CN111171228B - 一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法。含有叠氮功能基团的水凝胶可以通过点击化学反应连接核酸分子，在基因测序领域有重要用途。制备方法主要步骤包括：混合丙烯酰胺单体与丙烯酰胺叠氮单体；加入水溶性引发剂，所述水溶性引发剂为过硫酸钾和TEMED组成的氧化还原引发体系；所述的引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1；然后在15‑30℃条件下反应10‑30h，经异丙醇沉淀收集，即得到含有叠氮功能基团的线性水凝胶。

Description

一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法，可以有效固载核酸分子，属于基因测序领域。
背景技术
水凝胶是一种亲水的三维网络结构的凝胶。水凝胶有很好的亲水性，适用于水相反应体系。水凝胶被大量的应用于生物、化学等领域。水凝胶的合成方法很多，并且合成方法直接影响了水凝胶的性能。水凝胶具有较好的生物相容性、低免疫反应和结构中潜在的生物活性基序列等优点，已经广泛地被研发用于再生医学、药物递送和组织粘附等，还可被设计用于组装细胞外基质，为细胞生长和组织的形成提供三维支撑，已被广泛地应用于3D细胞培养。另外，结合点击化学，水凝胶可以连接多种功能性分子，能够广泛应用于生物材料等方面。特别的，水凝胶可以应用到基因测序领域，作为核酸固载的介质。目前还没有特别合适的固载核酸的专门用于基因测序的水凝胶。本发明公开一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法，合成的N3功能基团的线性水凝胶的制备方法，工艺简便，适于生产，同时水凝胶生物兼容性好，可有效实现水凝胶在修饰后的芯片上固载及核酸分子在水凝胶上固载。
发明内容
本发明所述的目的是这样实现的，本发明提供一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丙烯酰胺单体、功能性丙烯酰胺单体溶于溶剂中，搅拌混合均匀，其中功能性丙烯酰胺单体与丙烯酰胺单体质量比0.1～0.5；
(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性引发剂；所述水溶性引发剂为过硫酸钾和TEMED组成的氧化还原引发体系；所述的引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1；
(3)步骤(2)的体系在15-30℃条件下反应10-30h，经异丙醇沉淀收集，即得到含有叠氮功能基团的线性水凝胶。
根据优选的实施方式，步骤(1)中所述溶剂为水。
根据优选的实施方式，所述步骤(1)中甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5。
根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述丙烯酰胺单体与所述溶剂的质量比为：0.01～0.05。
根据优选的实施方式，步骤(2)中，所述所述的引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1。
根据优选的实施方式，步骤(3)中，所述所述聚合反应的温度为室温；所述聚合反应时间为24h；
根据优选的实施方式，所述步骤(3)中水凝胶分子量特征区间在5000-100000。
根据优选的实施方式，步骤(1)中，所述的功能性丙烯酰胺单体是指，具有叠氮基团能用来固载核酸的甲基丙烯酰胺叠氮单体；所述的甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5。
根据优选的实施方式，可以替代的选择，步骤(2)中，所述的水溶性引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐、过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钾和过硫酸铵和四甲基乙二胺，优选过硫酸钾和四甲基乙二胺，引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1。
根据优选的实施方式，步骤(3)中，所述聚合反应的温度为室温；所述聚合反应时间为24h。
本发明提供一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丙烯酰胺单体、甲基丙烯酰胺叠氮单体溶于水中；所述丙烯酰胺单体与所述溶剂的质量比为：0.01～0.05；甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5；
