KR20150016634A - 중합체 코팅 - Google Patents

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웨인 엔. 조지
대니얼 브래턴
앤드류 에이. 브라운
홍지 렌
라이언 씨. 스미스
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 기재의 표면에 공유 부착된 중합체 코팅, 그리고 분자 어레이 및 플로우 셀 등과 같은, 기재의 형성 및 조작 시 중합체 코팅, 예컨대, 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM)의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 공유 부착된 중합체, 예컨대, PAZAM으로 코팅된 비드를 이용해서 기재 표면을 제조하는 방법, 그리고 본 명세서에 기술된 기재 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

중합체 코팅{POLYMER COATINGS}
출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2012년 6월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제61/657,508호; 2013년 1월 17일에 출원된 미국 특허 출원 제61/753,833호; 및 2013년 3월 4일에 출원된 미국 특허 출원 제13/784,368호에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 이로써 이들은 모두 그들의 전문이 참조로 포함된다.
분야
일반적으로, 본 발명은 화학, 생물 및 재료 과학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 핵산 및 단백질 등과 같은 분자의 검출 및/또는 분석을 위하여 이용되는 기재(substrate)의 표면에 공유 부착된(covalently attached) 중합체 코팅에 관한 것이다.
중합체-코팅된 기재는 다수의 기술적 응용에서 사용된다. 예를 들어, 이식가능한 의료 기기는 생물학적으로 불활성인 중합체로 코팅될 수 있다. 다른 예에서, 중합체 코팅된 기재는 생물학적 분자의 제조 및/또는 분석을 위하여 이용된다. 소정의 핵산 서열분석 방법 등과 같은 분자 분석은, 기재의 중합체-코팅된 표면에 대한 핵산 가닥의 부착에 의존한다. 부착된 핵산 가닥의 서열은 이어서 당업계에 잘 알려진 많은 상이한 방법에 의해 결정될 수 있다.
소정의 합성에 의한 서열분석 방법(sequencing-by-synthesis process)에 있어서, 플로우 셀(flow cell)의 하나 이상의 표면은 핵산이 부착되는 중합체로 코팅된다. 플로우 셀을 코팅하는데 이용되는 현재의 절차는 플로우 셀 상의 채널 내로 중합 믹스를 이동시키고 고정된 시간 기간 동안 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 이 절차는 간단하고, 브리지 증폭 및 서열분석을 포함하는 모든 하류 화학 처리 단계를 지속적으로 지지할 수 있는 신뢰성 있는 코팅을 초래한다.
그러나, 현재 사용되는 표면 중합체 코팅의 다수에 몇 가지 제약이 있다. 예를 들어, (i) 현재의 접근법의 몇몇은 공기-민감성 중합체 믹스가 요구되기 때문에 표면을 코팅하는데 이용될 수 있는 방법을 제한하고; (ii) 형성된 코팅의 몇몇은 "습윤" 상태에서, 예를 들어, 수용액 중에서 보관되어야 하며; 그리고 (iii) 강도 구배를 피하기 위하여 그래프팅 조건(grafting condition)이 최적화될 필요가 종종 있다.
게다가, 주기적으로 이격된 구획된 특징부(feature)들을 지니는 패턴화된 플로우 셀을 작성할 필요도 있다. 패턴화된 플로우 셀을 작성하는 하나의 방법은 비드를 화학적으로 수식하고 나서 그 비드를 미리 배열된 표면에 적용하는 것이며, 여기서 표면은 해당 비드를 수용할 수 있는 개방 벽을 포함하고 있다. 비드는 이것을 벽 내로 장입하기 전에 클러스터-성장 기반 서열분석을 지지할 수 있는 중합체로 코팅될 수 있다. 평면 어레이 표면 상에 유용한 중합체 코팅은 해당 코팅에 의해 초래되는 응집 및 코팅 후 수용성 완충액 중에 비드를 보관하는 요건으로 인해 비드를 코팅하기에 편리하지 않을 수 있다. 이 때문에 상업적 응용에 일부 제한이 있다. 따라서, 비드를 코팅하는데 이용될 경우 현재의 중합체 코팅의 단점의 하나 이상을 겪지 않는 새로운 중합체 코팅에 대한 필요가 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태는 개선된 중합체 코팅을 포함하는 하나 이상의 표면을 지니는 기재에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 플로우 셀이고, 중합체 코팅은 플로우 셀의 하나 이상의 레인의 하나 이상의 표면에 적용된다.
본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태는 표면을 포함하는 기재에 관한 것으로, 여기서 해당 표면에는 중합체 코팅이 공유 부착되어 있다. 본 명세서에 기술된 조성물의 다른 실시형태는 작용화된 표면(functionalized surface)을 포함하는 기재에 관한 것으로, 여기서 해당 표면 상의 일련의 작용기에 중합체 코팅이 공유 부착되고, 이들 작용기는 스트라우딩거 결찰(Staudinger ligation)을 위한 오쏘 위치에 포스핀 치환체를 지니는 알켄, 알킨, 나이트렌, 알데하이드, 하이드라진, 활성화 에스터, 글라이시딜 에터, 아민, 말레이미드 및 벤조일 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태는 화학식 (I) 및 (II)의 반복 단위를 포함하는 중합체 코팅을 지니는 표면을 포함하는 기재를 제공한다. 소정의 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시된다. 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ib)로 표시된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IIIa)의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IIIb)의 중합체를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IV)의 중합체를 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법의 몇몇 실시형태는 기재의 표면에 고정된 중합체 코팅을 제조하는 것에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 중합체를 기재의 표면과 접촉시켜서, 표면 위에 중합체 코팅의 층을 형성하는 것을 포함하되, 여기서 표면은 복수의 작용기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 기재의 표면 상의 작용기에 공유 결합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 중합성 재료를 기재의 표면 상에 중합시킴으로써 기재의 표면 상에 인시츄(in situ)로 형성된다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 중합체는 기재의 표면과 접촉하기 전에 사전 형성된다. 소정의 실시형태에 있어서, 작용기는 스트라우딩거 결찰을 위한 오쏘 위치에 포스핀 치환체를 지니는 알켄, 알킨, 나이트렌, 알데하이드, 하이드라진, 활성화 에스터, 글라이시딜 에터, 아민, 말레이미드 및 벤조일 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드기를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 알켄기를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (I) 및 (II)의 반복 단위를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시된다. 소정의 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ib)로 표시된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IIIa)의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III')의 중합체는 또한 화학식 (IIIb)에 의해 표시된다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IV)의 중합체를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 표면의 작용기에 공유 결합하기 전에 수용액 중에 용해된다.
본 명세서에 기술된 방법의 다른 실시형태는 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시형태에 있어서, 해당 방법은 복수의 올리고뉴클레오타이드를 본 명세서에 기술된 조성물들 중 어느 하나의 중합체 코팅 또는 본 명세서에 기술된 방법들 중 어느 하나에 의해 제조된 중합체 코팅에 존재하는 반응 부위와 반응시키는 단계; 중합체 코팅에 부착된 복수의 올리고뉴클레오타이드를 증폭될 주형과 접촉시키는 단계(각 주형은 올리고뉴클레오타이드와 혼성화(hybridizing) 가능한 서열을 포함함); 및 올리고뉴클레오타이드를 이용해서 주형을 증폭시킴으로써, 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 프라이머가 이용될 수 있는데, 그 중 하나 혹은 둘은 중합체 코팅에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 복수의 제1올리고뉴클레오타이드를 본 명세서에 기술된 조성물들 중 어느 하나의 중합체 코팅 또는 본 명세서에 기술된 방법들 중 어느 하나에 의해 제조된 중합체 코팅에 존재하는 반응 부위와 반응시키는 단계; 중합체 코팅에 부착된 복수의 제1올리고뉴클레오타이드를 증폭될 주형과 접촉시키는 단계(각 주형은 3' 단부에 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화가능한 서열을 그리고 5' 단부에 그 보체가 제2올리고뉴클레오타이드에 혼성화가능한 서열을 포함함); 및 주형을 제1올리고뉴클레오타이드 및 제2올리고뉴클레오타이드를 이용해서 증폭시켜(여기서 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅에 선택적으로 부착됨), 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 아지도기와 반응될 알킨기를 포함한다. 이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅에 존재하는 염화사이아누르(cyanuric chloride)와 반응될 아민기를 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 활성화된 아민기, 예컨대, 하이드라지닐기 또는 하이드라조닐기와 반응될 알데하이드기를 포함한다 . 이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 티오사이아네이트기 또는 카복실산기와 반응될 아민기를 포함한다. 이러한 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 글라이시딜기와 반응될 아민기를 포함한다. 이러한 방법의 더욱 추가의 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 다이-알데하이드 링커를 통해서 중합체 코팅의 아민기와 반응될 아민기를 포함한다. 이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅에 존재하는 활성화 에스터 혹은 에폭시기와 반응될 아민기를 포함한다. 이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅에 존재하는 옥소-아민기와 반응될 알데하이드기를 포함한다. 이러한 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 복수의 제1올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2올리고뉴클레오타이드와 반응하기 전에 물 혹은 수성 완충액으로 세척된다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (III)의 중합체를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (III')의 중합체를 포함한다.
본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태는 본 명세서에 기술된 기재 조성물들 중 어느 하나를 포함하는 플로우 셀에 관한 것이다. 몇몇 이러한 실시형태는 중합체 코팅을 통해서 기재의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 클러스터에 존재한다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 단일의 폴리뉴클레오타이드 클러스터 내의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 지닌다. 클러스터 내의 개별의 폴리뉴클레오타이드는 일단부에서 혹은 양단부에서 중합체 코팅에 부착될 수 있다. 부착(들)은 폴리뉴클레오타이드의 가닥의 5' 및/또는 3' 단부를 통해서 가능할 수 있다. 상이한 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 지니지만, 이것은 모든 실시형태에서 필수는 아니다.
본 명세서에 기술된 방법의 몇몇 실시형태는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 이러한 실시형태는 (a) 폴리뉴클레오타이드 중합효소를 중합체 코팅을 통해서 본 명세서에 기술된 조성물의 어느 하나의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드 클러스터와 접촉시키는 단계; (b) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 중합효소에 의해 이용될 경우 검출가능한 신호가 발생되도록 기재의 표면에 뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 클러스터에서 신호를 검출하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c)를 반복함으로써, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 클러스터에 존재하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 기재의 표면은 플로우 셀 내에 존재한다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 단일 유형의 뉴클레오타이드만이 단일 흐름 단계 동안 플로우 셀 내에 존재한다. 이러한 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로부터 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법의 다른 실시형태에 있어서, 복수의 상이한 유형의 뉴클레오타이드가 단일 흐름 단계 동안 플로우 셀에 존재한다. 이러한 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로부터 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 검출가능한 신호는 광학 신호를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 검출가능한 신호는 비광학 신호를 포함한다. 이러한 실시형태에 있어서, 비광학 신호는 파이로포스페이트의 농도 변화 혹은 pH의 변화일 수 있다.
본 명세서에 기술된 몇몇 실시형태는 비드의 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 비드의 표면 상에 복수의 작용기를 형성하는 단계; 및 본 명세서에 기술된 중합체 코팅을 비드와 접촉시켜 비드의 표면 상에 중합체 코팅층을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 중합체 코팅은 비드의 표면 상의 작용기에 공유 결합된다. 중합체 코팅된 비드는 코팅 전 혹은 후에 기재의 표면 상에 장입될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 표면은 개방 웰(open well)을 포함할 수 있고, 각 웰은 하나 이상의 비드를 수용하는 치수를 지닐 수 있다(즉, 몇몇 실시형태에서 웰은 단지 단일의 비드만을 수용할 수 있음). 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 아크릴아마이드기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (I) 및 (II)의 반복 단위를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시된다. 소정의 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ib)로 표시된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III)의 중합체는 또한 화학식 (IIIa)로 표시된다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III')의 중합체는 또한 화학식 (IIIb)로 표시된다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 화학식 (IV)의 중합체를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 비드는 본 명세서에 기술된 중합체 코팅으로 완전히 코팅된다. 다른 실시형태에 있어서, 비드는 본 명세서에 기술된 중합체 코팅으로 부분적으로 코팅된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 상승된 온도에서 비드의 표면에 공유 결합된다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 포토 활성화(photo activation)를 통해서 비드의 표면에 공유 결합된다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 비드는 웰 내에 미리 배열되고, 중합체 코팅이 이어서 이 배열된 비드에 공유 결합된다.
비드는 화학적, 생체 흡착성 혹은 이들 둘 모두의 힘을 통해서 기재의 표면(예컨대, 플로우 셀 또는 웰)에 고정될 수 있다.　 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅된 비드는 이를 기재의 표면 상의 개방 웰 속에 장입함으로써 기재의 표면에 고정된다.　 대안적으로 또는 부가적으로, 중합체 코팅된 비드는 기재의 표면 상의 작용기에 공유 결합됨으로써 기재의 표면에 고정된다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기술된 방법은 비드를 기재의 표면에 장입하기 전에 과잉의 미결합된 중합체 코팅을 제거하도록 중합체 코팅된 비드를 세척하는 단계를 더 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 전처리된 비드와 접촉하기 전에 용액 중에 용해된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 수용액 중에 용해된다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기술된 방법은 본 명세서에 기술된 바와 유사한 방법을 이용해서 배열된 폴리뉴클레오타이드를 형성하기 위하여 부가적인 단계들을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면은 웰, 패드 혹은 기타 특징부로 패턴화된다.
본 명세서에 기술된 몇몇 바람직한 실시형태는 중합체 코팅이 공유 부착된 표면을 구비하는 기재에 관한 것으로, 여기서 중합체 코팅은 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III)의 중합체는 또한 화학식 (IIIa)로 표시된다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III')의 중합체는 또한 화학식 (IIIb)로 표시된다. 일 실시형태에 있어서, 기재는 비드이다.
본 명세서에 기술된 몇몇 바람직한 실시형태는 기재의 표면을 제조하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 기재의 표면 상에 복수의 작용기를 형성하는 단계, 및 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 기재의 표면과 접촉시켜 기재의 표면 상에 중합체 코팅층을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 중합체 코팅은 기재의 표면 상의 작용기에 공유 결합된다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III)의 중합체는 또한 화학식 (IIIa)로 표시된다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (III')의 중합체는 또한 화학식 (IIIb)로 표시된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 알켄, 알킨, 또는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 상승된 온도에서 알켄기에 공유 결합된다. 일 실시형태에 있어서, 알켄기는 아크릴아마이드기이다. 일 실시형태에 있어서, 기재는 비드이다.
도 1a는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM)의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 도면;
도 1b는 PAZA에 대한 컴퓨터 계산된 분자량 분포를 도시한 도면;
도 1c는 가볍게 가교결합된 PAZAM의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 도면;
도 2a 및 도 2b는 PAZAM를 이용해서 코팅된 전형적인 유리 플로우 셀의 타이푼 스캔(Typhoon scan)(도 2b) 및 플로우 셀의 8개의 레인을 따라 중앙 타이푼 강도(도 2a)를 도시한 도면;
도 3a 및 도 3b는 PAZAM을 이용해서 코팅된 HiSeq 유리 플로우 셀의 타이푼 스캔을 도시한 도면. 도 3a는 상보적 염료-함유 올리고뉴클레오타이드 서열과 혼성화된 그래프트된 표면의 타이푼 형광 화상을 도시한 도면. 도 3b는 인시츄 PAZAM의 중앙 타이푼 강도의 차트를 도시한 도면;
도 4a 및 도 4b는 PAZAM을 이용해서 스핀 코팅된 유리 기재의 타이푼 스캔을 도시한 도면. 도 4a는 상보적 염료-함유 올리고뉴클레오타이드 서열과 혼성화된 그래프트된 표면의 타이푼 형광 화상을 도시한 도면. 도 4b는 스핀 코팅된 PAZAM의 중앙 타이푼 강도의 차트를 도시한 도면;
도 5a 내지 도 5c는 흐름-코팅된 PAZAM 표면 상의 클러스터를 도시한 도면. 도 5a는 채널들의 UV-조사된 영역의 확대도. 도 5b 및 도 5c는 채널들의 클러스터 수 및 클러스트 여과 강도를 도시한 도면;
도 6a 내지 도 6c는 스핀-코팅된 PAZAM 표면 상의 클러스터를 도시한 도면. 도 6a는 Hiseq 플로우 셀 상의 스핀 코팅된 PAZAM의 중앙 타이푼 강도의 차트를 도시한 도면. 도 6b는 상보적 염료-함유 올리고뉴클레오타이드 서열과 혼성화된 그래프트된 표면의 타이푼 형광 화상을 도시한 도면. 도 6c는 레인 3 및 5 상의 클러스터의 확대 화상을 도시한 도면;
도 7a 및 도 7b는 전형적인 플로우 셀 화상(도 7b) 및 플로우 셀의 8개 라인을 따른 중앙 강도(도 7a)를 도시한 도면;
도 8a 내지 도 8i는 흐름-코팅된 PAZAM 혼합물 상의 클러스터와 폴리뉴클레오타이드의 서열분석 및 얻어진 데이터를 도시한 도면;
도 9는 상보적 형광 올리고뉴클레오타이드와 혼성화된 알킨 올리고로 작용화된 스핀 코팅된 기재를 도시한 도면;
도 10a 및 도 10b는 대안적인 광-활성 크로스링커(photo-active crosslinker)의 스크리닝 결과를 도시한 도면. 도 10a는 중앙 타이푼 강도 대 포토(Photo) XL의 차트를 도시한 도면. 도 10b는 상이한 가교제의 UV 시간 대 포토 XL의 차트를 도시한 도면;
도 11a 내지 도 11b는 광활성, 패턴화된 표면 및 중합체 로킹(polymer locking)을 도시한 도면;
도 12는 10% 미만의 습도를 지니는 실온에서 6일 보존된 후의 열 가교결합된 PAZAM 층 상의 잔류 표면%를 예시한 도면;
도 13a는 열 가교된 PAZAM 표면 상에 5 PhiX 주형을 이용해서 성장된 클러스터를 예시한 도면;
도 13b는 열 가교결합된 플로우 셀 상에서 2×26 사이클 실행 후의 서열분석 메트릭을 예시한 도면;
도 14는 패턴화된 실란 패취에 PAZAM을 열 가교결합함으로써 제작된 패턴화된 어레이 상에 성장된 클러스터를 예시한 도면;
도 15는 PAZAM 코팅된 비드에 의해 제작된 패턴화된 PAZAM 어레이를 예시한 도면;
도 16은 광활성 중합체를 이용한 분할 및 조합 접근법을 예시한 도면.
본 발명은 표면에 공유 결합된 중합체로 코팅된 해당 표면을 포함하는 기재에 관한 것이다. 이러한 기재의 바람직한 실시형태는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM 또는 DASFA라고도 알려짐) 코팅을 포함한다. 이들 중합체 코팅은 기재의 작용화된 표면, 예컨대, 플로우 셀의 표면 혹은 분자 어레이의 표면에 공유 부착된다. 본 발명은 또한 이러한 중합체-코팅된 표면을 제조하는 방법, 그리고 이러한 중합체 코팅된 표면을 포함하는 기재를 이용하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, PAZAM-코팅된 표면을 지니는 기재는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 이용된다.
이 신규한 중합체 코팅 및 접근법은, 현재 공지된 중합체 코팅의 많은 제약을 극복하는 공기-안정적인 재료를 생성한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 용어 "포함하는(including)"뿐만 아니라 기타 형태, 예컨대, "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"의 사용은 제한적이지 않다. "지니는(혹은 구비하는)(having)"뿐만 아니라 기타 형태, 예컨대, "지니다(have)", "지니다(has)" 및 "지녔다(had)"의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 과도적인 문구에서든지 혹은 청구범위의 본체에서든지 간에, 용어 "포함하다(comprise(s))" 및 "포함하는(comprising)"은 제약을 두지 않는 의미를 지니도록 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어들은 "적어도 지니는" 또는 "적어도 포함하는"의 어구와 동의어적으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 방법의 맥락에서 이용되는 경우, 용어 "포함하는"은 그 방법이 적어도 인용된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계를 포함할 수 있는 것을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 이용되는 경우, 용어 "포함하는"은 그 화합물, 조성물 혹은 장치가 적어도 인용된 특징 혹은 성분을 포함하지만, 또한 추가적인 특징 혹은 성분도 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 공통적인 유기 약어는 다음과 같이 정의된다:
Ac 아세틸
Ac2O 아세트산 무수물
APTS 아미노프로필 실란
APTES (3-아미노프로필)트라이에톡시실란
APTMS (3-아미노프로필)트라이메톡시실란
aq. 수성
Azapa N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드
APTMS 3-아미노프로필 트라이메톡시실란
BHT 뷰틸화 하이드록실 톨루엔
Bn 벤질
Brapa 또는 BRAPA N-(5-브로모아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드
Bz 벤조일
BOC 또는 Boc tert-뷰톡시카보닐
Bu n-뷰틸
cat. 촉매
Cbz 카보벤질옥시
CyCl 염화사이아누르
℃ 섭씨온도
dATP 데옥시아데노신 삼인산염
dCTP 데옥시사이토신 삼인산염
dGTP 데옥시구아노신 삼인산염
dTTP 데옥시티민 삼인산염
DBU 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔
DCA 다이클로로아세트산
DCE 1,2-다이클로로에탄
DCM 염화메틸렌
DIEA 다이아이소프로필에틸아민
DMA 다이메틸아세트아마이드
DME 다이메톡시에탄
DMF N,N'-다이메틸폼아마이드
DMSO 다이메틸설폭사이드
DPPA 다이페닐포스포릴 아자이드
Et 에틸
EtOAc 에틸 아세테이트
g 그램(들)
GPC 겔 침투 크로마토그래피
h 또는 hr 시간(들)
iPr 아이소프로필
KPi pH 7.0에서의 10mM 인산칼륨 완충액
KPS 과황산칼륨
IPA 아이소프로필 알코올
IPHA·HCl N-아이소프로필하이드록실아민 염산염
LCMS 액체 크로마토그래피-질량 분광법
LDA 리튬 다이아이소프로필아마이드
m 또는 min 분(들)
mCPBA 메타-클로로퍼옥시벤조산
MeOH 메탄올
MeCN 아세토나이트릴
㎖ 밀리리터(들)
MTBE 메틸 tert-뷰틸 에터
NaN3 아자이드화나트륨
NHS N-하이드록시숙신이미드
PAZAM 아자파 비(Azapa ratio)에 대한 임의의 아크릴아마이드의 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)
PG 보호기
Ph 페닐
ppt 석출물
rt 실온
SFA 미국 특허 공개 제2011/0059865호에 정의된 바와 같은 실란 유리 아크릴아마이드(Silane Free Acrylamide)
설포-HSAB 또는 SHSAB N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트
TEA 트라이에틸아민
TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실
TCDI 1,1'-티오카보닐 다이이미다졸
Tert, t 3차
TFA 트라이플루오로아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
TEMED 테트라메틸에틸렌다이아민
㎕ 마이크로리터(들)
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상이한 프로브 분자가 상대 위치에 따라서 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 기재에 부착된 상이한 프로브 분자의 집단을 지칭한다. 어레이는 기재 상의 상이한 어드레스를 가진 위치에 각각 위치된 상이한 프로브 분자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 어레이는 상이한 프로브 분자를 각각 보유하는 별도의 기재를 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 프로브 분자는 액체 중 기재의 위치에 따라서 혹은 기재가 부착되는 표면 상의 기재의 위치에 따라서 식별될 수 있다. 별도의 기재가 표면 상에 위치되는 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어, 미국 특허 제6,355,431 B1호, 미국 특허 공개 제2002/0102578호 및 PCT 공개 제WO 00/63437호에 기술된 바와 같이 웰 내에 비드를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, FACS(fluorescent activated cell sorter) 등과 같은 미세유체 장치를 이용해서 액체 어레이 중에서 비드를 구별하기 위하여 본 발명에서 이용될 수 있는 예시적인 형태는, 예를 들어, 미국 특허 제6,524,793호에 기술되어 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 어레이의 추가의 예는, 제한 없이, 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 제WO 93/17126호; 제WO 95/11995호; 제WO 95/35505호; 제EP 742 287호; 및 제EP 799 897호에 기술된 것들을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"이란 원자들 간에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅이란, 다른 수단, 예를 들어, 접착 혹은 정전기 상호작용을 통해서 표면에 부착되는 것에 비해서, 기재의 작용화된 표면과의 화학적 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유 부착된 중합체는 또한 공유 부착 이외의 수단을 통해서 결합될 수도 있다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "중합체 로킹"이란, 중합체 코팅이 표면에 공유 결합되도록 기재의 표면 상의 작용기가 중합체 코팅과 반응하는 과정을 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 임의의 "R"기(들), 예컨대, 제한 없이, R2, R3, R4, R5, R6 , R7 및 R8은 표시된 원자에 부착될 수 있는 치환체를 나타낸다. R기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다. 2개의 "R"기가 "함께 취해져서"라고 기술된 경우, R기들과 이들이 부착되는 원자들이 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클을 형성할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, R2와 R3, 또는 R2, R3, 또는 R4와, 이것이 부착되는 원자는 "함께 취해져서" 또는 "함께 연결되어"라고 표시된 경우, 이것은 이들이 서로 공유 결합되어 고리를 형성하는 것을 의미하며, 그 예는 이하에 기술되어 있다:
Figure pct00001
하나의 기가 "선택적으로 치환된"으로 묘사된 경우는 언제든지, 그 기가 표시된 치환체의 하나 이상으로 치환되거나 비치환되어 있을 수 있다. 마찬가지로, 하나의 기가 "비치환 또는 치환된"으로 묘사된 경우, 치환된이라면, 치환체는 하나 이상의 표시된 치환체로부터 선택될 수 있다. 치환체가 표시되지 않은 경우, 이것은 표시된 "선택적으로 치환된" 또는 "치환된" 기가 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, (헤테로알리사이클릴)알킬, 하이드록시, 보호된 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시, 아실, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 사이아노, 할로겐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, 보호된 C-카복시, O-카복시, 아이소사이아나토, 티오사이아나토, 아이소티오사이아나토, 나이트로, 실릴, 설페닐, 설피닐, 설포닐, 할로알킬, 할로알콕시, 트라이할로메탄설포닐, 트라이할로메탄설폰아미도, 아미노, 모노-치환된 아미노기, 다이-치환된 아미노기, 및 이들의 보호된 유도체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 작용기의 군으로부터 개별적으로 그리고 독립적으로 선택된 하나 이상의 기(들)로 개별적으로 그리고 독립적으로 치환될 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬"이란 완전히 포화된(이중 혹은 삼중 결합이 없는) 탄화수소기를 포함하는 직쇄 혹은 분지쇄의 탄화수소 사슬을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 지닐 수 있다(이것이 본 명세서에서 나타날 때는 언제든지, "1 내지 20" 등과 같은 수치 범위는 단부 지점들을 포함하는 주어진 범위 내의 각 정수를 지칭하며; 예컨대, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 등등, 20개의 탄소 원자를 포함하여 그것까지로 구성될 수 있지만, 본 정의는 또한 그 수치 범위가 표시되지 않은 경우의 용어 "알킬"의 경우도 망라하는 것이다). 알킬기는 또한 약 7 내지 약 10개의 탄소 원자를 지니는 중간 크기의 알킬일 수도 있다. 알킬기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 지니는 저급 알킬일 수도 있다. 화합물의 알킬기는 "C1-C4 알킬" 또는 유사한 표기로서 표시될 수 있다. 단지 예로서, "C1-C4 알킬"은 알킬 사슬 중에 1 내지 4개의 탄소 원자가 있는 것을 나타내며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, 아이소-뷰틸, sec-뷰틸 및 t-뷰틸로부터 선택된다. 전형적인 알킬기는, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, 아이소뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 알킬기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알케닐"이란 1개 이상의 이중 결합을 지니는 직쇄 혹은 분지쇄의 탄화수소 사슬을 포함하는 알킬기를 지칭한다. 알케닐기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알키닐"이란 1개 이상의 삼중 결합을 지니는 직쇄 혹은 분지쇄의 탄화수소 사슬을 포함하는 알킬기를 지칭한다. 알키닐기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알킬"이란 완전히 포화된(이중 혹은 삼중 결합이 없음) 단환식 혹은 다환식 탄화수소 고리계를 지칭한다. 2개 이상의 고리로 구성될 경우, 고리들은 축합 방식으로 함께 연결될 수 있다. 사이클로알킬기는 고리(들) 중에 3 내지 10개의 원자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 사이클로알킬기는 고리(들) 중에 3 내지 8개의 원자를 포함할 수 있다. 사이클로알킬기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다. 전형적인 사이클로알킬기는, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알케닐"이란 적어도 하나의 고리 중에 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 단환식 혹은 다환식 탄화수소 고리계를 지칭하지만; 이중 결합은, 하나보다 많이 있다면, 모든 고리를 통해서 완전히 비편재화된 파이-전자계를 형성할 수 없다(다르게는 기는 본 명세서에 정의된 바와 같이 "아릴"일 수 있다). 2개 이상의 고리로 구성되는 경우, 고리들은 축합 방식으로 함께 연결될 수 있다. 사이클로알케닐기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알키닐"이란 적어도 하나의 고리 중에 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 단환식 혹은 다환식 탄화수소 고리계를 지칭한다. 하나 보다 많은 삼중 결합이 있다면, 삼중 결합은 모든 고리를 통해서 완전히 비편재화된 파이-전자계를 형성할 수 없다. 2개 이상의 고리로 구성되는 경우, 고리들은 축합 방식으로 함께 연결될 수 있다. 사이클로알키닐기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아릴"이란 고리들 중 적어도 하나를 통해서 완전히 비편재화된 파이-전자계를 지니는 탄소환식(모두 탄소) 단환식 혹은 다환식 방향족 고리계(예컨대, 2개의 탄소환 고리가 화학 결합을 공유할 경우 축합, 브리지화, 혹은 스피로 고리계, 예컨대, 1개 이상의 아릴 또는 비아릴 고리를 지니는 1개 이상의 고리를 포함함)를 지칭한다. 아릴기 중의 탄소 원자의 개수는 변할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 아릴기는 C6-C14 아릴기, C6-C10 아릴기 또는 C6 아릴기일 수 있다. 아릴기의 예로는 벤젠, 나프탈렌 및 아줄렌을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 아릴기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"이란 적어도 1개의 헤테로원자(예컨대, O, N, S)를 포함하는 고리계를 지칭한다. 이러한 계는 불포화되어 있을 수 있거나, 일부 불포화를 포함할 수 있거나, 또는 몇몇 방향족 부분을 함유할 수 있거나, 또는 모두 방향족일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로아릴"이란 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 탄소 이외의 원소와 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 단환식 혹은 다환식 방향족 고리계(완전히 비편재화된 파이-전자계를 지니는 적어도 하나의 고리를 구비하는 고리계)를 지칭한다. 헤테로아릴기의 고리(들) 중의 원자의 개수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로아릴기는 고리(들) 중에 4 내지 14개의 원자, 고리(들) 중에 5 내지 10개의 원자, 또는 고리(들) 중에 5 내지 6개의 원자를 함유할 수 있다. 또한, 용어 "헤테로아릴"은, 2개의 고리, 예컨대, 적어도 1개의 아릴 고리와 적어도 하나의 헤테로아릴 고리, 또는 적어도 2개의 헤테로아릴 고리가 적어도 하나의 화학 결합을 공유하는 축합 고리계를 지칭한다. 헤테로아릴 고리의 예로는, 퓨란, 퓨라잔, 티오펜, 벤조티오펜, 프탈라진, 피롤, 옥사졸, 벤조옥사졸, 1,2,3-옥사졸, 1,2,4-옥사졸, 티아졸, 1,2,3-티아다이아졸, 1,2,4-티아다이아졸, 벤조티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 인돌, 인다졸, 피라졸, 벤조피라졸, 아이소옥사졸, 벤조아이소옥사졸, 아이소티아졸, 트라이아졸, 벤조트라이아졸, 티아다이아졸, 테트라졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 퓨린, 프테리딘, 퀴놀린, 아이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 신놀린 및 트라이아진을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 헤테로아릴기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로알리사이클릭" 또는 "헤테로알리사이클릴"이란 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 18-원까지의 단환식, 이환식 및 삼환식 고리계를 지칭하되, 여기서 탄소 원자는 1 내지 5개의 헤테로원자와 함께 상기 고리계를 구성한다. 헤테로사이클은 이와 같이 해서 위치된 하나 이상의 불포화 결합을 선택적으로 포함할 수 있지만, 완전 비편재화된 파이-전자계는 모든 고리를 통해서 일어나지는 않는다. 헤테로원자는 산소, 황 및 질소로부터 독립적으로 선택된다. 헤테로사이클은 그 정의가 옥소-계 및 티오-계, 예컨대, 락탐, 락톤, 환식 이미드, 환식 티오이미드, 및 환식 카바메이트를 포함하도록 1개 이상의 카보닐 혹은 티오카보닐 작용기를 더 함유할 수 있다. 2개 이상의 고리로 구성된 경우, 그 고리들은 축합 방식으로 함께 연결될 수 있다. 또한, 헤테로알리사이클릭 내의 임의의 질소는 4차화되어 있을 수 있다. 헤테로알리사이클릴 또는 헤테로알리사이클릭기는 비치환 또는 치환되어 있을 수 있다. 이러한 "헤테로알리사이클릭" 또는 "헤테로알리사이클릴"기의 예로는, 1,3-다이옥신, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥산, 1,2-다이옥솔란, 1,3-다이옥솔란, 1,4-다이옥솔란, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사티인, 1,3-옥사티올란, 1,3-다이티올, 1,3-다이티올란, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 숙신이미드, 바비투르산, 티오바비투르산, 다이옥소피페라진, 히단토인, 다이하이드로유라실, 트라이옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아진, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 아이소옥사졸린, 아이소옥사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘, 몰폴린, 옥시란, 피페리딘 N-옥사이드, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 4-피페리돈, 피라졸린, 피라졸리딘, 2-옥소피롤리딘, 테트라하이드로피란, 4H-피란, 테트라하이드로티오피란, 티아몰폴린, 티아몰폴린 설폭사이드, 티아몰폴린 설폰, 및 그들의 벤조-축합 유사체(예컨대, 벤즈이미다졸리디논, 테트라하이드로퀴놀린, 3,4-메틸렌다이옥시페닐)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아르알킬" 및 "아릴(알킬)"이란 저급 알킬렌기를 통해서 치환체로서 연결된 아릴기를 지칭한다. 저급 알킬렌 및 아르알킬의 아릴기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다. 그 예로는 벤질, 2-페닐알킬, 3-페닐알킬 및 나프틸알킬을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로아르알킬" 및 "헤테로아릴(알킬)"이란, 저급 알킬렌기를 통해서, 치환체로서 연결된 헤테로아릴기를 지칭한다. 저급 알킬렌 및 헤테로아르알킬의 헤테로아릴기는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다. 그 예로는 2-티에닐알킬, 3-티에닐알킬, 퓨릴알킬, 티에닐알킬, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 아이소옥사졸릴알킬 및 이미다졸릴알킬 및 그들의 벤조-축합 유사체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
"(헤테로알리사이클릴)알킬"은 저급 알킬렌기를 통해서 치환체로서 접속된 헤테로사이클릭 또는 헤테로알리사이클릭기이다. 저급 알킬렌 및 (헤테로알리사이클릴)알킬의 헤테로사이클릭 또는 헤테로사이클릴은 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다. 그 예로는 (테트라하이드로-2H-피란-4-일)메틸, (피페리딘-4-일)에틸, (피페리딘-4-일)프로필, (테트라하이드로-2H-티오피란-4-일)메틸 및 (1,3-티아지난-4-일)메틸을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알콕시"란 화학식 -OR을 지칭하되, 여기서 R은 위에서 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 사이클로알키닐이다. 알콕시의 비제한적인 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(아이소프로폭시), n-뷰톡시, 아이소-뷰톡시, sec-뷰톡시 및 tert-뷰톡시이다. 알콕시는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "하이드록시알킬"이란 수소 원자의 하나 이상이 하이드록시기로 대체되어 있는 알킬기를 지칭한다. 예시적인 하이드록시알킬기는 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시프로필, 2-하이드록시프로필 및 2,2-다이하이드록시에틸을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 하이드록시알킬은 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬아미노"란 수소 원자의 하나 이상이 아미노기로 대체되어 있는 알킬기를 지칭한다. 예시적인 알킬아미노기는 아미노메틸, 2-아미노에틸, 3-아미노에틸을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 알킬아미노는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬아미도"란 수소 원자의 하나 이상이 C-아미도기 또는 N-아미도기로 대체되어 있는 알킬기를 지칭한다. 알킬아미도는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬티오"는 RS-를 지칭하며, 여기서 R은 알킬이다. 알킬티오는 치환 또는 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "C-아미도"기란 "-C(=O)N(RaRb)"기를 지칭하되, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다. C-아미도는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "N-아미도"기란 "RC(=O)N(Ra)-"기를 지칭하되, 여기서 R 및 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다. N-아미도는 치환 또는 비치환되어 있을 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "할로겐 원자", "할로겐" 또는 "할로"는, 원소의 주기율표의 제7 칼럼의 방사선-안정적인 원자 중 어느 하나, 예컨대, 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아민"이란 하나 이상의 수소가 R기로 선택적으로 치환될 수 있는 -NH2기를 지칭한다. R은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "알데하이드"란 -Rc-C(O)H기를 지칭하되, 여기서 Rc는 존재하지 않거나, 또는 독립적으로 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐렌, 사이클로알키닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 헤테로알리사이클릴렌, 아르알킬렌 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬렌으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "활성화 에스터"란 친핵체, 예를 들어 NHS 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터 또는 나이트로페닐 에스터와 자발적으로 반응하는 에스터를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "나이트렌"이란 카벤의 질소 유사체를 지칭하되, 여기서 질소 원자는 6개의 가전자로 미하전되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아미노"란 -NH2기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "하이드록시"란 -OH기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "사이아노"기란 "-CN"기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아지도"란 -N3기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "티올"이란 -SH기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "하이드라지닐"이란 -NHNH2기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "하이드라조닐"이란
Figure pct00002
기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "폼일"이란 -C(O)H기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "글라이시딜" 또는 "글라이시딜 에터"란
Figure pct00003
를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "에폭시"란
Figure pct00004
를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "카복실산"이란 -C(O)OH를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "티오사이아네이트"란 -S-C=N기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "옥소-아민"이란 -O-NH2기를 지칭하되, 여기서 -NH2의 하나 이상의 수소가 R기로 선택적으로 치환될 수 있다. R은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 접두사 "포토(또는 광)(photo)" 또는 "포토(또는 광)-"란 광 혹은 전자기 방사선과 관련하여 의미한다. 이 용어는, 스펙트럼의 방사선, 마이크로파, 적외선, 가시선, 자외선, X선 혹은 감마선 부분으로서 통상 공지된 범위의 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 전자기 스펙트럼의 전부 혹은 일부를 포괄할 수 있다. 스펙트럼의 일부는 본 명세서에서 언급된 금속들 등과 같은 표면의 금속 영역에 의해 차단되는 것일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 스펙트럼의 일부는 유리, 플라스틱, 실리카 혹은 본 명세서에서 언급된 기타 재료로 이루어진 영역 등과 같은 표면의 틈새 영역(interstitial region)을 통과하는 것일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 금속을 통과할 수 있는 방사선이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 유리, 플라스틱, 실리카 또는 본 명세서에서 언급된 기타 재료에 의해 마스킹되는 방사선이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "반응 부위"란 화학 반응 혹은 분자 상호작용에 의해서 하나 이상의 분자를 부착시키는데 이용될 수 있는 본 명세서에 기술된 중합체 코팅 상의 부위를 지칭한다. 이러한 부착은 공유 결합을 통해서 또는 기타 결합 혹은 상호작용력을 통해서 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "잔류 표면%"는 P5/P7 표면 프라이머를 염색하기 위하여 TET qc를 이용해서 측정된 강도를 지칭할 수 있다. P5 및 P7 프라이머는 HiSeq, MiSeq 및 게놈 분석기 플랫폼(Genome Analyzer platform) 상에서 서열분석을 위하여 일루미나사(Illumina Inc.)에서 판매하는 상업적 플로우 셀의 표면 상에 이용된다. 프라이머 서열은 미국 특허 공개 제2011/0059865 A1호(이것은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. TET는 P5/P7 프라이머에 대해 상보적인 서열을 지니는 염료 표지화된 올리고뉴클레오타이드이다. TET는 표면 상에 P5/P7 프라이머에 혼성화될 수 있고; 과잉의 TET는 세척될 수 있으며, 부착된 염료 농도는 타이픈 스캐너(제너럴 일렉트릭사(General Electric)) 등과 같은 주사 기기를 이용한 형광 검출에 의해 측정될 수 있다.
