KR20110114626A - 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법 - Google Patents

면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법 Download PDF

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Abstract

각 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 각 알레르겐을 효율적으로 추출하여, 환원제를 사용하지 않고 항체에 결합된 금 콜로이드의 붕괴에 따른 비특이반응을 없앰으로써, 신속하고 정확하게 알레르겐을 검출하는 것이다. 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체와, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피도프를 인식하는 단일클론항체가 고정된 전개지지체와, 피검시료로부터 SDS 등의 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 SDS 등의 음이온성 계면활성제와 Tween 20 등의 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 알레르겐 측정샘플과, 전개액을 사용하여, 전개액을 전개지지체에 전개시킨 후, 금 콜로이드의 집적 유무에 따라 알레르겐을 검출하는 면역크로마토그래피법에 있어서, FBS가 적어도 10% 포함되어 있는 전개액을 사용한다.

Description

면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법{ALLERGEN DETECTION METHOD USING IMMUNOCHROMATOGRAPHY}
본 발명은 각종 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 사용하여 각 알레르겐을 추출하고, 각 알레르겐이 변성/미변성의 어떠한 상태에 있든 음이온성 계면할성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 효율적으로 추출하여, 항체에 결합된 금 콜로이드의 붕괴에 따른 비특이반응을 억제함으로써, 신속하게 검출할 수 있는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나, 이에 사용할 수 있는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트에 관한 것이다.
자연환경의 감소, 자동차나 공장 등에서 배출되는 배기가스, 주택사정, 혹은 음식물의 변화 등 다양한 인자로 인해, 현재 3명 중 1명이 무언가의 알레르기질환을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히, 음식물 알레르기는 식품 중에 포함된 알레르기 유발물질(이하, 음식물 알레르겐이라 한다)의 섭취가 일으키는 유해한 면역반응으로, 피부염, 천식, 소화관 장애, 아나필랙시스(anaphylaxis) 쇼크 등을 일으키며, 이와 같은 음식물 알레르기 환자가 증가하고 있기 때문에, 의학 및 식품산업상 심각한 문제를 야기하고 있다. 이러한 위해(危害)들은 죽음에 이르게 할 수도 있으므로 미연에 처치를 할 필요가 있다. 그 때문에 표시를 통해 소비자에게 정보를 제공할 필요성도 높아지고 있어, FAO/WHO 합동 식품규격 위원회는 알레르기 물질로서 알려져 있는 8종의 원재료를 포함하는 식품에서는 그것을 포함한다는 취지의 표시에 대해 합의하였으며, 가맹국에서 각 국의 제도에 적합한 표시방법을 검토하기로 하였다(1999년 6월). 일본에서는 과거의 건강 위해 등의 정도, 빈도를 고려하여 중증의 알레르기 증상을 일으킨 실적이 있는 24품목의 식품에 대해 그 표시방법이 정해졌다(2002년 4월부터 시행). 알레르기를 일으키는 식품으로서는 달걀류, 우유류, 육류, 어류, 갑각류 및 연체동물류, 곡물류, 콩류 및 너트류, 과실류, 채소류, 맥주 효모 또는 젤라틴 등이 알려져 있다.
상기의 알레르겐을 신속하고 간단하게 검출하기 위해, 항원-항체에 의한 특이적 반응을 이용하여 특정 항원 또는 항체로 이루어진 피검출물질을 검출하는 면역측정법은 시료 중의 피검출물질을, 미립자에 감작시킨 항체 또는 항원과 면역반응에 의해 결합시켜, 결합으로 인해 발생하는 미립자의 응집상태를 측정하는 응집법이 간편한 면역측정법으로, 특히 육안판정이 가능한 점에서 일반적으로 사용되고 있는 방법이다.
또한, 시료 중의 피검출물질에, 방사성 동위원소, 효소 또는 형광물질로 이루어진 표식물질에 의해 라벨링한 항체 또는 항원을 면역반응에 의해 결합시켜, 이 결합된 표식물질을 측정하는 방사면역측정법, 효소면역측정법 혹은 형광면역측정법도 채택되고 있다. 이들 면역측정법에서는 경합형 반응, 샌드위치형 반응이 널리 사용되고 있다. 이들 중, 소위 샌드위치형 반응의 측정법으로서 면역크로마토그래피법이 알려져 있으며(예를 들면, 특허문헌 1 참조), 항원항체반응에 기인하는 높은 특이성 뿐만 아니라, 간이, 신속을 특징으로 하는 다양한 알레르겐 검출키트가 판매되고 있다.
