ES2859823T3

ES2859823T3 - Revestimientos poliméricos

Info

Publication number: ES2859823T3
Application number: ES13730419T
Authority: ES
Inventors: Wayne N George; Daniel Bratton; Andrew A Brown; Hongji Ren; Ryan C Smith
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2021-10-04
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: US9012022B2; US20140079923A1; EP2859055A1; US20210254151A1; CN108165119A; IL236023B; EP3792320A1; US12060609B2; BR112014030465A8; AU2013271677A1; US10954561B2; EP2859055B1; JP6449395B2; US20150259735A1; US20230357846A1; AU2013271677B2; IN2014DN11101A; JP2016027959A; PT2859055T; JP6204955B2

Abstract

Un sustrato que tiene una superficie que comprende un revestimiento polimérico unido covalentemente a la misma, en donde el revestimiento polimérico comprende una unidad recurrente de Fórmula (Ia) y una unidad recurrente de Fórmula (II): en las que: R1 es hidrógeno o alquilo C1-C6; RA es azido; cada uno de R4, R4', R5 y R5' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, R6, OR6, - C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 y -NR7R8; R6 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C10, hidroxialquilo C1-C6, arilo C6- C10, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heterociclilo de 3 a 10 miembros; cada uno de R7 y R8 es independientemente H o alquilo C1-C6, o R7 y R8 están unidos junto con el átomo o los átomos a los que están fijados para formar un heterociclo de 3 a 10 miembros; y o es un número entero entre 1-50.

Description

DESCRIPCIÓN

Revestimientos poliméricos

Campo

En general, la presente invención se refiere a los campos de la química, la biología y la ciencia de los materiales. Más específicamente, la presente invención se refiere a revestimientos poliméricos unidos covalentemente a una superficie de un sustrato que se utiliza para la detección y/o el análisis de moléculas, tales como ácidos nucleicos y proteínas.

Antecedentes

Se usan sustratos revestidos con polímero en muchas aplicaciones tecnológicas. Por ejemplo, los dispositivos médicos implantables pueden estar revestidos con polímero biológicamente inerte. En otro ejemplo, se usan sustratos revestidos con polímero para la preparación y/o el análisis de moléculas biológicas. Los análisis moleculares, tales como determinados métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, se basan en la unión de hebras de ácidos nucleicos a una superficie revestida con polímero de un sustrato. Se pueden determinar a continuación las secuencias de las hebras de ácidos nucleicos unidas mediante numerosos métodos diferentes que son muy conocidos en la técnica.

En determinados procesos de secuenciación por síntesis, se revisten una o más superficies de una celda de flujo con un polímero al que se unen ácidos nucleicos. El procedimiento actual utilizado para revestir las celdas de flujo implica transferir una mezcla de polimerización a canales de la celda de flujo e incubar durante un período de tiempo fijo. Este procedimiento es simple y da lugar a revestimientos fiables que son capaces de someterse de manera sistemática a todas las etapas de procesamiento químico aguas abajo, incluida la amplificación de tipo puente y la secuenciación.

Hay, sin embargo, varias limitaciones para muchos de los revestimientos poliméricos de superficies que se utilizan en la actualidad. Por ejemplo, (i) algunos de los enfoques actuales limitan los métodos que pueden utilizarse para revestir superficies, porque se requiere una mezcla de polímeros sensibles al aire; (ii) algunos de los revestimientos formados deben almacenarse en un estado "húmedo", por ejemplo, en solución acuosa; y (iii) las condiciones de injerto a menudo necesitan optimizarse para evitar gradientes de intensidad.

Además, también existe la necesidad de crear celdas de flujo con patrones con elementos definidos espaciados periódicamente. Un método de creación de celdas de flujo con patrones es modificar químicamente una perla y luego aplicar esa perla a una superficie previamente dispuesta, conteniendo la superficie pocillos abiertos que pueden alojar las perlas. Las perlas se pueden revestir con un polímero que pueda someterse a la secuenciación basada en el crecimiento de grupos antes de cargarlas en los pocillos. Los revestimientos poliméricos que son útiles en superficies de matrices planas pueden no ser convenientes para revestir perlas debido a la agregación provocada por el revestimiento y a los requisitos de almacenamiento de las perlas en tampones acuosos después del revestimiento. Esto da lugar a algunas limitaciones en las aplicaciones comerciales. Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos revestimientos poliméricos que no adolezcan de una o más de las desventajas de los revestimientos poliméricos actuales cuando se utilizan para revestir perlas.

Sumario

Algunas realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento se refieren a sustratos que tienen una o más superficies que comprenden un revestimiento polimérico mejorado. En algunas realizaciones, el sustrato es una celda de flujo y el revestimiento polimérico se aplica a una o más superficies de uno o más carriles de la celda de flujo.

Algunas realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento se refieren a un sustrato que comprende una superficie, en donde un revestimiento polimérico está unido covalentemente a la superficie. Otras realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento se refieren a un sustrato que comprende una superficie funcionalizada, en donde un revestimiento polimérico está unido covalentemente a una serie de grupos funcionales sobre la superficie y en donde los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en alqueno, alquino, nitreno, aldehído, hidrazina, éster activado, éter de glicidilo, amina, maleimida y éster benzoílico con un sustituyente fosfina en la posición orto para la ligadura de Staudinger. La invención proporciona un sustrato que tiene un revestimiento polimérico que comprende unidades de Fórmulas (Ia) y (II) como se definen en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III) o (III'). En una realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (IIIa). En una realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (IIIb). En otra realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (IV).

Algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento se refieren a la preparación de un revestimiento polimérico inmovilizado en una superficie de un sustrato. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un polímero con una superficie de un sustrato, en donde la superficie comprende una pluralidad de grupos funcionales, formándose así una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico está unido covalentemente a los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, el polímero se forma in situ sobre la superficie del sustrato polimerizando un material polimerizable sobre la superficie del sustrato. En alguna otra realización, el polímero se forma previamente antes de ponerlo en contacto con la superficie del sustrato. En determinadas realizaciones, los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en alqueno, alquino, nitreno, aldehído, hidrazina, éster activado, éter de glicidilo, amina, maleimida y éster benzoílico con un sustituyente fosfina en la posición orto para la ligadura de Staudinger. En determinadas realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden grupos fenil-azida opcionalmente sustituidos. En otras realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden grupos alquino. En incluso otras realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden grupos alqueno. El revestimiento polimérico comprende unidades recurrentes de Fórmulas (Ia) y (II) como se definen en las reivindicaciones del presente documento. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III) o (III'). En una realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (IIIa). En una realización, el polímero de Fórmula (III') también está representado por la Fórmula (IIIb). En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se disuelve en una solución acuosa antes de unirse covalentemente a los grupos funcionales de la superficie.

Otras realizaciones de los métodos descritos en el presente documento se refieren a la preparación de una matriz de polinucleótidos. En tales realizaciones, los métodos pueden comprender las etapas de hacer reaccionar una pluralidad de oligonucleótidos con sitios reactivos presentes en el revestimiento polimérico de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento o revestimientos poliméricos preparados mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento; poner en contacto la pluralidad de oligonucleótidos unidos al revestimiento polimérico con moldes que se van a amplificar, comprendiendo cada molde una secuencia capaz de hibridarse con los oligonucleótidos; y amplificar los moldes usando los oligonucleótidos, generando así una matriz agrupada de polinucleótidos. En algunas realizaciones, se pueden usar dos cebadores, pudiéndose unir uno o ambos al revestimiento polimérico. Por ejemplo, los métodos pueden comprender las etapas de hacer reaccionar una pluralidad de primeros oligonucleótidos con sitios reactivos presentes en el revestimiento polimérico de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento o revestimientos poliméricos preparados mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento; poner en contacto la pluralidad de primeros oligonucleótidos unidos al revestimiento polimérico con moldes que se van a amplificar, comprendiendo cada molde en el extremo 3' una secuencia capaz de hibridarse con los primeros oligonucleótidos y, en el extremo 5', una secuencia cuyo complemento es capaz de hibridarse con un segundos oligonucleótidos; y amplificar los moldes usando los primeros oligonucleótidos y los segundos oligonucleótidos, en donde el segundo oligonucleótido se une opcionalmente al revestimiento polimérico, generando así una matriz agrupada de polinucleótidos. En algunas realizaciones de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos alquino para hacerse reaccionar con grupos azido del revestimiento polimérico. En otras realizaciones de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con cloruro cianúrico presente en el revestimiento polimérico. En incluso otras realizaciones de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehído para hacerse reaccionar con grupos amina activados, tales como grupos hidrazinilo o hidrazonilo, del revestimiento polimérico. En otras realizaciones más de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos tiocianato o ácido carboxílico del revestimiento polimérico. En realizaciones adicionales de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos glicidilo del revestimiento polimérico. En incluso más realizaciones adicionales de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos amina del revestimiento polimérico a través de un enlazador de dialdehído. En otras realizaciones más de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos éster o epoxi activados presentes en el revestimiento polimérico. En otras realizaciones más de tales métodos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehído para hacerse reaccionar con los grupos oxo-amina presentes en el revestimiento polimérico. En algunas realizaciones de tales métodos, el revestimiento polimérico se lava con agua o tampón acuoso antes de reaccionar con la pluralidad de los primeros oligonucleótidos y la pluralidad de segundos oligonucleótidos. En una realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III). En otra realización, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III').

Algunas realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento se refieren a una celda de flujo que comprende una cualquiera de las composiciones de sustrato descritas en el presente documento. Algunas de tales realizaciones comprenden además polinucleótidos unidos a la superficie del sustrato mediante el revestimiento polimérico. En algunas realizaciones, los polinucleótidos están presentes en grupos de polinucleótidos. En algunas de tales realizaciones, los polinucleótidos dentro de un solo grupo de polinucleótidos tienen la misma secuencia de nucleótidos. Los polinucleótidos individuales de un grupo se pueden unir al revestimiento polimérico en un extremo o en ambos extremos. La una o varias uniones pueden ser a través del extremo 5' y/o 3' de una hebra del polinucleótido. Los polinucleótidos de diferentes grupos de polinucleótidos generalmente tienen diferentes secuencias de nucleótidos, pero esto no es necesario en todas las realizaciones.

Algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento se refieren a la determinación de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. Algunas de tales realizaciones comprenden las etapas de: (a) poner en contacto una polinucleótido polimerasa con grupos de polinucleótidos unidos a una superficie de una cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento mediante el revestimiento polimérico; (b) proporcionar nucleótidos a la superficie del sustrato de manera que se genere una señal detectable cuando la polinucleótido polimerasa utiliza uno o más nucleótidos; (c) detectar señales en uno o más grupos de polinucleótidos; y (d) repetir las etapas (b) y (c), determinando así una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido presente en uno o más grupos de polinucleótidos. En algunas de tales realizaciones, la superficie del sustrato está presente dentro de una celda de flujo. En algunas de tales realizaciones, solamente está presente un solo tipo de nucleótido en la celda de flujo durante una sola etapa de flujo. En tales realizaciones, el nucleótido se puede seleccionar entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En otras realizaciones de los métodos de determinación de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, está presente una pluralidad de tipos diferentes de nucleótidos en la celda de flujo durante una sola etapa de flujo. En tales realizaciones, los nucleótidos se pueden seleccionar entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En realizaciones adicionales de los métodos de determinación de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, la señal detectable comprende una señal óptica. En otras realizaciones, la señal no detectable comprende una señal no óptica. En tales realizaciones, la señal no óptica puede ser un cambio en el pH o un cambio en la concentración de pirofosfato.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un método para preparar una matriz de perlas. En algunas realizaciones, el método comprende formar una pluralidad de grupos funcionales sobre la superficie de una o más perlas; poner en contacto un revestimiento polimérico descrito en el presente documento con las perlas para formar una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie de las perlas, en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas. Las perlas revestidas con polímero se pueden cargar sobre la superficie de un sustrato antes o después de ser revestidas. En algunas realizaciones, la superficie puede incluir pocillos abiertos, y cada pocillo puede tener dimensiones que se adapten a una o más perlas (es decir, en algunas realizaciones, puede que los pocillos no alojen más de una sola perla). En algunas realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden grupos acrilamida. En algunas realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden grupos fenil-azida opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden grupos alquino. El revestimiento polimérico comprende unidades recurrentes de Fórmulas (Ia) y (II) como se definen en las reivindicaciones del presente documento. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III) o (III'). En una realización, el polímero de Fórmula (III) también está representado por la Fórmula (IIIa). En una realización, el polímero de Fórmula (III') también está representado por la Fórmula (IIIb). En determinadas realizaciones, las perlas están completamente revestidas con el revestimiento polimérico descrito en el presente documento. En otras realizaciones, las perlas están parcialmente revestidas con el revestimiento polimérico descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a la superficie de las perlas a una temperatura elevada. En algunas otras realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a la superficie de las perlas mediante fotoactivación. En algunas otras realizaciones, las perlas se disponen previamente en una matriz en pocillos y el revestimiento polimérico se une covalentemente a las perlas colocadas en la matriz.

La perla se puede fijar a la superficie de un sustrato (p. ej., una celda de flujo o un pocillo) mediante fuerzas químicas, de adsorción física, o ambas. En algunas realizaciones, las perlas revestidas con polímero se fijan a la superficie del sustrato cargándolas en pocillos abiertos sobre la superficie del sustrato. Como alternativa o adicionalmente, las perlas revestidas con polímero se fijan a la superficie del sustrato mediante unión covalente a los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además lavar las perlas revestidas con polímero para retirar el exceso de revestimiento polimérico no unido antes de cargar las perlas en la superficie del sustrato. En determinadas realizaciones, el revestimiento polimérico se disuelve en una solución antes de entrar en contacto con las perlas previamente tratadas. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se disuelve en una solución acuosa. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además etapas adicionales para formar polinucleótidos dispuestos en una matriz usando métodos similares a los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la superficie del sustrato tiene un patrón de pocillos, lechos cortos u otros elementos.

Algunas realizaciones preferidas descritas en el presente documento se refieren a un sustrato que tiene una superficie que comprende un revestimiento polimérico unido covalentemente al mismo, en donde el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III) o (III'). En una realización, el polímero de Fórmula (III) también está representado por la Fórmula (IIIa). En una realización, el polímero de Fórmula (III') también está representado por la Fórmula (IIIb). En una realización, el sustrato es una perla.

Algunas realizaciones preferidas descritas en el presente documento se refieren a un método para preparar una superficie de un sustrato comprende: formar una pluralidad de grupos funcionales sobre la superficie del sustrato, poner en contacto un polímero de Fórmula (III) o (III) con la superficie del sustrato para formar una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie del sustrato, en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato. En una realización, el polímero de Fórmula (III) también está representado por la Fórmula (IIIa). En una realización, el polímero de Fórmula (III') también está representado por la Fórmula (IIIb). En algunas realizaciones, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato se seleccionan entre alqueno, alquino o fenil-azida opcionalmente sustituida. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos alqueno a una temperatura elevada. En una realización, los grupos alqueno son grupos acrilamida. En una realización, el sustrato es una perla.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra el espectro de RMN de 1H de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM).

La Figura 1B muestra distribuciones de peso molecular calculadas para la PAZAM.

La Figura 1C muestra el espectro de RMN de 1H de una PAZAM ligeramente reticulada.

Las Figuras 2A y 2B muestran un barrido con escáner Typhoon de una celda de flujo de vidrio típica revestida con PAZAM (Figura 2B) y la mediana de la intensidad del escáner Typhoon (Figura 2A) a lo largo de los 8 carriles de la celda de flujo.

Las Figuras 3A y 3B muestran un barrido con escáner Typhoon de una celda de flujo de vidrio HiSeq revestida usando PAZAM. La Figura 3A muestra la imagen de fluorescencia del escáner Typhoon de la superficie injertada hibridada con una secuencia oligonucleotídica que contiene colorante complementaria. La Figura 3B muestra un gráfico de la mediana de la intensidad del escáner Typhoon de la PAZAM in situ.

Las Figuras 4A y 4B muestran un barrido con el escáner Typhoon de un sustrato de vidrio que ha sido revestido por centrifugación usando PAZAM. La Figura 4A muestra la imagen de fluorescencia del escáner Typhoon de la superficie injertada hibridada con una secuencia oligonucleotídica que contiene colorante complementaria. La Figura 4B muestra un gráfico de la mediana de la intensidad del escáner Typhoon de la PAZAM revestida por centrifugación.

