KR102407606B1

KR102407606B1 - 송악 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR102407606B1
Application number: KR1020200051003A
Authority: KR
Inventors: 김기영; 김다슬
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2022-06-10
Also published as: KR20210132512A

Abstract

본 발명은 송악 추출물을 포함하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

송악 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물{COMPOSITION COMPRISING HEDERA RHOMBEA FOR INHIBITING THE FORMATION OF BIOFILM}

칸디다는 사람에게 표면 또는 전신 감염을 유발하는 진균 병원체로, 병원성의 발달과 다제 내성 특성의 발달로 인하여 숙주 내부에서 지속적으로 생존 할 수 있으며, 그로 인하여 현재는 종종 치료가 잘 되지않는 원인 균 중에 하나이다. 칸디다의 병원성의 한 가지 특징은 바이오필름을 형성하는 능력으로, 숙주 면역계 및 항진균제와 같은 외부 요인으로부터 칸디다들을 보호하는 기능을 하고 있다.

바이오필름은 구강, 피부, 주방, 욕실, 배관 등 다양한 공간에 존재하며, 한번 형성된 바이오필름은 쉽게 제거되지 않기 때문에 빠른 진균 증식의 원인이 된다. 바이오필름 형성은 표면 물질의 부식, 병원균에 의한 감염 등의 원인이 되며, 구강 내에서는 충치 등과 같은 구강 질환을 유발하기도 한다.

바이오필름은 당 성분 등에 의해 만들어지는 복합체 내에 수용된 미생물 집단으로서, 상피, 폐 및 심장과 같은 표면 뿐 아니라 중앙 정맥 및 비뇨기 카테터, 자궁 내 장치 및 보철 심장판막과 같은 이식된 의료장치에 형성될 수 있다. 바이오필름은 미생물에 많은 이점을 제공하며, 특히 항진균제에 대한 내성을 증가시킨다. 이로 인해 바이오필름에 관한 감염 및 합병증의 발생이 증가하고 치료가 힘들어진다. 또한, 미생물의 바이오필름은 숙주 면역계에 영향을 미쳐 미생물의 생존이 증가하게 된다.

기존에는 이러한 바이오필름의 형성을 억제하기 위해 바이오필름을 형성하는 균주의 성장을 저해하는 방식을 이용하였으나, 체내에는 유해한 균과 유익한 균이 동시에 존재하고 있음에 따라 무조건적인 살균 보다는 세포의 성장은 유지하면서 바이오필름의 형성만을 억제하는 기술이 필요로 되고 있다.

또한, 기존 항진균제의 오남용으로 인한 미생물의 내성 획득 등 다양한 문제가 발생함에 따라, 항진균제 내성 획득 과정에 중요한 요소인 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는 물질의 발굴에 대한 요구가 증가하고 있다.

한국등록특허 제10-0970598호

본 발명의 목적은 송악 추출물(Hedera rhombea)을 포함하는, 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 이용한 바이오피름 형성 억제방법을 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 포함하는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항진균용 조성물을 포함하는 진균 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항진균용 조성물을 포함하는 항진균용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, 송악 추출물(Hedera rhombea)을 포함하는, 바이오필름 형성 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 “송악 추출물(Hedera rhombea)”은 두릅나무과에 속하는 상록덩굴식물로서 제주도를 비롯하여 전남, 전북, 경남, 경북 및 충남 등지의 산기슭 숲속에서 자생하며, 일본, 중국 및 대만에도 분포한다. 특히 상춘등자(常春藤子)로도 불리는 열매와 상춘등(常春藤)이라 불리는 줄기와 잎에는 루틴(rutin), 키주타사포닌 K₅(kizutasaponin K₅), 카페산(caffeic acid) 및 헤데라제닌-3-아라비노사이드(hederagenin-3-arabinoside)와 같은 다양한 성분들이 들어있어 항경련, 진통, 혈액 응고억제, 부종억제 및 항염증 작용 등 다양한 효능 효과가 있는 것으로 보고된 바 있으며, 본 발명에서는 진균에 의해 생성된 바이오필름에 대해 우수한 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.