이러한 면역크로마토그래피법에 적용되는 시료로서는 생체시료나 식품으로부터의 추출물 등이 있는데, 시료의 종류에 따라서는 검체가 존재하지 않음에도 불구하고 포착부위에서 연한 색깔을 띠는 소위 비특이반응을 발생시키는 일이 있어, 검사시 정확도의 저하를 초래하는 일이 있었다. 때문에, 완충액 중에 포스포릴콜린기를 갖는 중합체를 0.005~0.3w/v%의 농도로 함유하며, 이 중합체의 수평균분자량이 40,000 이상인 것을 특징으로 하는, 측정시의 비특이적 응집 및 비특이반응을 방지함으로써 높은 정확도로 측정할 수 있게 하는 전개용매(예를 들면, 특허문헌 2 참조)가 제안되고 있다.
또한, 상기 면역측정법에서는 단백질에 가열이나 가압 등으로 인해 변성 등이 발생한 경우, 측정결과가 낮아지거나 측정할 수 없는 케이스가 인정되고 있었다. 특정 원재료의 검사방법으로서 일본 후생노동성으로부터 통지를 받은 식안발 제0122001호에 실려 있는 샌드위치 ELISA법에서는, 가열한 피검시료로부터 각 알레르겐을 충분히 추출하기 위해, 변성제 및 환원제 (2-머켑토에탄올)을 이용한 추출용액을 사용하여 추출하는 방법이 채택되고 있다. 이는 종래부터 이용되어 온, 단백질 분석에 사용되는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동법의 샘플 조제방법이 응용되고 있으며, 피검시료로부터 각 알레르겐의 추출효율을 높이기 위해서는 변성제와 환원제가 필요불가결하다고 생각되고 있었다. 또한, 이들을 면역크로마토그래피법에 적응한 경우, 많은 비특이반응이 보이기 때문에 정확한 검사를 할 수 없어, 변성 단백질을 측정할 때에 문제가 되고 있었다.
본 출원인은 변성제 및 환원제를 이용한 추출용액을 사용하여 추출하여 면역크로마토그래피법에 적응한 경우라도, 금 콜로이드의 붕괴에 따른 비특이반응을 억제하여 신속하고 정확하게 알레르겐을 검출할 수 있는 면역크로마토그래피법을 제안하고 있다(예를 들면, 특허문헌 3 참조). 해당방법에서는 가열한 피검시료로부터 각 알레르겐을 충분히 추출하여, 더 간편한 면역크로마토그래피법에 의해 검사가 가능하게 되었기 때문에, 정확도와 간편성 면에서 비약적으로 향상될 수 있었다. 그러나, 사용하는 환원제 (2-머켑토에탄올)에서는 특이한 냄새가 나는 점, 및 2-머켑토에탄올이 2008년 7월 1일부터 독극물로서 지정된 점 때문에, 식품제조공장 등에서 간편하게 사용하기가 곤란해졌었다. 때문에, 보다 안전하고 효율적인 추출방법과, 이들을 면역크로마토그래피법에 적응한 경우 비특이반응이 보이지 않아 정확한 검사가 가능한 면역크로마토그래피법이 요구되고 있었다.