Las Figuras 5A-C muestran grupos sobre superficies de PAZAM revestidas por flujo. La Figura 5A es una versión ampliada de la región de los canales iluminada por UV. La Figura 5B y la Figura. 5C muestra el número de grupos y la intensidad de filtrado de los grupos de los canales.

Las Figuras 6A-C muestran grupos sobre una superficie de PAZAM revestida por centrifugación. La Figura 6A muestra un gráfico de la mediana de la intensidad del escáner Typhoon de PAZAM revestida por centrifugación sobre la celda de flujo Hiseq. La Figura 6B muestra la imagen de fluorescencia del escáner Typhoon de la superficie injertada hibridada con una secuencia oligonucleotídica que contiene colorante complementaria. La Figura 6C muestra imágenes ampliadas de grupos en los carriles 3 y 5.

Las Figuras 7A y 7B muestran una imagen de celda de flujo típica (Figura 7B) y la mediana de la intensidad (Figura 7A) a lo largo de los 8 carriles de la celda de flujo.

Las Figuras 8A-I muestran grupos y secuenciación de los polinucleótidos sobre una mezcla de PAZAM revestida por flujo y los datos obtenidos.

La Figura 9 muestra un sustrato revestido por centrifugación funcionalizado con oligos de alquino hibridados con oligonucleótidos fluorescentes complementarios.

Las Figuras 10A y 10B muestran los resultados del cribado de agentes reticulantes fotoactivos alternativos. La Figura 10A muestra un gráfico de la mediana de la intensidad del escáner Typhoon frente al Photo XL. La Figura 10B muestra un gráfico del tiempo UV frente al Photo XL de diferentes agentes reticulantes.

Las Figuras 11A-11B muestran una superficie con patrón, fotoactiva, y un bloqueo polimérico.

La Figura 12 ilustra el porcentaje de superficie que queda sobre una capa de PAZAM reticulada térmicamente tras seis días almacenada a temperatura ambiente con menos del 10 % de humedad.

La Figura 13A ilustra el grupo desarrollado con molde 5 PhiX en una superficie de PAZAM reticulada térmicamente. La Figura 13B ilustra las métricas de secuenciación tras un ciclo de 2 x 26 ejecutado sobre una celda de flujo reticulada térmicamente.

La Figura 14 ilustra el grupo desarrollado en una matriz con patrón creada mediante la reticulación térmica de PAZAM en parches de silano con patrón.

La Figura 15 ilustra matrices de PAZAM con patrón preparadas mediante perlas revestidas con PAZAM.

La Figura 16 ilustra un enfoque de división y combinación utilizando un polímero fotoactivo.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a sustratos que comprenden una superficie revestida con un polímero que está unido covalentemente a la superficie. Una realización preferida de tales sustratos incluye revestimientos de poli (N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (también conocida como PAZAM o DASFA). Estos revestimientos poliméricos se unen covalentemente a una superficie funcionalizada de un sustrato, tal como una superficie de una celda de flujo o una superficie de una matriz molecular. La presente divulgación también se refiere a métodos de preparación de tales superficies revestidas con polímero y a métodos de uso de sustratos que comprenden tales superficies revestidas con polímero. En una realización preferida, se utilizan sustratos que tienen superficies revestidas de PAZAM para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido.

Este nuevo revestimiento y enfoque polimérico genera un material estable al aire que supera muchas de las limitaciones de los revestimientos poliméricos conocidos en la actualidad.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia. El uso del término "que incluye", así como de otras formas, tales como "incluyen", "incluye", e "incluido/a", no es limitante. El uso de la expresión "que tiene", así como de otras formas, tales como "tienen", "tiene", y "tenía/n", no es limitante. Como se usan en la presente memoria descriptiva, ya sea en una expresión de transición o en el cuerpo de la reivindicación, el término "comprende/n" y la expresión "que comprende" deben interpretarse con un significado abierto. Es decir, el término y la expresión anteriores deben interpretarse como sinónimos de las expresiones "que tiene al menos" o "que incluye al menos". Por ejemplo, cuando se usan en el contexto de un proceso, el término "comprendiendo" o la expresión "que comprende" significan que el proceso incluye al menos las etapas citadas, pero que puede incluir etapas adicionales. Cuando se usan en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, el término "comprendiendo" o la expresión "que comprende" significan que el compuesto, la composición o el dispositivo incluye al menos los elementos o los componentes citados, pero que también puede incluir elementos o componentes adicionales.

Como se usan en el presente documento, las abreviaturas orgánicas comunes se definen de la siguiente manera:

Ac Acetilo

Ac²O Anhídrido acético

APTS aminopropil-silano

APTES (3-aminopropil)trietoxisilano

APTMS (3-aminopropil)trimetoxisilano

ac. Acuoso/a

Azapa N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida

APTMS 3-aminopropil-trimetoxisilano

BHT hidroxil-tolueno butilado

Bn Bencilo

Brapa o BRAPA N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida

Bz Benzoílo

Boc o BOC terc-Butoxicarbonilo

Bu n-Butilo

cat. Catalítico

Cbz Carbobenciloxi

CyCl Cloruro cianúrico

°C Temperatura en grados centígrados

dATP Trifosfato de desoxiadenosina

dCTP Trifosfato de desoxicitidina

dGTP Trifosfato de desoxiguanosina

dTTP Trifosfato de desoxitimidina

DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

DCA ácido Dicloroacético

DCE 1,2-Dicloroetano

DCM Cloruro de metileno

DIEA Diisopropiletilamina

DMA Dimetilacetamida

DME Dimetoxietano

DMF N,N'-Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPA Difenilfosforilazida

Et Etilo

EtOAc Acetato de etilo

g Gramo/s

GPC (Gel permeation chromatography) cromatografía de permeación en gel

h hora/s

iPr Isopropilo

KPi Tampón de fosfato de potasio 10 mM a pH 7,0

KPS Persulfato de potasio

IPA Alcohol isopropílico

IPHA.HCl Clorhidrato de A/-Isopropilhidroxilamina

LCMS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) cromatografía líquida con espectrometría de masas LDA diisopropilamida de litio

min minuto/s

mCPBA Ácido meta-cloroperoxibenzoico

MeOH Metanol

MeCN Acetonitrilo

ml mililitro/s

MTBE terc-Butiléter de metilo

NaN³Azida de sodio

NHS N-hidroxisuccinimida

PAZAM poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) de cualquier proporción de acrilamida con respecto a Azapa

PG (Protecting Group) Grupo protector

Ph Fenilo

ppt. Precipitado

TA Temperatura Ambiente

SFA (Silane Free Acrylamide) Acrilamida sin silano como se define en la publicación de patente de EE.UU. n.° 2011/0059865

Sulfo-HSAB o SHSAB N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato

TEA Trietilamina

TEMPO (2,2,6,6-Tetrametilpiperidin-1-il)oxilo

TCDI 1,1'-Tiocarbonil-diimidazol

terc, t terciario

TFA Ácido trifluoroacético

THF Tetrahidrofurano

TEMED Tetrametiletilendiamina

|jl Microlitro/s

Como se usa en el presente documento, el término "matriz" se refiere a una población de moléculas sonda diferentes que están unidas a uno o más sustratos, de tal manera que las moléculas sonda diferentes pueden diferenciarse entre sí de acuerdo con la localización relativa. Una matriz puede incluir diferentes moléculas sonda que se ubican cada una en una ubicación direccionable diferente sobre un sustrato. Como alternativa o adicionalmente, una matriz puede incluir sustratos separados soportando cada uno una molécula sonda diferente, en donde las moléculas sonda diferentes pueden identificarse de acuerdo con las ubicaciones de los sustratos sobre una superficie a la cual los sustratos están unidos o de acuerdo con las ubicaciones de los sustratos en un líquido. Los ejemplos de matrices en las que se encuentran sustratos separados sobre una superficie incluyen, sin limitación, las que incluyen perlas en pocillos como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.355.431 B1, documento US 2002/0102578 y publicación PCT n.°WO 00/63437. Los formatos ilustrativos que se pueden utilizar en la invención para distinguir perlas en una matriz líquida, por ejemplo, utilizando un dispositivo de microfluidos, tal como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS, Fluorescent Activated Cell Sorter), se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.524.793. Otros ejemplos adicionales de matrices que se pueden utilizar en la invención incluyen, sin limitación, los descritos en las patentes de EE.UU. n.° 5.429.807; 5.436.327; 5.561.071; 5.583.211; 5.658.734; 5.837.858; 5.874.219; 5.919.523; 6.136.269; 6.287.768; 6.287.776; 6.288.220; 6.297.006; 6.291.193; 6.346.413; 6.416.949; 6.482.591; 6.514.751 y 6.610.482; y los documentos WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287; y EP 799897.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enlazado covalentemente" o "unido covalentemente" se refiere a la formación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, un revestimiento polimérico unido covalentemente se refiere a un revestimiento polimérico que forma enlaces químicos con una superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con el enlace a la superficie por otros medios, por ejemplo, adhesión o interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que están unidos covalentemente a una superficie pueden también unirse por medios adicionales al enlace covalente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "bloqueo polimérico" se refiere al proceso en donde los grupos funcionales sobre la superficie de un sustrato reaccionan con el revestimiento polimérico de modo que el revestimiento polimérico se une covalentemente a la superficie.

Como se usa en el presente documento, cualquier grupo o grupos "R" tales como, sin limitación, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 representan sustituyentes que se pueden unir al átomo indicado. Un grupo R puede estar sustituido o no sustituido. Si dos grupos "R" se describen como que están "tomados juntos", los grupos R y los átomos a los que estos están fijados pueden formar un cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterociclo. Por ejemplo, sin limitación, si R2 y R3, o R2, R3 o R4, y el átomo al que está fijado, se indican "tomados juntos" o "unidos", significa que están unidos covalentemente entre sí para formar un anillo, un ejemplo de lo cual se muestra a continuación:

Cuando un grupo se describe como "opcionalmente sustituido", dicho grupo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más de los sustituyentes indicados. Análogamente, cuando un grupo se describe como "no sustituido o sustituido", si está sustituido, el sustituyente puede seleccionarse de entre uno o más de los sustituyentes indicados. Si no se indican sustituyentes, significa que el grupo "opcionalmente sustituido" o "sustituido" indicado puede estar sustituido individual e independientemente con uno o más grupos seleccionados individual e independientemente de un grupo de funcionalidades que incluyen, pero sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo, heteroaralquilo, (heteroaliciclil)alquilo, hidroxi, hidroxilo protegido, alcoxi, ariloxi, acilo, mercapto, alquiltio, ariltio, ciano, halógeno, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, C-carboxi protegido, O-carboxi, isocianato, tiocianato, isotiocianato, nitro, sililo, sulfenilo, sulfinilo, sulfonilo, haloalquilo, haloalcoxi, trihalometanosulfonilo, trihalometanosulfonamido, amino, grupo amino monosustituido, grupo amino disustituido y derivados protegidos de los mismos.

Como se usa en el presente documento, "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que comprende un grupo hidrocarburo completamente saturado (sin enlaces dobles o triples). En algunas realizaciones, el grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numérico tal como "de 1 a 20" se refiere a cada número entero del intervalo dado incluyendo los valores de los extremos; p. ej., "de 1 a 20 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta, e incluido, 20 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquilo" cuando no se designa ningún intervalo numérico). El grupo alquilo también puede ser un alquilo de tamaño medio que tenga de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 átomos de carbono. El grupo alquilo también puede ser un alquilo inferior que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo de los compuestos descritos puede designarse como "alquilo C¹-C⁴" o designaciones similares. Solamente a modo de ejemplo, "alquilo C¹-C⁴" indica que hay de uno a cuatro átomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona entre metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Los grupos alquilo típicos incluyen, pero sin limitación alguna, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo y hexilos. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo que contiene, en la cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, uno o más dobles enlaces. Un grupo alquenilo puede estar no sustituido o sustituido.

Como se usa en el presente documento, "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo que contiene, en la cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, uno o más triples enlaces. Un grupo alquinilo puede estar no sustituido o sustituido.

Como se usa en el presente documento, "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico o multicíclico completamente saturado (sin dobles o triples enlaces). Cuando están compuesto por dos o más anillos, los anillos pueden estar unidos uno a otro de forma condensada. Los grupos cicloalquilo pueden contener de 3 a 10 átomos en el/los anillo/s. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquilo pueden contener de 3 a 8 átomos en el/los anillo/s. Un grupo cicloalquilo puede estar no sustituido o sustituido. Los grupos cicloalquilo típicos incluyen, pero sin limitación alguna, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

Como se usa en el presente documento, "cicloalquenilo" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico o multicíclico que contiene uno o más dobles enlaces en al menos un anillo; aunque, si hay más de uno, los dobles enlaces no pueden formar un sistema de electrones pi completamente deslocalizados por todos los anillos (de lo contrario, el grupo sería "arilo", como se define en el presente documento). Cuando están compuesto por dos o más anillos, los anillos pueden estar conectados uno a otro de forma condensada. Un grupo cicloalquenilo puede estar no sustituido o sustituido.

Como se usa en el presente documento, "cicloalquinilo" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico o multicíclico que contiene uno o más triples enlaces en al menos un anillo. Si hay más de un triple enlace, los triples enlaces no pueden formar un sistema de electrones pi completamente deslocalizados por todos los anillos. Cuando están compuesto por dos o más anillos, los anillos pueden estar unidos uno a otro de forma condensada. Un grupo cicloalquinilo puede estar no sustituido o sustituido.

Como se usa en el presente documento, "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático carbocíclico (todo átomos de carbono) monocíclico o multicíclico (que incluye, p. ej., sistemas de anillo condensado, puenteado o espiro donde dos anillos carbocíclicos comparten un enlace químico, p. ej., uno o más anillos de arilo con uno o más anillos de arilo o no arilo) que tiene un sistema de electrones pi completamente deslocalizados en al menos uno de los anillos. El número de átomos de carbono en un grupo arilo puede variar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo arilo puede ser un grupo arilo C^a-C ^-M, un grupo arilo C⁶-C¹⁰o un grupo arilo C⁶. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero sin limitación, benceno, naftaleno y azuleno. Un grupo arilo puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "heterociclilo" se refiere a sistemas de anillo que incluye al menos un heteroátomo (p. ej., O, N, S). Tales sistemas pueden estar insaturados, pueden incluir algo de insaturación o pueden contener alguna parte aromática, o ser completamente aromáticos. Un grupo heterociclilo puede estar no sustituido o sustituido.

