (b) 25% etanolu (EtOH); (c) 0,2% geraniolu w 25% EtOH; (d) 0,1% Cytralu w 25% EtOH, (e) 0,2% Cytralu w 25% EtOH oraz (f) 0,5% Cytralu 25% EtOH. Procent zgniłych owoców w każdej grupie mierzono każdego dnia po traktowaniu i wyniki przedstawiono na fig. 3.

Jak widać na fig. 3, w kontrolnych owocach (zanurzonych tylko w wodzie) rozwinęła się zgnilizna szybko osiągająca osiem dni po szczepieniu 100%. Rozkład owocu zanurzonego w 25% etanolu (EtOH) był opóźniony, lecz 6 dni po szczepieniu rozpoczął się szybkie gnicie owoców traktowanych EtOH i trzy tygodnie po szczepieniu ponad 50% owoców było zgniłych.

Przeciwnie, owoce zanurzone w 0,2% Geraniolu i 0,1-0,2% Cytralu rozpuszczonych w 25% EtOH wykazywały wolniejszy rozkład i 18 dnia po szczepieniu tylko 20-40% owoców w tych grupach było zgniłych. Najskuteczniejsze hamowanie rozkładu uzyskano w wyniku zanurzenia szczepionego owocu w 0,2% Cytralu rozpuszczonym w 25% EtOH, który całkowicie hamował rozkład owocu do 18 dni po szczepieniu i tylko 20% owoców wykazywało rozkład dopiero po 28 dniach od szczepienia.

Dawka 0,5% cytralu była zbyt wysoka i w tym doświadczeniu spowodowała większy rozkład ze względu na fitotoksyczność.

PL 209 405 B1

P r z y k ł a d 3

Cytryny szczepiono, jak przedstawiono w przykładzie 2 i traktowano lub nie 25% etanolem, aby sprawdzić, czy 5000 ppm środka emulgującego Tween 20 może stabilizować grzybobójczą aktywność cytralu. Wyniki, przedstawione na fig. 4, wykazują, że takie stężenie Tween 20 wzmacniało aktywność cytralu. Dodatkowo zapobiegało fitotoksyczności, która zwykle jest powodowana przez cytral, jeśli nie jest rozpuszczony w etanolu. Prawdopodobnie, środek emulgujący umożliwia tworzenie mikrokoloidalnej stabilnej emulsji, która zapobiega fitotoksyczności przez umożliwienie jednorodnej dyspersji cytralu, który sam jest fitotoksyczny w tych stężeniach. Zatem, w preparacie Tween 20 w połączeniu z przeciwutleniaczem BHA może zastąpić etanol.

P r z y k ł a d o d n i e s i e n i a 4

Nie szczepione pomarańcze navel Washington podzielono na cztery grupy, w których poddano je działaniu preparatów następująco: (a) nie traktowano; (b) zanurzono w 50% etanolu; (c) zanurzono 0,2% Cytralu w 0,02% środku emulgującym L-77 (emulsja wodna); (d) zanurzono w 0,2% cytralu w 50% etanolu i (e) zanurzono w 0,2% wodnym roztworze imazalilu.

Pomarańcze następnie przechowywano przez cztery miesiące w temperaturze 15°C przy 50-75% względnej wilgotności i mierzono procent zgniłych owoców w każdej grupie w różnych okresach czasu po przechowywaniu. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Jak można zauważyć w tabeli 3, procent zgniłych owoców po traktowaniu preparatem według wynalazku (0,2% cytral w 50% etanolu) był znacząco niższy, niż ten traktowanych zarówno cytralem w wodnej emulsji lub z samym etanolem.

Ponadto, wyniki dla preparatu według wynalazku są porównywalne z tymi uzyskanymi dla imazalilu. Wysoki poziom rozkładu przy traktowaniu cytralem z 0,02% środkiem emulgującym był prawdopodobnie powodowany przez fitotoksyczność, którą obserwowano ze względu na brak zarówno etanolu jak i wyższego poziomu środka emulgującego.