특허문헌 1 : 일본특허공개 평5-010950호 공보 특허문헌 2 : 일본특허공개 2003-344406호 공보 특허문헌 3 : 일본특허공개 2007-278773호 공보
본 발명의 과제는 각 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 각 알레르겐을 추출하고, 각 알레르겐이 변성/미변성의 어떠한 상태에 있든 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 효율적으로 추출하여, 나아가 항체에 결합된 금 콜로이드의 붕괴에 따른 비특이반응을 억제함으로써, 신속하고 정확하게 알레르겐을 검출할 수 있는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나, 이에 사용할 수 있는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 가열한 피검시료로부터 각 알레르겐을 충분히 추출하기 위해 필요불가결하다고 생각되었었던 2-머켑토에탄올을 사용하지 않고, 각 알레르겐이 변성/미변성의 어떠한 상태에 있든 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 효율적으로 추출할 수 있는 점, 그리고 간편하게 검출할 수 있는 면역크로마토그래피법에 있어서, 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 전개액을 사용하면 상기 과제를 해결할 수 있는 점을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 (1) 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체와, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가 소정의 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 포함하는 전개액을 사용하여, 전개지지체에 전개시킨 후, 금 콜로이드의 집적 유무에 따라 알레르겐을 검출하는 면역크로마토그래피법에 있어서, 소태아혈청(FBS)이 적어도 10중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나, (2) 소태아혈청(FBS)이 적어도 30중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)기재의 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나, (3) 소태아혈청(FBS)이 적어도 50중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (2)기재의 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나, (4) 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가, 우유 알레르겐의 주요성분인 αs1 카제인, 유청(whey) 알레르겐의 주요성분인 β락토글로블린, 난백 알레르겐인 오브알부민(ovalbumin)과 오보뮤코이드(ovomucoid), 소맥(밀) 알레르겐의 주요성분인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 땅콩의 주요단백질인 Arah1 중에서 선택되는 변성 및 미변성 알레르겐을 특이적으로 인식하는 2종류의 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법, (5) 음이온성 계면활성제로서 도데실황산나트륨을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출법이나, (6) 비이온성 계면활성제로서 Tween 20을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 (7) 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체를 담지시킨 금 콜로이드 표지항체 담지체, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알르레겐에 대한 단일클론항체가 소정의 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 변성 및 미변성 알레르겐을 추출하기 위한 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액과, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 담지시킬 수 있는 샘플용 담체와, 소태아혈청(FBS) 또는 소태아혈청(FBS)을 포함하는 전개액을 구비한 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트나, (8) 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가, 우유 알레르겐의 주요성분인 αs1 카제인, 유청 알레르겐의 주요성분인 β락토글로블린, 난백 알레르겐인 오브알부민과 오보뮤코이드, 소맥 알레르겐의 주요성분인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 땅콩의 주요단백질인 Arah1 중에서 선택되는 변성 및 미변성 알레르겐을 특이적으로 인식하는 2종류의 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 상기 (7) 기재의 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트나, (9) 음이온성 계면활성제로서 도데실황산나트륨을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (7) 또는 (8) 기재의 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트에 관한 것이다.
본 발명의 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법에 따르면, 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용한 경우에도, 항체에 결합된 금 콜로이드의 붕괴에 따른 비특이반응을 억제하여 신속하고 정확하게 각종 알레르겐을 검출할 수 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법으로서는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체와, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가 소정 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 포함하는 전개액을 사용하여, 전개지지체에 전개시킨 후, 금 콜로이드의 집적 유무에 따라 알레르겐을 검출하는 면역크로마토그래피법에 있어서, 소태아혈청(FBS)이 적어도 10중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 소태아혈청(FBS)이 20~100중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것이 바람직하고, 30~100중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 40~100중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것이 특히 바람직하고, 50~100중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트로서는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체를 담지시킨 금 콜로이드 표지항체 담지체, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가 소정의 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 변성 및 미변성 알레르겐을 추출하기 위한 음이온성 계면활성체와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액과, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 담지시킬 수 있는 샘플용 담체와, 소태아혈청(FBS) 또는 소태아혈청(FBS)을 포함하는 전개액을 구비한 검출키트이면 특별히 제한되지 않지만, 상기 전개액으로서, 소태아혈청(FBS)이 적어도 10중량% 포함되어 있는 전개액, 바람직하게는 적어도 20중량% 포함되어 있는 전개액, 보다 바람직하게는 적어도 30중량% 포함되어 있는 전개액, 특히 바람직하게는 적어도 40중량% 포함되어 있는 전개액, 보다 더 바람직하게는 적어도 50중량%, 예를 들면 50~100중량% 포함되어 있는 전개액을 구비한 것이 바람직하다.
상기 전개액에서의 소태아혈청(FBS) 농도가 10중량% 미만인 경우, 비특이반응을 일으키기 쉬어 바람직하지 않다. 또한, 전개액은 완충액 중에 소태아혈청(FBS) 외에, 필요에 따라 다른 계면활성제, 방부제, 무기염 등의 각종 첨가제를 현탁 혹은 유탁 또는 용해시켜 조제할 수 있다. 완충액은 그 pH가 4~10, 특히 pH 6~8가 바람직하며, 예를 들어 인산완충액(PBS)이나 트리스완충액 등을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체의 제작방법은 종래 공지의 방법을 포함하여 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액에, 2mM 붕산완충액(pH 9.0)에 단일클론항체를 용해한 용액을 첨가하여, 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 첨가하여 다시 15분간 반응시키고 원심분리하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 금 콜로이드 표지항체 담지체는 상기 제작한 금 콜로이드 표지항체를 예를 들면 글래스울제 컨쥬게이트 패드에 도포하여 건조시킴으로써 제작할 수 있다.
