NO330037B1 - Mikrobiocidal vandig formulering og en fremgangsmate for inhibering av mikrobiell utvikling - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår midler for å inhibere mikrobiell utvikling. Mer spesielt angår opprinnelsen formuleringer og fremgangsmåter for å inhibere mikrobiell utvikling i lett bedervelige landbruksprodukter, husholdning og human hygiene, omfattende essensiell oljekomponenter eller deres derivater, oppnådd ved eksponering for lysstråling eller ved olcsidermg, sammen med stabilisatorer.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Forråtnelse av lett fordervelige landbruksprodukter forårsakes av mikrobiell infeksjon. Slike produkter oppbevares vanligvis i lange nok perioder under betingelser som tillater formering av ulike eksisterende mikroorganismer og svært ofte en høy prosent av produktet infisert. I tillegg til det åpenbart betydelig økonomiske tap forårsaket av den forringelse, produserer noen av disse mikroorganismene toksiske og karsinogene metabolitter som er skadelige for mennesker.

Kontroll av patogen infeksjon av lett bedervelige landbruksprodukter oppnås i dag hovedsakelig ved anvendelse eksogene, syntetiske fungisider og/eller bakterisider. Disse syntetiske kjemikalier har imidlertid toksiske rester i produktet. Utvikling av resistente stammer av mikroorganismer er observert. Som et resultat er flere slike fungisider og bakterisider trukket tilbake av myndighetene. Resttoksisiteten og den potensielle utfasingen ga opphav til utvikling av alternativer til de nåværende kjemikalier som anvendes for å forebygge bederving.

Flere alternativer er beskrevet nedenfor. For eksempel ultrafiolett stråling av landbruksprodukter (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V., Kim, J. J. og Carmeli, S.}1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food Chem., 40: 1217-1221; Rodov, V., Ben-Yehoshua, S., Kim, J. J., Shapiro, B. og Ittah, Y., 1992. Ultraviolet illumination induces scoparone production in kumquat and orange fruit and improves decay resistanee. J. Amer. Soc. Hortic. Sel, 117:188-192), eller eksponering av produktet for antagonistisk gjær (Wilson, C. L. og Chalutz, E., 1989. Postharvest biocontrol of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria. Scientia Horticulturae, 40: 105-112). UV-bestråling kan imidlertid være fytotoksisk og biokontrollen av antagonistisk gjær er ikke ennå ikke kommersielt ordentlig akseptert, mulig pga. ikke tilfredsstillende kontroll av patogener. Disse fremgangsmåter har videre forskjellige ulemper og noen av de relevante helsemyndigheter har enda ikke godkjent noen av dem.

Sitrusfrukt, så vel som ulike andre planter har noe endogen motstand mot patogener pga. produksjon av antimikrobielle substanser i plantevevet (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V., Kim, J. J. og Carmeli, S., (1992) Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food Chem., 40:1217-1221; Ben-Yehoshua, S., Rodov, V., Fang, D. Q., og Kim, J. J., (1995) Preformed antifungal compounds of citrus fruit: effect of postharvest treatments with heat and growth regulators. J. Agric. Food Chem. 43: 1062-1066; Rodov, V., Ben-Yehoshua, S., Fang, D. Q., og Kim, J. J., (1995) Preformed antifungal compounds oflemon fruit: citral and its relation to disease resistance. J. Agric. Food Chem. 43:1062-1066). Det er tidligere vist at disse substansene inkluderer essensielle oljekomponenter med et bredt spekter av antimikrobiell aktivitet. U.S. patent nr. 5 334 619 og 5 958 490 beskriver anvendelse av flere naturlig forekommende oljer som aktive ingredienser for å forhindre bedervelse etter innhøsting av landbruksprodukter. Bare noen få av de essensielle oljekomponentene har imidlertid mikrobiosidal aktivitet.

Citral (3,7-dimetyl-2,6-oktadienal) er en essensiell oljekomponent som naturlig produseres i flere typer sitrusfrukter, så vel som i noen andre planter, slik som sitrongress og eukalyptus. Citral er et umettet aldehyd fra terpen-serien og er sammensatt av en isomer blanding av geranial og neral. På grunn av dens intense sitronaroma og -smak, brukes citral mye i matvareindustri og kosmetikkindustri. Citral er kjent for å være et sikkert mattilskudd og er godkjent for anvendelse i mat av U.S. Food and Drug Administration. Citral har også vist å ha et svært effektivt og bredt spekter av antimikrobiell og antifungal aktivitet. Faktisk har Ben-Yehoshua et al.,

(1992) og Rodov et al. (1995) vist at citral er den mest aktivt konstitutive, antifungale forbindelse i sitronfrukt.

Limonen, l-metyl-4-(l-metyletenyl)sykloheksen (også kjent som p-menta-l,8-dien), er "et annet eksempel på en rikelig, essensiell oljekomponent som kan ekstraheres fra flavedokjertlene til sitrusfrukter. U.S. 4 379 168 og U.S. 5 951 992 beskriver anvendelse av limonen som henholdsvis et insekticid og pesticid. I sin rene form har den imidlertid svært lav antifungal aktivitet. Chalchat et al. (Chalchat, J. C, Chiron, F., Garry, R. Ph. og Lacoste (2000, J. Essent. Oil Res. 12:125-134) beskriver antirnikrobiell aktivitet av limonen hydroperoksid mot humane patogener.

Aureli et al (Aureli, P., Costantini, A. ogZolea, S., 1992. Antimicrobial activity of some plant essential oil against Listeria monocytogenes. J. Food Protection,

55: 344-348 viste at noen essensielle oljekomponenter har sterk aktivitet mot patogene bakterier, slik som Listeria og antyder deres anvendelse ved forebyggelse av infeksjon i mat av Listeria.

Flere forsøk på anvendelse av sitrat er utført for å kontrollere bederving av ulike landbruksprodukter. Det er vist at citral kan redusere forringelse av korn ved Aspergillus bygg med høy fuktighet. (Nandi, B., Thomke S. og Fries, N.,

1977. Preservation of high moisture barley grains with citral and allyl caproate and preliminary acceptability tests with piglets. Acta Agric. Scand., Th 105-109), rå ris (Mallick, A. K. og Nandi, B., 1982. Deterioration of stored rough rice. IV. Preservation and palatability of citral and propionic acid treated grains. Acta Agric. Scand., 32:177-187) og hvete (Ghosh, J. og Nandi, B., 1985. Preservation of high moisture wheat by some antifungal volatile compounds and palatability tests with rats. Acta Agric. Scand, 35: 245-254). Arora og Pandey (Arora, R. og Pandey, G. N., 1977. The application of essential oils and their isolates for blue mold decay control in Citrus reticulata Blanco. J. Food Sei. and Tech. 14: 14-16), rapporterte at citral, geraniol og andre essensielle oljekomponenter reduserer blåmugg-forringelse av Citrus reticulata- Oukt Oppfinnerne ifølge foreliggende oppfinnelse (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V., Kim, J. J. og Carmeli, S., 1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food Chem., 40:1217-1221 viste at anvendelse av eksogent citral pkPenicillium- inokulerte sitroner tydelig inhiberte deres forråtnelse.

