CN101368948A - 免疫球蛋白m检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫球蛋白M检测试剂，具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强、适用于各种类型的全自动生化分析仪的免疫球蛋白M(IgM)检测试剂。包括以下成份a.使样品中IgM抗原位点充分暴露，有利于与抗IgM抗体试剂充分结合的IgM反应剂；b.与人血清中的IgM抗原有高度特异反应性的抗IgM抗体试剂；c.与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂，特别是测定血清中的免疫球蛋白M(IgM)的试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白(γ-球蛋白)中。可分为五类，即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgM)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。免疫球蛋白M(IgM)是这五类免疫球蛋白中分子量最大的一种。其分子量为900000道尔顿，故又称为巨球蛋白。在正常人血清中平均浓度为60～180mg％，约占血清总免疫球蛋白的6％。主要存在于血管中，对防止菌血症起主要作用。一个IgM分子由5个单体通过J链连接成五聚体。这种结构使IgM具有较多的抗原结合价，可以同时和数个靶细胞结合。因此，IgM在机体抗感染免疫中起主力抗体的作用。IgM的抗菌作用比IgG高1000倍。在种系发育过程中，IgM是最先出现的免疫球蛋白。胎儿大约在胚胎期第20周即能合成IgM。因母体的IgM不能通过胎盘，如果胎儿或新生儿血液中出现IgM时，即表示已发生过宫内感染。1周岁以上的小儿，血清中IgM即达到成人水平。天然抗体多为IgM。冷凝素、类风湿因子等，都是IgM。
已知测定免疫球蛋白M(IgM)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、这些方法都存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样品需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种IgM检测试剂的改进，具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强、适用于各种类型的全自动生化分析仪的免疫球蛋白M(IgM)检测试剂。
为实现上述目的，本发明的技术方案是，包括：
其特征在于包括：
a、一种使样品中IgM抗原位点充分暴露，有利于与抗IgM抗体试剂充分结合的IgM反应剂，包括占其质量百分比为：0.01％-1％防腐剂、0.05％-1％的稳定剂、0.1-10％电解质、2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂、0.1％-0.5％反应促进剂，还包括5-200mmol/L缓冲液；
b、一种与人血清中的IgM抗原有高度特异反应性的抗IgM抗体试剂，包括占其质量百分比为：5％-50％抗IgM抗体、0.001％-5％的抗氧化剂和0.05％-20％稳定剂、0.01％-1％防腐剂、0.1-10％电解质和2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂，还包括5-200mmol/L缓冲液；
c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括占其质量百分比为0.01％-1％防腐剂、0.05-0.1％防霉剂、0.1％-1％稳定剂、0-0.6％IgM抗原，还包括缓冲液20-100mmol/L。
本发明中的抗IgM抗体来自羊、马、鼠或兔等哺乳动物。
本发明中的抗IgM抗体试剂中的稳定剂可以由乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛或人血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或多种构成。
本发明中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液，PH值为5-10。
本发明中的缓冲液优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为7.4-8.1。
本发明中的表面活性剂选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
本发明中的表面活性剂优选非离子表面活性剂。
本发明中的电解质可以是阴离子或阳离子。
本发明中的电解质优选氯化钠。
本发明中的防腐剂选自叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂。
本发明的优点在于：利用抗原抗体反应，加入反应剂(样品稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入抗IgM抗体试剂；高特异反应性的抗IgM抗体试剂与样本中相应的IgM抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的IgM含量成正比，在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知恒定的校准液比较，通过公式
式中：ΔGU为以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔGS为以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS为校准剂中IgM的浓度
可计算出样本中IgM的含量。本发明方法及试剂操作简单、样本不用预稀释，采用血清型液体恒定值校准液后不需每批更改参数，准确度高、重复性好、抗干扰能力强。并且还适用于各种类型的全自动生化分析仪。
下面结合具体实施方式对本发明做进一步介绍。
具体实施方式
实施例1
