KR101883325B1 - 탈지미세조류 유래 단백질 고함량 사료용 조성물 - Google Patents

탈지미세조류 유래 단백질 고함량 사료용 조성물 Download PDF

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신슬기
조재민
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Abstract

본 발명은 바이오디젤 생산의 부산물인 탈지미세조류로부터 단백질을 선택적으로 추출하고 함량을 증진시킨 단백질 고함량 사료용 조성물을 제공한다.

Description

탈지미세조류 유래 단백질 고함량 사료용 조성물{Feed composition containing high-protein content derived from lipid-extracted microalgae}
본 발명은 단백질 고함량 사료용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 탈지미세조류 유래 단백질 고함량 사료용 조성물에 관한 것이다.
산업적으로 단백질은 사료, 식품첨가제 등으로 사용되는 매우 중요한 물질이고 옥수수 및 대두와 같은 곡물의 단백질이 사용되는데 옥수수와 대두과 같은 곡물 유래 사료는 곡식가격 상승 및 불안정한 곡물가격으로 농가의 비용부담 및 확보에 어려움이 가중 되고 곡물가격 상승에 따라 옥수수와 대두와 같은 물질에서 전분 또는 지질을 추출하고 남은 박을 이용한 단백질 생산이 주를 이루고 있다. 한편 기존의 단백질 추출 공정은 유기용매 추출 이외에 대두로부터 단백질 분리를 위해 단백질의 등전점 조절을 통해 용해도를 높이거나 침전을 시키는 공정을 적용한 pH 변화를 통한 분리공정이 대표적인 공정인데 곡물박을 이용한 단백질 생산은 전분과 지질의 추출기술 발달에 따라 박의 생산량이 감소하고 원료가격 상승과 수급 불균형에 따라 생산량 감소 및 가격 상승하고 있어 단백질 추출을 위한 새로운 원료물질 탐색이 절실하다. 이에 따라 미세조류(microalgae) 유래 바이오디젤(fatty acid methyl esters) 생산가를 낮추기 위해서 지질 추출 후 버려지는 부산물인 탈지미세조류(lipid-extracted microalgae) 활용을 통한 부산물 크레디트(credit)를 확보하는 것이 하나의 방안으로 고려되고 있다. 탈지미세조류는 잔류 지질 외에 다른 곡류에 비해 많은 양의 단백질 (20%-60%)를 함유하고 있으며 단백질 아미노산 조성이 다양하여 필수아미노산 풍부하게 포함되어 있다. 이러한 탈지미세조류의 높은 단백질 함량에도 불구하고 탈지미세조류의 탈지공정에 유기용매가 적용된 이유로 일반적으로 사용되는 유기용매를 이용한 단백질 분리를 재적용하기 어려운 점이 있기 때문이다.
탈지미세조류로부터 단백질 분리를 위해 단백질의 등전점 조절을 통해 용해도를 높이거나 침전을 시키는 공정을 적용한 pH 변화를 통한 분리공정이 대표적인 공정이나 상기의 유기용매 추출과 같이 미세조류 이용 상업화 규모 단백질 추출기술이 개발 된 바가 없다는 점이 유기용매와 산도조절을 통한 미세조류 유래 사료 또는 식품용 단백질 생산의 미충족 기술이고 탈지미세조류 단백질 추출수율 최대화 및 추출 비용 절감을 위한 공정개선에 대한 연구는 매우 제한적으로 수행된 것으로 확인되어 단백질 추출 수율에 미치는 용매 및 산도를 포함한 주요 변수에 대한 조사가 수행될 필요성 있다. 또한 사료로서 가치를 높이기 위해 사료의 단백질 함량이 높고 곡물에서 섭취가 어려운 제한아미노산의 함량이 증진된 단백질 고함량 사료의 개발이 필요하다. 이와 관련하여 한국 등록특허 제1564829호는 미세조류 부산물을 함유하는 어류 양식용 배합사료 조성물에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 낮은 단백질 추출 수율로 인해 어류 양식용 사료에만 적용 가능한 한계가 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 바이오디젤 생산 부산물인 탈지미세조류로부터 단백질을 선택적으로 추출하고 함량을 증진키고 곡물에 부족한 아미노산인 제한아미노산의 함량이 높은 단백질 고함량 사료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 탈지미세조류(lipid-extracted microalgae) 추출물을 조단백질로 포함하는, 사료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 탈지미세조류를 준비하는 단계; 상기 탈지미세조류에 유기용매를 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 농축단계; 단백질이 농축된 탈지미세조류에 염기성 용액을 처리하여 단백질을 용출시키는 단백질 용출 단계; 및 상기 단백질 용출 단계에서 용출된 단백질에 산성 용액을 처리하여 단백질을 침전시키는 단백질 침전단계를 포함하는 사료용 