I de fleste tilfeller av tidligere anvendelser av essensielle oljekomponenter for å forhindre forråtnelse av landbrulcsprodukter, ble den essensielle oljekomponent anvendt på produktet i en vandig emulsjon. Selv om delvis forebyggelse av produktets forråtnelse ble oppnådd, ble anvendelse av slike substanser, er essensielle oljekomponenter, inkludert citral og geraniol fortsatt ikke anvendt kommersielt for forråtnelseskontroll av lett bedervelige landbruksprodukter. En hovedårsak for ikke å anvende disse substansene er deres anvendelse på lett bedervelige produkter, i en konsentrasjon effektiv mot mikroorganismer, påfører skade på produkter, som kan forårsake senere forråtnelse. For eksempel medfører essensielle oljer skader på fruktens skall og fargeforandringer på kjøtt. Denne skade kan være lei og resultere i betydelig forråtnelse av det behandlete produkt etter en relativt kort tidsperiode. En annen årsak til mangel på deres kommersielle anvendelse er deres ustabilitet, da mange av disse essensielle oljer er ustabile og tenderer til å brytes ned før de utøver sin baktericide aktivitet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er basert på det faktum at essensielle oljekomponenter av matkvalitet eller deres derivater oppnådd ved eksponering for lysstråling eller ved oksidering, kan anvendes som aktiv ingrediens i en stabil, effektiv mikrobiocidal formulering for inhibisjon av mikrobiell utvikling. I en slik formulering forebygges den kjente fytotoksiske skade av essensielle oljekomponenter og stabiliteten av denne essensielle oljekomponent eller dens derivater forlenges, som resulterer i en miljøvennlig mikrobiocidal sammensetning.

Foreliggende oppfinnelse omfatter:

Mikrobiocidal, vandig formulering omfattende:

(i) en effektiv mengde av citral,

(ii) minst en ytterligere stabilisator, nemlig en antioksidant valgt fra gruppen bestående av butylert hydroksyanisol (BHA), askorbinsyre, butylert hydroksytoluen (BHT) isoaskorbinsyre, a-tokoferol, p-karoten, eller blandinger derav; og

(iii) imazalil, i en konsentrasjon fra 5 ppm til 100 ppm.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for inhibering av mikrobiell utvikling omfattende påføring av en effektiv mengde av en vandig formulering ifølge krav 1 eller 2.

Mengden tilsatt etanol er fra ca. 10 % til ca. 50 %. Den essensielle oljekomponent er utvalgt fra gruppen monoterpen og sesquiterpenhydrokarboner, oksygenete terpenderivater, ikke-terpenderivater slik som aldehyder, alkoholer, syrer og fenoler. Formuleringen kan ytterligere omfatte et pesticid i en mindre mengde som i seg selv ikke er tilstrekkelig til å inhibere mikrobiell utvikling.

Oppfinnelsen kan også frembringe fremgangsmåter for å inhibere mikrobiell utvikling i husholdningen ved anvendelse av den mikrobiocidale, vandige formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse, enten alene eller sammen med alminnelig anvendte detergenter.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for human hygiene, der essensielle oljer eller deres derivater sammen med egnede utsettinger, tilsettes såpestykker, hygieniske oppvaskmidler, desinfiserende munnvann eller kosmetiske produkter.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

For å forstå oppfinnelsen og se hvordan den kan utføres i praksis, vil en foretrukket utførelsesform beskrives, med henvisning til følgende figurer, der: Figur 1 viser induksjon av scoparonproduksjon i moden, grønn sitron ved injeksjon av solbehandlet limonen, limonen eller citral til albedo eller ved å frigi innholdet fra oljekjertlene i modne, grønne sitroner. Figur 2 viser effekten av fruktmodning på sitroner på produksjon av fytoalexiner i modne, grønne og gule sitronfrukter. Figur 3 viser hastighet på forråtnelsen av Penicillium- inokulerte grapefrukt behandlet ved dypping i formuleringer av citral og geraniol. Figur 4 viser hastighet på forråtnelsen av Penicillium- inokulerte sitroner behandlet med en vandig emulsjon av citral stabilisert med 25 % etanol, amif 72 (20 % butylert hydroksyanisol, 6 % propylgallat og 4 % sitronsyre i propylenglykol), p-syModekstrin og polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween 20) sammenliknet med forråtnelse i frukt av samme type med 5000 ppm Tween 20 uten etanol. Figur 5 viser forråtnelseshastigheten av Penicillium- mokuleite sitroner behandlet med en vandig emulsjon av citral, omfattende oktylfenylpolyeteralkohol (Triton XI00) og butylert hydroksyanisol (BHA). Figur 6 viser forråtnelseshastigheten av Pew'cz7//«w-inokulerte sitroner behandlet med en vandig emulsjon av citral, omfattende polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween 20) og butylert hydroksyanisol (BHA), sammenliknet med forråtnelseshastigheten når imazalil ble tilsatt. (Imazalil er et fungicid, som ofte anvendes etter innhøsting for å beskytte frukt og grønnsaker). Figur 7 viser forråtnelseshastigheten av Pewci//i«m-inoladerte sitroner behandlet med en vandig 25 % etanolemulsjon av diklormetan råekstrakt av flavedo fra grønn sitron, sammenliknet med imazalil 1000 ppm og 25 % etanolløsning. Figur 8 viser forråtnelseshastigheten av Pe«ic////"wm-inokulerte sitroner behandlet med en 25 % vandig etanolløsning av ulike kombinerte formuleringer omfattende citral, 1-oktanol og diklormetan råekstrakt i 25 % etanol fra sitronflavedo, som ble eksponert for sollys i 4 timer før anvendelse. Figur 9 viser forråtnelseshastigheten av Penicillium- mdkulette sitroner behandlet med en 25 % etanolløsning av 5000 ppm limonen eksponert for sollys i 3 timer. Effekten av lengden på dyppingen, så vel som antall dyppinger, ble sammenliknet. Figur 10 viser forråtnelseshastigheten av PenicilliumAnokuierte sitroner behandlet med en vandig løsning av 2500 ppm limonen, som før anvendelse ble UV-bestrålt i 3 timer og deretter oppløst i 25 % etanol. Behandling med ett minutts behandling ved dypping i denne løsning (3UVL), ble sammenliknet med tre påfølgende dyppinger i samme løsning med en times mellomrom mellom dyppingene (3UVL3). Disse behandlingene ble sammenliknet med en dypping i vann eller i 25 % etanol. Figur 11 viser effekten av limonen hydroperoksid sammenliknet med fotooksidering med "Rose Bengal" på forråtnelsesprosenten av sitronfrukt inokulert med Penicillium digitatum. Figur 12 viser effekten av limonen hydroksyperoksid sammenliknet med en molybdat katalyst på forråtnelsen av sitronfrukt inokulert med Penicillium digitatum. Figur 13 viser effekten av fjerning av Rose Bengal-katalysatoren og dosen av Tween 20 på fytotoksisitet av sitronfrukt behandlet med limonen hydroksyperoksid. Figur 14 viser effekten av citralformulering på vekst av Staphylococcus aureus- céHer. Figur 15 viser effekten av citral- og solbehandlet limonen på vekst av Candida albicans- ceUer.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som beskrevet ovenfor angår foreliggende oppfinnelse en miljøvennlig mikrobiocidal formulering effektiv til å forhindre forråtnelse av landbruksprodukter for husholdning, oppfinnelsen kan også anvendes for human hygiene som en nutrasøytisk sammensetning. Den vandige mikrobiocidale formuleringen omfatter som den aktive ingrediens, én essensiell oljekomponent eller derivater derav, oppnådd ved lyseksponering eller ved oksidering, eller blandinger av slike essensielle oljer og/eller deres derivater, og minst én ytterligere stabilisator utvalgt fra gruppen bestående av etanol i en mengde fra ca. 10 til ca. 50 %, en emulgator, en antioksidant eller et innkapslingsmiddel. Stabilisatorens rolle er å stabilisere de essensielle oljekomponenter fra nedbrytning før de utfører sin mikrobiocidale vnkning og/eller forhindre og/eller redusere fytotoksisiteten til disse forbindelsene. Den mikrobiocidale essensielle oljekomponent er valgt fra gruppen bestående av monoterpenhydrokarboner og sesquiterpener, oksygenerte terpenderivater og ikke-terpenderivater slik som aldehyder (citral eller nonanal), alkoholer (oktanol, nonanol) og fenoler (cravacrol). Den vandige, mikrobiocidale formulering kan anvendes for en effektiv kontroll og inhibering av mikrobiell utvikling. Alle essensielle oljekomponenter er velkjente for å være matkvalitetskomponenter. Det bør videre understrekes at alle komponentene av den vandige mikrobiocidale formuleringen er matvarekvalitet og påfører ingen skade på det menneskelige legeme. Et stort anvendelsespotensiale er beskyttelse av lett bedervelige landbruksprodukter mot forråtnelse forårsaket av mikrober. Landbruksprodukter kan inkludere for eksempel ethvert ferskt matvareprodukt, som kan ødelegges pga. mikrobiell infeksjon, slik som frukt, grønnsaker, kjøtt og fisk. Andre potensielle anvendelser av hensiktsmessig formulering kan være ethvert tilfelle der en effektiv beskyttelse mot mikrober er nødvendig slik som innen husholdningen, kroppshygiene eller nutrasøytiske midler. For anvendelse innen husholdning kan den vandige mikrobiocidale formuleringen anvendes alene eller sammen med kommersielle detergenter. Ved anvendelse av essensielle oljekomponenter eller derivater derav for kroppshygiene, kan en effektiv mengde av disse essensielle oljekomponenter eller deres derivater være inkorporerte i såpestykker, i vaskeformuleringer, oppvaskmidler, munnvask eller deodorantløsninger eller ved andre sammensetninger. En effektiv mengde av en essensiell oljekomponent ifølge oppfinnelsen, spesielt der de essensielle oljer er utvalgt blant citral, perillaldehyd eller limonen, kan også være del av en sammensetning anvendt som et nutrasøytisk middel. Slike nutrasøytiske sammenseminger kan oppnå to effekter, nemlig å beskytte mot biocidale infeksjoner, så vel som å gi ytterligere helsebringende effekter, slik som å introdusere anti-cancer aktivitet. Flere formuleringer ifølge omfatter essensielle oljer, slik som citral, limonen, geraniol, mentol, carvon og perillaldehyd ble funnet å virke som anticancermidler og for å redusere kolesterolnivået og LDL. Citral og citronellal er kjent å lindre og berolige følelser og hjelpe kroppen til tilfredsstillende fordøyelse. Slike essensielle oljekomponenter er kjent som rytonæringsmidler eller funksjonell kost.

