CN109330997B - 活性成分紫苏醛在防治口咽念珠菌病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了天然活性成分紫苏醛在防治口咽念珠菌病中的用途，属于医药技术领域，本发明还揭示了单萜类化合物紫苏醛可以靶向于白色念珠菌的三大毒力因素：粘附性，菌丝相转变和分泌水解酶来抑制白色念珠菌对宿主产生的危害以及通过调节体内NLRP3炎症小体来起到抗菌、抗炎的功效。本发明采用实时荧光定量，免疫荧光，紫外光谱扫描等技术发现紫苏醛在较低剂量0.4μl/ml时就具有较强抗白色念珠菌功效。

Description

活性成分紫苏醛在防治口咽念珠菌病中的用途

技术领域

本发明涉及紫苏醛的新用途，属于医药技术领域。

背景技术

现如今，随着人类生活水平、医疗水平的不断改进、思想上的解放以及我国人口老龄化现象严重；糖尿病、艾滋病、癌症和肿瘤等免疫缺陷类疾病发病率不断上升；假牙技术、器官移植技术、化疗技术、静脉高营养技术以及免疫抑制剂和抗生素的大量使用，使得临床真菌感染率呈日渐上升趋势，且对人们的生命健康造成巨大得威胁，已成为这类感染患者的主要致死因素(1)。白色念珠菌是临床上威胁病患生命的主要条件致病真菌病原体，是人体的共生菌种，通常存在于人的口腔、上呼吸道、肠道、皮肤及生殖道等处，在通常情况下不会造成疾病，但是当微生态环境发生改变或人体免疫力低下时，白色念珠菌的粘附性会增加，并从酵母相转变为菌丝相，分泌天冬氨酸蛋白水解酶对人体产生致病性(2)。临床上有50％-60％的系统性真菌感染病例是由白色念珠菌引起的，且口咽念珠菌病鹅口疮就是由白色念珠菌感染所引起的常见疾病，常见于新生儿和免疫缺陷类疾病。据统计每年有1300万人感染鹅口疮，并且有40万人死于白色念珠菌感染，此类疾病的典型症状是口腔粘膜表面出现乳白色，微高起的斑膜，形似奶块，擦去斑膜后可见下方不出血的红色疮面，斑膜面积大小不等，可出现在舌，颊，颚或唇内粘膜上。受损的黏膜如若治疗不及时可不断扩大，蔓延到咽部、扁桃体、牙龈等，严重者可蔓延至食管、支气管，引起念珠菌性食管炎或肺念珠菌病，出现呼吸、吞咽困难，少数可并发慢性黏膜皮肤念珠菌病，影响终身免疫功能，甚至可继发其他细菌感染，造成败血症(3)。NLRP3炎症小体在当机体收到自身损伤信号和病原微生物刺激时便会启动先天性免疫系统激活炎症反应，使NLRP3，接头蛋白ASC以及Caspase1前体蛋白发生组装，随后Pro-caspase1自剪切成Caspase1，活化的Caspase1将再次切割白介素1β前体，释放炎症因子IL-1β到细胞外。NLRP3炎症小体活化所介导的促炎症因子的产生及细胞死亡是机体的一种自我保护性措施,它与机体抵御病原微生物感染、维持自身稳态密切相关(4)。目前，临床上对于抗白色念珠菌药物种类较为稀少，且由于白色念珠菌是真核生物，所开发的抗真菌药物较易产生毒副作用，将大大减少了抗真菌药物的选择。更为严峻的问题是在抗真菌药物选择较少的情况下，临床上出现大量的耐药菌株，为治疗白色念珠菌感染所引起的鹅口疮等念珠菌感染造成巨大困扰。所以开发安全高效，低毒有效，新型结构的抗真菌药物成为临床上治疗真菌感染迫在眉睫的问题。

我国地域辽阔，植被种类丰富，拥有着丰富的中草药资源，且在长期研究中发现，一些中药以及草本植物挥发油都有着抗真菌活性，药用植物作为一种具有治疗潜力的资源已经得到了历史的证明。紫苏(Perilla frutescens)原产于中国，现广泛分布于亚洲地区，具有特异的芳香气味，具有祛寒，清热解毒的功效，是一种较受欢迎的药食同源之物。紫苏醛(Perillaldehyde,PAE)，提取于紫苏中，一种天然单萜类化合物，为无色至浅黄液体，已被用于制备香精以及食品香料中。近期国际上的研究表明紫苏醛拥有较好抗菌，抗氧化，抗炎活性，并在抗食品腐败过程中有着较好的表现。目前，只有少量关于PAE抗真菌作用的报道，而对于紫苏醛抗白色念珠菌的研究更是鲜有报道，且迄今为止，国际上未见有紫苏醛对防治口咽念珠菌病的研究。本发明将揭示紫苏醛对与口腔念珠菌病得防治作用，为进一步开发临床抗真菌药物做出相应的努力。