중합체-코팅된 표면을 지니는 기재 조성물
본 명세서에 기술된 조성물의 제1양상은 중합체 코팅이 공유 부착된 표면을 포함하는 기재에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체는 PAZAM을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 하기 화학식 (I)의 반복 단위와 하기 화학식 (II)의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00005
식 중, 각각의 R1 및 R1'는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되고;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알킬아미노, 알킬아미도, 알킬티올, 아릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며; 각각의 R4, R4', R5 및 R5'는 독립적으로 H, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 또는 -NR7R8로부터 선택되고;
R6은 독립적으로 H, OH, 알킬, 사이클로알킬, 하이드록시알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
각각의 R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 알킬로부터 선택되거나, 또는 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자 또는 원자들과 함께 연결되어 헤테로사이클을 형성한다.
이러한 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H이고, R3은 선택적으로 치환된 알킬이다.
이러한 조성물의 추가의 실시형태에 있어서, R3은 N-아미도기로 치환된 알킬이다.
본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ia)로 표시된다:
Figure pct00006
식 중, R1은 H 또는 알킬이고; RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며; -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고; o는 1 내지 50의 정수이며; 단, R1이 H이고 RA가 할로이면, RA는 브로모기일 수 없다.
몇몇 이러한 실시형태에 있어서, o는 5이고, RA는 아지도이다.
추가의 실시형태에 있어서, R1은 수소이다.
더욱 추가의 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NR7R8이되, 여기서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소, 알킬 또는 하이드록시알킬로부터 선택된다.
이러한 중합체 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NH2, -C(O)NHCH3 또는 -C(O)N(CH3)2이다.
다른 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NH(CH2)2OH 또는 -C(O)N(CH3)(CH2)2OH이다.
또 다른 실시형태에 있어서, R4는 NR7R8이되, 여기서 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자들과 함께 연결되어 5원(five membered) 헤테로사이클을 형성한다.
5원 헤테로사이클을 포함하는 바람직한 실시형태에 있어서, 5원 헤테로사이클은 선택적으로 치환된 피롤리딘이다.
또 다른 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)OR6이되, 여기서 R6은 수소, 알킬 또는 하이드록시알킬로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, R6은 수소이다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, R6은 메틸이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, R6은 하이드록시에틸이다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, R4'는 수소이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, R4'는 알킬이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, R4'는 메틸이다.
몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, R5'는 수소이다.
부가적인 바람직한 실시형태에 있어서, R5'는 알킬이다.
추가의 바람직한 실시형태에 있어서, R5'는 메틸이다.
본 명세서에 기술된 중합체-코팅된 표면을 포함하는 기재의 또 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 하기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다:
Figure pct00007
식 중, R1은 H 또는 알킬로부터 선택되고; RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며; -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고; o는 1 내지 50 범위의 정수이고; R5는 H 또는 알킬로부터 선택되며; n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고; n은 1 내지 50,000 범위의 정수이며; 단, R1과 R5가 H이고, o가 5이면, RA는 브로모기일 수 없다. 몇몇 실시형태에 있어서, o는 5이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체는 또한 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)로 표시된다:
Figure pct00008
식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 표면에 부착된 일련의 작용기에 공유 결합되고, 여기서 작용기는 오쏘 위치에 포스핀 치환체를 지니는 알켄, 알킨, 나이트렌, 알데하이드, 하이드라진, 활성화 에스터, 글라이시딜 에터, 아민, 말레이미드 또는 벤조일 에스터로부터 선택된다.
이러한 조성물의 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 알킨을 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아지도이다.
이러한 조성물의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 나이트렌을 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아지도이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 활성화 에스터를 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아민이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 하이드라진을 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 폼일이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 알데하이드기를 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아민, 옥소-아민 또는 하이드로지닐이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 글라이시딜 에터를 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아민이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 아민을 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 아지도이다.
이러한 조성물의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 작용기는 말레이미드를 포함하고, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, 여기서 RA는 티올이다.
본 명세서에 기술된 중합체-코팅된 표면을 포함하는 기재의 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ib)로 표시된다:
Figure pct00009
식 중, R2는 선택적으로 치환된 아릴이다.
몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R2는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환된 페닐 아자이드이다. 하나의 특정 실시형태에 있어서, R2는 퍼플루오로 페닐 아자이드이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R1은 수소이다.
추가의 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R4는 -C(O)NR7R8이다. 하나의 특정 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NH2이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R4'는 수소이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R5는 알킬이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R5는 수소이다
몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R5'는 수소이다.
본 명세서에 기술된 중합체-코팅된 표면을 포함하는 기재의 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 하기 화학식 (IV)의 중합체를 포함한다:
Figure pct00010
식 중, n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 (IV)의 페닐기는 하나 이상의 플루오로기로 선택적으로 치환된다.
본 명세서에 기술된 중합체 코팅은 각종 기재에 공유 부착될 수 있다. 알켄, 알킨, 나이트렌, 알데하이드, 하이드라진, 활성화 에스터, 글라이시딜 에터, 아민, 말레이미드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 반응기로 작용화될 수 있는 본질적으로 임의의 기재 재료가 이용될 수 있다. 아크릴아마이드, 에논 또는 아크릴레이트는 또한 기재 재료로서 이용될 수도 있다. 기재는 단일 재료 혹은 복수의 상이한 재료를 포함할 수 있다. 기재는 복합체 혹은 라미네이트일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 유리를 포함하는 적어도 하나의 표면을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, 기재는 금속을 포함하는 적어도 하나의 표면을 지닌다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 금속은 금이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 지닌다. 일 실시형태에 있어서, 표면은 산화탄탈럼을 포함한다. 기타 기재 재료는 플라스틱, 규소, 이산화규소, 질화규소, 용융 실리카, 갈륨 비소화물, 인화인듐, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 기재는 평탄하거나, 둥글거나 혹은 텍스처화되어 있을 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면은 중합체-코팅된 영역과 중합체로 코팅되지 않은 불활성 영역을 모두 포함한다. 중합체-코팅된 영역은 반응 부위를 포함할 수 있고, 따라서, 화학 결합 혹은 다른 분자 상호작용을 통해서 분자를 부착하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체-코팅된 영역과 불활성 영역은 패턴 혹은 그리드를 형성하도록 교대로 되어 있을 수 있다. 이러한 패턴은 1차원 혹은 2차원일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 불활성 영역은 유리 영역, 금속 영역, 마스크 영역 및 틈새 영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 표면은 유리 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 표면은 금속 영역을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 표면은 마스크 영역을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 표면은 틈새 영역을 포함한다. 본 명세서에 기술된 조성물의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 비드일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 비드의 표면은 작용화된다. 작용화는 비드를 웰 내로 도입하기 전 혹은 후에 일어날 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 웰은 플로우 셀 표면에 미리 규정되어 있다. 본 발명의 중합체로 코팅될 수 있거나 또는 다르게는 본 명세서에서 언급된 조성물 혹은 방법에서 이용될 수 있는 예시적인 기재 재료는, 미국 특허 출원 제13/492,661호 및 제13/661,524호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 제2양상은 중합체 코팅이 공유 부착된 표면을 포함하는 하나 이상의 기재를 포함하는 플로우 셀에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기술된 플로우 셀은 위에서 기술된 기재들 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체는 PAZAM을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 플로우 셀은 중합체 코팅을 통해서 기재의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 클러스터 내의 플로우 셀에 존재하되, 여기서 폴리뉴클레오타이드 클러스터 중의 폴리뉴클레오타이드는 중합체 코팅을 통해서 플로우 셀의 표면에 부착된다. 이러한 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 부착되는 플로우 셀 본체의 표면이 기재로 간주된다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅된 표면을 지니는 별도의 기재가 플로우 셀의 본체 내로 삽입된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 플로우 셀은 복수의 레인 혹은 복수의 섹터로 분할되는 플로우 챔버이며, 여기서 복수의 레인 또는 복수의 섹터 중 1개 이상은 공유 부착된 본 명세서에 기술된 중합체 코팅으로 코팅된 표면을 포함한다. 본 명세서에 기술된 플로우 셀의 몇몇 실시형태에 있어서, 단일 폴리뉴클레오타이드 클러스터 내의 부착된 폴리뉴클레오타이드는 동일 혹은 유사한 뉴클레오타이드 서열을 지닌다. 본 명세서에 기술된 플로우 셀의 몇몇 실시형태에 있어서, 상이한 폴리뉴클레오타이드 클러스터 중의 부착된 폴리뉴클레오타이드는 상이한 혹은 비유사한 뉴클레오타이드 서열을 지닌다. 예시적인 플로우 셀 및 본 명세서에서 언급된 방법 혹은 조성물에 이용될 수 있는 플로우 셀을 제조하기 위한 기재는, 일루미나사(캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재)에서 상업적으로 입수가능한 것들 또는 제US 2010/0111768 A1호 또는 제US 2012/0270305호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
공유 부착된 중합체로 기재를 코팅하는 방법
본 명세서에 개시된 본 발명의 제1양상은 기재의 표면에 고정된 중합체 코팅을 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 중합체를 기재의 표면과 접촉시켜, 해당 표면 상에 중합체 코팅의 층을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 표면은 복수의 작용기를 포함하며, 중합체 코팅은 표면 상의 작용기에 공유 결합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 기재의 표면 상에 중합성 재료를 중합함으로써 기재의 표면 상에 인시츄로 형성된다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 중합체는 기재의 표면과 접촉하기 전에 미리 형성된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체는 PAZAM을 포함한다.
기재 표면에 중합체 코팅을 고정하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 하기 화학식 (I)의 반복 단위와 하기 화학식 (II)의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00011
식 중, 각각의 R1 및 R1'는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되고;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알킬아미노, 알킬아미도, 알킬티올, 아릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며; 각각의 R4, R4', R5 및 R5'는 독립적으로 H, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 또는 -NR7R8로부터 선택되고;
R6은 독립적으로 H, OH, 알킬, 사이클로알킬, 하이드록시알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
각각의 R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 알킬로부터 선택되거나, 또는 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자 또는 원자들과 함께 연결되어 헤테로사이클을 형성한다.
몇몇 실시형태에 있어서, R2는 H이고, R3은 선택적으로 치환된 알킬이다. 일 실시형태에 있어서, R3은 N-아미도기로 치환된 알킬이다.
기재 표면을 중합체로 코팅하는 방법의 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ia)로 표시된다:
Figure pct00012
식 중, R1은 H 또는 알킬이고; RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 아지리딘, 트라이아졸린, 에폭시 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며; -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고; o는 1 내지 50의 정수이며; 단, R1이 H이고 RA가 할로이면, RA는 브로모기일 수 없다.
이러한 방법의 일 실시형태에 있어서, o는 5이고, RA는 아지도이다.
이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, R1은 수소이다.
이러한 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NR7R8이되, 여기서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소, 알킬 또는 하이드록시알킬로부터 선택된다. 이러한 방법의 특정 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NH2이다.
이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, R4'는 수소이다.
이러한 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, R4'와 R5'는 둘 모두 수소이다.
이러한 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, R4'와 R5' 중 적어도 하나는 알킬, 예를 들어, 메틸기이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 하기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함한다:
Figure pct00013
식 중, R1은 H 또는 알킬로부터 선택되고; RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 아지리딘, 트라이아졸린, 에폭시 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며; -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고; o는 1 내지 50 범위의 정수이며; R5는 H 또는 알킬로부터 선택되고; n은 1 내지 50,000 범위의 정수이며; n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고; 단, R1과 R5가 H이고, o가 5이면, RA는 브로모기일 수 없다. 몇몇 실시형태에 있어서, o는 5이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체는 또한 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)로 표시된다:
Figure pct00014
식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
이러한 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 광-활성화 가능한 아자이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 광-활성화 가능한 아자이드는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드기이다. 이들 실시형태의 몇몇에 있어서, 페닐 아자이드는 기재의 표면 상의 아민기를 N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)와 반응시킴으로써 제조된다.
위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 페닐 아자이드는 중합체를 기재의 표면과 접촉시키기 전에 광-활성화된다. 이러한 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 광-활성화된 작용기는 나이트렌을 생성한다. 이러한 방법의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 광-활성화를 통해서 나이트렌에 공유 결합된다.
기재의 표면에 중합체 코팅을 공유 부착하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함한다.
기재의 표면에 중합체 코팅을 공유 부착하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 촉매의 존재 하에 작용기에 공유 결합된다. 특정 실시형태에 있어서, 촉매는 구리 촉매이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 구리 촉매를 이용하는 일 없이 알킬기에 공유 결합된다.
기재의 표면에 중합체 코팅을 공유 부착하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 작용기는 알켄기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알켄기는 아민 작용화된 표면을 아크릴로일기와 반응시킴으로써 제조된다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 아민 작용화된 표면은 해당 표면을 3-아미노프로필 트라이메톡시실란(APTMS)으로 처리함으로써 제조된다. 몇몇 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 아크릴로일기는 활성화된 아크릴산 에스터, 아크릴산, 아크릴산 염화물 또는 COMU(CAS 번호 1075198-30-9)로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 활성화된 아크릴산 에스터는 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터이다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 알켄기는 기재의 표면을 작용화된 실란과 직접 접촉시킴으로써 제조된다. 몇몇 추가의 실시형태에 있어서, 작용화된 실란은 3-아크릴아미도트라이메톡시실란 또는 메타크릴옥시프로필트라이메톡시실란으로부터 선택될 수 있다.
기재의 표면에 중합체 코팅을 공유 부착하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 상승된 온도에서 작용기에 공유 결합된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상승된 온도는 60℃ 내지 90℃ 범위의 임의의 온도이다.
기재 표면에 중합체 코팅을 고정시키는 방법의 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ib)로 표시된다:
Figure pct00015
식 중, R2는 선택적으로 치환된 아릴이다.
이러한 방법의 하나의 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R2는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환된 페닐 아자이드이다. 하나의 특정 실시형태에 있어서, R2는 퍼플루오로 페닐 아자이드이다.
기재 표면을 중합체로 코팅하는 방법의 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R1은 수소이다.
이러한 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R4는 -C(O)NR7R8이다. 하나의 특정 실시형태에 있어서, R4는 -C(O)NH2이다.
이러한 방법의 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R5는 수소이다.
이러한 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 (Ib) 중의 R4'와 R5' 둘 모두는 수소이다.
이러한 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합성 재료는 액체 형태로 적용된다.
