CN102985528A - 用于脱水藻类并从其中再循环水的方法和系统 - Google Patents

Abstract

提供了一种脱水藻类并从其中再循环水的方法。脱水湿藻类细胞培养物的方法包括从藻类细胞培养物去除液体以获得具有比藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质。从藻类细胞培养物去除的液体的至少一部分被再循环用于不同的藻类细胞培养物中。该方法包括向湿藻类生物质加入水可混溶溶剂组并等待足够时间量以允许藻类生物质的藻类细胞聚集并分离聚集的藻类细胞的至少一部分与溶剂组的至少一部分和湿藻类生物质的液体从而产生脱水的藻类生物质。脱水的藻类生物质可用于产生藻类产物，诸如生物燃料和营养品。

Description

用于脱水藻类并从其中再循环水的方法和系统

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年4月6日提交的题为Extraction withFractionation of Oil and Proteinaceous Material from OleaginousMaterial的美国临时申请No.61/321,290和2010年4月6日提交的题为Extraction With Fractionation of Oil and Co-Products from OleaginousMaterial的美国临时申请No.61/321,286的权益，其完整内容特此通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及提取和分馏藻类产物，包括但不限于油和蛋白。更具体地，本文所述的系统和方法以略微非极性的溶剂利用分步提取和分馏来加工湿藻类生物质。

发明背景

石油是主要包括烃类的天然来源。从地球提取石油是昂贵、危险的，经常以环境为代价。而且，世界范围的油储备正在快速减少。由于运输和转化石油为可用燃料诸如汽油和喷气燃料所需的加工，成本还增加了。

藻类近年来由于其产生脂质的能力而获得了明显的重要性，可用于产生可持续的生物燃料。可以利用这一能力来产生可再生燃料，减少全球气候变化，和处理废水。藻类作为生物燃料原料的优势来自于多种因素，包括与典型陆生油料作物植物相比高的每英亩生产率、基于非食物的原料来源、使用本来非生产性、不可耕作的土地、使用宽范围的水源(淡水、半咸水、盐水和废水)、产生生物燃料和有价值的副产物诸如类胡萝卜素和叶绿素二者。

在过去几十年已经筛选和研究了数千种藻类物种的脂质产量。其中，已经鉴定了富集脂质产量的约300种物种。脂质的组成和含量在生命周期的不同阶段变化，并受环境和培养条件影响。由于藻类细胞壁的生化组成和物理性质的显著差异性，用于提取的策略和方法取决于采用的单独藻类物种/株系是相当不同的。由于细胞壁的厚度和藻类细胞的小尺寸(约2至约20nm)，传统物理提取工艺诸如挤压，对藻类不能很好地起作用。而且与从种子回收的典型油类相比，藻油中的大量极性脂质带来精炼问题。

收获后，培养物中典型的藻类浓度从约0.1-1.0%(w/v)变化。这意味着，在试图提取油之前，必须去除每单位重量藻类多达1000倍的水量。目前，现有的含油材料油提取方法严格地要求几乎完全干燥的进料以改进所提取的油的产率和品质。由于加热藻类团块使其充分干燥所需能量的量，使得向生物燃料工艺进料藻类是不经济的。通常，在高温挤压或压碎进料以强化提取。由于藻类的单细胞测微性质，这些步骤以现有的设备可能不起作用。而且，藻油由于存在双键长链脂肪酸是非常不稳定的。传统提取方法中使用的高温导致油降解，从而增加这类方法的成本。

本领域已知通过使用己烷作为溶剂从干燥的藻类团块提取油。这一工艺是能量密集型的。使用热来干燥和使用己烷来提取产生较低品质的产物，因为这一类型的加工导致脂质和蛋白降解。

藻油提取可分为两类：破坏性方法和非破坏性方法。

破坏性方法包括通过机械、热、酶促或化学方法展平细胞。大多数破坏性方法产生乳液，需要昂贵的清除工艺。藻油包含大百分比的极性脂质和蛋白，这增强中性脂质的乳化。乳化被溶液中保留的营养素和盐成分进一步稳定化。乳液是复杂混合物，包含中性脂质、极性脂质、蛋白和其他藻类产物，需要深入精炼工艺来分离中性脂质，中性脂质是被转化为生物燃料的进料。

非破坏性方法提供低产量。乳化(Milking)是使用溶剂或化学品来从生长的藻类培养物提取脂质。虽然有时用来提取藻类产物，但是由于溶剂毒性和细胞壁破坏，乳化对于一些物种的藻类可能不起作用。这一困难使得难以开发通用的工艺。而且，由于介质中溶剂的最大可获得浓度，所需溶剂的体积将是庞大的。

多相提取将要求大量蒸馏，使用复杂的溶剂混合物，并使用于溶剂回收和再循环的机械成为必要。这使得这样的提取对于用在藻油技术中不实用和不经济。

因此，为了克服这些缺点，本领域中存在对用于提取和分馏藻类产物，尤其是藻油、藻类蛋白和藻类类胡萝卜素的改进方法和系统的需求。

发明概要

本文所述的实施方案一般涉及用于从包括例如藻类生物质的含油材料提取具有不同极性的脂质的系统和方法。尤其是，本文所述的实施方案涉及使用不同极性的溶剂和/或一系列膜式滤器从藻类生物质提取不同极性的脂质。在一些实施方案中，该滤器是微滤器。

在本发明的一些实施方案中，使用单种溶剂和水来萃取和分馏含油材料中存在的成分。在其他实施方案中，这些成分包括但不限于，蛋白、极性脂质和中性脂质。在又其他的实施方案中，使用多于一种溶剂。在又其他的实施方案中，使用溶剂的混合物。

在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可用于从含油材料提取脂质的副产物。这样的副产物的实例包括但不限于，蛋白质材料、叶绿素和类胡萝卜素。本发明的实施方案允许以允许产生燃料和营养产物二者的方式从藻类生物质同时提取和分馏藻类产物。

在本发明的一个实施方案中，提供了脱水藻类并从其再循环水的方法。

在本发明的另外实施方案中，脱水湿藻类细胞培养物的方法包括：使用烧结的金属管滤器去除藻类细胞培养物中的液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分，并再循环从所述藻类细胞培养物去除的液体的至少一部分用于不同的藻类细胞培养物中。该方法还包括向所述湿藻类生物质级分加入水可混溶溶剂组并等待一定的时间量以允许所述藻类生物质级分的藻类细胞聚集。该方法还包括分离所述聚集的藻类细胞的至少一部分与所述溶剂组的至少一部分和所述湿藻类生物质级分的液体从而产生脱水的藻类生物质。

在本发明的又另一实施方案中，脱水湿藻类细胞培养物的方法包括：使用膜、离心、烧结的金属管、溶气浮选和絮凝中的至少一种去除藻类细胞培养物中液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分，并再循环从所述藻类细胞培养物去除的液体的至少一部分用于不同的藻类细胞培养物中。该方法还包括向所述湿藻类生物质级分加入水可混溶溶剂组并等待一定的时间量以允许所述藻类生物质级分的藻类细胞聚集。该方法还包括分离所述聚集的藻类细胞的至少一部分与所述溶剂组的至少一部分和所述湿藻类生物质级分的液体从而产生脱水的藻类生物质。

在本发明的又另外实施方案中，脱水湿藻类细胞培养物的方法包括：去除湿藻类细胞培养物中的液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分，并向所述湿藻类生物质级分加入包含一种或多种溶剂的第一水可混溶溶剂组。该方法还包括从所述湿藻类生物质级分与水可混溶溶剂组的混合物产生大致上液相和大致上固相，并分离所述大致上固相的至少一部分。该方法还包括向所述大致上固相的分离部分加入包含一种或多种溶剂的第二水可混溶溶剂组，并通过沉淀或浮选藻类固体分离所述大致上固相与第二水可混溶溶剂组的混合物的藻类固体的至少一部分。该方法还包括再循环所述第一水可混溶溶剂组和第二水可混溶溶剂组的至少之一的至少一部分至随后的藻类细胞培养物脱水工艺。

附图简述

图1A是根据本公开内容的示例性实施方案的一种方法中包括的步骤的流程图。

图1B是根据本公开内容的脱水工艺的示例性实施方案的示意图。

图2是根据本公开内容的提取系统的示例性实施方案的示意图。

图3是显示使用包括完全极性范围的一系列溶剂对冻干的藻类生物质的Sohxlet提取的比较图，显示最大非破坏性藻油提取效力和极性对极性脂质和非极性脂质提取的影响。

图4A&B是显示以三种不同温度使用甲醇和石油醚的两步溶剂提取工艺中的中性脂质(A)纯度和(B)回收率的图示。

图5A&B是显示以三种不同温度使用甲醇水溶液和石油醚的两步溶剂提取工艺中的中性脂质(A)纯度和(B)回收率的图。

图6是显示以三种不同温度使用甲醇水溶液和石油醚的两步溶剂提取工艺中的脂质回收率的图。

图7是显示溶剂与固体生物质的比例对脂质回收率的影响的图。

图8是显示甲醇水溶液的单步提取回收中不同提取水溶液对干燥生物质的效力的图。

图9是显示多步甲醇提取对累积总脂质产率和中性脂质纯度的影响的图。

图10是显示使用湿生物质和乙醇的脂质累积回收率的图。

图11是显示比较微波辅助提取与常规提取系统的提取时间的图。

图12A是根据本公开内容的示例性实施方案的方法中包括的步骤的流程图，其并入了蛋白提取步骤。图12A中的所有单位是磅。

图12B是根据本公开内容的示例性提取工艺中包括的步骤的流程图。

图13是描述本发明的实施方案之一的流程图和质量平衡图，其中经由提取和分馏加工1000磅的藻类生物质以从该藻类生物质分离中性脂质、极性脂质和蛋白。

图14是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中可以加工藻类团块以形成多种产物。

图15是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中加工藻类中性脂质以形成多种产物。

图16是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中加工藻类中性脂质来形成燃料产品。

图17是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从淡水藻类生物质选择性提取藻类蛋白。

图18是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水藻类生物质选择性提取藻类蛋白。

图19是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水或淡水藻类生物质提取所选的藻类蛋白。

图20是描述本发明的实施方案之一的流程图，其中从盐水或淡水藻类生物质提取所选的藻类蛋白。

图21是显示使用本文公开的方法提取之前和之后的栅藻属(Scenedescemus sp.)细胞的照片。细胞在提取之前和之后都是大致上完整的。

详述

定义

本文使用的术语“管道”或其任何变化形式，包括可经由其输送流体的任何结构。管道的非限制性实例包括管子、配管、管槽或其他封闭结构。

本文使用的术语“储器(reservoir)”或其任何变化形式，包括能够保持流体的任何实体结构。储器的非限制性实例包括池塘、罐、湖、桶或其他类似结构。

本文使用的术语“约”或“大约”定义为由本领域技术人员理解的接近，在一个非限制性实施方案中该术语定义为在10%内、优选地在5%内、更优选地在1%内、和最优选地在0.5%内。