상기 전개지지체는 금 콜로이드 표지항체와 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체를 포함하는 완충액을 예를 들면 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시킨 후, 블록킹 처리함으로써 제작할 수 있다.
변성 및 미변성 알레르겐을 추출하여 측정샘플을 조제할 때에 사용되는 완충액에 있어서, 음이온성 계면활성제로서는 고급알콜 황산에스테르염, 알킬나프탈렌설폰산염, 알킬벤젠설폰산염, 알킬인산에스테르염 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 도데실황산나트륨(SDS)을 바람직하게 예시할 수 있다. 티오황산염으로서는 티오황산나트륨, 티오황산칼륨, 티오황산암모늄 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 티오황산나트륨을 바람직하게 예시할 수 있다. 비이온성 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 솔비탄지방산에스테르 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄모노라우레이트(Tween 20)를 바람직하게 예시할 수 있다. 상기 음이온성 계면활성제의 농도는 0.1~2.0%, 바람직하게는 0.25%~0.5%이며, 티오황산염의 농도는 0.1~5.0%, 바람직하게는 0.1%~1.0%이고, 비이온성 계면활성제의 농도는 0.01~1.0%, 바람직하게는 0.05~0.2%이며, 이들 농도범위의 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용하면, 추출효율이 높고 또한 비특이반응을 억제할 수 있는 점에서 바람직하다.
상기 측정샘플을 담지시킬 수 있는 샘플용 담체로서는 글래스울제 샘플 패드를 예시할 수 있다. 그리고, 이 샘플용 담체, 상기 금 콜로이드 표지항체 담지체, 상기 전개지지체, 바람직하게는 이 전개지지체의 타단에 전개액을 흡수하는 흡수패드 등의 흡수체를 순차적으로 연결함으로써 면역크로마토그래피 측정용 시험편으로 할 수 있다. 그리고, 샘플용 담체에 측정샘플을 스폿하고, 소태아혈청을 포함하는 전개액에 침지하면, 측정샘플 중의 알레르겐은 모세관 현상 등에 의해 이동하여 금 콜로이드 표지항체와 결합하고, 이 항원항체 복합체는 전개지지체 상을 또한 모세관 현상 등에 의해 이동하여, 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가 고정된 소정 위치에서 항원항체 복합체가 포착되어, 소정 위치에 나타나는 착색 라인의 유무에 따라 알레르겐을 검출할 수 있다.
상기 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체로서는 우유 알레르겐의 주요성분인 αs1 카제인, 유청(whey) 알레르겐의 주요성분인 β락토글로블린, 난백 알레르겐인 오브알부민과 오보뮤코이드, 소맥 알레르겐의 주요성분인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 땅콩의 주요단백질인 Arah1 중에서 선택되는 변성 및 미변성 알레르겐을 특이적으로 인식하는 2종류의 단일클론항체를 바람직하게 예시할 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명자들에 의해 제작된 항 αs1 카제인 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-BP-10263)가 생산하는 항 αs1 카제인 단일클론항체 Pas1CN1이나, 하이브리도마(FERM-BP-10264)가 생산하는 항 αs1 카제인 단일클론항체 Pas1CN2를 들 수 있으며, 항 β락토글로블린 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-ABP-11237)가 생산하는 항 β락토글로블린 단일클론항체 PβLG3이나, 하이브리도마(FERM-ABP-11238)가 생산하는 항 β락토글로블린 단일클론항체 PβLG4를 들 수 있다. 하이브리도마(FERM-BP-10263) 및 하이브리도마(FERM-BP-10264)는 2005년 2월 24일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수탁되어 있으며, 하이브리도마(FERM-ABP-11237) 및 하이브리도마(FERM-ABP-11238)는 2010년 2월 22일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수령되어 있다.