상기 송악은 60℃ 이상의 고온의 물을 용매로 하여 추출될 수 있으며, 또는 알코올을 용매로 하여 추출될 수 있다. 구체적으로, 물, C₁내지 C₄의 무수 또는 저급 알코올, 상기 물과 저급 알코올의 혼합 용매, 아세톤, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 용매로부터 수득된 것일 수 있다.

본 발명에서, “바이오필름(biofilm)”은 미생물에 의하여 형성된 막 모양 구조체이며, 표면에 연결된 미생물 세포층으로 이루어진 잘 구성된 미생물계로 복잡한 구조적 기능적 특징을 가지고 있다. 생체막은 미생물의 대사 과정에 영향을 주는 물리 화학적 구배를 갖는다. 바이오필름을 형성하는 세포는 부유세포보다 항생제, 항진균제에 대한 저향성이 1000배 이상 높으며, 바이오필름 형성은 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 한다(Anderson and O’Toole et al., 2008, Bacterial Biofilms 322:85-105).

본 발명에서, “바이오필름 형성 억제”는 상기와 같이 미생물에 의해 생성된 구조체의 형성을 감소시키거나, 형성이 불가능하게 하는 것을 말한다. 이러한 바이오필름의 형성 억제효과는 미생물의 생육, 증식을 억제하거나 사멸시키는 효과와는 무관하게 고체 표면에 들러붙는 혼합체의 형성을 저해하는 효과를 포함한다.

미생물이 바이오필름을 형성함으로써 항진균제 내성을 획득하는 과정은 다음과 같다. 첫 번째는 항진균제가 바이오필름을 투과하지 못해 항진균제가 바이오필름 내의 진균에 영향을 미치지 못하기 때문인데, 이는 세포 외 기질이 가지는 전하에 의한 것으로 음전하를 띄는 바이오필름 매트릭스에 양전하를 띄는 항진균제들이 결합함으로써 항진균제가 바이오필름을 투과하기 어렵기 때문에 내성이 발생한다. 두 번째는 바이오필름에 의해 미생물이 충분한 영양소와 산소를 공급받지 못해 바이오필름의 생장에 영향을 미치면서 생기는 내성이다. 산소와 영양소는 미생물 성장에 큰 영향을 미치는 요소이다. 바이오필름 내의 미생물은 바이오필름에 의해 영양소와 산소 공급 등이 제한되면서 대체로 낮은 대사 활동과 낮은 성장률을 가지며 이는 약물에 대한 저항성을 높이는 역할을 한다.

구체적으로, 상기 바이오필름은　칸디다(Candida)에 의해 형되는 것일 수 있다.

상기 칸디다는 칸디다 알바칸스(Candida albicans), 칸디다 안타르티카(Candida Antarctica), 칸디다아우리스(Candida auris), 칸디다 블랭키(Candida blankii), 칸디다 브라카렌시스(Candida bracarensis), 칸디다 브로멜리아아룸(Candida bromeliacearum), 칸디다 듀블리엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다트로피칼리스(Candida tropicalis) 및 칸디다파라프실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로 칸디다 알바칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다트로피칼리스(Candida tropicalis) 및 칸디다파라프실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에서, “칸디다 알바칸스(Candida albicans)”는 칸디다 진균 중에서 가장 흔한 균으로, 인체 내의 기회성 질병 유발 진균으로 분류되어 인체 내에서 공생하면서 평소에는 어떠한 부작용도 초래하지 않으나, 인체의 면역력이 떨어질 경우 유익균과의 균형이 깨지면서, 진균군락 및 바이오필름을 만들어 장 내를 장악하고, 장기, 점막 감염 및 혈액 감염 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, “칸디다 글라브라타(Candida glabrata)”는 반수체 효모로, 사람에게 정상적으로 존재하는 균이지만, 인체의 면역력이 떨어지면 감염을 일으킬 수 있는 균이다. 주로 칸디다증은 유아나 노인, 면역억제제 사용자, 항암치료를 받는 암환자, 후천성 면역결핍증 환자에게 잘 발생하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, “칸디다트로피칼리스(Candida tropicalis)”는 호중구 감소증의 흔한 병원체로 혈류를 통해 말초 기관으로 퍼지는 진균으로 알려져 있다.

