MX2012011561A - Extraccion selectiva de proteinas de algas de agua salada. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la extracción selectiva y fraccionamiento de proteínas de algas a partir de una biomasa de algas o cultivo de algas. Un método para la eliminación selectiva de productos de una biomasa de algas proporciona un proceso de extracción de una sola y múltiples etapas que permiten la separación eficaz de las proteínas de las algas. Estas proteínas pueden usarse como fuentes renovables de proteínas para materia prima animal y alimento humano. Más aun, los lípidos que permanecen en la biomasa de algas después de la extracción de las proteínas pueden usarse para generar combustibles renovables.

Description

EXTRACCION SELECTIVA DE PROTEINAS DE ALGAS DE AGUA SALADA Campo de la Invención La invención se refiere a la extracción y fraccionamiento de productos de alga, que incluyen, pero sin limitarse a, aceites y proteínas. Más específicamente, los sistemas y métodos descritos en la presente descripción utilizan la etapa de extracción y fraccionamiento con un solvente ligeramente no polar para procesar la biomasa húmeda de algas.

Antecedentes de la Invención El petróleo es un recurso natural compuesto principalmente de hidrocarburos. La extracción del aceite de petróleo a partir de la tierra es costosa, peligrosa, y frecuentemente a expensas del medio ambiente. Además, las extensas reservas mundiales del aceite se agotan rápidamente. Los costos se acumulan también debido al transporte y procesamiento requeridos para convertir el aceite de petróleo en combustibles utilizables tales como gasolina y combustible de reactor.

Las algas han ganado una importancia significativa en los últimos años dada su capacidad para producir lípidos, que se pueden usar para producir biocombustible sostenible. Esta capacidad se puede explotar para producir combustibles renovables, reducir el cambio climático global, y tratar Ref.: 235770 aguas residuales . La superioridad de las algas como una materia prima de biocombustible obedece a una diversidad de factores, que incluyen elevada productividad por-acre comparado con las plantas terrestres típicas para el cultivo de aceite, recursos de materia prima basados en no comestibles, uso de cualquier otra parte plana no-productiva, no cultivable, utilización de una amplia diversidad de fuentes de agua (fresca, salobre, salina, y aguas residuales) , producción tanto de biocombustibles como co-productos valiosos tales como carotenoides y clorofila.

Varias miles de especies de algas se detectaron y estudiaron en todo el mundo para la producción de lípidos durante las últimas décadas. De éstas, se identificaron aproximadamente 300 especies ricas en la producción de lípidos. La composición y contenido de lípidos varía en las diferentes etapas del ciclo de vida y se afectan por las condiciones ambientales y de cultivo. Las estrategias y enfoques para la extracción se diferencian bastante en dependencia de las especies/cepas individuales de algas empleadas debido a la notable variabilidad en la composición bioquímica y las propiedades físicas de la pared celular de las algas. Los procesos convencionales de extracción física, tal como extrusión, no funcionan bien con las algas dado el espesor de la pared celular y el tamaño pequeño (de aproximadamente 2 a aproximadamente 20nm) de las células de algas. Además, las grandes cantidades de lípidos polares en el aceite de algas, al compararlo con el aceite típico recuperado a partir de semillas, conducen a las cuestiones de refinamiento .

Después de cosechar, las concentraciones de algas típicas en los cultivos oscilan en el intervalo de aproximadamente 0.1-1.0 % (p/v) . Esto significa que antes de intentar la extracción de aceite se debe eliminar tanto como 1000 veces la cantidad de agua por unidad de peso de algas. Actualmente, los métodos de extracción de aceite que existen para materiales oleaginosos requieren estrictamente el alimento casi completamente seco para mejorar el rendimiento y calidad del aceite extraído. Debido a la cantidad de energía requerida para calentar la masa de algas hasta secarla suficientemente, el alimento de algas para el proceso de biocombustible se torna poco económico. Típicamente, el alimento se extrude o descama a altas temperaturas para mejorar la extracción. Estas etapas no pueden trabajar con el equipo existente, debido a la naturaleza de célula sencilla micrométrica de las algas. Además, el aceite de alga es muy inestable debido a la presencia de ácidos grasos de cadenas largas de doble enlace . Las altas temperaturas usadas en los métodos convencionales de extracción causan la degradación del aceite, aumentando de ese modo los costos de los métodos.

Se conoce en la técnica extraer el aceite a partir de la masa seca de algas usando hexano como un solvente. Este proceso es intenso en energía. El uso de calor para secar y hexano para extraer produce un producto de calidad inferior mientras que este tipo de procesamiento causa la degradación de lípido y proteína.

La extracción de aceite de algas se puede clasificar en dos tipos: métodos disruptivos o no disruptivos.

Los métodos disruptivos involucran la ruptura de la célula por métodos mecánicos, térmicos, enzimáticos o químicos. La mayoría de los métodos disruptivos resultan en emulsiones, que requieren un proceso de limpieza costoso. Los aceites de algas contienen un por ciento grande de lípidos polares y proteínas que mejoran la emulsificación de los lípidos neutros. La emulsificación se estabiliza además por el nutriente y componentes salinos dejados en la solución. La emulsión es una mezcla compleja, que contiene lípidos neutros, lípidos polares, proteínas, y otros productos de algas, que se procesan por refinamiento extensivo para aislar los lípidos neutros, que son el alimento que se convierte en biocombustible .

Los métodos no disruptivos proporcionan bajos rendimientos . El ordeño es el uso de solventes o químicos para extraer los lípidos a partir de un cultivo de algas en crecimiento. Aunque a veces se usa para extraer los productos de algas, el ordeño no puede funcionar con algunas especies de algas debido a la toxicidad del solvente y ruptura de la pared celular. Esta complicación hace difícil el desarrollo de un proceso genérico. Además, los volúmenes de solventes requeridos pueden ser astronómicos debido a la concentración máxima posible de solvente en el medio.

Las extracciones múltiples pueden requerir destilaciones extensivas, usando mezclas complejas de solventes, y necesitan mecanismos para la recuperación y reciclaje del solvente. Esto hace las extracciones poco prácticas y poco económicas para el uso en las tecnologías de aceite de algas.

En consecuencia, para superar estas deficiencias, existe una necesidad en la técnica de métodos y sistemas mejorados para la extracción y fraccionamiento de los productos de algas, en particular el aceite de algas, proteínas de algas, y carotenoides de algas.

Sumario de la Invención Las modalidades descritas en la presente descripción generalmente se refieren a los sistemas y métodos para la extracción de lípidos de diversas polaridades a partir de un material oleaginoso, que incluye por ejemplo, una biomasa de algas. En particular, las modalidades descritas en la presente descripción conciernen la extracción de lípidos de diversas polaridades a partir de una biomasa de algas usando solventes de diversas polaridades y/o una serie de filtros de membranas. En algunas modalidades, el filtro es un microfiltro .

En algunas modalidades de la invención, un sólo solvente y agua se usan para extraer y fraccionar los componentes presentes en un material oleaginoso. En otras modalidades, estos componentes incluyen, pero sin limitarse a, proteínas, lípidos polares, y lípidos neutros. En aún otras modalidades, se usa más de un solvente. En aún otras modalidades, se usa una mezcla de solventes.

En algunas modalidades, los métodos y sistemas descritos en la presente descripción son útiles para la extracción de coproductos de lípidos a partir del material oleaginoso. Los ejemplos de los coproductos incluyen, sin limitarse a, material proteinaceo, clorofila, y carotenoides . Las modalidades de la presente invención toman en consideración la extracción y fraccionamiento simultáneo de los productos de algas a partir de la biomasa de algas de manera que permiten la producción tanto de combustibles como productos nutritivos.

En una modalidad de la invención, se proporciona un método para la extracción selectiva de proteínas de algas de agua salada.

En otra modalidad de la invención, un método para extraer selectivamente proteínas de algas de una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas sustancialmente intactas incluye calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una primera mezcla de .extracción caliente compuesta de una primera fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas globulina, y una primera fase sustancialmente sólida; separar al menos una porción de la primera fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas globulina, de la primera fase sustancialmente sólida; mezclar la primera fase sólida con agua y calentar para generar una segunda mezcla de extracción caliente compuesta de una segunda fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas albúmina, y una segunda fase sustancialmente sólida; separar al menos una porción de la segunda fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas albúmina, de la segunda fase sustancialmente sólida; mezclar la segunda fase sustancialmente sólida con agua y calentar para generar una tercera mezcla de extracción caliente compuesta de una tercera fase sustancialmente líquida y una tercera fase sustancialmente sólida; elevar el pH de la tercera mezcla de extracción caliente para enriquecer la tercera fase sustancialmente líquida con proteínas glutamina; separar al menos una porción de la tercera fase sustancialmente líquida, enriquecida con proteínas glutamina, de la tercera fase sustancialmente sólida; calentar la tercera fase sustancialmente sólida y mezclar con un conjunto solvente para generar una cuarta mezcla de extracción caliente compuesta de una cuarta fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas prolamina, y una cuarta fase sustancialmente sólida; y separar al menos una porción de la cuarta fase sustancialmente líquida, enriquecida en proteínas prolamina, de la cuarta fase sustancialmente sólida. En algunos aspectos de la invención, cualquiera de una o más etapas de seperacion se realizan por al menos un método seleccionado del grupo que consiste de centrifugación, filtración, flotación, y sedimentación. En otros aspectos de la invención, al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura por dun tiempo seleccionado antes de la separación. En aún otros aspectos de la invención, al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura caliente durante entre aproximadamente 20 a aproximadamente 60 minutos. En aún otros aspectos de la invención, al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura caliente por entre aproximadamente 45 a aproximadamente 90 minutos. En algunos aspectos de la invención, al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a aproximadamente 50° C. En aún otros aspectos, la cuarta fase sustancialmente sólida está enriquecida en lípidos. En otros aspectos de la invención, el conjunto solvente comprende etanol . En todavía otros aspectos de la invención, el conjunto solvente comprende un alcohol.

En otra modalidad de la invención, un método para extraer selectivamente proteínas globulina de una biomasa de algas o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas de agua salada sustancialmente intactas incluye calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una fase líquida caliente, enriquecida en proteínas globulina, y una fase sustancialmente sólida caliente; y separar al menos una porción de la fase sustancialmente líquida caliente, enriquecida en proteínas globulina, de la fase sustancialmente sólida caliente. En algunos aspectos de la invención, la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada se mantiene a aproximadamente 50° C durante al menos una porción de la etapa de calentar y mezclar .

En otra modalidad de la invención, un método de extraer selectivamente proteínas albúmina de una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas sustancialmente intactas incluye calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una fase sustancialmente líquida caliente, enriquecida en proteínas albúmina, y una fase sustancialmente sólida caliente; separar al menos una porción de la fase sustancialmente líquida caliente, enriquecida en proteínas albúmina de la fase sustancialmente sólida caliente. En algunos aspectos de la invención, la mezcla de biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada y agua se mantiene a aproximadamente 50° C durante al menos una porción de la etapa de calentar y mezclar. En algunas modalidades de la invención, el conjunto solvente comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo .

Breve Descripción de las Figuras La FIG. 1A es un diagrama de flujo de las etapas involucradas en un método de acuerdo con una modalidad ilustrativa de la presente descripción.

La FIG. IB es un diagrama esquemático de una modalidad ilustrativa de un proceso de deshidratación de acuerdo con la presente descripción.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático de una modalidad ilustrativa de un sistema de extracción de acuerdo con la presente descripción.

La FIG. 3 es un gráfico comparativo que muestra la extracción Sohxlet de biomasa de algas liofilizada usando un arreglo de solventes que abarcan el intervalo de polaridad completo mostrando la eficiencia máxima de extracción de aceite de alga no disruptivo y el efecto de polaridad en la extracción de lípidos polar y no polar.

Las FIGS . 4A-4B son representaciones gráficas que muestran la FIG. 4A pureza y la FIG. 4B recuperación de lípidos neutros en el proceso de extracción por solvente de dos etapas usando metanol y éter de petróleo a tres temperaturas diferentes.

Las FIGS. 5A-5B son gráficos que muestran la FIG. 5A pureza y la FIG. 5B recuperación de los lípidos neutros en el proceso de extracción por solvente de dos etapas usando metanol y éter de petróleo a tres temperaturas diferentes .

La FIG. 6 es un gráfico que muestra la recuperación de lípidos en el proceso de extracción por solvente usando metanol acuoso y éter de petróleo a tres temperaturas diferentes .

La FIG. 7 es un gráfico que muestra el efecto de solventes en la relación de biomasa sólida en la recuperación de lípidos.

La FIG. 8 es un gráfico que muestra la eficacia de diferentes soluciones de extracción acuosas en una recuperación por extracción en una sola etapa de metanol acuoso en la biomasa seca.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra el efecto de extracciones de metanol de etapa múltiple en el rendimiento de lípido total acumulativo y la pureza de los lípidos neutros .

La FIG. 10 es un gráfico que muestra la recuperación acumulativa de lípidos usando biomasa húmeda y etanol.

La FIG. 11 es un gráfico que muestra una comparación de los tiempos de extracción de los sistemas de extracción asistida por microondas y extracción convencional La FIG. 12A es un diagrama de flujo de las etapas involucradas en un método de acuerdo con una modalidad ilustrativa de la presente descripción que incorpora una etapa de extracción de proteína. Todas las unidades en la FIG. 12A están en libras.

La FIG. 12B es un diagrama de flujo de las etapas involucradas en un proceso de extracción ilustrativo de acuerdo con la presente descripción.

La FIG. 13 es un diagrama de flujo y diagrama de balance de masas que describe una de las modalidades de la presente invención en donde 1000 libras (453.59kg) de biomasa de algas se procesó a través de la extracción y fraccionamiento para separar los lípidos neutros, lípidos polares, y proteína a partir de la biomasa de algas.

La FIG. 14 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde una masa de algas se puede procesar para formar diversos productos .

La FIG. 15 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde los lípidos neutros de algas se procesan para formar diversos productos .

La FIG. 16 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde los lípidos neutros de alga se procesan para formar productos de combustible .

La FIG. 17 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde las proteínas de algas se extraen selectivamente a partir de una biomasa de algas de agua dulce .

La FIG. 18 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde las proteínas de algas se extraen selectivamente a partir de una biomasa de algas de agua salada.

La FIG. 19 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde una proteína de algas seleccionada se extrae a partir de una biomasa de algas de agua salada o agua dulce .

La FIG. 20 es un diagrama de flujo que describe una de las modalidades de la presente invención en donde una proteína de algas seleccionada se extrae a partir de una biomasa de algas de agua salada o agua dulce .

La FIG. 21 es una fotografía que muestra las células de Scenedesce/nus sp. antes y después de la extracción usando los métodos descritos en la presente descripción. Las células se encuentran sustancialmente intactas tanto antes como después de la extracción.