Como se usa en el presente documento, "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico o multicíclico (un sistema de anillo que tiene al menos un anillo con un sistema de electrones pi completamente deslocalizados) que contiene uno o más heteroátomos, es decir, un elemento distinto de carbono, incluyendo, pero sin limitación, nitrógeno, oxígeno y azufre, y al menos un anillo aromático. El número de átomos en el/los anillo/s de un grupo heteroarilo puede variar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un grupo heteroarilo puede contener de 4 a 14 átomos en el/los anillo/s, de 5 a 10 átomos en el/los anillo/s o 5 a 6 átomos en el/los anillo/s. Asimismo, el término "heteroarilo" incluye sistemas de anillos condensados donde dos anillos, tales como al menos un anillo de arilo y al menos un anillo de heteroarilo, o al menos dos anillos de heteroarilo, comparten al menos un enlace químico. Los ejemplos de anillos de heteroarilo incluyen, pero sin limitación, furano, furazano, tiofeno, benzotiofeno, ftalazina, pirrol, oxazol, benzoxazol, 1,2,3-oxadiazol, 1,2,4-oxadiazol, tiazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, benzotiazol, imidazol, benzoimidazol, indol, indazol, pirazol, benzopirazol, isoxazol, benzoisoxazol, isotiazol, triazol, benzotriazol, tiadiazol, tetrazol, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, purina, pteridina, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina, cinnolina y triazina. Un grupo heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "heteroalicíclico" o "heteroaliciclilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico y tricíclico de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, hasta 18 miembros, en donde los átomos de carbono junto con de 1 a 5 heteroátomos constituyen dicho sistema de anillo. Un heterociclo puede contener, opcionalmente, uno o más enlaces insaturados situados de una forma tal que, sin embargo, no tenga lugar un sistema de electrones pi completamente deslocalizados por todos los anillos. Los heteroátomos se seleccionan independientemente entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Un heterociclo puede contener adicionalmente una o más funcionalidades carbonilo o tiocarbonilo, con el fin de hacer que la definición incluya sistemas oxo y sistemas tio tales como lactamas, lactonas, imidas cíclicas, tioimidas cíclicas y carbamatos cíclicos. Cuando están compuesto por dos o más anillos, los anillos pueden estar unidos uno a otro de forma condensada. Adicionalmente, cualquier nitrógeno en un heteroalicíclico se puede cuaternizar. Los grupos heteroaliciclilo o heteroalicíclicos pueden estar no sustituidos o sustituidos. Los ejemplos de tales grupos "heteroalicíclicos" o "heteroaliciclilo" incluyen, pero no se limitan a, 1,3-dioxina, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, 1,2-dioxolano, 1,3-dioxolano, 1,4-dioxolano, 1,3-oxatiano, 1,4-oxatiína, 1,3-oxatiolano, 1,3-ditiol, 1,3-ditiolano, 1,4-oxatiano, tetrahidro-1,4-tiazina, 2H-1,2-oxazina, maleimida, succinimida, ácido barbitúrico, ácido tiobarbitúrico, dioxopiperazina, hidantoína, dihidrouracilo, trioxano, hexahidro-1,3,5-triazina, imidazolina, imidazolidina, isoxazolina, isoxazolidina, oxazolina, oxazolidina, oxazolidinona, tiazolina, tiazolidina, morfolina, oxirano, N-óxido de piperidina, piperidina, piperazina, pirrolidina, pirrolidona, pirrolidiona, 4-piperidona, pirazolina, pirazolidina, 2-oxopirrolidina, tetrahidropirano, 4H-pirano, tetrahidrotiopirano, tiamorfolina, sulfóxido de tiamorfolina, tiamorfolino sulfona y sus análogos condensados a benzo (p. ej., benzoimidazolidinona, tetrahidroquinolina, 3,4-metilendioxifenilo).

Como se usan en el presente documento, "aralquilo" y "aril(alquilo)" se refieren a un grupo arilo conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno inferior. El grupo alquileno inferior y arilo de un aralquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, bencilo, 2-fenilalquilo, 3-fenilalquilo y naftilalquilo.

Como se usan en el presente documento, "heteroaralquilo" y "heteroaril(alquilo)" se refieren a un grupo heteroarilo conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno inferior. El grupo alquileno inferior y heteroarilo del heteroaralquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, 2-tienilalquilo, 3-tienilalquilo, furilalquilo, tienilalquilo, pirrolilalquilo, piridilalquilo, isoxazolilalquilo e imidazolilalquilo, y sus análogos benzocondensados.

Un "(heteroaliciclil)alquilo" es un grupo heterocíclico o heteroalicíclico conectado, como sustituyente, a través de un grupo alquileno inferior. El alquileno inferior y el heterocíclico o un heterociclilo de un (heteroaliciclil)alquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a tetrahidro-2H-piran-4-il)metilo, (piperidin-4-il)etilo, (piperidin-4-il)propilo, (tetrahidro-2H-tiopiran-4-il)metilo y (1,3-tiazinan-4-il)metilo.

Como se usa en el presente documento, "alcoxi" se refiere a la Fórmula -OR, en donde R es un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo o un cicloalquinilo se define como anteriormente. Una lista no limitante de alcoxis es metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metiletoxi (isopropoxi), n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi y ferc-butoxi. Un alcoxi puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "hidroxialquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno se reemplazan por un grupo hidroxi. Los grupos hidroxialquilo a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo y 2,2-dihidroxietilo. Un hidroxialquilo puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "alquilamino" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno están reemplazados por un grupo amino. Los grupos alquilamino ilustrativos incluyen, pero sin limitación, aminometilo, 2-aminoetilo, 3-aminoetilo. Un alquilamino puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "alquilamido" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno están reemplazados por un grupo C-amido o un grupo N-amido. Un alquilamido puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, "alquiltio" se refiere a RS-, en el que R es un alquilo. El alquiltio puede estar sustituido o no sustituido.

Como se usa en el presente documento, un grupo "C-amido" se refiere a un grupo "-C(=0)N(R^aR^b)" en el que R^ay R^bpueden ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo o (heteroaliciclil)alquilo. Un C-amido puede estar sustituido o no sustituido. Como se usa en el presente documento, un grupo "N-amido" se refiere a un grupo "RC(=O)N(R^a)-" en el que R y R^apueden ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo o (heteroaliciclil)alquilo. Un N-amido puede estar sustituido o no sustituido. La expresión "átomo de halógeno" y los términos "halógeno" o "halo", como se usan en el presente documento, significan uno cualquiera de los átomos radioestables de la columna 7 de la Tabla Periódica de los Elementos, tales como, flúor, cloro, bromo y yodo.

El término "amina", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NH², en donde uno o más hidrógenos pueden estar opcionalmente sustituidos con un grupo R. R puede ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo o (heteroaliciclil)alquilo.

El término "aldehído", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -R^c-C (O) H, en donde R^cpuede estar ausente o seleccionarse independientemente entre alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, cicloalquinileno, arileno, heteroarileno, heteroaliciclileno, aralquileno o (heteroaliciclil)alquileno. La expresión "éster activado", como se usa en el presente documento, se refiere a un éster que reacciona espontáneamente con un nucleófilo, por ejemplo, éster de NHS, éster de pentafluorofenilo o éster de nitrofenilo. El término "nitreno", como se usa en el presente documento, se refiere al análogo de nitrógeno de un carbeno, en donde el átomo de nitrógeno no está cargado con seis electrones de valencia.

El término "amino", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NH².

El término "hidroxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -OH.

El término grupo "ciano", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo "-CN".

El término "azido", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -N³.

El término "tiol", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -SH.

El término "hidrazinilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NHNH².

El término "hidrazonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo

El término "formilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -C(O)H.

El término "glicidilo" o "éter glicidílico", como se usa en el presente documento, se refiere a

El término "epoxi", como se usa en el presente documento, se refiere a

O

El término "ácido carboxílico", como se usa en el presente documento, se refiere a -C(O)OH.

El término "tiocianato", como se usa en el presente documento, se refiere al grupo -S-CeN.

El término "oxo-amina", como se usa en el presente documento, se refiere al grupo -O-NH², en donde uno o más hidrógeno de -NH²pueden estar opcionalmente sustituidos con un grupo R. R puede ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo o (heteroaliciclil)alquilo.

Como se usan en el presente documento, los prefijos "foto" o "foto-" significan relativos a una radiación luminosa o electromagnética. El término puede abarcar todo o parte del espectro electromagnético que incluye, pero sin limitación, uno o más de los intervalos comúnmente conocidos como radio, microondas, infrarrojo, radiación visible, ultravioleta, partes del espectro de rayos X o rayos gamma. La parte del espectro puede ser una que está bloqueada por una región metálica de una superficie tal como los metales que se definen en el presente documento. Como alternativa o adicionalmente, la parte del espectro puede ser una que atraviesa una región intersticial de una superficie tal como una región hecha de vidrio, plástico, sílice u otro material que se define en el presente documento. En realizaciones particulares, se puede usar radiación que pueda pasar a través de un metal. Como alternativa o adicionalmente, se puede usar radiación que esté enmascarada por vidrio, plástico, sílice u otro material que se define en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, la expresión "sitio reactivo" significa un sitio en los revestimientos poliméricos descritos en el presente documento que se puede utilizar para unir una o más moléculas mediante una reacción química o interacción molecular. Tal unión puede ser mediante un enlace covalente o mediante otras fuerzas de unión o interactivas.

Como se usan en el presente documento, la expresión "porcentaje de superficie restante" se puede referir a la intensidad medida usando un TET qc para teñir las cebadores superficiales P5/P7. Los cebadores P5 y P7 se utilizan sobre la superficie de celdas de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para secuenciar sobre las plataformas HiSeq, MiSeq y Genome Analyzer. Las secuencias de cebadores se describen en la publicación de patente de EE.UU. N.° 2011/0059865 A1. t Et es un oligonucleótido marcado con colorante que tiene una secuencia complementaria al cebador P5/P7. El TET se puede hibridar al cebador P5/P7 sobre una superficie; se puede lavar el exceso de TET y se puede medir la concentración de colorante adherido mediante detección de fluorescencia utilizando instrumentos de barrido tales como un escáner Typhoon (General Electric).

Composiciones de sustrato que tienen una superficie revestida con polímero

Un primer aspecto de las composiciones descritas en el presente documento se refiere a un sustrato que comprende una superficie que tiene un revestimiento polimérico unido covalentemente a la misma. En una realización preferida, el polímero comprende PAZAM. El revestimiento polimérico comprende una unidad recurrente de Fórmula (la) y una unidad recurrente de Fórmula (II):

y heterociclilo;

RA es azido;

cada uno de R4, R4', R5 y R5' se selecciona independientemente entre H, R6, OR6, -C(O)OR6,-C(O)R6, -OC(O)R6, C(O) NR7R8 o -NR7R8;

R⁶se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C¹-C⁶, cicloalquilo C³-C¹⁰, hidroxialquilo C¹-C⁶, arilo C⁶-C¹⁰, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heterociclilo de 3 a 10 miembros;

cada uno de R⁷y R⁸es independientemente H o alquilo C¹-C⁶, o R⁷y R⁸están unidos junto con el átomo o los átomos a los que están fijados para formar un heterociclo de 3 a 10 miembros;

y o es un número entero entre 1 y 50.

En algunas de tales realizaciones, o es 5 y RA es azido.

En realizaciones adicionales, R1 es hidrógeno.

En otras realizaciones adicionales, R4 es -C(O)NR7R8, donde cada R7 y R8 se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo C¹-C⁶o hidroxialquilo C¹-C⁶.

En algunas realizaciones de tales composiciones poliméricas, R4 es -C(O)NH²,-C(O)NHCH³o -C(O)N(CH³)².

En otras realizaciones, R4 es -C(O)NH(CH²)²OH o -C(O)N(CH³)(CH²)²OH.

En incluso otras realizaciones, R4 es NR7R8, en donde R7 y R8 se unen con los átomos a los que están fijados para formar un heterociclo de cinco miembros.

En realizaciones preferidas que comprenden un heterociclo de cinco miembros, el heterociclo de cinco miembros es una pirrolidina opcionalmente sustituida.

Incluso en otras realizaciones, R4 es -C(O)OR6, en donde R6 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C¹-C⁶o hidroxialquilo C¹-C⁶.

En una realización preferida, R6 es hidrógeno.

En otra realización preferida, R6 es metilo.

En otra realización preferida adicional, R6 es hidroxietilo.

En otras realizaciones preferidas, R4' es hidrógeno.

En incluso otras realizaciones preferidas, R4' es alquilo.

En aún otras realizaciones preferidas, R4' es metilo.

En algunas realizaciones preferidas, R5' es hidrógeno.

En realizaciones preferidas adicionales, R5' es alquilo.

En más realizaciones preferidas adicionales, R5' es metilo.

En otra realización más de los sustratos que comprenden una superficie revestida con polímero descrita en el presente documento, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III) o (III'):

en donde R¹es H o alquilo C¹-C⁶; R⁵es H o alquilo C¹-C⁶; n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000. En algunas realizaciones, o es 5.

En una realización, el polímero de Fórmula (III) también está representado por la Fórmula (IIIa):

en donde n es un número entero en el intervalo de 1-20.000 y m es un número entero en el intervalo de 1-100.000.

En algunas de tales realizaciones, el revestimiento polimérico está unido covalentemente a una serie de grupos funcionales unidos a la superficie, en donde los grupos funcionales se seleccionan entre alqueno, alquino, nitreno, aldehído, hidrazina, éster activado, éter de glicidilo, amina, maleimida o éster benzoílico con un sustituyente fosfina en posición orto.

En una realización preferida de tales composiciones, los grupos funcionales comprenden alquinos, y la unidad recurrente de Fórmula (I) también está representada por la Fórmula (la), en donde RA es azido.

En otra realización preferida de tales composiciones, los grupos funcionales comprenden nitrenos, y la unidad recurrente de Fórmula (I) también está representada por la Fórmula (la), en donde RA es azido.

En otra realización preferida más de tales composiciones, los grupos funcionales comprenden amina, y la unidad recurrente de Fórmula (I) también está representada por la Fórmula (la), en donde RA es azido.

El revestimiento polimérico descrito en el presente documento se puede unir covalentemente a varios sustratos. Esencialmente cualquier material de sustrato que pueda funcionalizarse con grupos reactivos, incluyendo, pero sin limitación, alqueno, alquino, nitreno, aldehído, hidrazina, éster activado, éter de glicidilo, amina, maleimida se puede utilizar. También se pueden utilizar acrilamida, enona o acrilato como material de sustrato. Los sustratos pueden comprender un único material o una pluralidad de diferentes materiales. Los sustratos pueden ser materiales compuestos o estratificados. En algunas realizaciones, el sustrato tiene al menos una superficie que comprende vidrio. En otras realizaciones, el sustrato tiene al menos una superficie que comprende un metal. En algunas de tales realizaciones, el metal es oro. En algunas realizaciones, el sustrato tiene al menos una superficie que comprende un óxido metálico. En una realización, la superficie comprende un óxido de tántalo. Otros materiales de sustrato pueden incluir, pero sin limitación, plástico, silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio, sílice fundida, arseniuro de galio, fosfuro de indio, aluminio, cerámicas, poliimida, cuarzo, resinas, polímeros y copolímeros. El sustrato puede ser plano, redondo o texturado.

En algunas realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento, la superficie del sustrato comprende tanto regiones revestidas con polímero como regiones inertes que no están revestidas con polímero. Las regiones revestidas con polímero pueden comprender sitios reactivos y, por tanto, se pueden utilizar para unir moléculas a través de enlaces químicos u otras interacciones moleculares. En algunas realizaciones, las regiones revestidas con polímero y las regiones inertes pueden alternarse para formar un patrón o una rejilla. Tales patrones pueden tener una o dos dimensiones. En algunas realizaciones, las regiones inertes se pueden seleccionar del grupo que consiste en regiones de vidrio, regiones de metal, regiones de máscara y regiones intersticiales. En una realización preferida, la superficie comprende regiones de vidrio. En otra realización preferida, la superficie comprende regiones metálicas. En aún otra realización preferida, la superficie comprende regiones de máscara. En otra realización preferida adicional, la superficie comprende regiones intersticiales. En algunas realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento, el sustrato puede ser una perla. En una realización preferida, la superficie de la perla está funcionalizada. La funcionalización puede ocurrir antes o después de introducir la perla en un pocillo. En una realización, el pocillo se define previamente en la superficie de una celda de flujo. Los materiales de sustrato ilustrativos que se pueden revestir con un polímero de la presente divulgación o que se pueden utilizar de otro modo en una composición o un método expuesto en el presente documento se describen en los documentos de EE.UU. con n.° de serie 13/492.661 y 13/661.524.

Un segundo aspecto de las composiciones descritas en el presente documento se refiere a una celda de flujo que comprende uno o más sustratos que comprenden una superficie que tiene un revestimiento polimérico unido covalentemente a la misma. En algunas realizaciones, las celdas de flujo descritas en el presente documento comprenden uno o más de los sustratos descritos anteriormente. En una realización preferida, el polímero comprende PAZAM.

En algunas realizaciones, las celdas de flujo comprenden además polinucleótidos unidos a la superficie del sustrato mediante el revestimiento polimérico. En realizaciones preferidas, los polinucleótidos están presentes en las celdas de flujo en grupos de polinucleótidos, en donde los polinucleótidos de los grupos de polinucleótidos se unen a una superficie de la celda de flujo a través del revestimiento polimérico. En tales realizaciones, la superficie del cuerpo de la celda de flujo a la que se unen los polinucleótidos se considera el sustrato. En otras realizaciones, se introduce un sustrato separado que tiene una superficie revestida con polímero en el cuerpo de la celda de flujo. En realizaciones preferidas, la celda de flujo es una cámara de flujo que está dividida en una pluralidad de carriles o una pluralidad de sectores, en donde uno o más de la pluralidad de carriles o de la pluralidad de sectores comprende una superficie que está revestida con un revestimiento polimérico unido covalentemente descrito en el presente documento. En algunas realizaciones de las celdas de flujo descritas en el presente documento, los polinucleótidos unidos dentro de un solo grupo de polinucleótidos tienen la misma secuencia de nucleótidos o una similar. En algunas realizaciones de las celdas de flujo descritas en el presente documento, los polinucleótidos unidos de diferentes grupos de polinucleótidos tienen secuencias de nucleótidos diferentes o no similares. Las celdas de flujo y los sustratos ilustrativos para la fabricación de celdas de flujo que se pueden usar en el método o composición definida en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los disponibles en el mercado de Illumina, Inc. (San Diego, CA) o descritos en los documentos US 2010/0111768 A1 o US 2012/0270305.