本文使用的术语“抑制”或“减少”或这些术语的任何变化形式，包括为实现期望结果的任何可测量的降低或完全抑制。

本文使用的术语“有效”是指足以实现期望的、预料的或预期的结果。

词语“一(a)”或“一(an)”在本文当联合术语“包括”使用时可表示“一个(one)”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

本文使用的术语“或”是指“和/或”，除非明确地指出是仅指备选项或备选项是互斥的，尽管公开内容支持仅指备选项和“和/或”的定义。

本文使用的术语“湿”用于表示包含约50%至约99.9%含水量。含水量可以是胞内或胞外的。

本文使用的术语“溶剂组”用于指包含一种或多种溶剂的组合物。这些溶剂可以是两亲的(还称为两性的或略微非极性的)、亲水或疏水的。在一些实施方案中，这些溶剂是水可混溶的，在其他实施方案中，它们是水中不可混溶的。可用于实践本发明方法的溶剂的非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、和乙腈、烷烃类(己烷、戊烷、庚烷、辛烷)、酯类(乙酸乙酯、乙酸丁酯)、酮类(甲基乙基酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK))、芳族化合物(甲苯、苯、环己烷、四氢呋喃)、卤代烷(氯仿、三氯乙烯)、醚类(二乙醚)、和混合物(柴油、喷气燃料、汽油)。

本文使用的术语“油”包括包含中性脂质和极性脂质的组合物。本文使用的术语“藻油(algae oil)”和“藻油(algal oil)”可互换地使用。

本文使用的术语“扩散物”或“渗透物"可以指已经经过分离装置(包括但不限于滤器或膜)的材料。

本文使用的术语“滞留物”可以指在扩散物已经经过分离装置后剩余的材料。

本文使用的词语“包含”(和包含的任何形式诸如“comprise”和“comprises”)、“具有”(和具有的任何形式诸如“have”和“has”)、“包括”(和包括的任何形式诸如“includes”和“include”)、或“含有”(和含有的任何形式诸如“contains”和“contain”)是封闭式或开放式的，不排除另外的、未提及的元素或方法步骤。

本文使用的术语“极性脂质”或其任何变化形式包括但不限于，磷脂和糖脂。

本文使用的术语“中性脂质”或其任何变化形式包括但不限于，甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、类胡萝卜素、蜡、固醇类。

本文使用的术语“固相”是指通常较为固态的材料的集合，不意为表示该相中的所有材料是固态。因此，具有实质量的固体同时保留一些液体的相被这一术语的定义涵盖。同时，本文使用的术语“液相”是指通常较为液态的材料的集合，且这样的集合可包括固体材料。

本文使用的术语“生物柴油”是指来源于藻类的脂肪酸的甲酯或乙酯。

本文使用的术语“营养品”是指提供健康和/或医学益处的食物。非限制性实例包括类胡萝卜素、胡萝卜烯类、叶黄素诸如玉米黄质、虾青素和叶黄质。

本文使用的术语“生物燃料”是指来源于生物来源的燃料。非限制性实例包括生物柴油、喷气燃料、柴油、调合用喷气燃料(jet fuel blendstock)和调合用柴油(diesel blend stock)。

本文联合极性脂质使用的术语“杂质”是指与目标产物共提取或与目标产物具有相同特性的目标产物以外的所有成分。

本文联合极性脂质使用的术语“润滑剂”是指加氢处理的藻类脂质诸如C16-C20烷烃类。

本文联合极性脂质使用的术语“去垢剂”是指糖脂、磷脂及其衍生物。

本文联合极性脂质使用的术语“食品添加剂”是指大豆卵磷脂替代品或来源于藻类的磷脂。

本文使用的术语“非甘油物质”是指与甘油级分分离的任何杂质。进一步的清除步骤将去除存在的大多数以产生药品级甘油。

本文使用的术语“不饱和脂肪酸”是指具有至少一个碳双键的脂肪酸。不饱和脂肪酸的非限制性实例包括棕榈油酸、十七酸、硬脂酸、油酸、十八碳烯酸、亚油酸、γ-亚油酸、α亚油酸、花生酸、二十碳烯酸、高γ亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳酸、二十二碳二烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳四烯酸。主链中具有20或更多个碳原子的脂肪酸一般称为“长链脂肪酸”。主链中具有19或更少个碳原子的脂肪酸一般称为“短链脂肪酸”。

不饱和长链脂肪酸包括但不限于，ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和ω-9脂肪酸。本文使用的术语“ω-3脂肪酸”是指，但不限于表1中列出的脂肪酸。

表1

本文使用的术语“调合用喷气燃料”是指具有适合用作喷气燃料的碳链长度的烷烃类。

本文使用的术语“调合用柴油”是指具有适合用作柴油的碳链长度的烷烃类。

本文使用的术语“动物饲料”是指来源于藻类的物质，可以被动物食用并为动物提供营养支持。

本文使用的术语“人类食物”是指来源于藻类的物质，可以被人类食用并为人类提供营养支持。来源于藻类的人类食品可以包含必要营养，诸如碳水化合物、脂肪、蛋白、维生素或矿物质。

本文使用的术语“生物除污”是指使用藻类生长来从工业废水或市政废水除去污染物，诸如但不限于，硝酸盐、磷酸盐和重金属。

本文使用的术语“废水”是指包含多种污染品或污染物，包括但不限于硝酸盐、磷酸盐和重金属的工业废水或市政废水。

本文使用的术语“富集”应指约50%或更大含量。

本文使用的术语“大致上”应指主要地。

本文使用的术语“球蛋白蛋白”是指盐溶性蛋白。

本文使用的术语“白蛋白蛋白”是指水溶性蛋白。

本文使用的术语“谷蛋白蛋白”是指碱溶性蛋白。

本文使用的术语“醇溶谷蛋白蛋白”是指醇溶性蛋白。醇溶谷蛋白蛋白的非限制性实例是麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、燕麦蛋白。

本文使用的术语“藻类培养物”是指培养基中的藻类细胞。

本文使用的术语“藻类生物质”是指至少部分地脱水的藻类培养物。

本文使用的术语“脱水”是指除去至少一些水。

本文使用的术语“藻类糊”是指具有允许其流动的流体特性的部分脱水的藻类培养物。一般藻类糊具有约90%的含水量。

本文使用的术语“藻类块”是指缺少藻类糊的流体特性并倾向于结块的部分脱水的藻类培养物。一般藻类块具有约60%或更少的含水量。

盐水藻类细胞包括但不限于，海水和咸水藻类物种。盐水藻类细胞见于自然界的水体，诸如但不限于，海、洋和河口。盐水藻类物种的非限制性实例包括微绿球藻属(Nannochloropsis sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)。

淡水藻类细胞见于自然界的水体，诸如但不限于，湖和池塘。淡水藻类物种的非限制性实例包括栅藻属(Scendescemus sp.)、鞭毛藻属(Haemotococcus sp.)。

可以用于本发明方法的微藻类的非限制性实例是以下门之一的成员：绿藻门(Chlorophyta)、蓝藻门(Cyanophyta)(蓝细菌)和不等鞭毛门(Heterokontophyta)。在某些实施方案中，用于本发明方法的微藻类是以下纲之一的成员：硅藻纲(Bacillariophyceae)、大眼藻纲(Eustigmatophyceae)和金藻纲(Chrysophyceae)。在某些实施方案中，用于本发明方法的微藻类是以下属之一的成员：微绿球藻属、小球藻属(Chlorella)、杜氏藻属、栅藻属(Scenedesmus)、月芽藻属(Selenastrum)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、螺旋藻属(Spirulina)、双眉藻属(Amphora)和棕鞭藻属(Ochromonas)。

可以用于本发明方法的微藻类物种的非限制性实例包括：东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格门氏藻属(Agmenellum spp.)、透明茧形藻属(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻(Amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线状变种(Amphora coffeiformis var.linea)、咖啡形双眉藻斑点变种(Amphora coffeiformis var.punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphora coffeiformis var.taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(Amphora coffeiformis var.tenuis)、优美双眉藻(Amphoradelicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphora delicatissima var.capitata)、双眉藻属、鱼腥藻属(Anabaena)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、布朗尼葡萄藻(Botryococcus braunii)、Botryococcussudeticus、小型片球藻(Bracteococcus minor)、Bracteococcusmedionucleatus、四鞭藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟勒氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、牟勒氏角毛藻亚盐变种(Chaetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻属(Chaetoceros sp.)、Chlamydomas perigranulata、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极洲小球藻(Chlorella antarctica)、黄绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、念球菌小球藻(Chlorella Candida)、囊状小球藻(Chlorella capsulate)、干燥小球藻(Chlorella desiccate)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、淡褐小球藻(Chlorella fusca)、淡褐小球藻空泡变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、Chlorella glucotropha、水溪小球藻(Chlorella infusionum)、Chlorella infusionum var.actophila、Chlorella infusionum var.auxenophila、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、Chlorella lobophora、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorella luteoviridis var.lutescens、Chlorella miniata、极微小球藻(Chlorella minutissima)、突变小球藻(Chlorella mutabilis)、夜间小球藻(Chlorella nocturna)、卵圆形小球藻(Chlorella ovalis)、小形小球藻(Chlorella parva)、嗜光小球藻(Chlorella photophila)、Chlorellapringsheimii、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、原始小球藻酸居变种(Chlorella protothecoides var.acidicola)、规则小球藻(Chlorellaregularis)、规则小球藻极小变种(Chlorella regularis var.minima)、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorella reisiglii、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、海洋小球藻椭圆变种(Chlorella saccharophilavar.ellipsoidea)、海水小球藻(Chlorella salina)、单纯小球藻(Chlorellasimplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属(Chlorellasp.)、球孢小球藻(Chlorella sphaerica)、Chlorella stigmatophora、万尼氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、Chlorella vulgaris fo.Tertia、普通小球藻自养变体(Chlorella vulgaris var.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorella vulgaris var.vulgaris)、Chlorella vulgarisvar.vulgaris fo.Tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris fo.Viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、水溪绿球藻(Chlorococcum infusionum)、绿球藻属(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属(Chroomonas sp.)、金球藻属(Chrysosphaera sp.)、球钙板藻属(Cricosphaera sp.)、隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐藻属(Cryptomonas sp.)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属(Cyclotella sp.)、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliella bardawil)、Dunaliella bioculata、颗粒状杜氏藻(Dunaliella granulate)、海生杜氏藻(Dunaliella maritime)、微小杜氏藻(Dunaliella minuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、Dunaliellapeircei、Dunaliella primolecta、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、Dunaliella tertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)、Dunaliella tertiolecta、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属(Eremosphaera sp.)、后棘藻属(Ellipsoidon sp.)、裸藻属(Euglenaspp.)、披刺藻属(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、蓝鼓藻属(Gleocapsa sp.)、丽丝藻属(Gloeothamnion sp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、膜胞藻属(Hymenomonas sp.)、lsochrysis aff.Galbana、球等鞭金藻(lsochrysisgalbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻属(Micractinium)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属(Monoraphidium sp.)、侏囊菌属(Nannochloris sp.)、盐生微绿球藻(Nannochloropsis salina)、微绿球藻属(Nannochloropsis sp.)、截形舟形藻(Navicula acceptata)、Navicula biskanterae、Naviculapseudotenelloides、具膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属(Navicula sp.)、肾鞭藻属(Nephrochlorissp.)、肾藻属(Nephroselmis sp.)、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚历山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻(Nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschia inconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschia microcephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusillamonoensis、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属(Nitzschiasp.)、棕鞭藻属(Ochromonas sp.)、小卵囊藻(Oocystis parva)、卵泡藻(Oocystis pusilla)、卵囊藻属(Oocystis sp.)、沼泽颤藻(Oscillatorialimnetica)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、亚短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、Parachlorella kessleri、Pascheria acidophila、巴夫藻属(Pavlova sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum)、噬菌体属(Phagus)、席藻属(Phormidium)、扁藻属(Platymonas sp.)、颗石藻(Pleurochrysis carterae)、Pleurochrysis dentate、颗石藻属(Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Prototheca wickerhamii)、Prototheca stagnora、波多黎各原壁藻(Prototheca portoricensis)、Prototheca moriformis、饶氏原藻(Protothecazopfii)、水生假小球藻(Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑葚藻属(Pyrobotrys)、不透明红球菌(Rhodococcusopacus)、Sarcinoid chrysophyte、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、集球藻属(Synechococcus sp.)、集胞藻属(Synechocystisf)、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetespatula)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmis sp.)、瑞典四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)和Viridiella fridericiana。

