KR20130040865A

KR20130040865A - 염수 조류로부터 단백질의 선택적 추출

Info

Publication number: KR20130040865A
Application number: KR1020127028942A
Authority: KR
Inventors: 아니켓 칼
Original assignee: 헬리아에 디벨롭먼트, 엘엘씨
Priority date: 2010-04-06
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2013-04-24
Also published as: MX2012011559A; EP2555633A2; EP2556142B1; KR20130094182A; US8513383B2; SG184417A1; ZA201207026B; CA2794686A1; ZA201207149B; US20120028337A1; US20120035349A1; US8197691B2; US20120282662A1; AU2011237695B2; US8658772B2; US20120264194A1; US8308948B2; US20120232144A1; US20110195485A1; BR112012025326A2

Abstract

조류 생물질 또는 조류 배양물로부터 조류 단백질을 선택적으로 추출하고 분별하는 방법이 개시된다. 조류 생물질로부터 생성물을 선택적으로 제거하는 방법은 단일 및 다중 단계 추출 공정을 가능하게 하며, 이는 조류 단백질의 효율적인 분리를 가능하게 한다. 이들 단백질은 동물 사료 및 인간을 위한 식품을 위한 재생가능한 단백질 원료로 사용될 수 있다. 또한, 단백질의 추출 후에 조류 생물질 내에 잔여하는 지질은 재생가능한 연료를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

Description

염수 조류로부터 단백질의 선택적 추출{SELECTIVE EXTRACTION OF PROTEINS FROM SALTWATER ALGAE}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2010년 4월 6일자 출원된, 유지성 물질로부터 오일 및 단백질성 물질의 분별을 이용한 추출(Extraction with Fractionation of Oil and Proteinaceous Material from Oleaginous Material)이란 제목의 미국 가출원 제61/321,290호, 및 2010년 4월 6일자 출원된, 유지성 물질로부터 오일 및 공생성물의 분별을 이용한 추출(Extraction With Fractionation of Oil and Co-Products from Oleaginous Material)이란 제목의 미국 가출원 제61/321,286호의 이익을 주장하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 오일 및 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조류(algal) 생성물을 추출 및 분별하는 것과 관련된다. 더욱 상세하게는, 본 명세서에 기술된 시스템 및 방법은 습윤한 조류 생물질(biomass)을 처리하기 위해 약한 비극성 용매를 이용하는 단계식 추출(step extraction) 및 분별을 사용한다.

발명의 배경

석유는 주로 탄화수소로 이루어진 천연 자원이다. 지하로부터 석유 오일을 추출하는 것은 비용이 많이 들고, 위험하며, 대개 환경을 훼손시킨다. 게다가, 오일의 전세계적 매장량은 빠르게 줄어들고 있다. 석유 오일을 휘발유 및 항공유와 같은 사용가능한 연료로 전환하기 위해 요구되는 운송 및 가공으로 인해 비용이 또한 늘어난다.

조류는 지속가능한 바이오연료를 생산하기 위해 사용될 수 있는 이들의 지질 생성 능력을 고려하여 최근에 상당한 중요성을 얻고 있다. 재생가능한 연료를 생산하기 위해, 전지구적 기후 변화를 감소시키기 위해, 그리고 폐수를 처리하기 위해 이러한 능력이 개발될 수 있다. 바이오연료 공급물질로서의 조류의 우월성은 전형적인 지생(terrestrial) 정유작물에 비해 높은 에이커당 생산성, 비-식량 기반 공급원, 다른 경우 비생산성이고, 경작불가능한 땅의 이용, 광범위한 물원천(담수, 염수, 식염수, 및 폐수)의 활용, 바이오연료 및, 카르테노이드 및 클로로필과 같은 가치있는 공생성물 모두의 생산을 비롯한 다양한 요인들로부터 기인한다.

지난 수십년 동안 전세계적으로 수천종의 조류가 지질 생산을 위해 선별되고 연구되었다. 이들 중, 지질 생산이 풍부한 약 300 종이 확인되었다. 지질 조성 및 함량은 생애 주기의 여러 단계에서 달라지고 환경 및 배양 조건에 의해 영향을 받는다. 추출의 전략 및 접근법은 조류 세포벽의 생화학적 조성의 상당한 다양성 및 물리적 특성으로 인해 오히려 사용되는 개별적인 조류 종/계통(strain)에 따라 달라진다. 압출과 같은 종래의 물리적 추출 공정은 조류 세포의 세포벽의 두께 및 작은 크기(약 2 내지 약 20nm)를 고려하면 조류에서는 쉽지 않다. 게다가, 조류 오일 내 다량의 극성 지질은, 종자에서 회수되는 전형적인 오일과 비교할 때 정제 문제를 야기한다.

수확 시, 배양물 내 전형적인 조류 농도는 약 0.1-1.0 % (w/v)의 범위이다. 이는 오일 추출을 시도하기 전에 조류의 단위 중량당 1000배만큼의 물의 양을 제거해야 함을 의미한다. 현재, 유지성 물질을 위해 존재하는 오일 추출 방법은 추출된 오일의 수율 및 질을 향상하기 위해 거의 완전히 건조된 공급물질을 엄격하게 요구한다. 조류 물질을 충분히 건조하기 위한 열을 위해 요구되는 에너지의 양으로 인해, 바이오연료 처리에 대한 조류 공급물질은 비경제적인 것으로 나타난다. 전형적으로, 공급물질은 추출을 증진하기 위해 고온에서 압출되거나 작게 잘려진다. 이들 단계는 조류의 단일 세포 미세 특성으로 인해 기존 장비로는 이루어질 수 없다. 게다가, 조류 오일은 이중 결합된 긴 사슬 지방산의 존재로 인해 매우 불안정하다. 종래의 추출 방법에서 사용되는 고온은 오일의 분해를 야기하고, 이를 통해 그러한 방식의 비용을 증가시킨다.

헥산을 용매로 이용하여 건조된 조류 물질로부터 오일을 추출하는 것은 당해 분야에 공지이다. 상기 공정은 에너지 집약적이다. 건조를 위한 열의 사용 및 추출을 위한 헥산의 사용은 낮은 질의 생성물을 생산하는데, 왜냐하면 이러한 유형의 가공이 지질 및 단백질 분해를 야기하기 때문이다.

조류 오일 추출은 두 가지 유형: 파괴적 방법 또는 비-파괴적 방법으로 분류될 수 있다.

파괴적 방법은 기계적, 열적, 효소적 또는 화학적 방법에 의한 세포 용해를 수반한다. 대부분의 파괴적 방법은 에멀전을 야기하여, 고비용의 세정 공정을 필요로 한다. 조류 오일은 중성 지질의 에멀전화를 증진시키는 극성 지질 및 단백질을 높은 비율로 함유한다. 에멀전은 용액에 잔여하는 영양분 및 염 성분에 의해 더욱 안정화된다. 상기 에멀전은 중성 지질, 극성 지질, 단백질, 및 기타 조류 생성물을 함유하는 복합적인 혼합물이며, 바이오연료로 전환되게 되는 공급 물질인 중성 지질의 분리를 위해 대규모의 정제 공정을 한다.

비-파괴적 방법은 낮은 수율을 제공한다. 착유(Milking)는 성장하는 조류 배양물로부터 지질을 추출하기 위해 용매 또는 화학물질을 사용하는 것이다. 종종 조류 생성물을 추출하기 위해 사용되지만, 착유는 용매의 독성 및 세포벽 붕괴로 인해 일부 종의 조류에서는 작동되지 않을 수 있다. 이 문제는 포괄적인 공정의 개발을 어렵게 한다. 게다가, 요구되는 용매의 부피가 매체 내 용매의 최대 수득가능 농도로 인해 천문학적일 수 있다.

다중상 추출(Multiphase extraction)은 복합 용매 혼합물을 사용하고, 용매 회수 및 재순환을 위한 메커니즘을 필요로 하는 집중적인 증류를 요할 것이다. 이는 그러한 추출을 조류 오일 기술에 사용하기에 비현실적이고 비경제적이게 한다.

따라서, 이들 문제점들을 극복하기 위해, 조류 생성물, 특히 조류 오일, 조류 단백질, 및 조류 카르테노이드를 추출하고 분별하기 위한 향상된 방법 및 시스템에 대한 요구가 당해 분야에 존재한다.

본 명세서에 기술된 구체예는 일반적으로 예를 들어 조류 물질을 비롯한 유지성 생물질로부터 다양한 극성을 가지는 지질을 추출하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이며. 특히, 본 명세서에 기술된 구체예는 다양한 극성을 갖는 용매 및/또는 일련의 막 여과기를 이용하여 조류 생물질로부터 다양한 극성을 갖는 지질을 추출하는 것에 관련된다. 일부 구체예에서, 여과기는 마이크로여과기이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 유지성 물질 내에 존재하는 성분들을 추출하고 분별하기 위해 단일 용매 및 물이 사용된다. 다른 구체예에서, 이들 성분들은 단백질, 극성 지질, 및 중성 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 용매가 사용된다. 또다른 구체예에서, 용매의 혼합물이 사용된다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 유지성 물질로부터 지질의 공생성물을 추출하기에 유용하다. 그러한 공생성물의 예는 제한 없이, 단백질성 물질, 클로로필, 및 카르테노이드를 포함한다. 본 발명의 구체예는 연료 및 영양 산물 모두의 제조를 가능하게 하는 방식으로 조류 생물질로부터 조류 생성물의 동시적인 추출 및 분별을 가능하게 한다.

본 발명의 한 구체예에서, 염수 조류로부터 단백질을 선택적으로 추출하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 실질적으로 온전한 조류 세포로 이루어진 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 조류 단백질을 선택적으로 추출하는 방법은 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 가열하고 혼합하여 글로불린 단백질이 풍부한 1차 실질적 액체상, 및 1차 실질적 고체상으로 이루어진 1차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계; 상기 1차 실질적 고체상으로부터 글로불린 단백질이 풍부한 상기 1차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계; 상기 1차 고체상을 물과 혼합하고 가열하여 알부민 단백질이 풍부한 2차 실질적 액체상, 및 2차 실질적 고체상으로 이루어진 2차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계; 상기 2차 실질적 고체상으로부터 알부민 단백질이 풍부한 상기 2차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계; 상기 2차 실질적 고체상을 물과 혼합하고 가열하여 3차 실질적 액체상, 및 3차 실질적 고체상으로 이루어진 3차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계; 상기 3차 가열된 추출 혼합물의 pH를 높여서 상기 3차 실질적 액체상에 글루텔린 단백질을 풍부하게 하는 단계; 상기 3차 실질적 고체상으로부터 글루텔린 단백질이 풍부한 3차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계; 상기 3차 실질적 고체상을 가열하고 용매 세트와 혼합하여 프롤라민 단백질이 풍부한 4차 실질적 액체상, 및 4차 실질적 고체상으로 이루어진 4차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계; 및 상기 4차 실질적 고체상으로부터 프롤라민 단백질이 풍부한 4차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 분리 단계 중 어느 하나 이상은 원심분리, 여과, 부유, 및 침강으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 방법에 의해 수행된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 분리 전에 선택된 시간 동안 가열된 온도로 유지된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 20 내지 약 60 분간 가열된 온도로 유지된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 45 내지 약 90 분간 가열된 온도로 유지된다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 50℃로 유지된다. 또다른 양태에서, 상기 4차 실질적 고체상은 지질이 풍부하다. 본 발명의 다른 양태에서, 상기 용매 세트는 에탄올을 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 상기 용매 세트는 알코올을 포함한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 실질적으로 온전한 염수 조류 세포로 이루어진 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 글로불린 단백질을 선택적으로 추출하는 방법은 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 가열하고 혼합하여 글로불린 단백질이 풍부한 가열된 액체상, 및 가열된 실질적 고체상을 생성하는 단계; 및 상기 가열된 실질적 고체상으로부터 글로불린 단백질이 풍부한 상기 가열된 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물은 적어도 한 부분을 가열하고 혼합하는 동안 약 50℃로 유지된다.

본 발명의 또다른 양태에서, 실질적으로 온전한 조류 세포로 이루어진 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 알부민 단백질을 선택적으로 추출하는 방법은 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 가열하고 혼합하여 알부민 단백질이 풍부한 실질적으로 가열된 액체상, 및 가열된 실질적 고체상을 생성하는 단계; 상기 가열된 실질적 고체상으로부터 알부민 단백질이 풍부한 상기 가열된 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물 및 물의 혼합물은 적어도 한 부분의 가열 및 혼합 단계 동안 약 50℃로 유지된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 용매 세트는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함한다.

도 1A는 본 개시의 예시적인 구체예에 따른 방법에 관여하는 단계들의 흐름도(flowchart)이다.
도 1B는 본 개시에 따른 탈수 공정의 예시적인 구체예의 모식도이다.
도 2는 본 개시에 따른 추출 시스템의 예시적인 구체예의 모식도이다.
도 3은 극성 및 비-극성 지질 추출에 대한 최대 비-파괴적 조류 오일 추출 효율 및 극성의 효과를 보여주는 완전 극성 범위를 포함하는 다수의 용매를 이용하는 동결건조된 조류 생물질의 속실렛(Sohxlet) 추출을 나타내는 비교그래프이다.
도 4A 및 B는 세 가지의 상이한 온도에서 메탄올 및 페트롤륨 에테르를 사용하는 두 단계 용매 추출 공정에서 중성 지질 (A) 순도 및 (B) 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 5A 및 B는 세 가지의 상이한 온도에서 수성 메탄올 및 페트롤륨 에테르를 사용하는 두 단계 용매 추출 공정에서 중성 지질 (A) 순도 및 (B) 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 세 가지의 상이한 온도에서 수성 메탄올 및 페트롤륨 에테르를 사용하는 두 단계 용매 추출 공정에서 지질 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 지질 회수율에 대한 고체 생물질 비에 있어서 용매의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 건조 생물질에 대한 수성 메탄올의 단일 단계 추출 회수에 있어서 상이한 수성 추출 용액의 효과성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 누적된 총 지질 수율 및 중성 지질 순도에 대한 다중 단계 메탄올 추출의 효과를 나타낸는 그래프이다.
도 10은 습윤 생물질 및 에탄올을 이용하는 지질의 누적 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 마이크로웨이브(microwave) 보조 추출 및 종래의 추출 시스템의 추출 시간의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 12A는 단백질 추출의 단계를 포함하는 본개시의 예시적인 구체예에 따른 방법에 관여하는 단계들의 흐름도이다. 도 12A 내의 모든 단위는 파운드(pound)이다.
도 12B는 본 개시에 따른 예시적인 추출 공정에 관여하는 단계들의 흐름도이다.
도 13은 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도 및 물질 수지(mass balance) 도표이며, 여기서 조류 생물질로부터 중성 지질, 극성 지질, 및 단백질을 분리하기 위해 1000 lbs.의 조류 생물질이 추출 및 분별을 통해 처리되었다.
도 14는 조류 물질이 처리되어 다양한 생성물을 형성할 수 있는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 15는 조류 중성 지질이 처리되어 다양한 생성물을 형성하는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 16은 조류 중성 지질이 처리되어 연료 생성물을 형성하는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 17은 조류 단백질이 담수 조류 생물질로부터 선택적으로 추출되는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 18은 조류 단백질이 염수 조류 생물질로부터 선택적으로 추출되는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 19는 선택된 조류 단백질이 염수 또는 담수 조류 생물질로부터 추출되는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 20은 선택된 조류 단백질이 염수 또는 담수 조류 생물질로부터 추출되는 본 발명의 구체예 중 하나를 기술하는 흐름도이다.
도 21은 본 명세서에 기술된 방법을 사용한 추출 전과 후의 뗏목말 종(Scenedescemus sp.) 세포를 나타내는 사진이다. 상기 세포는 추출 전후 모두 실질적으로 온전하다.

정의

본 명세서에 사용된 용어 "도관(conduit)" 또는 이의 어느 한 변형은 이것을 통해 액체가 전달될 수 있는 임의의 구조를 포함한다. 도관의 비-제한적인 예시는 파이프, 튜브, 채널, 또는 기타 폐쇄된 구조를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "저장소(reservoir)" 또는 이의 어느 한 변형은 유체를 보유할 수 있는 임의의 본체 구조물을 포함한다. 저장소의 비-제한적인 예시는 연못, 탱크, 호수, 욕조, 또는 기타 유사한 구조물을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 숙련가가 이해하는 것에 가깝게 정의되며, 하나의 비-제한적인 구체예에서 상기 용어는 10% 이내, 바람직하게는 5% 이내, 더욱 바람직하게는 1% 이내, 및 가장 바람직하게는 0.5% 이내인 것으로 정의된다.

