CN111171229B

CN111171229B - 一种核酸固载微球的制备方法

Info

Publication number: CN111171229B
Application number: CN202010087598.8A
Authority: CN
Inventors: 段海峰; 刘海涛; 乔朔; 康力; 陈子天
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2040-02-12
Also published as: CN111171229A

Abstract

本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，可以有效固载核酸分子。该方法包括如下步骤,将水溶性功能性丙烯酰胺叠氮单体、丙烯酰胺单体、N,N‑亚甲基双丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮溶于异丙醇和水混合溶剂中；加入自由基引发剂，加热从室温升至70‑90℃，经聚合反应即得到目标功能性聚合物微球；聚合物微球通过可反应性叠氮基团与炔基核酸分子反应，可有效实现核酸固载于微球上。

Description

一种核酸固载微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种核酸固载微球的制备方法，可以有效固载核酸分子，属于基因测序领域。

背景技术

生物活性负载性微球(Microsphere)为粒径在50nm～2mm之间的球形颗粒，带有反应性基团如-NH 2，-COOH，-SH等。微球由于具有较小的尺寸而致使其具有明显的表面效应如材料的亲和性好、生物相容性好、以及在生物体内易吸收、易游走等特性，已广泛的应用于细胞学、免疫学、微生物学、分子生物学以及临床诊断与治疗以及高通量基因检测等众多领域。

在微球用于高通量基因检测分析某些核酸序列的方法中，依赖于微球的尺寸分布在1μm左右、高度均匀分散以及微球对于核酸链的负载量。然后，可通过本领域公知的许多不同的方法来确定负载的核酸链的序列。

在某些微球用于核酸测序方法中，程序包括用带测序的核酸样本通过领域内公知的许多方法与微球相应的反应基团快速高效结合，实现负载；将负载核酸的微球引入流动池的通道中，并进入相应的反应微坑道，孵育固定的时间，产生始终能够支持扩增和测序在内的所有下游化学处理步骤。相比于其他类型的核酸负载体方法，如芯片涂覆负载性包被，核酸负载性微球具有更好的可控性，核酸负载量大等优势。

本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，可以有效固载核酸分子。本发明所述的核酸固载微球单一性好，核酸固载量大，有利于基因测序等方面的应用。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将丙烯酰胺单体、功能性丙烯酰胺单体、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于异丙醇和水混合溶剂中，并搅拌均匀；

(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性分散剂聚乙烯吡咯烷酮，并搅拌均匀；所述的聚乙烯吡咯烷酮与丙烯酰胺单体质量比为0.05～0.5；

(3)向步骤(2)的体系中加入自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)，所述的自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)与丙烯酰胺单体质量比 0.01～0.1；

(4)加热步骤(3)的体系至70-90℃，经聚合反应即得到粒径0.5～5微米、粒径CV小于0.4的功能性单分散水凝胶聚合物微球；

(5)聚合物微球通过“点击”化学固载核酸分子；所述的“点击”化学指的是铜催化的叠氮-炔基环加成反应，所用催化剂为硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的络合物(Cu-THPTA)，其中催化剂与功能性丙烯酰胺叠氮单体摩尔比为 1～100。

根据优选的实施方式，所述步骤(1)中混合溶剂中异丙醇和水质量比为 1:0～1:0.1。

根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述的功能性丙烯酰胺单体是指：1) 具有叠氮基团能用来固载核酸的甲基丙烯酰胺叠氮单体，所述的甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5；2)具有生物素基团能用来实现微球固载的丙烯酰胺生物素单体，所述的丙烯酰胺生物素单体与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.05。

根据优选的实施方式，所述步骤(1)中混合溶剂为异丙醇、乙醇、乙腈和水的混合溶剂，优选异丙醇和水的混合体系，异丙醇和水的体积比为4～9。

根据优选的实施方式，所述步骤(4)中微球粒径特征区间在0.5-3um。

根据优选的实施方式，步骤(1)中，丙烯酰胺单体与与所述混合溶剂的质量比为：0.01～0.05

根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述功能性丙烯酰胺单体为用来固载核酸的水溶性丙烯酰胺叠氮单体和用来固载微球的丙烯酰胺生物素单体。

根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺单体质量比为0.04～0.2。

根据优选的实施方式，步骤(2)中，所述分散剂为甲基纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸钠和聚乙烯吡咯烷酮中至少一种；所述分散剂与所述丙烯酰胺单体的质量比为0.05～0.5。

根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述搅拌的转速为100～1000r/min。

根据优选的实施方式，步骤(3)中，所述引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钾和四甲基乙二胺、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)中至少一种；所述引发剂与所述丙烯酰胺单体的质量比为0.01～0.1。