在其他实施方案中，生物质可以是植物材料，包括但不限于大豆、玉米、棕榈、亚麻、麻风树、芥花、椰子、花生、红花、棉籽、亚麻籽、向日葵、米糠和橄榄。

公开了用于从湿的含油材料(包括例如藻类生物质)提取不同极性的脂质和副产物(例如，蛋白)的系统和方法。具体地，本文描述的方法和系统涉及提取和分馏藻类成分的能力，通过以逐渐变得极性较低的亲水性溶剂/水混合物进行连续提取(即，随着从一个提取步骤进行到下一个，溶剂/水比例中的水逐渐减少)。换言之，藻类中的间质溶剂(其重量的75%)最初是水，逐渐被略微非极性的溶剂代替为有机溶剂的共沸混合物。这导致提取在每一步骤发展的极性可溶的成分，从而导致同时分馏所提取的成分。还公开了通过酸浸出和/或碱提取来提取蛋白副产物。

在本发明的一些实施方案中，使用单种溶剂和水来提取和分馏含油材料中存在的成分。在其他实施方案中，使用溶剂组和水来提取和分馏含油材料中存在的成分。在一些实施方案中，含油材料是湿的。在其他实施方案中，含油材料是藻类。

极性脂质回收率主要取决于其离子电荷、水溶性和位置(胞内、胞外或膜连的)。极性脂质的实例包括但不限于，磷脂和糖脂。可以用于分离和纯化极性脂质的策略可粗略分为分批模式或连续模式。分批模式的实例包括沉淀(pH、有机溶剂)、溶剂提取和结晶。连续模式的实例包括离心、吸附、泡沫分离和沉淀、和膜技术(切向流过滤、渗滤和沉淀、超滤)。

本发明的其他目的、特征和益处将从以下详述变得明显。然而应理解的是，详述和实施例虽然指出了本发明的特定实施方案，但仅以示例的方式提供。另外，根据该详述，预计在本发明精神和范围内的改变和修改将对本领域技术人员变得明显。

令人惊讶地，提出的非破坏性提取工艺导致超过90%的回收率。剩余生物质中的少量极性脂质增强了当剩余生物质用作饲料时的价值。这至少部分地是因为生物质的高的长链不饱和脂肪酸含量。另外，乙醇提取物可以被进一步直接转酯。而且，不同于现有的常规方法，本文描述的方法和系统对于任何藻类是通用的，并通过使用水可混溶的有机溶剂梯度使得能够回收藻类中大部分有价值成分(包括极性脂质)。

通过使用本发明获得的中性脂质级分具有低的金属含量，从而增强脂质级分的稳定性，并减少随后的加工步骤。金属由于其催化氧化的能力，容易使得中性脂质不稳定。而且，金属抑制加氢处理催化剂，使得在可以精炼中性脂质混合物之间去除它们成为必要。本文公开的系统和方法允许提取蛋白和/或极性脂质级分中的金属。这是有益的，因为蛋白和极性脂质受暴露于金属的高度影响，并且在一些情形中实际上被金属稳定。

本文公开的系统和方法可以以湿的生物质开始，减少干燥和脱水成本。与常规提取工艺相比，公开的提取和分馏工艺将具有相对低的操作成本，由于中度的温度和压力条件、以及溶剂再循环。而且，常规提取工艺是成本过高的，不能够满足市场需求。

本文描述的系统和方法的另一方面是实现初步精炼的能力，这是在提取工艺期间分离极性脂质与中性脂质。示例性实施方案中使用的藻油与此前的实施方案中使用的植物油之间的差异包括单独脂质种类的百分比。示例性粗制藻油组成与植物油的比较示于以下表2：

表2

	粗制藻油(w/w)	植物油(w/w)
			中性脂质	30-90%	90-98%
磷脂	10-40%	1-2%
			糖脂	10-40%	<1%
游离脂肪酸	1-10%	<3%
			蜡	2-5%	<2%
色素	1-4%	Ppm

进行植物油的脱胶(物理和/或化学)以除去极性脂质(例如，糖脂和磷脂)。已被化学脱胶的植物油保留显著量的中性脂质。使用溶剂提取或超临界/亚临界流体提取或膜技术从脱胶的材料进一步除去这一中性脂质级分。相反，从含油的藻类生物质分离中性脂质比从植物油原料困难得多，由于通常藻油中发现存在大量的极性脂质(参见表2)。这是因为藻油中存在更大百分比的极性脂质增强中性脂质的乳化。乳化被溶液中留存的营养素和盐成分进一步稳定化。极性脂质以及金属的存在导致用于分离和利用中性脂质的加工困难。然而，由于极性脂质具有现存市场，其回收将为藻油产生燃料的用途增加显著的价值。

极性脂质由于其分子结构在性质上是表面活性剂并具有巨大的现存市场。用于产生极性脂质的许多现有技术是原材料或成本过高的。糖脂和磷脂的替代原料主要是藻油、燕麦油、小麦胚芽油和植物油。取决于物种、细胞的生理状态、培养条件、收获时间和用于提取的溶剂，藻油通常包含约30-85%(w/w)的极性脂质。此外，每种极性脂质的甘油主链具有连接的两个脂肪酸基团，而不是中性脂质三酰基甘油中的三种。与中性脂质相比，极性脂质的转酯作用可产生基于质量仅三分之二的终产物即酯化的脂肪酸。因此，极性脂质的去除和回收不仅在从藻类产生高品质生物燃料或甘油三酯方面是高度有益的，还产生增加价值的副产物糖脂和磷脂，这反过来可以补偿基于藻类的生物燃料生产相关的成本。容易回收和分馏由藻类产生的多种油和副产物的能力对于藻油工艺的经济成功是有益的。

本文描述的方法和系统的另一方面是从含油材料诸如藻类生物质提取蛋白的能力。本文公开的从藻类生物质提取蛋白质材料的方法包括提取和分馏的灵活和高度可定制的工艺。例如，在一些实施方案中，提取和分馏在单步骤发生，从而提供高效的工艺。从这样的生物质来源的蛋白可用于动物饲料、食物成分和工业产品。例如，这样的蛋白可用于诸如纤维、粘合剂、涂料、陶瓷、油墨、化妆品、纺织品、口香糖、和生物可降解塑料的应用。

本文描述的方法和系统的另一方面包括基于待提取的成分改变藻类生物质与溶剂的比例。在一个实施方案中，藻类生物质与等重量的溶剂混合。在另一个实施方案中，藻类生物质与较少重量的溶剂混合。在又另一个实施方案中，藻类生物质与较大重量的溶剂混合。在一些实施方案中，与藻类生物质混合的溶剂的量基于将使用的溶剂和藻类生物质/溶剂混合物的期望极性来计算。在又其他的实施方案中，藻类团块以多个步骤提取。在一个示例性实施方案中，连续提取藻类生物质，首先以其重量的约50-60%的略微非极性的、水可混溶溶剂。然后，剩余的藻类固体使用溶剂中约70%的固体重量提取。然后第三提取使用溶剂中约90%的固体重量进行。在被告知本发明的这些方面后，通过为了选择性提取藻类产物而调节藻类生物质和/或固体残留物的比例至期望极性，本领域技术人员将可以使用不同极性的不同溶剂。

例如，在优选的实施方案中，使用的溶剂是乙醇。通过改变溶剂的比例可选择性分离各成分。蛋白可以用约50%乙醇从藻类生物质提取，极性脂质则用约80%乙醇，中性脂质则用约95%或更大的乙醇。如果使用甲醇，用于从藻类生物质提取蛋白的溶剂浓度将是约70%。极性脂质将要求约90%甲醇，中性脂质将要求约100%甲醇。

本文描述的系统和方法的实施方案表现令人惊讶和意外的结果。首先，回收/提取工艺可以对湿生物质进行。这是主要的经济学益处，因为示例性实施方案避免使用干燥和破坏细胞所需的大量能量。使用本发明的系统和方法从干燥藻类生物质提取中性脂质远更有效的。从公开的工艺获得的产量比通过常规提取获得的哪些显著更高和更纯。这是因为常规提取常常产生乳液，使得成分分离极其困难。