조단백질의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 탈지미세조류를 준비하는 단계; 상기 탈지미세조류에 물, 유기용매 또는 그의 혼합물을 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 추출단계를 포함하는, 사료용 조단백질의 생산방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 바이오 디젤을 제조하기 위해 추출공정을 거친 후 남은 부산물인 탈지미세조류를 이용하여 단백질 함량이 증진된 사료용 조성물 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 단백질을 분리함에 있어 추출 용액의 pH에 따른 단백질 회수율을 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 단백질을 분리함에 있어 침전 pH에 따른 단백질 회수율을 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 단백질을 분리함에 있어 추출 시간에 따른 단백질 회수율을 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 단백질을 분리함에 있어 추출 온도에 따른 단백질 회수율을 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 단백질을 분리함에 있어 염기 추출 공정의 최적화 조건을 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류로부터 순차적 분리공정을 이용한 단백질 분리공정을 개략적으로 나타내는 공정도이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "미세조류(microalgae)"는 바다에 서식하는 식물성 플랑크톤으로, 흔히 적조를 일으키는 코클로디니움 같은 플랑크톤 역시 미세조류에 속한다. 해양 바이오에너지 연구가 주목하는 미세조류는 특히 지질, 즉 기름 성분이 풍부한 미세조류 종(種)이다. 크기는 10μm(미크론, 1m의 100만분의 1)정도, 머리카락 굵기의 10분의 1 안팎이다.
본 문서에서 사용되는 "탈지미세조류(lipid-extracted microalgae)"는 미세조류 배양 후 지질을 추출하고 잔류한 고체 부산물이며 미세조류 건조중량 30-50%를 차지하고 있다. 미세조류의 대량배양으로서 1960년대 아시아를 중심으로 건강보조식품으로서 클로렐라의 상업적 생산을 시작하였으며, 프랑스에서는 스피룰리나를 단백질원으로 개 발하고자 대량배양을 시작하였다. Spirulina는 단백질함량이 건량의 46-71%로매우 높고 γ-linolenic acid(GLA), phycocyanin, oxanthophyll, zeaxanthin 등 생리활성물질이 다량 함유되어 있어 식품보조제뿐만 아니라 동물사료로서 단백질이나 vitamin을 제공하는 우수한 소재로 선호되고 있다. 단백질 이외에 탄수화물과 리그닌이 일부 함유되어 있는데, 다양한 페놀성 물질의 결합체인 리그닌(lignin)이 외부를 감싸 보호하고 있는 형태를 지니고 있다. 탈지미세조류는 페놀성 화합물을 포함한 천연 항산화제를 함유하고 있어 지질 추출시 사용 된 용매에 용출되지 않은 다당체, 항산화물질 등 기능성 소재가 다량 함유되어 있어 고부가가치 식품, 사료, 화장품 및 의약품 소재로서 높은 가치가 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 탈지미세조류(lipid-extracted microalgae) 추출물을 조단백질로 포함하는, 사료용 조성물이 제공된다.
상기 사료용 조성물에 있어서, 상기 미세조류는 테트라셀미스, 스피루리나, 클로렐라 또는 식물성 플라크톤일 수 있고 지질, 탄수화물, 필수비타민 및 무기질을 추가로 포함할 수 있으며 상기 조단백질 10 중량부를 기준으로 상기 지질은 5 내지 10 중량부, 상기 탄수화물은 2 내지 30 중량부, 상기 필수비타민은 0.1 내지 0.5 중량부 및 상기 무기질은 0.5 내지 5 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 사료용 조성물은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다. 이때 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 사료용 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 탈지미세조류를 준비하는 단계; 상기 탈지미세조류에 유기용매를 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 농축단계; 단백질이 농축된 탈지미세조류에 염기성 용액을 처리하여 단백질을 용출시키는 단백질 용출 단계; 및 상기 단백질 용출 단계에서 용출된 단백질에 산성 용액을 처리하여 단백질을 침전시키는 단백질 침전단계를 포함하는 사료용 조단백질의 생산방법이 제공된다.