根据优选的实施方式，步骤(4)中，所述聚合反应的时间为2～4小时；所述聚合反应在100～300r/min的搅拌速度下进行。

本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将丙烯酰胺单体、甲基丙烯酰胺叠氮单体、丙烯酰胺生物素单体、N,N- 亚甲基双丙烯酰胺和4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)溶于异丙醇和水混合溶剂中，并搅拌均匀；

所述的异丙醇和水混合溶剂的质量比为1:0～1:0.1；甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5；丙烯酰胺生物素单体与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.05；所述丙烯酰胺单体与所述混合溶剂的质量比为：0.01～0.1；交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺单体质量比为0.04～0.2；

(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性聚合分散剂聚乙烯吡咯烷酮，并搅拌均匀；

所述的聚乙烯吡咯烷酮与丙烯酰胺单体质量比为0.05～0.5；

(3)向步骤(1)的体系中加入水溶性自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)；所述的自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)与丙烯酰胺单体质量比0.01～0.1；

(4)加热步骤(2)的体系至70-90℃，经聚合反应即得到目标功能性聚合物微球；

(5)聚合物微球通过“点击”化学可有效固载核酸分子，

所述的“点击”化学指的是向含有叠氮的微球溶液中加入炔基修饰的核酸分子，将核酸和微球连接在一起。

本发明提供一种核酸固载聚合物微球，其特征在于，根据前面所述的方法制备。

本发明有如下显著优点：(1)操作简易，实现功能性聚合物微球的直接聚合；(2)可控性好，包括微球可反应性基团的调控、微球尺寸的调控、微球负载核算量的调控；(3)微球的最大核酸负载量大。一般的来说，核酸固载的微球对于尺寸的要求以及核酸固载量的要求都比较高。首先来说，微球的尺寸会影响后续的核酸总量以及扩增。核酸固载微球尺寸差异过大，例如超过20％，则可能导致后续核酸总量变化太大，导致测序困难。另外，微球的尺寸一般不易过大或者过小。一般的，尺寸过大的微球，例如大于2微米，导致芯片上单个微球的所占空间过大，从而导致整个测序芯片的测序密度急剧降低。另外，如果微球尺寸过小，例如小于200nm，则导致核酸总量过小，荧光信号太弱，也不利于测序。一般的，300-1500nm直径的微球是比较合适尺寸的测序微球。本发明严格控制了微球的大小，核酸固载密度，并且合成方法简单，成本比较低。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1.功能性聚合物微球的反应装置；

图2.功能性聚合物微球的扫描电镜图片；

图3.功能性聚合物微球的动态光散射测试的尺寸分布，由该图可以得知，本实施例制备的功能性聚合物微球为单分散分布的微球，平均半径为1068nm；

图4.分散聚合方法制备的功能性聚合物微球动态光散射测试的尺寸分布，对应于实施例2；

图5.实施例3分散聚合制备的功能性聚合物微球固载带荧光素的核酸分子图片。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，工艺简便，适于生产，同时微球生物兼容性好，可有效实现核酸分子在微球表面固载。

本发明所提供的一种核酸固载微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将水溶性丙烯酰胺单体、功能性丙烯酰胺叠氮单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于异丙醇的水混合溶剂中，并搅拌均匀；

(2)向步骤(1)的体系中加入聚合分散剂，继续进行搅拌；

(3)向步骤(1)的体系中加入水溶性自由基引发剂，继续进行搅拌；

(4)加热步骤(2)的体系至70～90℃，经聚合反应即得到目标功能性聚合物微球；

(5)功能性聚合物微球的叠氮基团可通过“点击”化学，在微球上固载核酸分子。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(1)中所述的反应溶剂为异丙醇和水混合溶剂；

异丙醇和水混合溶剂的质量比为1:0～1:0.1，优选1:0.01～1:0.1，更优选1:0.01～1:0.05，更优选1:0.01～1:0.03。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(1)中所述的水溶性单体为丙烯酰胺和功能性丙烯酰胺叠氮单体中至少一种；

水溶性丙烯酰胺单体、功能性丙烯酰胺叠氮单体与所述混合溶剂的质量比为：0.01～0.1，优选0.01～0.08，更优选0.01～0.06，更优选0.02～0.05。

所述的水溶性丙烯酰胺单体指的是丙烯酰胺。所述的水溶性丙烯酰胺单体也可以指的是取代的丙烯酰胺。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(1)中所述的水溶性交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酰胺乙二醇和N,N- 亚甲基双丙烯酰胺中至少一种；