(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性引发剂过硫酸钾和TEMED，继续鼓Ar5min；
所述的引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1；
(3)步骤(2)的体系在室温条件下反应24h，经异丙醇沉淀收集，即得到含有N3功能基团的线性水凝胶。
本发明提供一种含有N3功能基团的线性水凝胶，其特征在于，根据前面任一项所述的方法制备。
本发明有如下显著优点：(1)操作简易，实现含有N3功能基团的线性水凝胶的直接聚合；(2)可控性好，包括水凝胶可反应性基团的调控、分子量分布的调控。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步阐述本发明。本发明的具体实施方式是对于本发明的进一步说明，不对本发明的范围造成限制。
本发明提供一种含有N3功能基团的线性水凝胶的制备方法，工艺简便，适于生产，同时水凝胶生物兼容性好，可有效实现水凝胶在修饰后的芯片上固载及核酸分子在水凝胶上固载。
本发明所提供的一种含有N3功能基团的线性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丙烯酰胺单体、甲基丙烯酰胺叠氮单体溶于水中，并搅拌溶解混匀，鼓Ar15min；
(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性引发剂过硫酸钾和TEMED，继续鼓Ar5min；
(3)步骤(2)的体系在室温条件下反应24h，经异丙醇沉淀收集，即得到分子量为5000-100000的含有N3功能基团的线性水凝胶。
上述聚合方法合成含有N3功能基团的线性水凝胶的方法中，步骤(1)中所述的单体为丙烯酰胺单体、甲基丙烯酰胺叠氮单体、丙烯酰胺生物素单体；
丙烯酰胺单体与溶剂的质量比为：0.01～0.05，优选0.015～0.045，更优选0.02～0.04，更优选0.025～0.035；甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为：0.1～0.5，优选0.15～0.45，更优选0.2～0.4，更优选0.25～0.35。
上述分散聚合方法合成含有N3功能基团的线性水凝胶的方法中，步骤(2)中所述引发剂为所述的水溶性引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐、过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钾或过硫酸铵和四甲基乙二胺，优选过硫酸钾和四甲基乙二胺；
所述水溶剂引发剂与丙烯酰胺单体的质量比为0.01～0.1；优选0.01～0.08，更优选0.01～0.06，更优选0.02～0.05。
上述分散聚合方法合成含有N3功能基团的线性水凝胶的方法中，步骤(3)中所述的聚合反应的时间为15～24小时；优选20-24小时。
所述聚合反应在室温条件下进行，优选25±2℃，或者优选25±10℃。
叠氮基团能用来固载核酸的甲基丙烯酰胺叠氮单体也称为含有叠氮基团的水凝胶单体。
提供一种含有叠氮基团的水凝胶单体的制备方法，其特征在于包括，
二胺与叠氮脂类化合物反应，获得第一中间产物，所述二胺单端氨基用保护基团修饰保护；
第一中间产物脱去氨基保护基团，获得一端为胺基，一端带有叠氮基团的第二中间产物；
第二中间产物与丙烯酰氯或者取代的丙烯酰氯发生反应，获得一端带有双键，一端带有叠氮基团的水凝胶单体；
其中所述取代的丙烯酰氯指的是甲基或乙基或者卤素连接到碳上的丙烯酰氯；
其中所述的叠氮脂类化合物的叠氮基团在端位。
根据优选的实施方式，所述二胺含有2-8个碳原子；所述二胺指的是伯胺。
根据优选的实施方式，所述二胺是中间带有1-5个PEG链的取代二胺。
根据优选的实施方式，所述二胺是1,4丁二胺。
根据优选的实施方式，所述第一中间产物脱去氨基保护基团指的是，单端叔丁基羰基保护的二胺与气态氯化氢发生反应，脱去保护基团。
根据优选的实施方式，所述二胺指的是包含以下结构的二胺。
一种含有叠氮基团的水凝胶单体的制备方法，其特征在于包括，
三胺与叠氮脂类化合物反应，获得第一中间产物，所述三胺中的氨基，其中一个或者两个用氨基保护基团修饰保护；
第一中间产物脱去氨基保护基团，获得一端或者两端为氨基，并且至少一端带有叠氮基团的第二中间产物；
第二中间产物与丙烯酰氯或者取代的丙烯酰氯发生反应，获得带有双键，并且带有叠氮基团的水凝胶单体；