또한, 하이브리도마(FERM-ABP-11235)가 생산하는 항 오브알부민 단일클론항체 PDOA3이나, 하이브리도마(FERM-ABP-11236)가 생산하는 항 오브알부민 단일클론항체 PDOA4를 들 수 있으며, 항 오보뮤코이드 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-BP-10279)가 생산하는 항 오보뮤코이드 단일클론항체 PNOM1이나, 하이브리도마(FERM-BP-10280)가 생산하는 항 오보뮤코이드 단일클론항체 PNOM2나, 하이브리도마(FERM-BP-10277)가 생산하는 항 오보뮤코이드 단일클론항체 PDOM1이나, 하이브리도마(FERM-BP-10278)가 생산하는 항 오보뮤코이드 단일클론항체 PDOM2를 들 수 있다. 하이브리도마(FERM-ABP-11235) 및 하이브리도마(FERM-ABP-11236)는 2010년 2월 22일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수령되어 있으며, 하이브리도마(FERM-BP-10279), 하이브리도마(FERM-BP-10280), 하이브리도마(FERM-BP-10277), 및 하이브리도마(FERM-BP-10278)은 2005년 2월 24일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수탁되어 있다.
또한, 항 소맥 글리아딘 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-BP-10267)가 생산하는 항 소맥 글리아딘 단일클론항체 PGL1이나, 하이브리도마(FERM-BP-10268)가 생산하는 항 소맥 글리아딘 단일클론항체 PGL2을 들 수 있다. 하이브리도마(FERM-BP-10267) 및 하이브리도마(FERM-BP-10268)는 2005년 2월 24일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수탁되어 있다.
또한, 항 메밀 단백질 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-ABP-11241)가 생산하는 항 24kDa단백질 단일클론항체 PBW5나, 하이브리도마(FERM-BP-10273)가 생산하는 항 76kDa단백질 단일클론항체 PBW2를 들 수 있다. 하이브리도마(FERM-ABP-11241)는 2010년 2월 22일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수령되어 있으며, 하이브리도마(FERM-BP-10273)는 2005년 2월 24일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수탁되어 있다.
항 땅콩 Arah1단백질 단일클론항체로서, 하이브리도마(FERM-ABP-11240)가 생산하는 항 미변성 Arah1단백질 단일클론항체 PAh1-5나, 하이브리도마(FERM-ABP-11239)가 생산하는 항 미변성 Arah1단백질 단일클론항체 PAh1-4를 들 수 있다. 하이브리도마(FERM-ABP-11240), 및 하이브리도마(FERM-ABP-11239)는 2010년 2월 22일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소: 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 쯔쿠바센터 중앙 제6)에 수령되어 있다.
이하, 실시예에 따라 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되지 않는다.
실시예 1
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 오브알부민의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 PDOA4(FERM-ABP-11236)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5mL에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 PDOA3(FERM-ABP-11235)의 MAb 용액을 조제하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 1% 스킴 밀크를 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드, 피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 검출용 샘플로는 이하의 모델식육제품을 공시(供試)하였다.
1) 달걀 단백질의 조제
아키야마 등[특정 원재료(달걀) 측정 후생노동성 통지 ELISA법의 복수기관에 의한 평가연구. 식품위생학 잡지, 44, 2003, 213-219]에 따라, 시판하는 계란으로 달걀 단백질을 조제하였다.
2) 모델식육제품
정량시험을 위한 모델식품으로서 식육제품을 선택하여, 표 1에 나타낸 배합으로 각 농도의 달걀 단백질을 포함하는 모델식육제품을 제작하였다. 붉은색 돼지고기는 돼지로스육에서 지방, 힘줄을 제거하고 기계에 의해 5mm로 저민 것을 사용하였다. 각 배합에 따라 첨가물을 계량하여 푸드 프로세서로 혼합한 후, 염화비닐 튜브에 충전하였다.
Figure pct00001
3) 가열온도/시간
가열은 75℃에서 30분간 가열한 것을 준비하였다. 가열 후, 푸드 프로세서로 균일하게 한 것을 검출용 샘플로 삼았다.
4) 샘플 전처리
검출용 샘플 1g을 재서, 여기에 추출액으로서 0.5% SDS와 티오황산나트륨이 최종농도로 0%~10.0% 함유되는 PBS를 19ml 첨가하여 교반하고, 끓는 물속에서 1시간 가열하여 냉각 원심한 후, 그 상청액을 측정샘플로 하였다.
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 2에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00002
표 2에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0%~5.0%일 때 2ppm까지 검출되었고, 0.1%~2.0%에서는 (+w)로 판정되었으며, 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합시킨 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 2
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 추출한 오브알부민의 검출]
1. 재료 및 방법
1) 이하의 '가열온도/시간', '샘플 전처리' 및 '면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인'을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2) 가열온도/시간
가열은 75℃에서 30분과 121℃에서 20분 가열한 것을 준비하였다.