水溶性交联剂与单体(水溶性丙烯酰胺单体+功能性丙烯酰胺叠氮单体)质量比为0.04～0.2；优选0.05～0.15，更优选0.06-0.1。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(2)中所述的分散剂为如甲基纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸钠和聚乙烯吡咯烷酮中至少一种；

所述分散剂与所述单体(水溶性丙烯酰胺单体+功能性丙烯酰胺叠氮单体)的质量比为0.05～0.5；优选0.08～0.4；更优选0.1-0.2。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(1)中所述的搅拌的转速为100～1000r/min；优选100-800rpm；更优选100-300rpm。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(3)中所述的水溶性引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钾和四甲基乙二胺、过硫酸钠、过硫酸钠和四甲基乙二胺、偶氮二异丁基脒盐酸盐、4,4'-偶氮双 (4-氰基戊酸)中至少一种；

所述水溶剂引发剂与所述单体(水溶性丙烯酰胺单体+功能性丙烯酰胺叠氮单体)的质量比为0.01～0.1；优选0.01～0.08，更优选0.01～0.06，更优选0.02～0.05。

上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(4)中所述的聚合反应的时间为2～4小时；优选2.5-3小时。

所述聚合反应在100～300r/min的搅拌速度下进行。

所述上述分散聚合方法合成功能性聚合物微球的方法中，步骤(5)中所述的核酸固载实现方案为“点击”化学；

所述“点击”化学条件，硫酸铜与功能性丙烯酰胺叠氮单体摩尔比为 100～1；优选80～2；更优选70～5。

点击化学(Click chemistry)，又译为“链接化学”、“速配接合组合式化学”，是由化学家巴里·夏普莱斯(K B Sharpless)在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。点击化学的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应 (Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition)。点击化学的概念对化学合成领域有很大的贡献，在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中，它已经成为最为有用和吸引人的合成理念之一。点击化学反应主要有4种类型：环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。文献报道广泛应用的点击反应(click reaction)是通过Cu(Ⅰ) 催化，炔基与叠氮基发生环加成反应，生成区域选择性的1,4-二取代 -1,2,3-三氮唑。

本领域常见的功能性分子，例如功能高分子是指具有某些特定功能的高分子材料。它们之所以具有特定的功能，是由于在其大分子链中结合了特定的功能基团，或大分子与具有特定功能的其他材料进行了复合，或者二者兼而有之。例如吸水树脂，它是由水溶性高分子通过适度交联而制得，遇水时将水封闭在高分子的网络内，吸水后呈透明凝胶，因而产生吸水和保水功能。

功能性丙烯酰胺单体指的是，具备其它活性基团的丙烯酰胺类分子。可以理解的，修饰叠氮基团、修饰生物素类似基团都是功能性丙烯酰胺分子的一种。

本发明中，所述的点击化学指的是叠氮-炔基的反应。所用催化剂优选硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的络合物(Cu-THPTA)，其中催化剂与功能性丙烯酰胺叠氮单体摩尔比为1～100。实际反应中，用到的是还原的一价铜离子。二价铜用常见的还原剂还原成一价铜，常见的有抗坏血酸钠等。

本发明中，点击化学条件指的是向具有叠氮基团的微球溶液中加入含有炔基的核酸分子，并加入催化剂。催化剂为硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的络合物(Cu-THPTA)，其中催化剂与功能性丙烯酰胺叠氮单体摩尔比为1～100。核酸通过叠氮-炔基的反应连接在一起。

