CN101000349B - 前白蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定血清中的前白蛋白(PA)的试剂盒。所要解决的技术问题是提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。本发明提供的技术方案是：前白蛋白检测试剂盒，包括以下成份：a、一种使样品中PA抗原位点充分暴露，有利于与抗PA抗体试剂充分结合的PA反应剂；b、一种与人血清中的PA抗原有高度特异反应性的抗PA抗体试剂；c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液。所述的PA反应剂还包括表面活性剂和反应促进剂。所述的PA反应剂与抗PA抗体试剂按3∶1的比例混合，以作为单一试剂使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂盒，特别是测定血清中的前白蛋白(PA)的试剂盒，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
前白蛋白(PA)是肝细胞合成的一种血清蛋白，电泳时迁移在白蛋白之前，故名前白蛋白，参与血清中甲状腺素和视黄醇的运输，由4个相同的亚基组成，含色氨酸3.15$，分子量54890，消光系数(E280nm)13.6，半衰期1.9天。因半衰期很短，被用来观测肝功能受损及营养缺乏的早期诊断指标。
已知测定前白蛋白(PA)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、这些方法都存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样品需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种前白蛋白检测试剂的改进，所提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。
本发明提供的技术方案是：
前白蛋白检测试剂盒，包括以下成份：
a、一种使样品中PA抗原位点充分暴露，有利于与抗PA抗体试剂充分结合的PA反应剂，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1％-5％防腐剂、0.1％-1％的稳定剂、0.1-40％电解质和20％-80％高分子加速剂；
b、一种与人血清中的PA抗原有高度特异反应性的抗PA抗体试剂，包括抗PA抗体、0.001％-5％的抗氧化剂和1％-20％的稳定剂(抗氧化剂和稳定剂的含量均为与抗PA抗体的重量百分比)，还包括前述PA反应剂，该PA反应剂与抗PA抗体的配比为5：1-100：1；
c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括缓冲液20-100mmol/L、防腐剂0.01-19mmol/L和稳定剂0.1-50mmol/L。
所述的PA反应剂还包括0.1-10％的表面活性剂和0.1％-0.5％反应促进剂。
所述的PA反应剂与抗PA抗体试剂按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
本发明提供的方法是利用抗原抗体反应，加入反应剂(样品稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入抗PA抗体试剂；高特异反应性的抗PA抗体试剂与样本中相应的PA抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的PA含量成正比，在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知恒定的校准液比较，则可计算出样本中APOA I、APOB的含量。本发明方法及试剂操作简单、样本不用预稀释，采用血清型液体恒定值校准液后不需每批更改参数，准确度高、重复性好、抗干扰能力强。并且还适用于各种类型的全自动生化分析仪。
具体实施方式
前白蛋白检测试剂盒，包括以下成份：
a、一种使样品中PA抗原位点充分暴露，有利于与抗PA抗体试剂充分结合的PA反应剂(或样品稀释液)，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1％-5％防腐剂、0.1％-1％的稳定剂、0.1-40％电解质、20％-80％高分子加速剂，还可包括0.1-10％的表面活性剂和0.1％-0.5％反应促进剂(防腐剂、稳定剂、电解质、高分子加速剂、表面活性剂及反应促进剂的含量比例均为与PA反应剂的重量百分比)；
作为缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等，本发明优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-10，优选7.4-8.1。
作为表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有：Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用，这里不作限制。
作为电解质的实例可以阴离子或阳离子，本发明优选阳离子中的氯化钠(NaCl)。
作为加速剂的实例可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000，优选聚乙二醇6000。
作为防腐剂的实例可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂，本发明从环保角度考虑，优选广谱杀菌剂。
作为反应促进剂的实例可以是溴化己二甲胺、聚凝胺。
作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白、乙二醇、甘露糖醇、海藻糖。
b、一种与人血清中的PA抗原有高度特异反应性的抗PA抗体试剂，包括抗PA抗体、0.001％-5％的抗氧化剂和1％-20％的稳定剂(抗氧化剂和稳定剂的含量均为与抗PA抗体的重量百分比)，还包括前述PA反应剂，该PA反应剂与抗PA抗体的配比为5：1-100：1；
作为抗PA抗体的实例可以是羊抗人PA抗血清、马抗人PA抗血清、鼠抗人PA抗血清、兔抗人PA抗血清等；这些血清均可外购获得，也可自制。
作为抗氧化剂的实例可以是丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等；
作为抗氧化剂可以先溶解在10-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到抗PA抗体试剂中。
c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括缓冲液20-100mmol/L、防腐剂0.01-19mmol/L、稳定剂0.1-50mmol/L。
作为缓冲液的实例有PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐等缓冲液等
作为防腐剂的实例有叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂等，可以单独使用或几种混合使用；其中的防霉剂的实例有丙酸钠、脱氧乙酸等，也可单独使用或几种混合使用。
作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白、丙三醇、单糖、多糖等可以单独使用或几种混合使用。
可以单独使用或几种混合使用。
以上所述的所有生化原料和试剂均可外购获得。
本发明的PA浓度值为：第1点：50-200mg/L；优选150mg/L第2点250-350g/L；优选300g/L；第3点400-500g/L；优选450g/L；第4点550-700g/L；优选600g/L。液体血清型恒定值校准液按照确定的PA浓度值加入不同量的PA抗原(每个试剂盒配置4瓶)；PA抗原可直接外购，或者自制。
以上所述的前白蛋白检测试剂盒中均为双试剂(即试剂盒中包括PA反应剂、抗PA抗体试剂和液体血清型恒定值PA校准液三种成份)；也可将所述的PA反应剂与抗PA抗体试剂按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
PA检测试剂的制备实施例：
实施例一
1、PA反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 100mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 5％
NaCL(电解质) 20％
PEG-6000(高分子加速剂) 40％
广谱杀菌剂(防腐剂) 3％
溴化己二甲胺(反应促进剂) 0.3％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.5％
2、抗PA抗体试剂(R2)
反应剂(样品稀释液) 500ml
兔抗人PA抗血清 100ml
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂) 2％
甘露糖醇(稳定剂) 5％
3、液体血清型PA恒定值校准液
缓冲液 CAPSO 100mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 2mmol/L
稳定剂 乙二胺四乙酸二钠 2mmol/L
稳定剂 牛血清白蛋白 3mmol/L.