示例性实施方案可适用于任何藻类或非藻类含油材料。示例性实施方案可使用任何水可混溶的略微非极性的溶剂，包括但不限于，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。具体实施方案可使用绿色可再生溶剂，诸如乙醇。试验的醇溶剂导致分离的中性脂质的更高产量和纯度。与本文公开的其他溶剂相比，乙醇是购买相对经济的。在一些示例性实施方案中，提取和分馏可以以一个步骤进行，随后如果需要，进行基于膜的纯化。所得的生物质是几乎无水的，并可以以比含水藻类浆液较少的能量完全干燥。

在一些示例性实施方案中，用于提取的溶剂是乙醇。其他实施方案包括但不限于，环己烷、石油醚、戊烷、己烷、庚烷、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、异丙醇和甲醇。在一些实施方案中，连续提取步骤中使用相同的溶剂。在其他实施方案中，每个提取步骤中使用不同的溶剂。在又其他的实施方案中，混合两种或多种溶剂并用在一个或多个提取步骤中。

在本文公开的方法的一些实施方案中，任何提取步骤中使用的两种或多种溶剂的混合物包括至少一种亲水性溶剂和至少一种疏水性溶剂。使用这样的混合物时，亲水性溶剂经由扩散从生物质提取材料。同时，联合使用相对少量的疏水性溶剂，并且使其参与液液分离，使得目标材料被浓缩在少量的疏水性溶剂中。然后两种不同溶剂形成两层体系，其可以使用本领域已知的技术来分离。在这样的实施方式中，疏水性溶剂可以是烷烃、酯、酮、芳香族、卤代烷烃、醚或商业混合物(例如，柴油、喷气燃料、汽油)的任何一种或多种。

在一些实施方案中，本文所述的提取工艺在一个或多个步骤中包括pH偏移。这样的pH偏移可用于分离蛋白质材料。在一些实施方案中，提取工艺的pH是酸性的(例如，小于约5)。在一些实施方案中，提取工艺的pH是碱性的(例如，大于约10)。

常规提取方案中己烷的使用污染了藻类生物质，使得副产物不能用在食品中。本发明的实施方案优于本领域已知的那些，因为它们需要使用的能量少得多，并使得产物适合用作燃料以及食品和营养补充物。

预计本说明书中讨论的任何实施方案可以以本发明的任何方法或系统实现，且反之亦然。而且，本发明的系统可以用于实现本发明的方法。

示例性实施方案的详述

对于从藻类溶剂提取油，最佳情形的情况是溶剂选择性提取三酰基甘油(TAG)，以高回收率留下藻类细胞中的所有的极性脂质和非TAG中性脂质(诸如蜡、固醇类)。第二选择是选择性提取极性脂质，然后提取不含极性脂质的更纯的中性脂质，导致更高的回收率。最后一个选择是提取所有脂质并以一步或两步实现非常高的回收率。

现在参考图1A，流程图100提供从含藻类的生物质分馏和纯化脂质中使用的方法的示例性实施方案中包括的步骤的概述。在第一步骤110中，收获藻类细胞。在随后的步骤120中，从藻类细胞去除水来产生10-25%的固体生物质。在步骤130中，对生物质进行基于溶剂的提取并收集级分。在一些实施方案中，步骤130还包括基于pH的提取和收集级分。最后，在步骤140中可进行固相/液相分离(包括但不限于技术诸如过滤、倾析和离心)以分离出更少的脂质成分。

藻类生物质当在步骤110中收获时通常由约1-5g/L的总固体组成。生物质可以在步骤120中利用包括但不限于溶气浮选、膜过滤、絮凝、沉淀、压滤、倾析或离心的技术部分脱水。脱水是从固体或半固体物质除去一些、大多数或全部的水。本发明的实施方案采用脱水技术来从收获的藻类生物质除去水。脱水可以利用本文公开的任何方法中的任何一种或组合、以及通过本领域技术人员已知的任何其他方法来进行。

步骤120产生的脱水的藻类生物质通常由约10-30%的固体组成。然后这种生物质可以在每个阶段分离级分的多阶段逆流溶剂提取工艺中以水可混溶的略微非极性的溶剂(例如，醇)提取。这一类型的工艺可以减少资本和操作费用。在一些实施方案中，生物质还经历酸和/或碱提取来分馏蛋白材料。

在一些实施方案中，藻类生物质的脱水能够通过以溶剂诸如乙醇处理收获的藻类生物质来进行。然后允许藻类生物质沉淀出溶液，然后可通过诸如但不限于虹吸作用的方法除去液体。这一脱水新方法具有比已知方法低的资本和操作成本，使得溶剂能够再循环，减少干燥生物质的成本，并具有在开始提取和/或分离藻类成分之间降低藻类生物质的极性的附加益处。事实上，理论上本文描述的基于溶剂的沉淀工艺是有效的，部分地因为有机溶剂减少或中和藻类表面上的负电荷的事实。在本发明的一些实施方案中，联合脱水方法以除去甚至更多的水。在一些实施方案中，在脱水工艺期间添加溶剂开始提取工艺。

图1B显示脱水工艺300的说明性实施方式。具有约1g/L至约10g/L(即，0.1-1%w/w)的最终干重的藻类培养物310经历水分离工艺320。工艺320可以包括离心、倾析、沉降或过滤。在一个实施方案中，使用烧结的金属管滤器来从培养物的水分离藻类生物质。当使用这样的滤器时，将回收的水330再循环向其他藻类培养物。同时，回收的藻类生物质已经被浓缩为“藻类糊”，其藻类密度高约200g/L(即，10-20%w/w)。然后在基于溶剂的沉淀工艺350中以溶剂340处理该浓缩的藻类糊。

沉淀工艺350包括向藻类糊添加溶剂340以实现具有溶剂与生物质的重量/重量比为约1:1至约1:10的混合物。允许藻类在沉降容器中沉降，通过例如，虹吸作用和/或倾析除去溶剂/水混合物360。能够通过公知技术诸如蒸馏和/或全蒸发回收和再使用溶剂。预计剩余湿的生物质370具有醇和水溶液中的约30%至约60%w/w的固体含量。

用于脱水的理想溶剂是密度超过1.1g/mL或低于0.9g/mL的工业上常用的水溶性溶剂。实例包括异丙醇、丙酮、乙腈、叔丁醇、乙醇、甲醇、1-丙醇、重水(D₂O)、乙二醇、和/或甘油。如果溶剂密度超过1.1g/mL，则藻类生物质将会浮选而不是在沉降容器的底部产生沉淀。

图2是提取系统200的示例性实施方案的示意图。使用本领域已知的方法，包括但不限于移动带、螺旋输送机、或经由提取腔来运输湿或干燥的藻类生物质。用于提取的溶剂从分配到每个生物质槽位置的储存罐再循环。过滤提取混合物，将生物质固体返回到槽并提取到储存罐中。带上的固体基于提取所需的停留时间周期地移动。每个储存罐中的提取物可在饱和时被补充或被新鲜溶剂连续地代替。这还将大幅度地减少下游加工时间和成本。这一实施方案包括主要储器210、运输机构220、多个分离装置241-248(例如，膜过滤装置)、多个提取储器261-268、和多个再循环泵281-287。在这一实施方案中，主要储器210分为多个入口储器211-218。

在操作期间，将藻类生物质201放置在靠近运输机构220的第一末端221的第一入口储器211。此外，将溶剂205放入靠近运输机构220的第二末端222的入口储器218。运输机构220将藻类生物质沿着运输机构220从第一末端221导向至第二末端222。随着运输藻类生物质，其经过多个分离装置241-248并分为不同极性的级分。经过分离装置241-248的扩散物部分被导向至储器261-268。

例如，将藻类生物质经过第一分离装置241的扩散物部分(例如，含有液体和足够小以经过分离装置241的颗粒的部分)导向至第一储器261。从第一储器261，扩散物部分可以再循环回到第一入口储器201。然后藻类生物质不经过第一分离装置241的滞留物部分可以被运输机构220导向至第二入口储器212和第二分离装置242，第二分离装置242可包括比第一分离装置241更精细的分离或过滤介质。

可以将经过第二分离装置242的扩散物部分的段导向至第二储器262，然后经再循环泵282再循环回到第二入口储器212。藻类生物质不经过第二分离装置242的滞留物或提取的部分能够被运输机构220导向至第三入口储器213。这一工艺可以对入口储器213-218和分离装置243-248重复，从而在每个阶段的滞留物部分被导向至随后的入口储器，而扩散物部分被导向至再循环储器并再循环回到流的入口储器。

在示例性实施方案中，第一级分将以最高的水与略微非极性的溶剂比例(即最极性混合物)提取，而最后的级分将以最纯的略微非极性的溶剂(即最小极性混合物)提取。因此工艺以随着级分降低极性的顺序提取各成分。第一级分的功能是除去残留的水和促进溶剂提取工艺。随后的级分富集极性脂质，而最后的级分富集中性脂质。

油级分可以被酯化以逸出长链不饱和脂肪酸。使用工艺诸如分子蒸馏联合非分子蒸馏从油分离类胡萝卜素和长链不饱和脂肪酸。可以使用分子蒸馏从类胡萝卜素分离所有的脂肪酸。可以使用简单的蒸馏柱分馏馏出物以分离低链的脂肪酸用于精炼。长链不饱和脂肪酸保持为柱中的高沸点残留物。

在一些非限制性实施方案中，本文描述的提取系统和方法包括一个或多个步骤来从含油材料(例如，藻类生物质)分离蛋白材料。这样的蛋白提取步骤采用pH调节来实现蛋白的分离和提取。例如，在一个非限制性实施方案中，为了蛋白提取优化第一分离装置中的溶剂的pH，产生富集蛋白材料的第一级分。依赖于目标蛋白的pKa调节蛋白提取步骤的pH。可使用本领域技术人员已知的方法，包括但不限于使用Poisson-Boltzmann方程、经验方法、基于分子动力学的方法、或使用滴定曲线来确定目标蛋白的pKa。

在一些实施方案中，溶剂pH是碱性的。例如，在一些实施方案中，溶剂pH大于约10。在其他实施方案中，溶剂pH从约10到约12变化。在进一步的实施方案中，溶剂pH是约10、约11或约12。在其他实施方案中，溶剂pH是酸性的。例如，在一些实施方案中，溶剂pH小于约5。在其他实施方案中，溶剂pH从约2到约5变化。在进一步的实施方案中，溶剂pH是约2、约3、约4、约4.5或约5。然后将第一分离装置的提取的部分导向至随后的入口储器以实现基于极性的提取和分馏。在另一非限制性实施方案中，通过类似方式(即，调节溶剂pH)在最终分离装置中分离蛋白材料。