상기 사료용 조단백질의 생산방법에 있어서, 상기 단백질 침전단계에서 침전된 단백질을 물, 유기용매 또는 그의 혼합물로 추출하는 단백질 추출단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 탈지미세조류를 준비하는 단계; 상기 탈지미세조류에 물, 유기용매 또는 그의 혼합물을 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 추출단계를 포함하는, 사료용 조단백질의 생산방법이 제공된다.
상기 사료용 조단백질의 생산방법에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 초산에틸, 에틸렌글라이콜 또는 벤젠일 수 있고 상기 산성 용액은 황산, 염산, 질산 및 초산일 수 있으며 상기 염기성 용액은 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화나트륨(NaOH) 또는 암모니아일 수 있다.
본 발명자들은 종래에는 단백질을 사료로 이용하기 위해 기존 사료와 적당한 배합량이 중요하며 배합의 편의성과 보관, 운송비 감소를 위해 단백질 함량을 높여 부피와 질량을 줄이는 것이 유리하여 단백질 고함량의 사료 생산이 필요함에 따라 바이오디젤 생산 후 버려지는 부산물인 탈지미세조류의 활용하는 방안에 대해 주목하였다. 탈지미세조류는 높은 단백질 함량에도 불구하고 탈지미세조류의 탈지공정에 유기용매가 적용된 이유로 유기용매만을 이용한 단백질 분리를 재적용하기 어려운 점과 미세조류를 이용한 상업화 규모의 단백질 추출기술이 개발 된 바가 없다는 점이 미세조류 유래 식품소재용 단백질 생산의 미충족 기술이었고 탈지미세조류에 포함된 아미노산이 다양하고 함량에 차이가 많아 유기용매와 산도 조절법을 병행한 추출 및 농축법 개발이 필요하여 바이오디젤 생산 부산물인 탈지미세조류로 부터 단일 및 다중 단계 추출 공정을 통해 생성물을 선택적으로 제거하여 단백질의 효율적인 분리가 가능하였고 특히 곡류로부터 섭취가 어려운 제한아미노산인 라이신, 메티오닌, 트레오닌등의 단백질 함량이 높아 어류, 갑각류 및 동물의 양식에 다양하게 활용될 수 있는 사료용 조성물을 개발하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 탈지미세조류(LEA)
본 발명에 사용된 미세조류는 인하대학교 해양바이오연구센터에서 실내배양기에서 배양 후 탈지과정을 마친 미세녹조류 Tetraselmis KCTC 12236BP를 제공받아 60℃오븐에서 12시간 건조하여 10~35 mesh 크기의 체로 선택된 건조 탈지미세조류를 사용하였으며 실험에 사용할 때까지 5℃ 냉동보관 하였다. 또한 추출용매로 사용한 유기용매는 Sigma-Aldrich 社(St. Louis, MO, USA)의 순도 95% 이상 시약을 사용하였고 분석에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich사의 일급 이상 시약을 사용하였다.
실시예 2: 탈지미세조류 세척
본 발명의 일 실시예에 따라 단백질 추출을 위한 탈지미세조류 분말 시료와 0.01 mol 황산용액을 1:10(w/w) 비율로 혼합한 뒤 50℃ 진탕배양기에서 150 rpm으로 2시간 세척하여 지질 추출 후 잔류한 유기용매를 제거하였다.