优选的，同时加入还原剂。

提供一种含有丙烯酰胺叠氮基团的单体的制备方法，其特征在于包括，

二胺与叠氮脂类化合物反应，获得第一中间产物，所述二胺单端氨基用保护基团修饰保护；

第一中间产物脱去氨基保护基团，获得一端为胺基，一端带有叠氮基团的第二中间产物；

第二中间产物与丙烯酰氯或者取代的丙烯酰氯发生反应，获得一端带有双键，一端带有叠氮基团的单体；

其中所述取代的丙烯酰氯指的是甲基或乙基或者卤素连接到碳上的丙烯酰氯；

其中所述的叠氮脂类化合物的叠氮基团在端位。

根据优选的实施方式，所述二胺含有2-8个碳原子；所述二胺指的是伯胺。

根据优选的实施方式，所述二胺是中间带有1-5个PEG链的取代二胺。

根据优选的实施方式，所述二胺是1,4丁二胺。

根据优选的实施方式，所述第一中间产物脱去氨基保护基团指的是，单端叔丁基羰基保护的二胺与气态氯化氢发生反应，脱去保护基团。

根据优选的实施方式，所述二胺指的是包含以下结构的二胺。

本发明提供一种含有叠氮基团的单体的制备方法，其特征在于包括，

三胺与叠氮脂类化合物反应，获得第一中间产物，所述三胺中的氨基，其中一个或者两个用氨基保护基团修饰保护；

第一中间产物脱去氨基保护基团，获得一端或者两端为氨基，并且至少一端带有叠氮基团的第二中间产物；

第二中间产物与丙烯酰氯或者取代的丙烯酰氯发生反应，获得带有双键，并且带有叠氮基团的单体；

其中所述取代的丙烯酰氯指的是甲基或乙基或者卤素连接到碳上的丙烯酰氯。

如下面路线一所示的单体化合物(功能性丙烯酰胺叠氮单体)，反应分为三步，第一步以单端BOC保护的二胺为起始原料，第二不是核心关键改进步骤：即通过与无毒且稳定性优良的市售叠氮乙酸酯类化合物反应，通过一步高效但不常见的氨基和酯基团交换反应，就可以得到含有叠氮基团的关键中间体化合物2；第二步，通过简便的化学反应脱去叔丁基羰基保护基团，得到相应的一端为胺基，一端带有叠氮基团的稳定中间体3；第三步，将胺基与丙烯酰氯反应即可得到目标化合物。重要亮点：此方法仅有三步反应，并且每一步反应都具有转化率极高，反应彻底，反应条件温和，中间体稳定的特点，最终产物以重结晶形式得到，纯度可达99％，总收率不低于50％。

本发明合成路线一如下：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

反应路线中，单体从左到右依次为酰胺单体、甲基丙烯酰胺叠氮单体、丙烯酰胺生物素单体。

1)将58g丙烯酰胺、10g功能性丙烯酰胺叠氮单体、0.6g功能性丙烯酰胺生物素单体、10g N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶解于异丙醇/水(9:1)混合溶剂中，搅拌5分钟，温度为25℃；

2)向上述体系中加入聚合分散剂10g聚乙烯吡咯烷酮，温度为25℃；

3)向上述体系中加入水溶性自由基引发剂0.6g过硫酸钾，温度为25℃；

4)将上述体系加热至90℃，并保持3小时，搅拌转速为300r/min，得到目标功能性聚合物微球。

本实施例所涉及的装置参见图1。本实施例制备的功能性聚合物微球的扫描电镜图片参见图2。本实施例制备的功能性聚合物微球的动态光散射测试的尺寸分布参见图3，由该图可以得知，本实施例制备的功能性聚合物微球为单分散分布的微球，平均半径为1068nm。通过分析可以发现，动态光散射测试的尺寸分布同电镜图片获得的尺寸分布基本是一致的。

实施例2

1)将58g丙烯酰胺、20g功能性丙烯酰胺叠氮单体、0.6g功能性丙烯酰胺生物素单体、10gN,N-亚甲基双丙烯酰胺溶解于异丙醇/水(8:1)混合溶剂中，搅拌5分钟，温度为25℃；

2)向上述体系中加入聚合分散剂20g聚乙烯吡咯烷酮，温度为25℃；

3)向上述体系中加入水溶性自由基引发剂1g 4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)，温度为25℃；

本实施例分散聚合方法制备的功能性聚合物微球动态光散射测试的尺寸分布参见图4.

实施例3

1)将58g丙烯酰胺、20g功能性丙烯酰胺叠氮单体、0.6g功能性丙烯酰胺生物素单体、10g N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶解于异丙醇/水(5:1)混合溶剂中，搅拌5分钟，温度为25℃；

2)向上述体系中加入聚合分散剂15g聚乙烯吡咯烷酮，温度为25℃；

3)向上述体系中加入水溶性自由基引发剂2g 4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)，温度为25℃；

4)将上述体系加热至80℃，并保持3小时，搅拌转速为300r/min，得到目标功能性聚合物微球。

5)功能性聚合物微球通过“点击”化学，固载带荧光素的核酸分子，表征微球上的核酸分子固载量。

本实施例中，制备的核酸分散聚合制备的功能性聚合物微球固载带荧光素的核酸分子图片见图5。

实施例4

第一步：用量筒量取BOC-1.4丁二胺(95.50mmol，18.27mL，1.1eq)加入到经洗净与烘干的250mL单口反应瓶中，搅拌；再用注射器量取叠氮乙酸甲酯 (86.90mmol，8.46mL，1.0eq)一次性加入到250mL单口反应瓶中，搅拌；室温反应30min-1h，至所有液体全部生成白色固体，TLC确定反应进程，反应完全处理；有原料剩余则加入250mL DCM，油浴加热至52℃回流。TLC跟踪，反应完全，体系中加入硅胶，拌样，层析柱柱层分离，先用100％PE洗脱掉可能剩余的叠氮乙酸甲酯及其它小极性杂质，再用100％EA洗脱出产品，并收集。使用旋转蒸发仪在40℃下脱除溶剂EA，油泵抽干，得到白色固体中间体2(24.1g， 88.8mmol，收率93.1％)。