调节溶剂pH按照本领域技术人员已知的方法来进行。例如，通过向溶剂流中混合适当的酸来实现酸性pH。可用于蛋白提取的示例性酸包括但不限于，磷酸、硫酸和盐酸。类似地，碱性pH通过向溶剂流添加和混合适当的碱来实现。可用于蛋白提取的示例性碱包括但不限于，氢氧化钾和氢氧化钠。

在一些实施方案中，蛋白提取在不同于本文描述的提取和分馏系统的系统中进行。例如，在一些实施方案中，将藻类生物质浸入调节pH的溶剂混合物，随后经由适当的分离技术(例如，离心或过滤)分离。然后如本文所述地将剩余固体引入基于极性的提取和分馏系统。类似地，在一些实施方案中，将来自基于极性的提取和分馏工艺的剩余提取物暴露于调节pH的溶剂混合物以在提取工艺结束时分离蛋白材料。

如图3所示，基于极性的溶剂选择和分馏理论通过使用允许从固体材料分离脂质的Sohxlet提取工艺深入分析溶剂和对提取的影响而开发。Sohxlet提取系统用于快速筛选用于脂质类型选择性和回收的溶剂。试验了来自涵盖宽范围极性的多个化学种类的溶剂，诸如烷烃、环烷烃、烷基卤、酯、酮。在提取之前，使用用于藻油评价的标准方法诸如Bligh-Dyer脂质提取方法以三份试验待提取的生物质的脂质含量和组成。生物质包含22.16%的总脂质，其中49.52%是中性脂质。

图3展示通过利用多种极性和非极性溶剂联合Sohxlet提取工艺提取干燥藻类团块收集的证据。取决于烷烃溶剂的链长度，可以实现60-70%纯度的中性脂质和15-45%的总脂质回收率而无破坏和溶剂提取。试验的最长链烷烃溶剂即庚烷，回收60%的中性脂质和42%的总脂质。如图3所示，使用溶剂和常规提取方法诸如己烷提取干燥藻类团块的结果是低效、昂贵的，并导致差的产量。本文公开的系统和方法解决这些低效，通过控制略微非极性的溶剂与水的比例以分离出不同极性的成分，且成分的丧失最少。

较低碳的醇溶剂对于极性脂质更有选择性。中性脂质纯度对于甲醇是22%，对于乙醇是45%。异丙醇未显示极性和非极性脂质之间的任何选择性，产生52%纯的中性脂质产物。甲醇回收67%的总脂质和多于90%的极性脂质。因此，甲醇是本发明的实施方案的极佳候选物，其中甲醇可以用于在使用庚烷或己烷提取中性脂质之前从含油材料选择性提取极性脂质。试验的其他溶剂类型不显示对脂质类型的任何选择性，因为中性脂质纯度接近49%，与原始生物质中存在的脂质组成相似。而且，以这些溶剂实现的总脂质回收率从约15-35%变化，使得这些溶剂不适于选择性提取特定脂质类型或总脂质提取。

使用以下实施例1中所述的标准试验室规模分批溶剂提取装置证实来自Sohxlet分析的结果。对第一步骤选择的溶剂是甲醇以回收极性脂质，且第二步骤中选择石油醚以回收中性脂质。所有的提取以1:10的固体:溶剂比例进行。该实验中的每个提取步骤长1小时。进行的其他实验(数据未示出)指出，约45分钟或更长时间对于成功提取是足够长的。该停留时间取决于系统的热和质量传递。

在不同温度40℃、50℃和65℃进行甲醇提取以确定哪个最佳。石油醚提取在35℃(此温度接近该溶剂沸点的)进行。选择石油醚是因为其对中性脂质的高选择性、低沸点、和在提取后观察到的产物品质。

图4A显示，在65℃甲醇提取步骤后进行的石油醚提取中的中性脂质纯度超过80%，证明这两个提取步骤的联合增强了最终粗制油产物的中性脂质含量。图4B显示，总中性脂质回收率低，在第一步骤中存在显著量的中性脂质丧失。

为了减少甲醇提取步骤中中性脂质的丧失，通过向溶剂添加水可以增加溶剂的极性。图5A和5B显示以70%v/v甲醇水溶液提取上述生物质，随后以石油醚提取的结果。图5A显示，石油醚提取中的中性脂质纯度比使用纯甲醇实现的高得多。而且，通过在第一提取步骤中使用甲醇水溶液大大减少中性脂质的丧失。如图5B所示，在更高温度的甲醇提取改进中性脂质纯度但略微降低后续步骤中的总脂质回收率。

在一些示例性实施方案中，控制提取工艺的温度以确保藻类生物质中存在的藻类成分的最佳稳定性。藻类蛋白、类胡萝卜素和叶绿素是表现温度敏感性的藻类成分的实例。在其他实施方案中，在已经从藻类生物质提取温度敏感性藻类成分后升高温度。

在又其他示例性实施方案中，调节提取工艺的温度以优化期望产物的产量。提取可以在室温到(但低于)提取混合物的沸点运行。在又其他的实施方案中，取决于期望产物的溶解度而改变提取工艺的温度。在又其他的实施方案中，取决于待提取的生物质的藻类株系而优化提取温度。升高的提取温度增加期望化合物的溶解度并减少提取混合物的粘度，增强提取回收。

在一些实施方案中，提取在压力下运行以升高提取混合物的沸点。在这些实施方式中，增加压力到足以阻止沸腾的程度，同时保持提取混合物的温度低于任何期望产物将开始降解、变性、分解或被破坏的温度。

在一些示例性实施方案中，提取在进行提取的条件(例如，大气压或高压)下在接近所用溶剂的沸点进行。在其他实施方案中，提取在接近提取混合物的沸点进行，再次考虑其他提取条件。在这样的温度，由于质量转移阻力较低，溶剂向藻类细胞的汽相渗透更快。如果允许提取温度显著超过溶剂的沸点，那么溶剂-水系统可以形成共沸混合物。因此，保持系统在或接近溶剂的沸点将产生足够蒸汽以增强提取，而减少开支。此外，油的溶解度在较高温度增加，这可以进一步增加在接近溶剂沸点的温度的提取效力。图6显示甲醇水溶液-石油醚提取方案中的总脂质回收率。尽管在接近其沸腾温度进行甲醇提取略微降低中性脂质回收率，如图5B所示，但其增强总脂质回收率。

在其他实施方案中，提取在环境光照条件下进行。在其他实施方案中，提取在不透光容器诸如但不限于钢管或罩中进行以保护感光的藻类成分不降解。类胡萝卜素是感光的藻类成分。

在其他的示例性实施方案中，提取在通常的大气条件下发生。在又其他的实施方案中，提取在氮气氛下发生以保护容易氧化的藻类成分。在又其他的实施方案中，提取在惰性气体氛下发生以保护容易氧化的藻类成分。可能容易氧化的藻类成分包括类胡萝卜素、叶绿素和脂质。

在示例性实施方案中，基于生物质中固体的干重，用于提取的溶剂与固体比例为3-5。残留的藻类生物质富集碳水化合物(例如，淀粉)，且可以用作产生用于提取的溶剂的原料。

图7显示溶剂与固体比例对总脂质回收率的影响。随着溶剂与固体比例增加，总脂质回收率有相应和大幅的增加。认为这是因为脂质在甲醇与其他常用的油提取溶剂诸如己烷相比较低的溶解度。

成分的溶解度受提取工艺中使用的溶剂的极性影响。溶解度特性可以用于确定湿生物质与溶剂的比例。例如，40%w/w的湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果向该混合物加入100g乙醇，则乙醇与湿生物质的比例是1份生物质比1份乙醇且混合物中乙醇的浓度是100/(100+60)，等于液相中约62%w/w的乙醇。乙醇水混合物中62%w/w的乙醇对应6.6的极性指数，以重量计算并平均了各成分的极性。具有极性指数5.2的乙醇和具有极性指数9的水，在含62%乙醇和38%水的混合物中导致极性指数为(0.62*5.2+.38*9)约6.6。用于提取极性脂质和中性脂质的混合物的极性指数计算为分别约5.8和5.4。鉴于本公开内容，本领域技术人员将能够配制可以选择性提取这些成分的溶剂组。

在另一实例中，如果提取溶剂是异丙醇和乙醇的1:1混合物，则该溶剂的极性是((3.9+5.4)/2)，即约4.65。将计算溶剂与湿生物质的比例以匹配极性。为了得到6.6的极性指数，我们需要制备通过解答以下代数等式而计算的55%w/w的IPA-水混合物：

x*4.65+(1-x)*9=6.6

↓

x=(9-6.6)/(9-4.65)=0.55

↓

溶剂混合物-水中55%w/w的溶剂混合物

↓

对于40%w/w湿生物质，湿生物质与IPA比例是(1-0.55)/0.6~0.75

对于40%w/w湿生物质，这将对应100份湿生物质比75份溶剂混合物的比例。40%w/w的湿生物质对于每100g湿生物质具有40g生物质和60g水。如果向该混合物加入75g溶剂混合物，则混合物中溶剂的浓度是(75/(75+60))，即溶剂混合物-水溶液中约55%w/w的溶剂混合物。该计算可以用于获得在每一提取阶段和对于每种产物的溶剂生物质比例。溶剂组的数个非限制性实例呈现在表3。

表3

所有实施例中描述的提取混合物由大致上固相和大致上液相构成。这些相然后在提取后分离。然后可以从液相去除液体溶剂，产生提取产物。在一些实施方案中，蒸发溶剂。在这样的实施方式中，液液提取技术可以用于减少需要被蒸发的溶剂的量。如果条件允许，使用的任何溶剂可以被再循环。

理论上，在提取之前处理藻类生物质将增强脂质提取的生产率和效率。在这一方向进行了实验，比较向藻类生物质加入碱或另一种有机溶剂以改变表面特性和增强提取的作用。尝试了多种处理，包括甲醇水溶液、氢氧化钠水溶液和DMSO水溶液。如图8证明的，加入5%DMSO使脂质回收率增加3倍。这些提取步骤可用来显著减少甲醇提取步骤。然而，以上实验中使用的溶液在更大规模下使用可能并不理想，因为高成本、粘度、和回收和再循环DMSO的能力。