3) 샘플 전처리
가열 후, 푸드 프로세서로 균일하게 한 것을 검출용 샘플로 삼았다. 검출용 샘플 1g을 재서, 거기에 0.5% SDS를 포함하는 PBS를 19ml 첨가하여 교반하고, 끓는 물속에서 1시간 가열하여 냉각 원심한 후, 상청액을 측정샘플[1]로 삼았다. 또한, 측정샘플[1]에 최종농도가 0.2%가 되도록 Tween 20을 첨가한 것을 측정샘플[2]로 삼았다. 또한, 0.5% SDS 및 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS를 19ml 첨가하여 교반하고, 끓는 물속에서 1시간 가열하여 냉각 원심한 후, 상청액을 측정샘플[3]으로 삼았다. 상기 측정샘플[2]는 SDS 추출 후에 Tween 20을 첨가하고 있기 때문에, 추출에 관여하는 것은 아니며, 면역크로마토그래피 키트로 샘플을 측정할 때에 Tween 20이 존재하고 있는 것이 면역크로마토그래피 키트의 감도에 관여하는 지를 검토하기 위한 것이며, 상기 측정샘플[3]은 SDS와 Tween 20을 공존시켜 추출하고 있기 때문에, 추출효율에 Tween 20이 공헌하는지를 검토하기 위한 것이다.
4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로서 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플[1], 측정샘플[2], 측정샘플[3]을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
표 3에 나타낸 바와 같이 75℃에서 30분간 가열한 모델식육제품에서는 모든 측정샘플에서 2ppm까지 (+)로 판정되었으며, 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 한편, 표 4에 나타낸 바와 같이, 121℃에서 20분간 가열한 모델식육제품에서는 측정샘플[3]에서 2ppm까지 (+w)로 판정되었으며, 달걀 단백질을 2ppm까지 검출할 수 있었다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 3
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 카제인의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 Pαs1CN2(FERM-BP-10264)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 Pαs1CN1(FERM-BP-10263)의 MAb 용액을 조제하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 0.1% 우피 젤라틴을 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드, 피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 유단백은 아키야마 등의 방법에 따라 홀스타인종의 신선유를 사용하여 조제하였다. 또한, 검출용 샘플로는 표 5에 나타낸 바와 같은 배합의 모델식육제품을 공시하고, 가열온도/시간, 샘플 전처리는 실시예 1과 동일한 조건에서 실시하였다.
Figure pct00005
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로서 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 6에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다,
Figure pct00006
표 6에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0%~2.0%일 때 2ppm까지 검출되었고, 0.1%~1.%까지 (+w)로 판정되었으며, 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 4
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 추출한 카제인의 검출]
1. 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 가열온도/시간, 샘플 전처리, 및 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인을 실시예 2와 동일한 조건에서 실시한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 7 및 표 8에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같이 측정샘플[3]에서 2ppm까지 (+w)로 판정되었으며, 유단백질을 2ppm까지 검출할 수 있었다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 측정샘플[3]과 같이 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 추출방법인 경우에 가장 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하게 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 5
[면역크로마토그래피법에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 유청(whey)의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 PβLG4(FERM-ABP-11238)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 PβLG3(FERM-ABP-11237)의 MAb 용액을 조제하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 0.1% 우피 젤라틴을 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드, 피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 유단백은 아키야마 등의 방법에 따라 홀스타인종의 신선유를 사용하여 조제하였다. 또한, 검출용 샘플로는 표 3에 나타낸 바와 같은 배합의 모델식육제품을 공시하고, 가열온도/시간, 샘플 전처리는 상기와 동일한 조건에서 실시하였다.
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 9에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00009
표 9에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0%~1.0일 때 2ppm까지 검출되었으며, 0.1%일 때 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 6
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 추출한 유청(whey)의 추출]
1. 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 가열온도/시간, 샘플 전처리, 및 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인을 실시예 2와 동일한 조건에서 실시한 것 이외에는 실시예 5와 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 7
[면역크로마토그래피법에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 소맥(밀) 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 PGL2(FERM-BP-10268)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 PGL1(FERM-BP-10267)의 MAb 용액을 조제하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 1% 우피 젤라틴을 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드, 피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 소맥 단백질은 아키야마 등의 방법에 따라 시판 밀가루를 사용하여 조제하였다. 또한, 검출용 샘플로는 표 12에 나타낸 바와 같은 배합의 모델식육제품을 공시하고, 가열온도/시간, 샘플 전처리는 상기와 동일한 조건에서 실시하였다.