Descripción Detallada de la Invención DEFINICIONES El término "conducto" o cualquier variación de éste, como se usa en la presente invención, incluyen cualquier estructura a través de la cual un fluido se puede transportar. Los ejemplos no limitantes de conductos incluyen tuberías, tubo, canales, u otras estructuras cerradas.

El término "receptáculo" o cualquier variación de éste, como se usa en la presente invención, incluyen cualquier estructura corporal capaz de retener el fluido. Los ejemplos no limitantes de receptáculos incluyen estanques, tanques, lagos, cubos, u otras estructuras similares.

El término "aproximadamente" o "alrededor" , como se usa en la presente invención, se define tan cercano como sea entendido por aquellos con experiencia en la materia, y en una modalidad no limitante los términos se definen para estar dentro de 10%, de preferencia dentro de 5%, con mayor preferencia dentro de 1%, y con la máxima preferencia dentro de 0.5%.

Los términos "inhibir" o "reducir" o cualquier variación de estos términos, como se usa en la presente invención, incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa para alcanzar un resultado deseado.

El término "eficaz," como se usa en la presente invención significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado, o pretendido.

El uso de la palabra "un" o "uno" cuando se usa junto con el término "que comprende" en la presente descripción puede significar "uno", pero es consistente también con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más que uno . " El término "o" como se usa en la presente invención, significa "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse sólo a las alternativas o las alternativas que se excluyen mutuamente, aunque la descripción apoya una definición que se refiere sólo a las alternativas y "y/o." El uso del término "húmedo" como se usa en la presente invención, se usa para significar que contiene aproximadamente 50% a aproximadamente 99.9% de contenido de agua. El contenido de agua se puede localizar ya sea intracelularmente o extracelularmente .

El uso del término "conjunto de solventes" como se usa en la presente invención, se usa para indicar una composición que comprende uno o más solventes. Estos solventes pueden ser antipáticos (además conocidos como anfifílieos o ligeramente no polares) , hidrófilos, o hidrófobos. En alguna modalidad, estos solventes son miscibles en agua, y en otros, son inmiscibles en agua. Los ejemplos no limitantes de solventes que pueden usarse para practicar los métodos de la presente invención incluyen metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo, alcanos (hexano, pentano, heptano, octano) , ásteres (acetato de etilo, acetato de butilo) , cetonas (metil etil cetona ( EK) , metil isobutil cetona (MIBK) ) , aromáticos (tolueno, benceno, ciciclohexano, tetrahidrofurano) , haloalcanos (cloroformo, tricloroetileno) , éteres (éter dietilico) , y mezclas (diesel, combustible de reactor, gasolina) .

El término "aceite" como se usa en la presente invención incluye composiciones que contienen lípidos neutros y lípidos polares. Los términos "aceite de algas" y "aceite de algas" como se usa en la presente invención se usan indistintamente .

El término "difusato" o "permeado" como se usa en la presente invención se puede referir al material que ha pasado a través de un dispositivo de separación, que incluye, pero sin limitarse a un filtro o membrana.

El término "retenido" como se usa en la presente invención se puede referir al material que permanece después de que el difusato ha pasado a través de un dispositivo de separación.

Como se usa en la presente invención, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como, "comprender" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluyen" (y cualquier forma de que incluyen, tal como "incluyen" e "incluye"), o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contienen") son finales inclusivos o abiertos y no excluyen elementos no mencionados o etapas del método adicionales.

El término "lípidos polares" o cualquier variación de éste, como se usa en la presente invención, incluye, pero sin limitarse a, fosfolípidos y glicolípidos .

El término "lípidos neutros" o cualquier variación de éste, como se usa en la presente invención, incluye, pero sin limitarse a, triglicéridos , diglicéridos , monoglicéridos , carotenoides, ceras, esteróles.

El término "fase sólida" como se usa en la presente invención se refiere a una recolección de material que generalmente es más sólida que no, y no pretende significar que todo el material en la fase es sólido. Así, una fase que tiene una cantidad sustancial de sólidos, aunque retiene algunos líquidos, se incluye dentro del significado de éste término. Entretanto, el término "fase líquida", como se usa en la presente invención, se refiere a una recolección de material que generalmente es más líquida que no, y la recolección puede incluir materiales sólidos.

El término "biodiesel" como se usa en la presente invención se refiere a ésteres de metil o etil de ácidos grasos derivados de algas El término "nutracéutico" como se usa en la presente invención se refiere a un producto alimenticio que proporciona beneficios médicos y/o a la salud. Los ejemplos no limitantes incluyen carotenoides , carotenos, xantofilos tal como zeaxantina, astaxantina, y luteína.

El término "biocombustible" como se usa en la presente invención se refiere al combustible derivado de fuente biológica. Los ejemplos no limitantes incluyen biodiesel, combustible de reactor, diesel, materia prima de mezcla de combustible de reactor y materia prima de mezcla de diesel .

El término "impurezas", cuando se usa en relación con los lípidos polares, como se usa en la presente invención, se refiere a todos los componentes distintos de los productos de interés que se coextraen o tienen las mismas propiedades como el producto de interés.

El término "lubricantes", cuando se usa en relación con lípidos polares, como se usa en la presente invención se refiere a lípidos de algas tales como C16-C20 alcanos.

El término "detergentes", cuando se usa en relación con lípidos polares, como se usa en la presente invención se refiere a glicolípidos , fosfolípidos y derivados de éstos.

El término "aditivos de alimento" , cuando se usa en relación con lípidos polares, como se usa en la presente invención se refiere a sustitutos de lecitina de soja o fosfolípidos derivados de algas.

El término "materia sin glicerina" como se usa en la presente invención se refiere a cualquier impureza que se separa de la fracción de glicerina. Una etapa adicional de limpieza eliminará la mayoría que está presente para producir la glicerina de grado farmacéutico.

El término "ácidos grasos insaturados" como se usa en la presente invención se refiere a los ácidos grasos con al menos un doble enlace carbono. Los ejemplos no limitantes de ácidos grasos insaturados incluyen acido palmitoleico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido oléico, ácido octadecenoico, ácido linoleico, ácido gamma- linoleico, ácido alfa linoleico, ácido araquídico, ácido eicosenoico, ácido homogamma linoleico, ácido araquidónico, ácido eicosapenenoico, behénico, ácido docosadienoico, heneicosapentaenoico, ácido docosatetraenoico . Los ácidos grasos que tienen 20 o más átomos de carbono en la cadena principal se refieren generalmente como "ácidos grasos de cadena larga" . Los ácidos grasos que tienen 19 o menos átomos de carbono en la cadena principal se refieren generalmente como "ácidos grasos de cadena corta" .

Los ácidos grasos de cadena larga insaturados incluyen, pero sin limitarse a, ácidos grasos omega-3, ácidos grasos omega-6, y ácidos grasos omega-9. El término "ácidos grasos omega-3" como se usa en la presente invención se refiere a, pero sin limitarse a los ácidos grasos enumerados en la Tabla 1.

Tabla 1 El término "materia prima de mezcla de combustible de reactor" como se usa en la presente invención se refiere a alcanos con cadena de carbono de longitudes adecuadas para el uso como combustible de reactor.

El término "materia prima de mezcla de diesel" como se usa en la presente invención se refiere a alcanos con cadena de carbono con longitudes adecuadas para el uso como diesel .

El término "alimento animal" como se usa en la presente invención se refiere a sustancias derivadas de algas que pueden consumirse y usarse para proporcionar soporte nutricional a un animal.

El término "alimento humano" como se usa en la presente invención se refiere a sustancias derivadas de algas que pueden consumirse para proporcionar soporte nutricional a las personas . Los productos para alimento humano derivados de algas pueden contener nutrientes esenciales, tales como carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas, o minerales.

El término "biorremediación" como se usa en la presente invención se refiere al uso del crecimiento de algas para eliminar impurezas, tales como, pero sin limitarse a, nitratos, fosfatos, y metales pesados, a partir de aguas residuales de la industria o aguas residuales municipales.

El término "aguas residuales" como se usa en la presente invención se refiere a aguas residuales de la industria o aguas residuales municipales que contienen una diversidad de contaminantes o impurezas, que incluyen, pero sin limitarse a nitratos, fosfatos, y metales pesados.

El término "enriquecido" , como se usa en la presente invención, significa un contenido de aproximadamente 50% o mayor.

El término "sustancialmente" , . como se usa en la presente invención, significa mayormente.

El término "proteínas de globulina" como se usa en la presente invención se refiere a las proteínas solubles en sal .

El término "proteínas de albúmina" como se usa en la presente invención se refiere a las proteínas solubles en agua .

El término "proteínas de glutelina" como se usa en la presente invención se refiere a las proteínas solubles en álcali .

El término "proteínas de prolamina" como se usa en la presente invención se refiere a las proteínas solubles en alcohol. Los ejemplos no limitantes de proteínas de prolamina son gliadina, zeína, hordeina, avenina.

El término "cultivo de algas" como se usa en la presente invención se refiere a células de algas en medio de cultivo .

El término "biomasa de algas" como se usa en la presente invención se refiere a un cultivo de algas al menos parcialmente deshidratado.

El término "deshidratado" como se usa en la presente invención se refiere a la eliminación de al menos algo de agua .

El término "pasta de algas" como se usa en la presente invención se refiere a un cultivo de algas parcialmente deshidratado que tiene propiedades de fluido que le permiten fluir. Generalmente una pasta de algas tiene un contenido de agua de aproximadamente 90%.

El término "torta de algas" como se usa en la presente invención se refiere a un cultivo de algas parcialmente deshidratado que carece de propiedades fluidas de una pasta de algas y tiende a aglutinarse. Generalmente una torta de algas tiene un contenido de agua de aproximadamente 60% o menos.

Las células de algas de agua salada incluyen, pero sin limitarse a, especies de algas marinas y de agua salobre. Las células de algas de agua salada se encuentran en la naturaleza en masas de agua tales como, pero sin limitarse a, mares, océanos, y estuarios. Los ejemplos no limitantes de especies de algas de agua salada incluyen Nannochloropsis sp. , Dunaliella sp.

Las células de algas de agua dulce se encuentran en la naturaleza en masas de agua tales como, pero sin limitarse a, lagos y estanques. Los ejemplos no limitantes de especies de algas de agua dulce incluyen Scendescemus sp. , Haemotococcus sp.

Los ejemplos no limitantes de microalgas que pueden usarse con los métodos de la invención son miembros de una de las siguientes divisiones: Chlorophyta, Cyanophyta (Cyanobacteria) , y Heterokontophyta . En ciertas modalidades, las microalgas usadas con los métodos de la invención son miembros de una de las siguientes clases: Bacillariophyceae, Eustig atophyceae, y Chrysophyceae . En ciertas modalidades, las microalgas usadas con los métodos de la invención son miembros de uno de los siguientes géneros: Nannochloropsis, Chlorella, Dunaliella, Scenedesmus, Selenastru , Oscillatoria, Phormidium, Spirulina, Amphora, y Ochromonas.

Los ejemplos no limitativos de las especies de microalgas que pueden usarse con los métodos de la presente invención incluyen: Achnanthes orientalis, Agmenellum spp. , Aphiprora hyaline, Amphora coffeiformis, Amphora coffeiformis var. linea, Amphora coffeiformis var. punctata, Amphora coffeiformis var. taylori, Amphora coffeiformis var. tenuis, Amphora delicatissi a, Amphora delicatissima var. capitata, Amphora sp., Anabaena, Ankistrodes us, Ankistrodesmus falcatus, Boekelovia hooglandii, Borodinella sp., Botryococcus hraunii, Botryococcus sudeticus, Bracteococcus minor, Bracteococcus medionucleatus, Cartería, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros muelleri, Chaetoceros muelleri var. subsalsum, Chaetoceros sp. , Chlamydomas perigranulata, Chlorella anitrata, Chlorella antárctica, Chlorella aureoviridis, Chlorella Candida, Chlorella capsúlate, Chlorella desiccate, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii , Chlorella fusca, Chlorella fusca var. vacuolata, Chlorella glucotropha, Chlorella infusionum, Chlorella infusionum var. actophila, Chlorella infusionum var. auxenophila, Chlorella kessleri , Chlorella lobophora, Chlorella luteoviridis, Chlorella luteoviridis var. aureoviridis, Chlorella luteoviridis var. lutescens, Chlorella miniata, Chlorella minutlssima, Chlorella mutabilis, Chlorella nocturna, Chlorella ovalis, Chlorella parva, Chlorella photophila, Chlorella pringsheimii, Chlorella protothecoides, Chlorella protothecoides var. acidicola, Chlorella regularis, Chlorella regularis var. mínima, Chlorella regularis var. umbricata, Chlorella reisiglii , Chlorella saccharophila, Chlorella saccharophila var. ellipsoidea, Chlorella salina, Chlorella simplex, Chlorella sorokiniana, Chlorella sp. , Chlorella sphaerica, Chlorella stig atophora, Chlorella vanniellii, Chlorella vulgaris, Chlorella vulgaris fo. tertia, Chlorella vulgaris var. autotrophica, Chlorella vulgaris var. viridis, Chlorella vulgaris var. vulgaris, Chlorella vulgaris var. vulgaris fo. tertia, Chlorella vulgaris var. vulgaris fo. viridis, Chlorella xanthella, Chlorella zofingiensis, Chlorella trebouxioides, Chlorella vulgaris, Chlorococcum infusionum, Chlorococcum sp. , Chlorogonium, Chroo onas sp. , Chrysosphaera sp., Cricosphaera sp. , Crypthecodiniu cohnii, Cryptomonas sp. , Cyclla cryptica, Cyclotella meneghiniana, Cyclotella sp., Dunaliella sp., Dunaliella bardawil, Dunaliella bioculata, Dunaliella granúlate, Dunaliella maritime, Dunaliella minuta, Dunaliella parva, Dunaliella peircei, Dunaliella primolecta, Dunaliella salina, Dunaliella terrícola, Dunaliella tertiolecta, Dunaliella viridis, Dunaliella tertiolecta, Eremosphaera viridis, Eremosphaera sp. , Ellipsoidon sp., Euglena spp. , Franceia sp. , Fragilaria crotonensis, Fragilaria sp., Gleocapsa sp., Gloeothamnion sp. , aematococcus pluvialis, Hymeno onas sp. , lsochrysis aff. galbana, lsochrysis galbana, Lepocinclis, Micractinium, Micractiniu , Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis salina, Nannochloropsis sp. , Navícula acceptata, Navícula biskantera , Navícula pseudotenelloides, Navícula pelliculosa, Navícula saprophila, Navícula sp., Nephrochloris sp. , Nephroselmis sp., Nitschia communis, Nitzschia alexandrina, Nitzschia closterium, Nitzschia communis, Nitzschia dissipata, Nitzschia frustulum, Nitzschia hantzschiana, Nitzschia inconspicua, Nitzschia intermedia, Nitzschia microcephala, Nitzschia pusilla, Nitzschia pusilla elliptica, Nitzschia pusilla monoensis, Nitzschia quadrangular, Nitzschia sp. , Ochro onas sp. , Oocystis parva, Oocystis pusilla, Oocystis sp. , Oscillatoria limnetica, Oscillatoria sp., Oscillatoria subbrevis, Parachlorella kessleri, Pascheria acidophila, Pavlova sp. , Phaeodactylu tricomutu , Phagus, Phormidium, Platymonas sp., Pleurochrysis carterae, Pleurochrysis dentate, Pleurochrysis sp. , Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis, Prototheca oriformis, Prototheca zopfii, Pseudochlorella aquatica, Pyramimonas sp., Pyrobotrys, Rhodococcus opacus, Sarcinoid chrysophyte, Scenedesmus ar atus, Schizochytrium, Spirogyra, Spirulina platensis, Stichococcus sp. , Synechococcus sp. , Synechocystisf, Tagetes erecta, Tagetes patula, Tetraedron, Tetraselmis sp., Tetraselmis suecica, Thalassiosira weissflogii , y Viridiella fridericiana.