防霉剂 丙酸钠 2mmol/L
按照确定的PA恒定值浓度将相应的PA抗原加入上述液体血清型PA恒定值校准液中(一般根据不同PA恒定值浓度，配置4瓶液体血清型PA恒定值校准液)，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。
也可将(R1)与(R2)按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
实施例二
1、PA反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 5mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 0.1％
NaCL(电解质) 0.1％
PEG-6000(高分子加速剂) 20％
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.1％
聚凝胺(反应促进剂) 0.1％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.1％
2、抗PA抗体试剂(R2)
反应剂(样品稀释液) 5000ml
羊抗人PA抗血清 100ml
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂) 0.001％
氯化镁(稳定剂) 1％
3、液体血清型恒定值PA校准液
缓冲液CAPSO 20mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 0.01mmol/L
稳定剂 丙三醇 0.1mmol/L
稳定剂 牛血清白蛋白 0.01mmol/L.
防霉剂 脱氧乙酸 0.01mmol/L
按照确定的PA恒定值浓度将相应的PA抗原加入上述液体血清型PA恒定值校准液中(一般根据不同PA恒定值浓度，配置4瓶液体血清型PA恒定值校准液)，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。
也可将(R1)与(R2)按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
实施例三
1、PA反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 200mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 10％
NaCL(电解质) 40％
PEG-6000(高分子加速剂) 80％
广谱杀菌剂(防腐剂) 5％
聚凝胺(反应促进剂) 0.5％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 1％
2、抗PA抗体试剂(R2)
反应剂(样品稀释液) 5000ml
鼠抗人PA抗血清 50ml
二丁基羟基甲苯(抗氧化剂) 5％
丙三醇(稳定剂) 20％
3、液体血清型恒定值PA校准液
缓冲液 CAPSO 100mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 19mmol/L
稳定剂 乙二胺四乙酸二钠 45mmol/L
稳定剂 牛血清白蛋白 5mmol/L.
防霉剂 丙酸钠 19mmol/L
按照确定的PA恒定值浓度将相应的PA抗原加入上述液体血清型PA恒定值校准液中(一般根据不同PA恒定值浓度，配置4瓶液体血清型PA恒定值校准液)，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。
也可将(R1)与(R2按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
以下描述测定的具体操作步骤：
一、双试剂基本操作：
(仪器：具有340nm波长，37℃恒温装置的生化分析仪)
结果计算：
式中：ΔAU以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS校准液中PA的浓度
二、单试剂基本操作：
(仪器：具有340nm波长，37℃恒温装置的生化分析仪)
结果计算：
式中：ΔAU以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS校准液中PA的浓度
储存及稳定性：本发明提供的试剂盒在2～8℃避光保存可稳定一年。
Claims (1)
1.前白蛋白检测试剂盒，包括以下成份：
1)、PA反应剂
磷酸盐缓冲液100mmol/L，聚氧乙烯月桂醚5％，NaCl 20％，PEG-6000 40％，广谱杀菌剂3％，溴化己二甲胺0.3％，乙二胺四乙酸二钠0.5％，其中，所述百分含量比例均为与PA反应剂的重量百分比；
2)、抗PA抗体试剂
PA反应剂500ml，兔抗人PA抗血清100ml，丁基羟基茴香醚2％，甘露糖醇5％，其中，丁基羟基茴香醚和甘露糖醇的含量比例均为与兔抗人PA抗血清的重量百分比；
3)、液体血清型PA恒定值校准液
缓冲液CAPSO 100mmol/L，广谱杀菌剂2mmol/L，乙二胺四乙酸二钠2mmol/L，牛血清白蛋白3mmol/L，丙酸钠2mmol/L；按照确定的PA恒定值浓度将相应的PA抗原加入上述液体血清型PA恒定值校准液中，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。
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