1.Brown GD,Denning DW,Gow NA,Levitz SM,Netea MG,White TC.2012.Hiddenkillers:human fungal infections.Sci Transl Med 4:165rv13.doi:10.1126/scitranslmed.3004404

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发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供紫苏醛的新用途，具体的是紫苏醛在制备防治口咽念珠菌病药物中的用途，还提供了以紫苏醛为活性成分的防治口咽念珠菌病的药物组合物。

本发明提供了紫苏醛在制备防治口咽念珠菌病药物中的用途。

进一步的，所述的药物是防治白色念珠菌鹅口疮的药物。

进一步的，所述的药物是以紫苏醛为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

进一步的，所述的药剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。

进一步的，所述的外用制剂为洗剂、涂膜剂或搽剂。

进一步的，所述的药剂可用于开发药用牙膏、漱口水以及含片。

进一步的，所述的制剂中紫苏醛的浓度为0.4μL/mL-1.0μL/mL。

本发明的紫苏醛对白色念珠菌具有抑制作用，可用于制备防治口咽念珠菌病的药物。

附图说明：

图1为本发明体外抑制白色念珠菌生长的靶点探究

注：A图为白色念珠菌在0.4μL/mL、0.6μL/mL和0.8μL/mL紫苏醛处理后细胞外液酸化的测定，Control组为不给药组；B图为白色念珠菌在不同浓度紫苏醛处理后结晶紫染色测定其生物膜的生成量；C图为不同浓度紫苏醛处理后对白色念珠菌生物膜上麦角固醇合成量的影响；D图为紫苏醛对白色念珠菌生物膜合成以及菌丝生长相关基因的表达。

图2为本发明对体内白色念珠菌生长的抑制作用

注：Control组为不感染白色念珠菌的生长对照组；Ca组为感染白色念珠菌，且不给药组；2mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重2mg/kg PAE给药治疗组；3mg/kgPAE组为感染白色念珠菌并每日按体重3mg/kg PAE给药治疗组；4mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重4mg/kg PAE给药治疗组；20mg/kg FCZ组为感染白色念珠菌并每日按体重20mg/kg FCZ给药治疗对照组。A图为体内接种白色念珠菌后各组小鼠生存曲线图；B图为各组小鼠体重变化趋势图；C图为各组小鼠口腔白色念珠菌载菌量；D图为各组小鼠肾脏载菌量。

图3为本发明对小鼠舌头组织病理检测结果

注：Control组为不感染白色念珠菌的生长对照组；Ca组为感染白色念珠菌，并且不给药组；2mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重2mg/kg PAE给药治疗组；3mg/kgPAE组为感染白色念珠菌并每日按体重3mg/kg PAE给药治疗组；4mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重4mg/kg PAE给药治疗组；20mg/kg FCZ组为感染白色念珠菌并每日按体重20mg/kg FCZ给药治疗对照组。A图和B图分别为各组小鼠舌头在20倍镜和40倍镜下HE染色结果。C图和D图分别为各组小鼠舌头在20倍镜和40倍镜下PAS染色结果。

图4为本发明对NLRP3炎症小体的抑制作用

注：Control组为不感染白色念珠菌的生长对照组；Ca组为感染白色念珠菌，并且不给药组；2mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重2mg/kg PAE给药治疗组；3mg/kgPAE组为感染白色念珠菌并每日按体重3mg/kg PAE给药治疗组；4mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重4mg/kg PAE给药治疗组；20mg/kg FCZ组为感染白色念珠菌并每日按体重20mg/kg FCZ给药治疗对照组。A图为Western Blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达情况的影响；B图和C图为Caspase-1和ASC灰度值结果分析；D图为ELISA检测各组小鼠舌头中促炎因子IL-1β的释放。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

实施例1：紫苏醛对白色念珠菌外液酸化影响测定

用无菌PBS将白色念珠菌细胞悬液稀释至10⁷CFU/ml，加入SDB中200rpm，30℃振荡培养48h。将菌悬液转置50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃上清。加入20ml无菌水重悬洗涤2次。并将白色念珠菌重悬于50mM的氯化钾溶液中，使其终体积为40ml。将菌悬液置于4℃冰箱进行过夜饥饿处理。次日加入不同浓度的紫苏醛，使其终浓度分别为0.4μl/ml，0.6μl/ml，0.8μl/ml，对照组加入相同体积的Tween 80，并用50mM的氯化钾溶液将终体积调整至45ml，室温孵化10min。再次5000rpm离心10min，弃上清，加入10％的葡萄糖渗透液20ml诱导酸化。每隔10min测量一次菌悬液的胞外PH，总时间为1h。实验重复3次。