기재 표면에 중합체 코팅을 고정시키는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 작용기는 복수의 중합체-코팅된 영역과 복수의 불활성 영역을 형성하고 이어서 중합체 재료의 중합을 행하도록 기재의 표면 상에 배열된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 불활성 영역은 유리 영역, 금속 영역, 마스크 영역 및 틈새 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 불활성 영역은 유리를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 중합체-코팅된 영역 및 복수의 불활성 영역은 패턴 또는 그리드를 형성하도록 표면 상에 배열된다. 그러한 패턴 또는 그리드는 기재의 표면에 관하여 1차원 혹은 2차원일 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국 특허 출원 제13/492,661호 및 제13/661,524호(이들의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
기재의 표면에 고정된 중합체 코팅을 제조하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 표면의 작용기에 공유 결합하기 전에 수용액 중에 용해된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 비드이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 제2양상은 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시형태에 있어서, 해당 방법은 (a) 복수의 제1올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2올리고뉴클레오타이드를 본 명세서에 기술된 기재 중 어느 하나의 표면 상에 존재하는 중합체 코팅 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면에 중합체 코팅을 고정시키는 방법들 중 어느 하나에 의해 제조된 중합체 코팅 상의 반응 부위와 반응시키는 단계; (b) 중합체 코팅에 부착된 복수의 제1올리고뉴클레오타이드를 증폭될 주형과 접촉시키는 단계; 및 (c) 제1올리고뉴클레오타이드 및 제2올리고뉴클레오타이드를 이용해서 주형을 증폭시켜, 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각 주형은 3' 단부에 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화가능한 서열을, 그리고 5' 단부에 그 보체가 제2올리고뉴클레오타이드에 혼성화 가능한 서열을 포함한다. 상기 방법에 있어서, 제2올리고뉴클레오타이드는 임의선택적이다. 따라서, 제2올리고뉴클레오타이드는 몇몇 실시형태에서 존재할 필요는 없다. 존재한다면, 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅에 부착될 수 있거나, 또는 증폭 단계 동안 용액 중에 제공될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 아지도기와 반응될 알킨기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 염화사이아누르와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 하이드라지닐기 또는 하이드라조닐기 등과 같은 활성화된 아민기와 반응될 알데하이드기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 티오사이아네이트 또는 카복실산기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 부가적인 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 글라이시딜기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 다이-알데하이드 링커를 통해서 중합체 코팅의 아민기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 활성화 에스터 또는 에폭시기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 옥소-아민기와 반응될 알데하이드기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드의 어레이를 제조하는 위에서 기술된 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 기재의 표면 상의 중합체 코팅은 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)의 중합체를 포함한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 제3양상은 기재의 표면을 제조하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 하나 이상의 비드의 표면 상에 복수의 작용기를 형성하는 단계; 본 명세서에 기술된 중합체 코팅을 비드와 접촉시켜, 해당 비드의 표면 상에 중합체 코팅층을 형성하는 단계(여기서 중합체 코팅은 비드의 표면 상의 작용기에 공유 결합됨); 및 중합체 코팅된 비드를 기재의 표면에 고정시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 기재는 플로우 셀이다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 PAZAM을 포함한다. 중합체 코팅층은 비드를 완전히 혹은 부분적으로 덮을 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 중합체 코팅층은 약 20㎚의 두께를 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비드는 약 1.2마이크론 이하의 직경을 지닌다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 비드는 약 0.5마이크론 이하의 직경을 지닌다. 바람직한 실시형태에 있어서, 기재의 표면은 패턴화된다. 그러나, 약 10마이크론 이하, 5마이크론 이하, 3마이크론 이하 또는 2마이크론 이하의 직경을 지니는 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 보다 큰 비드가 이용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 알켄을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알켄기는 비드의 아민 작용화된 표면을 아크릴로일기와 반응시킴으로써 제조된다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 아민 작용화된 표면은 해당 표면을 3-아미노프로필 트라이메톡시실란(APTMS)으로 처리함으로써 제조된다. 몇몇 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 아크릴로일기는 활성화된 아크릴산 에스터 또는 아크릴산 염화물로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 활성화된 아크릴산 에스터는 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터이다. 다른 유용한 커플링제는 아크릴산, COMU(CAS 번호 1075198-30-9), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, 알켄기는 기재의 표면을 작용화된 실란과 직접 접촉시킴으로써 제조된다. 몇몇 추가의 실시형태에 있어서, 작용화된 실란은 3-아크릴아미도트라이메톡시실란 또는 메타크릴옥시프로필트라이메톡시실란으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 전처리된 비드는 중합체 코팅과 접촉하기 전에 중합 저해제를 포함하는 용액에 노출된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합 저해제는 뷰틸화된 하이드록실 톨루엔(BHT), 다이에틸하이드록실아민 또는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실(TEMPO)로부터 선택된다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 상승된 온도에서 비드의 표면 상의 알켄기에 공유 결합된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상승된 온도는 60℃ 내지 90℃ 범위 내의 임의의 온도이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 광-활성화 가능한 아자이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 광-활성화 가능한 아자이드는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드기이다. 이들 실시형태의 몇몇에 있어서, 페닐 아자이드는 기재의 표면 상의 아민기를 N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)와 반응시킴으로써 제조된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 페닐 아자이드는 중합체를 기재의 표면과 접촉시키기 전에 광-활성화된다. 이러한 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 광-활성화된 작용기는 나이트렌을 생성한다. 이러한 방법의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 광-활성화를 통해서 작용기에 공유 결합된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 비드의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 촉매의 존재 하에 작용기에 공유 결합된다. 특정 실시형태에 있어서, 촉매는 구리 촉매이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 구리 촉매를 이용하는 일 없이 알킨기에 공유 결합된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅된 비드는 기재의 표면 상의 개방 웰에 상기 비드를 장입시킴으로써 기재의 표면에 고정된다. 비드 및 웰은 단지 하나에 불과한 비드가 각 웰에 체류하게 되는 치수를 지닐 수 있다. 대안적으로, 상대적인 치수는 웰 당 다수의 비드를 초래할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 중합체 코팅된 비드는 중합체 코팅의 작용기를 기재의 표면 상의 작용기와 반응시킴으로써 기재의 표면에 고정된다. 표면의 작용기는 표면의 특정 특징부, 예를 들어, 웰 또는 패드에 위치될 수 있다. 대안적으로, 기재의 작용기는 평면 표면을 가로질러 퍼질 수 있다. 본 명세서에서 언급된 방법 및 조성물을 이용해서 코팅될 수 있는 이러한 표면을 제조하는 예시적인 방법은 미국 특허 출원 제13/492,661호 및 제13/661,524호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. 일 실시형태에 있어서, 중합체 코팅의 작용기는 아민을 포함하고, 기재의 표면 상의 작용기는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅의 작용기는 아자이드를 포함하고, 기재의 표면 상의 작용기는 알킨을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 중합체 코팅의 작용기는 티올을 포함하고, 기재의 표면 상의 작용기는 말레이미드를 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 기재의 표면에 비드를 장입하기 전에 중합체 코팅된 비드를 세척하여 과잉의 미결합된 중합체 코팅을 제거하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 코팅은 비드와 접촉하기 전에 용액 중에 용해된다. 일 실시형태에 있어서, 용액은 수용액이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 복수의 제1올리고뉴클레오타이드 및 복수의 제2올리고뉴클레오타이드를 비드의 중합체 코팅 상의 반응 부위와 반응시키는 단계; 중합체 코팅에 부착된 복수의 제1올리고뉴클레오타이드를 증폭될 주형과 접촉시키는 단계(각 주형은 3' 단부에 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 가능한 서열을, 그리고 5' 단부에 그의 보체가 제2올리고뉴클레오타이드에 혼성화 가능한 서열을 포함함); 및 제1올리고뉴클레오타이드 및 제2올리고뉴클레오타이드를 이용해서 주형을 증폭시켜, 폴리뉴클레오타이드의 클러스터링된 어레이를 생성하는 단계를 더 포함한다.
위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 아지도기와 반응될 알킨기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 염화사이아누르와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 하이드라지닐기 또는 하이드라조닐기 등과 같은 활성화된 아민기와 반응될 알데하이드기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 티오사이아네이트 또는 카복실산기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 부가적인 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 글라이시딜기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 추가의 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 다이-알데하이드 링커를 통해서 중합체 코팅의 아민기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 활성화 에스터 또는 에폭시기와 반응될 아민기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 티올기와 반응될 말레이미드기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 올레핀 교차-복분해를 통해서 중합체 코팅의 알켄기와 반응될 알켄기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드는 양쪽 모두 이러한 기를 포함한다.
위에서 기술된 방법의 또 다른 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드 또는 제2올리고뉴클레오타이드는 중합체 코팅의 옥소-아민기와 반응될 알데하이드기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드의 양쪽 모두는 이러한 기를 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 중합체 코팅된 비드를 광학 영상화제(optical imaging agent)로 염색하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 광학 영상화제는 Dylight 488 포스핀, Dylight 550 포스핀, Dylight 650 포스핀(모두 써모피셔 사이언티픽사(ThermoFisher Scientific) 제품), 그리고 DBCO-Fluor 488, DBCO-Fluor 525, DBCO-Fluor 545, DBCO-Fluor 568, DBCO-Fluor 585 및 DBCO-SETA 650 등과 같은 염색된 알킨 염료(클릭 케미스트리 툴즈사(Click Chemistry Tools, Inc.)로부터의 DBCO계 염료) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 광학 영상화제는 DyLight 488 포스핀이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 기재의 표면을 제조하는 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 기재는 규소 기재, 플라스틱 기재, 또는 첨가제 함침된 플라스틱 기재로부터 선택될 수 있다. 몇몇 추가의 실시형태에 있어서, 플라스틱 기재에는 SiO2, TiO2, 또는 카본 블랙이 함침될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 각종 증폭 수법 중 하나를 이용할 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 수법으로는, 중합효소 연쇄 반응(polyemrase chain reaction: PCR), 회전 환형 증폭(rolling circle amplification: RCA), 다중 전위 증폭(multiple displacement amplification: MDA) 또는 랜덤 프라임 증폭(random prime amplification: RPA)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에 있어서, 증폭에 이용되는 하나 이상의 프라이머는 중합체 코팅에 부착될 수 있다. PCR 실시형태에 있어서, 증폭에 이용되는 프라이머들 중 하나 또는 둘은 중합체 코팅에 부착될 수 있다. 2종의 부착된 프라이머를 이용하는 형식은, 이중 가닥 앰플리콘이 복제된 주형 서열을 측면에 배치하고 있는 두 부착된 프라이머 사이에 브리지-유사 구조를 형성하기 때문에 종종 브리지 증폭이라고 지칭된다. 브리지 증폭에 이용될 수 있는 예시적인 시약 및 조건은, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,658호; 미국 특허 공개 제2002/0055100호; 미국 특허 제7,115,400호; 미국 특허 공개 제2004/0096853호; 미국 특허 공개 제2004/0002090호; 미국 특허 공개 제2007/0128624호; 및 미국 특허 공개 제2008/0009420호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. PCR 증폭은 또한 증폭 프라이머들 중 하나가 중합체 코팅에 부착되고 제2프라이머가 용액 중에 있는 상태에서 수행될 수 있다. 하나의 부착된 프라이머와 가용성 프라이머의 조합을 이용하는 예시적인 형식은, 예를 들어, 문헌[Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003)], 제WO 05/010145호, 또는 미국 특허 공개 제2005/0130173호 또는 제2005/0064460호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술된 바와 같은 에멀전 PCR이다. 에멀전 PCR은 그 형식의 예시이며, 본 명세서에서 언급된 방법의 목적을 위하여, 에멀전의 사용은 임의 선택적이며 실제로 몇몇 실시형태에 대해서 에멀전은 이용되지 않는 것이 이해될 것이다. 또한, 프라이머는 ePCR 문헌에 언급된 바와 같이 고체 담지체에 직접 부착될 필요는 없고, 대신에 본 명세서에서 언급된 바와 같은 중합체 코팅에 부착될 수 있다.
RCA 수법은 본 발명의 방법에 이용하기 위하여 변형될 수 있다. RCA가 앰플리콘을 생성하는 RCA 반응 및 원리에서 이용될 수 있는 예시적인 성분들은, 예를 들어, 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)] 및 제US 2007/0099208 A1호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. RCA에 이용되는 프라이머는 중합체 코팅에 부착되거나 혹은 용액 중에 있을 수 있다.
MDA 수법은 본 발명의 방법에서 이용하기 위하여 변형될 수 있다. MDA에 대한 몇몇 기본적인 원리 및 유용한 조건은, 예를 들어, 문헌들[Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002); Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)], 미국 특허 제5,455,166호; 미국 특허 제5,130,238호; 및 미국 특허 제6,214,587호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. MDA에 이용되는 프라이머는 중합체 코팅에 부착되거나 혹은 용액 중에 있을 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 위에서 예시된 증폭 수법들의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들어, RCA 및 MDA는 RCA가 (예컨대, 용액-상 프라이머를 이용해서) 용액 중 연쇄체 앰플리콘을 생성하는데 이용되는 것과 조합하여 이용될 수 있다. 앰플리콘은 이어서 중합체 코팅에 부착된 프라이머를 이용해서 MDA용의 주형으로서 이용될 수 있다. 이 예에서, 조합된 RCA 및 MDA 단계 후에 생성된 앰플리콘이 중합체 코팅에 부착될 것이다.
본 명세서에 개시된 본 방법의 제3양상은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드 중합효소를 본 명세서에 기술된 중합체 코팅 중 어느 하나를 통해서 기재의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드 클러스터와 접촉시키는 단계; (b) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 중합효소에 의해 이용될 경우 검출가능한 신호가 생성되도록 기재의 중합체-코팅된 표면에 뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 클러스터에서 신호를 검출하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c)를 반복해서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 클러스터에 존재하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 플로우 셀 내에 존재하는 기재의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드에 대해서 결정된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체-코팅된 표면은 플로우 셀의 일체화된 부분이다. 다른 실시형태에 있어서, 중합체-코팅된 표면은 플로우 셀 내에 배치된 별도의 기재이다. 추가의 실시형태에 있어서, 별도의 기재는 플로우 셀의 표면 또는 다른 부분에 결합되거나 부착되거나 혹은 다르게는 고정될 수 있다.
핵산 서열분석은 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 이용될 수 있다. 바람직한 방법에 있어서, 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis: SBS)은 본 명세서에 기술된 중합체 코팅의 어느 하나를 통해서 기재의 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 이용된다. 이러한 방법에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 중합효소와 연관된 주형 폴리뉴클레오타이드에 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 중합효소는 폴리뉴클레오타이드 주형에 대해서 상보적인 새롭게 합성된 핵산 가닥 내로 하나 이상의 뉴클레오타이드를 혼입시킨다. 합성은 주형 폴리뉴클레오타이드의 일부분에 대해서 혹은 주형 폴리뉴클레오타이드의 일단부에 공유 결합된 범용 혹은 비가변적 핵산의 일부분에 대해서 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 개시된다. 뉴클레오타이드가 주형 폴리뉴클레오타이드에 대항하여 혼입됨에 따라서, 검출가능한 신호가 발생되어, 어떤 뉴클레오타이드가 서열분석 과정의 각 단계 동안 혼입되었는지의 결정을 가능하게 한다. 이와 같이 해서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부분에 대해서 상보적인 핵산의 서열이 생성될 수 있고, 이에 따라서 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부분의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 허용할 수 있다. 플로우 셀은 본 발명의 방법에 의해 생성되고 또한 합성에 의한 서열분석(SBS) 또는 사이클 내에서 시약의 반복된 전달을 수반하는 기타 검출 수법이 실시되는 어레이를 수용하는 편리한 형식을 제공한다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시시키기 위하여, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등이 본 명세서에서 언급된 방법에 의해 제조된 핵산 어레이를 수용하는 플로우 셀 내로/플로우 셀을 통해서 흐르게 될 수 있다. 프라이머 연장으로 인해 표지된 뉴클레오타이드를 혼입시키게 되는 어레이의 부위들이 검출될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가된 추가의 프라이머 연장을 종결하는 가역적 종결 속성을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 지니는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가되어, 후속의 연장은 탈블록화제가 전달되어 해당 모이어티를 제거할 때까지 일어날 수 없게 된다. 따라서, 가역적 종결을 이용하는 실시형태에 대해서, 탈블록화 시약이 플로우 셀에 (검출이 일어나기 전에 혹은 후에) 전달될 수 있다. 세척은 각종 전달 단계 사이에서 수행될 수 있다. 그 후, 사이클은 n개의 뉴클레오타이드에 의해 프라이머를 연장시키기 위하여 n회 반복될 수 있고, 이에 따라서 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 작성된 어레이와 함께 이용하기에 용이하게 적합화될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, 및 US 2008/0108082(이들 문헌의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
파이로서열분석(pyrosequencing) 등과 같이, 환식 반응을 이용하는 기타 서열분석 절차가 이용될 수 있다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오타이드가 발생기 핵산 가닥 내로 혼입됨에 따라서 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); US 6,210,891; US 6,258,568 및 US 6,274,320(이들 문헌의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)). 파이로서열분석에 있어서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해 아데노신 삼인산염(ATP)으로 직접 전환됨으로써 검출될 수 있고, 발생된 ATP의 수준은 루시페라제-발생 광자를 통해서 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 휘도 검출 시스템을 통해서 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 이용되는 여기 방사선 공급원은 반드시 파이로서열분석 절차를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 어레이에 파이로서열분석을 적용하는데 이용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는, 예를 들어, WO 12/058096 A1, US 2005/0191698 A1, US 7,595,883 및 US 7,244,559(이들 문헌의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