Métodos de revestimiento de sustratos con polímeros unidos covalentemente

Un primer aspecto de los presentes métodos descritos en el presente documento se refiere a un proceso para preparar un revestimiento polimérico inmovilizado en una superficie de un sustrato. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un polímero con la superficie de un sustrato, en donde la superficie comprende una pluralidad de grupos funcionales, formando de ese modo una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie y en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales de la superficie. En algunas realizaciones, el polímero se forma in situ sobre la superficie del sustrato polimerizando un material polimerizable sobre la superficie del sustrato. En alguna otra realización, el polímero se forma previamente antes de ponerlo en contacto con la superficie del sustrato. En una realización preferida, el polímero comprende PAZAM.

En algunas realizaciones de los métodos de inmovilización de un revestimiento polimérico en la superficie de un sustrato, el revestimiento polimérico comprende una unidad recurrente de Fórmula (Ia) y una unidad recurrente de Fórmula (II) como se definen en el presente documento.

En otras realizaciones de los métodos de revestimiento de la superficie de un sustrato con un polímero, R¹es H o alquilo C¹-C⁶.

En una realización de tal método, o es 5 y RA es azido.

En otra realización de tal método, R1 es hidrógeno.

En otra realización más de tal método, R4 es -C(O)NR7R8, en donde cada R7 y R8 es independientemente hidrógeno, alquilo C¹-C⁶o hidroxialquilo C¹-C⁶. En una realización particular de tal método, R4 es -C(O)NH².

En otra realización de tal método, R4' es hidrógeno.

En una realización adicional de tal método, tanto R4' como R5' son hidrógeno.

Incluso en otra realización de tal método, al menos uno de R4' y R5' es alquilo C¹-C⁶, por ejemplo, un grupo metilo.

En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III):

en donde R1 es H o alquilo C¹-C⁶; RA es azido, R5 es alquilo C¹-C⁶; n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y m es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000. En algunas realizaciones, o es 5.

En una realización, el polímero de Fórmula (III) también está representado por la Fórmula (IIIa) o (IIIb):

En algunas realizaciones de tales métodos, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden azidas fotoactivables. En algunas realizaciones, las azidas fotoactivables son grupos fenil-azida opcionalmente sustituidos. En algunas de estas realizaciones, la fenil-azida se prepara haciendo reaccionar un grupo amina sobre la superficie del sustrato con N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HSAB).

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la fenil-azida se fotoactiva antes de poner en contacto el polímero con la superficie del sustrato. En una realización preferida de tales métodos, los grupos funcionales fotoactivados generan nitreno. En otra realización preferida de tales métodos, el revestimiento polimérico se une covalentemente a grupos nitreno mediante fotoactivación.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente para unir covalentemente un revestimiento polimérico a la superficie de un sustrato, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden grupos alquino.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente para unir covalentemente un revestimiento polimérico a la superficie de un sustrato, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales en presencia de un catalizador. En una realización particular, el catalizador es un catalizador de cobre. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos alquino sin utilizar un catalizador de cobre.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente para unir covalentemente un revestimiento polimérico a la superficie de un sustrato, los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden grupos alqueno. En algunas realizaciones, los grupos alqueno se preparan haciendo reaccionar la superficie funcionalizada con amina con grupos acriloílo. En algunas realizaciones preferidas, la superficie funcionalizada con amina se preparó tratando la superficie con 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMS). En algunas realizaciones preferidas adicionales, el grupo acriloílo se puede seleccionar entre un éster acrílico activado, ácido acrílico, cloruro acrílico o COMU (número CAS 1075198-30-9). En una realización, el éster acrílico activado es un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) del ácido acrílico. En algunas otras realizaciones, los grupos alqueno se preparan poniendo en contacto directamente la superficie del sustrato con silanos funcionalizados. En algunas realizaciones adicionales, el silano funcionalizado se puede seleccionar entre 3-acrilamidotrimetoxisilano o metacriloxipropiltrimetoxisilano.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente para unir covalentemente un revestimiento polimérico a la superficie de un sustrato, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales a una temperatura elevada. En una realización preferida, la temperatura elevada es cualquier temperatura en un intervalo de 60 °C a 90 °C.

En algunas realizaciones de tales métodos, el material polimerizable se aplica en forma líquida.

En algunas realizaciones de los métodos de inmovilización de un revestimiento polimérico en la superficie de un sustrato, la pluralidad de grupos funcionales están dispuestos sobre la superficie del sustrato para formar una pluralidad de regiones revestidas con polímero y una pluralidad de regiones inertes tras la polimerización del material polimérico. En algunas realizaciones, las regiones inertes se seleccionan del grupo que consiste en regiones de vidrio, regiones de metal, regiones de máscara y regiones intersticiales. En una realización preferida, las regiones inertes comprenden vidrio. En algunas realizaciones, la pluralidad de regiones revestidas con polímero y la pluralidad de regiones inertes están dispuestas sobre la superficie para formar un patrón o una rejilla. Tales patrones o rejillas pueden ser unidimensionales o bidimensionales con respecto a la superficie del sustrato. Las superficies con patrón ilustrativas que se pueden emplear se describen en los documentos de EE.UU. con n.° de serie 13/492.661 y 13/661.524.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente para preparar un revestimiento polimérico inmovilizado en una superficie de un sustrato, el revestimiento polimérico se disuelve en una solución acuosa antes de unirse covalentemente a los grupos funcionales de la superficie. En alguna realización, el sustrato es una perla.

Un segundo aspecto de los presentes métodos desvelados en el presente documento se refiere a un proceso para preparar una matriz de polinucleótidos. En tales realizaciones, los métodos pueden comprender las etapas de (a) hacer reaccionar una pluralidad de primeros oligonucleótidos y una pluralidad de segundos oligonucleótidos con sitios reactivos sobre un revestimiento polimérico presente sobre una superficie de uno cualquiera de los sustratos descritos en el presente documento o un revestimiento polimérico preparado mediante uno cualquiera de los métodos de inmovilización de un revestimiento polimérico en una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento; (b) poner en contacto la pluralidad de primeros oligonucleótidos unidos al revestimiento polimérico con moldes que se van a amplificar; y (c) amplificar los moldes usando los primeros oligonucleótidos y los segundos oligonucleótidos, generando así una matriz agrupada de polinucleótidos. En algunas realizaciones, cada molde comprende en el extremo 3' una secuencia capaz de hibridarse con los primeros oligonucleótidos y, en el extremo 5', una secuencia cuyo complemento es capaz de hibridarse con los segundos oligonucleótidos. En los métodos anteriores, el segundo oligonucleótido es opcional. Por tanto, en algunas realizaciones, no es necesario que el segundo oligonucleótido esté presente. Si está presente, el segundo oligonucleótido se puede unir al revestimiento polimérico o se puede proporcionar en solución durante la etapa de amplificación.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos alquino para hacerse reaccionar con los grupos azido del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con cloruro cianúrico del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehido para hacerse reaccionar con grupos amina activados, tales como grupos hidrazinilo o hidrazonilo del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En otras realizaciones más de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos tiocianato o ácido carboxílico del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En realizaciones adicionales de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos glicidilo del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En más realizaciones adicionales de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos amina del revestimiento polimérico a través de un enlazador de dialdehído. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos éster o epoxi activados del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehido para hacerse reaccionar con los grupos oxo-amina del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En una realización preferida de los métodos descritos anteriormente de preparación de una matriz de polinucleótidos, el revestimiento polimérico sobre la superficie del sustrato comprende un polímero de Fórmula (Illa) o (IIIb).

Un tercer aspecto de los presentes métodos desvelados en el presente documento se refiere a un método para preparar una superficie de un sustrato que comprende: formar una pluralidad de grupos funcionales sobre la superficie de una o más perlas; poner en contacto un revestimiento polimérico descrito en el presente documento con las perlas para formar una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie de las perlas, en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas; y fijar las perlas revestidas con polímero a la superficie del sustrato. En una realización, el sustrato es una celda de flujo. En una realización, el revestimiento polimérico comprende PAZAM. La capa de revestimiento polimérico puede cubrir las perlas total o parcialmente. En una realización, la capa de revestimiento polimérico sobre la superficie de las perlas tiene un espesor de aproximadamente 20 nm. En alguna realización, las perlas tienen un diámetro de aproximadamente 1,2 micrómetros o inferior. En algunas otras realizaciones, las perlas tienen un diámetro de aproximadamente 0,5 micrómetros o inferior. En una realización preferida, la superficie del sustrato tiene un patrón. Sin embargo, se pueden utilizar perlas de mayor tamaño, incluyendo, pero sin limitación, las que tienen un diámetro de aproximadamente 10 micrómetros o inferior, 5 micrómetros o inferior, 3 micrómetros o inferior, o 2 micrómetros o inferior.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden alquenos. En algunas realizaciones, los grupos alqueno se preparan haciendo reaccionar la superficie funcionalizada con amina de las perlas con grupos acriloílo. En algunas realizaciones preferidas, la superficie funcionalizada con amina se preparó tratando la superficie con 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMS). En algunas realizaciones preferidas adicionales, el grupo acriloílo se puede seleccionar entre un éster acrílico activado o un cloruro acrílico. En una realización, el éster acrílico activado es un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) del ácido acrílico. Otros agentes de acoplamiento útiles incluyen ácido acrílico, COMU (número CAS 1075198-30-9), 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o N-hidroxisuccinimida (NHS). En algunas otras realizaciones, los grupos alqueno se preparan poniendo en contacto directamente la superficie del sustrato con silanos funcionalizados. En algunas realizaciones adicionales, el silano funcionalizado se puede seleccionar entre 3-acrilamidotrimetoxisilano o metacriloxipropiltrimetoxisilano. En algunas realizaciones, las perlas previamente tratadas se exponen a una solución que comprende un inhibidor de la polimerización antes de entrar en contacto con el revestimiento polimérico. En alguna realización, el inhibidor de la polimerización se selecciona entre hidroxil-tolueno butilado (BHT), dietilhidroxilamina o (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)oxilo (TEMPO). En algunas realizaciones preferidas, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos alqueno sobre la superficie de las perlas a una temperatura elevada. En una realización preferida, la temperatura elevada es cualquier temperatura en un intervalo de 60 °C a 90 °C.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden azidas fotoactivables. En algunas realizaciones, las azidas fotoactivables son grupos fenil-azida opcionalmente sustituidos. En algunas de estas realizaciones, la fenil-azida se prepara haciendo reaccionar un grupo amina sobre la superficie del sustrato con N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HSAB). En algunas realizaciones, la fenil-azida se fotoactiva antes de poner en contacto el polímero con la superficie del sustrato. En una realización preferida de tales métodos, los grupos funcionales fotoactivados generan nitreno. En otra realización preferida de tales métodos, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales mediante fotoactivación.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden grupos alquino. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales en presencia de un catalizador. En una realización particular, el catalizador es un catalizador de cobre. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos alquino sin utilizar un catalizador de cobre.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, las perlas revestidas de polímero se fijan a la superficie del sustrato cargando dichas perlas en los pocillos abiertos sobre la superficie del sustrato. Las perlas y los pocillos pueden tener dimensiones que hagan que no resida más de una perla en cada pocillo. Como alternativa, las dimensiones relativas pueden producir múltiples perlas por pocillo, las perlas revestidas de polímero se fijan a la superficie del sustrato haciendo reaccionar grupos funcionales del revestimiento polimérico con grupos funcionales sobre la superficie del sustrato. Los grupos funcionales de la superficie se pueden ubicar en elementos particulares de una superficie, por ejemplo, pocillos o lechos cortos. Como alternativa, los grupos funcionales del sustrato pueden extenderse por una superficie plana. Los métodos ilustrativos para preparar tales superficies, que se pueden revestir usando los métodos y las composiciones expuestos en el presente documento, se describen en los documentos de EE.UU. con n.° de serie 13/492.661 y 13/661.524. En una realización, los grupos funcionales del revestimiento polimérico comprenden aminas y los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). En otra realización, los grupos funcionales de revestimiento polimérico comprenden azidas y los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden alquinos. En aún otra realización, los grupos funcionales del revestimiento polimérico comprenden tioles y los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden maleimidas.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, el método comprende además lavar las perlas revestidas con polímero para retirar el exceso de revestimiento polimérico no unido antes de cargar las perlas en la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico se disuelve en una solución antes de entrar en contacto con las perlas. En una realización, la solución es una solución acuosa.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, el método comprende además hacer reaccionar una pluralidad de primeros oligonucleótidos y una pluralidad de segundos oligonucleótidos con sitios reactivos sobre el revestimiento polimérico de las perlas; poner en contacto la pluralidad de primeros oligonucleótidos unidos al revestimiento polimérico con moldes que se van a amplificar, comprendiendo cada molde en el extremo 3' una secuencia capaz de hibridarse con los primeros oligonucleótidos y, en el extremo 5', una secuencia cuyo complemento es capaz de hibridarse con los segundos; y amplificar los moldes usando los primeros oligonucleótidos y los segundos oligonucleótidos, generando así una matriz agrupada de polinucleótidos.

En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos alquino para hacerse reaccionar con los grupos azido del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con cloruro cianúrico del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehído para hacerse reaccionar con grupos amina activados, tales como grupos hidrazinilo o hidrazonilo del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En otras realizaciones más de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos tiocianato o ácido carboxílico del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En realizaciones adicionales de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos glicidilo del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En realizaciones adicionales de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos amina del revestimiento polimérico a través de un enlazador de dialdehído. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos amina para hacerse reaccionar con grupos éster o epoxi activados del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos maleimida para hacerse reaccionar con los grupos tiol del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos alqueno para hacerse reaccionar con los grupos alqueno del revestimiento polimérico mediante metátesis cruzada de olefinas. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En incluso otras realizaciones de los métodos descritos anteriormente, los primeros oligonucleótidos o los segundos oligonucleótidos comprenden grupos aldehído para hacerse reaccionar con los grupos oxo-amina del revestimiento polimérico. En una realización preferida, tanto los primeros oligonucleótidos como los segundos oligonucleótidos comprenden tales grupos.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, el método comprende además la etapa de teñir las perlas revestidas con polímero con un agente de formación de imágenes ópticas. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes ópticas se selecciona del grupo que consiste en fosfina Dylight488, fosfina Dylight 550, fosfina Dylight 650 (ambas de ThermoFisher Scientific) y colorantes de alquinos deformados (colorantes a base de DBCO de Click Chemistry Tools, Inc.) tales como: DBCO-Fluor 488, DBCO-Fluor 525, DBCO-Fluor 545, DBCO-Fluor 568, DBCO-Fluor 585 y DBCO-SETA 650. En una realización, el agente de formación de imágenes ópticas es la fosfina DyLight488.

En algunas realizaciones de los métodos de preparación de una superficie de un sustrato como se describe en el presente documento, el sustrato se puede seleccionar entre un sustrato de silicio, un sustrato de plástico o un sustrato de plástico impregnado con aditivos. En algunas realizaciones adicionales, el sustrato de plástico se puede impregnar con SiO², TiO²o negro de humo.