Noen av de essensielle oljekomponenter er kjente innen teknikken for å være effektive til bekjempelse av mikrober, spesielt i landbruksprodukter. Imidlertid er essensielle oljekomponenter forbundet med to iboende utfordringer, som så langt har begrenset deres praktiske anvendelser. Et problem er forbundet med deres begrensete kapasitet pga. oksygeneringsprosesser forårsaket av rask desintegrering av de essensielle oljer ved eksponering for oksygen. Selv om deres anvendelse som potente mikrobiocider er kjent, er følgelig effekten av slik anvendelse begrenset pga. den korte levetiden. Anvendelse av ganske store mengder av en essensiell olje for å forlenge dens mikrobiocidale effekt, fører uvegerlig til den neste ulempe: Dersom blandingen ikke danner en virkelig løsning, vil eksponeringen av frukt for høye konsentrasjoner av essensielle oljer påføre skade på produktet.

Det er nå funnet at når de essensielle oljekomponenter anvendes som aktiv komponent i en mikrobedrepende sammensetning sammen med minst et additiv, som stabiliserer eller løser opp de essensielle oljekomponenter, oppnås en stabil og effektiv mikrodrepende sammensetning som ikke medfører skade på produktet. Disse additiver velges fra etanol, en antioksidant, en emulgator eller et innkapslingsmiddel. Hver av disse additiver beskytter de essensielle oljekomponenter ved ulike mekanismer. Etanol som selv er et biocid, tilsettes for å oppløse den essensielle oljekomponent og forhindrer fytotoksisitet, og bør være til stede i en mengde på ca. 10 % til ca. 50 %. Emulgatoren danner en mikrokolloidal løsning som hjelper til å forebygge fytotoksisitet av de essensielle oljekomponenter. Emulgatoren kan velges fra gruppen omfattende alkylarylpolyeteralkohol (DX), polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween 20), polyoksyetylensorbitanmonooleat (Tween 80), oktylfenylpolyeteralkohol (Triton 100). Noen av disse emulgatorene er matvarekvalitet, for eksempel Tween 20. Konsentrasjonen av emulgatoren bør være 0,1 vektprosent.

Antioksidanten reduserer oksidasjonshastigheten til de essensielle oljer, som fører til deres nedbryting. Videre reduserer antioksidanten den iboende toksisitet til de essensielle oljer. Antioksidanten kan velges fra gruppen omfattende forbindelser slik som, men ikke begrenset til: butylert hydroksyanisol (BHA), askorbinsyre, isoaskorbinsyre, a-tokoferol, butylert hydroksytoluen (BHT), P-karoten eller deres blandinger. Foretrukne antioksidantkonsentrasjoner i formuleringen ifølge oppfinnelsen er i området fra 0,05 % til ca. 0,8 % (vekt/volum). Antioksidantens effekt på reduksjon av fytotoksisiteten til den essensielle oljen i det tilfellet BHA tilsettes citral, er vist i tabell 1, som viser skallødeleggelsesindeks (Peel Blemish Index), der det skal forstås at DHA i seg selv i forårsaker noen skade.

Skallødeleggelsesindeksen bestemmes ved

Skadepoeng: 0 = ingen skade; 1 = lett skadet; 2 = moderat skadet; 3 = alvorlig skadet.

Innkapslingsmidlene tilsatt formuleringen settes sammen med de essensielle oljekomponenter, følgelig forhindres deres degradering og den effektive mikrobiocidale virkningsperiode forlenges. Innkapslingsmiddelet kan være enhver matvarekvalitetsmatriks eller polymer laget av karbohydrat eller protein eller andre matrikser slik som, men ikke begrenset til kornstivelse, maltodekstrin, p-syklodekstrin, silikagel, kasein, chitosan og deres blandinger. Lavmolekylvektspolyetylen og ulike typer voks kan også virke som innkapslingsmateriale. Faktisk er det funnet at ved å tilsette citral ulike voksformuleringer uten innhold av fungicider, øker effektiviteten til citral, som da reduserer både forråtnelse og fytotoksisitet. Tilsetting av syldodekstrin til citral resulterte også i lengre levetid av citralet på overflaten av de behandlete appelsiner. Foretrukne konsentrasjoner av innkapslingsmiddelet i formuleringen ifølge oppfinnelsen er i området fra ca. 0,1 % til ca. 0,8 % (vekt/volum).

Tilsetting av en emulgator reduserte den iboende fytotoksisitet til de essensielle oljer. Denne effekten vises ved ødeleggelsesindeksen til den essensielle oljen citral ved tilsetting av emulgator, som vist i tabell 2.