실시예 3: 주요성분 분석
탈지미세조류의 단백질은 탄소, 수소, 산소의 각 원소 외에 반드시 일정량의 비율로 질소를 함유하고 있는데 상기 탈지미세조류의 단백질 정량은 전질소량을 정량하고 그 값에 일정의 계수를 곱하여 조단백질의 양을 구하였다. 질소 정량법은 1883년 Kjeldahl이 제안한 방법으로 수행하였고 탈지미세조류 중의 단백질 정량은 전질소량을 정량하고 그 값에 일정의 계수를 곱하여 단백질 함량으로 하는 것이 일반적인데 본 발명에서 100/16, 즉 6.25의 계수를 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. 조지방 분석은 클로로포름과 메탄올을 이용하여 추출하여 총 지질함량을 측정하였다. 지질시료에 2 ml의 dichromate solution을 넣은 후 60 분 동안 중탕 하였다. 실온에서 식힌 후 10 ml의 증류수를 첨가하여 발색되도록 하여 350 nm에서 흡광도를 측정하였고, 기준시약으로는 1 mg/ml의 palmitic acid를 사용하였다. 회분 분석은 시료를 500~550℃에서 태울 때 휘발되지 않고 남는 무기물을 측정하는 것으로, 백색-회백색의 회분이 얻어질 때까지 계속 가열하였다. 회화가 끝난 후, 온도가 약 200℃ 이하로 되었을 때 데시케이터에 옮겨 식힌 후 칭량하였다. 세포벽의 성분분석은 미국 신재생 에너지 연구소(NREL; National Renewable Energy Laboratory)에서 제시한 NREL LAP (Laboratory Analytical Procedure)에 따라 분석을 진행하였다. 해당 바이오매스 고체 샘플 0.3 g을 3.0 ml 고농도 황산(72% w/w)에 넣고 30℃에서 1시간 동안 가수분해를 진행한 후 84 ml의 증류수로 4.0% 황산 액으로 희석한 후 고압멸균장치를 이용하여 121℃에서 1시간 동안 2차 가수분해를 하였다. 가수분해된 상등액을 HPLC (Bio-Rad Aminex HPX-87P column)와 Refractive index detector(Varian 356-LC, Varian, Inc., CA, USA)를 이용하여 각 성분에 대한 정량분석을 수행하였다. 건조된 탈지미세조류의 세포벽 주요성분은 분석을 수행하였을 때 발명에 사용 된 Tetraselmis 의 세포벽 구성성분은 표 1과 같다.
그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 탈지미세조류의 주요성분 함량은 조단백질 22.7%로 측정되었다.
단백질 조지방 탄수화물 회분 리그닌 합계
함량(%) 22.7 0.74 13.6(육탄당) 5.6(오탄당) 32.6 3.8 79.0
실시예 4: 염기/산용액을 이용한 단백질 분리
염기용액을 이용한 단백질 용출과 침전은 탈지미세조류를 pH가 조절 된 염기용매 또는 NaOH를 용매로 하여 고체시료와 첨가비율을 1:10(w/w)로 혼합한 후 30-100℃로 유지된 진탕배양기에서 150 rpm으로 6시간 교반하여 단백질을 용출키거나 초음파 추출기에서 30-100℃ 온도에서 20-80 kHz의 초음파강도로 단백질을 용출시켰다. 이후 혼합물을 4,000×g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 회수하였고 등전점을 이용한 단백질 침전을 위해 5 N HCl 첨가를 통해 등전 pH로 떨어뜨린 뒤 10,000×g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리 하여 침전된 단백질을 회수하였다. 상기 회수한 단백질은 5배(w/w)의 1차 증류수를 가하여 세척하여 오븐 또는 동결건조기에서 건조시켜 시료로 사용하였다.
실시예 5: 추출용액의 pH에 따른 단백질 회수율
NaOH를 이용한 단백질 분리는 NaOH 첨가를 통해 분리용액의 pH를 높여 강알칼리 조건에서 단백질을 용출시켰다. 수용성 단백질은 용출용액의 pH에 따라 단백질의 용해도가 다르게 나타나는데 최적용출 조건을 탐색하기 위해 2M NaOH 용액을 사용하여 용출용액의 pH가 단백질 회수율에 미치는 영향을 평가하였다.