Un método expuesto en el presente documento puede utilizar cualquiera de varias técnicas de amplificación. Las técnicas ilustrativas que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), amplificación por círculo rodante (RCA, Rolling Circle Amplification), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, Múltiple Displacement Amplification) o amplificación por cebador aleatorio (RPa , Random Prime Amplification). En realizaciones particulares, uno o más cebadores usados para la amplificación se pueden unir a un revestimiento polimérico. En realizaciones de PCR, uno o ambos de los cebadores usados para la amplificación pueden unirse a un revestimiento polimérico. Los formatos que utilizan dos especies de cebadores unidos se suelen denominar amplificación de tipo puente, porque los amplicones bicatenarios forman una estructura similar a un puente entre los dos cebadores unidos que flanquean la secuencia molde que se ha copiado. Se describen ejemplos de reactivos y condiciones que pueden utilizarse para la amplificación de tipo puente, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 5.641.658; publicación de patente de EE.UU. n.° 2002/0055100; patente de EE.UU. n.° 7.115.400; publicación de patente de EE.UU. n.° 2004/0096853; publicación de patente de EE.UU. n.° 2004/0002090; publicación de patente de Ee .UU. n.° 2007/0128624; y publicación de patente de EE.UU. n.° 2008/0009420. La amplificación por PCR también se puede llevar a cabo con uno de los cebadores de amplificación unido a un revestimiento polimérico y el segundo cebador en solución. Un formato ilustrativo que usa una combinación de un cebador unido y un cebador soluble es la PCR en emulsión como se describe, por ejemplo, en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

100:8817-8822 (2003), el documento WO 05/010145 o las publicaciones de patente de EE.UU. n.° 2005/0130173 o 2005/0064460. La PCR en emulsión es ilustrativa del formato, y se entenderá que para los fines de los métodos expuestos en el presente documento, el uso de una emulsión es opcional y, de hecho, para varias realizaciones no se usa una emulsión. Asimismo, los cebadores no necesitan unirse directamente a soportes sólidos como se establece en las referencias de ePCR, sino que, en cambio, pueden unirse a un revestimiento polimérico como se establece en el presente documento.

Las técnicas de RCA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Se describen ejemplos de componentes que se pueden utilizar en una reacción de RCA y los principios por los cuales la RCA produce amplicones, por ejemplo, en Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A1. Los cebadores utilizados para la RCA pueden estar en solución o unidos a un revestimiento polimérico.

Las técnicas de MDA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Se describen algunos principios básicos y condiciones útiles para la MDA, por ejemplo, en Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 99:5261-66 (2002); Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker et al., "Molecular Methods for Virus Detection", Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992); y los documentos US 5.455.166; US 5.130.238; y US 6.214.587. Los cebadores utilizados para la MDA pueden estar en solución o unidos a un revestimiento polimérico.

En realizaciones particulares, se puede utilizar una combinación de las técnicas de amplificación ilustradas anteriormente. Por ejemplo, se pueden utilizar la RCA y MDA en una combinación en donde la RCA se usa para generar un amplicón concatamérico en solución (p. ej., usando cebadores en fase de solución). Luego, se puede utilizar el amplicón como molde para la MDA usando cebadores que se unan a un revestimiento polimérico. En este ejemplo, los amplicones producidos tras las etapas combinadas de RCA y MDA se unirán al revestimiento polimérico.

Un tercer aspecto de los presentes métodos desvelados en el presente documento se refiere a un proceso de determinación de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. En tales realizaciones, los métodos pueden comprender las etapas de (a) poner en contacto una polinucleótido polimerasa con grupos de polinucleótidos unidos a una superficie de un sustrato mediante uno cualquiera de los revestimientos poliméricos descritos en el presente documento; (b) proporcionar nucleótidos a la superficie del sustrato revestida con polímero de manera que se genere una señal detectable cuando la polinucleótido polimerasa utiliza uno o más nucleótidos; (c) detectar señales en uno o más grupos de polinucleótidos; y (d) repetir las etapas (b) y (c), determinando así una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido presente en uno o más grupos de polinucleótidos.

En algunas realizaciones de los métodos que se describen en el presente documento, se determina una secuencia de nucleótidos para un polinucleótido unido a la superficie del sustrato que está presente dentro de una celda de flujo. En algunas realizaciones, la superficie revestida con polímero es una parte integral de la celda de flujo. En otras realizaciones, la superficie revestida con polímero es un sustrato separado colocado dentro de la celda de flujo. En realizaciones adicionales, el sustrato separado se puede acoplar, unir o fijar de otro modo a una superficie u otra parte de la celda de flujo.

La secuenciación de ácidos nucleicos se puede utilizar para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mediante varios procesos conocidos en la técnica. En un método preferido, se utiliza la secuenciación por síntesis (SBS, Sequencing-By-Synthesis) para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido a una superficie de un sustrato mediante cualquiera de los revestimientos poliméricos descritos en el presente documento. En tal proceso, se proporcionan uno o más nucleótidos a un polinucleótido molde que se asocia con una polinucleótido polimerasa. La polinucleótido polimerasa incorpora el uno o más nucleótidos a una hebra de ácido nucleico de nueva síntesis que es complementaria del molde de polinucleótido. La síntesis se inicia a partir de un cebador de oligonucleótido que es complementario de una porción del polinucleótido molde o a una porción de un ácido nucleico universal o no variable que está unido covalentemente a un extremo del polinucleótido molde. A medida que se incorporan nucleótidos contra el polinucleótido molde, se genera una señal detectable que permite determinar qué nucleótido se ha incorporado en cada etapa del proceso de secuenciación. De esta manera, se puede generar la secuencia de un ácido nucleico complementario de al menos una porción del polinucleótido molde, permitiendo por tanto determinar la secuencia del polinucleótido de al menos una porción del polinucleótido molde. Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para alojar una matriz que se produce mediante los métodos de la presente divulgación y que se somete a una secuenciación por síntesis (SBS) u otra técnica de detección que implica la administración repetida de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., puede fluir hacia/a través de una celda de flujo que alberga una matriz de ácidos nucleicos fabricada mediante los métodos establecidos en el presente documento. Se pueden detectar aquellos sitios de una matriz en los que la extensión del cebador hace que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, se puede añadir a un cebador un análogo de nucleótido que tenga un resto terminador reversible, de manera que no pueda producirse una extensión posterior hasta que se administre un agente de desbloqueo para retirar el resto. Por tanto, para realizaciones que utilizan la terminación reversible, se puede administrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Se pueden llevar a cabo lavados entre las diversas etapas de administración. El ciclo se puede repetir n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando así una secuencia de longitud n. Se describen procedimientos ilustrativos de SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida mediante los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, in Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), y los documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281 y US 2008/0108082.

Se pueden utilizar otros procedimientos de secuenciación que utilizan reacciones cíclicas, tales como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan determinados nucleótidos a una cadena de ácido nucleico naciente (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); documentos u S 6.210.891; US 6.258.568 y US 6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado se puede detectar convirtiéndolo inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado puede detectarse mediante fotones producidos por luciferasa. Por tanto, la reacción de secuenciación se puede controlar mediante un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación utilizadas para los sistemas de detección basados en fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Sistemas fluídicos útiles, detectores y procedimientos que se pueden utilizar para la aplicación de pirosecuenciación a matrices de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en los documentos WO 12/058096 A1, US 2005/0191698 A1, US 7.595.883 y US 7.244.559.

También son útiles las reacciones de secuenciación por ligadura, incluyendo, por ejemplo, las descritas en Shendure et al., Science 309:1728-1732 (2005); y los documentos US 5.599.675; y US 5.750.341. Algunas realizaciones pueden incluir procedimientos de secuenciación por hibridación como se describe, por ejemplo, en Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995); y el documento WO 1989/10977. En los procedimientos tanto de secuenciación por ligadura como de secuenciación por hibridación, los ácidos nucleicos que están presentes en los sitios de una matriz se someten a ciclos repetidos de administración y detección de oligonucleótidos. Los sistemas fluídicos para los métodos de SBS como se establece en el presente documento o en las referencias citadas en el presente documento se pueden adaptar fácilmente para la administración de reactivos para procedimientos de secuenciación por ligadura o secuenciación por hibridación. Normalmente, los oligonucleótidos se marcan con fluorescencia y pueden detectarse usando detectores de fluorescencia similares a los descritos con respecto a los procedimientos de SBS en el presente documento o en las referencias citadas en el presente documento.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican el seguimiento en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Por ejemplo, se pueden detectar las incorporaciones de nucleótidos mediante interacciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) entre una polimerasa portadora de un fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato, o con guías de ondas en modo cero (ZMW, ZeroMode Waveguides). Se describen técnicas y reactivos para la secuenciación basada en FRET, por ejemplo, en Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 105, 1176-1181 (2008).

Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido a un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede utilizar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles en el mercado de Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1.

Otra aplicación útil para una matriz de la presente divulgación, por ejemplo, habiendo sido producida mediante un método establecido en el presente documento, es el análisis de expresión génica. La expresión génica se puede detectar o cuantificar usando técnicas de secuenciación del ARN, tales como aquellas que se refieren a una secuenciación de ARN digital. Las técnicas de secuenciación del ARN se pueden llevar a cabo usando metodologías de secuenciación conocidas en la técnica tales como las que se han definido anteriormente. La expresión génica se puede detectar o cuantificar también usando técnicas de hibridación llevadas a cabo mediante hibridación directa en una matriz o usando un ensayo multiplexado, cuyos productos se detectan en una matriz. Una matriz de la presente divulgación, por ejemplo, habiendo sido producida mediante un método establecido en el presente documento, también se puede utilizar para determinar genotipos para una muestra de ADN genómico de uno o más individuos. Los métodos ilustrativos para la expresión basada en matrices y el análisis de genotipado que se pueden llevar a cabo en una matriz de la presente divulgación se describen en las patentes de EE.UU. n.° 7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 o 6.355.431, o las publicaciones de patente de EE.UU. n.° 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 o US 2005/0181440 A1.

En algunas realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una celda de flujo, solamente está presente un solo tipo de nucleótido en la celda de flujo durante una sola etapa de flujo. En tales realizaciones, el nucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste en dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En otras realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una celda de flujo, está presente una pluralidad de tipos diferentes de nucleótidos en la celda de flujo durante una sola etapa de flujo. En tales métodos, los nucleótidos se pueden seleccionar entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos.

La determinación del nucleótido o de los nucleótidos incorporados durante cada etapa de flujo para uno o más de los polinucleótidos unidos al revestimiento polimérico sobre la superficie del sustrato presente en la celda de flujo se consigue detectando una señal producida en o próxima al molde polinucleotídico. En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la señal detectable comprende una señal óptica. En otras realizaciones, la señal no detectable comprende una señal no óptica. En tales realizaciones, la señal no óptica comprende un cambio de pH en o cerca de uno o más de los moldes polinucleotídicos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de PAZAM

General

A menos que se indique lo contrario, todas las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de nitrógeno o argón, y los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales (Aldrich Chemical Company, Fisher Scientific, Dow) y se utilizaron tal como se recibieron sin purificación adicional. Todas las temperaturas de reacción registradas indican la temperatura del baño/aire en contacto con el recipiente de reacción. No se requirieron disolventes anhidros.

Los espectros de RMN de 1H y RMN de 13C se registraron en óxido de deuterio (para CL-RMN con 99,9 % atom. D) en un Bruker Avance

Instrumento de 400 MHz. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón, (ppm, 8) campo abajo del tetrametilsilano (TMS) y están referenciados con respecto al disolvente indicado como patrón interno.

Los análisis de GPC (Gel Permeation Chromatography, cromatografía de permeación sobre gel) fueron realizados por Smithers Rapra Technology Limited utilizando las siguientes condiciones cromatográficas:

Instrumento: Malvern/Viscotek Triple Detector Array TDA301 con bomba y automuestreador asociados.

Columnas: Agilent 1x PLaquagel-OH 40 plus 1 x PLaquagel-OH 60, 30 cm, 13 pm o

Agilent PLaquagel-OH Guard plus 2 x PLaquagel-OH Mixed, 30 cm, 8 pm

Eluyente: NaNO³0,2 M; NaH²PO⁴0,01 M ajustado a pH = 7,0

Caudal: 1,0 ml/min (nominal),

Temperatura: 30 °C (nominal)

Detector: Índice de refracción con presión diferencial y dispersión de luz en ángulo recto

Los datos se recopilaron y se analizaron utilizando el software Malvern/Viscotek "OminSec".

Espectroscopia de fotoluminiscencia

Las mediciones de fluorescencia se realizaron en un generador de imágenes de modo variable Typhoon Trio (GE) y los datos se procesaron utilizando el software ImageQuant TL.

Se prepararon películas delgadas para el análisis mediante revestimiento usando métodos de flujo de revestimiento por centrifugación sobre sustratos de vidrio o Si limpios preparados adecuadamente. Los espectros de fotoluminiscencia de las películas injertadas secas hibridadas con oligos complementarios fluorescentes se recogieron en un Typhoon Trio (GE).

Síntesis

El revestimiento polimérico descrito en el presente documento se puede preparar de diversas formas. En el Esquema 1A, se muestra un método para la síntesis del polímero de Fórmula (Illa).

Esquema 1A. Síntesis de una mezcla de PAZAM en estado de solución

(i) H²O/DMF, KPS, TEMED, 35 °C, 1,5 h

(ii) H²O, NaN^a, 65 °C, 2 h.

La síntesis de N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA) (1c) se describió en la publicación de patente de EE.UU. n°. 2011/0059865.

El polímero de acrilamida soluble en agua (PAZAM) se preparó mediante una polimerización de radicales libres iniciada químicamente. El polímero en bruto se purificó mediante precipitaciones consecutivas para producir PAZAM con pesos moleculares medios en número de 300-400 kDa. También se pueden obtener pesos moleculares medios en un intervalo más amplio, por ejemplo, en un intervalo de 30-600 kDa.

Se disolvió acrilamida (5,0 g, 70,3 mmol) en H²O desionizada (45 ml),y la mezcla se agitó bien con formación de vórtice para garantizar la disolución completa. En un matraz independiente, se añadió BRAPA (1,0 g, 3,61 mmol) a DMF (10 ml, 9,44 g), y se agitó la mezcla resultante con formación de vórtice para ayudar a la disolución. A continuación, se combinó una mezcla de la solución de BRAPA (9,25 g o 9,80 ml), la solución acuosa de acrilamida (47,5 ml) y agua (190 ml), y se agitó durante 5 min. A continuación, se filtró la solución a través de un filtro Whatman de 0,2 pm. Se añadió persulfato de potasio (125 mg, 0,46 mmol) a agua (2,5 ml), y se agitó la mezcla con formación de vórtice para disolver. Se añadió azida de sodio (11,5 g, 177 mmol) a agua desionizada (82,9 ml) y se agitó la solución con formación de vórtice para disolver. (La concentración final de NaN³(en la mezcla con polímero en bruto) es de 0,53 M, que corresponde a un exceso de 50 veces de NaN³en relación con la BRAPA disponible).

Se purgó la premezcla de BRAPA/acrilamida (~250 ml) con argón durante 20 min usando una pipeta de plástico. Se añadió a esta mezcla de monómeros tetrametiletilendiamina (TEMED) (pura, 273 pl) y persulfato de potasio (50 mg/ml; 2370 pl). Se agitó la mezcla y se calentó hasta 35 °C durante 1,5 horas y luego se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Manteniendo la agitación, se añadió Chainguard 1-15 (1390 pl) a la mezcla en bruto, seguido de la solución de azida sódica 2,03 M (82,9 ml). Para garantizar la inactivación completa de los radicales restantes generados durante la polimerización, se burbujeó aire a través de la mezcla durante 10 min. Se agitó la mezcla con polímero inactivada a 65 °C durante 2 h. A continuación, se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se pudo almacenar en este estado (a 4 °C) durante períodos prolongados.

Se añadió la mezcla en bruto (~335 ml) gota a gota a un gran exceso (~1,5 l) de IPA, mientras se mantenía una suave agitación. El polímero precipitó en forma de un sólido blanco que se recogió y se secó en la bomba. Se volvió a disolver el polímero parcialmente secado (~10 g) en H²O (100 ml) agitando la mezcla, a temperatura ambiente, durante al menos una hora para ayudar a la disolución. A continuación, se añadió gota a gota la solución viscosa a 1,5 l de IPA mientras se mantenía la agitación. Se filtró el sólido al vacío y luego se secó usando un alto vacío para producir PAZAM en forma de un sólido blanco (~5,6 g,> 95 %). Los espectros de RMN de 1H se muestran en la Figura 1A.