본 발명에서, “칸디다파라프실로시스(Candida parapsilosis)”는 가축, 곤충 및 토양으로 분리되는 병원체로서, 비뇨 생식관에 영향을 미치거나 심지어 전신 감염을 일으키는 원인균으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 칸디다 알바칸스, 칸디다 글라브라타, 칸디다트로피칼리스 및 칸디다파라프실로시스 모두에 대하여 바이오필름 형성 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 1 및 표 1). 본 발명의 조성물을 이용하여 바이오필름 형성 억제 용도로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 바이오필름 형성 및 병원성에 영향을 주는 균사-특이적(hyphal-specific) 유전자 ALS 3, ECE 1, HWP 1; Ras1-cAMP-Efg1 신호경로 관여 유전자 CYR 1, EFG 1, RAS 1; MAP 키나아제 신호경로 관여 유전자 ADH 5, CSH 1, GSC 1, ZAP 1; Cph-Tec 1 신호경로 및 세포 외 기질에 관여하는 유전자 TEC 1, HST 7의 발현이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였는 바(도 4), 바이오필름 형성 억제가 유전자 발현 단계부터 억제되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 측면은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물이 우수한 바이오필름 형성 억제 효과를 나타냄에 따라, 본 발명의 조성물을 형성된 바이오필름에 직접 처리하여 억제시키거나, 바이오필름의 형성이 예상되는 표면 또는 바이오필름이 형성될 경우 문제가 생길 수 있는 표면에 바이오필름 형성의 예방을 위해 처리할 수 있다.

이러한 표면은 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물의 표면 뿐 아니라 필터, 수처리막, 마스크소재 등 바이오필름의 억제가 필요한 곳이면 제한없이 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 포함하는 항진균용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “항진균(Antifungal)”은 진균의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 것을 말하며, “항진균용 조성물”은 진균의 생육을 저해하는 활성을 가지는 조성물로서, 항미생물제를 총칭하는 의미일 수 있고, 항진균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다.

구체적으로, 상기 항진균용 조성물은 다른 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 항진균제는 미코나졸(miconazole)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명 일 실시예에서는 미코나졸과 함께 처리한 경우, 송악 추출물을 단독 처리한 경우에 비해 바이오필름 형성 억제 효과가 증가하고, 항진균 효과가 우수한 것을 확인하였는 바(도 2), 다른 항진균제와 복합 또는 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 항진균용 조성물을 포함하는 진균 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서 병원성 억제 효과를 확인한 결과, 병원성에 중요한 영향을 주는 효모 형태로부터 균사 형태로의 이형 전이가 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였는 바(도 3), 본 발명의 조성물은 진균에 의한 감염증에 대한 예방 또는 치료 용도로 적용될 수 있다.

구체적으로, 상기 진균은 칸디다(Candida)일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 진균에 의한 감염증은 칸디다 알바칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis) 또는 이들의 조합을 원인균으로 하여 발생하는 질염, 피부감염, 호흡기계 감염, 식중독, 여드름, 만성 안검염, 안구내염, 구강염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 칸디다 균주에 의해 발생되는 모든 감염증을 포함한다.

또한 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 다른 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 항진균제는 미코나졸인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 송악 추출물 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 구체적으로 경구용 제형 또는 비경구형 제형으로 적용될 수 있다. 경구형 제형으로 액제, 정제 형태를 적용할 수 있으며, 비경구형 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다. 더욱 구체적으로는 주사제 형태일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 적용될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 또 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 필요에 따라 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 항진균용 조성물을 포함하는, 항진균용 식품 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 항진균용 식품 조성물은 진균 감염에 대한 예방 또는 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에서 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의도이다. 구체적으로, 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 송악 추출물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 의료 및 기타 산업 분야에서 바이오필름 형성을 억제하기 위한 용도로서 다양하게 사용될 수 있다.