그 결과, pH가 증가함에 따라 단백질 회수율이 비례하여 증가하는 것으로 나타났다(도 1). 이는 NaOH 첨가에 따라 단백질 수소결합의 붕괴로 인한 수소원자의 해리가 증가하게 되고 이로 인해 단백질의 표면 전하량이 증가하여 용해도가 증가하였기 때문인 것으로 사료된다. 상기 실험의 결과에 근거하여 이후 진행되는 실험에서는 초기 용출조건을 2 M NaOH를 이용하여 pH 13로 조정하여 수행하였다.
실시예 6: 등전점 탐색
본 발명의 일 실시예에 따라 1차 용출 용액에 염기성 용액을 처리하여 단백질 침전의 최적조건을 관찰하였다. 염기성 용액을 이용한 용출 결과물을 4,000×g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고 상등액에 포함된 단백질을 침전시키기 위해 5 N HCl 첨가를 통해 등전 pH인 3-5 범위로 떨어뜨린 뒤 침전물 생성을 확인하고 10,000×g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리하여 상기 침전된 단백질을 회수하였다.
또한, NaOH를 이용한 단백질 분리는 증류수에 NaOH 첨가용액을 pH를 높여 단백질을 용출한 후, 상등액을 회수하여 단백질이 용해 된 염기용액을 HCl을 이용하여 등전점에 가깝게 pH를 shifting시켜 단백질의 순전하를 0으로 만들어 수용 단백질 간의 척력을 최소화하여 침전을 유도하였다. NaOH를 이용한 단백질 분리는 pH를 높여 단백질을 용출한 후, 상등액을 회수하여 단백질이 용해 된 염기용액을 HCl을 이용하여 등전점에 가깝게 pH를 shifting 시켜 단백질의 순전하를 최소화하여 수용 단백질 간의 척력을 최소화시켜 침전을 유도시키는 방법을 말한다. 이를 위해 NaOH를 이용한 용출 후 등전점으로 pH이동을 통한 등전점 침전을 위해 산성화 공정이 필요한데 침전과정에서 침전 pH가 단백질 회수량에 미치는 영향을 파악하고 회수량이 최대가 되는 등전점을 확인하고자 등전점 실험을 위해 NaOH 용출 용액에 HCl을 점진적으로 첨가하여 pH를 조절하여 최대 침전 조건을 탐색하였다.
그 결과, 침전 pH가 3.6에 근접함에 따라 단백질 회수율이 증가하는 것으로 나타났다(도 2).
실시예 7: 단백질 용출 시간이 단백질 회수율에 미치는 영향
단백질 용출과 침전을 통한 회수공정은 추출시간, 온도, 용매의 종류에 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있어 단백질 회수에 미치는 용출시간의 영향을 평가하기 위해 용출시간을 0.5 - 16 hr로 변화시켜 회수율을 비교하였다.
그 결과, 용출시간이 증가함에 따라 회수율이 증가하며 추출 8 hr에 최대 회수율을 보였는데 이는 용출 시간증가에 비례하여 단백질 내의 수소결합 파괴에 따른 전하의 노출에 따라 용해도가 증가한 것으로 예측할 수 있다(도 3). 하지만 용출시간이 길어짐에 따라 회수율이 줄어드는 결과를 보였는데 이는 단백질의 과분해에 의해 회수되는 단백질의 양이 줄어든 결과라고 예상된다.
실시예 8: 용출온도가 회수율에 미치는 영향
단백질 추출 시, NaOH를 이용한 용출 시, 온도가 단백질회수에 미치는 영향을 평가하고자 용출시간을 8시간으로 고정하고 용출온도를 40-80℃ 로 변화시켜 시험을 수행하였다.
그 결과, 단백질회수율은 전반적으로 용출온도 60℃까지 증가하나 60℃ 이후에서 감소하는 경향을 나타내었다(도 4). 이는 탈지미세주류의 있는 수용성 단백질이 비교적 낮은 온도에서 더 잘 분리가 되는 것으로 기존 해조류의 수용성 단백질 추출연구에 있어 파래, 김, 미역, 모자반 등이 40-60℃에서 1-3 시간 추출 시, 최대 추출율을 보이며 이후의 온도에서 추출율이 감소하는 경향을 보였다는 것과 유사한 결과이다. 거대조류 또는 미세조류의 세포벽에 리그닌 성분이 없어 물리/화학적으로 결합력이 상대적으로 낮아 저온에서 열수에 의한 팽윤이 낮은 온도에서도 쉽게 일어나 수용성 물질의 용출이 용이하기 때문이라고 판단된다. 또한, 탈지미세조류로부터 단백질 추출조건 최적화를 위해 용매선정, 추출 pH, 침전 pH, 추출 시간과 온도를 순차적으로 최적화한 결과, 추출수율은 추출용매인 알칼리 농도가 증가할수록 단백길 침전 pH 3.6에서 높게 나타났고 알칼리 농도가 침전 pH에 비하여 보다 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며 추출시간과 온도의 증가에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 염기 추출 공정의 최적화 조건인 추출 pH 13, 침전 pH 3.6에서 최대 수율 51.4%를 획득하였다(도 5).