实验结果

如图1A所示，PAE可以破坏白色念珠菌细胞膜的通透性，并且随着时间的推移，对照组的细胞外pH值保持下降趋势，而药物治疗组的细胞外pH值则停止下降趋势。特别是在0.6和0.8μl/ml PAE处理组中，10分钟后细胞外pH不再降低，并且在60分钟时0.4μl/mlPAE处理组的外部液体酸化被完全抑制。

实施例2：紫苏醛对口咽念珠菌病的防护作用

紫苏醛对由白色念珠菌引起的口咽念珠菌病具有较好的防护作用。

1.实验分组

小鼠装笼后被随机分为6组，Control组为不感染白色念珠菌的生长对照组；Ca组为感染白色念珠菌，并且不给药组；2mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重2mg/kgPAE给药治疗组；3mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重3mg/kg PAE给药治疗组；4mg/kg PAE组为感染白色念珠菌并每日按体重4mg/kg PAE给药治疗组；20mg/kg FCZ组为感染白色念珠菌并每日按体重20mg/kg FCZ给药治疗对照组。

2.模型的构建

本实验选取6周龄大的C57BL/6雄性小鼠。经适应性饲养一周后，进行免疫抑制造模。在造模的前一天在小鼠的饮水中给予0.5mg/ml的盐酸四环素。在造模的第一天和第三天进行肌肉注射醋酸可的松。醋酸可的松溶于含有0.5％Tween-20的PBS溶液中，注射量为225mg/kg。在造模当天给小鼠腹腔注射甲苯噻嗪10mg/kg。10-15分钟后腹腔注射1.25mg/g的乌来糖将小鼠麻醉，用刀片在小鼠舌背表面轻轻刮拭，但是不引起出血和红肿。然后将100μl含有6*10⁸yeast ml-1的白色念珠菌悬液注入小棉花中，让它吸满菌液至饱和。然后将棉花塞入小鼠口中两个小时。在后续的实验中每天向治疗组小鼠口腔中注射100μl的0.4μl/ml、0.6μl/ml和0.8μl/ml的紫苏醛清洗口腔，阳性对照氟康唑治疗组使用同样的方式进行治疗。造模组每天用蒸馏水冲洗口腔，以防止因为冲洗时因液体的流速冲走白色念珠菌，使造模组与治疗组达到平行。造模期间每日称量小鼠的体重，以及记录其生存状况。

2.载菌量的测定

小鼠在感染后第五天处死。部分取小鼠的舌头和肾脏进行涂布，进行载菌量的检测。将组织加入1ml的PBS匀浆后，稀释200倍后滴入100μl涂布于含有20μg/ml的氯霉素SDA(葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g溶于1L水中)平板上，放入30℃培养箱中培养两天进行记数。

3.组织病理检测

HE染色

冰冻切片样本前处理：回温：将预先制作好并保存在-20℃冰箱中的冷冻切片取出回温，放置37℃孵育箱中烤片2小时。水合：将回温好的切片，水中浸泡30-60秒左右。染色：用蒸馏水润湿组织1-2分钟，甩掉水分，但要确保蒸馏水润湿整个组织，并均匀分布。苏木素核染染液染色5分钟左右，水洗3-5秒。

伊红浆染染液染色2分钟，在水洗1-2分钟，滤纸吸干或自然晾干。乙醇梯度脱水，盖上树胶封片镜检。

PAS染色

冷冻切片直接入蒸馏水30-60秒，是蒸馏水润湿整个组织。自来水冲洗2-3分钟，再用蒸馏水浸洗2次。入过碘酸溶液，室温放置5-8分钟，一般不宜超过10分钟。自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。入Schiff Reagent，置于室温阴暗处浸染10-20分钟。自来水冲洗10分钟。入苏木素染色液，染细胞核1-2分钟。酸性乙醇分化液分化2-5秒。自来水冲洗10-15分钟，更换蒸馏水清洗，使其反蓝。逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固镜检。