구체적으로, 의료 분야에서는, 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물의 표면에 형성되는 바이오필름의 형성을 억제하는데 사용될 수 있으며, 역삼투막 등과 같은 다양한 수처리막의 표면에 형성되는 바이오필름의 형성을 억제하는 데에도 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 진찰 및 진단기기, 임상검사기기, 방사선기기, IUD, 기관 튜브, 각종 카테터, 정형외과 기기 등과 같은 수술관련기기, 병원설비 및 응급장비, 비만 및 건강관련기기, 콘택트 렌즈, 스텐트, 밸브, 성형 보형물 등과 같은 다양한 의료 분야에 형성된 바이오필름의 형성 억제에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않고 다양한 식품 및 세탁기, 가습기, 식기 세척기 등과 같은 다양한 생활용품의 표면에 형성되는 바이오필름의 형성을 억제하는 데에도 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 송악 추출물(Hedera rhombea)을 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물은 의료기기, 의료용 재료 또는 수처리막의 표면 등에 형성되는 바이오필름의 형성 억제에 활용될 수 있다. 또한, 상기 송악 추출물은 천연물에서 유래한 성분을 포함하므로 인체에 독성이 낮은 물질로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 바이오필름의 형성을 억제함으로써, 항진균제 내성을 억제하면서 미생물 감염을 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 송악 추출물에 의한 칸디다 알바칸스(Candida albicans, C. albicans)의 바이오필름 형성 억제 정도를 확인한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 항진균제와 송악 추출물을 C. albicans에 처리한 경우의 복합 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 칸디다의 이형 전이(Dimorphic transition)의 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A, B: RPMI 1640 배지 이용, C, D: 10% FBS의 YPD 배지 이용)
도 4는 송악 추출물에 의한 C. albicans의 바이오필름 및/또는 병원성에 관여하는 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: ALS 3, ECE 1, HWP 1 확인 결과, B: CYR 1, EFG 1, RAS 1 확인 결과, C: ADH 5, CSH 1, GSC 1, ZAP 1 확인 결과 D: TEC 1, HST 7 확인 결과)
도 5는 송악 추출물에 의한 C. albican의 성장 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 1. 송악 추출물의 제조

송악(Hedera rhombea)은 잎과 줄기를 물에 세척하여 건조시킨 후, 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 40℃~80℃의 물을 용매로 하여 추출하였으며, 이후 5% 내지 10%의 추출물을 획득하였다.

실시예 1. 바이오필름 형성 억제 효과 확인

송악 추출물에 대한 칸디다(Candida)의 바이오필름 형성을 저해하는지 확인하기 위하여, 송악 추출물을 농도에 따라 처리하여 바이오필름 형성 분석(Biofilm formation assay)를 수행하였다.

구체적으로, 96 웰 플레이트에 OD₆₀₀=0.1의 상기 C. albicans, C. tropicalis, C. grabrata, C. parapsilosis 를 각각 넣어준 후 송악 추출물을 최대 100 μg/mL로부터 2 배씩 희석하여 처리하였다. 각 플레이트는 30ºC에서 24시간 배양한 다음, 바이오필름 형성 억제하는 정도를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었따. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행하였다.

구분	번호	생물막 저해 농도 (IC50; ug/ml)
Candida albicans	KCTC7965	10.0
Candida tropicalis	KCTC17762	75.0
Candida tropicalis	KCTC7212	12.5
Candida grabrata	KCTC7219	7.25
Candida parapsilosis	KACC45480	5.00

그 결과, 송악 추출물은 칸디다(Candida)의 바이오필름 형성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 1 및 표 1).

실시예 2. 송악 추출물과 항진균제의 복합 효능 확인

상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이 바이오필름 형성을 저해하는 송악 추출물이 기존의 항진균제에 대한 감수성에 변화를 줄 수 있는지 확인하고자, 칸디다 알바칸스(Candida albicans, C. albicans)에 기존의 항진균제와 혼합 처리하여 항진균 활성을 확인하였다.

구체적으로, 24시간 동안 형성시킨 바이오필름에 6.25 및 25 μg/mL 농도의 송악 추출물(Hedera rhombea, HR)을 기존 항진균제인 3.125 μg/mL의 미코나졸(miconazole, MCZ)을 동시에 처리하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 모든 실험은 3회 실시하였다.

그 결과, 송악 추출물 + 미코나졸을 동시에 처리하여 바이오필름 형성을 억제한 경우의 C. albicans의 수가 미코나졸 단독 처리시 보다 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 2).

상기 결과는 송악 추출물이 칸디다의 바이오필름 형성을 억제함으로써 미코나졸 항진균제의 칸디다에 대한 감수성을 증가시킨 것임을 시사한다.