Det bør bemerkes at i tillegg til én essensiell oljekomponent, dens derivater oppnådd ved bestråling eller ved blandinger av disse, kan den mikrobiocidale sammensetning omfatte et annet biocid i en svært lav konsentrasjon. En slik lav konsentrasjon av biocidet er ikke tilstrekkelig til på egenhånd å forhindre mikrobiell skade, imidlertid sammen med den essensielle oljen ifølge foreliggende oppfinnelse eller dennes derivater kan den mikrobielle forråtnelse forhindres. Eksempler på slike biocider kan være imazalil, tiabendazol, panoctine, rovral, prochloraz, natriumortofenylfenat, metalaxyl, fosetyl-AI, kaptan, oksykmolin, d^oranbenzalkoniumklorid, canon, tiofanatmetyl, triforin, karbendazim, triademinol, vinklozolin, etakonazol eller blandinger derav. Konsentrasjonen av slike tilsatte pesticider kan være fra ca. 5 ppm til ca. 100 ppm. Anvendelsen av slik sammensetning omfatter en kombinasjon av en essensiell oljekomponent eller dens derivater, oppnådd ved lysstrålingseksponering sammen med en liten mengde fungicid vil gjøre det mulig å oppnå to viktige fordeler: 1. Redusere den toksiske rest av biocidet, som er et viktig krav fra alle helsemyndigheter i forbindelse med alle toksiske fungicider. 2. Kontroll av utviklingen av resistens mot biocidet fra patogenet. Dette spesifikke punkt vil oppnås ved anvendelse av den nye formuleringen med eller uten biocidkomponenten. Faktisk vurderes anvendelse av et forskjellig biocid, som kan ha forskjellige virkningsmekanisme, selv for en relativt kort tidsperiode, som den anbefalte måte å kontrollere populasjoner resistente mot biocider.

De essensielle oljekomponenter ifølge oppfinnelsen kan fremstilles syntetisk eller de kan være et separat planteekstrakt, omfattende flere komponenter av essensielle oljer, dvs. blandinger av slike. De kan også være en renset, naturlig essensiell oljetilberedning, anriket med hensyn til en enkelt, essensiell oljekomponent eller enhver kombinasjon av disse. Tilberedninger inneholdende naturlige, essensielle oljer kan fremstilles fra ulike planter, slik som sitrusfrukter, sitrongress og eukalyptustrær. Eksempler på essensielle oljeforbindelser er citral, 1-oktanol, heptanol, nonanol, geraniol, oktanal, nonanal, dekanat, perillaldehyd, perillalkohol, citronellol, citronellal, carvon, carveol, linalool, vanillin, cinnamaldehyd, kanelsyre, eugenol, mentol, limonen, carvacrol, terpineol, tymol, vanillin og kamfer. I tilfeller ifølge oppfinnelsen der den essensielle oljen er derivatisert ved lyseksponering, kan slik derivatisering utføres på syntetisk fremstilte essensielle oljer, på naturlig ekstraherte essensielle oljer eller på et råekstrakt omfattende flere essensielle oljer. I det siste tilfellet kan én eller flere essensielle oljer derivatiseres, mens andre kan være upåvirket. Videre kan lyseksponering utføres enten før ekstraheringen av de essensielle oljekomponenter fra deres naturlige kilder, eller etter deres ekstrahering.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan en blanding av én essensiell oljekomponent eller et derivat derav oppnås ved lysbestråling og emulgator og antioksidant tilsettes direkte som en antimikrobiell sammensetning til mat, toalettartikler og husholdnmgsartikler for mikrodrepende hensikter. Blandingen kan også tilberedes i form av en væske eller som aerosol ved tilsetting av ikke-toksiske basisstoffer i en egnet mengde etter behov, og tilsettes eller sprayes for mikrodrepende hensikter.

Konsentrasjonen av den ene essensielle oljekomponent som er nødvendig for å oppnå en effekt, kan enkelt bestemmes av fagpersonen i hvert tilfelle, og avhenger av typen av essensiell olje, så vel som måten den påføres preparatet. I tilfellet citral eller geraniol varierer den effektive mengden fra ca. 0,1 % til 1 %.

Formuleringen kan påføres produktet som skal beskyttes på ulike tidspunkt før eller under deres lagring. Når formuleringen påføres fruktene, vil den fortrinnsvis påføres før pakking, dvs. etter høsting. Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan påføres produktet ved enhver metode der produktet vil komme i kontakt med en effektiv mengde av formuleringen, dvs. en mengde som vil inhibere dens infeksjon av mikroorganismer under lagringsperioden. Eksempler på påføringsmetoder er dypping, damping, spraying og skumming av frukten i pakkeriet. En annen metode kan være inkorporering av disse materialer i en voksemulsjon. Som nevnt tidligere er faktisk voksenmlsjon et egnet løsningsmiddel for behandling av flere sitrasfrukter.

En annen fremgangsmåte for påføring er damping av frukten i et relativt lufttett kammer som anvender flyktighet av mange av de aktive materialene, slik som citral.

En annen mulig metode for påføring kan utføres ved anbringelse av de aktive materialene på et silikagelmateriale som anvendes som tørkesubstans eller som en absorbent. Dette materialet kan absorbere mer enn 10 % av sin vekt i våre aktive materialer, og beholdes deretter som en innkapslet enhet. Når den omliggende luftfuktighet til disse materialer øker, vil disse aktive biocider frigis, og vann vil erstatte dem. Faktisk er dette situasjonen når frukt er innelukket i et lagerrom eller i en beholder som inneholder lett bedervelige landbruksprodukter som kontinuerlig transpirerer. En slik påføring kan medføre en kontrollert, langsom frigivelse av fungicidet som muliggjør en lengre beskyttelse mot forråtnelse.

Formuleringen kan også påføres via langsomt degraderbare polymerer, og som ved sin degradering frigir den essensielle oljekomponenten til produktet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er oljefonnuleringens pH fortrinnsvis 7, men kan også være basisk med en pH opptil 9.

Som nevnt bør den vandige mikrobiocidale formuleringen omfatte en stabilisator for å oppløse den ene essensielle oljekomponent. I det tilfellet at stabilisatoren er etanol, er det vist at citral ved en konsentrasjon på 0,2 % var mye mer effektiv til å inhibere forråtnelse av ikke-inokulerte Washington-appelsiner når de ble påført som en formulering inneholdende 10-50 % etanol, enn når den ble påført, ved samme konsentrasjon, i en vandig emulsjon (tabell 3, se også eksempel 4).

I tillegg fremkom ingen skade på produktet, som normalt er forbundet med påføring av essensiell olje. I nærvær av 10 % til 50 % etanol påførte ikke den essensielle oljen noen fytotoksisk skade. Skade oppsto selv ikke når de essensielle oljer ble påført ved en relativt høy konsentrasjon (0,5 % til 1 %), kjent innen teknikken for å påføre betydelig skade.

Effekten av slike formuleringer til å redusere forråtnelse er således vist med alle sitrastrukter testet i pakkeriet (resultater vist i tabell 3 og 4), og med mango- og paprikafrukter (data ikke vist). Eksperimentet med paprika viste en god kontroll av hovedpatogenene i paprika i Israel, Botrytis cinerea ogAlternaria alternata.

Tabell 4. Effekt av limonen eksponert for sollys i tre timer, og forråtnelse av kumquat-frukt etter lagring ill dager ved 10 °C og holdbarhetssimulering ved 20 °C i 6 dager.

Den essensielle oljekomponenten limonen, som tilhører familien hydrokarbonmonoterpener, omfatter kvantitativt ca. 85 % av de essensielle oljekomponenter til stede i sitrus. Limonen som sådan er imidlertid ikke tilfredsstillende aktiv. Ikke desto mindre ble det funnet at limonen kan fungere som en forløper til et svært aktivt mikrobiocid ved å eksponere homogeniserte fruktskall for sollys, etterfulgt av ekstrahering av oljen med et organisk løsningsmiddel, spesielt diklormetan, heksan eller etylacetat. Den samme effekten kan oppnås ved UV-bestråling av limonen etter dens ekstrahering (figurene 9 og 10). Det samme gjelder syntetisk fremstilt limonen. Videre kan limonen også oksideres ved anvendelse av konvensjonelle oksidasjonsmidler. Et spesielt eksempel er heterogen katalyse ved anvendelse av molybdatsalt.

En mikrobiocidal sammensetning kan følgelig omfatte limonen eller et råekstrakt av essensielle oljer, omfattende en vesentlig mengde limonen som lysbestråles. Det bør bemerkes at antioksidanter ikke bør anvendes når det anvendes derivater av essensielle oljer som er eksponert for sollys.