En otras modalidades, la biomasa puede ser material de planta, incluyendo pero sin limitarse a soja, maíz, palma, camelina, jatrofa, cañóla, coco, cacahuate, cártamo, semilla de algodón, linaza, girasol, salvado de arroz, y olivo.

Se describen sistemas y métodos para la extracción de lípidos y coproductos (por ejemplo, proteínas) de diversas polaridades a partir de un material húmedo oleaginoso, que incluye, por ejemplo, una biomasa de algas. En particular, los métodos y sistemas descritos en la presente invención descripción conciernen a la capacidad de extraer y fraccionar los componentes de algas haciendo extracciones secuenciales con una mezcla de solvente hidrófilo/agua que se torna progresivamente menos polar (es decir, el agua en la relación solvente/agua se reduce progresivamente a medida que se procede de una etapa de extracción a la siguiente) . En otras palabras, el solvente intersticial en las algas (75% de su peso) es inicialmente agua y se reemplaza gradualmente por el solvente ligeramente no polar hacia el azeotropo del solvente orgánico. Esto resulta en la extracción de componentes solubles a la polaridad desarrollada en cada etapa, conduciendo de este modo al fraccionamiento simultáneo de los componentes extraídos. También se describe la extracción de subproductos proteinaceos por lixiviación ácida y/o extracción alcalina.

En algunas modalidades de la invención, un sólo solvente y agua se usan para extraer y fraccionar los componentes presentes en un material oleaginoso. En otras modalidades, un conjunto de solventes y agua se usan para extraer y fraccionar los componentes presentes en un material oleaginoso. En algunas modalidades el material oleaginoso es húmedo. En otras modalidades, el material oleaginoso es alga.

La recuperación del lípido polar depende principalmente de su carga iónica, solubilidad del agua, y localización (intracelular, extracelular o unida a la membrana) . Los ejemplos de lípidos polares incluyen, pero sin limitarse a, fosfolípidos y glicolípidos . Las estrategias que se pueden usar para separar y purificar los lípidos polares se pueden dividir a grandes rasgos en modos discontinuos o continuos. Los ejemplos de modos discontinuos incluyen precipitación (pH, solvente orgánico) , extracción por solvente y cristalización. Los ejemplos de modos continuos incluyen centrifugación, adsorción, separación de espuma y precipitación, y tecnologías de membrana (filtración por flujo tangencial, diafiltración y precipitación, ultra filtración) .

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se tornarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos, si bien indican modalidades específicas de la invención, se dan solamente en forma de ilustración. Además, se contempla dentro del espíritu y alcance de la invención que serán evidentes los cambios y modificaciones a partir de esta descripción detallada para aquellos con experiencia en la técnica.

Sorprendentemente, el proceso propuesto de extracción no disruptivo resulta en la recuperación de más del 90%. La pequeña cantidad de lípidos polares en la biomasa remanente mejora su valor cuando la biomasa remanente se usa para la alimentación. Esto se debe, al menos en parte, al alto contenido de ácido graso de cadena larga insaturada de la biomasa. Adicionalmente, los extractos de etanol se pueden además transesterificar directamente. Además, a diferencia de los métodos convencionales existentes, los métodos y sistemas descritos en la presente descripción son genéricos para cualquiera de las algas, y permiten la recuperación de una porción significativa de los componentes valiosos en las algas, que incluyen lípidos polares, mediante el uso de un gradiente de solvente orgánico miscible en agua.

La fracción lipídica neutra obtenida por el uso de la presente invención posee un bajo contenido de metal, mejorando de ese modo la estabilidad de la fracción lipídica, y reduciendo las etapas posteriores de procesamiento. Los metales tienden a hacer inestables a los lípidos neutros debido a su capacidad para catalizar la oxidación. Además, los metales inhiben los catalizadores de hidrotratamiento, que se necesitan eliminar antes que se pueda refinar una mezcla de lípido neutro. Los sistemas y métodos descritos en la presente descripción toman en consideración la extracción de metales en las fracciones de proteína y/o lípido polar. Esto es ventajoso debido a que las proteínas y lípidos polares no están muy afectados por la exposición al metal, y en algunos casos se estabilizan en realidad por los metales.

Los sistemas y métodos descritos en la presente descripción pueden comenzar con biomasa húmeda, lo que reduce los costos de secado y deshidratación. Comparados con los procesos convencionales de extracción, los procesos de extracción y fraccionamiento descritos pueden tener costos de operación relativamente bajos debido a la temperatura moderada y condiciones de presión, junto con el reciclaje del solvente. Además, los procesos convencionales de extracción son de costos prohibidos y no pueden satisfacer la demanda del mercado.

Otro aspecto de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción es la capacidad para lograr el refinamiento preliminar, lo cual es la separación de lípidos polares a partir de lípidos neutros durante el proceso de extracción. Las diferencias entre el aceite de algas usado en las modalidades ilustrativas y los aceites vegetales usados en las modalidades anteriores incluyen el por ciento de las clases individuales de lípidos. Una composición ilustrativa de aceite crudo de algas se compara con aceite vegetal según se muestra en la Tabla 2 más abajo: Tabla 2 El desgomado (físico y/o químico) del aceite vegetal se hace para eliminar los lípidos polares (por ejemplo, glicolípidos y fosfolípidos) . El aceite vegetal que se desgomó químicamente retiene una cantidad significativa de lípido neutro. Esta fracción de lípido neutro se elimina además a partir del material desgomado usando extracción por solvente o extracción de fluido supercrítico/subcrítico o tecnología de membrana. A diferencia, la separación de los lípidos neutros a partir de una biomasa oleaginosa de algas es mucho más difícil que a partir de una materia prima de aceite vegetal debido a la presencia de grandes cantidades de lípidos polares que se encuentran típicamente en el aceite de algas (ver Tabla 2) . Esto se debe a que el mayor porcino de lípidos polares presentes en el aceite de algas mejora la emulsificación de los lípidos neutros. La emulsificación se estabiliza además por el nutriente y componentes salinos dejados en la solución. La presencia de lípidos polares, junto con metales, resultan en dificultades para el procesamiento por separación y utilización de los lípidos neutros. Sin embargo, debido a que los lípidos polares tienen un mercado existente, su recuperación puede añadir valor significativo al uso del aceite de algas para generar combustibles .

Los lípidos polares son agentes tensioactivos por naturaleza debido a su estructura molecular y a que tienen un vasto mercado existente. Muchas de las tecnologías existentes para producir lípidos polares son de materia prima o costo prohibitivo. Las materias primas alternativas para glicolipidos y fosfolípidos son principalmente de aceite de algas, aceite de avena, aceite de germen de trigo y aceite vegetal. El aceite de algas típicamente contiene aproximadamente 30-85 % (p/p) de lípidos polares en dependencia de las especies, estado fisiológico de la célula, condiciones de cultivo, tiempo de cosecha, y el solvente utilizado para la extracción. Además, la cadena principal de glicerol de cada lípido polar tiene dos grupos de ácidos grasos unidos en vez de tres en el triacilglicerol del lípido neutro. La transesterificación de lípidos polares puede rendir sólo dos tercios del producto final, es decir, ácido grasos esterificados, cuando se compara con la de lípidos neutrales, en función de la masa. Por lo tanto, la eliminación y recuperación de los lípidos polares no sólo puede ser muy beneficiosa en la producción de biocombustibles de alta calidad o triglicéridos a partir de algas, sino además puede generar co-productos de glicolipidos y fosfolípidos con valor-añadido, que a su vez puede acodar el costo asociado con la producción de biocombustible basado en algas. La capacidad para recuperar y fraccionar fácilmente los diversos aceites y co-productos producidos por las algas es ventajosa para el éxito económico del proceso de aceite de algas .

Un aspecto adicional de los métodos y sistemas descritos en la presente invención es la capacidad para extraer las proteínas a partir de un material oleaginoso, tal como biomasa de algas. Los métodos de extracción de material proteinaceo a partir de biomasa de algas descritos en la presente invención comprenden un proceso de extracción y fraccionamiento flexible y muy modificable. Por ejemplo, en algunas modalidades, la extracción y fraccionamiento se presenta en una sola etapa, proporcionando de ese modo un proceso muy eficaz. Las proteínas obtenidas a partir de la biomasa son útiles para alimentos animales, ingredientes de alimentación y productos industriales. Por ejemplo, las proteínas son útiles en aplicaciones tales como fibras, adhesivos, recubrimientos, cerámicas tintas, cosméticos textiles, goma de mascar, y plásticos biodegradables .

Otro aspecto de los métodos y sistemas descritos en la presente invención involucra variar la relación de biomasa de algas por solvente en función de los componentes que se extraen. En una modalidad, una biomasa de algas se mezcla con un peso igual de solvente. En otra modalidad, una biomasa de algas se mezcla con un peso menor de solvente. En aún otra modalidad, una biomasa de algas se mezcla con un peso mayor de solvente. En algunas modalidades, la cantidad de solvente mezclado con una biomasa de algas se calcula en función del solvente que se usa y la polaridad deseada de la mezcla de biomasa de algas/solvente . En aún otras modalidades, la masa de algas se extrae en diversas etapas. En una modalidad ilustrativa, una biomasa de algas es extraída secuencialmente, primero con aproximadamente 50-60% de su peso con un solvente ligeramente no polar, miscible en agua. Segundo, los sólidos de algas remanentes se extraen usando aproximadamente 70% del peso de los sólidos en solvente. Una tercera extracción se realiza después usando aproximadamente 90% del peso de los sólidos en solvente. Habiéndose informado de estos aspectos de la invención, una persona con experiencia en la técnica será capaz de usar diferentes solventes de diferentes polaridades ajustando las relaciones de la biomasa de algas y/o residuos sólidos a la polaridad deseada para extraer selectivamente los productos de algas.

Por ejemplo, en la modalidad preferida, el solvente usado es etanol . Los componentes pueden aislarse selectivamente variando la relación de solvente. Las proteínas pueden extraerse a partir de una biomasa de alga con aproximadamente 50% de etanol, lípidos polares con aproximadamente 80% de etanol, y lípidos neutros con aproximadamente 95% o más de etanol. Si se usa metanol, la concentración del solvente para extraer las proteínas a partir de una biomasa de alga sería aproximadamente 70%. Los lípidos polares requerirían aproximadamente 90% metanol, y los lípidos neutros requerirían aproximadamente 100% de metanol .

Las modalidades de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción presentan resultados sorprendentes e inesperados. En primer lugar, el proceso de recuperación/extracción se puede hacer sobre una biomasa húmeda. Es una ventaja económica importante como modalidades ilustrativas evitan el uso de grandes cantidades de energía requerida para secar y romper las células. La extracción de lípidos neutros a partir de una biomasa seca, de algas es mucho más eficaz usando los sistemas y métodos de la presente invención. Los rendimientos obtenidos a partir de los procesos descritos son significativamente mayores y más puros que aquellos obtenidos por extracciones convencionales. Esto es debido a que la extracción convencional frecuentemente resulta en emulsiones, que rinden separaciones de los componentes extremadamente difíciles.

Las modalidades ilustrativas se pueden aplicar a cualquier material oleaginoso de algas o no algas . Las modalidades ilustrativas pueden usar cualquier solvente ligeramente no polar miscible en agua, que incluyen, pero sin limitarse a, metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo . Las modalidades específicas pueden usar un solvente verde renovable, tal como etanol. Los solventes de alcohol probados resultaron en mayor rendimiento y pureza de lípidos neutros aislados. El etanol es relativamente económico de comprar, en comparación con otros solventes descritos en la presente invención. En algunas modalidades ilustrativas, la extracción y fraccionamiento se pueden realizar en una sola etapa seguida por la purificación por membrana si es necesario. La biomasa resultante es casi desprovista de agua y puede secarse completamente con menor energía que una suspensión acuosa de algas.

En algunas modalidades ilustrativas, el solvente usado para extraer es etanol. Otras modalidades incluyen, pero sin limitarse a, ciciclohexano, éter de petróleo, pentano, hexano, heptano, éter dietílico, tolueno, acetato de etilo, cloroformo, diclorometano, acetona, acetonitrilo, isopropanol, y metanol . En algunas modalidades, se usa el mismo solvente en etapas de extracción secuenciales . En otras modalidades, diferentes solventes se usan en cada etapa de extracción. En aún otras modalidades, dos o más solventes se mezclan y usan en una o más etapas de extracción.

En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente invención, una mezcla de dos o más solventes usada en cualquiera de las etapas de extracción incluyen al menos un solvente hidrófilo y al menos un solvente hidrófobo.

Cuando se usa la mezcla, el solvente hidrófilo extrae el material a partir de la biomasa por medio de difusión. Entretanto, una cantidad relativamente pequeña de solvente hidrófobo se usa en combinación, y se involucra en una separación líquido- líquido tal que el material de interés se concentra en la pequeña cantidad de solvente hidrófobo. Los dos solventes diferentes después forman un sistema bicapa, que se puede separar usando técnicas conocidas en la técnica. En la implementación, el solvente hidrófobo puede ser uno cualquiera o más de un alcano, un éster, una cetona, un aromático, un haloalcano, un éter, o una mezcla comercial (por ejemplo, diesel, combustible de reactor, gasolina) .

En algunas modalidades, los procesos de extracción descritos en la presente invención incorporan viraje de pH en una o más etapas. El viraje de pH es útil para aislar el material proteinaceo. En algunas modalidades, el pH del proceso de extracción es ácido (por ejemplo, menor que aproximadamente 5) . En algunas modalidades, el pH del proceso de extracción es alcalino (por ejemplo, mayor que aproximadamente 10) .