GPC (NaNO³0,2 M; NaH²PO⁴0,01 M ajustado a pH = 7,0; calibrada utilizando polisacárido pululano de distribución limitada con un peso molecular máximo de 130.000, una viscosidad intrínseca de 0,511 y un índice de refracción diferencial en nitrato de sodio 0,1 M de 0,147 ml/g. Se utilizó un valor para el índice de refracción diferencial (dn/dc) de 0,191 ml/g para calcular los datos de peso molecular de la muestra): PMn = 3,15 x 105 Da, PMp = 1,0 x 106 Da, PMp/Mn = 3,2 (Véase la Figura 1B). El polímero tenía una distribución del PM multimodal. La muestra de PAZAM fue difícil de filtrar antes de comenzar el análisis cromatográfico, lo que contribuyó a la amplia distribución del peso y provocó aberraciones de medición, aumentando la complejidad del análisis. La PAZAM seca se podía volver a disolver en agua a la concentración deseada, normalmente, del 0,01 al 12 % p/v.

Preparación de PAZAM lineal

Como alternativa, en el Esquema 1B, se muestra la síntesis de una PAZAM lineal (lllb).

Esquema 1B. Síntesis de una PAZAM lineal

Preparación de la premezcla de 1d/acrilamida: Se mezclaron 1a (915 mg), azida sódica (236 mg) y DMF (9 ml) en un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de una barra agitadora. Se dispuso el matraz en un baño DrySyn y se calentó la solución bajo una atmósfera de nitrógeno con agitación durante 2 h a 35 °C (temperatura del baño) para formar 1d. Se disolvió acrilamida (4,78 g) en agua desionizada y se añadió la solución 1d resultante a la solución de acrilamida y se agitó para mezclar. Se filtró la mezcla de reacción a través de un filtro de 0,2 pm.

Se colocó un matraz con reborde de 1 l en un baño DrySyn de 1 l en un agitador/placa calefactora con la tapa del matraz sujeta con abrazaderas. El matraz dotó de una paleta de agitación en forma de ancla a través de un casquillo de agitación y se conectó la paleta de agitación a un agitador superior. Se conectó un condensador de aire a una junta de ajuste rápido de la tapa del matraz y se unió un adaptador de tubo conectado a un colector de nitrógeno (pero sin flujo de gas en ese momento) a la parte superior del condensador. Se transfirió la solución de la mezcla de reacción filtrada al matraz preparado y se burbujeó nitrógeno a través de la solución usando una pipeta Stripette de 5 ml unida al colector de nitrógeno durante 30 minutos mientras se calentaba previamente la mezcla de reacción hasta 35 °C (temperatura del baño).

Preparación de la solución de polímero de PAZAM en bruto: Mientras se llevaba a cabo la desgasificación de la premezcla de acrilamida/1d, se disolvió persulfato de potasio (119 mg) en agua desionizada (2,4 ml) con agitación de formación de vórtice. Se encendió el flujo de nitrógeno sobre la parte superior del condensador para garantizar un flujo de nitrógeno sobre la mezcla de reacción desgasificada. Tras el proceso de desgasificación, se añadió TEMED (99 pl) a la mezcla de reacción mientras se agitaba a 200 rpm. Después, se añadió solución de persulfato de potasio a la mezcla de reacción agitada para iniciar la polimerización. Se siguió agitando a 200 rpm bajo nitrógeno a 35 °C (temperatura del baño) durante durante 1,5 h.

Inactivación de la polimerización: Mientras se llevaba a cabo la reacción de polimerización, se preparó solución de IPHA.HCl disolviendo IPHA.HCl (312 mg) en agua desionizada (2,80 ml). Una vez que la reacción de polimerización tuvo lugar durante 1,5 h, se retiró la línea de nitrógeno de la parte superior del condensador, dejando el recipiente de reacción abierto al aire. Se añadió una solución de hidróxido de sodio (1 M) a la mezcla de reacción agitada, seguida de la solución de IPHA.HCl preparada para inactivar la polimerización. Se agitó la mezcla de reacción inactivada a 200 rpm a 35 °C (temperatura del baño) durante otros 30 minutos.

Purificación del polímero de PAZAM: Se añadió la mezcla en bruto lentamente mediante una pipeta Stripette a 2-propanol agitado (750 ml) y se siguió agitando durante 1 h más. Se decantó el disolvente y se eliminó en forma de residuo que contenía azida de sodio. Se aplastó el polímero precipitado para exprimir el disolvente atrapado. Se volvió a disolver el polímero en agua desionizada (150 ml) y se añadió la solución con polímero lentamente mediante una pipeta Stripette a 2-propanol agitado (750 ml) y se mantuvo en agitación durante otra hora. Se decantó el disolvente nuevamente y se eliminó en forma de residuo que contenía azida de sodio. Se aplastó el polímero precipitado para exprimir el disolvente atrapado. El polímero resultante se secó en un desecador a alto vacío durante 18 horas y luego se transfirió a un recipiente etiquetado, tarado, y se almacenó a oscuras a temperatura ambiente.

Preparación de PAZAM ligeramente reticulada

De forma similar, se preparó una PAZAM ligeramente reticulada siguiendo el Esquema de síntesis general 1B con un procedimiento modificado como se describe en el presente documento.

Preparación de la premezcla de Id/acrilamida: Se mezclaron 1a (915 mg), azida sódica (106 mg) y DMF (9 ml) en un matraz de fondo redondo de 25 ml dotado de una barra agitadora. Se dispuso el matraz en un baño DrySyn y se calentó la solución bajo una atmósfera de nitrógeno con agitación durante 2 h a 35 °C (temperatura del baño) para formar 1d. Se disolvió acrilamida (4,78 g) en agua desionizada y se añadió la solución 1d resultante a la solución de acrilamida y se agitó para mezclar. Se filtró la mezcla de reacción a través de un filtro de 0,2 pm.

Preparación de la solución de polímero de PAZAM en bruto: Mientras se llevaba a cabo la desgasificación de la premezcla de acrilamida/1d, se disolvió persulfato de potasio (119 mg) en agua desionizada (2,4 ml) con agitación de formación de vórtice. Se encendió el flujo de nitrógeno sobre la parte superior del condensador para garantizar un flujo de nitrógeno sobre la mezcla de reacción desgasificada. Tras el proceso de desgasificación, se añadió TEMED (99 pl) a la mezcla de reacción mientras se agitaba a 200 rpm. Después, se añadió solución de persulfato de potasio a la mezcla de reacción agitada para iniciar la polimerización. Se siguió agitando a 200 rpm bajo nitrógeno a 35 °C (temperatura del baño) durante 1,5 h.

Inactivación de la polimerización y azidólisis: Mientras se llevaba a cabo la reacción de polimerización, se preparó solución de IPHA.HCl disolviendo IPHA.HCl (312 mg) en agua desionizada (2,80 ml). Además, se preparó una solución de azida de sodio disolviendo 575 mg de azida de sodio en 8 ml de agua desionizada. Una vez que la reacción de polimerización tuvo lugar durante 1,5 h, se retiró la línea de nitrógeno de la parte superior del condensador, dejando el recipiente de reacción abierto al aire. Tras retirar uno de los tapones de la tapa, se añadió una solución de hidróxido de sodio (1 M) a la mezcla de reacción agitada, seguida de la solución de IPHA.HCl preparada para inactivar la polimerización. Después, se añadió la solución de azida de sodio a la mezcla de reacción agitada. Se calentó la mezcla de reacción inactivada hasta 65 °C (temperatura del baño) y se siguió agitando a 200 rpm durante 2 h mientras se mantenía la temperatura.

Purificación del polímero de PAZAM: Se añadió la mezcla en bruto lentamente mediante una pipeta Stripette a 2-propanol agitado (750 ml) y se siguió agitando durante 1 h más. Se decantó el disolvente y se eliminó en forma de residuo que contenía azida de sodio. Se aplastó el polímero precipitado para exprimir el disolvente atrapado. Se volvió a disolver el polímero en agua desionizada (150 ml) y se añadió la solución con polímero lentamente mediante una pipeta Stripette a 2-propanol agitado (750 ml) y se mantuvo en agitación durante otra hora. Se decantó el disolvente nuevamente y se eliminó en forma de residuo que contenía azida de sodio. Se aplastó el polímero precipitado para exprimir el disolvente atrapado. El polímero resultante se secó en un desecador a alto vacío durante 18 horas y luego se transfirió a un recipiente etiquetado, tarado, y se almacenó a oscuras 4 °C.

Se obtuvo la RMN de 1H de la PAZAM ligeramente reticulada a partir de una mezcla de 100 pl de D²O con una solución de agua de 500 pl (3 %) del polímero (véase la Figura 1C).

Ejemplo 2

Preparación de un derivado de PAZAM

En el Esquema 2, se muestra la síntesis de un derivado de PAZAM. En primer lugar, se hace reaccionar BRAPA (1c) con una hidroxilamina protegida con f-Boc (2a) para formar un producto intermedio (2b), que se trata con ácido dicloroacético para formar un derivado de oxoamina de PAZAM (2c). 2c se puede injertar posteriormente con oligonucleótidos funcionalizados con aldehído para formar 2d.

Esquema 2. Síntesis de un derivado oxoamínico de PAZAM

Ejemplo 3

Revestimientos poliméricos

Revestimientos de PAZAM sobre sustratos de vidrio/celdas de flujo

Se depositaron soluciones acuosas de PAZAM sobre sustratos de vidrio, plástico o silicona. Los revestimientos se injertaron posteriormente (usando un oligonucleótido funcionalizado con alquino) y se hibridó un colorante complementario con la superficie injertada. Véanse las Figuras 2A y 2B. En la Figura 2B, se proporcionan los barridos típicos de fluorescencia. Luego, se injertó el polímero utilizando cebadores (oligonucleótidos de alquino) a diferentes concentraciones para proporcionar una superficie que contenía cuatro carriles a una densidad de cebador oligonucleotídico aproximadamente patrón (~15.000 cebadores/pm2) y cuatro carriles a una densidad de cebador superior (~50.000 cebadores/pm2). Las densidades de cebador pueden variar de 2.500 a 1 x 106 cebadores/pm2 dependiendo de la concentración de cebador de injerto seleccionada (Figura 2A).

En la Figura 3A, se muestra un barrido con escáner Typhoon de una celda de flujo de vidrio HiSeq (Illumina) revestida con PAZAM. La superficie del polímero se injertó utilizando cebadores (oligonucleótidos de alquino) a concentraciones crecientes demostrando el intervalo de densidades de los cebadores.(cebadores/pm2) que se puede lograr usando esta técnica (Figura 3B).

La Figura 4A ilustra un barrido con escáner Typhoon de un sustrato de vidrio que se revistió por centrifugación usando PAZAM. A continuación, se fabricó una celda de flujo de tamaño adecuado para encajarla en el analizador de genomas (Illumina) utilizando la oblea. Como se describe en las Figuras 2A y 2B, la superficie del polímero se injertó luego usando cebadores (oligonucleótidos de alquino) a concentraciones crecientes, demostrando el intervalo de densidades de cebadores (cebadores/pm2) que se pueden lograr en una superficie revestida por centrifugación mediante este enfoque (Figura 4B).

Las superficies de PAZAM revestidas por flujo fueron capaces de soportar la amplificación de los moldes de ADN sembrados. La Figura 5A ilustra que los grupos de ADN que crecieron a partir de los moldes en el canal de SFA patrón (carril 1) eran idénticos a los de los canales revestidos con PAZAM. Los grupos se desarrollaron usando la amplificación de grupos de 28 ciclos cBot ([PhiX] = 1 pM, molde corto, 80 pb), y luego se tiñeron con SYBR Green. Los resultados demostraron que este enfoque proporcionó una superficie potente capaz de soportar la amplificación de tipo puente (Figura 5B y Figura 5C).

6A y 6B muestran los grupos de ADN sobre una superficie de PAZAM revestida por centrifugación. Esto ilustra que las superficies de PAZAM revestidas por centrifugación fueron capaces de soportar la amplificación del molde de ADN sembrado, para dar grupos similares a los observados en la superficie de SFA patrón. Las imágenes típicas de los grupos se obtuvieron usando Manteia (objetivo X20, exposición de 1 mJ) y tinción con SYBR Green (Figura 6C).

Deposición de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM)

Materiales y equipamiento

El (3-aminopropil)trimetoxisilano (97 %) (APTMS) e isopropanol (reactivo de grado analítico) (IPA), la N,N,N',N',N"-pentametildietilentriamina (PMDETA), el sulfato de cobre (CuSO4.5H2O, solución al 4 % p/v) y el ascorbato de sodio (NaAsc) se adquirieron de Sigma Aldrich. Se preparó una solución acuosa de IPA al 50 % para los lavados. Se adquirió N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (Sulfo-HSAB) de Webscientific. Se preparó internamente una solución acuosa de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM) al 2 % p/v. La dilución tuvo lugar en un horno de hibridación durante la noche a 35 °C. Se prepararon internamente tampón de fosfato de potasio (solución acuosa 10 mM, pH = 7) (KPi) y solución de clorato de sodio y citrato de sodio (SSC). La limpieza de la celda de flujo se realizó utilizando un incinerador de plasma de oxígeno Emitech K105OX. Se utilizó un termociclador MJ Research PTC-200 (MJ) para la deposición en solución de sulfo-HSAB y PAZAM. Se utilizó una lámpara de mesa UV UVP serie XX para la reacción fotoquímica de sulfo-HSAB con PAZAM. Se usó un sensor de fotodiodo Ophir PD300-UV (20 pW-300 mW) para controlar la potencia UV administrada a la celda de flujo durante la reacción fotoquímica.

Método

Se colocó una celda de flujo sin procesar (Illumina) en el incinerador de plasma durante 10 minutos a 100 W. A continuación, se silanizó el sustrato de vidrio limpio mediante deposición de vapor. Se colocaron los accesos de la celda de flujo en la parte superior de dos viales de vidrio abiertos que contenían 100 pl de APTMS puro en un desecador de vacío. Se colocó el desecador al vacío y se incubó a 60 °C durante la noche. Tras retirarla del desecador de vacío, la celda de flujo se colocó en un MJ y se cebó con KPi (10 mM) durante 2 minutos a 75 pl.min-1. A continuación, se hizo fluir una solución de sulfo-HSAB 21,1 mM en KPi 10 mM durante 2 minutos a 100 pl.min-1. Se realizó una incubación estática a oscuras durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Luego, se realizaron lavados posteriores con agua desionizada, solución de IPA al 50% y agua desionizada durante 2 minutos a 100pl.min'1 respectivamente, asegurándose de que no se introdujera ningún espacio de aire en los canales de la celda de flujo. A continuación, se hizo fluir la solución de PAZAM al 2 % en los canales durante 1 minuto a 100 pl.min-1, asegurándose de que no se introdujera ningún espacio de aire en los canales de la celda de flujo. Tras retirarla del MJ, se iluminó la celda de flujo con UV usando la lámpara UV. La distancia entre la fuente de UV y la celda de flujo fue de 1 cm. El tiempo de exposición se ajustó de modo que se administraron 15 J por centímetro cuadrado de área a la celda de flujo. Posteriormente, la celda de flujo se lavó con agua desionizada, IPA al 50 %, agua desionizada y KPi (10 mM) durante 2 minutos a 100pl.min'1 respectivamente. A continuación, la celda de flujo se funcionalizó haciendo reaccionar oligonucleótidos de alquino en KPi (10 mM) con PMDETA, sulfato de cobre y NaAsc (solución acuosa de 500 mg.mf 1) a 60 °C durante 30 minutos. La presencia de los oligonucleótidos de alquino sobre la superficie se confirmó mediante tinción con un oligonucleótido secuenciado complementario funcionalizado con un colorante fluorescente en el extremo 5' de los cebadores de alquino.

Resultados

La detección de fluorescencia se realizó en un escáner fluorescente Typhoon Trio (GE Healthcare). Se muestran una imagen típica (Figura 7B) y un gráfico que indica las medianas de las intensidades a lo largo de los canales (Figura 7A).

Se completó una serie de 2 x 26 ciclos sobre una celda de flujo HiSeq de 2,6 mm (Illumina). El primer informe base indicó que se detectaron grupos en todos los carriles (véanse las Figuras 8A a Figura 8C). Los grupos todavía estaban presentes en los canales revestidos con PAZAM después de 26 ciclos. Los resultados también mostraron que los grupos de PAZAM pudieron secuenciarse en el protocolo de extremo emparejado de Illumina y arrojar datos durante 52 ciclos (es decir, un par de 26 ciclos). Véase la Figura 8D a la Figura 8I.