문헌[Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005)]; US 5,599,675; 및 US 5,750,341(이들 문헌의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것들을 비롯하여 결찰에 의한 서열분석 반응이 또한 유용하다. 몇몇 실시형태는, 예를 들어, 문헌들[Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995)]; 및 WO 1989/10977(이들의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술된 바와 같은 혼성화에 의한 서열분석 절차를 포함한다. 결찰에 의한 서열분석 및 혼성화에 의한 서열분석 절차의 양쪽 모두에 있어서, 어레이의 부위들에 존재하는 핵산에는 올리고뉴클레오타이드 전달 및 검출의 반복 사이클이 시행된다. 본 명세서에서 언급된 바와 같은 또는 본 명세서에서 인용된 문헌에서의 SBS 방법에 대한 유체 시스템은 결찰에 의한 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석 절차에 대한 시약의 전달을 위해 용이하게 적합화될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지되고, 본 명세서에서 또는 본 명세서에서 인용된 문헌에서 SBS 절차에 관하여 기술된 것과 유사한 형광 검출기를 이용해서 검출될 수 있다.
몇몇 실시형태는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단-보유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 통해서 또는 제로모드 도파관(zeromode waveguide: ZMW)을 이용해서 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석을 위한 수법 및 시약은, 예를 들어, 문헌들[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)](이들 문헌의 개시내용은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
몇몇 SBS 실시형태는 뉴클레오타이드의 연장 생성물로의 혼입 시 방출된 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 아이온 토런트사(Ion Torrent)(코네티컷주 길퍼드시에 소재, 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)의 자회사)로부터 상업적으로 입수가능한 전기 검출기 및 관련 수법 또는 US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; 또는 US 2010/0282617 A1(이들 문헌은 각각 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술된 서열분석 방법 및 시스템을 이용할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 언급된 방법에 의해 생성된 본 발명의 어레이를 위한 다른 유용한 응용은, 유전자 발현 분석이다. 유전자 발현은 디지털 RNA 서열분석이라 지칭되는 것들과 같은 RNA 서열분석 수법을 이용해서 검출 또는 정량화될 수 있다. RNA 서열분석 수법은 위에서 기술된 것들과 같은 당업계에 공지된 서열분석 방법을 이용해서 수행될 수 있다. 유전자 발현은 또한 어레이에의 직접 혼성화에 의해 수행된 혼성화 수법을 이용해서, 또는 다중 어레이(그 생성물은 어레이 상에 검출됨)를 이용해서 검출 또는 정량화될 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 언급된 방법에 의해 생성된 본 발명의 어레이는, 또한 하나 이상의 개체로부터의 게놈 DNA 샘플에 대해 유전자형을 결정하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 어레이 상에서 수행될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전형 분석에 대한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허 공개 제2005/0053980 A1호; 제2009/0186349 A1호 또는 미국 특허 공개 제2005/0181440 A1호(이들 문헌의 각각은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다.
플로우 셀을 이용하는 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 단일 유형의 뉴클레오타이드만이 단일 흐름 단계 동안 플로우 셀에 존재한다. 이러한 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 플로우 셀을 이용하는 위에서 기술된 방법의 다른 실시형태에 있어서, 복수의 상이한 유형의 뉴클레오타이드가 단일 흐름 단계 동안 플로우 셀에 존재한다. 이러한 방법에서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로부터 선택된다.
플로우 셀에 존재하는 기재의 표면 상의 중합체 코팅에 부착된 폴리뉴클레오타이드들 중 하나 이상에 대해서 각 플로우 단계 동안 혼입된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들의 결정은, 폴리뉴클레오타이드 주형에서 혹은 그 근방에서 생성된 신호를 검출함으로써 달성된다. 위에서 기술된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 검출가능한 신호는 광학 신호를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 검출가능한 신호는 비광학 신호를 포함한다. 이러한 실시형태에 있어서, 비광학 신호는 폴리뉴클레오타이드 주형의 하나 이상에서 혹은 그 근방에서의 pH의 변화를 포함한다.
실시예
실시예 1
PAZAM 제조
일반론
달리 표시되지 않는 한, 모든 반응은 질소 혹은 아르곤 분위기 하에 수행되었고, 출발 물질은 상업적 공급사(알드리치 화학사(Aldrich Chemical Company), 피셔 사이언티픽사(Fisher Scientific), 다우사(Dow))로부터 획득하였으며, 추가의 정제 없이 입수한 그대로 이용하였다. 기록된 모든 반응 온도는 반응 용기와 접촉한 욕/공기의 온도를 나타낸다. 무수 용매는 필요로 되지 않았다.
1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼은 부르커 어밴스(Bruker Avance) 400 MHz 기기 상에서 산화중수소(LC NMR용 99.9at.%D)에서 기록되었다. 화학적 이동은 테트라메틸실란(TMS)으로부터 백만분율(ppm, δ) 다운필드로 표현되고, 내부 표준으로서 표시된 용매를 기준으로 한다.
GPC 분석은 이하의 크로마토그래피 조건을 이용해서 스미더스 라프라 테크놀로지사(Smithers Rapra Technology Limited)에 의해 수행되었다:
기기: 관련된 펌프와 오토샘플러를 구비한 말번/비스코텍(Malvern/Viscotek) 트리플 검출기 어레이 TDA301.
칼럼: 애질런트(Agilent) 1 x PL아쿠아겔(PLaquagel)-OH 40 플러스 1 x PL아쿠아겔-OH 60, 30㎝, 13㎛, 또는 애질런트 PL아쿠아겔-OH 가드 플러스 2 x PL아쿠아겔-OH 믹스트, 30㎝, 8㎛
용리액: 0.2M NaNO3; 0.01M NaH2PO4 (pH = 7.0로 조정)
유량: 1.0㎖/분(공칭),
온도: 30℃(공칭)
검출기: 시차 압력 및 직각 광 산란을 이용한 굴절률
데이터는 수집하여 말번/비스코텍 'OminSec' 소프트웨어를 이용해서 분석하였다.
광발광 분광법
형광 측정은 타이푼 트리오 배리어블 모드 이미저(Typhoon Trio Variable Mode Imager(GE) 상에서 행하고, 데이터는 이미지퀀트(ImageQuant) TL 소프트웨어를 이용해서 처리하였다.
박막은 적절하게 준비된 세정된 Si 또는 유리 기재 상에 스핀 코팅 플로우 방법을 이용해서 코팅에 의한 분석을 위하여 준비하였다. 형광 상보적 올리고를 이용해서 혼성화된 건조 그래프트된 막의 광발광 스펙트럼은 타이푼 트리오(GE) 상에서 수행하였다.
합성
본 명세서에 기술된 중합체 코팅은 각종 방식으로 제조될 수 있다. 화학식 (IIIa)의 중합체의 합성을 위한 하나의 방법이 반응식 1A에 표시되어 있다.
반응식 1A. 용액-상태 PAZAM 혼합물의 합성
Figure pct00016
N-(5-브로모아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드(BRAPA)(1c)의 합성은 미국 특허 공개 제2011/0059865호(이 공보의 개시내용은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있었다.
수용성 아크릴아마이드 중합체(PAZAM)는 화학적으로 개시된 자유 라디칼 중합에 의해 준비하였다. 조질의 중합체는 연속 석출에 의해 정제시켜 수평균 분자량 300 내지 400 kDa을 지니는 PAZAM을 제공하였다. 보다 넓은 범위의 평균 분자량, 예를 들어, 30 내지 600 kDa 범위도 얻어질 수 있다.
아크릴아마이드(5.0g, 70.3 m㏖)를 탈이온화된 H2O(45㎖) 중에 용해시키고, 이 혼합물을 완전한 용해를 확보하도록 철저히 와류 교반하였다(vortexed). 별도의 플라스크에서, DMF(10㎖, 9.44g)에 BRAPA(1.0g, 3.61 m㏖)를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 용해를 돕기 위하여 철저하게 와류 교반하였다. 이어서 BRAPA 용액(9.25g, 또는 9.80㎖), 수성 아크릴아마이드 용액(47.5㎖) 및 물(190㎖)의 혼합물을 배합하고 5분 동안 교반하였다. 이 용액을 이어서 0.2㎛ 왓트만 필터를 통해서 여과시켰다.
물(2.5㎖)에 과황산칼륨(125㎎, 0.46 m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 와류 교반시켜 용해시켰다. 탈이온수(82.9㎖)에 아자이드화나트륨(11.5g, 177 m㏖)을 첨가하고, 이 용액을 와류 교반시켜 용해시켰다. ((조질의 중합체 믹스 중) NaN3의 최종 농도는 0.53M이며, 이는 입수가능한 BRAPA에 비해서 50배 과량의 NaN3에 상당한다).
BRAPA/아크릴아마이드 프레-믹스(~250㎖)를 플라스틱 피펫을 이용해서 20분 동안 아르곤으로 퍼지시켰다. 이 단량체 혼합물에 테트라메틸에틸렌다이아민(TEMED)(순수, 273㎕) 및 과황산칼륨(50 mg/㎖; 2370㎕)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하고, 1.5시간 동안 35℃로 가열하고 나서, 실온까지 냉각시켰다. 교반을 유지하면서, 이 조질의 혼합물에 체인가드(Chainguard) I-15(1390㎕)를 첨가하고 나서 2.03M 아자이드화나트륨 용액(82.9㎖)을 첨가하였다. 중합 동안 발생되는 어떠한 나머지 라디칼의 완전한 퀀칭(quenching)을 확보하기 위하여, 이 혼합물을 통해서 10분 동안 공기를 버블링시켰다. 퀀칭된 중합체 혼합물을 65℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 이어서 실온까지 냉각시켰으며, 이 상태에서(4℃에서) 연장된 기간 동안 보관할 수 있었다.
조질의 혼합물(~335㎖)을 대과잉(~1.5ℓ)의 IPA에 완만한 교반을 유지하면서 적가 첨가하였다. 중합체는 백색 고체로서 석출되었고, 이것을 회수하여 펌프에서 건조시켰다. 부분 건조된 중합체(~10g)를, H2O(100㎖) 중에, 용해를 돕기 위하여 이 혼합물을 실온에서 적어도 1시간 동안 교반함으로써 재용해시켰다. 이어서 이 점성 용액을 1.5ℓ의 IPA에 교반을 유지하면서 적가 첨가하였다. 고체를 진공 하에 여과하고 나서, 고진공에서 건조시켜 PAZAM을 백색 고체로서 제공하였다(~5.6g, 95% 초과). 1H NMR 스펙트럼은 도 1a에 도시되어 있다.
GPC(0.2M NaNO3; 0.01M NaH2PO4(pH = 7.0로 조정됨); 피크 분자량 130,000, 고유 점도 0.511, 및 0.147㎖/g의 0.1M 질산나트륨 중에서의 시차 굴절률을 지니는 좁은 분포 풀루란 다당류를 이용해서 교정됨. 0.191㎖/g의 시차 굴절률(dn/dc)에 대한 값은 샘플로부터의 분자량 데이터를 계산하는데 이용되었다): M n = 3.15×105 Da, M w = 1.0×106 Da, M w /M n = 3.2(도 1b 참조). 중합체는 다봉 MW 분포를 지녔다. PAZAM 샘플은 크로마토그래피 분석을 시작하기 전에 여과시키는 것은 곤란하였는데, 이는 넓은 중량 분포에 기인하고, 측정 인공산물을 초래하여, 분석의 복잡성을 증가시켰다. 건조된 PAZAM은 이어서 목적으로 하는 농도, 전형적으로 0.01 내지 12% w/v로 물에 재용해시킬 수 있었다.
선형 PAZAM 제조
대안적으로, 선형 PAZAM(IIIb)의 합성은 반응식 1B에 표시되어 있다.
반응식 1B. 선형 PAZAM의 합성
Figure pct00017
1d/아크릴아마이드 프레믹스의 제조: 1a(915㎎), 아자이드화나트륨(236㎎) 및 DMF(9㎖)를 교반봉을 장착한 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 함께 혼합하였다. 이 플라스크를 드라이신 욕(drysyn bath)에 배치하고, 그 용액을 질소 분위기 하에 35℃(욕 온도)에서 2시간 동안 교반하면서 가열하여 1d를 형성하였다. 아크릴아마이드(4.78g)를 탈이온수에 용해시키고, 얻어진 1d 용액을 아크릴아마이드 용액에 첨가하고, 소용돌이 혼합시켰다. 이 반응 혼합물을 0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켰다.
1ℓ 플랜지 플라스크를 교반기/핫플레이트 상에서 1ℓ 드라이신 욕에 셋업하고 플라스크 덮개를 죄었다. 이 플라스크에 교반기 글랜드(stirrer gland)를 통해서 앵커 형상 교반 패들을 장착하고 이 교반 패들을 오버헤드 교반기에 접속하였다. 공기 응측기를 플라스크 덮개의 하나의 퀵피트 조인트(quickfit joint)에 부착하고, 질소 매니폴드(하지만 이 시간에 가스 흐름은 없음)에 접속된 튜빙 어댑터를 상기 응축기의 상부에 부착하였다. 여과된 반응 혼합물 용액을 플라스크 셋업으로 옮기고, 이 반응 혼합물을 35℃(욕 온도)로 예열하면서 질소 매니폴드에 부착된 5㎖ 스트리페트(stripette)를 이용해서 30분 동안 이 용액을 통해서 질소를 버블링시켰다.
조질의 PAZAM 중합체 용액의 제조: 아크릴아마이드/1d 프레믹스의 탈기를 진행 중이면서, 과황산칼륨(119㎎)을 와류 교반하면서 탈이온수(2.4㎖) 중에 용해시켰다. 탈기된 반응 혼합물 위쪽에 질소 흐름을 확보하기 위하여 응축기의 상부에서의 질소 흐름을 기동시켰다. 탈기 과정 후, TEMED(99㎕)를 이 반응 혼합물에 200rpm에서 교반하면서 첨가하였다. 이어서, 이 교반된 반응 혼합물에 과황산칼륨 용액을 첨가하여 중합을 시작하였다. 질소 하에 35℃(욕 온도)에서 1.5시간 동안 200rpm에서 교반을 계속하였다.
중합 퀀칭: 중합 반응이 진행 중인 동안, 탈이온수(2.80㎖) 중에 IPHA·HCl(312㎎)을 용해시켜 IPHA·HCl 용액을 제조하였다. 일단 중합 반응이 1.5시간 동안 진행 중이면, 응축기의 상부로부터 질소 라인을 제거하여, 반응 용기를 공기에 개방 상태로 두었다. 이 교반된 반응 혼합물에 수산화나트륨 용액(1M)을 첨가하고 나서 위에서 제조된 IPHA·HCl 용액을 첨가하여 중합을 퀀칭시켰다. 퀀칭된 반응 혼합물을 35℃(욕 온도)에서 더욱 30분 동안 200 rpm에서 교반하였다.
PAZAM 중합체 정제: 조질의 혼합물을 교반된 2-프로판올(750㎖)에 스트리페트에 의해 서서히 첨가하고, 1시간 동안 계속 교반하였다. 용매를 따라 내어, 아자이드화나트륨-함유 폐기물로서 처분하였다. 석출된 중합체를 짓눌러서 트랩된 용매를 짜내었다. 중합체를 탈이온수(150㎖) 중에 재용해키고, 중합체 용액을 교반된 2-프로판올(750㎖)에 스트리페트에 의해 서서히 첨가하고 더욱 1시간 동안 교반을 유지하였다. 용매를 재차 따라내어 아자이드화나트륨-함유 폐기물로서 처분하였다. 석출된 중합체를 짓눌러서 트랩된 용매를 짜내었다. 얻어진 중합체를 고진공 하에 18시간 동안 데시케이터 속에서 건조시키고 나서, 무게를 단 표지를 붙인 용기로 옮기고 암실에서 실온에서 보관하였다.
가볍게 가교결합된 PAZAM 제조
마찬가지로, 가볍게 가교결합된 PAZAM을 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 절차를 이용해서 일반적인 합성 반응식 1B에 따라서 제조하였다.
1d/아크릴아마이드 프레믹스의 제조: 1a(915㎎), 아자이드화나트륨(106㎎) 및 DMF(9㎖)를 교반봉을 장비한 25㎖ 둥근-바닥 플라스크에서 함께 혼합하였다. 이 플라스크를 드라이신 욕에 배치하고, 이 용액을 질소 분위기 하에 35℃(욕 온도)에서 2시간 동안 교반하면서 가열하여 1d를 형성하였다. 아크릴아마이드(4.78g)를 탈이온수에 용해시키고, 얻어진 1d 용액을 아크릴아마이드 용액에 첨가하고 소용돌이 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켰다.
1ℓ 플랜지 플라스크를 교반기/핫플레이트 상에서 1ℓ 드라이신 욕에 셋업하고 플라스크 덮개를 죄었다. 이 플라스크에 교반기 글랜드를 통해서 앵커 형상 교반 패들을 장착하고 이 교반 패들을 오버헤드 교반기에 접속하였다. 공기 응측기를 플라스크 덮개의 하나의 퀵피트 조인트에 부착하고, 질소 매니폴드(하지만 이 시간에 가스 흐름은 없음)에 접속된 튜빙 어댑터를 상기 응축기의 상부에 부착하였다. 여과된 반응 혼합물 용액을 플라스크 셋업으로 옮기고, 이 반응 혼합물을 35℃(욕 온도)로 예열하면서 질소 매니폴드에 부착된 5㎖ 스트리페트를 이용해서 30분 동안 이 용액을 통해서 질소를 버블링시켰다.
조질의 PAZAM 중합체 용액의 제조: 아크릴아마이드/1d 프레믹스의 탈기를 진행 중이면서, 과황산칼륨(119㎎)을 와류 교반하면서 탈이온수(2.4㎖) 중에 용해시켰다. 탈기된 반응 혼합물 위쪽에 질소 흐름을 확보하기 위하여 응축기의 상부에서의 질소 흐름을 실시하였다. 탈기 과정 후, TEMED(99㎕)를 이 반응 혼합물에 200rpm에서 교반하면서 첨가하였다. 이어서, 이 교반된 반응 혼합물에 과황산칼륨용액을 첨가하여 중합을 시작하였다. 질소 하에 35℃(욕 온도)에서 1.5시간 동안 200rpm에서 교반을 계속하였다.
중합 퀀칭 및 아지돌라이시스(azidolysis): 중합 반응이 진행 중인 동안, 탈이온수(2.80㎖) 중에 IPHA·HCl(312㎎)을 용해시켜 IPHA·HCl 용액을 제조하였다. 또한, 8㎖ 탈이온수 중에 아자이드화나트륨 575㎎를 용해시켜 아자이드화나트륨 용액을 제조하였다. 일단 중합 반응이 1.5시간 동안 진행 중이면, 응축기의 상부로부터 질소 라인을 제거하여, 반응 용기를 공기에 개방 상태로 두었다. 덮개로부터 스토퍼들 중 하나를 제거한 후, 이 교반된 반응 혼합물에 수산화나트륨 용액(1M)을 첨가하고 나서, 위에서 제조된 IPHA·HCl 용액을 첨가하여 중합을 퀀칭시켰다. 이어서 이 교반된 반응 혼합물에 상기 아자이드화나트륨 용액을 첨가하였다. 퀀칭된 반응 혼합물을 65℃(욕 온도)로 가열하고, 이 온도를 유지하면서 2시간 동안 200 rpm에서 계속 교반하였다.
PAZAM 중합체 정제: 조질의 혼합물을 교반된 2-프로판올(750㎖)에 스트리페트에 의해 서서히 첨가하고, 1시간 동안 계속 교반하였다. 용매를 따라 내어, 아자이드화나트륨-함유 폐기물로서 처분하였다. 석출된 중합체를 짓눌러서 트랩된 용매를 짜내었다. 중합체를 탈이온수(150㎖) 중에 재용해키고, 중합체 용액을 교반된 2-프로판올(750㎖)에 스트리페트에 의해 서서히 첨가하고 더욱 1시간 동안 교반을 유지하였다. 용매를 재차 따라내어 아자이드화나트륨-함유 폐기물로서 처분하였다. 석출된 중합체를 짓눌러서 트랩된 용매를 짜내었다. 얻어진 중합체를 고진공 하에 18시간 동안 데시케이터 속에서 건조시키고 나서, 무게를 단 표지를 붙인 용기로 옮기고 암실에서 4℃에서 보관하였다.
가볍게 가교결합된 PAZAM의 1H NMR은 중합체의 500㎕ 수용액(3%)과 100㎕ D2O의 혼합물로부터 얻었다 (도 1c 참조).
실시예 2
PAZAM 유도체의 제조
PAZAM의 유도체의 합성은 반응식 2에 도시되어 있다. 우선, BRAPA(1c)를 t-Boc-보호된 하이드록실아민(2a)과 반응시켜 중간생성물(2b)을 형성하였으며, 이것을 다이클로로아세트산으로 처리하여 PAZAM의 옥소-아민 유도체(2c)를 형성하였다. 2c는 이어서 알데하이드 작용화된 올리고뉴클레오타이드로 그래프트시켜 2d를 형성할 수 있다.
반응식 2. PAZAM의 옥소-아민 유도체의 합성
Figure pct00018
실시예 3
중합체 코팅
유리 기재/플로우 셀 상에의 PAZAM 코팅
수성 PAZAM 용액을 유리, 플라스틱 혹은 규소 기재 상에 침착시켰다(deposited). 이 코팅을 이어서 (알킨-작용화된 올리고뉴클레오타이드를 이용해서) 그래프팅시키고, 이 그래프팅된 표면에 상보적 염료를 혼성화시켰다. 도 2a 및 도 2b 참조. 전형적인 형광 스캔은 도 2b에 제공되어 있다. 중합체를 이어서 상이한 농도에서 프라이머(알킨 올리고뉴클레오타이드)를 이용해서 그래프팅시켜, 대략 표준 올리고뉴클레오타이드 프라이머 밀도(~15000 프라이머/㎛2)에서 4개 레인 그리고 보다 높은 프라이머 밀도(~50000 프라이머/㎛2)에서 4개 레인을 포함하는 표면을 제공하였다. 프라이머 밀도는 2500 내지 1×106 프라이머/㎛2의 범위일 수 있고, 이는 선택된 그래프팅 프라이머 농도에 좌우된다(도 2a).
PAZAM을 이용해서 코팅된 HiSeq(일루미나사) 유리 플로우 셀의 타이푼 스캔은 도 3a에 도시되어 있다. 중합체 표면을, 이 수법을 이용해서 달성될 수 있는 프라이머 밀도(프라이머/㎛2)의 범위를 입증하는 증가되는 농도에서 프라이머(알킨 올리고뉴클레오타이드)를 이용해서 그래프팅시켰다(도 3b).
도 4a는 PAZAM을 이용해서 스핀 코팅된 유리 기재의 타이푼 스캔을 예시하고 있다. 게놈-분석기(Genome-Analyzer)(일루미나사) 내에 끼워맞춤되는 크기의 플로우 셀을 이어서 웨이퍼를 이용해서 제작하였다. 도 2a 및 도 2b에 묘사된 바와 같이, 중합체 표면을 이어서, 이 접근법을 통해서 스핀-코팅된 표면 상에서 달성될 수 있는 프라이머 밀도(프라이머/㎛2)의 범위를 입증하는 증가되는 농도에서 프라이머(알킨 올리고뉴클레오타이드)를 이용해서 그래프팅시켰다(도 4b).
플로우-코팅된 PAZAM 표면은 시드된(seeded) DNA 주형의 증폭을 지지할 수 있었다. 도 5a는 표준 SFA 채널(레인 1)에서 주형으로부터 성장된 DNA 클러스터가 PAZAM-코팅된 채널에서의 것과 동일한 것을 예시한다. 클러스터는 cBot을 이용해서 성장시켰다. 28 사이클 클러스터 어플리케이션([PhiX] = 1pM, 짧은 주형, 80 b.p.)은 이어서 SYBR 녹색 염색하였다. 그 결과는 이 접근법이 브리지 증폭을 지지할 수 있는 견고한 표면을 제공한 것으로 입증하였다(도 5b 및 도 5c).
도 6a 및 도 6b는 스핀-코팅된 PAZAM 표면 상의 DNA 클러스터를 도시한다. 이것은 스핀-코팅된 PAZAM 표면이 표준 SFA 표면 상에서 관찰된 것과 유사한 클러스터를 부여하도록 시드된 DNA 주형의 증폭을 지지할 수 있었던 것을 예시한다. 이 클러스터의 전형적인 화상은 만테이아(Manteia)(20× 대물렌즈, 1mJ 노출) 및 SYBR 녹색 염색을 이용해서 얻었다(도 6c).
폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM) 침착
재료 및 장비
(3-아미노프로필)트라이메톡시실란(97%)(APTMS) 및 아이소프로판올(분석 등급 시약)(IPA), N,N,N',N',N"-펜타메틸다이에틸렌트라이아민(PMDETA), 황산구리(CuSO4.5H2O, 4% w/v 용액) 및 아스코르브산나트륨(NaAsc)은 시그마 알드리치사로부터 구입하였다. 50% IPA 수용액은 세척용으로 준비하였다. N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)는 웹사이언티픽사(Webscientific)로부터 구입하였다. 2% 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드)(PAZAM) w/v 수용액은 사내에서 제조하였다. 희석은 35℃에서 혼성화로 내에서 하룻밤 행하였다. 인산칼륨 완충액(10mM 수용액, pH = 7)(KPi)과 염소산나트륨 및 시트르산나트륨 용액(SSC)은 사내에서 제조하였다. 플로우 셀의 세정은 에미티크(Emitiech) K105OX 산소 플라즈마 애셔(plasma asher)를 이용해서 수행하였다. MJ 리서치 PTC-200 써모 사이클러(MJ Research PTC-200 Thermo Cycler)(MJ)는 설포-HSAB 및 PAZAM의 용액 침착을 위하여 이용하였다. UVP XX-시리즈 UV 벤치 램프(Bench lamp)는 설포-HSAB와 PAZAM의 광화학 반응을 위하여 이용하였다. 오피어(Ophir) PD300-UV 포토다이오드 센서(20pW 내지 300mW)는 광화학 반응을 통해서 플로우 셀에 전달된 UV 파워를 모니터링하는데 이용하였다.
방법
원(raw) 플로우 셀(일루미나사)은 플라즈마 애셔에 100W에서 10분 동안 배치하였다. 깨끗한 유리 기재를 이어서 증기 침착에 의해 실란화시켰다. 플로우 셀의 포트를 진공 데시케이터 내에서 순수한 APTMS 100㎕를 함유하는 2개의 개방 유리 바이알의 상부에 배치하였다. 데시케이터를 진공 하에 배치하고, 60℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 진공 데시케이터로부터 제거 후, 플로우 셀을 MJ 상에 배치하고, 75㎕·분-1에서 2분 동안 KPi(10mM)로 프라이밍하였다. 10mM KPi 중의 21.1mM 설포-HSAB 용액을 이어서 100㎕·분-1에서 2분 동안 흐르게 하였다. 정적 인큐베이션을 암실에서 실온에서 1.5시간 동안 수행하였다. 후속의 세척은 이어서 탈이온수, 50% IPA 용액 및 탈이온수로 각각 100㎕·분-1에서 2분 동안 수행하여 공기 간극이 플로우 셀의 채널에 도입되지 않은 것을 확실히 하였다. 2% PAZAM 용액을 이어서 채널 내로 100㎕·분-1에서 1분 동안 흐르게 하여, 공기 간극이 플로우 셀의 채널에 도입되지 않은 것을 확실히 하였다. MJ로부터 제거 시, 플로우 셀은 UV 램프를 이용해서 UV-조명하였다. UV-공급원과 플로우 셀 간의 간격은 1㎝였다. 노광 시간은 15J/㎠ 면적이 플로우 셀에 전달되도록 조정하였다. 다음에, 플로우 셀은 탈이온수, 50% IPA, 탈이온수 및 KPi(10mM)로 각각 100㎕·분-1에서 2분 동안 후속으로 세척하였다. 플로우 셀은 이어서 KPi(10mM) 중 알킨 올리고뉴클레오타이드를 PMDETA, 황산구리 및 NaAsc(500mg.㎖-1 수용액)와 60℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 작용화시켰다. 표면 상의 알킨 올리고뉴클레오타이드의 존재는 알킨 프라이머의 5' 단부에서 형광 염료로 작용화된 상보적 서열분석된 올리고뉴클레오타이드로 염색함으로써 확인하였다.
결과
형광 검출은 타이푼 트리오 형광 스캐너(GE 헬쓰케어사) 상에서 수행하였다. 전형적인 화상(도 7b) 및 채널을 따른 중앙 강도를 나타내는 그래프(도 7a)가 도시되어 있다.
2×26 사이클 실행은 HiSeq 2.6mm 플로우 셀(일루미나사) 상에서 완료하였다. 첫번째 기본 보고는, 클러스터가 모든 레인에서 검출된 것을 나타내었다(도 8a 내지 도 8c 참조). 클러스터는 26 사이클 후 PAZAM으로 코팅된 채널에서 여전히 존재하였다. 결과는 또한 PAZAM 클러스터가 일루미나 쌍을 이룬-단부 프로토콜에서 서열분석될 수 있었고, 52사이클(즉, 26사이클의 쌍) 동안 데이터를 복귀시키는 것을 나타내었다. 도 8d 내지 도 8i 참조.