El uso de hexano en los procedimientos convencionales de extracción contamina la biomasa de algas, tal que los co-productos no se pueden usar en los productos alimenticios. Las modalidades de la presente invención son superiores a las conocidas en la técnica, ya que requieren el uso de mucho menos energía y rinden productos adecuados para el uso como combustibles, así como productos alimenticios y suplementos nutritivos .

Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación se puede implementar en relación con cualquier método o sistema de la invención y viceversa. Además, los sistemas de la invención se pueden usar para lograr los métodos de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS Para la extracción por solvente del aceite a partir de algas lo mejor es un solvente que extrae selectivamente los triacilgliceroles (TAG) y deja con altas recuperaciones en la célula de alga a todos los lípidos polares y lípidos neutros no-TAG tales como ceras, esteróles. La segunda opción sería extraer selectivamente lípidos polares y después extraer los lípidos neutros puros carentes de lípidos polares, lo que resulta en una alta recuperación. La última opción sería extraer todos los lípidos y lograr una recuperación muy alta en una o dos etapa.

Refiriéndose ahora a la FIG. 1A, una diagrama de flujo 100 proporciona una visión general de las etapas involucradas en las modalidades ilustrativas de los métodos usados en el fraccionamiento y purificación de lípidos a partir de una biomasa que contiene algas . En una primera etapa lio, las células de algas se cosechan. En una etapa posterior 120, el agua se elimina a partir de las células de algas para producir un 10-25% de biomasa sólida. En la etapa 130, una extracción basada en solvente se realiza en la biomasa y se recolectan las fracciones . En algunas modalidades, la etapa 130 incorporará también la extracción basada en pH y la recolección de fracción. Finalmente, se puede realizar una separación de la fase sólida/líquida, que incluyen, pero sin limitarse a las técnicas tales como filtración, decantación, y centrifugación, en una etapa 140 para separar los componentes lipidíeos pequeños .

La biomasa de algas cuando se cosecha en la etapa 110 consta típicamente de aproximadamente de 1-5 g/1 de sólidos totales. La biomasa se puede deshidratar parcialmente en la etapa 120 usando técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, elutriación disuelta, filtración por membrana, floculación, sedimentación, filtro de presión, decantación o centrifugación. La deshidratación es la eliminación de algunos, la mayoría o la totalidad del agua de una sustancia sólida o semisólida. Las modalidades de la presente invención utilizan las técnicas de deshidratación para eliminar el agua a partir de una biomasa de alga cosechada. La deshidratación se puede llevar a cabo usando cualquiera o una combinación de cualquiera de los métodos descritos en la presente invención descripción, así como por cualquiera de otros métodos conocidos por aquellos con experiencia en la materia.

[0004] La deshidratación de la biomasa de algas que resulta de la etapa 120 típicamente consta de aproximadamente 10-30% de sólidos. Esta biomasa se puede extraer después por solventes no polares miscibles en agua ligeramente (por ejemplo, alcoholes) , en un proceso de extracción por solvente a contracorriente de múltiples etapas que segrega las fracciones en cada etapa. Este tipo de proceso puede reducir tanto los gastos de capital como de operación. En algunas modalidades, la biomasa se somete también a la extracción ácida y/o alcalina para fraccionar el material de proteína.

En algunas modalidades, la deshidratación de una biomasa de algas se puede llevar a cabo tratando la biomasa de algas cosechada con un solvente tal como etanol . La biomasa de algas se deja reposar después de solución y los líquidos se pueden eliminar después puede por métodos tales como, pero sin limitarse a, extracción por sifón. Este novedoso método de deshidratación tiene costos capitales y de operación inferiores a los métodos conocidos, permite el reciclaje del solvente, reduce el costo de secado de la biomasa, y tiene el beneficio añadido de disminuir la polaridad de la biomasa de algas antes de iniciar la extracción y/o separación de los componentes de algas. De hecho, se ha teorizado que los procesos de sedimentación basados en solvente descritos en la presente son eficaces, en parte, debido al hecho de que los solventes orgánicos reducen o neutralizan la carga negativa en la superficie de las algas. En algunas modalidades de la invención, los métodos de deshidratación se combinan para eliminar aún más el agua. En algunas modalidades, la adición del solvente durante el proceso de deshidratación inicia el proceso de extracción.

La FIG. IB muestra una implementación ilustrativa de un proceso de deshidratación 300. Un cultivo de algas 310 que tiene un peso seco final de aproximadamente 1 g/1 a aproximadamente 10 g/1 (es decir, 0.1-1% p/p) se somete a un proceso de separación por agua 320. El proceso 320 puede incluir centrifugación, decantación, sedimentación, o filtración. En una modalidad, un filtro de tubo de metal sinterizado se usa para separar la biomasa de algas del agua del cultivo. Cuando se usa un filtro, el agua recuperada 330 se recicla dirigida a otros cultivos de algas. Entretanto, la biomasa de algas recuperada se concentró a una "pasta de algas" con una densidad de algas tan alta como aproximadamente 200 g/1 (es decir, 10-20% p/p) . Esta pasta de algas concentrada se trata después con un solvente 340 en un proceso de sedimentación basado en solvente 350.

El proceso de sedimentación 350 involucra añadir el solvente 340 a la pasta de algas para alcanzar una mezcla que tiene una relación solvente por biomasa peso/peso de entre aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10. Las algas se dejan reposar en un recipiente de sedimentación, y una mezcla de solvente/agua 360 se elimina mediante, por ejemplo, extracción por sifón y/o decantación. El solvente se puede recuperar y reutilizar por técnicas bien conocidas, tales como destilación y/o pervaporación. La biomasa húmeda remanente 370 se espera que tenga un contenido de sólidos de aproximadamente 30% a aproximadamente 60% p/p en una solución de alcohol y agua.

Los solventes ideales para deshidratar son solventes solubles en agua industrialmente comunes con densidades de más de 1.1 g/ml o más abajo de 0.9 g/ml . Los ejemplos incluyen isopropanol, acetona, acetonitrilo, t-butil alcohol, etanol, metanol, 1-propanol, agua pesada (D20) , etilenglicol, y/o glicerina. Si la densidad del solvente es más de 1.1 g/ml después, la biomasa de algas flotaría en lugar de crear un sedimento en el fondo del recipiente de sedimentación.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático de una modalidad ilustrativa de un sistema de extracción 200. La biomasa de algas húmeda o seca se transporta usando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a un cinturón en movimiento, una cinta transportadora de rosca, o a través de cámaras de extracción. El solvente para la extracción se recircula a partir de un tanque de almacenamiento asignado a cada posición de ranura de biomasa. La mezcla de extracción se filtra, retornando los sólidos de biomasa de vuelta en la ranura y el extracto en el depósito de almacenamiento. Los sólidos en el cinturón se mueven periódicamente en función de la necesidad de tiempo de permanencia para la extracción. Los extractos en cada tanque de almacenamiento se pueden ya sea recargar hasta la saturación o reemplazar continuamente por solvente fresco. Esto reduciría también el tiempo de procesamiento corriente abajo y drásticamente el costo. Esta modalidad comprende un receptáculo primario 210, un mecanismo de transporte 220, una pluralidad de dispositivos de separación 241-248 (por ejemplo, dispositivos de filtración por membrana) , una pluralidad de receptáculos de extracción 261-268, y una de bombas de reciclaje 281-287. En esta modalidad, el receptáculo primario 210 se divide en una pluralidad de receptáculos de entrada 211-218.

Durante la operación, la biomasa de algas 201 se coloca en un primer receptáculo de entrada 211 próximo de un primer extremo 221 del mecanismo de transporte 220. Adicionalmente , el solvente 205 se coloca en un receptáculo de entrada 218 próximo a segundo extremo 222 del mecanismo de transporte 220. El mecanismo de transporte 220 dirige la biomasa de algas a lo largo del mecanismo de transporte 220 a partir del primer extremo 221 hacia el segundo extremo 222. Como la biomasa de alga se transporta, pasa a través de la pluralidad de dispositivos de separación 241-248 y se separa en fracciones de diversas polaridades. Las porciones del difusato que pasan a través de los dispositivos de separación 241-248 se dirigen a los receptáculos 261-268.

Por ejemplo, la porción del de la biomasa de algas que pasa a través del primer dispositivo de separación 241 (por ejemplo, la porción que contiene suficiente líquido y pequeñas partículas para pasar a través del dispositivo de separación 241) se dirige al primer receptáculo 261. A partir del primer receptáculo 261, la porción del se puede reciclar de vuelta al primer receptáculo de entrada 201. La porción retenida de la biomasa de algas que no pasa a través del primer dispositivo de separación 241 se puede dirigir después por el mecanismo de transporte 220 al segundo receptáculo de entrada 212 y segundo dispositivo de separación 242, que puede comprender uno medio de separación o filtración más fino que el dispositivo de separación 241.

El segmento de la porción del difusato que pasa a través segundo dispositivo de separación 242 se puede dirigir al segundo receptáculo 262, y reciclar después de vuelta al segundo receptáculo de entrada 212 mediante la bomba de reciclaje 282. La porción retenida o extraída de la biomasa de algas que no pasa a través del segundo dispositivo de separación 242 se puede dirigir por el mecanismo de transporte 220 al tercer receptáculo de entrada 213. Este proceso se puede repetir para los receptáculos de entrada 213-218 y dispositivos de separación 243-248 tal que las porciones retenidas en cada etapa se dirigen a los receptáculos de entrada posteriores, mientras que las porciones del difusato se dirigen a los receptáculos de reciclaje y reciclan de vuelta al receptáculo de entrada corriente .

En modalidades ilustrativas, la primera fracción se extraerá con la más alta relación agua a solvente ligeramente no polar, es decir, mezcla más polar, mientras que la última fracción se extraerá con el solvente ligeramente no polar más puro, es decir la mezcla menos polar. El proceso por lo tanto extrae los componentes en el orden de polaridad decreciente con la fracción. La función de la primera fracción es eliminar el agua residual y facilitar el proceso de extracción por solvente. Las fracciones que siguen son ricas en lípidos polares, mientras que las fracciones finales son ricas en lípidos neutros.

La fracción de aceite se puede esterificar para liberar a los ácidos grasos de cadena larga insaturada. Los carotenoides y ácidos grasos insaturados de cadena larga insaturada se pueden separar del aceite usando procesos tales como destilación molecular en conjunto con la destilación no-molecular. Todos los ácidos grasos se pueden separar de los carotenoides mediante la destilación molecular. Los destilados se pueden fraccionar mediante una columna sencilla de destilación para separar por refinación los ácidos grasos de cadena inferiores. El ácido graso de cadena larga insaturada permanece como residuo en la columna de alta ebullición.

En algunas modalidades no limitantes, el sistema y métodos de extracción descritos en la presente incorporan una o más etapas para aislar el material de proteína a partir del material oleaginoso (por ejemplo, biomasa de algas) . Las etapas de extracción de proteína emplean ajuste (s) de pH para lograr el aislamiento y extracción de la proteína. Por ejemplo, en una modalidad no limitante, el pH del solvente en el primer dispositivo de separación para la extracción de proteína, lo que resulta en una primera fracción que es rica en material de proteína. El pH de la etapa de extracción de la proteína se ajusta dependiendo de la pKa de las proteínas de interés . La pKa de una proteína de interés se puede determinar usando métodos conocidos para un experto en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse al uso de la ecuación de Poisson-Boltzmann, métodos empíricos, métodos basados en la dinámica molecular, o el uso de curvas de titulación.

En algunas modalidades, el pH del solvente es alcalino. Por ejemplo, en algunas modalidades, el pH del solvente es mayor que aproximadamente 10. En otras modalidades, el pH del solvente se encuentra en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 12. En modalidades adicionales, el pH del solvente es de aproximadamente 10, aproximadamente 11, o aproximadamente 12. En otras modalidades, el pH del solvente es ácido. Por ejemplo, en algunas modalidades, el pH del solvente es menor que aproximadamente 5. En otras modalidades, el pH del solvente se encuentra en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. En modalidades adicionales, el pH del solvente es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 , aproximadamente 4.5, o aproximadamente 5. La porción extraída del primer dispositivo de separación se dirige después a los receptáculos de entradas posteriores para lograr la extracción y en función de la polaridad. En otra modalidad no limitante, el material de proteína se separa en el dispositivo de separación final por medios similares (es decir, ajuste del pH del solvente) .

El ajuste del pH del solvente se logra de acuerdo con los métodos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, el pH ácido se alcanza mediante la mezcla de un ácido apropiado en una corriente de solvente. Los ácidos ilustrativos útiles para la extracción de proteínas incluyen, sin limitarse a, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido clorhídrico. De manera similar, el pH alcalino se alcanza por adición y mezcla de una base apropiada en la corriente de solvente. Las bases ilustrativos útiles para la extracción de proteína incluyen, sin limitarse a, hidróxido de potasio e hidróxido de sodio.

En algunas modalidades, la extracción de proteína se realiza en un sistema separado del sistema de extracción y fraccionamiento descritos en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, una biomasa de algas se remoja en una mezcla de solvente de pH ajustado, seguido por el aislamiento a través de una técnica de separación apropiada (por ejemplo, centrifugación, o filtración) . El sólido remanente se introduce después en un sistema de extracción y fraccionamiento en función de la polaridad, tal como se describe en la presente invención. De manera similar, en algunas modalidades, el extracto remanente a partir de un proceso de extracción y fraccionamiento en función de la polaridad se expone a una mezcla de solventes de pH ajustado para aislar material de proteína al final del proceso de extracción.

Como se muestra en la FIG. 3, la selección del solvente y la teoría de fraccionamiento en función de la polaridad se desarrollaron por un extenso análisis de solventes y el efecto en la extracción usando el proceso de extracción Sohxlet, que permite la separación de los lípidos a partir de un material sólido. El sistema de extracción Sohxlet se utilizó para el tamizaje rápido de solventes por la selectividad y recuperación de la clase lipídica. Los solventes de clases químicas diversas que abarcan una amplia variedad de polaridades tales como alcanos, cicloalcanos , haluros de alquilo, ésteres, cetonas, se probaron. Antes de la extracción, el contenido de lípidos y la composición de la biomasa que se extrae se probaron por triplicado usando los métodos estándares para la estimación de aceite de algas tales como el método de extracción de lípidos Bligh-Dyer. La biomasa contuvo 22.16% de lípidos totales de los que 49.52% fue lípido neutro.