Revestimiento por centrifugación con PAZAM sobre un sustrato sólido

En un experimento típico, primero se limpió un sustrato de vidrio con patrón incinerando durante cinco minutos en una incineradora de plasma (Emitech K105OX) a 100 W. Tras limpiar, se silanizó el sustrato colocándolo en un desecador de vacío que contenía 0,5 ml de (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) en viales abiertos. Se colocó el desecador a presión reducida y se incubó a 60 °C durante una hora. Tras la silanización, se abrió el desecador y se recuperó el sustrato. A continuación, se colocó el sustrato boca abajo en una placa de Petri que contenía una solución de 5 mg/ml de N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (SHSAB) en tampón de fosfato de potasio (KPi) 10 mM a pH 7,0. Tras una hora a temperatura ambiente, el sustrato se enjuagó con agua y se secó con nitrógeno. Se colocó el sustrato en el aparato de revestimiento por centrifugación y se pipeteó una solución de PAZAM al 2 % p/v en agua sobre el sustrato. Tras el revestimiento por centrifugación, se irradió el sustrato inmediatamente con radiación UV de 365 nm (UVP, lámpara XX15L) durante 30 minutos. A continuación, se enjuagó la superficie abundantemente con agua y se secó con nitrógeno. Tras sellar con un cubreobjetos, después se funcionalizó la superficie haciéndola reaccionar con oligonucleótidos de alquino (3 x 10'9) en KPi 10 mM pH 7,0 (1,429 ml), junto con N,N,N',N',N"-pentametildietilentriamina (PMDETA, 13,14 ul, 6,3 x 10‘5 moles), sulfato de cobre (CuSO4.5H2O, solución al 4 % p/v, 7,49 pl, 1,2 x 10‘6 moles) y ascorbato de sodio (4,75 pl de una solución de 500 mg/ml en agua, 1,2 x 10‘5 moles) a 60 °C durante 30 minutos. La presencia de los oligonucleótidos de alquino sobre la superficie se confirmó mediante tinción con oligonucleótido secuenciado complementario funcionalizado con un colorante rojo Texas fluorescente en el extremo 5'. Como se muestra en la Figura 7A, la señal fluorescente podría detectarse barriendo en un escáner fluorescente Typhoon Trio (GE Healthcare).

La Figura 9 muestra un sustrato revestido por centrifugación funcionalizado con oligos de alquino hibridados con oligonucleótidos fluorescentes complementarios. El color oscuro indica la presencia de oligonucleótidos en una capa revestida con polímero por centrifugación.

Ejemplo 4

Preparación de la superficie funcionalizada con alquino

Esquema 3. Vías de síntesis sugeridas para la preparación de superficies funcionalizadas con alquino

Como se describe en el presente documento, se pueden utilizar diversos grupos funcionales para el bloqueo de polímeros. El Esquema 3 ilustra diversas vías de síntesis sugeridas para preparar una superficie funcionalizada con alquino.

Un enfoque alternativo implica el uso del agente de acoplamiento fotoactivo N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HSAB). El sulfo-HSAB es un agente de reticulación bifuncional disponible en el mercado que comprende una aril-azida fotoactiva y una unidad de NHS activada. Tras la exposición a la luz ultravioleta (~250-374 nm), la aril-azida genera un nitreno con la liberación de nitrógeno. Esta especie altamente reactiva puede sufrir varias reacciones de inserción rápidas.

Ejemplo 5

Preparación de superficie fotoactiva

Esquema 4. Vía utilizada para generar una superficie fotoactiva

,

1 -24 h

A P T S

El Esquema 4 muestra una vía para preparar una superficie fotoactiva. La superficie se trata previamente con APTS (metoxi o etoxisilano) y se hornea para formar una monocapa (o multicapa) de grupo amina. Después, los grupos amina se hacen reaccionar con sulfo-HSAB para formar un derivado de azido. La activación por UV a 21 °C con de 1 a 30 J/cm2 de energía genera una especie de nitreno activo, que puede sufrir fácilmente varias reacciones de inserción con la PAZAM.

Los hallazgos iniciales indican que este enfoque, que implica el uso de una superficie fotoactiva y mezclas de PAZAM purificadas, se puede emplear para revestir celdas de flujo GA convencionales (Illumina) y los revestimientos resultantes se pueden utilizar para desarrollar grupos. Adicionalmente, los polímeros se pueden depositar (p. ej., mediante revestimiento por centrifugación, mojado, inmersión, pulverización, etc.) sobre una oblea fotoactiva preparada con resultados similares. Una mezcla de PAZAM revestida, derivada como se describe en el Esquema 4 anterior, se ha llevado a la secuenciación y, a continuación, se detalla un resumen de la ejecución.

Agentes de reticulación alternativos

Además del sulfo-HSAB, también se cribaron la fotoestabilidad y la eficacia de otros tres agentes de reticulación, y se compararon con las del sulfo-HSAB.

NHS-Diazirina 3BA ATFB

(Acido 4-benzoilbenzoico, áster succinimidílico) Acido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico ester succimmidi ico

Los agentes de reticulación alternativos se cribaron utilizando el flujo de proceso convencional con una celda de flujo GA (Illumina). Los agentes de reticulación ensayados incluyen Sulfo-HSAB, diazirina, BBA y ATFB. Las reacciones de acoplamiento se realizaron a 20 °C en DMF a una concentración de aproximadamente 20 mM. Tras la deposición de APTES, se trataron carriles alternos de una celda de flujo funcionalizada con aminosilano con una solución acuosa/DMF 20 mM de cada uno de los agentes de reticulación. Los canales se incubaron durante un tiempo idéntico al del canal de control de sulfo-HSAB. Tras sucesivos lavados, el revestimiento con PAZAM y la exposición UV para fijar el polímero a la superficie, se injertaron los carriles con los presentes oligonucleótidos cebadores patrón y se tiñeron con una secuencia de oligonucleótido fluorescente complementaria. Los resultados posteriores a la hibridación con rojo Texas se resumen en las Figuras 10A y 10B.

El rendimiento de los tres agentes de reticulación alternativos se evaluó midiendo la señal fluorescente de los oligonucleótidos complementarios hibridados utilizando un generador de imágenes Typhoon. Los resultados fueron claros, siendo las densidades de los cebadores superficiales medidas inferiores a la mitad de las registradas para el sulfo-HSAB. Para cualquiera de estos agentes de reticulación fotoactivos (incluyendo el sulfo-HSAB), el mecanismo de inserción para formar un enlace covalente con el polímero revestido probablemente puede activarse térmicamente.

Ejemplo 6

Preparación de superficies insaturadas y reticulación térmica de PAZAM

Otro enfoque alternativo para el bloqueo de polímeros es la reticulación térmica de PAZAM, lo que incluye funcionalizar la superficie del sustrato con grupos insaturados tales como alqueno. El Esquema 5 ilustra algunas vías de síntesis para generar superficies funcionalizadas con alqueno.

Esquema 5. Vía utilizada para generar una superficie funcionalizada con acrilamida

KPi 10 mM pH 7,0

60 min a 20 °C

QC

_grupo

Primero se trató la superficie del sustrato con 3-aminopropiltrimetoxoisilano (APTMS) (5a) para formar una superficie funcionalizada con amina. Luego, se hicieron reaccionar los grupos funcionales amina con cloruro de acriloílo (5b) o éster de acriloil-NHS activado (5c). Posteriormente, se introdujo la PAZAM en la superficie insaturada bombeando una solución acuosa de PAZAM al 1-2 % en la celda de flujo o aplicando un revestimiento por centrifugación sobre un portaobjetos de vidrio abierto. La cantidad de PAZAM que está presente en la solución acuosa bombeada a una celda de flujo puede ser, por ejemplo, 0,1-10 %. El sustrato se incubó a una temperatura elevada, normalmente, a 60 °C. En este proceso, los grupos azida sobre la PAZAM reaccionaron con los grupos alqueno insaturados sobre la superficie. En este proceso pueden intervenir diferentes mecanismos, tales como los sugeridos por Krülle et al., Tetrahedron: Asymmetry (1997), 8: 3087-3820.

Después de un lavado con agua o tampón acuoso para eliminar el exceso de PAZAM sin reaccionar, la superficie se puede injertar en cebadores de ácido nucleico. Se puede utilizar la técnica convencional en todos los demás procesos posteriores, p. ej., QC o crecimiento de grupos. La superficie tiene características de rendimiento similares a las del polímero que se bloquea mediante activación UV. Por ejemplo, se puede injertar con diferentes concentraciones de cebadores de injerto para lograr diferentes densidades de cebadores. También se puede deshidratar, almacenar en seco y volver a hidratar, manteniendo un rendimiento de superficie activa (véase la Figura 12).

Ejemplo 7

Aplicación de revestimiento polimérico en grupos y secuenciación

En las Figuras 8A-I, se completó una serie de 2 x 26 ciclos utilizando una celda de flujo HiSeq revestida con PAZAM (Illumina). El primer informe base indicó que se detectaron grupos en todos los carriles. Además, todavía había grupos de PAZAM presentes tras 26 ciclos. Los grupos de PAZAM finalizaron una lectura de extremo emparejado y arrojaron datos durante 52 ciclos completos (es decir, un par de 26 ciclos).

La superficie revestida con polímero preparada mediante el método de reticulación térmica también es activa para el crecimiento y la secuenciación de grupos usando los métodos convencionales descritos en el presente documento. La Figura 13A muestra grupos desarrollados sobre una superficie reticulada térmicamente con PhiX V3 como molde, fotografiados en un Hi-Seq (Illumina). La Figura 13B ilustra las métricas de secuenciación obtenidas de una serie de 2 x 26 ciclos en un Hi-Seq con química de secuenciación convencional.

Ejemplo 8

Aplicación de revestimiento polimérico en formación de patrones

Además de revestir celdas de flujo uniformes, la generación de una capa fotoactiva también se puede utilizar para formar una superficie con patrón. Se pueden utilizar comúnmente técnicas de microfabricación para crear "islas" de funcionalidad amino en un "mar" de material inerte o pasivo.

Una aril-azida, como sulfo-HSAB, se puede ubicar en el núcleo amino para crear una capa fotoactiva con patrón. El revestimiento de esta superficie con una mezcla de polímeros como PAZAM seguido de la exposición a los rayos UV y el posterior lavado deja una matriz con patrón de polímero. Este proceso se demuestra en la Figura 11A.

La región de fondo se deja libre de cualquier polímero fotoacoplado, porque el agente de reticulación solo se encuentra en el parche. La reacción de inserción de radicales se limita a una monocapa en la superficie, lo que minimiza la propagación incontrolada de radicales. También se puede acceder fácilmente a las aril-azidas funcionalizadas con unidades de silano y fosfato a partir de materiales de partida disponibles en el mercado, permitiendo el anclaje a una amplia variedad de tipos de parches (véase la Figura 11A). Se observó la deposición de polímero preferencial en los parches de elementos funcionalizados utilizando un portaobjetos con elementos de vidrio desnudo y una región intersticial dorada (Figura 11B). El lado derecho muestra una imagen de fluorescencia de Manteia y el lado izquierdo muestra una imagen del Typhoon del portaobjetos, indicando las zonas más oscuras un mayor revestimiento polimérico.

De forma similar, el método de reticulación térmica también permite la formación de parches con patrón de polímero funcional cuando se crea un patrón en la capa funcional subyacente. Por ejemplo, se pueden preparar parches de aminosilanos con patrón usando técnicas litográficas comunes. Normalmente, esto implica revestir un sustrato con una capa protectora, y exponerlo luego revelando la capa protectora para dejar parches desnudos en el sustrato. Los parches desnudos luego se funcionalizan con el silano, seguido de la retirada de la mayor parte de la capa protectora y dejando atrás pequeños parches de sustrato funcionalizado con amino con una zona intersticial en masa de sustrato no funcional. Estos parches se pueden funcionalizar luego con los grupos alqueno insaturados como se muestra en el Esquema 5 , y luego incubarse con PAZAM. La superficie resultante se compone de pequeños parches de PAZAM en una cuadrícula predefinida, que luego puede admitir el crecimiento de grupos sobre una matriz con patrón definida. En la Figura 14, se muestra una superficie hecha como se ha descrito anteriormente para soportar la amplificación de tipo puente de forma selectiva en las regiones con patrón. Los elementos son de 450 nm de diámetro con un paso de 1,4 |jm. Los grupos se desarrollaron usando un kit Illumina V3 PE cBot con una molde de ADN humano 1 pM. La superficie fue fotografiada con Sybr green después de la amplificación.

Otros métodos para fabricar superficies con patrón que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos de EE.UU. con n.° de serie 13/492.661 y 13/661.524.

Ejemplo 9

Revestimiento de perlas con PAZAM

Se pueden utilizar diversos métodos para aplicar un revestimiento polimérico a las perlas. Un enfoque descrito en el presente documento incluye el uso de una superficie activable por UV para el bloqueo del polímero. Un enfoque alternativo descrito en el Ejemplo 11 incluye el uso de una superficie funcionalizada con alqueno o acrilamida para la reticulación térmica del polímero. En el enfoque de base térmica, la perla generalmente se expone a soluciones de lavado que contienen un inhibidor de la polimerización (por ejemplo, BHT, dietilhidroxilamina o TEMPO, etc.) tras la funcionalización con grupos alqueno o acrilamida. Esto se puede hacer para evitar que las perlas se agreguen debido a la polimerización prematura de los grupos alqueno o acrilamida.

Tras revestir las perlas con PAZAM, las perlas se lavaron para retirar el exceso de PAZAM sin unir. La capa de PAZAM tenía aproximadamente 20 nm de espesor tras el lavado. A continuación, se injertaron las perlas en cebadores (mezclas de P5/P7) haciendo reaccionar los grupos azida en PAZAM con un oligonucleótido modificado con alquino en 5'. También se puede utilizar química de injerto alternativa, que incluye, pero sin limitación: hacer reaccionar los grupos amina del polímero con oligonucleótidos modificados con NHS 5'; hacer reaccionar los grupos oxo-amina del polímero con oligonucleótidos modificados con aldehído 5' para formar oxima; hacer reaccionar los grupos tiol del polímero con oligonucleótidos modificados con maleimida 5'; metátesis cruzada de olefinas (reacción de los grupos alqueno terminales tanto del polímero como de los oligonucleótidos modificados en 5' en presencia de un catalizador de metátesis); hacer reaccionar los grupos amina del polímero con oligonucleótidos modificados con cloruro cianúrico 5'; etc. El exceso de cebadores no injertados a la PAZAM sobre la perla se puede lavar, dejando perlas con una capa de PAZAM-oligo encima de ellas.

Se pueden utilizar varios métodos para realizar el control de calidad de las perlas revestidas con polímero antes de la aplicación en la superficie del sustrato. Un método es teñir la PAZAM directamente con tintes (por ejemplo, Fosfina Dylight488). Otro método es marcar los oligonucleótidos injertados con complementos inversos marcados con colorante de los oligonucleótidos sobre PAZAM. Las perlas marcadas se pueden medir mediante citometría de flujo o se pueden verter sobre una superficie y luego analizar mediante microscopía óptica (incluyendo la microscopía de luz fluorescente). También, se puede utilizar una alícuota de las perlas en una prueba destructiva para evaluar cómo se comportarán las perlas en un ensayo. Un ejemplo es cargar una alícuota sobre un sustrato, realizar la secuenciación y determinar si la mayor parte de las perlas es lo suficientemente buena para usarlas para cargarlas en muchas matrices.

Se pueden utilizar diferentes tipos de sustratos grabables para la carga de perlas, por ejemplo, silicio, plástico (Zeonor®) y plástico impregnado con aditivos (p. ej., SiO²o negro de humo). La Figura 15 ilustra las matrices de PAZAM con patrón preparadas cargando perlas revestidas con PAZAM en portaobjetos Zeonor transparentes.

Existen varias ventajas de usar perlas revestidas con polímero para la preparación de matrices con patrones. En primer lugar, el enfoque de las perlas es rentable y ahorra tiempo. El enfoque de la carga de perlas permite la preparación de una superficie de matriz con alta densidad en comparación con los enfoques convencionales de revestimiento e injerto de celdas de flujo. Un enfoque de convención ilustrativo utiliza un dispositivo que administra diferentes reactivos a la celda de flujo y permite controlar la temperatura de la celda de flujo, lo que da hace que solo se injerte una fracción de los cebadores bombeados, produciendo una cantidad sustancial de residuos. Además, el procedimiento de carga de perlas descrito en el presente documento es mucho más rápido que el procedimiento convencional y permite aplicaciones comerciales a gran escala.