실시예 3. 칸디다의 병원성 억제 효과 확인

송악 추출물에 대한 C. albicans의 병원성 억제 효과를 확인하기 위하여, 칸디다의 병원성에 중요한 영향을 끼치는 효모 형태(yeast form)으로부터 균사 형태(Hyphae form)로의 이형 전이(Dimorphic transition) 억제 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, RPMI 1640 및 10% FBS를 포함하는 YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)를 이용하여 균사의 형성을 유도한 다음 송악 추출물 1.56 μg/mL, 6.25 μg/mL 및 25 μg/mL의 농도로 각각 처리하였다.

그 결과, 송악 추출물을 처리한 배지 모두에서 칸디다의 이형 전이가 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(도 3). 상기 결과를 통해 송악 추출물이 바이오 필름 형성을 억제하면서, 칸디다의 이형 전이를 저해하여 칸디다의 병원성을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 송악 추출물에 의한 바이오필름 형성 및 병원 관련 유전자의 발현 억제 효과 확인

송악 추출물이 C. albicans에 대한 균사-특이적(hyphal-specific) 유전자, Ras1-cAMP-Efg1 신호경로, MAP 키나아제 신호경로, Cph-Tec 1 신호경로 및 세포 외 기질 관련 유전자의 발현을 저해시키는지 확인하기 위해 qRT-PCR를 수행하였다.

qRT-PCR 수행에 사용한 프라이머는 하기 표 2에 정리한 바와 같다. qRT-PCR 프라이머 수행 조건으로는 40 싸이클로 95℃에서 15초, 40℃에서 60초, 72℃에서 30초로 수행하였다.

유전자			프라이머 종류	프라이머 서열(5'-3')	서열번호
hyphal-specific genes	ALS 3	forward	GGTTATCGTCCATTTGTTG	1
	ALS 3	reverse	TTCTGTATCCAGTCCATCT	2
	ECE 1	forward	ACAGTTTCCAGGACGCCAT	3
	ECE 1	reverse	ATTGTTGCTCGTGTTGCCA	4
	HWP 1	forward	ACAGGTAGACGGTCAAGG	5
	HWP 1	reverse	GGGTAATCATCACATGGTTC	6
Ras1-cAMP-Efg1 pathway related genes	CYR 1	forward	GTTTCCCCCACCACTCA	7
	CYR 1	reverse	TTGCGGTAATGACACAACAG	8
	EFG 1	forward	TTGAGATGTTGCGGCAGGAT	9
	EFG 1	reverse	ACTGGACAGACAGCAGGAC	10
	RAS 1	forward	GAGGTGGTGGTGTTGGTA	11
	RAS 1	reverse	TCTTCTTGTCCAGCAGTATC	12
MAP Kinases pathway related genes	ADH 5	forward	ACCTGCAAGGGCTCATTCTG	13
	ADH 5	reverse	CGGCTCTCAACTTCTCCATA	14
	CSH 1	forward	CGTGAGGACGAGAGAGAAT	15
	CSH 1	reverse	CGAATGGACGACACAAAACA	16
	GSC 1	forward	CCCATTCTCTAGGCACGA	17
	GSC 1	reverse	ATCAACAACCACTTGCTTCG	18
	ZAP 1	forward	ATCTGTCCAGTGTTGTTTGTA	19
	ZAP 1	reverse	AGGTCTCTTTGAAAGTTGTG	20
Cph-Tec 1 pathway and extracellular matrix related genes	TEC 1	forward	GCACTGGCTTCAAGCTCAAA	21
	TEC 1	reverse	GCTGCTGCACTCAAGTTCTG	22
	HST 7	forward	GCCAGTATGGTCGGAGGAT	23
	HST 7	reverse	ACATAGGCATCGTCTTCGTC	24

그 결과, 송악 추출물이 균사-특이적(hyphal-specific) 유전자, Ras1-cAMP-Efg1 신호경로, MAP 키나아제 신호경로, Cph-Tec 1 신호경로 및 세포 외 기질 관련 유전의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 4).

상기 결과는 송악 추출물이 바이오필름 형성 및 병원성에 관여하는 유전자의 발현을 억제하며, 결과적으로 바이오필름의 형성을 억제함을 의미한다.