고체 기재 상에서의 PAZAM의 스핀 코팅
전형적인 실험에서, 패턴화된 유리 기재는 플라즈마 애셔(Emitiech K105OX)에서 100W에서 5분 동안 애싱함으로써 세정하였다. 세정 후, 기재는 개방 바이알 내에 (3-아미노프로필)트라이에톡시실란(APTES) 0.5㎖를 수용하는 진공 데시케이터에 배치함으로써 실란화되었다. 데시케이터는 감압 하에 배치하고, 60℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 실란화 후, 데시케이터는 개방하고 기재를 회수하였다. 기재를 이어서 10mM 인산칼륨 완충액(KPi)(pH 7.0) 중 5 mg/㎖ N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(SHSAB)의 용액을 수용하고 있는 페트리 접시에 엎어 놓았다. 실온에서 1시간 후, 기재를 물로 세척하고 질소로 송풍 건조시켰다. 기재를 스핀 코터 상에 배치하고, 수중 2% w/v PAZAM의 용액을 기재 위에 피펫팅하였다. 스핀 코팅 후, 기재에 365㎚ UV 방사선(UVP, 램프 XX15L)으로 30분 동안 즉시 조사하였다. 이어서 표면을 물로 광범위하게 헹구고 질소로 송풍 건조시켰다. 커버슬립으로 실링 후, 표면은 이어서 N,N,N',N',N"-펜타메틸다이에틸렌트라이아민(PMDETA, 13.14㎕, 6.3×10-5 ㏖), 황산구리(CuSO4·5H2O, 4% w/v 용액, 7.49㎕, 1.2×10-6 ㏖) 및 아스코르브산 나트륨(수중 500 mg/㎖ 용액 4.75㎕, 1.2×10-5 ㏖)과 함께 60℃에서 30분 동안 10mM KPi pH 7.0(1.429㎖) 중 알킨 올리고뉴클레오타이드(3×10-9 ㏖)와 반응시킴으로써 작용화시켰다. 표면 상의 알킨 올리고뉴클레오타이드의 존재는 형광 텍사스 레드 염료로 5' 단부에서 작용화된 상보적 서열분석된 올리고뉴클레오타이드로 염색함으로써 확인되었다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 형광 신호는 타이푼 트리오 형광 스캐너(GE 헬쓰케어사) 상에서 스캐닝함으로써 검출될 수 있었다.
도 9는 상보적 형광 올리고뉴클레오타이드로 혼성화된 알킨 올리고로 작용화된 스핀 코팅된 기재를 도시한다. 어두운 색은 스핀 코팅된 중합체층 상에서의 올리고뉴클레오타이드의 존재를 나타낸다.
실시예 4
알킨 작용화된 표면의 제조
반응식 3. 알킨 작용화된 표면을 제조하기 위한 제안된 합성 경로
Figure pct00019
본 명세서에 기술된 바와 같이, 각종 작용기는 중합체 로킹에 이용될 수 있다. 반응식 3은 알킨 작용화된 표면을 제조하기 위한 각종 제안된 합성 경로를 예시한다.
대안적인 접근법은 광활성 커플링제인 N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)의 사용을 수반한다. 설포-HSAB는 광활성 아릴 아자이드 및 활성화된 NHS 단위로 구성된 상업적으로 입수가능한 이작용성 가교제이다. UV 광(~250 내지 374㎚)에 노광 시, 아릴 아자이드는 질소의 방출과 함께 나이트렌을 생성한다. 이 고도의 반응성 종은 각종 신속한 삽입 반응을 겪을 수 있다.
실시예 5
광-활성 표면의 제조
반응식 4. 광활성 표면을 생성하는데 이용된 경로
Figure pct00020
반응식 4는 광활성 표면을 제조하는 경로를 도시한다. 표면은 APTS(메톡시 또는 에톡시 실란)로 전처리하고 소성하여 아민기 단층(또는 다층)을 형성한다. 이어서 아민기는 설포-HSAB와 반응하여 아지도 유도체를 형성한다. 1 내지 30 J/㎠ 에너지로 21℃에서의 UV 활성화는 활성 나이트렌종을 생성하며, 이는 PAZAM과의 각종 삽입 반응을 용이하게 겪을 수 있다.
초기의 지견은, 광활성 표면 및 정제된 PAZAM 혼합물의 사용을 수반하는 이 접근법이 표준 GA 플로우 셀(일루미나사)을 코팅하는데 이용될 수 있고, 얻어지는 코팅이 클러스터를 성장시키는데 이용될 수 있는 것을 나타내고 있다. 부가적으로, 중합체는 유사한 결과를 지니는 준비된 광활성 웨이퍼 상에 (예컨대, 스핀-코팅, 침지(dunking), 딥핑(dipping), 분사 등에 의해) 침착시킬 수 있다. 상기 반응식 4 에서 묘사된 바와 같이 유래된 코팅된 PAZAM 혼합물은 서열분석이 행해졌으며, 이 실행의 요약은 이하에 상세히 설명된다.
대안적인 가교제
설포-HSAB에 부가하여, 3가지 다른 가교제의 광안정성 및 효능이 또한 스크리닝되고 설포-HSAB와 비교되었다.
Figure pct00021
대안적인 가교제는 GA 플로우셀(일루미나사)로 표준 처리 플로우를 이용해서 스크리닝하였다. 테스트된 가교제는 설포-HSAB, 다이아지린, BBA 및 ATFB를 포함한다. 커플링 반응은 약 20mM의 농도에서 DMF 중에 20℃에서 행해졌다. APTES 침착 후, 아미노실란-작용화된 플로우셀의 교호 레인은 크로스링커의 각각의 20mM 수성/DMF 용액으로 처리하였다. 채널은 설포-HSAB 대조군 채널로서 동일한 시간 동안 인큐베이팅하였다. 연속적인 세척, 표면에 대한 PAZAM 코팅 및 중합체를 로킹하기 위한 UV 노광 후, 레인들을 표준 프라이머 올리고뉴클레오타이드로 그래프팅하고, 상보적 형광 올리고뉴클레오타이드 서열로 염색하였다. 텍사스 레드(Texas Red) 혼성화 후의 결과는 도 10a 및 도 10b에 요약되어 있다.
3개의 대안적인 크로스링커의 성능은 타이푼 이미저를 이용해서 혼성화된 상보적 올리고뉴클레오타이드의 형광 신호를 측정함으로써 평가하였다. 그 결과는 명확하였고, 측정된 표면 프라이머 밀도는 설포-HSAB에 대해 기록된 것의 절반 미만이었다. 이들 광활성 크로스링커(설포-HSAB를 포함함) 중 어느 것에 대해서도, 코팅된 중합체를 지니는 공유 결합을 형성하기 위한 삽입 기전은 아마도 열적으로 촉발될 수 있다.
실시예 6
불포화 표면의 제조 및 PAZAM의 열 가교결합
중합체 로킹에 대한 다른 대안적인 접근법은, 알켄 등과 같은 불포화 기로 기재의 표면을 작용화시키는 것을 포함하는, PAZAM의 열 가교결합이다. 반응식 5는 알켄 작용화된 표면을 생성하는 몇몇 합성 경로를 예시한다.
반응식 5. 아크릴아마이드 작용화된 표면을 생성하는데 이용되는 경로
Figure pct00022
기재의 표면은 우선 3-아미노프로필트라이메톡시실란(APTMS)(5a)으로 처리하여 아민 작용화된 표면을 형성하였다. 이어서 아민 작용기를 염화아크릴로일(5b) 또는 활성화된 아크릴로일 NHS 에스터(5c)와 반응시켰다. 그 후, PAZAM을 플로우셀 내에 1 내지 2% PAZAM 수용액을 펌핑함으로써 또는 개방 유리 슬라이드의 상부 상에 스핀 코팅함으로써 불포화 표면에 도입하였다. 플로우 셀 내로 펌핑된 수용액에 존재하는 PAZAM의 양은, 예를 들어, 0.1 내지 10%일 수 있다. 기재는 상승된 온도에서, 전형적으로 60℃에서 인큐베이팅하였다. 이 과정에서, PAZAM 상의 아자이드기는 표면 상의 불포화 알켄기와 반응시켰다. 이 과정에서, 문헌[
Figure pct00023
et al., Tetrahedron: Asymmetry (1997), 8: 3087-3820](이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 제안된 바와 같이 상이한 기전이 수반될 수 있다.
과잉의 미반응 PAZAM을 제거하기 위하여 물 혹은 수성 완충액을 이용한 세척 후, 표면은 핵산 프라이머에 그래프트될 수 있다. 기타 모든 하류 공정, 예컨대, QC 또는 클러스터 성장에서 표준 수법이 이용될 수 있다. 표면은 UV 활성화를 통한 중합체 로킹에 특징적인 유사한 성능을 지닌다. 예를 들어, 이것은 상이한 프라이머 밀도를 달성하기 위하여 상이한 농도의 그래프팅 프라이머로 그래프팅될 수 있다. 또, 이것은 활성 표면 처리량을 유지하면서 탈수, 건조 보관 및 재수화될 수도 있다(도 12 참조).
실시예 7
클러스터의 중합체 코팅 및 서열분석의 적용
도 8a 내지 도 8i에서, PAZAM-코팅된 HiSeq 플로우 셀(일루미나사)을 이용해서 2×26 사이클 실행을 완료하였다. 첫번째 기본 보고는 모든 레인에서 클러스터가 검출된 것을 나타내었다. 또한, PAZAM 클러스터는 26 사이클 후에 여전히 존재하였다. PAZAM 클러스터는 쌍을 이룬 단부 판독을 완료하고 완전한 52 사이클(즉, 26사이클의 쌍) 동안 데이터를 복귀시켰다.
열 가교결합 방법에 의해 제조된 중합체 코팅된 표면은 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 방법을 이용한 클러스터 성장 및 서열분석에 대해서 또한 활성이다. 도 13a는 Hi-Seq(일루미나사) 상에 영상화된, 주형으로서의 PhiX V3을 이용해서 열 가교결합된 표면 상에 성장된 클러스터를 도시한다. 도 13b는 종래의 서열분석 화학을 이용한 Hi-Seq 상에서의 2×26 사이클 실행으로부터 얻어진 서열 분석 메트릭을 예시한다.
실시예 8
중합체 코팅의 패터닝 적용
광활성 층의 생성은, 규칙적인 플로우 셀을 코팅하는 것에 부가해서, 또한 패턴화된 표면을 형성하는데 이용될 수 있다. 미세제작 수법이 불활성 혹은 수동 재료의 "바다"에서 아미노 작용성의 "섬"을 작성하는데 통상 이용될 수 있다.
설포-HSAB와 같은 아릴 아자이드는, 패턴화된 광활성 층을 작성하기 위하여 아미노 코어 상에 위치될 수 있다. 이 표면을 PAZAM와 같은 중합체 혼합물로 코팅한 후 UV 노광 및 후속의 세척은 중합체-패턴화된 어레이를 남긴다. 이 과정은 도 11a에서 보여주고 있다.
백그라운드 영역에는 어떠한 포토커플링된 중합체도 남아 있지 않은데 그 이유는 크로스링커가 패취에만 위치되어 있기 때문이다. 라디칼 삽입 반응은 표면에서 단층에 국한되어 라디칼의 비제어된 전파를 최소화한다. 실란 및 포스페이트 단위로 작용화된 아릴 아자이드는 또한 상업적으로 입수가능한 출발 물질로부터 용이하게 접근될 수 있어, 광범위한 패치 유형에 앵커링을 허용한다(도 11a 참조). 작용화된 특징부 패취 내의 우선적인 중합체 침착은 베어 유리 특징부(bare glass feature)와 금 틈새 영역을 지니는 슬라이드를 이용해서 관찰되었다(도 11b). 우측은 만테이아 형광 화상을 나타내고, 좌측은 슬라이드의 타이푼 화상을 나타내며, 보다 어두운 영역이 증가된 중합체 코팅을 나타낸다.
마찬가지로, 열 가교결합 방법은 또한 하지 작용성 층이 패턴화된 경우 작용성 중합체의 패턴화된 패취의 형성을 가능하게 한다. 예를 들어, 패턴화된 아미노실란의 패취는 통상의 리소그라피 수법을 이용해서 제조될 수 있다. 전형적으로, 이것은 레지스트로 기재를 코팅하고, 노광하고 나서 이 레지스트를 현상하여 기재 상의 베어 패취를 남기는 것을 포함한다. 베어 패취는 이어서 실란으로 작용화되고 나서, 레지스트의 벌크를 제거하여, 아미노 작용화된 기재의 작은 패취 뒤에 비작용성 기재의 벌크 틈새를 남긴다. 이들 패취는 이어서 반응식 5에 표시된 바와 같은 불포화 알켄기로 작용화될 수 있고, 이어서 PAZAM을 이용해서 인큐베이팅될 수 있다. 얻어지는 표면은 미리 규정된 그리드 내에 PAZAM의 작은 패취들을 포함하는 바, 이는 이어서 규정된 패턴화된 어레이 상에 클러스터 성장을 지지할 수 있다. 도 14에서, 위에서 기술된 바와 같이 작성된 표면은 패턴화된 영역 상에 선택적으로 브리지 증폭을 지지하는 것으로 나타난다. 특징부는 직경이 450㎚이고 피치가 1.4㎛이다. 클러스터는 1pM 인간 DNA 주형을 구비한 일루미나 V3 PE cBot 키트를 이용해서 성장되었다. 그 표면은 증폭 후 Sybr 녹색으로 영상화하였다.
이용될 수 있는 패턴화된 표면을 작성하는 다른 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제13/492,661호 및 제13/661,524호(이들의 각각은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다.
실시예 9
PAZAM을 이용한 비드 코팅
비드에 중합체 코팅을 도포하는 각종 방법이 이용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 하나의 접근법은 중합체 로킹을 위하여 UV 활성화 가능한 표면의 이용을 포함한다. 실시예 11에 기술된 대안적인 접근법은 중합체의 열 가교결합을 위하여 알켄 혹은 아크릴아마이드 작용화된 표면의 이용을 포함한다. 열-기반 접근법에 있어서, 비드는 일반적으로 알켄기 또는 아크릴아마이드기로 작용화된 후 중합 저해제(예를 들어, BHT, 다이에틸하이드록실아민 또는 TEMPO 등)를 함유하는 세척 용액에 노출된다. 이것은 알켄기 또는 아크릴아마이드기의 조기 중합으로 인한 비드의 응집을 방지하기 위하여 행해질 수 있다.
비드 상에 PAZAM을 코팅한 후, 비드는 과잉의 비결합 PAZAM을 제거하기 위하여 세척하였다. PAZAM층은 세척 후 약 20㎚ 두께였다. 비드는 이어서 PAZAM 상의 아자이드기를 5' 알킨 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시킴으로써 프라이머들(P5/P7의 믹스)에 그래프트시켰다. 중합체 중의 아민기를 5'-NHS 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시키는 단계; 중합체 중의 옥소-아민기를 5'-알데하이드 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시켜 옥심을 형성하는 단계; 중합체 중의 티올기를 5'-말레이미드 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시키는 단계; 올레핀 교차복분해 단계(중합체와 5'-변형된 올리고뉴클레오타이드 양쪽 모두에서의 말단 알켄기들을 복분해 촉매의 존재 하에 반응시키는 단계); 중합체 중의 아민기를 5'-염화사이아누르 변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시키는 단계 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 대안적인 그래프팅 화학이 또한 이용될 수 있다. 비드 상의 PAZAM에 그래프트되지 않은 과잉의 프라이머는 세척하여 제거하여, 비드 상에 PAZAM-올리고 층을 지니는 비드를 남겼다.
기재의 표면에 도포하기 전에 중합체 코팅된 비드에 대한 품질 제어를 수행하기 위하여 수개의 방법이 이용될 수 있다. 하나의 방법은 염료(예를 들어, Dylight 488 포스핀)를 이용해서 PAZAM을 직접 염색하는 것이다. 다른 방법은 PAZAM 상의 올리고뉴클레오타이드의 염료-표지된 역 상보체로 그래프트된 올리고뉴클레오타이드를 표지화하는 것이다. 표지된 비드는 표면 상에 유세포분석 혹은 주조에 의해 측정하고 나서, 광 현미경 검사(현광 광 현미경 분석을 포함)에 의해 분석하였다. 또한, 비드의 분획은 비드가 검정에서 어떻게 수행될 것인지를 접근하는 파괴 시험에서 이용될 수 있다. 하나의 예는 기재 상에 분획을 장입하고, 서열분서을 수행하고, 비드의 벌크가 많은 어레이 상에 장입을 위하여 이용하기에 충분히 양호한지를 결정하는 것이다.
상이한 유형의 에칭가능한 기재, 예를 들어, 규소, 플라스틱(Zeonor(등록상표)), 및 첨가제(예컨대, SiO2 또는 카본블랙)가 함침된 플라스틱이 비드 장입용으로 이용될 수 있다. 도 15는 깨끗한 Zeonor 슬라이드 상에 PAZAM-피복된 비드를 장입함으로써 제조된 패턴화된 PAZAM 어레이를 예시한다.
패턴화된 어레이의 제조를 위하여 중합체 코팅된 비드를 이용하는 수개의 이점이 있다. 우선, 비드 접근법은 비용 효율적이고 시간 절약적이다. 비드 장입 접근법은 종래의 코팅 접근법 및 플로우 셀 그래프팅에 비해서 높은 밀도를 지니는 어레이 표면의 제조를 가능하게 한다. 예시적인 통상적인 접근법은 플로우 셀에 상이한 시약을 전달하고 플로우 셀 온도를 제어할 수 있게 하는 장치를 이용하며, 그 결과 펌핑된 프라이머의 분획만이 실질적인 폐기물로 된다. 또한, 본 명세서에 기술된 비드 장입 절차는 종래의 절차보다 훨씬 신속하고, 또한 대규모의 상업적인 적용을 가능하게 한다.
실시예 10
광활성 중합체
본 명세서에는 브리지 증폭 및 후속의 합성에 의한 서열분석(SBS) 화학을 지지할 수 있는 대안적인 수-가용성 중합체의 사용이 개시되어 있다. 또한, 중합체는 다양한 상이한 수법을 이용해서 표면에 용이하게 적용될 수 있다. 특히, 표면에 적용되기 전에 완전히 특징으로 할 수 있는 선형 중합체를 전개시키는 것은 표면 코팅의 품질의 잠재적인 변동을 제한하기 위하여 유익하다. 또한, 본 명세서에 기술된 접근법은 중합체의 딥, 분사 및 스핀-코팅을 포함하는 대안적인 코팅 전략을 이용하는 능력을 포함한다.
반응식 6은 상업적으로 입수 가능한 출발 물질을 이용해서 제조될 수 있는 선형 중합체의 제조를 도시한다. 중합체는, 플로우 셀 내로의 제작 전에, 제어가능한 방식으로, 유리 및 규소 웨이퍼를 코팅하여, 용액 중합체와 코팅된 웨이퍼 둘 모두에 대한 완전한 특징화를 가능하게 하는데 이용될 수 있다. 이 방법은 또한 필요에 따라 한쪽 또는 양쪽의 플로우 셀 표면을 작용화시킬 수 있다.
반응식 6. 광활성 선형 중합체의 합성
Figure pct00024
중합은 전통적인 용액-상 수법을 이용해서 대규모로 수행될 수 있다. 아크릴아마이드 및 새로운 단량체 6c(단일의 1-단계 절차를 통해서 합성됨)는 PAZAM을 제조하기 위한 현재의 절차와 유사한 자유-라디칼 중합을 이용해서 중합될 수 있다.
하나의 변형예는 퍼플루오로아릴 아자이드의 사용을 수반한다(Keana, J. F. W.; Cai, S. X. New Reagents for Photoaffinity Labeling: Synthesis and Photolysis of Functionalized Perfluorophenyl Azides. J. Org. Chem. 1990, 55, 3640-3647)(이 문헌의 개시내용은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함됨). 이들 종은 나이트렌의 생성 시 환 확장을 겪게 되는 감소된 경향을 나타낸다. 그 결과, UV-촉발된 반응은 삽입 생성물의 배타적인 형성을 지니는 클리너이다.
반응식 7. 광활성 중합체를 제조하기 위한 퍼플루오로 아릴 아자이드 단량체의 합성
Figure pct00025
표지화제로서의 아릴 아자이드의 사용은 이미 1969년부터 보고되어 있었다(Fleet, G. W. J.; Porter, R. R.; Knowles, J. R. Affinity Labeling of Antibodies with Aryl Nitrene as Reactive Group. Nature 1969, 224, 511-512)(이 문헌의 개시내용은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함됨). 본 출원에 있어서, 이들 작용기의 이중 반응성은 싱글렛 나이트렌 종의 UV-촉발된 생성 후의 포토커플링제 및 1,3-쌍극 환화 첨가(올리고의 그래프팅을 위하여)에서의 파트너로서 이용된다. UV-활성 단량체를 이용하는 이점은 "클린"(삽입 생성물 단독)하고, 화학선택적이며, 방대한 수의 삽입가능한 결합을 제공하는 중합체 환경으로 편재화된다.
이 접근법은 어떠한 침착 후 작용화 단계도 수행할 필요를 제거한다. 일단 사전-그래프트된 중합체로 코팅되면, 웨이퍼를 다이싱하고, 커버슬립을 부착하고, 이용가능한 표면 프라이머의 수를 결정/확인하기 위하여 수행되는 QC 단계를 수행할 수 있다.
정제된 배취는, 이어서, 예를 들어, 구리 촉매된 후이스겐(Huisgen) 1,3-환화 첨가를 이용해서 용액 중에서 그래프트된 부분(대략 ~80%)으로 분할된다(도 16: 경로 2). 그래프팅된 중합체는 이어서 웨이퍼 표면 및 이웃하는 중합체 사슬 둘 모두에 로킹 가능한 유리 광활성기뿐만 아니라 쌍을 이룬 단부 프라이머 양쪽 모두를 함유하는 중합체 믹스를 제공하기 위하여 비반응 재료와 재조합될 수 있다(도 16 참조).
이 포토커플링 접근법은 클러스터 성장 및 서열분석 단계 둘 모두를 지지하기 위하여 중합체 견고성을 향상시킨다. 이전의 작업은 동적 규소-무함유-아크릴아마이드 믹스가 SBS를 지지할 수 있지만 클러스터 후 희미하게 가시적이며 서열분석 동안 더욱 현저하게 되는 바람직하지 않은 "주름"을 나타내는 것으로 제시되었다. 본 명세서에 개시된 포토커플링 접근법의 사용은 과도한 유연성을 감소시키고 그래프트된 프라이머에 대한 접근을 유지하면서 웨이퍼에 대한 중합체의 앵커링을 향상시킬 수 있다.
실시예 11
열 가교결합을 이용한 비드의 PAZAM으로의 코팅
실리카 비드는 인디아나주의 피셔스시에 소재한 방스 랩(Bang's Labs)으로부터 10 중량% 고체 현탁액으로서 얻었다(PN SS04N/9348, 그러나 많은 다른 비드 조성 및 크기가 마찬가지 방식으로 이용될 수 있음에 유의해야 한다). 1㎖(100㎎)의 분획을 1.5㎖ 에펜도르프 관에 옮겼다. 이 관을 벤취탑 원심분리기(5000 rfu) 상에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 스핀 다운시켰다. 이 용액을 흡인에 의해 제거하였다. 다음에, 이 관에 아세토나이트릴(알드리치 PN 34967) 1㎖를 첨가하고, 해당 관을 30초 동안 와류교반하여 현탁액을 균질화시키고, 이어서 재차 스핀다운시켰다. 이 과정을 5시간 반복하여 용매를 교환하였다. 최종적으로, 용매의 마지막 부분은 흡인에 의해 제거하였다(원심분리 후 비드를 스핀다운시켰다).
별도의 15㎖ 관에 아세토나이트릴 5㎖ 및 3-아크릴아미도프로필트라이메톡시실란(Gelest PN SIA0146.0) 100㎕를 첨가하였다. 이 용액을 15초 동안 와류교반하여 이 용액을 혼합하였다. 다음에, 이 용액에 중합 저해제를 첨하가여 조기 중합을 방지하였다: N,N-다이에틸하이드록실아민(알드리치 PN 471593) 2㎕를 실란 용액 2㎖에 첨가하여 저해제 농도를 1000ppm으로 만들었다. 다음에, 비드에 저해제 용액을 지니는 실란 용액 1㎖를 첨가하였다. 상기 관을 30초 동안 와류교반하여 실란 용액 중의 비드 현탁액을 균질화시켰다. 비드를 이어서 실란에 대해서 로티세리(rotisserie) 믹서 상에서 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 다음에, 비드의 관을 원심분리시켜 비드를 스핀다운시키고, 흡인에 의해 용액을 제거하였다. 비드를 이어서 위에 기술된 것과 마찬가지 방식으로 N,N-다이에틸하이드록실아민 중합 저해제 1000ppm을 함유하는 아세토나이트릴로 용매 교환하였다.
실란화 후, 비드를 중합 저해제 1000ppm을 함유하는 에탄올로 (5회 연속 원심분리, 흡인 및 새로운 용매 첨가에 의해) 용매 교환하였다. 다음에, 비드를 중합 저해제 1000ppm을 함유하는 아세톤으로 용매 교환하였다. 최종적으로, 잔류 아세톤은 흡인에 의해 제거하고(비드의 원심분리 후), 비드의 관을 고무 밴드로 고정된 킴와이프(kimwipe)로 캐핑하여 건조된 비드가 진공실 내로 도망가지 못하게 확실히 하였다. 비드를 이어서 40℃로 사전 가온된 진공로에 배치하고, 1시간 동안 진공(대략 27 Torr)을 수용하게끔 시행하였다. 비드를 이어서 진공로로부터 제거하고 중합 저해제 1000ppm을 함유하는 HPLC 등급수 1㎖를 첨가하였다. 비드 현탁액을 이어서 30초 동안 와류교반시켜 균질화시켰다.
별도의 1.5㎖ 에펜도르프 관에, 이전 단계로부터의 비드의 수성 현탁액 10㎕를 첨가하였다. 다음에, 비드에 HPLC 등급수 중 PAZAM 중합체의 1.0 중량% 용액 1㎖를 첨가하였다. 이 용액을 벤치탑 보텍서 상에서 20초 동안 와류교반하여 균질화시키고 나서, 7000 rfu에서 90초 동안 원심분리하여 비드를 얻었다. PAZAM 중합체 용액을 이어서 흡인에 의해 제거하였다. 다음에, 비드에 2.0 중량% PAZAM 용액 1㎖를 첨가하고, 이 용액을 벤치탑 보텍서 상에서 20초 동안 와류교반하였다. 다음에, 관을 60℃에서 1시간 반응시킴으로써 PAZAM을 실란에 열 그래프트시켰다. 비드에 PAZAM의 열 그래프트 후, 비드를 5×1㎖ HPLC 등급수로 (위에서 기술된 용매 교환 방법을 이용해서) 실온에서 세척하고 나서, 3×1㎖의 사전 가온된(대략 40℃) HPLC 등급수로 세척하였다. 비드를 100㎕의 HPLC 등급수 내에 희석시켜 10 중량% 고체 현탁액을 제조하였다.
P% 및 5' 알키닐 작용기를 지니는 P7 올리고뉴클레오타이드를 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 절차를 이용해서 별도로 합성하였다(또는 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드 합성 벤더로부터 상업적으로 획득하였다). 올리고뉴클레오타이드 용액은 HPLC 수 중 100μM 용액으로서 제공하였다.
아지도-작용화된 PAZAM에 알키닐-작용화된 올리고뉴클레오타이드의 그래프팅은 다음과 같이 행하였다. PAZAM-그래프팅된 비드 용액의 10 중량% 고체의 100㎕ 분획에 1xPBS 완충액(pH 7.4) 800㎕ 및 올리고뉴클레오타이드 용액 100㎕을 첨가하였다. 이 용액에 온화한 버블링 질소 유량에서 10분 동안 질소 가스를 살포하였다. 다음에, 순수한 PMDETA(알드리치 PN 369497) 2㎕를 첨가하였다. 다음에, 황산구리(알드리치 PN C2284)의 160mM 수용액 17㎕를 첨가하였다. 이 용액은 20초 동안 와류 교반하여 혼합함에 따라서 보라색으로 변하였다. 최종적으로, HPLC 수 중의 아스코르브산 나트륨(알드리치 PN A7631)의 40 ㎎/㎖ 용액 25㎕를 첨가하고, 20초 동안 와류 교반함으로써 혼합 후 청색으로 변하였다. 이 용액은 60℃에서 1시간 동안 반응하도록 허용하였다. 다음에, 비드를 원심분리하고, 이 반응 용액을 흡인에 의해 제거하였다. 비드를 앞서 기술된 바와 같은 유사한 방식으로 1xPBS 완충액(pH 7.4)에서 세척하였다(완충액 5×1㎖ 세척액을 이용한 용매 교환).
올리고-작용화된 비드를 이어서 1.2마이크론 구멍들로 작용화된 빈 마이크로어레이 슬라이드 상에 장입하였다. 슬라이드들을 미국 특허 제6,770,441호에 기술된 바와 같이 준비하였다. 비드는 다음과 같이 장입하였다: 웰을 보유하고 있는 슬라이드는 실온에서 5분 동안 0.1N NaOH에 담그고 나서 흐르는 HPLC 등급수(약 100㎖)로 격렬하게 세척함으로써 사전 세정하고, 질소 스트림 하에 건조시켰다. 다음에, 10㎕의 200 프루프 에탄올(알드리치 PN E7023)을 100㎕의 비드 용액에 첨가하였다. 비드 용액을 이어서 피펫을 통해서 현미경용 슬라이드에 가하였다. 다음에, 슬라이드를 40℃로 사전에 가온된 진공로에 배치하고, 슬라이드를 30분 동안 증발시켰다. 잔류 비드를 현미경용 슬라이드의 표면으로부터 에탄올-포화된 킴와이프의 가벼운 수동 도포에 의해 제거하였다.
이 방법으로 준비된 하나의 슬라이드에 5xSSC 완충액(알드리치 PN S6639) 중 5'-염료 표지된(바람직하게는 Cy5) 올리고뉴클레오타이드의 10μM 용액을 첨가하였으며, 이 올리고에 대한 역보체는 PAZAM-그래프트된 비드에 고정시켰다. 슬라이드는 이어서 유리 커버슬립으로 덮었다. 슬라이드는 실온에서 30분 동안 혼성화시켰다. 다음에, 커버슬립을 제거하고, 슬라이드를 엄청난 양의 흐르는 5xSSC 완충액(약 100㎖)으로 세척하였다. 최종적으로, 이 슬라이드에 100㎕의 5xSSC 완충액과 이어서 커버슬립을 첨가하고, 슬라이드를 GE 타이푼 FLA 9500 상에서 촬영하여 500 PMT 세팅을 구비한 Cy5 염료 채널 세팅에서 스캐닝하였다.
이 방법에서 제작된 다른 슬라이더에 고무제 가스킷과, 일루미나 HiSeq 서열분석 기기를 통해서 액체 도입을 가능하게 하기 위하여 유리 내 구멍들의 적절한 위치에 사전에 구멍을 뚫은 다른 현미경용 슬라이드를 부가하였다. DNA 클러스터를 이어서 슬라이드들 상에서 성장시키고, 클러스터는 HiSeq 2000(일루미나사, 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재)용의 제조사의 지시에 따라서 서열분석하였다. 이 슬라이드는 클러스터 당 150 bp까지의 샘플 DNA를 서열분석할 수 있는 것을 나타내었다.