P r z y k ł a d 5

Plastry mięsa wołowiny podzielono na poniższe dwie grupy: (a) nie traktowane plastry mięsa; (b) plastry mięsa zanurzone na 30 sekund w 0,2% Cytralu rozpuszczonego w 20% etanolu. Plastry mięsa następnie przechowywano w temperaturze 1°C i przy 85% wilgotności względnej i całkowite zliczenie populacji mikroorganizmów w każdym plastrze mięsa przeprowadzano przez 2 tygodnie po traktowaniu. Wyniki wykazywały, że całkowite zliczenie populacji mikroorganizmów w plastrach mięsa traktowanych cytralem rozpuszczonym w 20% etanolu było mniejsze niż 10% całkowitego zliczenia stwierdzonego w nie traktowanych plastrach mięsa.

P r z y k ł a d 6

Cytryny szczepione Penicillium, jak przedstawiono w przykładzie 2, zanurzono na 2 minuty w wodnym roztworze obejmującym cytral, środek emulgujący (Tryton X100) i BHA w różnych stężeniach. Stężenie cytralu wynosi 1,0%. Kontrolny roztwór zawierał 0,5% Tryton X100. Wyniki przedstawiono na fig. 5. Jak widać, wpływ 0,1% BHA powodował zwiększenie aktywności cytralu w zapobieganiu rozwoju patogenu.

P r z y k ł a d 7

Cytryny szczepione Penicillium, jak przedstawiono w przykładzie, 2 traktowano wodnym roztworem obejmującym 0,5% Cytral, 0,3% BHA, Tween 20 i imazalil i przechowywano w temperaturze 20°C przez 21 dni. Wyniki przedstawiono na fig. 6. Imazalil o stężeniach 1 i 10 ppm był niewystarczający do pełnego zahamowania rozkładu. Jednakże dodanie do 10 ppm imazalilu 0,5% cytralu całkowicie zapobiegało rozkładowi i umożliwiało zmniejszenie obu dawek, a także pozostałości tych skutecznych, lecz niepożądanych, syntetycznych środków grzybobójczych. Dodanie cytralu do 1 ppm imazalilu nie hamowało wystarczająco rozkładu, lecz prowadziło do znacznie lepszych efektów niż 1 ppm samego imazalilu.

P r z y k ł a d 8

Cytryny szczepione Penicillium 10⁴ spor/ml zanurzono dzień później w wodnym roztworze obejmującym cytral i detergent (Tween 20), inne olejki eteryczne jak i pewne połączenia bardziej skutecznych olejków eterycznych i przetrzymywano przez okres sześciu dni. Wyniki ochrony przeciwko mikroorganizmom uzyskane z zastosowaniem różnych olejków eterycznych przedstawiono w tabeli 7. Niektóre z olejków eterycznych, zwłaszcza kwas cynamonowy, wanilina, oktanol i mieszanina kilku olejków eterycznych, były bardziej skuteczne w przeprowadzonych doświadczeniach niż cytral. Dodatkowo ich aktywność przeciwko P. digitatum była dłużej obserwowana.

PL 209 405 B1

T a b e l a 7

Wpływ z różnych olejków eterycznych na procent rozkładu szczepionego owocu przechowywanego przez 6 dni w temperaturze 20°C

Nr	Traktowanie	% rozkładu
1.	Zanurzenie w wodzie	73
2.	Etanol 25%	30
3.	1-oktanol 5000 ppm + EtOH 25% + Tween 20 5000 ppm	7
4.	Cytral 1000 ppm + 1-nonanol 1000 ppm + 1-oktanol 1000 ppm + Karweol 1000 ppm + EtOH 25% + Tween 20 4000 ppm	7
5.	Kwas trans-cinamonowy 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	3
6.	1-oktanol 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	10
7.	Benzaldehyd 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	20
8.	Cytral 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	13
9.	Wanilina 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	7
10.	Karweol 2500 ppm + EtOH 25% + Tween 20 2500 ppm	23

P r z y k ł a d 9

Ogólna procedura otrzymywania najbardziej aktywnego surowego ekstraktu z flawedo cytryny.