본 명세서에 사용된 용어 "저해하는" 또는 "감소시키는" 또는 이들 용어의 어느 한 변형은 원하는 결과를 성취하기 위한 임의의 측정가능한 감소 또는 완전한 저해를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "효과적인"은 바람직한, 기대하는, 또는 의도한 결과를 달성하기 위해 적절함을 의미한다.

본 명세서의 단어 "a" 또는 "an"의 사용은, 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우, "하나"를 의미할 수 있지만 또한 "하나 이상의", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과의"를 의미하는 것과 동일하다.

본 명세서에 사용된 용어 "또는"은, 비록 본 개시는 단지 대안만 그리고 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지하지만, 상기 대안이 단독임 또는 상기 대안이 상호 배타적임을 가리키는 것으로 달리 명백하게 지시되지 않은한 "및/또는"을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "습윤한"의 사용은 약 50% 내지 약 99.9% 수분을 함유하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 수분은 세포내 또는 세포외에 위치할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "용매 세트"의 사용은 하나 이상의 용매를 포함하는 조성물을 의미하기 위해 사용된다. 이들 용매는 양극성(양친매성 또는 약한 비극성으로도 공지임), 친수성, 또는 소수성일 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 용매는 수 혼화성이고 다른 구체예에서, 이들은 물에서 비혼화성이다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용될 수 있는 용매의 비-제한적인 예시는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴, 알칸(헥산, 펜탄, 헵탄, 옥탄), 에스테르(에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트), 케톤(메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 이소부틸 케톤(MIBK)), 방향족(톨루엔, 벤젠, 시클로헥산, 테트라히드로푸란), 할로알칸(클로로포름, 트리클로로에틸렌), 에테르(디에틸 에테르), 및 혼합물 (디젤, 항공유, 휘발유)을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "오일"은 중성 지질 및 극성 지질을 함유하는 조성물을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "조류 오일(algae oil)" 및 "조류 오일(algal oil)"은 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "투석물(diffusate)" 또는 "투과물(permeate)"은 여과기 또는 막을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분리 장치를 통해 통과한 물질을 가리킬 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "잔류물(retentate)"은 투석물이 분리 장치를 통해 통과한 후에 남은 물질을 가리킬 수 있다.

본 명세서에 사용된, 단어"포함하는(comprising)" (및 포함하는의 어느 한 형태, 가령 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"), "가지는(having)" (및 가지는의 어느 한 형태, 가령 "가지다(have)" 및 "가지다(has)"), "포함하는(including)" (및 포함하는의 어느 한 형태, 가령 "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"), 또는 "함유하는(containing)" (및 함유하는의 어느 한 형태, 가령 "함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)")은 포괄적이거나 개방(open-ended)되어 있고 부가적인, 나열되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "극성 지질" 또는 이의 어느 한 변형은 인지질 및 당지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "중성 지질" 또는 이의 어느 한 변형은 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 모노글리세라이드, 카르테노이드, 왁스, 스테롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "고체상"은 일반적으로 고체상이 아닌 것보다 더욱 고체인 물질의 조합을 가리키며, 상(phase) 내 모든 물질이 고체인 것을 의미하는 것을 의도하지는 않는다. 따라서, 액체를 일부 보유하지만 상당량의 고체를 가지는 상이 상기 용어의 의미 내에 포함된다. 한편, 본 명세서에 사용된 용어 "액체상"은 일반적으로 액체상이 아닌 것보다 더욱 액체인 물질의 조합을 가리키며, 그러한 조합은 고체 물질을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "바이오디젤(biodiesel)"은 조류에서 유래한 지방산의 메틸 또는 에틸 에스테르를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "영양분"은 건강 및/또는 의학적 이익을 제공하는 식품을 가리킨다. 비-제한적인 예시는 카르테노이드, 카로텐(carotene), 크산토필 가령 제아잔틴(zeaxanthin), 아스타잔틴(astaxanthin), 및 루테인(lutein)을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "바이오연료"는 생물학적 원천으로부터 유래한 연료를 가리킨다. 비-제한적인 예시는 바이오디젤, 항공유, 디젤, 항공유 혼합 원료(blend stock) 및 디젤 혼합 원료를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "불순물"은, 극성 지질과 관련하여 사용된 경우, 공추출되거나 관심의 생성물과 동일한 특성을 가진, 관심의 생성물이 아닌 기타 모든 성분을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "윤활제"는, 극성 지질과 관련하여 사용된 경우, 수소처리된 조류 지질 가령 C16-C20 알칸을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "세제(detergent)"는, 극성 지질과 관련하여 사용된 경우, 당지질, 인지질 및 이들의 유도체를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "식품 첨가물"은, 극성 지질과 관련하여 사용된 경우, 대두 레시틴 대용물 또는 조류에서 유래한 인지질을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "비-글리세린 물질"은 글리세린 분획과 함께 분리되는 임의의 불순물을 가리킨다. 약제학적 등급의 글리세린을 제조하기 위해 추가적인 세정 단계를 통해 존재하는 대부분의 비-글리세린 물질이 제거될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "불포화 지방산"은 적어도 하나의 탄소 이중 결합을 가지는 지방산을 가리킨다. 불포화 지방산의 비-제한적인 예시는 팔미톨레산, 마르가르산, 스테아르산, 올레산, 옥타디센산, 리놀레산, 감마-리놀레산, 알파 리놀레산, 아라키드산, 에이코세노산, 순수(homo)감마 리놀레산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사디에노산, 헤네이코사펜타에노산, 도코사테트라에노산을 포함한다. 골격 내에 20개 이상의 탄소 원자를 가지는 지방산은 일반적으로 "긴사슬 지방산"으로 지칭된다. 골격 내에 19개 이하의 탄소 원자를 가지는 지방산은 일반적으로 "짧은사슬 지방산"으로 지칭된다.

불포화 긴사슬 지방산은 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 및 오메가-9 지방산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 용어 "오메가-3 지방산"은 표 1에 나열된 지방산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일반 명칭	지질 명칭	화학 명칭
에이코사트리에노산(ETE)	20:3 (n-3)	all-cis-11,14,17-에이코사트리에노산
에이코사테트라에노산(ETA)	20:4 (n-3)	all-cis-8,11,14,17-에이코사테트라에노산
에이코사펜타에노산(EPA)	20:5 (n-3)	all-cis-5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산
헤네이코사펜타에노산(HPA)	21:5 (n-3)	all - cis-6,9,12,15,18-헤네이코사펜타에노산
도코사펜타에노산(DPA)	22:5 (n-3)	all-cis-7,10,13,16,19- 도코사펜타에노산
클루파노돈산	22:6 (n-3)	all-cis-4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산
도코사헥사에노산(DHA)	24:5 (n-3)	all-cis-9,12,15,18,21-테트라코사펜타에노산
테트라코사펜타에노산	24:6 (n-3)	all-cis-6,9,12,15,18,21-테트라코사헥사에노산

본 명세서에 사용된 용어 "항공유 혼합 원료"는 항공유로 사용하기에 적절한 탄소 사슬 길이를 가지는 알칸을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "디젤 혼합 원료"는 디젤로 사용하기에 적절한 탄소 사슬 길이를 가지는 알칸을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "동물 사료"는 동물을 위한 영양 공급을 제공하기 위해 소비되고 사용될 수 있는 조류-유래 물질을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "인간 식량"은 사람들을 위한 영양 공급을 제공하기 위해 소비될 수 있는 조류-유래 물질을 가리킨다. 조류-유래 인간 식량 제품은 필수 영양소, 가령 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 또는 무기질을 함유할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "생물정화(bioremediation)"는 공업 폐수 또는 도시 하수로부터 공해 물질, 가령, 이에 제한되지 않지만, 질산염, 인산염, 및 중금속을 제거하기 위해 조류 재배를 사용하는 것을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "폐수"는 질산염, 인산염, 및 중금속을 비롯하지만 이에 제한되지 않는 다양한 오염물질 또는 공해물질을 함유하는 공업 폐수 또는 도시 하수를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "풍부한"은 약 50% 이상의 함유량을 의미할 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "실질적으로"는 대부분을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "글로불린 단백질"은 염용성(salt soluble) 단백질을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "알부민 단백질"은 수용성 단백질을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "글루텔린 단백질"은 알칼리 용해성 단백질을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "프롤라민 단백질"은 알코올 용해성 단백질을 가리킨다. 프롤라민 단백질의 비-제한적인 예시는 글리아딘(gliadin), 제인(zein), 호르데인(hordein), 아베닌(avenin)이다.

본 명세서에 사용된 용어 "조류 배양물"은 배양 배지 내 조류 세포를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "조류 생물질"은 적어도 부분적으로 탈수된 조류 배양물을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "탈수된"은 물의 적어도 일부의 제거를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "조류 반죽"은 유동을 허용하는 유체 특성을 가지는 부분적으로 탈수된 조류 배양물을 가리킨다. 일반적으로 조류 반죽은 약 90%의 수분을 가진다.

본 명세서에 사용된 용어 "조류 케익"은 조류 반죽의 유체 특성이 없고 덩어리지는 경향을 갖는 부분적으로 탈수된 조류 배양물을 가리킨다. 일반적으로 조류 케익은 약 60% 이하의 수분을 가진다.

염수 조류 세포는 해수 및 기수(brackish) 조류 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 염수 조류 세포는 자연에서 이에 제한되지 않지만, 바다, 대양, 및 강의 하구와 같은 물 속에서 발견된다. 염수 조류 종의 비-제한적인 예시는 나노클로로푸시스 종(Nannochloropsis sp .), 두날리엘라 종(Dunaliella sp .)을 포함한다.

담수 조류 세포는 자연에서 이에 제한되지 않지만 호수 및 연못과 같은 물 속에서 발견된다. 담수 조류 종의 비-제한적인 예시는 뗏목말 종(Scenedescemus sp.), 헤마토코쿠스 종(Haemotococcus sp.) 을 포함한다.

본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 미세조류의 비-제한적인 예시는 다음의 문(division) 중 하나의 구성원이다: 녹조식물문(Chlorophyta ), 남조식물문(Cyanophyta (남조류, Cyanobacteria), 및 부등편모조식물문(Heterokontophyta). 특정 구체예에서, 본 발명의 방법과 함께 사용되는 미세조류는 다음의 강(class) 중 하나의 구성원이다: 규조강(Bacillariophyceae ), 진안점조강( Eustigmatophyceae ), 및 황갈조강( Chrysophyceae ). 특정 구체예에서, 본 발명의 방법과 함께 사용되는 미세조류는 다음의 속(genera) 중 하나의 구성원이다: 나노클로로푸시스속(Nannochloropsis), 클로렐라속(Chlorella), 두날리엘라속(Dunaliella), 뗏목말속 (Scenedesmus), 셀레나스트룸속(Selenastrum), 오실라토리아속(Oscillatoria), 포르미디움속(Phormidium), 스피루리나속(Spirulina), 암포라속(Amphora), 및 오크로모나스속(Ochromonas).

본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 미세조류 종의 비-제한적인 예시는 다음을 포함한다: 아크난테스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis), 아구메넬룸 종(Agmenellum spp.), 암피포라 히알린(Amphiprora hyaline), 암포라 코파이포르미스(Amphora coffeiformis), 암포라 코파이포르미스 리니아 변종(Amphora coffeiformis var . linea), 암포라 코파이코르미스 푼크타타 변종(Amphora coffeiformis var . punctata), 암포라 코파이코르미스 타이로리 변종(Amphora coffeiformis var . taylori), 암포라 코파이코르미스 테누이스 변종(Amphora coffeiformis var . tenuis), 암포라 델리카티시마(Amphora delicatissima), 암포라 델리카티시마 카피타타 변종(Amphora delicatissima var . . capitata), 암포라 종(Amphora sp .), 아나베나(Anabaena), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키스트로데스무스 팔카투스(Ankistrodesmus falcatus), 뵈켈로비아 후글란디이(Boekelovia hooglandii), 보로디넬라 종(Borodinella sp .), 보트리오코쿠스 브라우니이(Botryococcus braunii), 보트리오코쿠스 수데티쿠스(Botryococcus sudeticus), 브라크테오코쿠스 미노르(Bracteococcus minor), 브라크테오코쿠스 메디오누클레아투스(Bracteococcus medionucleatus), 카르테리아(Carteria), 카에토세로스 그라실리스(Chaetoceros gracilis), 카에토세로스 뮤엘러리(Chaetoceros muelleri), 카에토세로스 뮤엘러리 서브살숨 변종(Chaetoceros muelleri var . subsalsum), 카에토세로스 종(Chaetoceros sp .), 클라미도마스 페리그라눌라타(Chlamydomas perigranulata), 클로렐라 아니트라타(Chlorella anitrata), 클로렐라 안타르크티카(Chlorella antarctica), 클로렐라 아우레오비리디스(Chlorella aureoviridis), 클로렐라 칸디다(Chlorella Candida), 클로렐라 캡슐레이트(Chlorella capsulate), 클로렐라 데시케이트(Chlorella desiccate), 클로렐라 엘립소이디아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에메르소니이(Chlorella emersonii), 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 푸스카 바큘로라타 변종(Chlorella fusca var . vacuolata), 클로렐라 글루코트로파(Chlorella glucotropha), 클로렐라 인퓨시오눔(Chlorella infusionum), 클로렐라 인퓨시오눔 액토필라 변종(Chlorella infusionum var . actophila), 클로렐라 인퓨시오눔 옥세노필라 변종(Chlorella infusionum var . auxenophila), 클로렐라 케스러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 로보포라(Chlorella lobophora), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 아우레오비리디스 변종(Chlorella luteoviridis var . aureoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 루테센스 변종(Chlorella luteoviridis var . lutescens), 클로렐라 미니아타(Chlorella miniata), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 무타빌리스(Chlorella mutabilis), 클로렐라 녹투르나(Chlorella nocturna), 클로렐라 오발리스(Chlorella ovalis), 클로렐라 파르바(Chlorella parva), 클로렐라 포토필라(Chlorella photophila), 클로렐라 프링샤이미이(Chlorella pringsheimii), 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides), 클로렐라 프로토테코이데스 애시디콜라 변종(Chlorella protothecoides var . acidicola), 클로렐라 레굴라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 레굴라리스 미니마 변종(Chlorella regularis var . minima), 클로렐라 레굴라리스 움브리카타 변종(Chlorella regularis var . umbricata), 클로렐라 레이시글리이(Chlorella reisiglii), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 사카로필라 엘립소디아 변종(Chlorella saccharophila var . ellipsoidea), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 심플렉스(Chlorella simplex), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 종(Chlorella sp .), 클로렐라 스파에리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 스티그마토포라(Chlorella stigmatophora), 클로렐라 바니엘리이(Chlorella vanniellii), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스 테르티아 이종(Chlorella vulgaris fo . tertia), 클로렐라 불가리스 오토트로피카 변종(Chlorella vulgaris var . autotrophica), 클로렐라 불가리스 비리디스 변종(Chlorella vulgaris var . viridis), 클로렐라 불가리스 불가리스 변종(Chlorella vulgaris var . vulgaris), 클로렐라 불가리스 불가리스 변종 테르티아 이종(Chlorella vulgaris var . vulgaris fo . tertia), 클로렐라 불가리스 불가리스 변종 비리디스 이종(Chlorella vulgaris var . vulgaris fo . viridis), 클로렐라 크산텔라(Chlorella xanthella), 클로렐라 조핀지엔시스(Chlorella zofingiensis), 클로렐라 트레복시오데스(Chlorella trebouxioides), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로로코쿰 인퓨시오눔(Chlorococcum infusionum), 클로로코쿰 종(Chlorococcum sp .), 클로로고니움(Chlorogonium), 크로오모나스 종(Chroomonas sp .),크리소파에라 종(Chrysosphaera sp .), 크리코스파에라 종(Cricosphaera sp .), 크립테코디니움 코니이(Crypthecodinium cohnii), 크립토모나스 종(Cryptomonas sp .), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 시클로텔라 메네기니아나(Cyclotella meneghiniana), 시클로텔라 종(Cyclotella sp .), 두날리엘라 종(Dunaliella sp .), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 비오쿨라타(Dunaliella bioculata), 두날리엘라 그라뉼레이트(Dunaliella granulate), 두날리엘라 마리타임(Dunaliella maritime), 두날리엘라 미누타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파르바(Dunaliella parva), 두날리엘라 페이르세이(Dunaliella peircei), 두날리엘라 프리몰렉타(Dunaliella primolecta), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테리콜라(Dunaliella terricola), 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 에르모스파에라 비리디스(Eremosphaera viridis), 에르모스파에라 종(Eremosphaera sp .), 엘립소이돈 종(Ellipsoidon sp .), 유글레나 종(Euglena spp .), 프란세이아 종(Franceia sp .), 프라길라리아 크로토넨시스(Fragilaria crotonensis), 프라길라리아 종(Fragilaria sp .), 글레오캅사 종(Gleocapsa sp .), 글로에오탐니온 종(Gloeothamnion sp .), 해마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 히메노모나스 종(Hymenomonas sp .), 이소크리시스 갈바나 형(lsochrysis aff . galbana), 이소크리시스 갈바나(lsochrysis galbana), 레포신클리스(Lepocinclis), 미크락티니움(Micractinium), 미크락티니움(Micractinium), 모노라피디움 미누툼(Monoraphidium minutum), 모노라피디움 종(Monoraphidium sp .), 나노클로리스 종(Nannochloris sp .), 나노클로로푸시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나노클로로푸시스 종(Nannochloropsis sp.), 나비쿨라 악셉타타(Navicula acceptata), 나비쿨라 비스칸테레(Navicula biskanterae), 나비쿨라 슈도테넬로이데스(Navicula pseudotenelloides), 나비쿨라 펠리큘로사(Navicula pelliculosa), 나비쿨라 사프로필라(Navicula saprophila), 나비쿨라 종(Navicula sp .), 네프로클로리스 종(Nephrochloris sp .), 네프로셀미스 종(Nephroselmis sp .), 닛치아 코무니스(Nitschia communis), 닛츠키아 알렉산드리나(Nitzschia alexandrina), 닛츠키아 클로스테리움(Nitzschia closterium), 닛츠키아 코무니스(Nitzschia communis), 닛츠키아 디스시파타(Nitzschia dissipata), 닛츠키아 프루스툴룸(Nitzschia frustulum), 닛츠키아 한츠시아나(Nitzschia hantzschiana), 닛츠키아 인콘스피쿠아(Nitzschia inconspicua), 닛츠키아 인테르메디아(Nitzschia intermedia), 닛츠키아 미크로세팔라(Nitzschia microcephala), 닛츠키아 푸실라(Nitzschia pusilla), 닛츠키아 푸실라 엘립티카(Nitzschia pusilla elliptica), 닛츠키아 푸실라 모노에시스(Nitzschia pusilla monoensis), 닛츠키아 콴드랑글라(Nitzschia quadrangular), 닛츠키아 종(Nitzschia sp .), 오크로모나스 종(Ochromonas sp .), 오오시스티스 파르바(Oocystis parva), 오오시스티스 푸실라(Oocystis pusilla), 오오시스티스 종(Oocystis sp .), 오실라토리아 림네티카(Oscillatoria limnetica), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp .), 오실라토리아 서브레비스(Oscillatoria subbrevis), 파라클로렐라 케슬러리(Parachlorella kessleri), 파셰리아 애시도필라(Pascheria acidophila), 파블로바 종(Pavlova sp.), 파에오닥틸룸 트리코모툼(Phaeodactylum tricomutum), 파구스(Phagus), 포르미디움(Phormidium), 플라티모나스 종(Platymonas sp .), 플뢰로크리시스 카르터레(Pleurochrysis carterae), 플뢰로크리시스 덴테이트(Pleurochrysis dentate), 플뢰로크리시스 종(Pleurochrysis sp .), 프로토테카 위커하미이(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 좁피이(Prototheca zopfii), 슈도클로렐라 아쿠아티카(Pseudochlorella aquatica), 피라미모나스 종(Pyramimonas sp.), 피로보트리스(Pyrobotrys), 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 사르시노이드 크리소파이트(Sarcinoid chrysophyte), 센데무스 아라마투스(Scenedesmus armatus), 쉬조키트리움(Schizochytrium), 스피로지라(Spirogyra), 스피루리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스티초코쿠스 종(Stichococcus sp .), 시네초코쿠스 종(Synechococcus sp .), 시네초시스티스프(Synechocystisf), 타게테스 에렉타(Tagetes erecta), 타게테스 파툴라(Tagetes patula), 테트라에드론(Tetraedron), 테트라셀미스 종(Tetraselmis sp .), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오시라 와이스플로기이(Thalassiosira weissflogii), 및 비리디엘라 프리데리시아나(Viridiella fridericiana).