실시예 9: 유기용매를 이용한 고함량 단백질 생산
유기용매를 이용한 비단백질 부분 제거는 세척 탈지미세조류를 건조한 후, 20-100% 유기용매를 사용하여 1:10(w/w) 비율로 혼합한 후 30-100℃로 유지된 진탕배양기에서 150 rpm으로 6시간 교반하여 제거하거나 초음파 추출기에서 30-100℃ 온도에서 20-80 kHz의 초음파강도로 제거하였다. 이후 혼합물을 4,000×g, 4℃의 조건에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 회수하였으며 침전된 고체물질에 포함된 단백질을 정량하여 회수율을 계산하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 유기용매를 이용한 1차 추출을 통해 단백질 함량이 3.0배 이상 증진된 추출물을 확보하였으며 단백질 회수율은 모든 유기용매 분리에서 95% 이상을 확보하였다.
실험번호 1차용매 2차용매 1차 세척액 2차 세척액 단백질함량(%) 단백질 수율(%)
1 DIW pH4 DIW pH4 68.26 95%이상
2 EtOH 25% DIW Ph4 EtOH 25% EtOH 100% 64.02 95%이상
3 ACN 50% EtOH 25% ACN 100% ACN 100% 58.77 95%이상
4 ACN 50% ACN 100% 53.45 95%이상
5 ACN 100% EtOH 25% ACN 100% ACN 100% 54.38 95%이상
6 ACN 100% ACN 100% 53.67 95%이상
7 EtOH 50% EtOH 25% EtOH 100% EtOH 100% 58.19 95%이상
8 EtOH 50% EtOH 100% 54.47 95%이상
9 EtOH 100% EtOH 25% EtOH 100% EtOH 100% 60.38 95%이상
10 EtOH 100% EtOH 100% 51.77 95%이상
11 ACT 50% EtOH 25% ACT 100% ACT 100% 60.59 95%이상
12 ACT 50% ACT 100% 55.93 95%이상
13 ACT 100% EtOH 25% ACT 100% ACT 100% 58.63 95%이상
14 ACT 100% ACT 100% 52.06 95%이상
DIW= 증류수, ACN = 아세토나이트릴, EtOH= 에탄올, ACT = 아세톤
실시예 10: 염기용출과 유기용매를 이용한 단백질 함량 증대
단백질 함량 증대를 위하여 탈지미세조류에 상기 실시예 4의 방법과 상기 실시예 5 내지 8의 최적조건을 적용하여 염기 및 산을 이용하여 조단백질을 용출시키고 실시예 9에 있는 방법 즉 유기용매를 이용한 순차적인 추출을 통해 단백질 함량이 22.7%에서 76.4%로 3.4배 증가하였으며 단백질 회수율은 61%를 확보하였다.(도 6).
실시예 11: 아미노산 영양성분 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 탈지미세조류 추출물의 아미노산 영양성분을 분석하였다. 아미노산은 AOAC법을 변형하여 이온교환 크로마토그래피법을 이용한 ninhydrin postcolumn반응법으로 단백질로부터 아미노산을 분해하였다. 탈지미세조류 시료 0.2 g을 분해관에 넣고 5 N HCl 50 mL를 가하여 질소가스를 주입한 후 110℃에서 24시간 가수분해 시켰다. 여액을 감압농축기로 농축 후 0.2 M sodium citrate buffer로 50 mL로 정용한 후, 0.45 μm의 nylon syringe filter로 여과한 여액을 분석시료로 사용하였다 아미노산 분석기기의 조건은 amino acid analyser L-8900에 양이온교환수지를 이용하여 60℃에서 분석을 진행하였으며 이동상은 0.4 mL/min으로 유속을 조정하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 종래 곡류 사료 및 농후사료인 육골분과 비교한 결과, 탈지미세조류 추출-농축 결과물의 필수아미노산의 함량이 곡류사료 및 육골분 농후사료 대비 4배 및 1.1 - 1.3배 더 높게 나타났다.