Figure pct00012
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로서 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 13에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다,
Figure pct00013
표 13에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0%~10.0%일 때 2ppm까지 검출되었으며, 0.1%~5.0%까지는 (+)로 판정되었는데, 특히 0.1%~2.0%까지가 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 8
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 추출한 소맥 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 가열온도/시간, 샘플 전처리, 및 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인을 실시예 2와 동일한 조건에서 실시한 것 이외에는 실시예 7과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 14 및 표 15에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00014
Figure pct00015
표 14 및 표 15에 나타낸 바와 같이 모든 측정샘플에서 2ppm까지 (+)로 판정되었으며, 소맥 단백질을 2ppm까지 검출할 수 있었다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 또한, 측정샘플[3]과 같이 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 추출방법인 경우에 가장 시인성이 좋았기 때문에, 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 9
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 메밀 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 PBW2(FERM-BP-10273)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 pH 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 PBW5(FERM-ABP-11241)의 MAb 용액을 조제하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 1% 스킴밀크를 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드,피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 메밀 단백질은 아카야마 등의 방법에 따라 시판 메밀가루를 사용하여 조제하였다. 또한, 검출용 샘플로는 표 16에 나타낸 바와 같은 배합의 모델식육제품을 공시하고, 가열온도/시간, 샘플 전처리는 상기와 동일한 조건에서 실시하였다.
Figure pct00016
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로서 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 17에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다,
Figure pct00017
표 17에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0.1%~5.0%일 때 2ppm까지 검출되었고, 특히 0.5%와 5.0%에서는 (+w)로 판정되었으며, 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 10
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비온성 계면활성제로 추출한 메밀 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 가열온도/시간, 샘플 전처리, 및 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인을 실시예 2와 동일한 조건에서 실시한 것 이외에는 실시예 9와 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 18 및 표 19에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00018
Figure pct00019
표 18에 나타낸 바와 같이 75℃에서 30분간 가열한 모델식육제품에서는 측정샘플[3]에서 2ppm까지 (+-)로 판정되었으며, 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 또한, 표 19에 나타낸 바와 같이 121℃에서 20분간 가열한 모델식육제품에서는 측정샘플[3]에서 2ppm까지 (+w)로 판정되었으며, 메밀 단백질을 2ppm까지 검출할 수 있었다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 11
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 티오황산염으로 추출한 땅콩 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
(1) 금 콜로이드 표지항체의 제작
2mM 붕산완충액(pH 9.0)으로 1mg/ml가 되도록 PAh1-4(FERM-ABP-11239)의 MAb 용액을 조제하였다. 미리 0.2M 탄산칼륨용액으로 9.0으로 조제한 금 콜로이드 용액(시그마사 제품) 5ml에 MAb 용액을 500μl 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 후, 10% BSA 용액을 635μl 첨가하여 다시 15분간 반응시켰다. 원심분리를 실시하여 1% BSA 용액으로 OD525=1.0이 되도록 조제하였다.
(2) 항체 고정화 멤브레인의 제작
PBS로 4mg/ml가 되도록 PAh1-5(FERM-ABP-11240)의 MAb 용액을 조제하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선형태로 도포하여 건조시켰다. 그 후, 1% 스킴밀크를 포함하는 TBS로 37℃에서 1시간 블록킹한 후, TBS로 세정하여 건조시켰다.
(3) 면역크로마토그래피 스트립의 조립
항체 고정화 멤브레인 뿐만 아니라, 피검액 스폿용인 글래스울제 샘플 패드, 피검액 흡수용인 글래스울제 흡수패드를 별도로 준비하여, 샘플 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수패드의 순으로 각각 부착함으로써, 면역크로마토그래피 스트립으로 만들었다. 메밀 단백질은 아키야마 등의 방법에 따라 탈지 땅콩을 사용하여 조제하였다. 또한, 검출용 샘플로는 표 20에 나타낸 바와 같은 배합의 모델식육제품을 공시하고, 가열온도/시간, 샘플 전처리는 상기와 동일한 조건에서 실시하였다.