其中所述取代的丙烯酰氯指的是甲基或乙基或者卤素连接到碳上的丙烯酰氯。
下面路线一所示的水凝胶单体化合物1，反应分为三步，第一步以单端BOC保护的二胺为起始原料，第二不是核心关键改进步骤：即通过与无毒且稳定性优良的市售叠氮乙酸酯类化合物反应，通过一步高效但不常见的氨基和酯基团交换反应，就可以得到含有叠氮基团的关键中间体化合物2；第二步，通过简便的化学反应脱去叔丁基羰基保护基团，得到相应的一端为胺基，一端带有叠氮基团的稳定中间体3；第三步，将胺基与丙烯酰氯反应即可得到目标化合物。重要亮点：此方法仅有三步反应，并且每一步反应都具有转化率极高，反应彻底，反应条件温和，中间体稳定的特点，最终产物以重结晶形式得到，纯度可达99％，总收率不低于50％。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。含有叠氮基团的水凝胶单体的合成路线1如下：
Figure BDA0002375224120000051
本发明中所述的N3指的是氮氮三键，也即是叠氮基团。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中甲基丙烯酰胺叠氮单体根据需求可以自行合成。
实施例1
1)将200mg丙烯酰胺、50mg甲基丙烯酰胺叠氮单体溶解于10ml水中，搅拌5分钟溶解，加入50ml离心管，温度为25℃，鼓Ar15min；
2)将30mg过硫酸钾溶解于1ml水中，向上述体系中加入过硫酸钾溶液100ml，温度为25℃，继续鼓Ar5min；
3)向上述体系中加入TEMED(四甲基乙二胺)10ul，温度为25℃，结束鼓气；
4)将上述体系密封，室温(25℃)反应24小时，得到目标含有N3功能基团的线性水凝胶。
5)将反应后的水凝胶边搅拌边用塑料滴管逐滴将产物反应加入200ml IPA中，滴加完毕继续搅拌5min，等絮状物沉降到和上层溶液分层，缓慢吸出上层白色液体，把剩余沉淀倒入50ml离心管中离心，离心机设置为1968RCF-3min，离心，用玻璃棒均匀按压沉淀尽量除掉IPA，再加入11ml MQ，vortex使沉淀溶解。
实施例2
1)将200mg丙烯酰胺、70mg甲基丙烯酰胺叠氮单体溶解于15ml水中，搅拌5分钟溶解，加入50ml离心管，温度为25℃，鼓Ar15min；
2)将20mg过硫酸钾溶解于1ml水中，向上述体系中加入过硫酸钾溶液100ml，温度为25℃，继续鼓Ar5min；
3)向上述体系中加入TEMED 7ul，温度为25℃，结束鼓气；
4)将上述体系密封，室温(25℃)反应24小时，得到目标含有N3功能基团的线性水凝胶。
5)将反应后的水凝胶边搅拌边用塑料滴管逐滴将产物反应加入200ml IPA中，滴加完毕继续搅拌5min，等絮状物沉降到和上层溶液分层，缓慢吸出上层白色液体，把剩余沉淀倒入50ml离心管中离心，离心机设置为1968RCF-3min，离心，用玻璃棒均匀按压沉淀尽量除掉IPA，再加入11ml MQ，vortex使沉淀溶解。
实施例3
1)将100mg丙烯酰胺、50mg甲基丙烯酰胺叠氮单体溶解于10ml水中，搅拌5分钟溶解，加入50ml离心管，温度为25℃，鼓Ar15min；
2)将30mg过硫酸钾溶解于1ml水中，向上述体系中加入过硫酸钾溶液100ml，温度为25℃，继续鼓Ar5min；
3)向上述体系中加入TEMED10ul，温度为25℃，结束鼓气；
4)将上述体系密封，室温(25℃)反应24小时，得到目标含有N3功能基团的线性水凝胶。
5)将反应后的水凝胶边搅拌边用塑料滴管逐滴将产物反应加入200ml IPA中，滴加完毕继续搅拌5min，等絮状物沉降到和上层溶液分层，缓慢吸出上层白色液体，把剩余沉淀倒入50ml离心管中离心，离心机设置为1968RCF-3min，离心，用玻璃棒均匀按压沉淀尽量除掉IPA，再加入11ml MQ，vortex使沉淀溶解。
实施例4
水凝胶单体的合成：
第一步：用量筒量取BOC-1.4丁二胺(95.50mmol，18.27mL，1.1eq)加入到经洗净与烘干的250mL单口反应瓶中，搅拌；再用注射器量取叠氮乙酸甲酯(86.90mmol，8.46mL，1.0eq)一次性加入到250mL单口反应瓶中，搅拌；室温反应30min-1h，至所有液体全部生成白色固体，TLC确定反应进程，反应完全处理；有原料剩余则加入250mL DCM，油浴加热至52℃回流。TLC跟踪，反应完全，体系中加入硅胶，拌样，层析柱柱层分离，先用100％PE洗脱掉可能剩余的叠氮乙酸甲酯及其它小极性杂质，再用100％EA洗脱出产品，并收集。使用旋转蒸发仪在40℃下脱除溶剂EA，油泵抽干，得到白色固体中间体2(24.1g，88.8mmol，收率93.1％)。