다른 구체예에서, 생물질은 대두, 옥수수, 야자, 카멜리나(camelina), 자트로파(jatropha), 카놀라(canola), 코코넛, 땅콩, 홍화, 목화씨, 아마인, 해바라기, 쌀겨, 및 올리브를 포함하지만 이에 제한되지 않는 식물성 물질일 수 있다.

예컨대 조류 생물질을 비롯한 습윤한 유지성 물질로부터 다양한 극성을 갖는 지질 및 공생성물(예를들어, 단백질)을 추출하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다. 특히, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 점진적으로 덜 극성이 되는 친수성 용매/물 혼합물을 이용한 연속적 추출을 실시하여 조류 성분을 추출 및 분별하는 능력에 관련된다(즉, 한 추출 단계에서 다음 단계로 진행될수록 용매 내 물/물 비율이 점진적으로 감소한다). 달리 말하면, 조류 내 사이(interstitial) 용매(조류 중량의 75%)는 초기에는 물이며 약한 비극성 용매로 점차 대체되어 유기 용매의 공비혼합물이 된다. 이는 각 경우에 발생되는 극성에서 용해성인 성분의 추출을 야기하며, 이를 통해 추출되는 성분들의 동시적인 분별을 유발한다. 산 침출 및/또는 알칼리 추출을 통한 단백질성 부산물의 추출이 또한 개시된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 유지성 물질에 존재하는 성분들을 추출하고 분별하기 위해 단일 용매 및 물이 사용된다. 다른 구체예에서, 유지성 물질에 존재하는 성분들을 추출하고 분별하기 위해 용매 세트 및 물이 사용된다. 일부 구체예에서 상기 유지성 물질은 습윤되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 유지성 물질은 조류이다.

극성 지질 회수는 주로 상기 지질의 이온성 전하, 수용성, 및 위치(세포내, 세포외 또는 막부착)에 의존한다. 극성 지질의 예는 인지질 및 당지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 극성 지질을 분리하고 정제하기 위해 사용될 수 있는 전략은 크게 회분식(batch) 또는 연속식 방식으로 나눌 수 있다. 회분식 방식의 예는 침전 (pH, 유기 용매), 용매 추출 및 결정화를 포함한다. 연속식 방식의 예는 원심분리, 흡착, 거품분리 및 침전, 및 막 기술(접선 유동 여과(tangential flow filtration), 정용여과(diafiltration) 및 침전, 한외여과(ultra filtration))을 포함한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점이 이어지는 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 본 상세한 설명 및 실시예는, 본 발명의 특정한 구체예를 나타내지만, 오로지 예시의 방식으로 제공되는 점이 이해되어야 한다. 추가적으로, 당해 분야의 숙련가에게 본 발명의 사상 및 범위내의 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것임이 고려된다.

예기치 않게, 제안된 비-파괴적 추출 공정은 90%을 넘는 회수율을 도출한다. 잔여하는 생물질내 소량의 극성 지질은 상기 잔여 생물질이 사료를 위해 사용되는 경우 그 가치가 올라간다. 이는, 적어도 부분적으로, 생물질의 높은 긴사슬 불포화 지방산 함량에 기인한다. 또한, 에탄올 추출물은 추가적으로 직접 트랜스에스테르화될 수 있다. 게다가, 기존의 종래 방법과 달리, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 어떠한 조류에 대해서도 포괄적이며, 수 혼화성 유기 용매 구배의 사용에 의해 조류에서 극성 지질을 비롯한 가치있는 성분들의 상당한 부분의 회수를 가능하게 한다.

본 발명의 사용을 통해 수득된 중성 지질 분획은 낮은 금속 함량을 가지며, 이를 통해 지질 분획의 안정성을 높이며, 이후의 가공 단계를 줄인다. 금속은 이들이 갖는 산화 촉매 능력으로 인해 중성 지질을 불안정하게 하는 경향을 갖는다. 게다가, 금속은 수소처리 촉매를 저해하여, 중성 지질 혼합물이 정제될 수 있기 전에 금속의 제거가 필요하다. 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 단백질 및/또는 극성 지질 분획에서 금속의 추출을 가능하게 한다. 이것은 단백질 및 극성 지질이 금속 노출에 의해 고도로 영향받지 않고, 그리고 일부 경우에는 실제로 금속에 의해 안정화되기 때문에 장점이 된다.

본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 습윤 생물질로 출발할 수 있고, 건조 및 탈수 비용을 저감할 수 있다. 종래의 추출 공정과 비교하여, 개시된 추출 및 분별 공정은 용매 재사용과 함께 온화한 온도 및 압력 조건으로 인해 비교적 낮은 수행 비용을 가질 것이다. 게다가, 종래의 추출 공정은 비용이 지나치게 높아 시장의 수요에 맞출 수 없다.

본 명세서에 기술된 시스템 및 방법의 또다른 양태는 추출 공정 도중 중성 지질로부터 극성 지질을 분리하는 것인 예비 정제를 성취하는 능력이다. 예시된 구체예에 사용된 조류 오일 및 기존 구체예에 사용된 식물성 오일간의 차이는 지질의 개별적인 종류의 백분율을 포함한다. 예시적인 조류 미정제 오일 조성물이 식물성 오일과 비교되어 하기 표 2에 나타난다:

	조류 미정제 오일(w/w)	식물성 오일(w/w)
중성 지질	30-90%	90-98%
인지질	10-40%	1-2%
당지질	10-40%	<1%
유리 지방산	1-10%	<3%
왁스	2-5%	<2%
안료	1-4%	Ppm

극성 지질(예를 들어, 당지질 및 인지질)을 제거하기 위해 식물성 오일의 탈검(물리적 및/또는 화학적)이 수행된다. 화학적으로 탈검된 식물성 오일은 상당한 양의 중성 지질을 보유한다. 상기 중성 지질 분획은 탈검된 물질로부터 용매 추출 또는 초임계/아임계 유체 추출 또는 막 기술을 이용하여 더욱 제거된다. 반대로, 유지성 조류 생물질로부터 중성 지질의 분리는 조류 오일에서 전형적으로 발견되는 다량의 극성 지질의 존재로 인해 식물성 오일 공급물질으로부터 분리하는 것보다 훨씬 더 어렵다(표 2 참조). 이는 조류 오일에 존재하는 더 많은 비율의 극성 지질이 중성 지질의 에멀전화를 증진하기 때문이다. 상기 에멀전화는 용액 내에 잔여하는 영양분 및 염 성분에 의해 더욱 안정화된다. 금속과 더불어, 극성 지질의 존재는 중성 지질의 분리 및 사용을 위한 가공 불편을 유발한다. 그러나, 극성 지질이 실존하는 시장을 가지기 때문에, 지질의 회수는 연료를 생성하기 위한 조류 오일의 사용에 상당한 가치를 부가할 것이다.

극성 지질은 이들의 분자 구조로 인해 본성적으로 계면활성제이며 거대한 실존하는 시장을 갖는다. 극성 지질을 생산하기 위한 많은 기존 기술은 원료 물질 또는 비용이 지나치게 비싸다. 당지질 및 인지질을 위한 대안적인 공급 원료는 주로 조류 오일, 귀리 오일, 밀배아 오일 및 식물성 오일이다. 조류 오일은 종(species), 세포의 생리학적 상태, 배양 조건, 수확 시기, 및 추출을 위해 사용된 용매에 따라 전형적으로 약 30-85 % (w/w) 극성 지질을 함유한다. 또한, 각각의 극성 지질의 글리세롤 골격은 중성 지질 트리아실글리세롤에서 세 개 대신 두 개의 지방산 기가 부착되어 있다. 극성 지질의 트랜스에스테르화는 중성 지질의 수득과 비교할 때 질량 기준으로 단지 2/3의 최종 생성물, 즉, 에스테르화 지방산만을 수득할 수 있다. 따라서, 극성 지질의 제거 및 회수는 조류로부터 고품질의 바이오연료 또는 트리글리세라이드를 생산하는데 매우 유리할 뿐 아니라, 부가가치 공생성물 당지질 및 인지질을 생성하며, 이는 다시 조류-기반 바이오연료 생산과 결부된 비용을 상쇄할 수 있다. 조류에 의해 만들어진 다양한 오일 및 공생성물을 쉽게 회수하고 분별하는 능력은 조류 오일 가공의 경제적 성공에 있어서 유리하다.

본 명세서에 기술된 방법 및 시스템의 추가적인 양태는 유지성 물질, 가령 조류 생물질로부터 단백질을 추출하는 능력이다. 본 명세서에 개시된 조류 생물질로부터 단백질성 물질의 추출 방법은 유연하고 고도로 맞춤가능한 추출 및 분별 공정을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 추출 및 분별은 단일 단계에서 일어나고, 이를 통해 매우 효율적인 공정을 제공한다. 그러한 생물질로부터 유래한 단백질은 동물 사료, 식품 성분 및 공업 제품에 있어서 유용하다. 예를 들면, 그러한 단백질은 섬유, 접착제, 코팅, 세라믹, 잉크, 화장품, 직물, 츄잉검, 및 생분해 플라스틱과 같은 응용 분야에서 유용하다.

본 명세서에 기술된 방법 및 시스템의 또다른 양태는 추출될 성분을 기초로 하여 조류 생물질에 대한 용매의 비율이 달라지는 것을 수반한다. 한 구체예에서, 조류 생물질은 동일 중량의 용매와 혼합된다. 또다른 구체예에서, 조류 생물질은 더 적은 중량의 용매와 혼합된다. 또다른 구체예에서, 조류 생물질은 더 많은 중량의 용매와 혼합된다. 일부 구체예에서, 조류 생물질과 혼합되는 용매의 양은 사용될 용매 및 바람직한 조류 생물질/용매 혼합물의 극성을 기초로 하여 산출된다. 또다른 구체예에서, 조류 물질은 여러 단계로 추출된다. 한 예시적인 구체예에서, 조류 생물질은 연속적으로 추출되며, 1차로 상기 생물질 중량의 약 50-60%의 약한 비극성, 수 혼화성 용매로 추출된다. 2차로, 잔여하는 조류 고체는 용매 내 약 70%의 고체 중량을 이용하여 추출된다. 이후 용매 내 약 90%의 고체 중량을 이용하여 3차 추출이 수행된다. 본 발명의 이들 양태를 접하면, 당해 분야의 숙련가는 조류 생성물을 선택적으로 추출하기 위해 바람직한 극성에 대한 조류 생물질 및/또는 고체 잔여물의 비를 조정하여 상이한 극성을 갖는 상이한 용매를 사용할 수 있을 것이다.

예를 들면, 바람직한 구체예에서, 사용된 용매는 에탄올이다. 용매의 비율을 다르게 하여 성분들이 선택적으로 분리될 수 있다. 조류 생물질로부터 단백질은 약 50% 에탄올로, 극성 지질은 약 80% 에탄올로, 및 중성 지질은 약 95% 이상 에탄올로 추출될 수 있다. 메탄올이 사용되었을 경우, 단백질을 조류 생물질로부터 추출하기 위한 용매 농도는 약 70%일 것이다. 극성 지질은 약 90% 메탄올을 필요로 하며, 중성 지질은 약 100% 메탄올을 필요로 할 것이다.