4.实验结果

4.1紫苏醛对小鼠口咽念珠菌病治疗效果的初步结果

如图2所示，与高浓度PAE治疗组和FCZ处理组相比，接种了白色念珠菌且不予治疗的WT小鼠具有较低的存活率(P<0.01，图2A)，所受感染的小鼠在7天后仅有40％的存活率。然而4mg/kg PAE和20mg/kg FCZ治疗组小鼠存活率为77％和76％。2mg/kg和3mg/kg治疗小鼠也拥有着57％和63％的存活率，仅用盐水给药的生长对照小鼠没有发生死亡。如图2B所示，与Ca组相比，PAE治疗组，尤其是4mg/kg PAE治疗组发现紫苏醛能显著缓解了体重的下降趋势。

4.2紫苏醛降低小鼠口腔以及肾脏中白色念珠菌含量

如图2C所示，PAE能明显减少小鼠口腔中白色念珠菌的定殖，在舌组织中的菌落形成单位计数所示，与对照组相比，4mg/kg PAE处理的小鼠恢复至接近正常小鼠舌头载菌量水平(P>0.05)。且4mg/kg PAE处理组小鼠舌背表面白色念珠菌含量稍优于氟康唑组。同样，PAE还显著降低了小鼠肾脏中白色念珠菌的数量(图2D)，在4mg/kg PAE处理组中肾脏载菌量也恢复接近至正常水平。

4.3紫苏醛改善小鼠舌背表面组织损伤

如图3A和B所示未接种白色念珠菌的对照组小鼠具有完整的舌乳头和角质层。与未感染的小鼠形成鲜明对比的是，受感染小鼠的舌乳头已无法识别，产生大量中性粒细胞以及角质层出现明显的肿胀。在2和3mg/kg PAE治疗组小鼠的舌头出现明显的改善效果。虽然仍有一些嗜酸性粒细胞和中性粒细胞出现在感染部位，但与感染的小鼠相比，出现较少的炎症因子，并显示出组织正在进行修复的趋势。在4mg/kg PAE和20mg/kg FCZ处理组中，舌背表面已恢复接近至与具有免疫活性的小鼠同等水平。且FCZ和高浓度的PAE处理的小鼠几乎完全抵抗感染，舌背表面具有极低的真菌负荷。此外，我们使用PAS染色来检测小鼠口腔表面上真菌的定殖状况。如图4C和D所示，感染组表现出广泛的真菌菌丝侵入粘膜的浅表上皮层。白色念珠菌破坏了乳头和角化的浅表上皮的整体结构，特征性白色念珠菌病变在感染小鼠的舌头上很容易看到。相反，PAE处理的小鼠中的舌上皮仅表现出浅表性菌丝侵袭和完整的组织结构。与免疫活性小鼠相同，用4mg/kg PAE和20mg/kg FCZ处理的感染小鼠几乎未在表面上发现白色念珠菌细胞侵入上皮组织。HE和PAS染色结果显示PAE在治疗口腔念珠菌病方面是高效的。

实施例3：紫苏醛对NLRP3炎症小体的抑制

Western Blot检测紫苏醛对小鼠NLRP3炎症小体的影响

实验步骤

1、制备0.8％的分离胶以及浓缩胶，每孔加入40μg的变性蛋白质样品。80V，30min跑出浓缩胶后，改为120V，60min跑至分离胶底部。将胶以350mA，60min转印至孔径为0.2μm的PVDF膜上。将膜放入TBS中平衡5min后，用奶粉室温封闭1h。TBST洗膜，10min*3次。孵一抗4℃过夜。TBST洗膜，10min*3次。室温孵育二抗40min。TBST洗膜，10min*3次。滴加ELC显色液显色。

实验结果

如图4所示，紫苏醛可以显著降低Caspase1以及ASC蛋白的表达，从而抑制NLRP3炎症小体的组装，降低舌头中促炎因子IL-1β的含量，进一步缓解由白色念珠菌引起的口腔炎症等一系列炎症反应。

研究结果证明了紫苏醛对白色念珠菌引起的口咽念珠菌病有明显的治疗作用。

本发明中紫苏醛对白色念珠菌具有显著地抑制作用，且对口咽念珠菌病有较好的治疗效果，可用于制备防治白色念珠菌口咽念珠菌病的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.紫苏醛在制备防治鹅口疮病药物中的用途, 所述的药物是以紫苏醛为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成，所述的药物可以通过抑制NLRP3炎症小体从而缓解由白色念珠菌引起的口腔炎症，所述药物中紫苏醛的浓度为0.4 µL/mL - 1.0 µL/mL。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物制剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的外用制剂为洗剂、涂抹剂或搽剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物可用于开发药用牙膏、漱口水和含片。

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