Flawedo owocu cytryny (egzokarp) pobierano i ekstrahowano przez noc w dichlorometanie, następnie naświetlano światłem słonecznym przez około 18 godzin do momentu, gdy kolor dichlorometanowego ekstraktu stał się brązowy. Flawedo mielono i przesączono poprzez warstwę bibuły Whatmana. Ekstrahowany roztwór odparowano do usunięcia dichlorometanu i gęsty płyn rozdzielono również chromatograficznie w kolumnie 60 krzemionkowej, stosując dichlorometan jako nośnik. W wyniku chromatografii otrzymano dwie frakcje dichlorometanu, jedną zieloną i drugą bezbarwną. Surowy aktywny ekstrakt izolowano przez odparowanie zielonej frakcji dichlorometanowej. Owoc cytryny szczepiony Penicillium digitatum 10⁴ spor/ml zanurzono 24 godziny po szczepieniu w etanolowym roztworze obejmującym ekstrahowane pozytywne w teście waniliny związki, a następnie przechowywano w temperaturze 20°C. Wpływ związków na rozwój patogenów na owocu sprawdzono codziennie w trakcie przechowywania.

Przedstawiono na fig. 7 wpływ różnych stężeń (10000, 5000 i 2500 ppm surowego ekstraktu) w porównaniu do wpływu uzyskanego przez etanolowy roztwór, imazalilu lub wody. 10000 ppm surowego ekstraktu całkowicie zapobiegało rozwojowi patogenów. Przy takiej wysokiej dawce surowego ekstraktu, niektóre owoce ulegały fitotoksyczności. Jednakże przedstawiono, że fitotoksyczność była głównie powodowana przez inne składniki, a nie przez składniki aktywne grzybobójcze, ponieważ fitotoksyczność mogła być usunięta, przy utrzymaniu aktywności niszczenia mikroorganizmów. Podobne wyniki uzyskano przy ekstrakcji limonenu heksanem.

P r z y k ł a d 10

Wodoronadtlenek limonenu wytworzono z limonenu dwoma sposobami.

Sposób 1: przez fotoutlenianie. Przekształcenie limonenu i wydajność reakcji była niemal 100% po około 8 godzinach reakcji. Czysty EtOH stosowano jako rozpuszczalnik, z różem bengalskim jako aktywatorem. Inne, aktywowane światłem aktywatory, na przykład chlorofil, również katalizują reakcję. Do reakcji fotokatalitycznej stosowano wysokociśnieniowe lampy rtęciowe z filtrem WG 345. Inne drogi wzbudzania światłem, np światłem monochromatycznym (emitancja światła -345 nm w przypadku różu bengalskiego), światłem UV, laserem również dostarczają produkt, wodoronadtlenek limonenu.

Sposób 2: poprzez heterogenną katalizę (bez światła). Molibdenian sodu (Na2MoO4 2H2O) stosowano jako katalizator, 300 ml stężonego H2O2 jako środka utleniającego dodano do rozpuszczalnika, do 700 ml EtOH. Warunki reakcji w celu otrzymania żądanego produktu były następujące: ciśnienie atmosferyczne, temperatura 50°C i 5-6 godzin reakcji z ciągłym mieszaniem. Przekształcenie limonenu i wydajność reakcji była niemal 100%.

Porównano produkty uzyskane tymi dwoma sposobami. Pomiary chromatografii gazowej wykazywały w przybliżeniu podobne wartości dla obu produktów. Aktywność grzybobójczą produktów wyPL 209 405 B1 tworzonych dwoma różnymi sposobami sprawdzono taką samą metodą. Cytryny szczepione Penicillium (10⁴ spor/ml) zanurzono w wodnym roztworze obejmującym wodoronadtlenek limonenu, detergent (Tween 20) i etanol. Rozkład określano w określonych odstępach czasu przez 26 dni. Wyniki zabezpieczenia przeciwko mikroorganizmom uzyskane z zastosowaniem tych mieszanin przedstawiono na fig. 11 i 12.

W przypadku sposobu 1, po zanurzeniu stwierdzono fitotoksyczne działanie na owoc. Zwiększanie ilości Tween 20 w mieszaninie i usunięcie różu bengalskiego wyeliminowało lub przynajmniej znacząco obniżyło fitotoksyczność. Róż bengalski oddzielono od aktywnego wodoronadtlenku przez umieszczenie roztworu w kolumnie ze złożem krzemionkowym, stosując mieszaninę heksan:octan etylu 9:1. Po usunięciu różu bengalskiego stwierdzono bardzo nieznaczne lub całkowity brak uszkodzeń związanych z fitotoksycznością.