본 명세서에 기술된 시스템 및 방법의 구체예들은 놀랍게도 예상치 못한 결과를 나타낸다. 무엇보다도, 회수/추출 공정을 습윤 생물질에 수행할 수 있다. 예시적 구체예가 세포를 건조하고 파괴하기 위해 요구되는 많은 양의 에너지의 사용을 회피하기 때문에 이는 주요 경제적인 이점이 된다. 건조 조류 생물질로부터 중성 지질의 추출은 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하면 훨씬 더 효과적일 수 있다. 개시된 공정으로부터 수득된 수율은 종래의 추출로 수득된 것보다 상당히 더 높고 더 순수하다. 이는 종래의 추출이 흔히 에멀전을 유도하여, 성분의 분리를 극히 어렵게 만들기 때문이다.

예시적인 구체예는 어떠한 조류 또는 비-조류 유지성 물질에도 적용할 수 있다. 예시적인 구체예는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떠한 수-혼화성의 약한 비극성 용매도 사용할 수 있다. 특정한 구체예는 그린(green) 재생가능 용매, 가령 에탄올을 사용할 수 있다. 시험된 상기 알코올 용매는 분리된 중성 지질의 더 높은 수율 및 순도를 도출했다. 에탄올은 본 명세서에 개시된 다른 용매와 비교할 때 구입하기에 비교적 경제적이다. 일부 예시적인 구체예에서, 추출 및 분별은 한 단계로 수행될 수 있고 이후 필요한 경우 막-기반 정제가 수행될 수 있다. 수득되는 생물질은 물이 거의 없고 수성 조류 슬러리보다 더 적은 에너지를 이용하여 완전히 건조될 수 있다.

일부 예시적인 구체예에서, 추출을 위해 사용된 용매는 에탄올이다. 다른 구체예는 시클로헥산, 페트롤륨 에테르, 펜탄, 헥산, 헵탄, 디에틸 에테르, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤, 아세토니트릴, 이소프로판올, 및 메탄올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 연속적 추출 단계에서 동일한 용매가 사용된다. 다른 구체예에서, 각 추출 단계에서 상이한 용매가 사용된다. 또다른 구체예에서, 둘 이상의 용매가 혼합되어 하나 이상의 추출 단계에서 사용된다.

본 명세서에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 임의의 추출 단계에서 사용된 둘 이상의 용매의 혼합물은 적어도 하나의 친수성 용매 및 적어도 하나의 소수성 용매를 포함한다. 그러한 혼합물을 사용하는 경우, 상기 친수성 용매는 생물질로부터 확산을 통해 물질을 추출한다. 한편, 상대적으로 소량의 소수성 용매는 조합되어 사용되며 관심의 물질이 상기 소량의 소수성 용매에 농축되도록 액체-액체 분리에 관여한다. 두 가지 상이한 용매는 이후 두-층의 시스템을 형성하며, 이것은 당해 분야에 공지인 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 그러한 구현에 있어서, 상기 소수성 용매는 알칸, 에스테르, 케톤, 방향족, 할로알칸, 에테르, 또는 시판되는 혼합물(예를 들어, 디젤, 항공유, 휘발유) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 상기 추출 공정은 하나 이상의 단계에서 pH 교차(excursion)를 포함한다. 그러한 pH 교차는 단백질성 물질을 분리하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 추출 공정의 pH는 산성이다(예를 들어, 약 5 미만). 일부 구체예에서, 추출 공정의 pH는 알칼리성이다(예를 들어, 약 10 초과).

종래의 추출 절차에서 헥산의 사용은 공생성물이 식품 제품에 사용될 수 없도록 조류 생물질을 오염시킨다. 본 발명의 구체예는 훨씬 적은 에너지의 사용을 필요로 하며 생성물을 연료로서뿐 아니라 식품 및 영양 보충제로서의 사용을 위해 적절하게 만들기 때문에, 당해 분야에 공지인 방법보다 우월하다.

본 명세서에서 논의된 임의의 구체예가 본 발명의 방법 또는 시스템과 관련되어 활용될 수 있고, 또한 역으로도(vice versa) 가능함이 포함된다. 게다가, 본 발명의 시스템은 본 발명의 방법을 성취하기 위해 사용될 수 있다.

예시적 구체예의 설명

조류로부터 오일을 용매 추출하기 위해 최적의 시나리오는 용매가 높은 회수율을 가지고 선택적으로 트리아실글리세롤(TAG)을 추출하고 모든 극성 지질 및 비-TAG 중성 지질 가령 조류 세포 내 왁스, 스테롤을 남기는 것이다. 두 번째 가능한 것은 극성 지질을 선택적으로 추출하고 이후 극성 지질이 없는 더욱 순수한 중성 지질을 추출하여, 높은 수율을 도출하는 것일 수 있다. 마지막으로 가능한 것은 모든 지질을 추출하고 하나 또는 두 개의 단계에서 매우 높은 수율을 달성하는 것일 수 있다.

이제 도 1A를 참조하여, 흐름도 100은 조류-함유 생물질로부터의 지질의 분별 및 정제에서 사용되는 방법의 예시적인 구체예에 수반되는 단계들의 개략도를 제공한다. 첫 번째 단계 110에서, 조류 세포를 수확한다. 이어지는 단계 120에서, 조류 세포로부터 물을 제거하여 10-25% 고체 생물질을 얻는다. 단계 130에서, 생물질에 대해 용매-기반 추출을 수행하고 분획을 수집한다. 일부 구체예에서, 단계 130은 또한 pH-기반 추출과 분획 수집을 포함할 것이다. 마지막으로, 더 작은 지질 성분을 분리해내기 위해 여과, 따라내기(decanting), 및 원심분리와 같은 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고체/액체상 분리가 단계 140에서 수행될 수 있다.

조류 생물질은 단계 110에서 수확된 경우 전형적으로 약 1-5 g/L의 총 고체(total solid)로 이루어진다. 상기 생물질은 단계 120에서 용존공기부상법(dissolved air floatation), 막 여과, 응집, 침강, 압축여과, 따라내기 또는 원심분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기술을 이용하여 부분적으로 탈수할 수 있다. 탈수는 물의 일부, 대부분, 또는 전부를 고체 또는 반고체 물질로부터 제거하는 것이다. 본 발명의 구체예는 수확된 조류 생물질로부터 물을 제거하기 위해 탈수 기술을 이용한다. 탈수는 본 명세서에 기술된 방법 중 어느 하나 또는 어느 하나의 조합, 뿐만 아니라 당해 분야의 숙련가에게 공지인 임의의 기타 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

단계 120에서 수득된 탈수된 조류 생물질은 전형적으로 약 10-30% 고체로 이루어진다. 상기 생물질은 이후 수 혼화성의 약한 비극성 용매(예를 들어, 알코올)을 이용하여, 각 단계에서 분획을 분리하는 다단식 역류(countercurrent) 용매 추출 공정에서 추출할 수 있다. 상기 유형의 공정은 자본 및 작동 비용 모두를 낮출 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 생물질은 또한 산성 및/또는 알칼리성 추출을 거쳐 단백질 물질을 분별한다.

일부 구체예에서, 조류 생물질의 탈수는 수확된 조류 생물질을 에탄올과 같은 용매를 이용하여 처리함으로써 수행할 수 있다. 조류 생물질을 이후 용액에서 가라앉게 하고 그 후에 이에 제한되지 않지만 사이퍼닝(siphoning )과 같은 방법에 의해 액체를 제거할 수 있다. 이러한 신규한 탈수 방법은 공지의 방법보다 더 낮은 자본 및 작동 비용을 가지며, 용매 재사용을 가능하게 하고, 생물질의 건조 비용을 저감하며, 조류 성분의 추출 및/또는 분리를 시작하기 전에 조류 생물질의 극성을 감소시키는 추가의 이익을 갖는다. 실제로, 본 명세서에 기술된 용매-기반 침강 공정이, 부분적으로는, 유기 용매가 조류 표면 상의 음 전하를 감소하거나 중화한다는 사실로 인해 효과적이라는 점이 이론화되었다. 본 발명의 일부 구체예에서, 더 많은 물을 제거하기 위해 탈수 방법들을 조합한다. 일부 구체예에서, 탈수 공정 도중 용매의 부가로 추출 과정이 시작된다.

도 1B는 탈수 공정 300의 예시적인 사용을 나타낸다. 약 1 g/L 내지 약 10 g/L(즉, 0.1-1% w/w)의 최종 건조 중량을 가지는 조류 배양물 310을 물 분리 공정 320으로 처리한다. 공정 320은 원심분리, 따라내기, 침강, 또는 여과를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 소결된(sintered) 금속 튜브 여과기를 사용하여 배양물의 물로부터 조류 생물질을 분리한다. 그러한 여과기를 이용하는 경우, 회수된 물 330은 다른 조류 배양에 그대로 재사용된다. 한편, 회수된 조류 생물질을 약 200 g/L(즉, 10-20% w/w)만큼 높은 조류 밀도를 갖는 "조류 반죽"으로 농축했다. 상기 농축된 조류 반죽은 이후 용매-기반 침강 공정 350에서 용매 340로 처리한다.

침강 공정 350은 용매 340를 조류 반죽에 부가하여 약 1:1 내지 약 1:10의 중량/중량 용매 대 생물질 비를 가지는 혼합물을 얻는 단계를 수반한다. 조류를 침강 용기에서 가라앉게 하고, 용매/물 혼합물 360을 예를 들면, 사이퍼닝 및/또는 따라내기에 의해 제거한다. 용매는 증류 및/또는 투석증발(pervaporation)과 같은 공지의 기술을 통해 회수하여 재사용할 수 있다. 잔여하는 습윤 생물질 370은 알코올 및 물 용액에서 약 30% 내지 약 60% w/w의 고체 함량을 가지는 것으로 예상된다.

탈수를 위해 이상적인 용매는 1.1 g/mL 초과 또는 0.9 g/mL 미만의 밀도를 갖는 공업적으로 흔한 수용성 용매이다. 예시는 이소프로판올, 아세톤, 아세토니트릴, t-부틸 알코올, 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 중수(D₂O), 에틸렌 글리콜, 및/또는 글리세린을 포함한다. 만약 용매 밀도가 1.1 g/mL를 초과한다면 조류 생물질은 침강 용기의 바닥에 침전을 형성하는 대신 떠오르게 될 것이다.

도 2는 추출 시스템 200의 예시적인 구체예의 모식도이다. 습윤하거나 건조한 조류 생물질은 이동 벨트, 스트류 컨베이어(screw conveyor), 또는 추출 챔버 통과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지인 방법을 이용하여 이동한다. 추출을 위한 용매는 각각의 생물질 투입구 위치에 배치된 저장 탱크로부터 재순환된다. 추출 혼합물은 여과되어, 생물질 고체는 다시 투입구로 그리고 추출물은 저장 탱크로 들어간다. 벨트 상의 고체는 추출을 위한 체류 시간 조건을 기준으로 주기적으로 이동한다. 각 저장 탱크 내 추출물은 포화시 보충하거나 연속적으로 새로운 용매로 대체할 수 있다. 이것은 또한 하류 가공 시간 및 비용을 상당히 줄일 수 있다. 상기 구체예는 1차 저장소 210, 이동 메커니즘 220, 복수의 분리 장치 241-248(예를 들어, 막 여과 장치), 복수의 추출 저장소 261-268, 및 복수의 재순환 펌프 281- 287를 포함한다. 상기 구체예에서, 1차 저장소 210는 다수의 유입(inlet) 저장소 211-218로 분배된다.

작동 동안, 조류 생물질 201은 이동 메커니즘 220의 1차 말단 221 근처인 1차 유입 저장소 211에 배치된다. 또한, 용매 205는 이동 메커니즘 220의 2차 말단 222 근처인 유입 저장소 218에 배치된다. 이동 메커니즘 220은 조류 생물질을 이동 메커니즘 220을 따라 1차 말단 221로부터 2차 말단 222으로 이동시킨다. 조류 생물질이 이동하는 동안, 생물질은 복수의 분리 장치 241- 248를 통과하며 다양한 극성의 분획으로 분리된다. 분리 장치 241- 248를 통과한 투석물 부분은 저장소 261-268로 향한다.

예를 들면, 1차 분리 장치 241를 통과한 상기 조류 생물질의 투석물 부분(예를 들어, 액체 및 분리 장치 241를 통과할 정도로 작은 입자를 함유하는 부분)은 1차 저장소 261로 향한다. 1차 저장소 261로부터, 상기 투석물 부분은 1차 유입 저장소 201로 다시 재순환될 수 있다. 1차 분리 장치 241를 통과하지 못한 조류 생물질의 잔류물 부분은 이후 이동 메커니즘 220에 의해 2차 유입 저장소 212 및, 1차 분리 장치 241보다 더 미세한 분리 또는 여과 매체를 포함할 수 있는 2차 분리 장치 242로 향할 수 있다.

2차 분리 장치 242를 통과한 투석물 부분의 일부분은 2차 저장소 262로 향할 수 있고, 이후 재순환 펌프 282를 통해 다시 2차 유입 저장소 212로 재순환될 수 있다. 2차 분리 장치 242를 통과하지 못한 조류 생물질의 잔류물 또는 추출된 부분은 이동 메커니즘 220에 의해 3차 유입 저장소 213로 향할 수 있다. 각 단계의 잔류물 부분은 이어지는 유입 저장소로 향하는 반면, 투석물 부분은 재순환 저장소로 향하고 현재의 유입 저장소로 다시 재순환되도록, 유입 저장소 213-218 및 분리 장치 243-248에 대해 상기 공정이 반복될 수 있다.

예시적인 구체예에서, 1차 분획은 가장 높은 물 대 약한 비극성용매 비, 즉, 가장 극성인 혼합물로 추출될 것이지만, 마지막 분획은 가장 순수한 약한 비극성용매, 즉 가장 비극성인 혼합물로 추출될 것이다. 따라서 상기 공정은 분획을 이용하여 감소하는 극성의 순서대로 성분들을 추출한다. 1차 분획의 기능은 잔여 물을 제거하고 용매 추출 공정을 촉진하는 것이다. 이어지는 분획은 극성 지질이 풍부한 반면, 최종 분획은 중성 지질이 풍부하다.

오일 분획은 긴사슬 불포화 지방산을 유리하기 위해 에스테르화될 수 있다. 비-분자 증류와 함께 분자 증류와 같은 공정을 이용하여 카르테노이드 및 긴사슬 불포화 지방산을 오일로부터 분리할 수 있다. 분자 증류를 이용하여 모든 지방산을 카르테노이드로부터 분리할 수 있다. 증류물은 정제를 위해 더작은 사슬 지방산을 분리하기 위해 단순 증류 컬럼을 이용하여 분별될 수 있다. 긴사슬 불포화 지방산이 컬럼 내에 고비점 잔여물로서 남는다.

일부 비-제한적 구체예에서, 본 명세서에 기술된 추출 시스템 및 방법은 유지성 물질(예를 들어, 조류 생물질)로부터 단백질 물질을 분리하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 그러한 단백질 추출 단계는 단백질의 분리 및 추출을 성취하기 위해 pH 조정(들)을 활용한다. 예를 들면, 한 비-제한적인 구체예에서, 1차 분리 장치 내 용매의 pH는 단백질 추출을 위해 최적화되어, 단백질 물질이 풍부한 1차 분획을 도출한다. 단백질 추출 단계의 pH는 관심의 단백질의 pKa에 따라 조정된다. 관심의 단백질의 pKa는 프와송-볼츠만 식(Poisson-Boltzmann equation), 경험적 방법, 분자 동력학 기반 방법, 또는 적정 곡선의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야의 숙련가에게 공지인 방법을 이용하여 알 수 있다.

일부 구체예에서, 용매 pH는 알칼리성이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 용매 pH는 약 10을 초과한다. 다른 구체예에서, 용매 pH는 약 10 내지 약 12의 범위이다. 추가의 구체예에서, 용매 pH는 약 10, 약 11, 또는 약 12이다. 다른 구체예에서, 용매 pH는 산성이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 용매 pH는 약 5 미만이다. 다른 구체예에서, 용매 pH는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 추가의 구체예에서, 용매 pH는 약 2, 약 3, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5이다. 1차 분리 장치의 추출된 부분은 이후 극성에 따른 추출 및 분별을 얻기 위해 이어지는 유입 저장소로 향한다. 또다른 비-제한적인 구체예에서, 단백질 물질은 최종 분리 장치에서 유사한 수단(즉, 용매 pH 조정)에 의해 분리된다.