第二步：取第一步中得到白色固体中间体2(24.1g，88.8mmol，1.0eq) 加到1000mL经洗净与烘干的单口瓶中，加入500mL 1，4-二氧六环溶解，搅拌。称取500g固体氯化钠于另一个经洗净与烘干的1000mL单口瓶中，量取100mL 浓硫酸于滴液漏斗滴加到1000mL氯化钠单口瓶中，控制滴加速度60d/min。氯化钠与浓硫酸产生的HCl(g)通过抗酸腐蚀导管通入到500mL 1，4-二氧六环反应体系中，剧烈搅拌，TLC跟踪，反应完全(8-15h)则处理。抽滤体系中析出的白色固体，用200mL 1，4-二氧六环洗涤，油泵抽干备用，得到白色固体中间体3(12.2g，71.2mmol，收率80.1％)。

第三步：取第二步中所得白色固体中间体3(12.2g，71.2mmol，1.0eq) 于1000mL经洗净与烘干的单口瓶中，加入500mL无水甲醇溶解，再加入Et3N (24.7mL，178.0mmol，2.5eq),搅拌，液氮乙醇体系降温至-20℃，恒温。使用10mL注射器量取甲基丙烯酰氯(85.44mmol，8.2mL，1.2eq)溶解在25mL超干THF中，转移至滴液漏斗，缓慢滴加到甲醇体系中，控制滴加速度120d/min，保温-20℃，滴毕自由升温至Rt，反应15-18h。TLC，确定反应完全，使用旋转蒸发仪45℃脱除反应体系中的溶剂，得到略灰白色黏状固体粗品，粗品中加入500mL THF，搅拌30min，抽滤，再用200mL THF洗涤白色固体，收取母液，45℃脱除溶剂，得到无色油状液体(或微黄)。无色油状液体加入适量硅胶，DCM拌样，层析柱分离，先用100％PE洗脱掉小极性杂质，再用100％EA洗脱出产品，并收集。使用旋转蒸发仪在40℃下脱除溶剂EA，得到白色固体粗品；若得无色油状液体，可用体积比PE/EA＝1/1的混合溶剂50mL带1-3次可得白色固体粗品。得到的粗品用体积比PE/EA＝1/1的混合溶剂在60℃下溶解至最大饱和，自由降温重结晶15-20h。重结晶析出针状晶体，抽滤得到白色固体，100％PE洗涤白色固体，油泵抽干，得到白色固体目标产物4纯品(11.9g，49.8mmol，收率 70％，纯度:99％；LC/MS:240.1,241.1；熔点：84℃，1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ5.62(t,J＝1.0Hz,1H),5.42–5.22(m,1H),3.96(s,2H), 3.22(q,J＝2.7Hz,4H),1.88(dd,J＝1.6,1.0Hz,3H),1.52(dq,J ＝6.6,3.2Hz,4H)。

本发明所介绍的改进型分散聚合方法，可实现功能性聚合物微球的直接聚合，所得到的聚合物微球为单分散性、尺寸均匀的微球，并通过调控组分的比例实现微球可反应性基团和微球尺寸的控制。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种核酸固载微球的制备方法，包括如下步骤：

(3)向步骤(2)的体系中加入自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)，所述的自由基引发剂4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)与丙烯酰胺单体质量比为 0.01～0.1；

(5)聚合物微球通过“点击”化学固载核酸分子；所述的“点击”化学指的是铜催化的叠氮-炔基环加成反应，所用催化剂为硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的络合物(Cu-THPTA)，其中催化剂与功能性丙烯酰胺单体摩尔比为1～100。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中混合溶剂中异丙醇和水质量比为1:0～1:0.1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的功能性丙烯酰胺单体是指：1)具有叠氮基团能用来固载核酸的甲基丙烯酰胺叠氮单体，所述的甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5；2)具有生物素基团能用来实现微球固载的丙烯酰胺生物素单体，所述的丙烯酰胺生物素单体与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.05。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺单体质量比为0.04～0.2。

5.根据权利1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述搅拌的转速为100～1000r/min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述聚合反应的时间为2～4小时；所述聚合反应在100～300r/min的搅拌速度下进行。

7.一种核酸固载聚合物微球，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述的方法制备。