실시예 5. 송악 추출물에 의한 박테리아 성장 억제 확인

상기 실험결과에서 확인한 송악 추출물의 바이오필름 형성 저해 효과가 균의 성장을 억제하기 때문에 당연히 수반되는 효과인지, 또는 직접적으로 바이오필름 자체의 형성을 억제하는 효과를 나타내는 것인지 확인하기 위하여, 송악 추출물에 의한 C. albicans의 생존을 확인하였다.

구체적으로, C. albicans의 생존을 확인하기 위해 100 μg/ml 농도의 송악 추출물을 처리하여 박테리아의 성장을 관찰하였다. 모든 실험은 3회 실시하였다.

그 결과, 송악 추출물은 C. albicans의 생존에 전혀 영향을 주지 않음을 확인하였다. 이에 따라, 송악 추출물이 특히 바이오필름 형성을 억제함으로써 항진균 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5).

즉, 본 발명의 송악 추출물은 미생물 진균의 성장과 무관하게 바이오필름의 형성만을 억제하는 것을 특징으로 하는 바, 이는 무차별적인 살균 보다는 병원성만을 억제할 수 있도록 함으로써 일반 항진균제보다 저항성이 적게 유발이 된다.

본 발명의 조성물은 항진균제의 내성이 점차 큰 문제가 되고 있는 현 시점에서 감염성 진균의 성장에는 별다른 영향을 미치지 않아 항진균제 내성 문제가 발생되지 않으면서, 동시에 병원성을 나타내는 바이오필름 및/또는 단백질의 생성을 억제하여 감염성 질환 등에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> COMPOSITION COMPRISING HEDERA RHOMBEA FOR INHIBITING THE FORMATION OF BIOFILM <130> 20PP30241 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALS 3_forward <400> 1 ggttatcgtc catttgttg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALS 3_reverse <400> 2 ttctgtatcc agtccatct 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE1_reverse <400> 3 acagtttcca ggacgccat 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE1_reverse <400> 4 attgttgctc gtgttgcca 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HWP1_forward <400> 5 acaggtagac ggtcaagg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HWP1_reverse <400> 6 gggtaatcat cacatggttc 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR1_forward <400> 7 gtttccccca ccactca 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR1_reverse <400> 8 ttgcggtaat gacacaacag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFG1_forward <400> 9 ttgagatgtt gcggcaggat 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFG1_reverse <400> 10 actggacaga cagcaggac 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAS1_forward <400> 11 gaggtggtgg tgttggta 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAS1_reverse <400> 12 tcttcttgtc cagcagtatc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5_forward <400> 13 acctgcaagg gctcattctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5_reverse <400> 14 cggctctcaa cttctccata 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSH1_forward <400> 15 cgtgaggacg agagagaat 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSH1_reverse <400> 16 cgaatggacg acacaaaaca 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSC1_forward <400> 17 cccattctct aggcacga 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSC1_reverse <400> 18 atcaacaacc acttgcttcg 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAP1_forward <400> 19 atctgtccag tgttgtttgt a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZAP1_reverse <400> 20 aggtctcttt gaaagttgtg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEC1_forward <400> 21 gcactggctt caagctcaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEC1_reverse <400> 22 gctgctgcac tcaagttctg 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HST7_forward <400> 23 gccagtatgg tcggaggat 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HST7_reverse <400> 24 acataggcat cgtcttcgtc 20

Claims

송악(Hedera rhombea) 추출물을 포함하는, 칸디다(Candida)에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물에 있어서,
상기 송악 추출물은 물을 용매로 추출하여 수득한 것인, 바이오필름 형성 억제용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 칸디다는 칸디다 알바칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다트로피칼리스(Candida tropicalis) 및 칸디다파라프실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제1항의 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법.
제1항의 조성물을 포함하는 항진균용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 진균은 칸디다(Candida)것인, 항진균용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 항진균용 조성물은 다른 항진균제를 추가로 포함하는 것인, 항진균용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 항진균제는 미코나졸(miconazole)인 것인, 항진균용 조성물.
제6항의 항진균용 조성물을 포함하는, 진균 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 진균은 칸디다(Candida)인 것인, 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 다른 항진균제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 항진균제는 미코나졸인 것인, 약학적 조성물.
제6항의 항진균용 조성물을 포함하는, 항진균용 식품 조성물.