Figure pct00020
(4) 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인
조제한 금 콜로이드 표지항체를 20μl, 전개액으로서 소태아혈청(FBS)을 30μl, 측정샘플을 50μl 첨가하고 면역크로마토그래피 스트립에 공시하여, 검출을 확인하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 21에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00021
표 21에 나타낸 바와 같이 티오황산나트륨 농도가 0.1%~10.0%일 때 2ppm까지 검출되었고, 특히 0.1%~2.0%까지가 (+w)로 판정되었으며, 가장 시인성이 좋았다. 0ppm에서는 비특이반응은 없었다. 이 때문에, 음이온성 계면활성제와 티오황산염을 조합한 추출방법인 경우에 추출효율이 높고, 또한 전개액으로 FBS를 사용함으로써 비특이반응이 없으며, 신속하고 정확한 면역크로마토그래피 키트를 구축하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 12
[면역크로마토그래피에 의한 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 추출한 땅콩 단백질의 검출]
1. 재료 및 방법
1) 모델식육제품의 가열온도/시간, 샘플 전처리, 및 면역크로마토그래피에 의한 검출의 확인을 실시예 2와 동일한 조건에서 실시한 것 이외에는 실시예 11과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 결과
그 검출결과를 표 22 및 표 23에 나타내었다. 판정은 라인이 강한 쪽에서부터 순서대로 (+), (+w), (+-)로 표기하고, 음성을 (-)표기로 하였다.
Figure pct00022
Figure pct00023
우유 알레르겐, 난백 알레르겐, 소맥 알레르겐, 메밀 알레르겐, 땅콩 알레르겐 등의 음식물 알레르겐을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법이나 이에 사용할 수 있는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트를 제공한다.
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11235 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11236 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11237 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11238 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11239 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11240 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-11241 20100222 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10263 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10264 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10267 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10268 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10273 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-10277 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10278 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10279 20050224 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM-BP-10280 20050224

Claims (9)

  1. 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체와, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가 소정의 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 포함하는 전개액을 사용하여, 전개지지체에 전개시킨 후, 금 콜로이드의 집적 유무에 따라 알레르겐을 검출하는 면역크로마토그래피법에 있어서, 소태아혈청(FBS)이 적어도 10중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    소태아혈청(FBS)이 적어도 30중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    소태아혈청(FBS)이 적어도 50중량% 포함되어 있는 전개액을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법.
  4. 제 1 항~제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가, 우유 알레르겐의 주요성분인 αs1 카제인, 유청(whey) 알레르겐의 주요성분인 β락토글로블린, 난백 알레르겐인 오브알부민과 오보뮤코이드, 소맥 알레르겐의 주요성분인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 땅콩의 주요단백질인 Arah1 중에서 선택되는 변성 및 미변성 알레르겐을 특이적으로 인식하는 2종류의 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출방법.
  5. 제 1 항~제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    음이온성 계면활성제로서 도데실황산나트륨을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출법.
  6. 제 1 항~제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비이온성 계면활성제로서 Tween 20을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피법에 의한 알레르겐 검출법.
  7. 변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체에 금 콜로이드를 결합한 금 콜로이드 표지항체를 담지시킨 금 콜로이드 표지항체 담지체, 상기 금 콜로이드 표지항체와는 다른 에피토프를 인식하는 변성 및 미변성 알르레겐에 대한 단일클론항체가 소정의 위치에 고정된 전개지지체와, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 변성 및 미변성 알레르겐을 추출하기 위한 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 완충액과, 알레르겐을 포함하는 식품 등의 피검시료로부터 음이온성 계면활성제와 티오황산염, 또는 음이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 사용하여 추출한 변성 및 미변성 알레르겐 측정샘플을 담지시킬 수 있는 샘플용 담체와, 소태아혈청(FBS) 또는 소태아혈청(FBS)을 포함하는 전개액을 구비한 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    변성 및 미변성 알레르겐에 대한 단일클론항체가, 우유 알레르겐의 주요성분인 αs1 카제인, 유청 알레르겐의 주요성분인 β락토글로블린, 난백 알레르겐인 오브알부민과 오보뮤코이드, 소맥 알레르겐의 주요성분인 글리아딘, 메밀의 주요단백질인 분자량 24kDa와 76kDa의 단백질, 땅콩의 주요단백질인 Arah1 중에서 선택되는 변성 및 미변성 알레르겐을 특이적으로 인식하는 2종류의 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    음이온성 계면활성제로서 도데실황산나트륨을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피용 알레르겐 검출키트.
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