Stosowany preparat obejmuje 0,25% wodoronadtlenek limonenu, 1% Tween 20, 400 ppm różu bengalskiego i 25% EtOH. Taka kompozycja, całkowicie hamowała rozwój zgnilizny, bez żadnej fitotoksyczności. Sześćdziesiąt dni po szczepieniu nie stwierdzono żadnego rozkładu na badanym owocu, podczas gdy w próbce stosowanej jako kontrola, szczepiony owoc zgnił po 5 dniach (fig. 11). Ten grzybobójczy wpływ może być wyjaśniony zarówno przez bezpośrednie działanie grzybobójcze wodorotlenku limonenu jak i również zwiększony poziom skoparonu i skopoletyny, który był indukowany przez wodoronadltenek limonenu jak przedstawiono wcześniej dla poddanego działaniu słońca limonenu (fig. 1).

W przypadku sposobu 2, stosowany preparat zawierał 0,5% i 0,25% wodoronadtlenku limonenu, 2% Tween 20 i 25% EtOH. Rozkład szczepionych cytryn nie rozwinął się przez 12 dni (fig. 12). Dawka 0,5% LHPO dała pełne ograniczenie rozkładu, podczas gdy przy 0,25% LHPO nadal stwierdzono pewien rozkład. Kontrolny roztwór, obejmujący 2% Tween 20 i 25% EtOH wykazywał bardzo niską aktywność grzybobójczą (90% rozkładu) wykazując ponownie, że aktywnym związkiem jest wodoronadtlenek limonenu.

Preferowany jest sposób 2, biorąc pod uwagę takt, że róż bengalski, który stosowano jako katalizator w sposobie 1, powodował działania niepożądane: obniżał aktywność grzybobójczą i wzmacniał fitotoksyczność, a na koniec reakcji musiał być oddzielony od aktywnego związku.

P r z y k ł a d 11

Cytryny szczepione Penicillium (10⁴ spor/ml) zanurzono w wodnym roztworze obejmującym cytral, detergent (Tween 20), inne składniki olejków eterycznych, jak i dichlorometanowy surowy ekstrakt flawedo z cytryny naświetlany światłem słonecznym. Rozkład określono w określonych odstępach w trakcie 20 dni. Wyniki ochrony przeciwko mikroorganizmom uzyskane dla róż nych olejków eterycznych przedstawiono na fig. 8.

Połączenie poddanego działaniu słońca, surowego cytralu i 1-oktanolu w stężeniu odpowiednio 0,5% i 0,25% prowadziło do hamowania rozwoju rozkładu przez ponad 20 dni (fig. 8). Takie traktowanie zapewniało rozkład mniejszy niż 5%, podczas gdy kontrola wykazała rozkład powyżej 95%. Dodatkowo, mniej niż 10% rozkład owocu wystąpił po traktowaniu połączeniem 0,25% cytralu i 0,25% 1-oktanolu lub 0,25% cytralu i 0,25% traktowanego promieniowaniem słonecznym surowym, lub 0,125% cytralem, 0,125% traktowanym promieniowaniem słonecznym surowym ekstraktem i 0,125% 1-oktanolem.

P r z y k ł a d 12

Czysty limonen naświetlano światłem słonecznym przez trzy godziny. Bakteriobójczą kompozycję przygotowano przez rozpuszczenie traktowanego limonenu w wodnym roztworze zawierającym 25% etanol i detergent (Tween 20). Cytryny szczepione Penicillium 10⁴ spor/ml zanurzono przez jedną minutę jednokrotnie lub do czterech razy jeden dzień szczepieniu, w kompozycji obejmującej poddany działaniu światła słonecznego roztworu limonenu i przechowywano w temperaturze 20°C. Wpływ traktowanego promieniowaniem słonecznym limonenu na rozwój patogenu na owocach sprawdzano codziennie podczas przechowywania. Fig. 9 przedstawia wpływ liczby zanurzeń i długości każdego zanurzenia na ograniczenie rozkładu. Dane sugerują, że wyniki są w znacznym stopniu zależne od ilości materiału absorbowanego przez patogen lub tkanki owocu. Na fig. 9 wykazano, że limonen traktowany światłem słonecznym daje lepsze hamowanie rozkładu po większej ilości lub dłuższym zanurzeniu w porównaniu do jednego zanurzenia.