용매 pH의 조정은 당해 분야의 숙련가에게 공지인 방법에 따라 달성된다. 예를 들면, 산성 pH는 적절한 산을 용매 스트림에 혼합하여 성취된다. 단백질 추출에 유용한 예시적인 산은 제한 없이, 인산, 황산, 및 염산을 포함한다. 유사하게, 알칼리성 pH는 적절한 염기를 용매 스트림에 부가하고 혼합하여 성취된다. 단백질 추출에 유용한 예시적인 염기는 제한 없이, 수산화칼륨, 및 수산화나트륨을 포함한다.

일부 구체예에서, 단백질 추출은 본 명세서에 기술된 추출 및 분별 시스템과 별도의 시스템에서 수행된다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 조류 생물질을 pH-조정된 용매 혼합물에 침지(soaked)한 후, 적절한 분리 기술(예를 들어, 원심분리, 또는 여과)를 통해 분리한다. 잔여 고체를 이후 본 명세서에 기술된, 극성에 기반한 추출 및 분별 시스템에 도입한다. 유사하게, 일부 구체예에서, 극성에 기반한 추출 및 분별 공정으로부터의 잔여 추출물을 pH-조정된 용매 혼합물에 노출하여 추출 공정의 마지막에 단백질 물질을 분리한다.

도 3에 나타난 바와 같이, 용매 선택 및 극성에 기반한 분별의 이론은 용매의 집중적인 분석 및 고체 물질로부터 지질의 분리를 가능하게 하는 속실렛 추출 공정을 이용하는 추출에 대한 효과에 의해 발전되었다. 지질 부류 선택성 및 회수를 위한 용매의 빠른 선별을 위해 속실렛 추출 시스템을 사용했다. 광범위한 극성을 가지는 다양한 화학물질 부류, 가령 알칸, 시클로알칸, 알킬 할라이드, 에스테르, 케톤으로부터 용매들을 시험했다. 추출 전에, 추출될 생물질의 지질 함량 및 조성을 조류 오일 예측을 위한 표준 방법 가령 블라이-다이어(Bligh-Dyer) 지질 추출 방법을 이용하여 삼중복으로 시험했다. 상기 생물질은 22.16% 총 지질을 함유했고, 그 중 49.52%는 중성 지질이었다.

도 3은 속실렛 추출 공정과 조합하여 다양한 극성 및 비극성 용매를 이용한 건조 해조 물질의 추출에 의해 모아진 데이터를 나타낸다. 알칸 용매의 사슬 길이에 따라, 60-70% 순도의 중성 지질 및 15-45%의 총 지질 회수율을 붕괴 및 용매 누출 없이 얻을 수 있다. 시험된 최장 사슬 알칸 용매인 헵탄은 60%의 중성 지질 및 42%의 총 지질을 회수했다. 도 3에 나타난 바와 같이, 헥산과 같은 용매 및 종래의 추출 방법을 이용한 건조 해조 물질의 추출의 결과는 비효율적이고, 비싸며, 빈약한 수율을 도출한다. 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 성분 손실은 최소로 하여 상이한 극성을 갖는 성분들을 분리해내기 위해 약한 비극성용매에 대한 물의 비율을 조절하여 이러한 비효율성을 다룬다.

저급 탄소 알코올 용매는 극성 지질에 대해 더욱 선택적이었다. 중성 지질 순도는 메탄올에 대해 22%이고 에탄올에 대해 45%였다. 이소프로필 알코올은 극성 및 비극성 지질 간에 어떠한 선택성도 보이지 않았고, 52% 순도 중성 지질 생성물을 도출했다. 메탄올은 67%의 총 지질 및 90% 초과의 극성 지질을 회수했다. 그러므로, 메탄올은 본 발명의 구체예를 위한 우수한 후보이며 여기서 메탄올은 헵탄 또는 헥산을 이용하여 중성 지질을 추출하기 전에 유지성 물질로부터 극성 지질을 선택적으로 추출하기 위해 사용될 수 있다. 검사된 다른 용매 부류는 중성 지질 순도가 본래의 생물질에 존재하는 지질 조성과 유사한 49%와 가까웠기 때문에, 지질 부류에 대한 어떠한 선택성도 나타내지 않았다. 게다가, 이들 용매로 성취된 총 지질 회수율은 약 15-35% 범위여서, 이들 용매들은 특정 지질 부류의 선택적 추출 또는 총 지질 추출에 부적절한 것으로 여겨졌다.

상기 속실렛 분석으로부터의 결과를 하기의 실시예 1에 기술된 표준 소규모(bench scale) 회분식 용매 추출 장치를 이용하여 확인하였다. 선택된 용매는 극성 지질을 회수하기 위한 1차 단계에서는 메탄올, 그리고 중성 지질을 회수하기 위한 2차 단계에서는 페트롤륨 에테르였다. 모든 추출은 1:10의 고체:용매 비로 수행되었다. 상기 실험에서 각각의 추출 단계는 1 시간 동안이었다. 실시된 다른 실험(데이터 나타나지 않음)은 약 45 분 또는 그 이상이 추출이 성공적이기 위해 충분히 길다는 것을 나타낸다. 이러한 체류 시간은 시스템의 열 및 질량 이동에 의존적이다.

어떤 온도가 최적인지 결정하기 위해 상이한 온도인, 40 ^oC, 50 ^oC, 및 65 ^oC에서 메탄올 추출을 수행했다. 페트롤륨 에테르 추출은 상기 용매의 비등점과 가까운 35 ℃에서 수행했다. 페트롤륨 에테르는 이것이 가진 중성 지질에 대한 높은 선택성, 낮은 비등점, 및 추출 후 관찰된 생성물의 질로 인해 선택되었다.

도 4A는 65^oC에서 메탄올 추출 단계 후에 수행된 페트롤륨 에테르 추출에서의 중성 지질 순도가 80%를 초과함을 나타내며, 이들 두 추출 단계의 조합이 최종 미정제 오일 생성물의 중성 지질 함량을 증가시켰음을 증명한다. 도 4B는 총 중성 지질 회수율이 낮았으며, 1차 단계에서 상당한 양의 중성 지질 손실이 있었음을 나타낸다.

메탄올 추출 단계에서 중성 지질의 손실을 최소화하기 위해, 용매에 물을 부가하여 용매의 극성을 증가시킬 수 있다. 도 5A 및 5B는 전술된 생물질을 70% v/v 수성 메탄올로 추출하고 이후 페트롤륨 에테르로 추출한 결과를 나타낸다. 도 5A는 페트롤륨 에테르 추출에서의 중성 지질 순도가 순수한 메탄올을 사용하여 얻은 것보다 더 높았음을 보여준다. 더욱이, 중성 지질의 손실은 1차 추출 단계에서 수성 메탄올을 사용한 것에 의해 훨씬 감소되었다. 도 5B에 나타난 바와 같이, 더 높은 온도에서의 메탄올 추출은 중성 지질 순도는 높이지만 이후의 단계에서의 총 지질 회수를 약간 감소시켰다.

일부 예시적인 구체예에서 조류 생물질 내 존재하는 조류 성분의 최적의 안정성을 보장하기 위해 추출 공정의 온도를 조절한다. 조류 단백질, 카르테노이드, 및 클로로필은 온도 민감성을 나타내는 조류 성분의 예들이다. 다른 구체예에서, 조류 생물질로부터 온도 민감성 조류 성분들이 추출되고 난 후에 온도를 높인다.

또다른 예시적인 구체예에서, 바람직한 생성물의 수율을 최적화하기 위해 추출 공정의 온도를 조정한다. 추출은 주변 온도부터 최대, 그러나 추출 혼합물의 비등점 미만으로 진행할 수 있다. 또다른 구체예에서, 추출 공정의 온도는 바람직한 생성물의 용해성에 따라 변화한다. 또다른 구체예에서, 추출 온도는 추출될 생물질의 조류 계통(strain)에 의존하여 최적화된다. 상승된 추출 온도는 바람직한 화합물의 용해성을 높이고 추출 혼합물의 점도를 감소시켜 추출 회수율을 증진한다.

일부 구체예에서, 추출은 추출 혼합물의 비등점을 상승시키는 압력 하에 진행된다. 이들 활용에 있어서, 압력은 추출 혼합물의 온도를 바람직한 생성물 중 어느 하나가 분해, 변성, 붕괴, 또는 파괴되기 시작할 온도 미만을 유지하면서, 끓는 것을 방지하기에 필요한 정도까지 증가된다.

일부 예시적인 구체예에서, 추출은 사용된 용매의 비등점 부근에서, 추출이 수행되는 조건(예를 들어, 대기압 또는 상승된 압력)으로 수행된다. 다른 구체예에서, 추출은 추출 혼합물의 비등점 부근에서, 다시 다른 추출 조건을 고려하여 수행된다. 그러한 온도에서, 조류 세포 내로의 용매의 증기상 침투는 더 낮은 질량 이동 저항으로 인해 더 빨라진다. 추출 온도가 용매의 비등점을 상당히 초과하도록 허용되는 경우, 상기 용매-물 시스템은 공비혼합물을 형성할 수 있다. 따라서, 시스템을 용매의 비등점에 또는 그 부근으로 유지하는 것은 비용을 줄이는 반면, 추출을 증진하기 위해 충분한 증기를 생성한다. 또한, 오일의 용해성은 더 높은 온도에서 증가하며, 이는 용매 비등점에 가까운 온도에서 추출의 효과를 더욱 높일 수 있다. 도 6은 수성 메탄올-페트롤륨 에테르 추출 구조에서 총 지질 회수율을 나타낸다. 메탄올 추출을 용매의 비등 온도 부근에서 수행하는 것이 도 5B에서 관찰한 바와 같이 중성 지질 회수율을 약간 떨어뜨림에도 불구하고, 이는 총 지질 회수율을 높인다.

다른 구체예에서, 추출은 주변 밝기 조건 하에 수행한다. 다른 구체예에서, 추출은 광 민감성 조류 성분이 분해되는 것으로부터 보호하기 위해 이에 제한되지 않지만 강(steel) 튜브 또는 케이스와 같은 불투명한 용기에서 수행한다. 카르테노이드가 광 민감성 조류 성분이다.

다른 예시적인 구체예에서, 추출은 일반적인 대기 조건하에 일어난다. 또다른 구체예에서, 추출은 산화되기 쉬운 조류 성분을 보호하기 위해 질소 대기하에 일어난다. 또다른 구체예에서, 추출은 산화되기 쉬운 조류 성분을 보호하기 위해 불활성 가스의 대기하에 일어난다. 산화되기 쉬울 수 있는 조류 성분은 카르테노이드, 클로로필, 및 지질을 포함한다.

예시적인 구체예에서, 추출을 위한 용매-대-고체 비는 생물질 내 고체의 건조 중량을 기초로 하여 3 내지 5 이다. 잔여 조류 생물질은 탄수화물(예를 들면, 전분)이 풍부하며 추출을 위해 사용되는 용매를 제조하기 위한 공급 원료로서 사용될 수 있다.

도 7은 총 지질 회수율에 대한 용매 대 고체 비의 효과를 나타낸다. 용매 대 고체 비가 증가된 경우, 총 지질 회수율의 상응하는 및 급격한 증가가 존재했다. 이는 다른 흔히 사용되는 오일 추출 용매 가령 헥산과 비교할 때 메탄올 내에서 지질의 낮은 용해성에 기인한다고 생각된다.

성분들의 용해성은 추출 공정에 사용되는 용매의 극성에 의해 영향을 받는다. 용해 특성은 습윤 생물질 대 용매의 비를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 40% w/w 습윤 생물질은 매 100 g의 습윤 생물질에 있어서 40 g 생물질 및 60 g 물을 갖는다. 100 g의 에탄올이 상기 혼합물에 부가되는 경우, 에탄올 대 습윤 생물질의 비는 1 부의 습윤 생물질 대 1 부의 에탄올이며 혼합물 내 에탄올의 농도는 100/(100+60)로서 액체상에서 약 62% w/w의 에탄올과 동일하다. 상기 에탄올 물 혼합물 내의 62% w/w의 에탄올은 중량으로 산출되고 성분의 극성으로 평균을 낸 6.6의 극성 지수에 해당한다. 62% 에탄올 및 38% 물을 함유하는 혼합물 내에서 5.2의 극성 지수를 갖는 에탄올, 및 9의 극성 지수를 갖는 물은 약 6.6의 극성 지수(0.62*5.2+.38*9)를 도출한다. 극성 지질 및 중성 지질의 추출을 위한 혼합물의 극성 지수는 각각 약 5.8 및 5.4으로 산출된다. 본 개시에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 이들 성분을 선택적으로 추출할 수 있는 용매 세트를 배합할 수 있을 것이다.

또다른 예에서, 추출 용매가 이소프로필 알코올 및 에탄올의 1:1 혼합물인 경우, 상기 용매의 극성은 ((3.9+5.4)/2)로 약 4.65이다. 용매 대 습윤 생물질의 비는 극성을 맞추도록 산출된다. 6.6의 극성 지수를 얻기 위해, 다음의 대수식(algebraic equation)을 풀어 산출된 55% w/w의 IPA-물 혼합물을 만들어야 한다:

x*4.65+(1-x)*9=6.6

↓

x = (9-6.6)/(9-4.65) = 0.55

↓

용매 혼합물-물 내 55% w/w의 용매

↓

40% w/w 습윤 생물질을 위해, 습윤 생물질 대 IPA 비는 (1-0.55)/0.6 ~ 0.75이다.

40% w/w 습윤 생물질을 이용하면 이것은 100 부의 습윤 생물질 대 75 부의 용매 혼합물의 비율과 일치할 것이다. 40% w/w 습윤 생물질은 매 100 g의 습윤 생물질에 있어서 40 g 생물질 및 60 g 물을 갖는다. 75 g의 용매 혼합물이 상기 혼합물에 부가되는 경우, 혼합물 내 용매의 농도는 (75/(75+60))으로 용매 혼합물-물 용액 내에서 약 55% w/w의 용매 혼합물이다. 상기 계산법은 각각의 추출 단계에서 그리고 각각의 생성물에 대해 용매 생물질 비를 얻기 위해 사용할 수 있다. 용매 세트의 몇몇 비제한적인 예시가 표 3에 나타난다.

	습윤 생물질 부( part )	용매 부	생물질 건조도	건조 생물질 부	물 부	용매- 물 비	추출 용매 극성 지수
한 단계 단백질 추출
에탄올	100	99	40%	40	60	0.62	5.2
IPA	100	52	40%	40	60	0.46	3.9
MeOH	100	93	40%	40	60	0.61	5.1
프로판올	100	54	40%	40	60	0.47	4
1:1 IPA EtOH 혼합물	100	68	40%	40	60	0.53	4.55
95% 에탄올 물 혼합물	100	115	40%	40	60	0.66	5.39
95% 에탄올 5% 메탄올 혼합물	100	99	40%	40	60	0.62	5.195
95% 에탄올 5% IPA 혼합물	100	95	40%	40	60	0.61	5.135
한 단계 극성 지질 추출
에탄올	100	320	40%	40	60	0.84	5.2
IPA	100	101	40%	40	60	0.63	3.9
MeOH	100	274	40%	40	60	0.82	5.1
프로판올	100	107	40%	40	60	0.64	4
1:1 IPA EtOH 혼합물	100	154	40%	40	60	0.72	4.55
95% 에탄올 물 혼합물	100	468	40%	40	60	0.89	5.39
95% 에탄올 5% 메탄올 혼합물	100	317	40%	40	60	0.84	5.195
95% 에탄올 5% IPA 혼합물	100	289	40%	40	60	0.83	5.135
한 단계 중성 지질 추출
에탄올	100	1,080	40%	40	60	0.95	5.2
IPA	100	144	40%	40	60	0.71	3.9
MeOH	100	720	40%	40	60	0.92	5.1
프로판올	100	154	40%	40	60	0.72	4
1:1 IPA EtOH 혼합물	100	254	40%	40	60	0.81	4.55
95% 에탄올 물 혼합물	100	21,600	40%	40	60	1.00	5.39
95% 에탄올 5% 메탄올 혼합물	100	1,054	40%	40	60	0.95	5.195
95% 에탄올 5% IPA 혼합물	100	815	40%	40	60	0.93	5.135

모든 실시예에 기술된 추출 혼합물은 실질적 고체상 및 실질적 액체상으로 이루어진다. 이들 상들은 이후 추출 뒤 분리된다. 그런 다음 액체상으로부터 액체 용매를 제거하여, 추출 생성물을 수득한다. 일부 구체예에서, 용매는 증발된다. 그러한 사용에 있어서, 증발되어야 하는 용매의 양을 줄이기 위해 액체-액체 추출 기술을 사용할 수 있다. 사용된 임의의 용매는 조건이 허용된다면 재사용할 수 있다.