La FIG. 3 presenta los datos obtenidos por la extracción de una masa de algas seca usando varios solventes polares y no polares en combinación con un proceso de extracción Sohxlet . En dependencia de la longitud de cadena del solvente alcano, 60-70% de pureza de lípidos neutros y 15-45 % de recuperación de lípidos totales se puede lograr sin la interrupción y extracción por solvente. La cadena más larga de solvente alcano probado, heptano, recuperó 60% de los lípidos neutros y 42% del total de lípidos. Según se muestra en la FIG. 3, los resultados de la extracción de la masa de algas seca usando solventes y métodos convencionales de extracción tal como hexano son ineficientes, caros y resulta de bajos rendimientos. Los sistemas y métodos descritos en la presente invención se ocupan de estas ineficiencias controlando la proporción del solvente ligeramente no polar en agua para separar los componentes polaridades diferentes con pérdida mínima de los componentes.

Los solventes de alcohol de carbono inferior fueron más selectivos para los lípidos polares. La pureza del lípido neutro fue de 22% por metanol y 45% por etanol . El alcohol isopropílico no mostró ninguna selectividad entre lípidos polares y no polares, lo que resulta en un 52% del producto de lípido neutro puro. El metanol recuperó 67% de los lípidos totales y más de 90% de los lípidos polares. Por lo tanto, el metanol es un excelente candidato para una modalidad de la presente invención en donde el metanol se puede usar para extraer selectivamente los lípidos polares a partir de un material oleaginoso antes de la extracción de los lípidos neutros usando heptano o hexano. Las otras clases de solventes probados no mostraron ninguna selectividad hacia la clase lipídica ya que la pureza lípido neutro estuvo cerca de 49%, similar a la composición de lípidos presentes en la biomasa original. Además, la recuperación de lípidos totales lograda con estos solventes oscila de aproximadamente 15-35%, y produce estos solventes inadecuados para la extracción selectiva de clases en particular o extracción de lípidos totales .

Los resultados del análisis Sohxlet se confirmaron usando el aparato estándar para extracción por solvente en lotes a escala de laboratorio se describe más abajo en el Ejemplo 1. Los solventes seleccionados fueron metanol para la primera la etapa de recuperación de lípidos polares, y éter de petróleo en la segunda etapa para la recuperación de lípidos neutros. Todas las extracciones se realizaron con una relación sólido: solvente de 1:10. Cada etapa de extracción en este experimento fue de 1 hora de duración. Otros experimentos realizados (datos no mostrados) indican que aproximadamente 45 minutos o más es suficientemente largo para que sea exitosa la extracción. Este tiempo de retención depende de la transferencia de calor y masa del sistema.

Las extracciones por metanol se realizaron a diferentes temperaturas, 40 °C, 50 °C, y 65 °C, para determinar cuál fue la óptima. La extracción por éter de petróleo se realizó a 35°C, cercano al punto de ebullición del solvente. El éter de petróleo se eligió debido a su alta selectividad para los lípidos neutros, bajo punto de ebullición, y la calidad del producto observada después de la extracción.

La FIG. 4A muestra que la pureza del lípido neutro en una extracción por éter de petróleo llevada a cabo después de la etapa de extracción por metanol a 65°C está por encima de 80%, demostrando que la combinación de esas dos etapas de extracción mejoró el contenido de lípido neutro del producto final de aceite crudo. La FIG. 4B muestra que la recuperación de lípido neutro total fue inferior y existió una cantidad significativa de pérdida de lípido neutro en la primera etapa .

Para minimizar la pérdida de lípidos neutros en la etapa de extracción por metanol, la polaridad del solvente se puede aumentar añadiendo agua al solvente. La FIG. 5A y 5B muestran los resultados de la extracción de la biomasa antes mencionada con 70% v/v de metanol acuoso seguido por la extracción con éter de petróleo. La FIG. 5A muestra que la pureza del lipido neutro fue mucho mayor en la extracción por éter de petróleo que la que se logró mediante el uso de metanol puro. Además, la pérdida de lípidos neutros se redujo en gran medida por el uso de metanol acuoso en la primera etapa de extracción. Como se observa en la FIG. 5B, la extracción por metanol a temperaturas más altas mejoró la pureza del lipido neutro pero disminuyó ligeramente la recuperación de lípidos totales en la etapa posterior.

En algunas modalidades ilustrativas la temperatura del proceso de extracción se controla para asegurar la estabilidad óptima de los componentes de las algas presentes en la biomasa de algas. Las proteínas de algas, carotenoides y clorofila son ejemplos de los componentes de algas que muestran sensibilidad a la temperatura. En otras modalidades, la temperatura se aumenta después de que se extrajeron de la biomasa de algas los componentes de algas sensibles a la temperatura .

En aún otras modalidades ilustrativas, la temperatura del proceso de extracción se ajusta para optimizar el rendimiento del producto deseado. Las extracciones se pueden ejecutar desde temperatura ambiente hasta, pero por debajo, del punto de ebullición de la mezcla de extracción. En aún otras modalidades, la temperatura del proceso de extracción se cambia dependiendo de la solubilidad del producto deseado. En aún otras modalidades, la temperatura de extracción se optimiza dependiendo de la cepa de algas que se extrae de la biomasa. Las temperaturas de extracción elevadas aumentan la solubilidad de los compuestos deseados y reducen la viscosidad de la mezcla de extracción mejorando la recuperación de la extracción.

En algunas modalidades, la extracción se ejecuta a presión para elevar el punto de ebullición de la mezcla de extracción. En estas implementaciones, la presión se aumenta en el grado necesario para evitar la ebullición, mientras se mantiene la temperatura de la mezcla de extracción por debajo de una temperatura a la que cualquiera de los productos deseados empezaría a degradarse, desnaturalizarse, descomponerse o destruirse.

En algunas modalidades ilustrativas, la. extracción se realiza próxima al punto de ebullición del solvente usado, en las condiciones bajo las cuales se realiza la extracción (por ejemplo, presiones elevadas o atmosféricas) . En otras modalidades, la extracción se realiza próxima al punto de ebullición de la mezcla de extracción, justificando nuevamente otras condiciones de extracción. A las temperaturas, la penetración de la fase de vapor del solvente en las células de las algas es más rápida debido a la resistencia inferior en la transferencia de masa. Si la temperatura de extracción se deja exceder significativamente el punto de ebullición del solvente, el sistema solvente-agua puede formar un azeótropo. Así, manteniendo el sistema en o próximo al punto de ebullición del solvente puede generar vapores suficientes para mejorar la extracción, mientras que reduce los gastos. Además, la solubilidad del aceite se aumenta a temperaturas más altas, lo cual puede aumentar además la efectividad de la extracción a temperaturas cercanas al punto de ebullición del solvente. La FIG. 6 muestra la recuperación de lípidos total es en el esquema de extracción por éter petróleo- metanol acuoso. Aunque la modalidad de la extracción por metanol próximo a su temperatura de ebullición disminuye ligeramente la recuperación de lípidos neutros como se observa en la FIG. 5B, mejora la recuperación de lípidos totales.

En otras modalidades, la extracción se lleva a cabo bajo condiciones de iluminación ambiental. En otras modalidades, la extracción se lleva a cabo en un recipiente opaco, tal como, pero sin limitarse a, un tubo o carcasa de acero, para proteger de la degradación los componentes de algas sensibles a la luz. Los carotenoides son componentes de algas sensibles a la luz.

En otras modalidades ilustrativas, la extracción tiene lugar bajo condiciones atmosféricas normales. En aún otras modalidades, la extracción tiene lugar bajo una atmósfera de nitrógeno para proteger los componentes de algas propensos a la oxidación. En aún otras modalidades, la extracción tiene lugar bajo una atmósfera de gas inerte para proteger los componentes de algas propensos a la oxidación. Los componentes de las algas que podrían ser propensos a la oxidación incluyen carotenoides , clorofila y lípidos.

En modalidades ilustrativas, la relación para la extracción de solvente por sólido está entre 3-5 en función del peso seco de los sólidos en la biomasa. La biomasa residual de algas es rica en carbohidratos (por ejemplo , almidón) y se puede usar como una materia prima de alimentación para producir el solvente usado para la extracción.

La FIG. 7 muestra el efecto de la relación solvente por sólido en la recuperación de lípidos totales. Como la relación solvente por sólido se aumentó, hubo un aumento correspondiente y drástico en la recuperación de lípidos totales. Se cree que esto se debió a la menor solubilidad de los lípidos en metanol, en comparación con otros solventes de extracción de aceite comúnmente usados tal como hexano.

[0008] La solubilidad de los componentes se afecta por la polaridad del solvente usado en un proceso de extracción.

Las propiedades de solubilidad se pueden usar para determinar la relación de biomasa húmeda por solvente. Por ejemplo, un 40% p/p de biomasa húmeda tiene 40 g de biomasa y 60 g de agua por cada 100 g de biomasa húmeda. Si 100 g de etanol se añaden a esta mezcla, la relación de etanol por biomasa húmeda es 1 parte de biomasa húmeda por 1 parte de etanol y la concentración de etanol en la mezcla es 100/(100+ 60) lo que equivale a aproximadamente 62% p/p de etanol en la fase líquida. El 62% p/p de etanol en la mezcla de etanol agua se corresponde a un índice de polaridad de 6.6, calculado en peso y promediando las polaridades de los componentes. El etanol, que tiene un índice de polaridad de 5.2, y el agua, que tiene un índice de polaridad de 9, en una mezcla que contiene 62% de etanol y 38% agua resulta en un índice de polaridad ( 0.62*5.2+ .38*9) de aproximadamente 6.6. El índice de polaridad de la mezcla para la extracción de lípidos polares y lípidos neutros se calcula que sea aproximadamente 5.8 y 5.4 respectivamente. A la luz de la presente descripción, un experto en la técnica será capaz de formular un conjunto de solventes que pueden extraer selectivamente estos componentes.

En otro ejemplo, si el solvente de extracción es una mezcla 1:1 de alcohol isopropílico y etanol, la polaridad de este solvente es ( (3.9+5.4 ) /2 ) , lo cual es aproximadamente 4.65. La relación de solvente a la biomasa húmeda se calcularía para coincidir las polaridades. Para obtener un índice de polaridad de 6.6, tendríamos que preparar un 55% p/p de la mezcla IPA-agua calculada resolviendo la siguiente ecuación algebraica: x*4.65+ (1-x) *9=6.6 X = (9-5.6)/ (9-4.65) = 0.55 55% p/^ de mezcla solvente en la mezcla solvente-agua Para un 40% p/p de biomasa húmeda, la relación de biomasa húmeda a IPA es (1-0.55) /O.6 ~ 0.75 Con un 40% p/p de biomasa húmeda esto correspondería a una relación de 100 partes de biomasa húmeda por 75 partes de mezcla de solventes. Un 40% p/p de biomasa húmeda tiene 40 g de biomasa y 60 g de agua por cada 100 g de biomasa húmeda. Si 75 g de la mezcla de solvente se añaden a esta mezcla, la concentración de solvente en la mezcla es (75/(75+60)) es aproximadamente 55% p/p de la mezcla de solvente en la solución mezcla de solvente-agua . Este cálculo se puede usar para obtener la relación solvente por biomasa en cada etapa de extracción y para cada producto. Unos pocos ejemplos no limitantes de conjuntos de solventes aparecen en la Tabla 3.

TABLA 3 La mezcla de extracción descrita en todos los ejemplos se compone de una fase sustancialmente sólida y una fase sustancialmente líquida. Estas fases se separan después de la extracción posterior. Esto se puede seguir después por la eliminación del solvente líquido a partir de la fase líquida, rindiendo un producto de extracción. En algunas modalidades, se evapora el solvente. En la implementación, una técnica de extracción líquido- líquido se puede usar para reducir la cantidad de solvente que se necesita evaporar. Cualquiera de los solventes usados se puede reciclar si las condiciones lo permiten.

Se teorizó que el tratamiento de la biomasa de algas antes de la extracción aumentaría la productividad y la eficiencia de la extracción de lípidos. En esta dirección se realizó un experimento comparando el efecto de añadir una base u otro solvente orgánico a una biomasa de algas para cambiar las propiedades de la superficie y mejorar la extracción. Se intentó una diversidad de tratamientos que incluyen el metanol acuoso, hidróxido sódico acuoso, y DMSO acuoso. Como muestra la FIG. 8, la adición de 5% de DMSO aumenta 3 veces la recuperación de lípidos . Estas etapas de extracción se pueden explotar para reducir dramáticamente las etapas de extracción por metanol. Sin embargo, las soluciones usadas en los experimentos anteriores pueden no ser ideales para el uso a escalas más grandes debido al alto costo, viscosidad y capacidad para recuperar y reciclar el DMSO.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra el efecto de una octava etapa de extracción por metanol en el rendimiento acumulativo de lípidos totales y la pureza del lípido neutro extraído. En esta modalidad, 112 gramos de biomasa húmeda (25.6% de peso seco), se extrajo con 350 mi de metanol puro y calentando durante 10 minutos a potencia de irradiación de 160 en cada etapa. Esto resultó en una temperatura de extracción de aproximadamente 75 lo cual se aproximó al punto de ebullición de la mezcla de extracción. Usando este proceso, se determinó que es posible obtener lípidos neutros muy puros a partir de aceite de algas una vez que se extrajo la mayoría de los lípidos polares. La FIG. 9 muestra que es posible aislar el lípido neutro de pureza alta una vez que se extraen todos los lípidos polares. En este caso un 5% de rendimiento de la biomasa total se logró con más del 90% de pureza de lípidos neutros en las etapas 5 hasta la 8 de extracción por metanol. Además, debido al punto de ebullición de la mezcla de extracción, la mayor parte del agua en la biomasa se extrae completamente en la primera etapa de extracción, junto con carbohidratos, proteínas y metales.

La FIG. 10 muestra que la recuperación de los lípidos se puede hacer más eficaz mediante el uso de etanol para extraer los lípidos y proteínas a partir de la biomasa húmeda. Usando etanol, se puede lograr el 80% de la recuperación de lípidos totales en aproximadamente 4 etapas en lugar de las 9 generalmente necesarias usando metanol. Este aumento en la recuperación se puede atribuir a una mayor solubilidad de los lípidos en etanol en comparación con metanol. Además, el punto de ebullición del etanol acuoso es mayor que el de metanol acuoso, lo que facilita además la recuperación de los lípidos. Esto es debido a que la temperatura más alta rinde el aceite menos viscoso, mejorando de ese modo la difusibilidad. Otra ventaja distinta de este proceso es que usa el etanol residual en la fracción de aceite para la transesterificación, así como que reduce la carga de calor en la operación de secado de la biomasa.

Además, la FIG. 10 demuestra que las fracciones iniciales no son ricas en lípidos, conteniendo proteínas, y otras moléculas altamente polares, seguidas por las fracciones ricas en lípidos polares y finalmente las fracciones de lípidos neutros. Por lo tanto, con un diseño apropiado del aparato de extracción, se puede recuperar totalmente los tres productos en un solo proceso de fraccionamiento y extracción.