En slik elssponering av limonen for bestråling fører til rask fotooksidering som danner et svært aktivt antifungalt middel. Et slikt middel kan karakteriseres som den komponent som gir purpurfargen i vanillm-svovelsyretesten (heretter betegnet "vanillintesten") eller fortrinnsvis ved blå fluorescens oppnådd som et resultat av bestråling med en UV-lampe. Selv om denne testet kan reagere med andre terpener og deres derivater, kan det spesifikke produkt av limonen karakteriseres ved sin typiske farge og retensjonsforhold

- Rf - på kromatogrammet. Fotooksidering kan utføres enten ved eksponering av

limonen for ultrafiolett eller hvitt lys, eller ved eksponering for sollys. I disse tre tilfeller har det oppnådde materialet den samme retensjonstid i HPLC. Disse materialene ga den samme purpurfargen i vanillintesten og den samme flekken ved lynnsjiktskromatografi. Det kan således konkluderes med at alle disse eksponeringsmålene resulterer i det samme materialet. Det ble funnet at klorofyll deltar i fotooksideringen av limonen til det nye produktet som gir den positive purpurfargeresponsen i vanillintesten. Dette materialet viste en høy antifungal aktivitet i bioanalyse for inhibisjon av forlengelse av

conidia fra Penicillium digitatum. Den resulterende aktivitet var mye større enn den for scoparon eller scopoletin, stoffer kjente som endogene fytoaleksiner fra sitrusfrukt, eller enn den fra citral som var kjent som den mest aktive, konstitutive antifungale materiale i sitronfrukt (Ben Yehoshua et al. 1992).

En annen observasjon viste at dette materialet induserer resistensmekanismer i sitrusfrukten, slik som frembringelse av akkumulering av fytoaleksiner (figur 1). Behandling av ikke-inokulerte sitroner ved injisering av 5 ul foto-oksidert limonen inn i albedovevet rett under flavedo, frembrakte produksjon av scoparon og scopoletin i disse sitroner opp til nivåer passende for å beskytte frukten mot patogenet. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved injeksjon av diklormetan eller heksan råekstrakt fra sitronflavedo, som viste fullstendig forhmdring av forråtnelse (figur 7). Tilsvarende, ved å skade oljekjertlene eller ved injeksjon av limonen til albedovevet i modne, grønne sitroner, ble en svært viktig effekt utløst ved frembringelse av endogene resistensmekanismer i sitrusfrukter, slik det vises i figur 1 ved akkumulering av scoparon. Slik skade på gul frukt ga mye lavere respons, som viser at modning av frukt påvirker denne resistensresponsen og eldre frukt er mindre beskyttet (figur 2). Faktisk ble denne lavere resistens i gul frukt observert i mange andre eksperimenter. Interessant var det å observere at injeksjon av citral ikke frembrakte den samme beskyttende respons (figur 1). Til forskjell fra limonen induserte sannsynligvis citralinjeksjonen ikke produksjon av vanillinpositivt, aktivt materiale. Det ble videre funnet mye høyere nivåer av både scoparon (over 1000 u_g/g fersk vekt) og scopoletin (over 200 u.g/g fersk vekt) etter dypping av inokulert frukt i diklormetan råekstrakt, som forhindret forråtnelse (figur 7). Fytoaleksinnivåene som ble funnet var flere ganger den mengde nødvendig for fullstendig kontroll av patogenene. Det er tydelig at de dannede limonen hydroperoksider således danner reaktive oksygenforbindelser som utløser immunsystemet i planten. Slike reaktive oksygenforbindelser påvirker også patogenet. Disse reaktive oksygenforbindelser har kort levetid og nedbrytes lenge før frukten distribueres til markedet.

Et viktig aspekt ifølge denne nye oppfinnelsen er at forråtnelseskontroll av patogenet oppnås ved både en direkte inhibisjon av patogenet så vel som ved å utløse endogene mekanismer for planteresistens. Sol eller UV-behandlet limonen eller det solbehandlete råekstrakt anvender således både direkte antifungal aktivitet så vel som å utløse den endogene resistensen.

Det ble tidligere rapportert, uten relevans til antifungal aktivitet (Schieberle, P., Maier, W., FM, J. og Grosch, W. 1987, HRGC separation of hydroperoxides formed during the photosensitized oxidation of (R)-(+)-limonene. J. of High Resolution Chromatography & Chromatography Communications, s. 588) at bestråling av limonen produserer ulike peroksider. Det er nå vist at de dannede hydroperoksider, og i særdeleshet (1 S,4R)-p-mentha-2,8-dien 1-hydroperoksid; (lR,4R)-p-mentha-2,8-dien

1-hydroperoksid; (2R,4R)-p-mentha-6,8-dien 2-hydroperoksid; og (2S,4R)-p-mentha-6,8-dien 2-hydroperoksid kan anvendes som effektive biocider i den vandige løsningen ifølge foreliggende oppfinnelse. Nærværet av disse hydroperoksider i bestrålt limonen ifølge ormfinnelsen ble bekreftet ved gasskromatografi massespektrometri og kjernemagnetiske resonansstudier (data ikke vist). Ifølge foreliggende oppfinnelse ble en ny fremgangsmåte som medfører høyere konsentrasjoner av hydroperoksider utviklet

med Rose Bengal som katalysator eller aktivator, som økte oksygenet i reaksjonen til energinivået til singelt oksygen. Anvendelse av denne fremgangsmåte resulterte i at nesten alt limonen ble konvertert til hydroksyperoksider. Blandingen av disse hydroksyperoksider var svært effektiv i kontroll av forråtnelse av inokulerte sitroner, selv ved doser på 2500 ppm (figur 11).

De utførte etøperimenter viste tydelig at dersom råekstrakt fra skall, eller dersom det ekstraherte limonen ikke ble bestrålt eller eksponert for sollys, var den dannede limonenløsning faktisk ikke tilstrekkelig aktiv og for variabel til å inhibere forråtnelse. Forråtnelsen i slike tilfeller utviklet seg som om frukten ikke hadde vært i kontakt med en mikrobiocidal formulering i det hele tatt. Den antifungale aktivitet så vel som induksjon av resistensmekanismene, slik det er vist ved akkumulering av scoparon, er således forbundet med disse hydroksyperoksider av limonen.

Eksponering for sollys eller bestråling av diklormetan eller heksanekstrakt av sitronflavedo, bør utføres i 3 til 6 timer. Effektiviteten av

sitronperoksidekstraktformuleringen som en biocidal sammensetning, øker ved lengre eksponeringsperioder av frukten til hydroperolcsidløsningen. Dypping av inokulert frukt i en hydroperoksidløsmng (limonen eksponert for sollys i 4 timer) i fire etterfølgende perioder, hver på 1 minutt, resulterte i forhindring av forråtnelse av inokulerte sitroner oppbevart ved 20° C i en periode på over 3 uker (figur 9). Effekten av limonen eksponert for sollys i 3 timer, og dens effekt til å forhindre forråtnelse, sammenliknet med ingen behandling (dypping i vann) eller behandling med en etanolløsning (25 %) er oppsummert i tabell 4 i et sammenlikningseksperiment med ikke-inokulert frukt. En frukthagespray med 5000, 10000 eller 20000 ppm vandig formulering av limonen i 25 % etanolløsning, som ble fullstendig konvertert, induserte produksjon av scoparon og scopoletin i Valencia-frukt på (og av) treet, reduserte forråtnelse av denne frukten når den ble inokulert med Penicillium digitatum etter innhøsting (data ikke vist).

I et separat eksperiment viste både citral og solbehandlet limonen (oppløst i

25 % etanol) en betydelig inhibisjon av veksten av patogenet Cladosporium herbarum som vokste i inokulerte maiskolber.