图9是显示8步骤甲醇提取对累计总脂质产量和提取的中性脂质的纯度的影响的图。在这一实施方案中，以350mL纯甲醇提取112克湿生物质(25.6%干重)，在每一步骤中以160W辐照功率加热10分钟。这导致提取温度为约75℃，接近提取混合物的沸点。使用这一工艺确定，已提取了大多数极性脂质后从藻油获得高纯的中性脂质是可能的。图9显示，在极性脂质都已被提取后分离高纯度中性脂质是可能的。在这一情形中，甲醇提取步骤5至8中实现5%产量的总生物质和超过90%的中性脂质纯度。而且，由于提取混合物的沸点，生物质中的大部分水在第一提取步骤中与碳水化合物、蛋白和金属一起被完全提取。

图10显示，通过使用乙醇来从湿的生物质提取脂质和蛋白可以更有效地进行脂质的回收。通过使用乙醇，以约4个步骤可以实现80%总脂质回收率，而不是通过使用甲醇一般需要的9个步骤。回收率的增加可以归因于脂质在乙醇中溶解度比在甲醇中的溶解度大。而且，乙醇水溶液的沸点比甲醇水溶液高，促进进一步回收脂质。这是因为更高温度使得油粘性较低，从而改进扩散性。这一工艺的另一独特益处是使用油级分中残留的乙醇用于转酯作用，以及降低对生物质干燥操作的热负荷。

此外，图10证明最初级分是不富集脂质的，包含蛋白和其他高极性分子，随后是富集极性脂质的级分，最后是中性脂质级分。因此通过适当地设计提取装置，人们可以以单个提取和分馏工艺回收所有三种产物。

本发明的另一实施方案使用微波来辅助提取。基于本申请公开的此前收集的数据，显示甲醇是从藻类提取所有脂质的最佳单种溶剂。因此，如本发明的实施例1所述，进行单溶剂多步提取以收集有关单溶剂微波提取系统的效力的数据。

图11是对数图，比较常规提取和微波辅助提取的提取时间和总脂质回收率。基于曲线的斜率，计算微波系统减少提取时间约5倍或更多。尽管常规方法具有较高的净脂质回收率，这是由于极性脂质的较高回收率。基于这些结果，已经优化了使用溶剂、带有或不带有微波辅助提取干燥藻类生物质的条件。本发明的一些实施方案使用常规微波装置，其发射激发水分子的波长。本发明的另外实施方案使用能够激发不同溶剂的定制的微波装置。本发明的又其他实施方案使用能够激发藻类生物质中存在的脂质的定制的微波装置。在一些实施方案中，使用微波激发藻类生物质中存在的脂质，从而增强脂质成分从藻类生物质的分离和提取。

含水量是生物质的将影响油提取效率的另一参数。在本发明的一些实施方案中，提取和分馏干燥藻类团块。在其他实施方案中，藻类团块是湿的。使用藻类质量含量为10%、25%和33%的生物质样品来研究水分对提取效能的影响。

图12A显示从藻类生物质逐步提取产物的说明性工艺400。图12A中的所有单位是磅。图12A显示工艺400的质量平衡，而用于进行该工艺的装备和/或系统的详情在本文别处描述。包含5磅藻类的生物质具有约0.63磅极性脂质、1.87磅中性脂质、1磅蛋白和1.5磅碳水化合物。在脱水步骤405中处理生物质和1000磅水，其从混合物分离950磅水并传递45磅水中的5磅藻类到第一提取步骤410。本文公开的任何脱水技术可以在脱水步骤405中。在第一提取步骤410中，将238磅乙醇和12磅水与来自前一步骤的藻类和水组合。第一提取步骤410具有约80.9%w/w乙醇的液相。回收231磅乙醇、53磅水和0.5磅藻类蛋白的第一液相，从其中通过例如蒸发去除水和乙醇，留下富集蛋白的产物415。从蒸发回收的溶剂可以再循环到第一提取步骤410。

来自第一提取步骤410的第一固相被传递到第二提取步骤420；该第一固相包括4.5磅藻类、2.6磅水和10.9磅乙醇。向来自前一步骤的第一固相加入86磅乙醇和4磅水。第二提取步骤420具有约93.6%w/w乙醇的液相。回收85.9磅乙醇、5.9磅水和0.6磅极性脂质的第二液相，从其中通过例如蒸发去除水和乙醇，留下富集极性脂质的产物425。从蒸发回收的溶剂能够再循环到第二提取步骤420。

来自第二提取步骤420的第二固相被传递到第三提取步骤430；该第一固相包括3.9磅藻类、0.7磅水和11磅乙醇。向来自前一步骤的第二固相加入70.5磅乙醇和3.5磅水。第三提取步骤430具有约95.4%w/w乙醇的液相。回收78.9磅乙醇、3.9磅水和1.6磅中性脂质的第三液相，从其中通过例如蒸发去除水和乙醇，留下富集中性脂质的产物435。从蒸发回收的溶剂可以再循环到第二提取步骤430。保留2.3磅藻类、0.3磅水和6.6磅乙醇的固相。

如图12A证明的，每个连续乙醇提取步骤所得的脂质特征受起始藻类中的含水量的影响很大。工艺400的模式对各自具有不同初始含水量的三种不同生物质收集物运行。随着初始含水量降低，最大脂质回收步骤从第三提取步骤改变为第四提取步骤(未示出)。然而，从这三种生物质样品的总脂质回收率是相当相似的，都高于藻类生物质的总脂质含量的95%。

当使用具有较高含水量的藻类团块时，乙醇水溶液混合物中的乙醇浓度低得多，因而粗提取物中的中性脂质百分比也较低。已经报道将具有90%水的藻类糊脱水是非常能量密集型的工艺。本文公开的方法意外地可以用于成功提取和分馏主要含水的藻类团块。由于总的脂质回收率不被从含90%水的藻类糊(10%藻类固体)开始而显著受影响，不同于常规提取方法，本文公开的方法不要求使用能量密集型的干燥步骤。

图12B显示工艺400的一个提取步骤的说明性实施方式500。向提取容器510提供藻类生物质和溶剂混合物505。提取藻类(如本文别处所述)之后，将混合物提供给粗过滤系统515诸如烧结的金属管滤器，其将混合物分为液相和固相。将固相传递到下游提取步骤。将液相传递到溶剂去除系统520例如蒸发器，以减少液相中的溶剂(例如，乙醇)含量。任选地将溶剂去除后剩余的液相传递到离心机525。将溶剂去除系统中保留的任何固体再循环或丢弃。离心机525辅助从液相中任何剩余的水和/或固体分离期望的藻类产物(例如，蛋白或脂质)。

图14显示藻类团块藉此可被加工以形成或回收一种或多种藻类产物的工艺600的一个实例。在这一实例中，使用本文公开的方法在前端工艺605中以逐步方式提取藻类生物质。提取和分离步骤随后是酯化工艺610、水解工艺615、加氢处理工艺620、和/或蒸馏工艺625以进一步分离成分和产物。成分和产物包括藻类脂质、藻类蛋白、甘油、类胡萝卜素、营养品(例如，长链不饱和油类和/或酯类)、燃料酯(一般，具有C20或更短的链长度的酯)、燃料、燃料添加剂、石脑油、和/或液体石油代替品。在优选实施方案中，燃料酯长度是C16链。在其他实施方案中，燃料酯长度是C18链。在又其他的实施方案中，燃料酯是链长度C20或更短的混合物。

酯化工艺610、水解工艺615、加氢处理工艺620和蒸馏工艺625是任选的，可以以多种顺序使用。虚线箭头和带点箭头标出在加工脂质级分时可何时进行水解、加氢处理、和/或蒸馏工艺的选项的一些但并非所有。例如，在本发明的一些实施方案中，在进行提取和/或分离后，能够直接加氢处理中性脂质级分来制造燃料产品和/或添加剂。可选地，在其他实施方案中，中性脂质级分能够被传递到酯化工艺610。

酯化工艺610可以包括本领域已知的技术，诸如酸/碱催化，并可以包括转酯作用。尽管对于产生一些产物不包括碱催化，但是酸催化是优选的，因为这些技术避免了在碱催化期间形成的皂，皂能够使得下游加工复杂化。还可使用酶促酯化技术。酯化可以加工大致上纯的脂质材料(本文所用的超过75%的脂质)。在酯化后，可去除甘油副产物。然后酯化脂质可以经历分子和/或非分子蒸馏(工艺625)以分离不同链长度的酯化的脂质以及脂质级分中存在的类胡萝卜素。然后可以将酯化的脂质传递到加氢处理工艺620以产生喷气燃料、生物柴油和其他燃料产品。可以使用本领域中已知的任何加氢处理工艺；这样的工艺向脂质分子添加氢并去除氧分子。用于加氢处理的示例性条件包括在600psi范围的高压和在600°F范围的温度将甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯与氢反应。常用的催化剂是NiMo或CoMo。

加氢处理燃料酯而不是粗制脂质具有多种益处。第一，酯化工艺610减少藻油中存在的某些磷和金属化合物的水平。这些材料对加氢处理工艺中常用的催化剂有毒。如此，加氢处理之前的酯化延长了加氢处理催化剂的寿命。而且，酯化减少被加氢处理的化合物的分子量，从而改进加氢处理工艺620的效能。另外，保持来自蒸馏工艺625的待加氢处理的燃料酯为蒸汽形式是有利的，因为如此做减少了加氢处理所需的能量。

在本发明的一些实施方案中，直接加氢处理中性藻类脂质以转化脂质为燃料产品和添加剂。而在其他实施方式中，将中性脂质酯化并经由蒸馏工艺625分为类胡萝卜素、长链不饱和酯、二十碳五烯酸(EPA)酯、和/或燃料酯。蒸馏工艺625可包括分子蒸馏以及本领域已知的任何蒸馏技术。例如，馏出物可以使用简单蒸馏柱分馏以分离低链脂肪酸用于精炼。长链不饱和脂肪酸作为高沸点剩余物保留在柱中。在一些实施方案中，然后可以将剩余蒸汽送去加氢处理工艺。本发明的两个益处是，其产生纯的饲料以及蒸汽产物，这有利于能量密集型加氢处理反应，如以上所述。

在本发明的一些实施方案中，极性脂质(和任选地，中性脂质)在被传递到酯化工艺之前在水解工艺615中水解。这样做释放了藻类脂质的脂肪酸，并使得更大量的藻类脂质能够形成为有用的产物。

图15是显示用于从中性脂质产生营养品产物的工艺700的流程图。在工艺700的一个实施方式中，向吸附工艺705供应中性脂质，分离类胡萝卜素与富集EPA的油。中性脂质可来自通过本文公开的任何选择性提取技术产生的藻类来源。然而，中性脂质可以来自其他来源，诸如植物来源。