Claims (50)

  1. 중합체 코팅이 공유 부착된(covalently attached) 표면을 지니는 기재(substrate)로서, 상기 중합체 코팅은 하기 하기 화학식 (I)의 반복 단위와 하기 화학식 (II)의 반복 단위를 포함하는 것인 기재:
    Figure pct00026

    식 중,
    각각의 R1 및 R1'는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되고;
    각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알킬아미노, 알킬아미도, 알킬티오, 아릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R4, R4', R5 및 R5'는 독립적으로 H, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 또는 -NR7R8로부터 선택되고;
    R6은 독립적으로 H, OH, 알킬, 사이클로알킬, 하이드록시알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 알킬로부터 선택되거나, 또는 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자 또는 원자들과 함께 연결되어 헤테로사이클을 형성한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ia)로 표시되는 것인 기재:
    Figure pct00027

    식 중, R1은 H 또는 알킬이고;
    RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르(cyanuric chloride), 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
    o는 1 내지 50의 정수이며,
    단, R1이 H이고, o가 5이며, RA가 할로이면, RA는 브로모기일 수 없다.
  3. 제2항에 있어서, RA는 아지도이고, R1은 수소이며, o는 5인 것인 기재.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함하는 것인 기재:
    Figure pct00028

    식 중, R1은 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
    o는 1 내지 50 범위의 정수이며;
    R5는 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 내지 50,000 범위의 정수이며;
    m은 1 내지 100,000 범위의 정수이고;
    단, R1과 R5가 H이고, o가 5이면, RA는 브로모기일 수 없다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체는 또한 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)로 표시되는 것인 기재:
    Figure pct00029