Den konvensjonelle fremgangsmåte for å kontrollere forråtnelse i sitrus pakkerier, omfatter flere forbindelser som også er miljøvennlige, men som ikke er inkludert i foreliggende formulering av tekniske årsaker. Slike forbindelser er kalsiumsalter, gibberelinsyre, 2,4-dikloreddiksyreacetaldehyd, chitosan eller chitosan pluss lave korisentrasjoner av metaller, slik som Zn eller Cu, noen organiske syrer, slik som eddiksyre, propionsyre, etc. Disse forbindelsene kan utgjøre deler av den foreliggende, miljøvennlige nye formuleringen. Faktisk har nye data vist slik aktivitet. Redusering av pH i formuleringene ned til 2 eller 3 bedret faktisk også kontrollen av patogenet i inokulerte frukteksp erimenter.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert i større detalj i de følgende eksempler med tilfeldig henvisning til etterfølgende figurer.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Minimal inhibitorisk konsentrasjon mot Penicillium digitatum og virkningsmekanismen av essensielle oljer, sammenliknet med imazalil.

Den minimale inhibitoriske konsentrasjon (MIC) av over 50 forbindelser funnet i oljekjertlene i sitrusfrukter, ble undersøkt ( in vitr6) ved å etablere den laveste konsentrasjon av forbindelsen der det ikke oppsto noen vekst av patogenet ( in vitro) i petriskåler. Tabell 5 viser MIC for de mer lovende forbindelser (sammenliknet med imazalil). Den nødvendige mengde av hver av forbindelsene som skal testes, oppløst i 0,5 ml aceton, ble tilsatt til en steril petriskål (90 mm) inneholdende 15 ml smeltet potetdekstroseagar (PDA) (50° C) for å gi en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Skålen ble forsiktig ristet for å sikre en jevn distribusjon av testforbindelsen og agaren ble hensatt for å stivne. Skålene ble inokulert ved anvendelse av et mycelskivesnitt (8 mm) fra en agarplate med Penicillium digitatum- kutiur som ikke enda hadde nådd sporestadiet. Mycelskiven ble plassert i senteret på hver testskål, og deretter oppbevart ved 24° C. Soppinhibisjon ble kontrollert ved å måle diameteren på hyfevekst etter 7 dager.

Ytterligere en test ble utført ( in vitro) for å undersøke om virlamigsmekanismen var fungicid eller fungistatisk; mycelskiven fra inoculum fra analyseplaten ble overført til en plate inneholdende kun PDA. Platene ble deretter kontrollert for vekst de neste 5 dagene. Dersom veksten gjenoppsto, ble forbindelsen klassifisert som fungistatisk, og dersom veksten ikke gjenoppsto ble den klassifisert som fungicidal. Resultatene er vist i tabell 5 og 6.

Agar diffusjonsanalysefremgangsmåte

Potetdekstroseagar (Difco) ble tilberedt og sterilisert. Mediet ble deretter nedkjølt i vannbad til 50 °C før inokkulering ved tilsetting av en suspensjon av Penicillium digitatum- sporer i sterilt vann, for å lage en sluttkonsentrasjon av sporer i mediet på IO<4>sporer/ml. Mediet ble forsiktig blandet for å dispergere sporene jevnt før utporsjonering av 15 ml til hver petriskål med diameter på 90 mm. 5 mg av hver substans for testing ble pipettert på et sterilt 13 mm antibiotisk Whatman analysepapir som ble plassert sentralt på den inokulerte agarplaten. Platene ble inkubert ved 24 °C i 3 dager. Antifungal aktivitet ble kontrollert ved måling av bredden på den klare sonen fra kanten av Whatmanpapiret til området for soppvekst. Verdiene er angitt som radius (mm) av sonen med inhibert vekst av patogenet på petriskålen. Total inhibisjon betyr at veksten var fullstendig inhibert.

I andre eksperimenter (data ikke vist) ble det funnet at citral og andre essensielle oljeformuleringer var effektive til å inhibere vekst av soppen Penicillium digitatum og av bakterien Erwinia carotovora, et viktig patogen i landbruksprodukter.

Eksempel 2

Uskadet grapefrukt ble høstet fra frukthagen og sortert den samme dag i laboratoriet for å fjerne skadet frukt. Grapefrukten ble vasket med springvann og lufttørket. Hver frukt ble deretter inokulert ved å stikke inn i flavedo-vevet, 15, mm dypt, med et verktøy med tre nåler på tre ulike steder. Før hver hulling, ble verktøyet dyppet i en sporesuspensjon av Penicillium digitatum (IO<6>sporer/ml). Den inokulerte grapefrukten ble oppbevart ved 17 °C og 85 % relativ fuktighet i 24 timer, deretter ble grapefruktene inndelt i seks grupper og grapefrukt fra hver gruppe ble behandlet ved neddypping i 2 minutter i: (a) vann; (b) 25 % etanol (EtOH); (c) 0,2 % geraniol i 25 % EtOH; (d) 0,1 % citral i 25 % EtOH; (e) 0,2 % citral i 25 % EtOH; og (f) 0,5 % citral i 25 %' EtOH.

Prosentandelen råtten frukt i hver gruppe ble målt hver dag etter behandling og resultatene er vist i figur 3.

Som det fremgår av figur 3, utviklet kontrollfrukten (kun dyppet i vann) rask forråtnelse, som når 100 % 8 dager etter inokulering. Forråtnelse av frukt dyppet i 25 % etanol (EtOH) ble forsinket, men 6 dager etter mokulering begynte en rask økning i forråtnelsen av EtOH-behandlet frukt, og 3 uker etter mokulering var mer enn 50 % av frukten råtten.

I motsetning viste frukt dyppet i 0,2 % geraniol og 0,1 % - 0,2 % citral oppløst i 25 % EtOH lavere forråtnelseshastighet og på dag 18 etter inokulering var bare 20 % - 40 % av frukten i disse gruppene råtten. Den mest effektive inhibisjon av forråtnelse ble observert ved å dyppe inokulert frukt i 0,2 % citral oppløst i 25 % EtOH, som fullstendig inhiberte forråtnelse av frukten fram til 18 dager etter inokulering, og resulterte i at kun 20 % av frukten viste forråtnelse så sent som 20 dager etter inokulering. Dosen på 0,5 % citral var for høy og i dette eksperimentet økte forråtnelsen pga. fytotoksisitet.

Eksempel 3

Sitroner ble inokulert som vist i eksempel 2 og behandlet med eller uten 25 % etanol for kontroll av om 5000 ppm av emulgatoren Tween 20 kunne stabilisere den antifungale citralaktiviteten. Resultatene som er vist i figur 4 demonstrerte at denne konsentrasjonen av Tween 20 økte citralaktiviteten. I tillegg forhindret den fytotoksisitet som vanligvis

forårsakes av citral, dersom den ikke er oppløst i etanol. Kanskje muliggjør emulgatoren dannelse av en mikrokolloidal stabil emulsjon, som forhindrer fytotoksisitet ved å tillate jevn dispersjon av citral, som er fytotoksisk i seg selv i disse konsentrasjoner. Tween 20 kombinert med antioksidanten DHA kan således erstatte etanol i formuleringen.

Eksempel 4

Ikke-inokulerte Washington-navleappelsiner ble inndelt i fire grupper som ble behandlet på følgende måte: (a) ingen behandling; (b) dyppet i 50 % etanol; (c) dyppet i 0,2 % citral i 0,02 % L-77 emulgator (vandig emulsjon); (d) dyppet i 0,2 % citral i 50 % etanol; og (e) dyppet i 0,2 % vandig imazalilløsning.

Appelsinene ble lagret i 4 måneder ved 15° C i 50-75 % relativ fuktighet, og prosentandelen råtten frukt i hver gruppe ble målt ved ulike tidspunkt under lagring. Disse resultatene er vist i tabell 3.