추출 전 조류 생물질의 처리가 지질 추출의 생산성 및 효율성을 증진한다는 점이 이론화되어 있다. 이러한 방향으로 염기 또는 또다른 유기 용매를 조류 생물질에 부가하여 표면 특성을 변화시키고 추출을 증진하는 것의 효과를 비교하는 실험을 수행했다. 수성 메탄올, 수성 수산화나트륨, 및 수성 DMSO를 비롯한 다양한 처리를 시도했다. 도 8에서 입증되는 바와 같이, 5% DMSO의 부가는 지질 회수율을 3-배 증가시켰다. 메탄올 추출 단계를 극적으로 줄이기 위해 이들 추출 단계를 활용할 수 있다. 그러나, 상기 실험에 사용된 용액들은 높은 비용, 점도, 및 DMSO를 회수하고 재사용하는 능력으로 인해 더 큰 규모에서의 사용에는 이상적이지 않을 수 있다.

도 9는 누적 총 지질 수율 및 추출된 중성 지질의 순도에 대한 8단계 메탄올 추출의 효과를 나타내는 도표이다. 상기 구체예에서, 112 그램의 습윤 생물질(25.6% 건조 중량)을 350 mL의 순수한 메탄올을 이용하고, 각 단계에서 160 W 광도력 (irradiance power)에서 10분간 가열하여 추출했다. 이는 추출 혼합물의 비등점 부근인 약 75 ℃ 의 추출 온도를 도출했다. 상기 공정을 이용하여, 일단 대부분의 극성 지질이 추출되었으면 조류 오일로부터 매우 순수한 중성 지질을 얻을 수 있는 것으로 결정되었다. 도 9는 일단 극성 지질이 모두 추출되면 고순도 중성 지질의 분리가 가능함을 나타낸다. 상기 경우에 메탄올 추출 단계 5내지 8에서 90%가 넘는 중성 지질의 순도를 가지고 5% 수율의 총 생물질이 수득되었다. 게다가, 추출 혼합물의 비등점으로 인해, 생물질 내의 대부분의 물은 1차 추출 단계에서, 탄수화물, 단백질 및 금속과 더불어 완전히 추출된다.

도 10은 지질의 회수가 습윤 생물질로부터 지질 및 단백질을 추출하기 위한 에탄올의 사용에 의해 훨씬 효율적이 될 수 있음을 나타낸다. 에탄올을 사용하여, 메탄올을 이용할때 일반적으로 요구되는 9단계가 아닌 약 4 단계에서 80%의 총 지질 회수율을 얻을 수 있다. 회수율의 상기 증가는 메탄올에 비해 에탄올에서 더 높은 지질의 용해성 덕분일 수 있다. 게다가, 수성 에탄올의 비등점은 수성 메탄올보다 더 높아서, 지질의 회수를 더욱 촉진시킨다. 이것은 더 높은 온도가 오일을 덜 점성있게 만들고, 이를 통해 분산력이 증가되기 때문이다. 상기 공정의 또다른 구별되는 이점은 오일 분획 내의 잔여 에탄올이 트랜스에스테르화를 위해 사용되는 점뿐 아니라 생물질 건조 공정에 투입되는 열을 줄이는 점이다.

또한, 도 10은 초기 분획은 단백질 및 다른 매우 극성인 분자를 함유하며 지질이 풍부하지 않고, 이후 극성 지질 풍부 분획 및 마지막으로 중성 지질 분획이 되는 것을 입증한다. 따라서 추출 장비의 적절한 설계를 이용하여, 세 가지 생성물을 모두 단일 추출 및 분별 공정에서 회수할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예는 추출을 보조하기 위해 마이크로웨이브(microwave)를 활용한다. 본 명세서에서 개시된 앞서 수집된 데이터를 기초로 하여, 메탄올이 조류로부터의 모든 지질의 추출을 위한 제일 좋은 단일 용매인 것이 나타난다. 따라서, 한 용매 마이크로웨이브 추출 시스템의 효과에 대한 데이터를 모으기 위해 본 명세서의 실시예 1에 기술된, 단일 용매 복합 단계 추출을 수행했다.

도 11은 종래의 추출 및 마이크로웨이브-보조 추출의 추출 시간 및 총 지질 회수율을 비교하는 대수 선도이다. 곡선의 기울기를 기초로 하여, 마이크로웨이브 시스템이 추출 시간을 약 5 배 이상 감소시키는 것을 산출하였다. 비록 종래의 방법이 더 높은 순(net) 지질 회수율을 갖지만, 이는 극성 지질의 더 높은 회수율 때문이다. 이들 결과를 기초로 하여, 마이크로웨이브 보조와 함께 또는 보조 없이 용매를 사용하는 건조 조류 생물질의 추출을 위한 조건을 최적화하였다. 본 발명의 일부 구체예는 물 분자를 진동시키는 파장을 방출하는 통상적인 마이크로웨이브 장비를 사용한다. 본 발명의 추가적인 구체예는 상이한 용매를 진동시킬 수 있는 주문제작된 마이크로웨이브 장치를 활용한다. 본 발명의 또다른 구체예는 조류 생물질에 존재하는 지질을 진동시킬 수 있는 주문제작된 마이크로웨이브 장치를 활용한다. 일부 구체예에서, 조류 생물질에 존재하는 지질은 마이크로웨이브를 이용하여 진동되며, 이를 통해 조류 생물질로부터의 지질 성분의 분리 및 추출이 증진된다.

수분 함량은 오일 추출의 효율에 영향을 주게 될 생물질의 또다른 파라미터이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 건조 조류 물질을 추출하고 분별한다. 다른 구체예에서, 조류 물질은 습윤하다. 추출 성능에 대한 수분의 영향을 조사하기 위해 10%, 25%, 및 33%의 조류 물질 함량을 가지는 생물질 샘플을 사용했다.

도 12A는 조류 생물질로부터 생성물을 다단식으로 추출하기 위한 예시적인 공정 400을 나타낸다. 도 12A의 모든 단위는 파운드이다. 도 12A는 공정 400의 물질 수지를 나타내지만, 공정을 수행하기 위한 장비 및/또는 시스템의 세부 사항은 본 명세서의 다른 곳에 기술된다. 5 파운드의 조류를 함유하는 생물질은 약 0.63 파운드의 극성 지질, 1.87 파운드의 중성 지질, 1 파운드의 단백질, 및 1.5 파운드의 탄수화물을 갖는다. 상기 생물질 및 1000 파운드의 물을 탈수 단계 405에서 처리하며, 여기서 950 파운드의 물이 상기 혼합물로부터 분리되고 45 파운드의 물 내 5 파운드의 조류가 1차 추출 단계 410으로 보내진다. 본 명세서에 개시된 탈수 기술 중 어느 하나를 탈수 단계 405에서 사용할 수 있다. 1차 추출 단계 410에서, 238 파운드의 에탄올 및 12 파운드의 물을 이전 단계로부터의 조류 및 물과 조합한다. 상기 1차 추출 단계 410는 약 80.9% w/w 에탄올의 액체상을 갖는다. 231 파운드의 에탄올, 53 파운드의 물, 및 0.5 파운드의 조류 단백질의 1차 액체상을 회수하고, 이로부터 물 및 에탄올을 예를 들면, 증발을 통해 제거하여, 단백질-풍부한 생성물 415을 남긴다. 상기 증발로부터 회수된 용매는 1차 추출 단계 410로 재순환될 수 있다.

1차 추출 단계 410로부터의 1차 고체상은 2차 추출 단계 420로 넘어가며; 상기 1차 고체상은 4.5 파운드의 조류, 2.6 파운드의 물, 및 10.9 파운드의 에탄올을 포함한다. 86 파운드의 에탄올 및 4 파운드의 물을 이전 단계로부터의 상기 1차 고체상에 부가한다. 2차 추출 단계 420는 약 93.6% w/w 에탄올의 액체상을 가진다. 85.9 파운드의 에탄올, 5.9 파운드의 물, 및 0.6 파운드의 극성 지질의 2차 액체상을 회수하고, 이로부터 물 및 에탄올을 예를 들면, 증발을 통해 제거하여, 극성 지질-풍부한 생성물 425을 남긴다. 상기 증발로부터 회수된 용매는 2차 추출 단계 420로 재순환될 수 있다.

2차 추출 단계 420로부터의 2차 고체상은 3차 추출 단계 430로 넘어가며; 상기 1차 고체상은 3.9 파운드의 조류, 0.7 파운드의 물, 및 11 파운드의 에탄올을 포함한다. 70.5 파운드의 에탄올 및 3.5 파운드의 물을 이전 단계로부터의 2차 고체상에 부가한다. 3차 추출 단계 430는 약 95.4% w/w 에탄올의 액체상을 가진다. 78.9 파운드의 에탄올, 3.9 파운드의 물, 및 1.6 파운드의 중성 지질의 3차 액체상을 회수하고, 이로부터 물 및 에탄올을 예를 들면, 증발을 통해 제거하여, 중성 지질-풍부한 생성물 435을 남긴다. 상기 증발로부터 회수된 용매는 2차 추출 단계 430로 재순환될 수 있다. 고체상의 2.3 파운드의 조류, 0.3 파운드의 물, 및 6.6 파운드의 에탄올이 잔여한다.

도 12A에서 입증된 바와 같이, 각각의 연속적인 에탄올 추출 단계를 이용하여 수득되는 지질 프로파일은 출발하는 조류 내 수분 함량에 의해 크게 영향받았다. 공정 400의 모델을 각각 서로 다른 초기 물 함량을 가지는 세 가지 상이한 생물질 조합에 대해 진행했다. 초기 물 함량이 감소하면서, 최대 지질 회수 단계가 3차 추출 단계부터 4분의 1(나타나지 않음)로 변화했다. 그러나, 이들 세 가지 생물질 샘플로부터의 전반적인 지질 회수율은 거의 유사했고, 모두 조류 생물질의 총 지질 함량의 95%를 초과했다.

더 높은 수분 함량을 가지는 조류 물질이 사용된 경우, 수성 에탄올 혼합물 내 에탄올 농도는 훨씬 낮았고, 결과적으로 미정제 추출물 내 중성 지질 백분율 또한 더 낮았다. 90% 물을 갖는 조류 반죽을 탈수하는 것은 매우 에너지 집약적인 공정인 것이 보고되어 있다. 놀랍게도 대부분 물을 함유하는 조류 물질을 성공적으로 추출하고 분별하기 위해 본 명세서에 기술된 방법을 사용할 수 있다. 종래의 추출 방법과 달리, 90% 물 (10% 조류 고체)을 함유하는 조류반죽으로 시작하는 것에 전반적인 지질 회수율이 크게 영향받지 않았으므로, 본 명세서에 개시된 방법은 에너지 집약적인 건조 단계의 사용을 필요로 하지 않는다.

도 12B는 공정 400의 추출 단계 중 하나의 예시적인 실시 500를 나타낸다. 조류 생물질 및 용매 혼합물 505을 추출 용기 510에 제공한다. 조류를 (본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이) 추출한 후에, 혼합물을 소결된 금속 튜브 여과기와 같은 거친 여과 시스템 515에 제공하여, 혼합물을 액체상 및 고체상으로 나눈다. 고체상을 하류 추출 단계로 보낸다. 액체상을 용매 제거 시스템 520, 예를 들어, 증발기에 보내어, 상기 액체상 내 용매(예를 들어, 에탄올) 함량을 감소시킨다. 용매 제거 후 잔여하는 액체상은 임의로, 원심분리 525로 보낸다. 용매 제거 시스템 내 잔여하는 임의의 고체는 재순환시키거나 폐기한다. 원심분리 525는 바람직한 조류 생성물(예를 들어, 단백질 또는 지질)을 액체상에 잔여하는 임의의 물 및/또는 고체로부터 분리하는 것을 보조한다.

도 14는 조류 물질을 처리하여 하나 이상의 조류 생성물을 형성하거나 회수할 수 있는 공정 600의 예시를 나타낸다. 상기 예시에서, 조류 생물질은 본 명세서에 개시된 방법을 이용하는 전위(front-end) 공정 605에서 다단식 방식으로 추출한다. 성분 및 생성물을 더욱 분리하기 위해 상기 추출 및 분리 단계 후에 에스테르화 공정 610, 가수분해 공정 615, 수소처리 공정 620, 및/또는 증류 공정 625이 이어진다. 상기 성분 및 생성물은 조류 지질, 조류 단백질, 글리세린, 카르테노이드, 기능성 식품(nutraceuticals)(예를 들어, 긴사슬 불포화 오일 및/또는 에스테르), 연료 에스테르(일반적으로, C20 이하의 사슬 길이를 가지는 에스테르), 연료, 연료 첨가물, 나프타(naphtha), 및/또는 액체 석유 대체물을 포함한다. 바람직한 구체예에서 연료 에스테르는 C16 사슬 길이이다. 다른 구체예에서, 연료 에스테르는 C18 사슬 길이이다. 또다른 구체예에서, 연료 에스테르는 C20 이하의 사슬 길이의 혼합물이다.

에스테르화 공정 610, 가수분해 공정 615, 수소처리 공정 620, 및 증류 공정 625는 선택적이며 다양한 순서로 사용할 수 있다. 대쉬(dash) 화살표 및 점(dot) 화살표는 가수분해, 수소처리, 및/또는 증류 공정이 지질 분획의 처리에서 수행될 수 있는 경우에 대한 일부의, 그러나 전부는 아닌 선택사항을 가리킨다. 예를 들면, 본 발명의 일부 구체예에서, 추출 및/또는 분리를 수행한 후에, 연료 생성물 및/또는 첨가물을 만들기 위해 상기 중성 지질 분획을 직접 수소처리할 수 있다. 대안적으로, 다른 구체예에서, 상기 중성 지질 분획을 에스테르화 공정 610으로 보낼 수 있다.

에스테르화 공정 610은 당해 분야에 공지된 기술, 가령 산/염기 촉매화를 포함할 수 있고, 트랜스에스테르화를 포함할 수 있다. 비록 염기 촉매화가 일부 생성물의 제조에 있어서 배제되지 않지만, 산 촉매화가 선호되며 이는 상기 기술이 염기 촉매화 도중에 형성되는, 하류 공정을 어렵게 할 수 있는 비누를 회피하기 때문이다. 효소적 에스테르화 기술이 또한 사용될 수 있다. 에스테르화는 실질적으로 순수한 지질 물질(본 명세서에 사용된 바와 같은 75%초과의 지질)을 가공할 수 있다. 에스테르화 후에, 글리세린 부산물을 제거할 수 있다. 에스테르화된 지질은 이후 다양한 사슬 길이의 에스테르화된 지질 뿐만 아니라 지질 분획 내에 존재하는 카르테노이드를 분리하기 위해 분자 및/또는 비분자 증류(공정 625)를 겪을 수 있다. 상기 에스테르화된 지질은 이후 항공유, 바이오디젤, 및 기타 연료 제품을 생성하기 위해 수소처리 공정 620으로 이동할 수 있다. 당해 분야에 공지인 임의의 수소처리 공정이 사용될 수 있으며; 그러한 공정은 지질 분자에 수소를 부가하고 산소 분자를 제거한다. 수소처리를 위한 예시적인 조건은 600 psi의 범위의 고압 및 600℉의 범위의 온도 하에 트리글리세라이드, 지방산, 지방산 에스테르를 수소와 반응시키는 것을 포함한다. 일반적으로 사용되는 촉매는 NiMo 또는 CoMo이다.