    식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 상기 표면에 부착된 일련의 작용기에 공유 결합되고, 상기 작용기는 스트라우딩거 결찰(Staudinger ligation)을 위한 오쏘 위치에 포스핀 치환체를 지니는 알켄, 알킨, 나이트렌, 알데하이드, 하이드라진, 활성화 에스터, 글라이시딜 에터, 아민, 말레이미드 및 벤조일 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 기재.
  7. 제6항에 있어서, 상기 작용기는 알킨을 포함하고, 상기 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, RA는 아지도인 것인 기재.
  8. 제6항에 있어서, 상기 작용기는 나이트렌을 포함하고, 상기 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, RA는 아지도인 것인 기재.
  9. 제6항에 있어서, 상기 작용기는 활성화 에스터를 포함하고, 상기 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 화학식 (Ia)로 표시되되, RA는 아민인 것인 기재.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 반복 단위는 또한 하기 화학식 (Ib)로 표시되는 것인 기재:
    Figure pct00030

    식 중, R2는 선택적으로 치환된 아릴이다.
  11. 제10항에 있어서, R2는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환된 페닐 아자이드인 것인 기재.
  12. 제10항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (IV)의 중합체를 포함하는 것인 기재:
    Figure pct00031

    식 중, n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화학식 (IV)의 페닐기는 1개 이상의 플루오로기에 의해 치환되는 것인 기재.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 중합체-코팅된 영역과 불활성 영역을 모두 포함하는 것인 기재.
  15. 제14항에 있어서, 상기 불활성 영역은 유리 영역, 금속 영역, 마스크 영역 및 틈새 영역(interstitial region)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 기재.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 불활성 영역은 유리를 포함하는 것인 기재.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재의 표면은 개방 웰(open well)을 포함하는 것인 기재.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재는 비드인 것인 기재.
  19. 기재의 표면에 고정된 중합체 코팅을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    중합체를 기재의 표면과 접촉시켜, 상기 표면 상에 중합체 코팅의 층을 형성하는 단계를 포함하되, 상기 표면은 복수의 작용기를 포함하고, 상기 중합체 코팅은 상기 표면 상의 작용기에 공유 결합되며,
    상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (I)의 반복 단위와 하기 화학식 (II)의 반복 단위를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00032

    식 중,
    각각의 R1 및 R1'는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되고;
    각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알킬아미노, 알킬아미도, 알킬티올, 아릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R4, R4', R5 및 R5'는 독립적으로 H, OH, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 또는 -NR7R8로부터 선택되고;
    R6은 독립적으로 H, OH, 알킬, 사이클로알킬, 하이드록시알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 알킬로부터 선택되거나, 또는 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자 또는 원자들과 함께 연결되어 헤테로사이클을 형성한다.
  20. 제19항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00033

    식 중, R1은 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
    o는 1 내지 50 범위의 정수이며;
    R5는 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고;
    m은 1 내지 100,000 범위의 정수이며;
    단, R1과 R5가 H이고, o가 5이면, RA는 브로모기일 수 없다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체는 또한 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)로 표시되는 것인 방법:
    Figure pct00034

    식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재의 표면 상의 작용기는 광-활성화 가능한 아자이드(photo-activatable azide)를 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재의 표면 상의 작용기는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 페닐 아자이드는 상기 기재의 표면 상의 아민기를 N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)와 반응시켜 제조되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 페닐 아자이드는 상기 중합체를 상기 기재의 표면과 접촉시키기 전에 광-활성화되는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 광-활성화를 통해서 상기 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  27. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 중합성 재료는 구리 촉매의 존재 하에 상기 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  29. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재의 표면 상의 작용기는 알켄기 또는 아크릴아마이드기를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 아크릴아마이드기는 아민 작용화된 표면을 활성화된 아크릴산 에스터 또는 아크릴산 염화물로부터 선택된 아크릴로일기와 반응시킴으로써 제조된 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 아민 작용화된 표면은 해당 표면을 3-아미노프로필 트라이메톡시실란(APTMS)으로 처리함으로써 제조된 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 활성화된 아크릴산 에스터는 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터인 것인 방법.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 작용기는, 상기 중합성 재료가 중합된 후에 복수의 중합체-코팅된 영역과 복수의 불활성 영역을 형성하도록 상기 기재의 표면 상에 배열되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 불활성 영역은 유리 영역, 금속 영역, 마스크 영역 및 틈새 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 불활성 영역은 유리를 포함하는 것인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 중합체-코팅된 영역과 상기 복수의 불활성 영역은 패턴을 형성하도록 상기 표면 상에 배열되는 것인 방법.
  37. 제19항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재는 비드인 것인 방법.
  38. 비드의 어레이를 제조하는 방법으로서,
    하나 이상의 비드의 표면 상에 복수의 작용기를 형성하는 단계; 및
    상기 비드를 중합체 코팅과 접촉시켜, 상기 비드의 표면 상에 중합체 코팅층을 형성하는 단계를 포함하되, 상기 중합체 코팅은 상기 비드의 표면 상의 상기 작용기에 공유 결합되고, 상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (I)의 반복 단위와 하기 화학식 (II)의 반복 단위를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00035

    식 중,
    각각의 R1 및 R1'는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되고;
    각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알킬아미노, 알킬아미도, 알킬티오, 아릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R4, R4', R5 및 R5'는 독립적으로 H, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 또는 -NR7R8로부터 선택되고;
    R6은 독립적으로 H, OH, 알킬, 사이클로알킬, 하이드록시알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 선택적으로 치환된 변이체로부터 선택되며;
    각각의 R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 알킬로부터 선택되거나, 또는 R7과 R8은 이들이 부착되는 원자 또는 원자들과 함께 연결되어 헤테로사이클을 형성한다.
  39. 제38항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 하기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00036

    식 중, R1은 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    RA는 수소, 아민, 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 옥소-아민, 아지도, 폼일, 할로, 하이드록시, 하이드라지닐, 하이드라조닐, 염화사이아누르, 티오사이아네이트, 카복실산, 글라이시딜, 활성화 에스터, 에폭시, 아지리딘, 트라이아졸린 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    -(CH2)-o의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
    o는 1 내지 50 범위의 정수이며;
    R5는 H 또는 알킬로부터 선택되고;
    n은 1 내지 50,000 범위의 정수이며;
    m은 1 내지 100,000 범위의 정수이고;
    단, R1과 R5가 H이고, o가 5이면, RA는 브로모기일 수 없다.
  40. 제39항에 있어서, 상기 화학식 (III) 또는 (III')의 중합체는 또한 하기 화학식 (IIIa) 또는 (IIIb)로 표시되는 것인 방법:
    Figure pct00037

    식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드의 표면 상의 작용기는 알켄 또는 아크릴아마이드를 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 알켄기 또는 아크릴아마이드기는 상기 비드의 표면을 작용화된 실란과 직접 접촉시킴으로써 제조된 것인 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 전처리된 비드가 상기 중합체 코팅과 접촉하기 전에 중합 저해제를 포함하는 용액에 노출되는 것인 방법.
  44. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드의 표면 상의 작용기는 선택적으로 치환된 페닐 아자이드기를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 페닐 아자이드는 상기 비드의 표면 상의 아민기를 N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HSAB)와 반응시킴으로써 제조된 것인 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 광-활성화를 통해서 상기 비드의 표면 상의 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  47. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 코팅은 상승된 온도에서 상기 비드의 표면 상의 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  48. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드의 표면 상의 작용기는 알킨기를 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 중합성 재료는 구리 촉매의 존재 하에 상기 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 코팅된 비드를 기재의 표면에 고정시키는 단계를 더 포함하는 방법.
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