Otra modalidad de la invención actual utiliza microondas para la extracción asistida. En función de los datos recogidos previamente descritos en esta solicitud, se muestra que el metanol solo es el mejor solvente para la extracción de todos los lípidos a partir de las algas . Por lo tanto, una extracción de múltiples etapas por solvente único, como se describe en el Ejemplo 1 de la presente solicitud, se realizó para recoger los datos sobre la eficacia de un solvente en el sistema de extracción por microondas.

La FIG. 11 es una representación logarítmica que compara el tiempo de extracción y la recuperación de lípidos totales de la extracción convencional y extracción asistida por microondas. En función de la pendiente de la curva, se calculó que el sistema de microondas reduce el tiempo de extracción en aproximadamente cinco veces o más. Mientras que los métodos convencionales tienen una mayor recuperación neta de lípidos, esto es debido a las mayores recuperaciones de lípidos polares. En función de estos resultados, se optimizaron las condiciones para la extracción de la biomasa de algas seca usando solventes con y sin asistencia por microondas. Algunas modalidades de la invención, usan equipos de microondas tradicionales, los cuales emiten longitudes de onda que excitan las moléculas de agua. Las modalidades adicionales de la invención utilizan aparatos de microondas hechos a la medida capaces de excitar diferentes solventes. Aún otras modalidades de la invención utilizan aparatos de microondas personalizados capaces de excitar los lípidos presentes en la biomasa de algas. En algunas modalidades, los lípidos presentes en la biomasa de algas se excitan usando microondas, mejorando de ese modo la separación y extracción de los componentes lipidíeos a partir de la biomasa de algas.

El contenido de humedad es otro parámetro de la biomasa que influirá en la eficiencia de la extracción de aceite. En algunas modalidades de la presente invención, la masa seca de algas se extrae y fracciona. En otras modalidades, la masa de algas es húmeda. Las muestras de biomasa con contenidos de 10%, 25%, y 33% de masa de algas se usaron para investigar la influencia de la humedad en el rendimiento de la extracción.

La FIG. 12A muestra un proceso ilustrativo 400 para una extracción por etapas de productos a partir de una biomasa de algas. Todas las unidades en la FIG. 12A están en libras. La FIG . 12A muestra un balance de masa del proceso 400, mientras que los detalles de los equipos y/o sistemas para la modalidad del proceso se describen en otra parte de la presente descripción. Una biomasa que contiene 5 libras (2.26kg) de algas tiene aproximadamente de 0.63 libras (0.28kg) de lípidos polares, 1.87 libras (0.84kg) de lípidos neutros, 1 libra (0.453 kg) de proteína, y 1.5 libras (0.68kg) de carbohidratos. La biomasa y 1000 libras (453.59kg) de agua se procesa en una etapa de deshidratación 405, que separa 950 libras (430.91 kg) de agua a partir de la mezcla y pasa a una primera etapa de extracción 410 5 libras (2.26kg) de algas en 45 libras (20.41kg) de agua. Cualquiera de las técnicas de deshidratación descritas en la presente se puede usar en la etapa de deshidratación 405. En la primera etapa de extracción 410, 238 libras (107.95kg) de etanol y 12 libras (5.44 kg) de agua se combinan con las algas y el agua a partir de la etapa anterior. La primera etapa de extracción 410 tiene una fase líquida de aproximadamente 80.9% p/p de etanol. Una primera fase líquida se recupera de 231 libras (104.77kg) de etanol, 53 libras (24.04kg) de agua y 0.5 libras (2.26 kg) de proteínas de algas, a partir de la cual el agua y el etanol se eliminan mediante, por ejemplo, evaporación, dejando un producto rico en proteínas 415. El solvente recuperado a partir de la evaporación se puede reciclar a la primera etapa de extracción 410.

Una primera fase sólida de la primera etapa de extracción 410 se pasa a una segunda etapa de extracción 420; esta primera fase sólida incluye 4.5 libras (2.04 kg) de algas, 2.6 libras (1.17kg) de agua, y 10.9 libras (4.94kg) de etanol. 86 libras (39.00kg) de etanol y 4 libras (1.81kg) de agua se añaden a la primera fase sólida de la etapa anterior. La segunda etapa de extracción 420 tiene una fase líquida de aproximadamente 93.6% p/p de etanol. Una segunda fase líquida se recupera de 85.9 libras (38.96kg) de etanol, 5.9 libras (2.67kg) de agua, y 0.6 libras (0.27kg) de lípidos polares, a partir de la cual el agua y el etanol se eliminan mediante, por ejemplo, evaporación, dejando un producto polar rico en lípido 425. El solvente recuperado a partir de la evaporación se puede reciclar a la segunda etapa de extracción 420.

Una segunda fase sólida de la segunda etapa de extracción 420 se pasa a una tercera etapa de extracción 430; esta primera fase sólida incluye 3.9 libras (1.76kg) de algas, 0.7 libras (0.31kg) de agua, y 11 libras (4.98kg) de etanol. 78.5 libras (33.79kg) de etanol y 3.5 libras (1.58kg) de agua se añaden a la segunda fase sólida de la etapa anterior. La tercera etapa de extracción 430 tiene una fase líquida de aproximadamente 95.4% p/p de etanol. Una tercera fase líquida se recupera de 78.9 libras (35.78kg) de etanol, 3.9 libras (1.76kg) de agua, y 1.6 libras (0.72kg) de lípidos neutros, a partir de la cual el agua y el etanol se eliminaron mediante, por ejemplo, evaporación, dejando un producto rico en lípidos neutros 435. El solvente recuperado a partir de la evaporación se puede reciclar a la segunda etapa de extracción 430. Una fase sólida de 2.3 libras (1.04kg) de algas, 0.3 libras (0.13kg) de agua, y 6.6 libras (2.99kg) de etanol permanece.

Como se demostró en la FIG. 12A, el perfil lipídico resultante con cada etapa secuencial de extracción por etanol se influenció en gran medida por el contenido de humedad en las algas iniciales. Los modelos del proceso 400 se ejecutaron en tres colecciones diferentes de biomasa, teniendo cada uno un contenido de agua inicial diferente. Como el contenido inicial de agua disminuyó, la etapa de recuperación máxima de lípidos cambió a partir de la tercera etapa de extracción a la cuarta (no mostrado) . Sin embargo, la recuperación de lípidos totales a partir de estas tres muestras de biomasa fueron bastante similar, todos por encima de 95% del contenido de lípidos totales de la biomasa de algas .

Cuando se usó la masa de algas con mayor contenido de humedad, la concentración de etanol en la mezcla de etanol acuoso fue mucho menor, y por lo tanto el porcentaje de lípido neutro en el extracto crudo fue menor también. Se informó que la deshidratacion de la pasta de algas con 90% de agua es un proceso muy intensivo de energía.

Sorprendentemente los métodos descritos en la presente se pueden usar para extraer y fraccionar con éxito una masa de algas que contiene principalmente agua. Como la recuperación de lípidos totales no se influenció significativamente partiendo de una pasta de algas que contiene 90% de agua (10% de sólidos de algas) , a diferencia de los métodos convencionales de extracción, los métodos descritos en la presente no requieren el uso de una etapa de secado con energía intensiva.

La FIG. 12B muestra una implementación ilustrativa 500 de una de las etapas de extracción del proceso 400. Una biomasa de algas y mezcla de solvente 505 se proporciona a un recipiente de extracción 510. Después de que el alga se extrae (como se describió en otra parte en la presente) , la mezcla se proporciona a un sistema de filtración grueso 515, tal como un filtro de tubo de metal sinterizado, el cual separa la mezcla en una fase líquida y una fase sólida. La fase sólida se pasa a una etapa de extracción corriente abajo. La fase líquida se pasa a un sistema de eliminación de solvente 520, por ejemplo, un evaporador, para reducir el contenido de solvente (por ejemplo, etanol) en la fase líquida. La fase líquida remanente después de la eliminación del solvente se pasa, opcionalmente , a una centrífuga 525. Cualquiera de los sólidos remanentes en el sistema de eliminación de solvente se recicla o desecha. La centrífuga 525 asiste en la separación del producto deseado de algas (por ejemplo, proteínas o lípidos) a partir de cualquier remanente de agua y/o sólidos en la fase líquida.

La FIG. 14 muestra un ejemplo de un proceso 600 mediante el cual se puede procesar la masa de algas para formar o recuperar uno o más productos de algas . En este ejemplo, una biomasa de algas se extrae de una manera escalonada en un proceso inicial 605 usando los métodos descritos en la presente descripción. Las etapas de extracción y separación se siguen por un proceso de esterificación 610, un proceso de hidrólisis 615, un proceso de hidrotratamiento 620, y/o un proceso de destilación 625 para aislar además los componentes y productos . Los componentes y productos incluyen lípidos de algas, proteínas de algas, glicerina, carotenoides , nutracéuticos (por ejemplo, aceites insaturados de cadena larga y/o ésteres) , ésteres de combustible (generalmente, los ésteres que tienen longitudes de cadena de C20 o más cortos), combustibles, aditivos de combustible, nafta, y/o sustitutos líquidos de petróleo. En modalidades preferidas, los ésteres de combustible son de longitudes de cadena C16. En otros, los ésteres de combustible son de longitudes de cadena C18. En aún otras modalidades, los ésteres de combustible son una mezcla de longitudes de cadena, C20 o más cortas.

[0009] El proceso de esterificación 610, proceso de hidrólisis 615, proceso de hidrotratamiento 620, y proceso de destilación 625 son opcionales y se pueden usar en diversas órdenes. Las flechas rayadas y flechas punteadas indican algunas, pero no todas, de las opciones de cuando se pueden realizar la hidrólisis, hidrotratamiento, y/o procesos de destilación en el procesamiento de las fracciones de lípidos. Por ejemplo, en algunas modalidades de la invención, después de que la extracción y/o separación se llevan a cabo, la fracción de lípidos neutros se puede hidrotratar directamente para preparar los productos de combustible y/o aditivos. Como alternativa, en otras modalidades, la fracción de lípido neutro se puede pasar al proceso de esterificación 610.

El proceso de esterificación 610 puede incluir métodos conocidos en la técnica, tales como catálisis ácido/básica, y puede incluir la transesterificación . Aunque la catálisis básica no se excluye para producir algunos productos, la catálisis ácida se prefiere como aquellas técnicas que evitan los detergentes que se forman durante la catálisis básica, lo cual puede hacer complicado el procesamiento corriente abajo. Las técnicas de esterificación enzimática se pueden usar también. La esterificación puede procesar material lipídico sustancialmente puro (más del 75% de lípidos, como se usa en la presente descripción) . Después de la esterificación, se puede eliminar el subproducto glicerina. Los lípidos esterificados pueden someterse después a destilación molecular y/o no molecular (proceso 625) para separax- los lípidos esterificados de diferentes longitudes de cadena, así como los carotenoides presentes en la fracción lipídica. Los lípidos esterificados se pueden pasar después al proceso de hidrotratamiento 620 para generar combustible de reactor, biodiesel, y otros productos de combustible. Cualquier proceso de hidrotratamiento conocido en la técnica se puede usar; el proceso añade hidrógeno a las moléculas de lípidos y elimina las moléculas de oxígeno. Las condiciones ilustrativas para hidrotratar comprenden reaccionar los triglicéridos , ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos con hidrógeno bajo alta presión en el intervalo de 600 psi y temperatura en el intervalo de 600 °F. Los catalizadores usados comúnmente son NiMo o CoMo.

Hidrotratar los ésteres de combustible en lugar de los lípidos crudos tiene varias ventajas. En primer lugar, el proceso de esterificación 610 reduce los niveles de determinados fósforos y compuestos de metales presentes en los aceites de algas. Estos materiales son venenos para los catalizadores usados típicamente en los procesos de hidrotratamiento. Así, la esterificación antes del hidrotratamiento prolonga la vida del catalizador del hidrotratamiento. Además, la esterificación reduce el peso molecular de los compuestos que se hidrotratan, mejorando el rendimiento del proceso de hidrotratamiento 620. Más aún, es ventajoso para retener los ésteres de combustible a partir del proceso de destilación 625 que se hidrotrata en una forma de vapor, ya que esto reduce la energía necesaria para hidrotratar .

En algunas modalidades de la invención, los lípidos neutros se hidrotratan directamente de algas para convertir los lípidos en productos combustibles y aditivos. Mientras en otras implementaciones, los lípidos neutros se esterifican a través del proceso de destilación 625 y separan en carotenoides, ésteres de cadena larga insaturada, ésteres de ácido eicosapentaenoico (EPA) , y/o ésteres de combustible. El proceso de destilación 625 puede incluir la destilación molecular así como cualquiera de las técnicas de destilación conocidas en la técnica. Por ejemplo, los destilados se pueden fraccionar usando una columna de destilación simple para separar los ácidos grasos de cadena inferior por la refinación. El ácido graso de cadena larga insaturada permanece como residuo en la columna de alta ebullición. En algunas modalidades, el vapor remanente se puede enviar después al proceso de hidrotratamiento . Dos de las ventajas de la presente invención son que rinde el alimento puro, así como un producto vapor, lo cual favorece la reacción de energía por hidrotratamiento intensivo, como se describió anteriormente .

En algunas modalidades de la invención, los lípidos polares (y, opcionalmente, lípidos neutros) se hidrolizan en el proceso de hidrólisis 615 antes de que se transfieran al proceso de esterificación. El proceder desata los ácidos grasos de los lípidos de algas, y permite que se formen en productos útiles una mayor cantidad de lípidos de algas.

La FIG. 15 es un diagrama de flujo que muestra un proceso 700 para producir productos nutracéuticos a partir de lípidos neutros. En una implementación del proceso 700, los lípidos neutros se alimentan a un proceso de adsorción 705 que separa los carotenoides a partir de aceite rico en EPA. Los lípidos neutros pueden ser a partir de una fuente de algas generada por cualquiera de las técnicas de extracción selectiva descritas en la presente descripción. Sin embargo, los lípidos neutros pueden ser a partir de otras fuentes, tales como fuentes de plantas.

El proceso de adsorción 705 incluye contactar los lípidos neutros con un adsorbente para adsorber los carotenoides, tales como el betacaroteno y xantofilas. En una implementación, el adsorbente es Diaion HP20SS (disponible en el comercio de ITOCHU Chemicals America, Inc.). Los lípidos neutros pueden contactar el adsorbente en un proceso de tipo discontinuo, en el cual el lípido neutro y el adsorbente se mantienen en un recipiente durante una cantidad seleccionada de tiempo. Después del tiempo de contacto, el absorbente y el líquido se separan usando métodos conocidos en la técnica. En otras implementaciones , el adsorbente se mantiene en un lecho adsorbente, y los lípidos neutros se pasan a través del lecho adsorbente. Después de pasar a través del lecho adsorbente, el contenido de carotenoides de los lípidos neutros se reduce, produciendo de ese modo n aceite rico en EPA.