Som det fremgår av tabell 3 var prosentandelen råtten frukt etter behandling med formuleringen ifølge oppfinnelsen (0,2 % citral i 50 % etanol) betydelig lavere enn ved behandling med enten citral i en vandig emulsjon eller med etanol alene. Videre er resultatene med formuleringen ifølge oppfinnelsen sammenliknbare med de oppnådd med imazalil. Det høye forråtnelsesnivå ved citralbehandling med 0,02 % emulgator, var muligens forårsaket av fytotoksisitet observert ved denne behandling pga. av mangel på enten etanol eller høyere nivå av emulgator.

Eksempel 5

Kjøttstykker av okse ble inndelt i de følgende to grupper: (a) ikke behandlete kjøttstykker; (b) kjøttstykker dyppet i 30 sekunder i 0,2 % citral oppløst i 20 % etanol. Kjøttstykkene ble deretter oppbevart ved 1° C og 85 % relativ fuktighet, og totalantallet mikrobepopulasjoner i hvert kjøttstykke ble telt 2 uker etter behandling. Resultatene viste at totalantallet mikropopulasjoner i kjøttstykkene behandlet med citral oppløst i 20 % etanol var mindre enn 10 % av totalantallet funnet i de ikke-behandlete kjøttstykkene.

Eksempel 6

Sitroner inokulert med Penicillium som vist i eksempel 2 ble dyppet i 2 minutter i en vandig løsning omfattende citral, emulgator (Triton XI00) og BHA ved ulike konsentrasjoner. Konsentrasjonen av citral var 1,0 %. Kontrolløsningen omfattet 0,5 % Triton XI00. Resultatene er vist i figur 5. Effekten av 0,1 % BHA for å øke citralaktiviteten for forebyggelse av patogenet, vises klart.

Eksempel 7

Sitroner inokulert med Penicillium som vist i eksempel 2 ble behandlet med en vandig løsning omfattende 0,5 % citral, 0,3 % BHA, Tween 20 og imazalil, og oppbevart ved 20 °C i en periode på 21 dager. Resultatene er vist i figur 6. Imazalilkonsentrasjonen ved 1 og 10 ppm var ikke tilstrekkelig til fullstendig kontroll av forråtnelsen. Tilsetting av 0,5 % citral til 10 ppm imazalil forhindret imidlertid forråtnelsen fullstendig, og muliggjorde reduksjon av både dosen og rester av dette effektive, men uønskete syntetiske fungicid. Tilsetting av citral til 1 ppm imazalil kontrollerte ikke forråtnelsen tilfredsstillende, men var mye bedre enn 1 ppm imazalil alene.

Eksempel 8

Sitroner inokulert med Penicillium IO<4>sporer/ml ble dyppet en dag senere i en vandig

løsning omfattende citral og en detergent (Tween 20), andre essensielle oljer, så vel som kombinasjon av de mest effektive essensielle oljene, og oppbevart over en periode på 6 dager. Resultatene av den oppnådde mikrobielle beskyttelse med disse ulike essensielle oljer er vist i tabell 7. Noen av disse essensielle oljene, spesielt kanelsyre, vanillin,

oktanol og blandinger av flere essensielle oljer, var mer effektive i disse eksperimentene enn citral. I tillegg varte deres virkning mot Penicillium digitatum lengre.

Eksempel 9

Generell prosedyre for å oppnå et mest effektivt råekstrakt fra sitronflavedo.

Sifronfruktfiavedo (exocarp) ble innhentet og ekstrahert over natten i diklormetan, deretter eksponert for sollys i ca. 18 timer inntil fargen på diklormetanekstraktet ble brunt. Flavedo ble blandet og filtrert gjennom et lag av Whatman papir. Den ekstraherte løsningen ble fordampet for å fjerne diklormetan og den tykke væsken ble ytterligere separert ved kromatografi på en silika 60-kolonne ved anvendelse av diklormetan som bærer. To fraksjoner diklormetan, en grønn og den andre fargeløs, ble oppnådd etter kromatografi. Det aktive råekstrakt ble isolert ved fordamping av den grønne diklormetanfraksjonen. Sitronfrukt inokulert med Penicillium digitatum IO<4>sporer/ml ble dyppet 24 timer etter inokulering i en etanolløsning omfattende de ekstraherte vanillinpositive forbindelsene, og oppbevart ved 20° C. Effekten av forbindelsene på patogenutvikling i frukten ble daglig undersøkt under lagring. Effekten er vist i figur 7 for ulike konsentrasjoner (10000, 50000 og 2500 ppm råekstrakt) sammenliknet med effekten oppnådd ved en etanolløsning, imazalil eller vann. 10000 ppm råekstrakt forhindret fullstendig utvilding av patogenet. I en slik høy dose av råekstrakt viste noen frukter noe fytotoksisitet. Imidlertid ble det vist at denne fytotoksisitet hovedsakelig var forårsaket av andre forbindelser og ikke av de aktive antifungale komponentene, da fytotoksisiteten kunne fjernes, mens den biocidale aktivitet ble opprettholdt.

Tilsvarende resultater ble oppnådd ved heksanekstraksjoner av limonen.

Eksempel 10

Limonenhydroperoksider ble tilberedt ved de følgende to alternativer fra limonen.

Alternativ 1: Ved fotooksidering: Konvertering av limonen og utbytte av reaksjonen var nesten 100 % etter ca. 8 timers reaksjonstid. Ren EtOH ble anvendt som løsningsmiddel, Rose Bengal som aktivator. Andre lysaktivatorer, for eksempel klorofyll katalyserer også reaksjonen. Høytrykks kvikksølvlampe med WG 345-filter ble anvendt for den fotokatalytiske reaksjonen. Andre måter for lysstimulering, som monokromatisk lys (lysemittering~345 nm i tilfellet Rose Bengal), UV-lys og laser gir også limonenhydroperoksidprodukt.

Alternativ 2: Via en heterogen katalytisk måte (uten lys): Natrium molybdat (Na2Mo042H20) ble anvendt som katalysator, 300 ml konsentrert H2Q2som oksidasjonsmiddel, ble tilsatt løsningsmiddelet, 700 ml EtOH. Reaksjonsbetingelsene som medførte de ønskete produkter var: Atmosfærisk trykk, temperatur på 50° C og reaksjonstid på 5-6 timer med kontinuerlig røring. Konvertering av limonen og reaksjonsutbytte var nesten 100 %.

Produktene fra disse to alternative fremgangsmåtene ble sammenliknet. Gasskromatografianalyser viste omkring tilsvarende produlctfordeling. Den antifungale aktivitet av produktene tilberedt ved de to alternative måtene, ble undersøkt i den samme fremgangsmåte. Sitroner inokulert med Penicillium (IO<4>sporer/ml) ble dyppet i en vandig løsning omfattende limonenhydroperoksid, en detergent (Tween 20), og etanol. Forråtnelsen ble evaluert ved spesielle intervaller i løpet av en periode på 26 dager. Resultatene for mikrobiell beskyttelse oppnådd ved disse blandinger er vist i figurene 11 og 12.

I tilfellet alternativ 1 fant fytotoksisitet av frukten sted etter dyppingen. Økende mengde av Tween 20 i blandingen og fjerning av Rose Bengal eliminerte eller i det minste reduserte betydelig denne fytotoksisitet. Rose Bengal ble separert fra det aktive hydroperoksid ved å anbringe løsningen på en silikakolonne ved anvendelse av en blanding av heksan:etylacetat 9:1. Etter fjerning av Rose Bengal ble svært liten, om noen, fytotoksisk skade observert.