미정제 지질보다 연료 에스테르를 수소처리하는 것은 여러 이점을 갖는다. 먼저, 에스테르화 공정 610은 조류 오일에 존재하는 특정한 인 및 금속 화합물의 수준을 감소시킨다. 이들 물질은 수소처리 공정에서 전형적으로 사용되는 촉매에게는 독이 된다. 따라서, 수소처리 전의 에스테르화는 수소처리 촉매의 수명을 연장한다. 또한, 에스테르화는 수소처리되는 화합물의 분자량을 감소시키며, 이를 통해 수소처리 공정 620의 성능을 향상시킨다. 역시 또한, 증류 공정 625으로부터의 연료 에스테르를 증기 형태로 수소처리되게 유지하는 것이 유리한데, 그렇게 함으로써 수소처리를 위해 요구되는 에너지가 감소하기 때문이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 중성 조류 지질은 지질을 연료 생성물 및 첨가물로 전환하기 위해 직접 수소처리된다. 한편 다른 실시에서, 중성 지질은 에스테르화되고 증류 공정 625을 통해 카르테노이드, 긴사슬 불포화 에스테르, 에이코사펜타에노산 (EPA) 에스테르, 및/또는 연료 에스테르로 분리된다. 증류 공정 625는 분자 증류뿐 아니라 당해 분야에 공지된 임의의 증류 기술을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 증류액을 정제를 위해 더작은 사슬 지방산을 분리하기 위해 단순 증류 컬럼을 이용하여 분별할 수 있다. 긴사슬 불포화 지방산은 컬럼 내에 고비점 잔여물로 남는다. 일부 구체예에서, 잔여 증기는 이후 수소처리 공정으로 보낼 수 있다. 본 발명의 두 가지 이점은 순수한 공급물 뿐 아니라 증기 생성물을 수득하여, 상기 기술된 바와 같이 에너지 집약적인 수소처리 반응을 쉽게 하는 점이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 극성 지질(및, 선택적으로, 중성 지질)은 에스테르화 공정으로 보내지기 전에 가수분해 공정 615에서 가수분해된다. 그렇게 함으로써 조류 지질의 지방산이 풀리고, 더 많은 양의 조류 지질이 유용한 생성물로 형성되게 한다.

도 15는 중성 지질로부터 기능성 식품을 제조하기 위한 공정 700을 나타내는 흐름도이다. 공정 700의 한 실시에 있어서, 중성 지질을 EPA-풍부 오일로부터 카르테노이드를 분리하는 흡착 공정 705으로 보낸다. 중성 지질은 본 명세서에 개시된 임의의 선택적인 추출 기술에 의해 생성된 조류 원천에서 유래할 수 있다. 그러나, 상기 중성 지질은 식물 원천과 같은 다른 원천에서 유래할 수 있다.

흡착 공정 705은 중성 지질을 흡착제와 접촉시켜 베타 카로텐 및 크산토필과 같은 카르테노이드를 흡착하는 단계를 포함한다. 한 실시에서, 상기 흡착제는 디아이온(Diaion) HP20SS(ITOCHU 케미칼스 아메리카(Chemicals America)사에서 구입가능)이다. 중성 지질은 회분-식 공정에서 흡착제와 접촉할 수 있고, 여기서 상기 중성 지질 및 흡착제는 선택된 양의 시간 동안 한 용기에 있게 된다. 접촉 시간 후에, 상기 흡착제 및 액체를 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 분리한다. 다른 실시에서, 흡착제를 흡착제 상(bed)에 있게 하고, 중성 지질을 상기 흡착제 상에 통과시킨다. 흡착제 상을 통과하면서, 중성 지질의 카르테노이드 함량이 감소하고, 이를 통해 EPA가 풍부한 오일을 생성한다.

흡착제를 알코올 가령 에탄올, 이소프로필 알코올, 부탄올, 에스테르 가령 에틸 아세테이트 또는 부틸 아세테이트, 알칸 가령 헥산, 및 펜탄을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적절한 용매로 처리하여 카르테노이드를 흡착제 물질로부터 회수할 수 있다.

도 16은 중성 지질 805로부터 연료 생성물 830을 제조하기 위한 공정 800을 나타내는 흐름도이다. 중성 지질은 본 명세서에 개시된 임의의 선택적인 추출 기술에 의해 생성된 조류 원천에서 유래할 수 있다. 그러나, 상기 중성 지질은 식물 원천과 같은 다른 원천에서 유래할수 있다. 중성 지질을 탈검 공정 810에서 처리하고, 여기서 상기 지질은 산 세척되어 중성 지질 내 금속 및 인지질의 수준이 감소된다. 일부 실시에서, 비교적 희석된 인산 용액을 상기 중성 지질에 부가하고, 혼합물을 가열하고 교반한다. 침전된 인지질 및 금속을 이후 잔여 오일로부터, 예를 들면, 원심분리를 통해 분리한다.

상기 처리된 오일을 이후 표백 공정 815으로 보내어 클로로필 및 기타 색소 화합물을 제거한다. 일부 실시에서, 표백 공정 815은 오일을 점토 및 또는 다른 흡착제 물질 가령 표백 점토(즉 벤토나이트 또는 풀러토(fuller's earth))와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계는 오일 내 클로로필 및 기타 색소 화합물의 수준을 감소시킨다. 처리된 오일은 이후 수소처리 공정 820으로 향하고, 상기 공정은 오일의 성분들을 수소화하고 탈산소화하여 연료 제품, 예를 들면, 항공유 혼합물, 디젤 연료 첨가물, 및 프로판을 형성한다. 또한, 상기 수소처리 공정 820은 또한 일부 크래킹(cracking) 및 더작은 사슬 화합물, 가령 LPG 및 나프타의 생성을 야기한다. 본 명세서에 기술된 임의의 수소처리 공정을 수소처리 공정 820을 위해 사용할 수 있다.

수소처리 공정 820에서 생성된 화합물의 혼합물은 이들을 다양한 연료 생성물 830로 분리하기 위해 증류 공정 825으로 보내진다. 증류 공정 825는 본 명세서에 기술되거나 연료 화합물의 분리에 대해 당해 분야에 공지인 분자 및 비-분자 증류 기술 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 조류 생물질로부터 선택적으로 단백질을 추출될 수 있다. 개시된 방법을 이용한 단백질의 추출은 많은 장점을 제공한다. 특히, 바람직한 단백질을 추출하기 전에 조류 세포를 용리할 필요가 없다. 이는 추출을 단순화하고 비용을 낮춘다. 본 발명의 방법은 조류 배양물, 생물질, 반죽, 또는 케익으로부터 단백질을 선택적으로 추출하고 분별하기 위해 상이한 부류의 단백질의 용해도 프로파일을 활용한다.

예를 들면, 조류 생물질에 가열 및 혼합을 가하여 물 및 알부민 및 글로불린으로 지칭되는 염용성 단백질을 추출할 수 있다. 상기 혼합물에 이후 pH 변화를 가하여 글루텔린으로 지칭되는 알칼리 용해성 단백질을 회수할 수 있다. 상기 단계 이후 프롤라민으로 지칭되는 알코올 용해성 단백질의 용매-기반 분리가 이어질 수 있다. 잔여 생물질은 탄수화물 및 지질이 풍부할 것이다.

단백질은 도 17 및 도 18에서 나타난 바와 같이 염수 및 담수 조류 세포 모두에서 추출할 수 있다. 염수 조류 배양물 또는 생물질 내의 염의 존재는 상이한 부류의 단백질의 추출에 영향을 주지만, 본 명세서에 개시된 방법은 담수 또는 염수 조류로부터 단백질을 선택적으로 추출할 수 있게 한다.

일부 구체예에서, 담수 조류 세포로부터의 단백질의 추출은 도 17에 나타난 신규한 공정에 의해 달성된다. 담수 조류 세포 또는 담수 조류 생물질을 가열하고 혼합한다. 혼합은 당해 분야에 공지인 다양한 방법 가령, 이에 제한되지 않지만 휘젓기(stirring), 교반, 및 흔들기(rocking)에 의해 달성될 수 있다. 상기 공정은 1차 실질적 액체상 및 1차 실질적 고체상으로 이루어진 1차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리한다. 분리는 원심분리, 따라내기, 부유, 침강, 및 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지인 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 1차 실질적 액체상은 알부민 단백질이 풍부하다.

상기 1차 실질적 고체상을 이후 염수와 혼합하고 가열하여 2차 실질적 액체상 및 2차 실질적 고체상으로 이루어진 2차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 상기 염수는 중성 해수일 수 있거나 수성 염 용액일 수 있다. 그러한 용액의 예는 주로 NaCl를 포함하며 약 전형적으로 35 g/L을 포함할 것이다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리한다. 상기 2차 실질적 액체상은 글로불린 단백질이 풍부하다.

상기 2차 실질적 고체상을 이후 물과 혼합하고 가열하여 3차 실질적 액체상 및 3차 실질적 고체상으로 이루어진 3차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 이후 상기 3차 추출 혼합물 또는 슬러리의 pH를 약 9 이상으로 조정하여, 상기 3차 실질적 액체상에 글루텔린 단백질이 풍부하게 한다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리하고, 상기 3차 실질적 액체상은 글루텔린 단백질이 풍부하다.

상기 3차 실질적 고체상을 이후 용매 세트와 혼합하고 가열하여 4차 실질적 액체상 및 4차 실질적 고체상으로 이루어진 4차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 용매 세트는 에탄올을 포함한다. 다른 비-제한적 구체예에서, 상기 용매 세트는 다음 용매 중 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리한다. 상기 4차 실질적 액체상은 프롤라민 단백질이 풍부하다. 잔여하는 4차 실질적 고체상은 출발하는 조류 생물질의 조성에 따라 지질이 풍부할 수 있다.

일부 구체예에서, 염수 조류 세포로부터의 단백질의 추출은 도 18에 나타난 신규한 공정에 의해 달성된다. 염수 조류 세포 또는 염수 조류 생물질을 가열하고 혼합한다. 혼합은 당해 분야에 공지인 다양한 방법 가령, 이에 제한되지 않지만 휘젓기, 교반, 및 흔들기에 의해 달성될 수 있다. 상기 공정은 1차 실질적 액체상 및 1차 실질적 고체상으로 이루어진 1차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리한다. 분리는 원심분리, 따라내기, 부유, 침강, 및 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지인 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 1차 실질적 액체상은 글로불린 단백질이 풍부하다.

상기 1차 실질적 고체상을 이후 물과 혼합하고 가열하여 2차 실질적 액체상 및 2차 실질적 고체상으로 이루어진 2차 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성한다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리한다. 상기 2차 실질적 액체상은 알부민 단백질이 풍부하다.

개시된 방법은 또한 도 17-20에 나타난 바와 같이, 상이한 유형의 단백질의 선택적인 추출을 가능하게 한다. 단일 단백질 생성물을 선택적으로 추출하기 위해 전술된 추출 공정의 단계 중 어느 하나를 나머지 단계들과 별도로 수행할 수 있다. 이중 두 가지 예가 추출 단계 1a 주변에 점선 박스를 통해 나타난 것과 같이 도 17 및 18에 나타난다.

비-제한적인 예시에서, 글로불린 단백질은 담수 조류 생물질로부터 상기 생물질을 염수와 혼합하고 가열하여 실질적 액체상 및 실질적 고체상으로 이루어진 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성함으로써 선택적으로 추출할 수 있다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리할 수 있다. 상기 액체상은 글로불린 단백질이 풍부하다. 도 17, 추출 단계 1a를 참조.

또다른 비-제한적인 예시에서, 알부민 단백질은 염수 조류 생물질로부터 상기 생물질을 물과 혼합하고 가열하여 실질적 액체상 및 실질적 고체상으로 이루어진 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성함으로써 선택적으로 추출할 수 있다 상기 고체 및 액체상을 이후 분리할 수 있다. 상기 액체상은 글로불린 단백질이 풍부하다. 도 18, 추출 단계 1a를 참조.

추가적인 비-제한적인 예시에서, 도 19에 나타난 바와 같이 담수 또는 염수 조류 생물질로부터 프롤라민 단백질을 선택적으로 추출할 수 있다. 조류 생물질을 용매 세트와 혼합하고 가열하여 실질적 액체상 및 실질적 고체상으로 이루어진 가열된 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성함으로써 선택적인 추출이 달성된다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리할 수 있다. 상기 액체상은 프롤라민 단백질이 풍부하다.

또다른 비-제한적인 예시에서, 도 20에 나타난 바와 같이 담수 또는 염수 조류 생물질로부터 단백질 분획을 선택적으로 추출할 수 있다. 조류 생물질을 용매 세트와 혼합하여 추출 혼합물 또는 슬러리를 생성하고 상기 혼합물의 pH를 변화시킴으로써 선택적인 추출이 달성된다. 상기 혼합물은 실질적 액체상 및 실질적 고체상으로 이루어진다. 상기 고체 및 액체상을 이후 분리할 수 있다. 상기 액체상은 단백질이 풍부하다.

본 발명의 이들 양태를 접하면, 당해 분야의 숙련가는 바람직한 단백질을 담수 또는 염수 조류 생물질로부터, 단일 단계 추출 공정, 또는 다중-단계 추출 공정에 의해 선택적으로 추출할 수 있을 것이다. 본 개시에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 조류 물질의 단백질 함량 및 관심의 단백질의 용해성 특성을 고려하는 것을 전제로, 상기 개시된 다중-단계 추출 구조의 순서를 맞바꿀 수 있을 것이다. 개시된 방법의 다른 구체예는 각각의 추출 단계 사이에 세정 단계를 포함할 수 있다.

임의의 개시된 단백질 추출 방법에 있어서, 상기 추출 혼합물/슬러리는 일정 기간 동안 가열된 온도로 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 추출 혼합물은 약 20 분 내지 약 90 분간 가열된 온도로 유지된다. 일부 양태에서, 추출 혼합물은 약 20 분 내지 약 60 분간 가열된 온도로 유지된다. 다른 양태에서, 추출 혼합물은 약 45 분 내지 약 90 분간 가열된 온도로 유지된다.

일부 구체예에서, 상기 추출 혼합물/슬러리는 약 50℃ 미만의 온도로 가열할 수 있다. 일부 양태에서, 알부민, 글로불린, 및 글루텔린 단백질을 약 50℃ 미만의 온도에서 추출한다. 다른 구체예에서 추출 혼합물/슬러리를 상기 추출 혼합물/슬러리의 비등점에 가까운 온도로 가열한다. 일부 양태에서, 프롤라민 단백질을 상기 추출 혼합물/슬러리의 비등점에 가까운 온도에서 추출한다. 다른 구체예에서 추출을 증진하기 위해 가열 및 혼합 단계동안 최대 및 50psi를 포함하여 대기압을 초과하게 압력을 올린다.

실시예 1

녹색 미세조류인 뗏목말(Scendesmus dimorphus, SD)을 외부 패널 광생물 반응기(photobioreactor)에서 배양했다. 다양한 지질 함량의 SD 샘플을 수확했다. 벌크 물을 원심분리로 제거한 후에, 상기 조류 샘플을 사용전까지 -80℃ 에서 3-5 cm 조류 케익으로 저장했다. 미리 계산된 양의 습윤 조류 생물질(15 그램 건조 조류 중량 당량) 및 90 mL의 에탄올 용매를 응축기, 기계적 교반기 및 열전대(thermocouple)가 구비된 3-목 플라스크에 부가했다. 한 실험에서, 혼합물을 마이크로웨이브 방사 하에 10분간 환류시켰다. 두 번째 실험에서, 혼합물을 전기적 가열을 이용하여 한 시간 동안 환류시켰다. 그 이후에, 혼합물을 실온으로 냉각하고 여과하여 투석물과 잔류물로 분리했다.

블라이 및 다이어의 지질 추출 방법에 따라 클로로포름-메탄올-물 시스템을 이용하여 조류 샘플의 총 지질을 분석했다. 상기 총 지질 값을 지질 회수율 계산을 위한 기준으로서 사용했다. 총 지질을 60-200 메쉬 실리카겔(머크 사(Merck Corp.), 독일)을 사용하는 표준 컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 중성 지질 및 극성 지질로 더욱 분리했다. 각각의 지질 분획을 미리 칭량된(weighed) 바이알로 옮기고, 먼저 30℃에서 회전 증발기(뷔키(Buechi), 스위스)로 증발시킨 후 고진공하에 건조했다. 상기 건조된 잔류물을 질소 하에 배치한 후 칭량했다. 내부 표준으로서 헵타데카노산 (C17:0)을 이용하여 지방산 메틸 에스테르로 유도체화한 후에 GC-MS를 통해 각각의 샘플의 지방산 프로파일을 정량화했다.