第二步：取第一步中得到白色固体中间体2(24.1g，88.8mmol，1.0eq)加到1000mL经洗净与烘干的单口瓶中，加入500mL 1，4-二氧六环溶解，搅拌。称取500g固体氯化钠于另一个经洗净与烘干的1000mL单口瓶中，量取100mL浓硫酸于滴液漏斗滴加到1000mL氯化钠单口瓶中，控制滴加速度60d/min。氯化钠与浓硫酸产生的HCl(g)通过抗酸腐蚀导管通入到500mL 1，4-二氧六环反应体系中，剧烈搅拌，TLC跟踪，反应完全(8-15h)则处理。抽滤体系中析出的白色固体，用200mL 1，4-二氧六环洗涤，油泵抽干备用，得到白色固体中间体3(12.2g，71.2mmol，收率80.1％)。
第三步：取第二步中所得白色固体中间体3(12.2g，71.2mmol，1.0eq)于1000mL经洗净与烘干的单口瓶中，加入500mL无水甲醇溶解，再加入Et3N(24.7mL，178.0mmol，2.5eq),搅拌，液氮乙醇体系降温至-20℃，恒温。使用10mL注射器量取甲基丙烯酰氯(85.44mmol，8.2mL，1.2eq)溶解在25mL超干THF中，转移至滴液漏斗，缓慢滴加到甲醇体系中，控制滴加速度120d/min，保温-20℃，滴毕自由升温至Rt，反应15-18h。TLC，确定反应完全，使用旋转蒸发仪45℃脱除反应体系中的溶剂，得到略灰白色黏状固体粗品，粗品中加入500mL THF，搅拌30min，抽滤，再用200mL THF洗涤白色固体，收取母液，45℃脱除溶剂，得到无色油状液体(或微黄)。无色油状液体加入适量硅胶，DCM拌样，层析柱分离，先用100％PE洗脱掉小极性杂质，再用100％EA洗脱出产品，并收集。使用旋转蒸发仪在40℃下脱除溶剂EA，得到白色固体粗品；若得无色油状液体，可用体积比PE/EA＝1/1的混合溶剂50mL带1-3次可得白色固体粗品。得到的粗品用体积比PE/EA＝1/1的混合溶剂在60℃下溶解至最大饱和，自由降温重结晶15-20h。重结晶析出针状晶体，抽滤得到白色固体，100％PE洗涤白色固体，油泵抽干，得到白色固体目标产物4纯品(11.9g，49.8mmol，收率70％，纯度:99％；LC/MS:240.1,241.1；熔点：84℃，1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ5.62(t,J＝1.0Hz,1H),5.42–5.22(m,1H),3.96(s,2H),3.22(q,J＝2.7Hz,4H),1.88(dd,J＝1.6,1.0Hz,3H),1.52(dq,J＝6.6,3.2Hz,4H)。
二胺或者三胺的保护属于常见的技术。保护基团的脱除也属于常见的技术。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种含有叠氮功能基团的线性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丙烯酰胺单体、功能性丙烯酰胺单体溶于溶剂中，搅拌混合均匀，其中功能性丙烯酰胺单体与丙烯酰胺单体质量比0.1～0.5；
(2)向步骤(1)的体系中加入水溶性引发剂；所述水溶性引发剂为过硫酸钾和TEMED组成的氧化还原引发体系；所述的引发剂与丙烯酰胺单体质量比为0.01～0.1；
(3)步骤(2)的体系在15-30℃条件下反应10-30h，经异丙醇沉淀收集，即得到含有叠氮功能基团的线性水凝胶；
其中，所述步骤(1)中溶剂为水；
所述步骤(3)中水凝胶分子量特征区间在5000-100000；
所述步骤(1)中，丙烯酰胺单体与与所述溶剂的质量比为：0.01～0.05；
其中，所述功能性丙烯酰胺单体为甲基丙烯酰胺叠氮单体，其合成步骤为：
第一步以单端BOC保护的二胺为起始原料，通过与叠氮乙酸酯类化合物反应，得到含有叠氮基团的中间体化合物；
第二步，将中间体化合物脱去叔丁基羰基保护基团，得到相应的一端为胺基，一端带有叠氮基团的稳定中间体；
第三步，将上一步得到的稳定中间体与丙烯酰氯反应得到甲基丙烯酰胺叠氮单体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的功能性丙烯酰胺单体是指，具有叠氮基团能用来固载核酸的甲基丙烯酰胺叠氮单体；所述的甲基丙烯酰胺叠氮单体与丙烯酰胺单体质量比为0.1～0.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述聚合反应的温度为室温；所述聚合反应时间为24h。
4.一种含有N3功能基团的线性水凝胶，其特征在于，根据权利要求1-3任一项所述的方法制备。
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