단백질 Lys Thr Met Glu Asp Lue Ala Gly
옥수수(곡류농후) 7.2 0.9 0.3 0.7
육골분(동물농후) 62 3.2 3.3 1.5
SCP(조사료) 61 0 0 0
LEA원물 1 22.4 1.3 1.0 0.6 2.3 2.0 1.7 1.5 1.3
LEA 추출-농축 76.4 4.1 3.6 2.0 7.8 6.9 6.6 5.5 4.2
결론적으로, 바이오디젤의 생산 부산물인 탈지미세조류를 대상으로 에탄올과 물에 의한 전처리 및 추출과정을 거쳐 제조한 본 발명의 탈지미세조류 유래 사료용 조성물은 지질추출 용매에 의한 독성이 없고, 특히 라이신, 트레오닌과 메타이오닌은 옥수수를 주재로 하는 사료에 부족하기 때문에 미생물 발효로 제조하여 사료첨가제 형태로 첨가해주고 있는데, 본 발명의 사료용 조성물의 경우 라이신의 함량이 높으므로 탄수화물과 지질, 무기질, 비타민 정도만 추가시켜주면 되기 때문에, 바이오디젤 생산 과정에서 생성되는 부산물인 탈지미세조류를 효율적으로 활용할 수 있는 기술이고 이외에도 다른 아미노산의 함량이 높아 가축사료 이외에도 조미료, 식품첨가제 및 건강보조제 제품 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 탈지미세조류를 준비하는 단계; 상기 탈지미세조류에 유기용매를 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 농축단계; 단백질이 농축된 탈지미세조류에 염기성 용액을 처리하여 단백질을 용출시키는 단백질 용출 단계; 및 상기 단백질 용출 단계에서 용출된 단백질에 산성 용액을 처리하여 단백질을 침전시키는 단백질 침전단계를 통해 제조된 탈지미세조류(lipid-extracted microalgae)로부터 추출된 조단백질 10 중량부, 지질 5 내지 10 중량부, 탄수화물 2 내지 30 중량부, 필수비타민은 0.1 내지 0.5 중량부 및 무기질 0.5 내지 5 중량부를 포함하는, 사료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 테트라셀미스, 스피루리나, 클로렐라 또는 식물성 플라크톤인, 사료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 탈지미세조류를 준비하는 단계;
    상기 탈지미세조류에 유기용매를 처리하여 지질 및 탄수화물을 제거하는 단백질 농축단계;
    단백질이 농축된 탈지미세조류에 염기성 용액을 처리하여 단백질을 용출시키는 단백질 용출 단계; 및
    상기 단백질 용출 단계에서 용출된 단백질에 산성 용액을 처리하여 단백질을 침전시키는 단백질 침전단계를 포함하는 사료용 조단백질의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단백질 침전단계에서 침전된 단백질을 물, 유기용매 또는 그의 혼합물로 추출하는 단백질 추출단계를 추가로 포함하는, 사료용 조단백질의 생산방법.
  7. 삭제
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 초산에틸, 에틸렌글라이콜 또는 벤젠인, 사료용 조단백질의 생산방법.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 산성 용액은 황산, 염산, 질산 및 초산인, 사료용 조단백질의 생산방법.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 염기성 용액은 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화나트륨(NaOH) 또는 암모니아인, 사료용 조단백질의 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20130040870A (ko) * 2010-04-06 2013-04-24 헬리아에 디벨롭먼트, 엘엘씨 담수 조류로부터 단백질의 선택적 추출
KR20150092549A (ko) * 2014-02-05 2015-08-13 강릉원주대학교산학협력단 미세조류 부산물을 함유하는 어류 양식용 배합사료조성물

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