Formuleringen som ble anvendt omfattet 0,25 % limonenhydroperoksid, 1 % Tween 20, 400 ppm Rose Bengal og 25 % EtOH. En slik sammensetning inhiberte forråmelsesulviklingen fullstendig uten noen fytotoksisitet. 60 dager etter inokkulering ble ingen forråtnelse funnet på behandlet frukt, mens i prøvene som ble anvendt som kontroll, råtnet inokulert frukt etter 5 dager (figur 11). Denne antifungale effekt kan forklares ved både den direkte antifungale effekt av limonenhydroperoksid, og også av det økte nivå av scoparon og scopoletin, som ble indusert av limonenhydroperoksidene, vist tidligere for solbehandlet limonen (figur 1).

Ved alternativ 2 omfattet den anvendte formuleringen 0,5 % og 0,25 % Hmonenhydroperoksid, 2 % Tween 20 og 25 % EtOH. Forråtnelsen av inokulerte sitroner ble ikke utviklet i løpet av 12 dager (figur 12). Dosen på 0,5 % LHPO medførte fullstendig kontroll av forråtnelsen, og 0,25 % LHPO viste fortsatt noe utvikling av forråtnelse. KontroUøsningen omfattende 2 % Tween 20 og 25 % EtOH, viste svært lav antifungal aktivitet (90 % forråtnelse), som igjen viser at den aktive forbindelsen er limonenhydroperoksid.

Alternativ 2 foretrekkes i lys av det faktum at Rose Bengal, anvendt som katalysator ved alternativ 1 hadde uønskete virkninger: Den antifungale aktivitet ble redusert og fytotoksisiteten økte, og ved slutten av reaksjonen måtte den fjernes fra den aktive forbindelsen.

Eksempel 11

Sitroner inokulert med Penicillium (IO<4>sporer/ml) ble dyppet i en vandig løsning omfattende citral, en detergent (Tween 20), andre essensielle oljekomponenter, så vel som et diklormetanråekstrakt fra sitronflavedo eksponert for sollys. Forråtnelse ble evaluert ved spesielle intervaller i løpet av en periode på 20 dager. Resultatene av den oppnådde mikrobielle beskyttelse med disse ulike essensielle oljer er vist i figur 8.

Kombinasjon av solbehandlet råekstrakt, citral og 1-oktanol ved konsentrasjon på henholdsvis 0,5 % og 0,25 %, viste inhibisjon av utvikling av forråtnelse i mer enn 20 dager (figur 8). Disse behandlinger resulterte i mindre enn 5 % forråtnelse, mens den for kontrollen, ble funnet å være større enn 95 %. I tillegg oppsto mindre enn 10 % fruktforråtnelse etterbehandling med en kombinasjon av 0,25 % citral og 0,25 % 1-oktanol, eller 0,25 % citral og 0,25 % solbehandlet råekstrakt, eller 0,125 % citral, 0,125 % solbehandlet råekstrakt og 0,125 % 1-oktanol.

Eksempel 12

Ren limonen ble eksponert for sollys i 3 timer. En mikrobiocidal sarnmensetning ble fremstilt ved å løse det behandlete limonen i en vandig løsning inneholdende 25 % etanol og en detergent (Tween 20). Sitroner inokulert med Penicillium 10<4->sporer/ml, ble dyppet i ett minutt én gang eller opptil fire ganger en dag etter inokkulering i sammensetningen omfattende solbehandlet limonenløsning og lagret ved 20 °C. Effekten av solbehandlet limonen på utvikling av patogenet på frukten ble daglig undersøkt under lagring. Figur 9 viser effekten av antall dyppinger og lengden på hvert dypp på reduksjon av forråtnelse. Dataene antyder at resultatene er svært påvirket av mengden materiale absorbert av patogenet eller fruktvevet. Denne figuren viser at limonen behandlet med sollys gir bedre forråtnelseskontroll etter flere og lengre dypp, sammenliknet med ett dypp.

Hksftnr prf 13

Rent limonen ble bestrålt med UV-lys (254 nm) i 3 timer. En mikrobiocidal sammemetning ble fremstilt ved å oppløse det behandlete limonen i en vandig løsning inneholdende 25 % etanol og en detergent (Tween 20). Sitroner inokulert med Penicillium 10<4->sporer/ml ble dyppet én gang eller tre ganger i løsningen én dag etter inokkulering i ett minutt i den bestrålte løsningen og lagret ved 20 °C. I tilfelle av flere dypp, ble frukten hensatt til tørking i én time mellom to etterfølgende dypp.

Effekten av ultrafiolett bestrålt limonen på patogen utvikling på frukten, ble undersøkt i løpet av én måned. Figur 10 viser den tilsvarende forråtnelsesinhibisjon av 25 % alkoholløsning og behandling med ett dypp i 2500 ppm UV-behandlet limonen (definert som 3UVL). De tre etterfølgende dypp i UV-behandlet limonen (definert som 3UVL3) hadde den beste forråtnelseskontroll av alle behandlingene. Kontrolløsningen er en vandig løsning inneholdende Tween 20.

Eksempel 14

Celler av villtype Staphylococcus aureus (5 x IO<8>, ODeoo= 0,219), ble dyrket i 3 timer i næringsløsning (cy/gp) ved 37 °C med ulike konsentrasjoner av ekstrakter fra 50-100 ul. OD ble bestemt ved 600 nm. Prøve 1 omfatter 2000 ppm citral, 25 % etanol og 2000 ppm Tween 20. Prøve 2 omfatter de samme substanser som prøve 1 sammen med p-CD 500 ppm og 300 ppm BHA. Både prøve 1 og 2 inhiberte betydelig cellevekst av Staphylococcus aureus. De samme sammensetningene av substanser uten citral (prøvene 3 og 4) inhiberte ikke vekst av patogenet (figur 14).

Eksempel 15

Celler av villtype Candida alhicans (1 x 10 ) ble dyrket i næringsløsning ved

37 °C med ulike konsentrasjoner av ekstrakter fra 50-100 ul. OD ble bestemt ved 600 nm.

De følgende behandlinger i 6 ulike rør ble utført:

RØR 1.2000 ppm citral + 25 % etanol + 2000 ppm Tween 20.

RØR 2. 2000 ppm citral + 25 % etanol + 2000 ppm Tween 20 + 300 ppm BHA. RØR 3. 2000 ppm solbehandlet limonen + 2000 ppm Tween 20.

RØR 4. 2000 ppm solbehandlet limonen + 25 % etanol + 2000 ppm Tween 20. RØR 5. 25 % etanol + 2000 ppm Tween 20.

RØR 6.25 % etanol + 2000 ppm Tween 20 + 500 ppm p-CD + 300 ppm BHA.

2000 ppm citral i 25 % etanol og 2000 ppm Tween 20, eller de samme substanser sammen med p-CD 500 ppm, 300 ppm BHA, eller solbehandlet limonen oppløst i enten 25 % etanol eller 2000 ppm Tween 20, inhiberte cellevekst fullstendig av denne organismen. De samme sammensetninger av substanser uten citral eller solbehandlet limonen (rørene 5 og 6) inhiberte ikke vekst av patogenet (figur 15).

Claims (4)

1. Mikrobiocidal, vandig formulering omfattende: (i) en effektiv mengde av citral, (ii) minst en ytterligere stabilisator, nemlig en antioksidant valgt fra gruppen bestående av butylert hydroksyanisol (BHA), askorbinsyre, butylert hydroksytoluen (BHT) isoaskorbinsyre, a-tokoferol, p-karoten, eller blandinger derav; og (iii) imazalil, i en konsentrasjon fra 5 ppm til 100 ppm.

2. Mikrobicidal, vandig formulering ifølge krav 1, hvor konsentrasjonen av citral er fra 0,1% til 1%.

3. Fremgangsmåte for inhibering av mikrobiell utvikling omfattende påføring av en effektiv mengde av en vandig formulering ifølge krav 1 eller 2.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, for beskyttelse av frukt og grønnsaker mot forråtnelse etter innhøsting.