상기 결과(데이터 나타나지 않음)는 마이크로웨이브 보조 추출이 1차 추출 단계에서 극성 지질의 제거를 위해 최적이며, 중성 지질의 분리에 있어서는 다소 덜 효과적임을 나타냈다. 전기적 가열은 추출 효과에 있어서 더욱 일정하다. 최종 수율은 마이크로웨이브 보조 추출 및 전기적 가열 보조 추출간에 대등하지만, 마이크로웨이브 보조 추출이 상당히 더 빠르다.

실시예 2

조류 생물질로부터의 단백질 추출

(1) 산 침출: 조류 생물질을 pH 4.5의 물에 1 시간 동안 침지했다. 이후 샘플을 3000 rpm으로 3분간 원심분리하고, 상청액을 제거했다. 잔여 고체를 희석 산(pH 4.5)으로 3회 세정하고 동결건조했다.

(2) 알칼리성 추출: 조류 생물질을 pH 11의 물에 1 시간 동안 침지했다. 이후 pH-조정된 물을 부가했다. 이후 샘플을 3000 rpm으로 3분간 원심분리하고, 상청액을 제거했다. 상청액을 산(pH 4.5)으로 중화한 뒤 원심분리했다. 잔여 고체를 희석 산(pH 4.5)으로 3회 세정하고 동결건조했다.

산 침출 및 알칼리성 추출의 결과는 하기 표 4에 나타난다.

공정	단백질 수율 (% 중량)	단백질 순도 (단백질 수율의 % 중량)
알칼리성 추출	16	45
산 침출	70	32.5

단백질 수율은 중량을 기준으로 하여, 동결건조된 고체의 중량을 pH-조정된 물에 침지하기 전의 조류 생물질의 중량과 비교하여 계산했다. 단백질의 순도는 미국유지화학회(American Oil Chemists' Society)의 공식적 방법(Ba-2a-38)에 의해, 각각의 공정의 동결건조된 고체에서 질소의 양을 측정하여 결정했다. 단백질은 조류 생성물 추출의 가치를 부가하는 중요한 생성물이기 때문에, 상기 정보는 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에서 다양한 수준의 단백질을 가지는 원료 물질의 사용을 가능하게 한다.

실시예 3

염수 조류 생물질로부터의 단백질의 추출

먼저 염수 내 약 1-10% w/w 고체로 이루어진 염수 조류 배양물을 50℃로 가열하고 상기 온도에서 1 시간 동안 유지했다. 수득된 슬러리를 원심분리하여 고체상으로부터 액체상을 분리했다. 상기 액체 추출물은 글로불린 단백질이 풍부한 것으로 결정되었다(원래의 조류 생물질에 존재하는 총 단백질의 약 10%).

상기 고체를 이후 담수에 현탁하고 약 50℃로 가열하고 약 1 시간 동안 유지했다. 수득된 슬러리를 다시 원심분리하여 고체상으로부터 액체상을 분리했다. 상기 액체상은 알부민 단백질이 풍부한 것으로 결정되었다(원래의 조류 생물질에 존재하는 총 단백질의 약 10%).

상기 고체를 이후 에탄올에 현탁하여 70% w/w 혼합물을 얻었다. 상기 혼합물을 약 75℃로 가열하고 상기 온도에서 약 1 시간 동안 유지했다. 수득된 슬러리를 원심분리하여 고체상으로부터 액체를 분리했다. 상기 액체상은 알부민 단백질이 풍부한 것으로 결정되었다(원래의 생물질에 존재하는 총 단백질의 약 30%).

상기 고체를 이후 알칼리 용액(수성 NaOH, pH 9)에 현탁하고 약 50℃로 가열하고 상기 온도에서 약 1 시간 동안 유지했다. 수득된 슬러리를 원심분리하여 고체상으로부터 액체를 분리했다. 상기 액체상은 글루텔린 단백질이 풍부한 것으로 결정되었다(원래의 생물질에 존재하는 총 단백질의 약 50%).

실시예 4

에탄올에 의한 조류 생물질의 단계 분별 및 추출

일천 파운드의 나노클로로푸시스속( Nannochloropsis ) 생물질(조류 계통 202.0로부터 배양됨, 아리조나 주립 대학, 조류 연구 및 생명공학 연구실에서 수취, ATCC 기증번호 PTA-11048)을 조류가 약 35% w/w 로 포함될 때까지 수확하고 탈수한 후 마지막으로 동결시켰다.

상기 추출 단계는 경첩식 뚜껑이 달린 400 갤런 재킷 주전자에서 수행했다. 뚜껑들을 스트랩을 이용하여 꽉 누르고 실리콘으로 봉했다. 상기 시스템은 또한 양날 섀프트(shaft)를 갖는 2 마력 방폭형(explosion proof) 모터를 갖는 혼합기를 포함했다. 상기 동결된 조류 물질을 상기 탱크에 쏟아붓고 동일 중량의 에탄올을 공압식(pneumatic) 드럼 펌프를 이용하여 펌핑해 넣었다. 상기 물질을 15 분간 교반하고 재킷을 스팀으로 가열하여 각각의 추출 단계에서 바람직한 온도를 얻었다. 상기 바람직한 온도는 끓이진 않지만, 혼합물의 비등점의 3℃ 이내를 의미하는, 그 부근이다. 상기 바람직한 온도는 혼합물의 비등점이 에탄올의 비율이 변화하면서 바뀌기 때문에 각각의 추출 단계마다 다르다. 바람직한 온도에 도달함에 있어서, 주전자의 내용물이 균일하게 가열되는 것을 보장하기 위해 상기 시스템을 60분간 바람직한 온도에서 두면서 연속적으로 교반했다.

이후 주전자의 내용물을 추출 용기밖으로 펌핑하고 분당 1 갤런으로 공압식 바이킹(Viking) 베인 펌프를 이용하여 샤플리스(Sharples) 디켄터(decanter) 원심분리기에 담았다. 상기 디켄터 원심분리기의 로터 회전 속도는 약 6000 rpm으로 설정했다. 고체를 밀폐된 플라스틱 드럼에 수집하고 액체에 대한 약 50% w/w 고체로 구성했다. 이들 고체를 주전자로 되돌리고, 여기서 전술된 추출 단계를 반복했다. 디켄터로부터의 상기 액체 스트림을 공급 탱크에 수집하고 이후 막 여과 시스템에 공급했다. 사용된 막은 그라버 테크놀러지(Graver Technologies)사에서 제작된 0.375 ft² SS 막이었다. 작동 조건은 60℃ ± 5℃ 및 40 psi의 평균 압력 구배였다. 플럭스(flux)를 유지하기 위해 상기 막 시스템을 약 매 15 분마다 압축 공기로 후세정했다. 막 시스템으로부터 수집된 투과물은 어떠한 입자성 물질도 없었다. 잔류물을 수집하고 상기 디켄터로 재순환시켰다.

이러한 추출 및 분별은 각 추출에서 공정을 통한 용매의 극성 변화로 인한 것이다. 도 13에 나타난 추출에서, 공정은 약 65% 순수한 물(35% w/w 조류 고체)을 함유하는 약 1000 lbs.의 습윤 조류 생물질을 이용하여 시작했다. 이것을 860 lbs.의 변성 에탄올(95% 에탄올 및 5% 메탄올)과 혼합하여, 약 55% 수성 에탄올을 함유하는 혼합물을 수득했다. 상기 고체 및 액체를 위에서 기술된 바와 같이 디켄터를 이용하여 분리했다. 습윤 고체 부분은 525 lbs.의 중량 및 40% 건조 물질이었다. 총 525 lbs.의 95% 변성 에탄올을 상기 고체에 부가하여, 약 85% 수성 에탄올로 이루어진 혼합물을 수득했다. 상기 고체 및 액체를 위에서 기술된 바와 같이 디켄터를 이용하여 분리했다. 고체 부분은 354.5 lbs.의 중량 및 40% 건조 물질이었다. 상기 물질에, 또다른 700 lbs.의 변성 에탄올을 부가하여, 약 95% 수성 에탄올의 혼합물을 수득했다. 상기 고체 및 액체를 위에서 기술된 바와 같이 디켄터를 이용하여 분리했다. 수득된 고체는 약 40% 건조 질량이었다. 상기 생물질은 물 및 에탄올의 잠열(latent heat)을 기초로 계산하여, 건조를 위해 60% 더 적은 에너지를 필요로 한다.

일부 실험(데이터 나타나지 않음)에서 다른 유형의 변성 에탄올을 실험했다. 95% 에탄올 및 5% 이소프로필 알코올을 함유하는 변성 에탄올을 추출에서 사용했지만, 95% 에탄올 및 5% 메탄올만큼 효과적이지 않았다. 100% 에탄올의 사용은 본 발명의 바람직한 구체예이지만, 일반적으로 비용 제약으로 인해 사용할 수 없다.

막 시스템으로부터의 투과물 스트림을 자체(in-house) 제작한 회분식 증류기(still)를 이용하여 증발시켰다. 작동 조건은 진공 증류동안 약 80℃였다. 투과물 내 모든 에탄올을 증발시켰다. 이들 추출 단계를 세 번 반복하여, 도 13에 나타난 바와 같은 네 가지의 생성물 풀(pool)을 수득했다. 이는 각각의 추출 단계를 이용하여, 혼합물에 물을 부가하여 극성이 변했고, 이것이 각 단계를 통해 상이한 성분들의 추출을 가능하게 했기 때문이다. 생성물 1은 조류 단백질을 함유하고, 그 결과, 작동 조건하에 증발될 수 있는 과량의 물을 시스템 내에 보유했다. 생성물 2는 극성 지질을 함유했다. 생성물 3은 중성 지질을 함유했다. 마지막으로, 생성물 4는 카르테노이드와 같은 잠재적 공생성물을 함유하는 잔여 생물질이었다.

실시예 5

에탄올에 의한 조류 생물질의 탈수 및 추출

수확시, 조류 생물질은 전형적으로 약 0.1 내지 0.5 %(w/w) 고체를 함유한다. 이것을 막 여과, 원심분리, 가열, 침강 또는 부유를 포함하지만 이에 제한되지 않는 조류 산업에서 공지인 임의의 방법을 이용하여 탈수할 수 있다. 응집은 부유 또는 침강을 보조할 수 있다. 그러한 방법의 전형적인 결과는 약 10% w/w 고체를 함유하는 조류 슬러리이다. 더욱 탈수하기 위하여, 또다른 탈수 방법을 사용하여 일부의 잔여하는 유리 물을 제거하고 40% w/w에 가까운 고체의 농도를 얻을 수 있다. 그러나, 탈수의 비용은 1차 탈수가 수행된 후에 기하급수적으로 증가한다. 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법의 장점은 한 회전의 탈수만을 거치는 조류 물질의 추출 및 분별을 가능하게 한다는 점이다.

그러한 공정의 예는 1차 추출 회전에서, 실시예 3에 기술된 프로토콜에 따라, 90% 순수한 물을 함유하는 1000 lbs.의 습윤 생물질을 1000 lbs.의 변성 에탄올(95% EtOH 및 5% MeOH)과 혼합하여, 약 50% 수성 에탄올의 용매 혼합물을 얻는 것일 수 있다. 수득된 생물질(350 lbs.)은 40% 건조하다. 이들 습윤 고체의 용매 조성은 50% 수성 에탄올이다. 또다른 350 lbs.의 변성 에탄올을 이용하여, 상기 혼합물의 조성은 약 81% 수성 에탄올일 수 있다. 수득된 생물질(235 lbs.)은 40% 건조하다. 이들 습윤 고체의 용매 조성은 81% 수성 에탄올이다. 또다른 470 lbs.의 변성 에탄올을 이용하여, 상기 혼합물의 조성은 약 95% 수성 에탄올일 수 있다. 수득된 고체는 약 95% 에탄올과 함께 40% 건조할 수 있다. 상기 습윤 생물질은 물 및 에탄올의 잠열을 기초로 건조를 위해 60% 더 적은 에너지를 필요로 한다. 상기 경우에, 1820 lbs. 에탄올을 이용하여 100 lbs.의 조류가 추출될 것이다. 출발 물질이 40% 조류 고체였던 실시예 3과 비교할 때, 2085 lbs. 에탄올을 이용하여 350 lbs.의 건조 조류 당량을 추출했다.

참고 문헌

다음의 참고 문헌들이 본 명세서에 그 전체로 참고로 포함된다:

미국 특허 제7,148,366호

Rhodes, Science Progress, 92(1):39-90, 2009. Generic review on using algae to produce biodieselChisti, Y. (2007). Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv 25, 294-306. - Generic review on using algae to produce biodiesel

Amin, Energy Convers . Manage ., 50:1834-1840, 2009. Generic review on using algae to produce biofuel and gas

Catchpole et al., J. of Supercritical Fluids, 47:591-597, 2009. SCF CO2 based extraction of specialty lipids

Bligh E G & Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959.

Christie , W. W., Lipid Analysis , 3 rd ed ., Oily Press , Bridgewater , UK , 2003, 416.

Approved Methods of the AACC, 9th ed., American Association of Cereal Chemists. St. Paul, MN, 1995 AACC Method 58-19.

Claims

실질적으로 온전한 조류 세포로 이루어진 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 조류 단백질을 선택적으로 추출하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
a. 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 가열하고 혼합하여 글로불린 단백질이 풍부한 1차 실질적 액체상, 및 1차 실질적 고체상으로 이루어진 1차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계;
b. 상기 1차 실질적 고체상으로부터 글로불린 단백질이 풍부한 상기 1차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계;
c. 상기 1차 고체상을 물과 혼합하고 가열하여 알부민 단백질이 풍부한 2차 실질적 액체상, 및 2차 실질적 고체상으로 이루어진 2차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계;
d. 상기 2차 실질적 고체상으로부터 알부민 단백질이 풍부한 상기 2차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계;
e. 상기 2차 실질적 고체상을 물과 혼합하고 가열하여 3차 실질적 액체상, 및 3차 실질적 고체상으로 이루어진 3차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계;
f. 상기 3차 가열된 추출 혼합물의 pH를 높여서 상기 3차 실질적 액체상에 글루텔린 단백질을 풍부하게 하는 단계;
g. 상기 3차 실질적 고체상으로부터 글루텔린 단백질이 풍부한 3차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계;
h. 상기 3차 실질적 고체상을 가열하고 용매 세트와 혼합하여 프롤라민 단백질이 풍부한 4차 실질적 액체상, 및 4차 실질적 고체상으로 이루어진 4차 가열된 추출 혼합물을 생성하는 단계; 및
i. 상기 4차 실질적 고체상으로부터 프롤라민 단백질이 풍부한 4차 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 분리 단계 중 하나 이상은 원심분리, 여과, 부유, 및 침강으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 방법에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 분리 전에 선택된 시간 동안 가열된 온도로 유지되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 20 내지 약 60 분간 가열된 온도로 유지되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 45 내지 약 90 분간 가열된 온도로 유지되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차, 2차, 3차, 및 4차 가열된 추출 혼합물 중 적어도 하나는 약 50^o C로 유지되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 4차 실질적 고체상은 지질이 풍부한 방법.
실질적으로 온전한 염수 조류 세포로 이루어진 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 글로불린 단백질을 선택적으로 추출하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
a. 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 가열하고 혼합하여 글로불린 단백질이 풍부한 가열된 액체상, 및 가열된 실질적 고체상을 생성하는 단계; 및
b. 상기 가열된 실질적 고체상으로부터 글로불린 단백질이 풍부한 상기 가열된 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물은 적어도 한 부분을 가열하고 혼합하는 동안 약 50℃로 유지되는 방법.
실질적으로 온전한 조류 세포로 이루어진 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물로부터 알부민 단백질을 선택적으로 추출하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
a. 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물을 혼합하고 가열하여 알부민 단백질이 풍부한 가열된 실질적 액체상, 및 가열된 실질적 고체상을 생성하는 단계; 및
c. 상기 가열된 실질적 고체상으로부터 알부민 단백질이 풍부한 상기 가열된 실질적 액체상의 적어도 한 부분을 분리하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 염수 조류 생물질 또는 염수 조류 배양물 및 물의 혼합물은 적어도 한 부분의 가열 및 혼합 단계 동안 약 50℃로 유지되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용매 세트는 에탄올을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용매 세트는 알코올을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용매 세트는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 용매 세트는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 용매 세트는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매를 포함하는 방법.