P r z y k ł a d 13

Czysty limonen naświetlano światłem UV (254 nm) przez trzy godziny. Bakteriobójczą kompozycję przygotowano przez rozpuszczenie traktowanego limonenu w wodnym roztworze zawierającym

PL 209 405 B1

25% etanol i detergent (Tween 20). Cytryny szczepione Penicillium 10⁴ spor/ml zanurzono przez jedną minutę jednokrotnie lub trzykrotnie w roztworze jeden dzień szczepieniu, w naświetlanym roztworze i przechowywano w temperaturze 20°C. W przypadku wielokrotnego zanurzenia, owoce pozostawiono do wysuszenia przez godzinę pomiędzy dwoma kolejnymi zanurzeniami.

Wpływ ultrafioletowego napromieniowania limonenu na rozwój patogenu na owocu sprawdzono przez jeden miesiąc. Fig. 10 przedstawia podobne hamowanie rozkładu przez roztwór 25% alkoholu i poddane jednemu zanurzeniu w 2500 ppm limonenu traktowanego UV (zdefiniowany jako 3UVL). Trzy kolejne zanurzenia w limonenie traktowanym UV, (zdefiniowane jako 3UVL3) dawały lepsze hamowanie rozkładu spośród tych procedur. Roztwór kontrolny stanowił wodny roztwór zawierający Tween 20.

P r z y k ł a d 14

Komórki gronkowca złocistego typu dzikiego (5 x 10⁸, OD600 = 0,219) hodowano przez 3 godziny w bulionie hodowlanym (cy/gp) w temperaturze 37°C w różnych stężeniach ekstraktów 50-100 pl. OD wyznaczano przy 600 nm.

Próbka 1 obejmowała 2000 ppm cytralu, 25% etanol i 2000 ppm Tween 20.

Próbka 2 obejmowała te same substancje, co próbka 1 wraz z β-CD 500 ppm i 300 ppm BHA.

Obie próbki 1 i 2 znacząco hamowały wzrost komórek Staphylococus aureus. Takie same kompozycje lecz bez cytralu (probówki 3, 4) nie hamują wzrostu patogenu (fig. 14).

P r z y k ł a d 15

Komórki Candida albicans typu dzikiego (1 x 10³) hodowano w bulionie hodowlanym w temperaturze 37°C przy różnych stężeniach ekstraktów 50-100 pl. OD wyznaczano przy 600 nm. Poniższe sposoby traktowania w 6 różnych probówkach były następujące:

Probówka 1. 2000 ppm Cytralu + 25% etanol + 2000 ppm Tween-20.

Probówka 2. 2000 ppm Cytralu + 25% etanol + 2000 ppm Tween-20 + 300 ppm BHA.

Probówka 3. 2000 ppm limonenu poddanego działaniu słońca + 2000 ppm Tween-20.

Probówka 4. 2000 ppm limonenu poddanego działaniu słońca + 25% etanol + 2000 ppm Tween-20.

Probówka 5. 25% etanol + 2000 ppm Tween-20.

Probówka 6. 25% etanol + 2000 ppm Tween-20 + 500 ppmp-CD + 300 ppm BHA.

2000 ppm cytralu w 25% etanolu i 2000 ppm Tween 20 lub tej samej substancji razem z β-CD 500 ppm, 300 ppm BHA lub limonen traktowany promieniowaniem słonecznym rozpuszczony zarówno w 25% etanolu, jak i w 2000 ppm Tween 20 całkowicie hamował wzrost komórek. Ta sama kompozycja substancji bez cytralu lub limonenu traktowanego promieniowaniem słonecznym (probówki 5 i 6) nie hamowała wzrostu patogenu (fig. 15).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Bakteriobójczy wodny preparat, znamienny tym, że zawiera:

(i) składnik olejku eterycznego, stanowiący cytral, przy czym stężenie cytralu wynosi od 0,1% do 1%;

(ii) przynajmniej jeden dodatkowy środek stabilizujący będący przeciwutleniaczem, wybrany z grupy obejmującej butylowany hydroksyanizol (BHA), kwas askorbinowy, butylowany hydroksytoluen (BHT), kwas izoaskorbinowy, α-tokoferol, β-karoten lub ich mieszaniny oraz (iii) imazalil w stężeniu od 5 ppm do 100 ppm.
2. Sposób hamowania rozwoju mikroorganizmów, znamienny tym, że podaje się skuteczną ilość wodnego preparatu określonego w zastrz. 1.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zabezpiecza się owoce i warzywa przeciwko gniciu po zbiorze.