吸附工艺705包括将中性脂质与吸附剂接触以吸附类胡萝卜素，诸如β胡萝卜素和叶黄素。在一个实施方式中，吸附剂是DiaionHP20SS(可从ITOCHU Chemicals America,Inc.商业获得)。中性脂质可以以分批型工艺接触吸附剂，其中中性脂质与吸附剂被保持在容器中持续所选的时间量。在接触时间之后，使用本领域已知的技术分离吸附剂与液体。在其他实施方式中，吸附剂被保持在吸附剂床中，中性脂质经过吸附剂床。在经过吸附剂床后，中性脂质的类胡萝卜素含量被减少，从而产生富集EPA的油。

类胡萝卜素可以通过以适当的溶剂处理吸附剂来从吸附剂材料回收，所述适当的溶剂包括但不限于，醇类诸如乙醇、异丙醇、丁醇、酯类诸如乙酸乙酯或乙酸丁酯、烷烃类诸如己烷和戊烷。

图16是显示用于从中性脂质805产生燃料产品830的工艺800的流程图。中性脂质可以来自通过本文公开的任何选择性提取技术产生的藻类来源。然而，中性脂质可以来自其他来源，诸如植物来源。中性脂质在脱胶工艺810中处理，其中脂质被酸洗以减少中性脂质中金属和磷脂的水平。在一些实施方式中，向中性脂质加入磷酸的相对稀溶液，加热并搅拌混合物。然后从剩余的油例如通过离心分离沉淀的磷脂和金属。

然后传递经处理的油到脱色工艺815以去除叶绿素和其他颜色化合物。在一些实施方式中，脱色工艺815包括将油与粘土和或其他吸附剂材料诸如脱色粘土(即，膨润土或漂白土)接触，减少油中叶绿素和其他颜色化合物的水平。然后传递经处理的油到加氢处理工艺820，其将油的成分氢化和除氧以形成燃料产品，例如，喷气燃料混合物、柴油燃料添加剂和丙烷。此外，加氢处理工艺820还导致一些裂解和产生较小链的化合物，诸如LPG和石脑油。本文描述的任何加氢处理工艺可以用于加氢处理工艺820。

将加氢处理工艺820中产生的化合物的混合物传递到蒸馏工艺825以将它们分为燃料产品830。蒸馏工艺825可以包括本文描述的或本领域已知用于分离燃料化合物的任何分子和非分子蒸馏技术。

在本发明的一些实施方案中，可从藻类生物质选择性提取蛋白。利用公开的方法提取蛋白提供了许多益处。具体地，藻类细胞不需要在提取期望蛋白之前被裂解。这简化了提取并减少了提取成本。本发明的方法利用不同类型蛋白的溶解度特征以从藻类培养物、生物质、糊或块选择性提取和分馏它们。

例如，藻类生物质可经受加热和混合以提取水和称为白蛋白和球蛋白的盐溶性蛋白。这一混合物然后可以经受pH变化以回收称为谷蛋白的碱溶性蛋白。然后这一步骤随后可以是基于溶剂地分离称为醇溶谷蛋白的醇溶性蛋白。剩余的生物质将富集碳水化合物和脂质。

蛋白可以从盐水和淡水藻类细胞二者提取，如图17和18所示。盐水藻类培养物或生物质中盐的存在影响不同类型蛋白的提取，但本文公开的方法使得人们能够从淡水或盐水藻类选择性提取蛋白。

在一些实施方案中，从淡水藻类细胞提取蛋白通过图17中所示的新工艺来实现。加热和混合淡水藻类细胞或淡水藻类生物质。混合可以通过本领域已知的多种方法实现，诸如但不限于，搅拌、振荡和摇动。这一工艺产生第一加热提取混合物或浆液，包括第一大致上液相和第一大致上固相。然后分离固相和液相。分离可以通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于，离心、倾析、浮选、沉淀和过滤。该第一大致上液相富集白蛋白蛋白。

第一大致上固相然后与盐水混合并加热以产生第二加热提取混合物或浆液，包括第二大致上液相和第二大致上固相。盐水可以是天然海水或可以是盐的水溶液。这样的溶液的一个实例包括约通常主要包含NaCl的35g/L。然后分离固相和液相。该第二大致上液相富集球蛋白蛋白。

第二大致上固相然后与水混合并加热以产生第三加热提取混合物或浆液，包括第三大致上液相和第三大致上固相。然后升高这一第三提取混合物或浆液的pH到约9或更大，使得第三大致上液相富集谷蛋白蛋白。然后分离固相和液相，第三大致上液相富集谷蛋白蛋白。

第三大致上固相然后与溶剂组混合并加热以产生第四加热提取混合物或浆液，包括第四大致上液相和第四大致上固相。在一个优选的实施方案中，溶剂组包括乙醇。在其他非限制性实施方案中，溶剂组包括一种或多种以下溶剂：甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。然后分离固相和液相。该第四大致上液相富集醇溶谷蛋白蛋白。剩余第四大致上固相可富集脂质，取决于起始藻类生物质的组成。

在一些实施方案中，从盐水藻类细胞提取蛋白通过图18中所示的新工艺实现。加热和混合盐水藻类细胞或盐水藻类生物质。混合可以通过本领域已知的多种方法实现，诸如但不限于，搅拌、振荡和摇动。这一工艺产生第一加热提取混合物或浆液，包括第一大致上液相和第一大致上固相。然后分离固相和液相。分离可以通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于，离心、倾析、浮选、沉淀和过滤。该第一大致上液相富集球蛋白蛋白。

第一大致上固相然后与水混合并加热以产生第二加热提取混合物或浆液，包括第二大致上液相和第二大致上固相。然后分离固相和液相。该第二大致上液相富集白蛋白蛋白。

第二大致上固相然后与水混合并加热以产生第三加热提取混合物或浆液，包括第三大致上液相和第三大致上固相。然后升高该第三提取混合物或浆液的pH到pH 9或更大，使得第三大致上液相富集谷蛋白蛋白。然后分离固相和液相，第三大致上液相富集谷蛋白蛋白。

第三大致上固相然后与溶剂组混合并加热以产生第四加热提取混合物或浆液，包括第四大致上液相和第四大致上固相。在一个优选的实施方案中，溶剂组包括乙醇。在其他非限制性实施方案中，溶剂组包括一种或多种以下溶剂：甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。然后分离固相和液相。这一第四大致上液相富集醇溶谷蛋白蛋白。剩余第四大致上固相可富集脂质，取决于起始藻类生物质的组成。

公开的方法还提供选择性提取不同类型的蛋白，如图17-20中所示。前述提取工艺的任何步骤可以与其余步骤分别地进行以选择性提取单种蛋白产物。其两个实例示于图17和18，由围绕提取步骤1a的带虚线的框显示。

在非限制性实例中，球蛋白蛋白可以从淡水藻类生物质选择性提取，通过混合所述生物质与盐水并加热以产生加热的提取混合物或浆液，包括大致上液相和大致上固相。然后能够分离固相和液相。液相富集球蛋白蛋白。参见图17，提取步骤1a。

在另一非限制性实例中，白蛋白蛋白可以从盐水藻类生物质选择性提取，通过混合所述生物质与水并加热以产生加热的提取混合物或浆液，包括大致上液相和大致上固相。然后能够分离固相和液相。液相富集球蛋白蛋白。参见图18，提取步骤1a。

在另外非限制性实例中，醇溶谷蛋白蛋白可以从淡水或盐水藻类生物质选择性提取，如图19所示。选择性提取通过混合藻类生物质与溶剂组并加热以产生加热的提取混合物或浆液，包括大致上液相和大致上固相来实现。然后可以分离固相和液相。液相富集醇溶谷蛋白蛋白。

在又另一非限制性实例中，蛋白级分可以从淡水或盐水藻类生物质选择性提取，如图20所示。选择性提取通过混合藻类生物质与溶剂组以产生提取混合物或浆液并实现混合物中的pH变化来实现。混合物包括大致上液相和大致上固相。然后可以分离固相和液相。液相富集蛋白。

在被告知本发明的这些方面后，本领域技术人员将能够通过单步提取工艺或多步提取工艺从淡水或盐水藻类生物质选择性提取期望蛋白。鉴于本公开内容，本领域技术人员将能够交换以上公开的多步提取方案的顺序，只要考虑到藻类团块的蛋白含量和目标蛋白的溶解度特性。公开的方法的其他实施方案可在每个提取步骤之间掺入洗涤步骤。

对于公开的任何蛋白提取方法，提取混合物/浆液可被在加热温度保持一个时间段。在一些实施方案中，提取混合物被在加热温度保持约20分钟至约90分钟。在一些方面，提取混合物被在加热温度保持约20分钟至约60分钟。在其他方面，提取混合物被在加热温度保持约45分钟至约90分钟。

在一些实施方案中，可加热提取混合物/浆液到小于约50℃的温度。在一些方面，在小于约50℃的温度提取白蛋白、球蛋白和谷蛋白蛋白。在其他实施方案中，将提取混合物/浆液加热到接近提取混合物/浆液的沸点的温度。在一些方面，在接近提取混合物/浆液的沸点的温度提取醇溶谷蛋白蛋白。在其他实施方案中，在加热和混合步骤期间增加压力高于大气压、达到并包括50psi，以增强提取。

实施例1

将绿微藻类二形栅藻(Scendesmus dimorphus，SD)培养在室外板状光生物反应器中。收获不同脂质含量的SD样品。通过离心去除大量水后，将藻类样品作为3-5cm藻类块储存在-80℃直到使用。将预先计算量的湿藻类生物质(相当于15克干燥藻类重量)和90mL乙醇溶剂加至装有冷凝器、机械搅拌器和热电偶的三颈烧瓶中。在一个实验中，在微波辐照下回流混合物10min。在第二个实验中，以电加热回流混合物1h。然后，冷却混合物到室温并通过过滤分离为扩散物和滞留物。

按照Bligh和Dyer的脂质提取方法使用氯仿-甲醇-水系统分析藻类样品的总脂质。这一总脂质值用作脂质回收率计算的参考。总脂质通过标准柱色谱法使用60–200目的硅胶(Merck Corp.,Germany)进一步分为中性脂质和极性脂质。将每种脂质级分转移到预先称重的小瓶中，最初使用旋转蒸发器(Büchi,Switzerland)在30℃蒸发，然后在高真空下干燥。将干燥的滞留物放置在氮气下然后称重。每种样品的脂肪酸特征在衍生化为脂肪酸甲酯后通过GC-MS定量，使用十七酸(C17:0)作为内部标准。