Los carotenoides se pueden recuperar del material adsorbente tratando el adsorbente con un solvente apropiado, que incluye, pero sin limitarse a, alcoholes tales como etanol, alcohol isopropílico, butanol, ésteres tales como acetato de etilo o acetato de butilo, alcanos tales como hexano y pentano.

La FIG. 16 es un diagrama de flujo que muestra un proceso 800 para producir los productos de combustible 830 a partir de lípidos neutros 805. Los lípidos neutros pueden ser a partir de una fuente de algas generada por cualquiera de las técnicas de extracción selectiva descritas en la presente descripción. Sin embargo, los lípidos neutros pueden ser a partir de otras fuentes, tales como fuentes de plantas. Los lípidos neutros se tratan en un proceso de desgomado 810, en el cual los lípidos son lavados con ácido para reducir los niveles de metales y fosfolípidos en los lípidos neutros . En algunas implementaciones, una solución relativamente diluida de ácido fosfórico se añade a los lípidos neutros, y la mezcla se calienta y agita. Los fosfolípidos precipitados y los metales se separan después del aceite remanente, por ejemplo, por centrifugación.

El aceite tratado se pasa después al proceso de blanqueo 815 para eliminar las clorofilas y otros compuestos de color. En algunas implementaciones , el proceso de blanqueo 815 incluye contactar el aceite con arcilla u otro material adsorbente, tal como arcilla de blanqueo (es decir, bentonita o tierra de batán) , lo cual reduce los niveles de clorofilas y otros compuestos de color en el aceite. El aceite tratado se pasa después, al proceso de hidrotratamiento 820, lo cual hidrogena y desoxigena los componentes del aceite para formar productos combustibles, por ejemplo, mezclas de combustible de reactor, aditivos de combustible diesel y propano. Además, el proceso de hidrotratamiento 820 causa también alguna desintegración y la creación de compuestos de menor cadena, tales como el LPG y nafta. Cualquiera de los procesos de hidrotratamiento descritos en la presente descripción se puede usar para el proceso de hidrotratamiento 820.

La mezcla de compuestos creados en el proceso de hidrotratamiento 820 se pasa a un proceso de destilación 825 para separarlos en diferentes productos combustibles 830. El proceso de destilación 825 puede incluir cualquiera de las técnicas de destilación molecular y no molecular descritas en la presente descripción o conocidas en la técnica para la separación de compuestos de combustible.

En algunas modalidades de la inmediata invención, las proteínas se pueden extraer selectivamente a partir de una biomasa de algas. La extracción de proteínas usando los métodos descritos ofrece muchas ventajas. En particular, las células de algas no necesitan que se lisen antes de extraer las proteínas deseadas. Esto simplifica y reduce los costos de extracción. Los métodos de la inmediata invención explotan los perfiles de solubilidad de las diferentes clases de proteínas para extraer de selectivamente y fraccionarlos a partir de un cultivo de algas, biomasa, pasta o torta.

Por ejemplo, una biomasa de algas se puede someter al calentamiento y mezcla para extraer el agua y proteínas solubles en sal llamadas albúminas y globulinas. Esta mezcla se puede someter después a un cambio en el pH para recuperar las proteínas solubles en álcali llamadas las glutelinas . Esta etapa se puede seguir después por una separación a base de solvente de las proteínas solubles en alcohol llamadas prolaminas . La biomasa remanente sería rica en carbohidratos y lípidos.

Las proteínas se pueden extraer a partir de las células de algas de agua salada y de agua dulce, como se muestra en las FIGS . 17 y 18. La presencia de sal en el cultivo de algas de agua salada o biomasa afecta la extracción de las diferentes clases de proteínas, pero los métodos descritos en la presente invención permiten una vez extraer selectivamente las proteínas a partir de algas de agua dulce o salada.

En algunas modalidades, la extracción de proteínas a partir de células de algas de agua dulce se logra mediante el proceso nuevo que se muestra en la FIG. 17. Las células de algas de agua dulce o una biomasa de algas de agua dulce se calientan y mezclan. La mezcla se puede lograr mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, mover agitar, y oscilar. Este proceso genera una primera mezcla o suspensión de extracción, comprendida de una primera fase sustancialmente líquida y una primera fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se separan después. La separación se puede lograr mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a, centrifugación, decantación, flotación, sedimentación y filtración. Esta primera fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas albúmina.

La primera fase sustancialmente sólida se mezcla después con agua salada y calienta para generar una segunda mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una segunda fase sustancialmente líquida y una segunda fase sustancialmente sólida. El agua salada puede ser agua de mar natural o puede ser una solución salada acuosa. Un ejemplo de la solución comprendería típicamente aproximadamente 35 g/1 que comprende principalmente NaCl . Las fases sólida y líquida se separan después. Esta segunda fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas globulinas .

La segunda fase sustancialmente sólida se mezcla después con agua y calienta para generar una tercera mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una tercera fase sustancialmente líquida y una tercera fase sustancialmente sólida. El pH de esta tercera mezcla de extracción o suspensión se eleva después a aproximadamente 9 o mayor, enriqueciendo la tercera fase sustancialmente líquida con proteínas glutelinas. Las fases sólida y líquida se separan después, siendo la tercera fase sustancialmente líquida enriquecida en proteínas glutelinas .

La tercera fase sustancialmente sólida se mezcla después con un conjunto de solventes y calienta para generar una cuarta mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una cuarta fase sustancialmente líquida y una cuarta fase sustancialmente sólida. En una modalidad preferida, el conjunto de solventes comprende etanol . En otras modalidades no limitantes, el conjunto de solventes comprende uno o más de los siguientes solventes: metanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo . Las fases sólida y líquida se separan después. Esta cuarta fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas prolamina. La cuarta fase sustancialmente sólida remanente se puede enriquecer en lípidos, dependiendo de la composición de la biomasa de algas de partida.

En algunas modalidades, la extracción de proteínas a partir de células de algas de agua salada se logra mediante el proceso nuevo que se muestra en la FIG. 18. Las células de algas de agua salada o biomasa de algas de agua salada se calientan y mezclan. La mezcla se puede lograr mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, mover agitar, y oscilar. Este proceso genera una primera mezcla o suspensión de extracción, comprendida de una primera fase sustancialmente líquida y una primera fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se separan después. La separación se puede lograr mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a, centrifugación, decantación, flotación, sedimentación y filtración. Esta primera fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas globulinas.

La primera fase sustancialmente sólida se mezcla después con agua y se calienta para generar una segunda mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una segunda fase sustancialmente líquida y una segunda fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se separan después. Esta segunda fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas albúmina.

La segunda fase sustancialmente sólida se mezcla después con agua y calienta para generar una tercera mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una tercera fase sustancialmente líquida y una tercera fase sustancialmente sólida. El pH de esta tercera mezcla de extracción o suspensión se eleva después a pH 9 o mayor, enriqueciendo la tercera fase sustancialmente líquida con proteínas glutelinas Las fases sólida y líquida se separan después, siendo la tercera fase sustancialmente líquida enriquecida en proteínas glutelinas.

La tercera fase sustancialmente sólida se mezcla después con un conjunto de solventes y calienta para generar una cuarta mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una cuarta fase sustancialmente líquida y una cuarta fase sustancialmente sólida. En una modalidad preferida, el conjunto de solventes comprende etanol. En otras modalidades no limitantes, el conjunto de solventes comprende uno o más de los siguientes solventes: metanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo . Las fases sólida y líquida se separan después. Esta cuarta fase sustancialmente líquida se enriquece en proteínas prolamina. La cuarta fase sustancialmente sólida remanente se puede enriquecer en lípidos, dependiendo de la composición de la biomasa de algas de partida.

Los métodos descritos proporcionan también la extracción selectiva de diferentes tipos de proteínas, como se muestra en las FIG. 17-20. Cualquiera de las etapas del proceso de extracción antes mencionado se puede realizar por separado a partir del resto de las etapas para extraer selectivamente un único producto proteico. Dos ejemplos de esto aparecen en las FIG. 17 y 18, como la demostrada por el cuadro de líneas discontinuas alrededor de etapa de extracción la.

En un ejemplo no limitante, las proteínas globulinas se pueden extraer selectivamente a partir de una biomasa de algas de agua dulce mezclando la biomasa con agua salada y calentando para generar una mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una fase sustancialmente líquida y una fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se pueden separar después. La fase líquida se enriquece en proteínas globulinas. Ver la Figura 17, etapa de extracción la.

En otro ejemplo no limitante, las proteínas albúminas se pueden extraer selectivamente a partir de una biomasa de algas de agua salada mezclando la biomasa con agua y calentando para generar una mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una fase sustancialmente líquida y una fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se pueden separar después. La fase líquida se enriquece en proteínas globulinas. Ver la Figura 18, etapa de extracción la.

En un ejemplo no limitante adicional, las proteínas prolaminas se pueden extraer selectivamente a partir de ya sea de biomasa de algas agua dulce o agua salada, como se muestra en la FIG. 19. La extracción selectiva se logra mezclando la biomasa de algas con un conjunto de solventes y calentando para generar una mezcla o suspensión de extracción caliente, comprendida de una fase sustancialmente líquida y una fase sustancialmente sólida. Las fases sólida y líquida se pueden separar después . La fase líquida se enriquece en proteínas prolaminas .

Todavía en otro ejemplo no limitante, una fracción de proteína se puede extraer selectivamente a partir de ya sea una biomasa de algas de agua dulce o agua salada como se muestra en la FIG. 20. La extracción selectiva se logra mezclando la biomasa de algas con un conjunto de solventes para generar una mezcla de extracción o suspensión y efectuando un cambio de pH en la mezcla. Las fases sólida y líquida se pueden separar después. Las fases sólida y líquida se pueden separar después . La fase liquida se enriquece en proteínas Habiéndose informado de estos aspectos de la invención, una persona con experiencia en la técnica será capaz de extraer selectivamente una proteína deseada a partir de ya sea una biomasa de algas de agua dulce o de agua salada ya sea por un proceso de extracción de una sola etapa, o un proceso de extracción de múltiples etapas. Como consecuencia de la presente descripción, un experto en la técnica será capaz de intercambiar el orden de los esquemas de extracción de múltiples etapas descritos anteriormente, siempre que el contenido de proteína de la masa de algas y las propiedades de solubilidad de las proteínas de interés se tengan en cuenta. Otras modalidades de los métodos descritos pueden incorporar un etapa de lavado entre cada etapa de extracción.

Para cualquiera de los métodos descritos de extracción de proteínas, la mezcla/suspensión de extracción se puede mantener a una temperatura caliente, durante un período de tiempo. En algunas modalidades, la mezcla de extracción se mantiene a una temperatura caliente durante entre aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 90 minutos. En algunos aspectos, la mezcla de extracción se mantiene a una temperatura caliente durante 'entre aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 60 minutos. En algunos aspectos, la mezcla de extracción se mantiene a una temperatura caliente durante entre aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 90 minutos.

En algunas modalidades, la mezcla de extracción/suspensión se puede calentar a temperaturas de menos de aproximadamente 50 °C. En algunos aspectos, las proteínas albúmina, globulina, y glutelina se extraen a temperaturas de menos de aproximadamente 50°C. En otras modalidades, la mezcla de extracción/suspensión se calienta a una temperatura cercana al punto de ebullición de la mezcla de extracción/suspensión. En algunos aspectos, las proteínas prolaminas se extraen a temperaturas cercanas al punto de ebullición de la mezcla de extracción/suspensión. En otras modalidades, se aumenta la presión por encima de la presión atmosférica, hasta e incluyendo, 50psi (2.39Kpa), durante las etapas de calentamiento y mezclado para aumentar la extracción.

Ejemplo 1 Las microalgas verdes Scendesmus dimorphus (SD) se cultivaron en fotobiorreactores con panel externo. Las muestras SD de contenido de lípidos diversos se cultivaron. Después de la eliminación de agua a granel por centrifugación, las muestras de algas se almacenaron como tortas de algas de 3-5 cm a -80°C hasta su uso. Una cantidad calculada de antemano de la biomasa de algas húmeda (15 gramos equivalentes en peso seco de algas) y 90 mi de solvente de etanol se añadió a un matraz de tres bocas equipado con condensador, agitador mecánico y un termopar. En un experimento, la mezcla se sometió a reflujo durante 10 minutos bajo irradiación por microondas. En un segundo, la mezcla se sometió a reflujo durante 1 hora con calentamiento electrónico. Después, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y separó por filtración en un difusado y retenido.

Los lípidos totales de las muestras de algas se analizaron usando un sistema de cloroformo-metanol-agua de acuerdo con el método de extracción de lípidos de Bligh y Dyer. Este valor lípidos totales se usó como referencia para el cálculo de la recuperación de lípidos. Los lípidos totales se separaron además en lípidos neutros y lípidos polares por el método estándar de cromatografía en columna usando gel de sílice con malla 60-200 (Merck Corp., Alemania) . Cada fracción de lípidos se transfirió en un vial previamente pesado, se evaporó inicialmente a 30°C usando un evaporador rotatorio (Büchi, Suiza) y se secó después en alto vacío. Los retenidos secos se colocaron bajo nitrógeno, y después se pesaron. El perfil de ácidos grasos de cada muestra se cuantificó por GC-MS después de la derivatización en ésteres de ácidos grasos metílicos, usando ácido heptadecanoico (C17:0) como estándar interno.

Los resultados (datos no mostrados) indicaron que la extracción asistida por microondas fue mejor para la eliminación de los lípidos polares en la primera etapa de extracción, y algo menos eficaces para la separación de lípidos neutros. El calentamiento electrónico es más consistente en la eficacia de la extracción. El rendimiento final es comparable entre la extracción asistida por microondas y la extracción asistida por calentamiento electrónico, pero, la extracción asistida por microondas es significativamente más rápida.

Ejemplo 2 Extracción de proteína a partir de biomasa de algas (1) Lixiviación acida: La Biomasa de algas se sumergió en agua a pH 4.5 durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron después a 3000 rpm durante tres minutos, y se eliminó el sobrenadante. Los sólidos remanentes se lavaron 3 veces con ácido diluido (pH 4.5) y liofilizaron. (2) Extracción alcalina: La biomasa de algas se remojó en agua a pH 11 durante 1 hora a continuación de la adición de agua con el pH ajustado. Las muestras se centrifugaron después a 3000 rpm durante tres minutos, y se eliminó el sobrenadante. El sobrenadante se neutralizó con ácido (pH 4.5) a continuación de la centrifugación. Los sólidos remanentes se lavaron 3 veces con ácido diluido (pH 4.5) y liofilizaron.

Los resultados de la lixiviación ácida y extracción alcalina se muestran más abajo en la Tabla 4.