Ejemplo 10 (Ejemplo de referencia)

Polímeros fotoactivos

En el presente documento, se describe el uso de polímeros alternativos solubles en agua que son capaces de soportar la amplificación de tipo puente y la posterior química de secuenciación por síntesis (SBS). Además, el polímero se puede aplicar fácilmente a superficies usando varias técnicas diferentes. En particular, el desarrollo de un polímero lineal que se pueda caracterizar completamente antes de ser aplicado a la superficie es beneficioso para limitar la posible variación de la calidad del revestimiento de la superficie. Además, el enfoque descrito en el presente documento incluye la capacidad de utilizar estrategias de revestimiento alternativas, incluyendo la inmersión, la pulverización y el revestimiento por centrifugación del polímero.

El Esquema 6 muestra la preparación de un polímero lineal que se puede preparar utilizando materiales de partida disponibles en el mercado. El polímero se puede utilizar para revestir, de una manera controlable, obleas de vidrio y silicio que permitan una caracterización completa tanto del polímero en solución como de la oblea revestida antes de la fabricación en celdas de flujo. Este método también permite funcionalizar una o ambas superficies de la celda de flujo según sea apropiado.

Esquema 6. Síntesis de un polímero lineal fotoactivo

La polimerización se puede realizar a gran escala utilizando técnicas tradicionales en fase de solución. La acrilamida y un nuevo monómero 6c (sintetizado mediante un procedimiento sencillo de una sola etapa) se pueden polimerizar usando polimerización por radicales libres análoga al procedimiento actual para preparar PAZAM.

Una modificación implica el uso de perfluoroaril-azidas (Keana, J. F. W.; Cai, S. X. "New Reagents for Photoaffinity Labeling: Synthesis and Photolysis of Functionalized Perfluorophenyl Azides". J. Org. Chem. 1990, 55, 3640-3647). Estas especies muestran una tendencia reducida a experimentar la expansión del anillo tras la generación del nitreno. Como resultado de ello, la reacción generada por los rayos UV es más limpia con la formación exclusiva de productos de inserción.

Esquema 7. Síntesis de un monómero de perfluoroaril-azida para preparar un polímero fotoactivo El uso de aril-azidas como agentes de mareaje se remonta a 1969. (Fleet, G. W. J.; Porter, R. R.; Knowles, J. R. "Affinity Labeling of Antibodies with Aryl Nitrene as Reactive Group". Nature 1969, 224, 511-512). En la presente solicitud, se aprovecha la doble reactividad de estos grupos funcionales; como pareja en la cidoadición 1,3-dipolar (para el injerto de los oligos) y como agente de fotoacoplamiento tras la generación activada por UV de una especie de nitreno singlete. La ventaja de utilizar un monómero con actividad UV es que la reacción es "limpia" (solo productos de inserción), quimioselectiva y ubicada con el entorno del polímero proporcionando una gran cantidad de enlaces insertables.

Este enfoque elimina la necesidad de realizar cualquier etapa de funcionalización posterior a la deposición. Una vez revestida con el polímero previamente injertado, la oblea se puede cortar en cubitos, se colocó un cubreobjetos y se realizó un etapa de QC para determinar/confirmar el número de cebadores de superficie disponibles.

El lote purificado se divide luego con una parte (aproximadamente el 80 %) injertada en solución usando, por ejemplo, 1,3-cicloadición de Huisgen catalizada por cobre (Figura 16: camino 2). El polímero injertado se puede recombinar luego con el material que no ha reaccionado para proporcionar una mezcla con polímero que contenga tanto cebadores de extremos emparejados como grupos fotoactivos libres capaces de bloquearse tanto en la superficie de la oblea como en las cadenas con polímero vecinas (véase la Figura 16).

Este enfoque de fotoacoplamiento mejora la resistencia del polímero para soportar tanto el crecimiento de grupos como las etapas de secuenciación. Trabajos previos han demostrado que las mezclas dinámicas de acrilamida sin silicio son capaces de soportar la SBS, pero que muestran "arrugas" no deseadas apenas visibles tras la agrupación y se vuelven más pronunciadas durante la secuenciación. El uso del enfoque de fotoacoplamiento desvelado en el presente documento puede mejorar el anclaje del polímero a la oblea al tiempo que disminuye la flexibilidad excesiva y mantiene el acceso a los cebadores injertados.

Ejemplo 11

Revestimiento de perlas con PAZAM mediante reticulación térmica

Se obtuvieron perlas de sílice en forma de una suspensión de sólidos al 10 % en peso de Bang's Labs of Fishers, IN (PN SS04N/9348, pero cabe señalar que se pueden utilizar muchas otras composiciones y tamaños de perlas de manera similar). Se transfirió una alícuota de 1 ml (100 mg) a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. El tubo se centrifugó en una centrífuga de mesa (5000 ufr) durante 30 segundos para centrifugar las perlas. La solución se retiró por aspiración. A continuación, se añadió 1 ml de acetonitrilo (Aldrich Pn 34967) al tubo, el tubo se agitó durante 30 segundos para homogeneizar la suspensión y luego se centrifugó de nuevo. Este proceso se repitió 5 veces para intercambiar el disolvente. Por último, se retiró el último disolvente por aspiración (tras la centrifugación para centrifugar las perlas).

En un tubo separado de 15 ml, se añadieron 5 ml de acetonitrilo y 100 pl de 3-acrilamidopropiltrimetoxisilano (Gelest PN SIA0146.0). Esta solución se agitó con formación de vórtice durante 15 segundos para mezclar la solución. A continuación, se añadió un inhibidor de la polimerización a la solución para evitar una polimerización prematura: se añadieron 2 pl de N,N-dietilhidroxilamina (Aldrich PN 471593) a los 2 ml de solución de silano para obtener una concentración de inhibidor de 1000 ppm. A continuación, se añadió a las perlas 1 ml de la solución de silano con solución inhibidora. El tubo se agitó con formación de vórtice durante 30 segundos para homogeneizar la suspensión de perlas en la solución de silano. A continuación, se dejó que las perlas reaccionaran con el silano durante 30 minutos a temperatura ambiente en un mezclador de rosticería. El tubo de perlas se centrifugó luego para centrifugar las perlas y la solución se retiró por aspiración. Después, se intercambiaron las perlas con disolvente en acetonitrilo que contenía 1000 ppm de inhibidor de la polimerización de N,N-dietilhidroxilamina de una manera similar a la descrita anteriormente.

Tras la silanización, se intercambiaron las perlas con disolvente en etanol que contenía 1000 ppm del inhibidor de la polimerización (mediante 5 centrifugaciones sucesivas, aspiración y nuevas adiciones de disolventes). A continuación, se intercambiaron las perlas con disolvente en acetona que contenía 1000 ppm del inhibidor de la polimerización. Por último, se retiró la acetona residual por aspiración (tras la centrifugación de las perlas), se tapó el tubo de perlas con una toallita kimwipe fijada con una banda de caucho para garantizar que las perlas secas no se escaparan a la cámara de evacuación. A continuación, se colocaron las perlas en un horno de vacío calentando previamente hasta 40 °C y se sometieron a vacío doméstico (aproximadamente 3,59 kPa (27 Torr)) durante 1 hora. A continuación, se retiraron las perlas del horno de vacío y se añadió 1 ml de agua de calidad HPLC que contenía 1000 ppm del inhibidor de la polimerización. Después, se homogeneizó la suspensión de perlas agitando con formación de vórtice durante 30 segundos.

A un tubo Eppendorf de 1,5 ml independiente, se añadieron 10 ul de la suspensión acuosa de perlas de la etapa anterior. A continuación, se añadió a las perlas 1 ml de una solución al 1,0 % en peso con polímero de PAZAM en agua de calidad HPLC. La solución se homogeneizó agitando con formación de vórtice durante 20 segundos en un dispositivo vorticial de sobremesa, y luego se centrifugó a 7000 ufr durante 90 segundos para obtener las perlas. La solución con polímero de PAZAM se retiró luego por aspiración. A continuación, se añadió 1 ml de una solución de PAZAM al 2,0 % en peso a las perlas y la solución se homogeneizó agitando en un dispositivo vorticial de sobremesa durante 20 segundos. A continuación, se injertó térmicamente la PAZAM en el silano haciendo reaccionar el tubo a 60 °C durante 1 hora. Después del injerto térmico de PAZAM a las perlas, las perlas se lavaron 5 x 1 ml de agua de calidad HPLC (usando el método de intercambio de disolvente descrito anteriormente) a temperatura ambiente y luego 3 x 1 ml de agua de calidad HPLC previamente calentada (aproximadamente a 40 °C). Las perlas se diluyeron en 100 |jl de agua de calidad HPLC para preparar una suspensión de sólidos al 10 % en peso.

Los oligonucleótidos P% y P7 con grupos funcionales alquinilo 5' se sintetizaron por separado usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos convencionales (o, como alternativa, se adquirieron en el mercado de proveedores de síntesis de oligonucleótidos). La solución de oligonucleótidos se proporcionó en forma de una solución 100 jM en agua de HPLC.

El injerto de los oligonucleótidos funcionalizados con alquinilo a la PAZAM funcionalizada con azido se realizó de la siguiente manera. Se añadieron, a la alícuota de 100 j l del 10 % en peso de sólidos de la solución de perlas injertadas con PAZAM, 800 j l de tampón PBS x1 a pH 7,4 y 100 j l de la solución de oligonucleótidos. Se roció esta solución con gas nitrógeno durante 10 minutos a un caudal de nitrógeno de burbujeo suave. A continuación, se añadieron 2 j l de PMDETA puro (Aldrich PN 369497). A continuación, se añadieron 17 j l de una solución acuosa 160 mM de sulfato de cobre (Aldrich PN C2284). La solución se volvió violeta cuando se mezcló agitando con formación de vórtice durante 20 segundos. Por último, se añadieron 25 j l de una solución de 40 mg/ml de ascorbato de sodio (Aldrich PN A7631) en agua de HPLC, y la solución se volvió azul después de mezclar con formación de vórtice durante 20 segundos. Se dejó reaccionar la solución a 60 °C durante 1 hora. A continuación, las perlas se centrifugaron y la solución de reacción se retiró por aspiración. Las perlas se lavaron en tampón PBS x1 (pH 7,4) de una manera similar a la descrita anteriormente (intercambio de disolvente usando 5 lavados de 1 ml del tampón).

Las perlas oligofuncionalizadas se cargaron luego en un portaobjetos de micromatriz vacío que se funcionalizó con orificios de 1,2 micrómetros. Los portaobjetos se prepararon como se describe en el documento US 6.770.441. Las perlas se cargaron de la siguiente manera: se limpió previamente el portaobjetos que contenía pocillos sumergiéndolo en NaOH 0,1 N durante 5 min a temperatura ambiente, luego se lavó vigorosamente haciendo fluir agua de calidad HPLC (aproximadamente 100 ml) y se secó bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, se añadieron 10 j l de etanol de prueba 200 (Aldrich PN E7023) a los 100 j l de solución de perlas. La solución de perlas se aplicó luego al portaobjetos de microscopio mediante una pipeta. A continuación, se colocó el portaobjetos en un horno de vacío previamente calentado hasta 40 °C y los portaobjetos se dejaron evaporar durante 30 min. Se retiraron las perlas residuales de la superficie del portaobjetos del microscopio mediante la aplicación manual suave de una toallita kimwipe saturada con etanol.

A un portaobjetos preparado de esta manera, se le añadió una solución 10 jM de oligonucleótido marcado con colorante 5' (preferentemente Cy5) en tampón SSC x5 (Aldrich PN S6639) con el complemento inverso al oligo que se inmovilizó en la perla injertada con PAZAM. A continuación, se cubrió el portaobjetos con un cubreobjetos de vidrio. Se dejó que el portaobjetos se hibridara a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se retiró el cubreobjetos y se lavó el portaobjetos haciendo fluir abundantes cantidades de tampón SSC x5 (aproximadamente 100 ml). Por último, se añadieron al portaobjetos 100 j l de tampón SSC x5 y luego se colocó un cubreobjetos, y se tomaron imágenes del portaobjetos en un Typhoon FLA 9500 de GE, realizando el barrido en la configuración del canal de tinte Cy5 con una configuración de 500 PMT.

Se añadió, a otro portaobjetos preparado de esta manera, una junta de caucho y otro portaobjetos de microscopio que se taladró previamente con la ubicación adecuada de los orificios en el vidrio para permitir la introducción de líquido a través de un instrumento de secuenciación Illumina HiSeq. Luego se desarrollaron grupos de ADN en los portaobjetos y los grupos se secuenciaron según las instrucciones del fabricante para e1HiSeq 2000 (Illumina Inc., San Diego, CA). Se demostró que este portaobjetos podía secuenciar hasta 150 pb de muestra de ADN por grupo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sustrato que tiene una superficie que comprende un revestimiento polimérico unido covalentemente a la misma, en donde el revestimiento polimérico comprende una unidad recurrente de Fórmula (Ia) y una unidad recurrente de Fórmula (II):

en las que:

R1 es hidrógeno o alquilo C¹-C⁶;

RA es azido;

cada uno de R4, R4', R5 y R5' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O)R6, -OC(O)R6, -C(O)NR7R8 y -NR7R8;

R6 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C¹-C⁶, cicloalquilo C³-C¹⁰, hidroxialquilo C¹-C⁶, arilo C6-C¹⁰, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heterociclilo de 3 a 10 miembros;

cada uno de R7 y R8 es independientemente H o alquilo C¹-C⁶, o R7 y R8 están unidos junto con el átomo o los átomos a los que están fijados para formar un heterociclo de 3 a 10 miembros; y

o es un número entero entre 1-50.

2. El sustrato de la reivindicación 1, en donde R1 es H.

3. El sustrato de la reivindicación 1, en donde el revestimiento polimérico comprende un polímero de Fórmula (III):

en la que R5 es H o alquilo C¹-C⁶;

n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y

m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.

4. El sustrato de la reivindicación 3, en donde

cada R1 y R5 es H; o es 5;

n es un número entero en el intervalo de 1 a 20.000; y

m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.

5. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el revestimiento polimérico está unido covalentemente a una serie de grupos funcionales fijados a dicha superficie, en donde los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en alqueno, alquino, nitreno, aldehido, hidrazina, éster activado, éter de glicidilo, amina, maleimida y éster benzoílico con un sustituyente fosfina en la posición orto para la ligadura de Staudinger.

6. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la superficie comprende tanto regiones revestidas con polímero como regiones inertes que no están revestidas con polímero; y en donde las regiones inertes se seleccionan del grupo que consiste en regiones de vidrio, regiones de metal, regiones de máscara y regiones intersticiales.

7. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la superficie del sustrato comprende pocillos abiertos.

8. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sustrato es una perla.

9. Un método de preparación de un revestimiento polimérico inmovilizado en una superficie de un sustrato, comprendiendo dicho método: poner en contacto un revestimiento polimérico descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 0 con una superficie de un sustrato, en donde la superficie comprende una pluralidad de grupos funcionales, formando de ese modo una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie y en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales de la superficie.

10. El método la reivindicación 9, en donde los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden azidas fotoactivables.

11. El método de la reivindicación 9, en donde los grupos funcionales sobre la superficie del sustrato comprenden alquino, alqueno o acrilamida.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la pluralidad de grupos funcionales están dispuestos sobre la superficie del sustrato para formar una pluralidad de regiones revestidas con polímero y una pluralidad de regiones inertes después de revestir la superficie con la capa de polímero.

13. Un método de preparación de una matriz de perlas que comprende:

formar una pluralidad de grupos funcionales sobre la superficie de una o más perlas; y

poner en contacto un revestimiento polimérico descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con las perlas para formar una capa de revestimiento polimérico sobre la superficie de las perlas, en donde el revestimiento polimérico se une covalentemente a los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas.

14. El método de la reivindicación 13, en donde los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden alquenos o acrilamidas.

15. El método de la reivindicación 13, en donde los grupos funcionales sobre la superficie de las perlas comprenden grupos fenil-azida.