结果(数据未示出)表示，微波辅助提取对于在第一提取步骤中去除极性脂质是最佳的，但对于分离中性脂质稍微低效。电加热在提取效力方面更一致。最终产量在微波辅助提取与电加热辅助提取之间是相当的，但微波辅助提取显著更快。

实施例2

从藻类生物质提取蛋白

(1)酸浸出：将藻类生物质浸入pH 4.5的水中1小时。然后以3000rpm离心样品3分钟，去除上清液。以稀酸(pH 4.5)洗涤剩余固体3次并冻干。

(2)碱提取：将藻类生物质浸入pH 11的水中1小时。随后加入经pH调节的水。然后以3000rpm离心样品3分钟，去除上清液。用酸(pH 4.5)中和上清液，随后离心。用稀酸(pH 4.5)洗涤剩余固体3次并冻干。

酸浸出和碱提取的结果示于以下表4。

表4

蛋白产量基于重量计算，比较冻干的固体的重量与浸入经pH调节的水之前藻类生物质的重量。蛋白纯度通过Official Method of theAmerican Oil Chemists'Society(Ba-2a-38)，测量每种工艺的冻干的固体中的氮量来确定。由于蛋白是增加藻类产物提取的价值的重要产物，所以这一信息允许在本文公开的系统和方法中使用带有不同水平的蛋白的原料。

实施例3

从盐水藻类生物质提取蛋白

将最初由盐水中约1-10%w/w固体构成的盐水藻类培养物加热至50℃并在这一温度保持1hr。将所得的浆液离心以从固相分离液相。确定提取的液体富集球蛋白蛋白(最初藻类生物质中存在的总蛋白的约10%)。

然后将固体悬浮在淡水中并加热至约50℃和保持约1小时。再次离心所得的浆液以从固相分离液体。确定液相富集白蛋白蛋白(最初藻类生物质中存在的总蛋白的约10%)。

然后将固体悬浮在乙醇中以产生70%w/w混合物。将这一混合物加热至约75℃并在该温度保持约1小时。离心所得的浆液以分离液相与固相。确定液相富集白蛋白蛋白(最初生物质中存在的总蛋白的约30%)。

然后将固体悬浮在碱性溶液中(NaOH水溶液,pH 9)并加热至约50℃和在该温度保持约1小时。离心所得的浆液以从固相分离液体。确定液相富集谷蛋白蛋白(最初生物质中存在的总蛋白的约50%)。

实施例4

通过乙醇分步分馏和提取藻类生物质

收获1000磅微绿球藻属生物质(从株系202.0培养，由ArizonaState University，Laboratory for Algae Research and Biotechnology获得，ATCC保藏编号PTA-11048)并脱水直到藻类构成约35%w/w，然后最后冷冻。

提取步骤在铰接盖的400加仑套锅中进行。盖用带子系紧并用硅酮密封。系统还包含混合器和2马力的防爆马达以及双刃柄。将冷冻的藻类材料倒入罐中，使用气动筒式泵泵入等量乙醇。搅拌材料15分钟，用流加热夹套以获得每个提取步骤的期望温度。期望的温度是接近混合物沸点，是指在混合物沸点的3℃内但不沸腾。每个提取步骤的这一期望温度是不同的，因为混合物的沸点随着乙醇的比例改变而改变。达到期望温度后，保持在期望温度持续搅拌系统60分钟以确保锅的内容物被均匀加热。

然后使用气动Viking叶轮泵以每分钟约1加仑将锅的内容物泵出提取容器并泵入Sharples倾析器离心机。倾析器离心转子速度设置为约6000rpm。将固体收集在密闭塑料桶中，由约50%w/w固体比液体组成。将这些固体返回罐，重复上述提取步骤。将来自倾析器的液体流收集到供料罐中然后供应到膜过滤系统。使用的膜是由GraverTechnologies制造的0.375ft²SS膜。操作条件是60℃±5℃，具有40psi的平均压力梯度。约每15分钟以压缩空气反冲膜系统以维持回流。从膜系统收集的渗透物不含任何颗粒物质。收集滞留物并再循环到倾析器。

这一提取和分馏是由于每次提取中工艺期间的溶剂极性改变。在图13中所示的提取，工艺以约1000磅包含约65%纯水的湿藻类生物质(35%w/w藻类固体)开始。将其与860磅变性乙醇(95%乙醇和5%甲醇)混合，产生包含约55%乙醇水溶液的混合物。使用如上所述的倾析器分离固体与液体。湿固体部分重525磅，是40%干质量的。向固体加入共525磅的95%变性乙醇，产生由约85%乙醇水溶液构成的混合物。使用如上所述的倾析器分离固体与液体。固体部分重354.5磅，是40%干质量的。向这一物质加入另外700磅的变性乙醇，产生约95%乙醇水溶液的混合物。使用如上所述的倾析器分离固体与液体。所得的固体是约40%干质量的。基于水和乙醇的潜在热计算，这一生物质干燥需要的能量少60%。

在一些实验中(数据未示出)，试验了其他类型的变性乙醇。提取中使用包含95%乙醇和5%异丙醇的变性乙醇，但发现不如95%乙醇和5%甲醇有效。使用100%乙醇是本发明的优选实施方案，但通常由于成本限制通常不可获得。

使用室内装配式分批蒸馏器从膜系统蒸发渗透物流。真空蒸馏期间的操作条件是约80℃。蒸发渗透物中的所有乙醇。重复这些提取步骤3次，产生四种产物混合池，如图13所示。这是因为在每个提取步骤下，极性随着向混合物加入水而改变，允许在每一步骤提取不同成分。产物1包含藻类蛋白，因此系统中保留的过量水在操作条件下不会被蒸发。产物2包含极性脂质。产物3包含中性脂质。最后，产物4是剩余的生物质，包含可能的副产物诸如类胡萝卜素。

实施例5

通过乙醇脱水和提取藻类生物质

收获后，藻类生物质通常包含约0.1至0.5%(w/w)的固体。其可使用藻类工业中已知的任何方法脱水，包括但不限于膜过滤、离心、加热、沉淀或浮选。絮凝可以辅助浮选或沉淀。这样的方法的典型结果是包含约10%w/w固体的藻类浆液。为了进一步脱水，可使用另一脱水方法以去除一些剩余游离水来使得固体浓度更接近40%w/w。然而，在进行第一次脱水后脱水的成本成倍地增加。本文公开的系统和方法的一个益处是，允许提取和分馏经历仅一轮脱水的藻类团块。

这样的工艺的一个实例可以是，在第一轮提取中，按照实施例3中所述的方案，将包含90%纯水的1000磅湿生物质与1000磅变性乙醇(95%EtOH和5%MeOH)混合，得到约50%乙醇水溶液的溶剂混合物。所得的生物质(350磅)是40%干燥的。这些湿固体的溶剂组成是50%乙醇水溶液。在另外350磅变性乙醇下，混合物的组成将是约81%乙醇水溶液。所得的生物质(235磅)是40%干燥的。这些湿固体的溶剂组成是81%乙醇水溶液。在另外470磅变性乙醇下，混合物的组成将是约95%乙醇水溶液。所得的固体将是40%干燥，带有约95%乙醇。基于水和乙醇的潜在热计算，该湿生物质干燥需要的能量少60%。在这一情况下，100磅藻类将使用1820磅乙醇提取。与其中起始材料是40%藻类固体的实施例3比较，以2085磅乙醇提取了350磅干燥藻类当量。

参考文献

以下参考文献通过引用全文并入本文：

美国专利7,148,366

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Claims (15)

1.一种脱水湿藻类细胞培养物的方法，所述方法包括：

a.使用烧结的金属管滤器去除藻类细胞培养物中的液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分；

b.再循环从所述藻类细胞培养物去除的液体的至少一部分用于不同的藻类细胞培养物中；

c.向所述湿藻类生物质级分加入水可混溶溶剂组并等待一定的时间量以允许所述藻类生物质级分的藻类细胞聚集；和

d.分离聚集的藻类细胞的至少一部分与所述溶剂组的至少一部分和所述湿藻类生物质级分的液体从而产生脱水的藻类生物质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述脱水的藻类生物质是藻类糊或藻类块。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述水可混溶溶剂组的密度比水低或高至少约10%。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂组包括二醇、甘油、丙酮、乙腈和醇类的一种或多种。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述藻类细胞不被加入所述水可混溶溶剂组而溶解。

6.一种脱水湿藻类细胞培养物的方法，所述方法包括：

a.使用膜、离心、烧结的金属管、溶气浮选和絮凝中的至少一种去除藻类细胞培养物中液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分；

b.再循环从所述藻类细胞培养物去除的液体的至少一部分用于不同的藻类细胞培养物中；

c.向所述湿藻类生物质级分加入水可混溶溶剂组并等待一定的时间量以允许所述藻类生物质级分的藻类细胞聚集；和

d.分离所述聚集的藻类细胞的至少一部分与所述溶剂组的至少一部分和所述湿藻类生物质级分的液体从而产生脱水的藻类生物质。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述脱水的藻类生物质是藻类糊或藻类块。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述水可混溶溶剂组的密度比水低或高至少约10%。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述溶剂组包括二醇、甘油、丙酮、乙腈和醇类的一种或多种。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述藻类细胞不被加入所述水可混溶溶剂组而溶解。

11.一种脱水湿藻类细胞培养物的方法，所述方法包括：

a.去除湿藻类细胞培养物中的液体的至少一部分以获得具有比所述藻类细胞培养物低的液体含量的湿藻类生物质级分；

b.向所述湿藻类生物质级分加入包含一种或多种溶剂的第一水可混溶溶剂组；

c.从所述湿藻类生物质级分与水可混溶溶剂组的混合物产生大致上液相和大致上固相；

d.分离所述大致上固相的至少一部分；

e.向所述大致上固相的分离部分加入包含一种或多种溶剂的第二水可混溶溶剂组；

f.通过沉淀或浮选所述藻类固体分离所述大致上固相与第二水可混溶溶剂组的混合物的藻类固体的至少一部分；和

g.再循环所述第一水可混溶溶剂组和第二水可混溶溶剂组的至少之一的至少一部分至随后的藻类细胞培养物脱水工艺。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述脱水的藻类生物质是藻类糊或藻类块。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述水可混溶溶剂组的密度比水低或高至少约10%。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述第一水可混溶溶剂组和所述第二水可混溶溶剂组的至少之一包括醇类和甘油的至少一种。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述藻类细胞不被加入所述第一水可混溶溶剂组或所述第二水可混溶溶剂组而溶解。

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