TABLA 4 peso, comparando el peso de los sólidos liofilizados con el peso de la biomasa de algas antes de embeber en el agua con el pH ajustado. La pureza de la proteína se determinó por el Método Oficial de la Sociedad Americana de Químicos de Aceite (Ba-2a-38) , midiendo la cantidad de nitrógeno en los sólidos liofilizados de cada proceso. Como las proteínas son un producto importante que se añade al valor de la extracción de productos de algas, esta información permite el uso de materias primas con niveles diversos de proteína en los sistemas y métodos descritos en la presente invención.

Ejemplo 3 Extracción de Proteínas a partir de la Biomasa de Algas de agua salada El cultivo de algas de agua salada inicialmente compuesto de aproximadamente 1-10% v/v de sólidos en agua salada se calentó a 50 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 1 hora. La suspensión resultante se centrifugó para separar la fase líquida a partir de la fase sólida. El extracto líquido se determinó que era rico en proteínas globulinas (aproximadamente 10% de las proteínas totales presentes en la biomasa de algas original) .

Los sólidos se suspendieron después en agua dulce y calentaron a aproximadamente 50 °C y mantuvieron durante aproximadamente 1 hora. La suspensión resultante se centrifugó de nuevo para separar el líquido de la fase sólida La fase líquida se determinó que era rica en proteínas de albúmina (aproximadamente 10% de las proteínas totales presentes en la biomasa de algas original) .

Los sólidos se suspendieron después en etanol para alcanzar una mezcla de 70% p/p. Esta mezcla se calentó a aproximadamente 75 °C y se mantuvo a esa temperatura durante aproximadamente 1 hora. La suspensión resultante se centrifugó de nuevo para separar el líquido de la fase sólida. La fase líquida se determinó que era rica en proteínas albúmina (aproximadamente 30% de las proteínas totales presentes en la biomasa de algas original) .

Los sólidos se suspendieron después en solución alcalina (NaOH acuoso, pH 9) y calentaron a aproximadamente 50 °C y se mantuvieron a esa temperatura durante aproximadamente 1 hora. La suspensión resultante se centrifugó de nuevo para separar el líquido de la fase sólida. La fase líquida se determinó que era rica en proteínas glutelinas (aproximadamente de 50% de las proteínas totales presentes en la biomasa original) .

Ejemplo 4 Etapa de Fraccionamiento y Extracción de Biomasa de Algas por Etanol Mil libras (453.59 kg) de biomasa de Naimochloropsis (cultivadas a partir de la cepa 202.0, obtenida de la Universidad del Estado de Arizona, Laboratorio para la Investigación de Algas y Biotecnología, ATCC número de depósito PTA-11048) , se cosecharon y deshidrataron hasta que las algas comprendieron aproximadamente 35 % v/v y después se congelaron finalmente.

Las etapas de extracción se realizaron en una caldera de 400 galones con chaqueta con tapas articuladas. Las tapas se ataron con correas y sellaron con silicona. El sistema contiene también un mezclador con un motor a prueba de explosión de 2 caballos de fuerza con unos dos vastagos de cuchillas. El material de alga congelada se vació en el tanque y un peso igual de etanol, se bombeó con el uso de una bomba de tambor neumático. El material se agitó durante 15 minutos y la chaqueta calentó con vapor para obtener la temperatura deseada en cada etapa de extracción. La temperatura deseada es próxima, lo que significa dentro de 3°C del punto de ebullición de la mezcla, pero no hirviendo. Esta temperatura deseada es diferente en cada etapa de extracción según se cambia el punto de ebullición de la mezcla cambia la proporción de etanol. Después de alcanzar la temperatura deseada, el sistema se agitó continuamente sostenido a la temperatura deseada durante 60 minutos para asegurar que los contenidos de la caldera fueran uniformemente caliente.

Los contenidos de la caldera se bombearon después fuera del recipiente de extracción y en una centrifuga de decantación Sharples, usando una bomba neumática de paletas Viking a aproximadamente 1 galón por minuto. La velocidad del rotor de la centrífuga de decantación se fijó a aproximadamente 6000 rpm. Los sólidos se recogieron en un barril plástico cerrado y consistieron en aproximadamente 50% v/v de sólidos a líquidos. Estos sólidos se devolvieron a la caldera, donde se repitieron las etapas de extracción mencionadas anteriormente. La corriente líquida de la decantación se recogió en un tanque de alimentación, y se alimentó después al sistema de filtración de membrana. La membrana usada fue una membrana SS 0.375 pie2 ( 10.34m2) fabricada por Graver Technologies. Las condiciones operativas fueron 60 °C ± 5°C y con un gradiente de presión promedio de 40 psi (1.915kPa). El sistema de membrana se volvió a lavar aproximadamente cada 15 minutos con aire comprimido para mantener el flujo. El permeado recolectado a partir del sistema de membrana fue libre de cualquier materia particulada. El retenido se recolectó y recicló a la decantación .

Esta extracción y fraccionamiento se debe al cambio en la polaridad del solvente a través del proceso en cada extracción. En la extracción que se muestra en la FIG. 13, el proceso se inició con aproximadamente 1000 libras (453.59kg) de biomasa húmeda de algas que contiene aproximadamente 65% de agua pura (35% v/v de sólidos de algas) . Esto se mezcló con 860 libras (390.10kg) de etanol desnaturalizado (95% de etanol y 5% de metanol) , resultando en una mezcla que contiene aproximadamente 55% de etanol acuoso. Los sólidos y líquidos se separaron mediante una decantación como se describió anteriormente. La porción sólida húmeda pesó 525 libras (238.13 kg) y fue 40% de masa seca. Un total de 525 libras (238.13 kg) del etanol desnaturalizado de 95% se añadió a los sólidos, resultando en una mezcla compuesta de aproximadamente 85% de etanol acuoso. Los sólidos y líquidos se separaron mediante una decantación como se describió anteriormente. La parte sólida pesó 354.5 libra (160.79 Kg) y fue 40% de masa seca. A esta masa, se añadió otras 700 libras (317.51kg) de etanol desnaturalizado, resultando en una mezcla de aproximadamente 95% de etanol acuoso. Los sólidos y líquidos se separaron mediante una decantación como se describió anteriormente. Los sólidos resultantes fueron aproximadamente 40 % de masa seca. Esta biomasa requiere 60% menos energía para secar, calculado en función del calor latente de agua y etanol .

En algunos experimentos (datos no mostrados) se probaron otros tipos de etanol desnaturalizado. El etanol desnaturalizado que contiene 95% de etanol y 5% de alcohol isopropílico se usó en una extracción, pero se encontró que no es tan eficaz como el de 95 % de etanol y 5 % de metanol. El uso de 100 % de etanol es una modalidad preferida de la presente invención, pero generalmente no está disponible debido a limitaciones de costo.

La corriente de permeado a partir del sistema de membrana se evaporó usando aún un lote fabricado en-casa. Las condiciones operativas fueron aproximadamente 80 durante la destilación al vacío. Todo el etanol en el permeado se evaporó. Estas etapas de extracción se repitieron tres veces, resultando en cuatro grupos de productos, tal como se muestra en la FIG. 13. Esto es porque en cada etapa de extracción, la polaridad cambia con la adición de agua a la mezcla, lo que permite la extracción de componentes diferentes en cada etapa. El producto 1 contuvo las proteínas de algas, y como resultado, retuvo el exceso de agua en el sistema que no se puede vaporizar bajo las condiciones operativas. El producto 2 contuvo los lípidos polares. El producto 3 contuvo los lípidos neutros. Por último, el producto 4 fue la biomasa residual, que contiene los co-productos potenciales, tales como los carotenoides .

Ejemplo 5 Deshidratación y Extracción de la Biomasa de Algas por Etanol Después de cosechar, la biomasa de algas contiene típicamente entre aproximadamente 0.1 a 0.5 % (v/v) de sólidos. Esto se puede deshidratar usando cualquiera de los métodos conocidos en la industria de las algas, que incluyen, pero sin limitarse a filtración de membrana, centrifugación, calentamiento, sedimentación o flotación. La floculación puede ayudar en la flotación o sedimentación. El resultado típico de los métodos es una suspensión de algas que contiene aproximadamente 10% v/v de sólidos. Para deshidratar además, otro método de deshidratación se puede usar para eliminar una parte del agua libre remanente para obtener la concentración de sólidos más cercanas a 40% v/v. Sin embargo, el costo de la deshidratación aumenta exponencialmente después de que se lleva a cabo la primera deshidratación. Una ventaja de los sistemas y métodos descritos en la presente invención es que toma en consideración la extracción y fraccionamiento de una masa de algas que ha experimentado sólo una ronda de deshidratación.

Un ejemplo de el proceso puede ser que en la primera ronda de extracción, a continuación del protocolo descrito en el Ejemplo 3, 1000 libras (453.59kg) de biomasa húmeda que contienen 90% de agua pura y se mezclan con 1000 libras (453.59kg) de etanol desnaturalizado (95% de EtOH y 5% de MeOH) , resultando en una mezcla de solvente de aproximadamente 50% de etanol acuoso. La biomasa resultante (350 libras (158.75kg) ) es 40% seca. La composición de solvente de estos sólidos húmedos es 50% de etanol acuoso. Con otras 350 libras (158.75kg) de etanol desnaturalizado, la composición de la mezcla sería de aproximadamente 81% de etanol acuoso. La biomasa resultante (235 libras (106.59kg) ) es 40% de materia seca. La composición de solvente de estos sólidos húmedos es 81% de etanol acuoso. Con otras 470 libras (213.18kg) de etanol desnaturalizado, la composición de la mezcla sería de aproximadamente 95% de etanol acuoso. Los sólidos resultantes serian 40% secos con aproximadamente 95% de etanol. Esta biomasa húmeda requiere 60% menos energía para secar en función del calor latente del agua y etanol . En este caso, 100 libras (45.35kg) de algas se extrajeron usando 1820 libras etanol (825.53 kg) . Cuando se comparó con el Ejemplo 3, en donde el material de partida fue 40% de sólidos de algas, 350 libras (158.75kg) del equivalente de algas secas se extrajo con 2085 libras (945.74kg) de etanol.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para extraer selectivamente proteínas de algas de una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesto de células de algas intactas, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesto de células de algas intactas que comprender proteínas globulina, proteínas albúmina, proteínas glutelina, y proteínas prolamina; b. calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una primera mezcla de extracción caliente compuesta de una primera fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas globulina, y una primera fase sustancialmente sólida compuesta de proteínas albúmina, proteínas glutelina, y proteínas prolamina; c. separar al menos una porción de la primera fase sustancialmente líquida, que comprende proteínas globulina, de la primera fase sustancialmente sólida; d. mezclar la primera fase sólida con agua y calentar para generar una segunda mezcla de extracción caliente compuesta de una segunda fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas albúmina, y una segunda fase sustancialmente sólida compuesta de proteínas glutelina y proteínas prolamina; e. separar al menos una porción de la segunda fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas albúmina, de la segunda fase sustancialmente sólida; f. mezclar la segunda fase sustancialmente sólida con agua y calentar para generar una tercera mezcla de extracción caliente compuesta de una tercera fase sustancialmente líquida y una tercera fase sustancialmente sólida; g. elevar el pH de la tercera mezcla de extracción caliente; h. separar al menos una porción de la tercera fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas glutelina, de la tercera fase sustancialmente sólida compuesta de proteínas prolamina; i. calentar la tercera fase sustancialmente sólida y mezclar con un conjunto solvente para generar una cuarta mezcla de extracción caliente compuesta de una cuarta fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas prolamina, y una cuarta fase sustancialmente sólida; y j . separar al menos una porción de la cuarta fase sustancialmente líquida, compuesta de proteínas prolamina, de la cuarta fase sustancialmente sólida, en donde la primera fase sustancialmente líquida tiene una concentración de proteína albúmina mayor que la segunda, tercera, y cuarta fases sustancialmente líquidas, la segunda fase sustancialmente líquida tiene una concentración de proteína globulina mayor que la primera, tercera, y cuarta fases sustancialmente líquidas, la tercera fase sustancialmente líquida tiene una concentración de proteína glutelina mayor que la primera, segunda, y cuarta fases sustancialmente líquidas, y la cuarta fase sustancialmente líquida tiene una concentración de proteína prolamina mayor que la primera, segunda y tercera fases sustancialmente líquidas.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más etapas de separación se realizan por al menos un método seleccionado del grupo que consiste de centrifugación, filtración, flotación, y sedimentación.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura caliente por un tiempo seleccionado antes de la separación.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura caliente durante entre aproximadamente 20 a aproximadamente 60 minutos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a una temperatura caliente durante entre aproximadamente 45 a aproximadamente 90 minutos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una de la primera, segunda, tercera, y cuarta mezcla de extracción caliente se mantiene a aproximadamente 50° C.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cuarta fase sustancialmente sólida está compuesta de lípidos.

8. Un método para extraer selectivamente proteínas globulina de una biomasa de algas o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas de agua salada sustancialmente intactas, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesto de células de algas intactas que comprende proteínas globulina y proteínas albúmina; b. calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una mezcla de extracción compuesta de una fase líquida caliente compuesta de proteínas globulina, y una fase sustancialmente sólida caliente compuesta de proteínas albúmina; y c. separar al menos una porción de la fase líquida caliente, compuesta de proteínas globulina, de la fase sustancialmente sólida caliente, en donde la fase líquida tiene una concentración de proteínas globulina mayor que la fase sustancialmente sólida y la fase sustancialmente sólida tiene una concentración de proteínas albúmina mayor que la fase líquida.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada se mantiene a aproximadamente 50° C durante al menos una porción de la etapa de calentar y mezclar .

10. Un método para extraer selectivamente proteínas albúmina de una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas sustancialmente intactas, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada compuesta de células de algas intactas que comprende proteínas albúmina y proteínas glutelina; b. calentar y mezclar la biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada para generar una mezcla de extracción compuesta de una fase sustancialmente líquida caliente compuesta de proteínas albúmina, y una fase sustancialmente sólida caliente compuesta de proteínas glutelina; y c. separar al menos una porción de la fase sustancialmente líquida caliente, compuesta de proteínas albúmina, de la fase sustancialmente sólida caliente, en donde la fase sustancialmente líquida caliente tiene una concentración de proteínas albúmina mayor que la fase sustancialmente sólida caliente y la fase sustancialmente sólida caliente tiene una concentración de proteínas glutelina mayor que la fase sustancialmente líquida caliente.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de biomasa de algas de agua salada o cultivo de algas de agua salada y agua se mantiene a aproximadamente 50° C durante al menos una porción de la etapa de calentar y mezclar.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjunto solvente comprende etanol.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjunto solvente comprende un alcohol .

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjunto solvente comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo.

15. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el conjunto solvente comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo .

16. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el conjunto solvente comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetato de etilo, y acetonitrilo.