a、一种使样品中IgM抗原位点充分暴露，有利于与抗IgM抗体试剂充分结合的IgM反应剂(或样品稀释液)，包括占其质量百分比为0.01％-1％防腐剂、0.05％-1％的稳定剂、0.1-10％电解质、2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂和0.1％-0.5％反应促进剂(防腐剂、稳定剂、电解质、高分子加速剂、表面活性剂及反应促进剂的含量比例均为与IgM反应剂的重量百分比)，还包括5-200mmol/L缓冲液；
作为缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等，本发明优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-10，优选7.4-8.1。
作为表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有：Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用。
作为电解质的实例可以阴离子或阳离子，本发明优选阳离子中的氯化钠(NaCl)。
作为加速剂的实例可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000，优选聚乙二醇6000。
作为防腐剂的实例可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂，本发明从环保角度考虑，优选广谱杀菌剂。
作为反应促进剂的实例可以是溴化己二甲胺、聚凝胺。
作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖。
b、一种与人血清中的IgM抗原有高度特异反应性的抗IgM抗体试剂，包括占其质量百分比为0.5％-50％抗IgM抗体、0.001％-5％的抗氧化剂和0.05％-20％的稳定剂，还包括0.01％-1％防腐剂、0.1-10％电解质和2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂、0.1％-0.5％反应促进剂；还包括5-200mmol/L缓冲液。
作为抗IgM抗体的实例可以是羊抗人IgM抗血清、马抗人IgM抗血清、鼠抗人IgM抗血清、兔抗人IgM抗血清等；这些血清均可外购获得，也可自制。
作为抗氧化剂的实例可以是丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等；
作为抗氧化剂可以先溶解在10-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到抗IgM抗体试剂中。
c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括占其质量百分比为、0.01％-1％防腐剂、0.05-0.1％防霉剂、0.1％-1％稳定剂、0-0.6％IgM抗原，还包括缓冲液20-100mmol/L
作为缓冲液的实例有PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐等缓冲液等，
作为防腐剂的实例有叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂等，可以单独使用或几种混合使用；其中的防霉剂的实例有丙酸钠、脱氧乙酸等，也可单独使用或几种混合使用。
作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白、丙三醇、单糖、多糖等可以单独使用或几种混合使用。
其中IgM反应剂和抗IgM抗体试剂的比例可以是3：1，4：1或5：1，也可以是7：1。
以上所述的所有生化原料和试剂均可外购获得。
本发明的IgM浓度值为：第1点：用生理盐0mg/L；第2点：0.20-0.8g/L；优选0.6g/L第3点0.8-2.5g/L；优选1.15g/L；第4点1.5-3.5g/L；优选2.0g/L；第5点3.0-6.0g/L；优选3.0g/L。液体血清型恒定值校准液按照确定的IgM浓度值加入不同量的IgM抗原。
每个试剂盒配置校准液4瓶；IgM抗原可直接外购，或者自制。
以上所述的免疫球蛋白M检测试剂盒中均为双试剂(即试剂盒中包括IgM反应剂、抗IgM抗体试剂和液体血清型恒定值IgM校准液三种成份)；也可将所述的IgM反应剂与抗IgM抗体试剂按一定的比例混合，以作为单一试剂使用。
IgM检测试剂的制备实施例：
实施例一
1、IgM反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 100mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 5％
NaCL(电解质) 10％
PEG-6000(高分子加速剂) 4％
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.1％
溴化己二甲胺(反应促进剂) 0.3％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.05％
2、抗IgM抗体试剂(R2)
磷酸盐缓冲液 100mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 5％
NaCL(电解质) 10％
PEG-6000(高分子加速剂) 4％
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.4％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.05％
兔抗人IgM抗血清 10％
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂) 0.01％
甘露糖醇(稳定剂) 5％
3、液体血清型IgM恒定值校准液
缓冲液 CAPSO 100mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 0.01％
稳定剂 乙二胺四乙酸二钠 0.1％
稳定剂 牛血清白蛋白 0.5％
防霉剂 丙酸钠 0.05％
将IgM抗原按照第1点为0g/L，第2点为0.6g/L；第3点为1.15g/L；第4点为2.0g/L；第5点为选3.0g/L加入上述溶液中，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。也可将试剂(R1)与(R2)按3：1的体积比例混合，以作为单一试剂使用。
也可将(R1)与(R2)按3：1的比例混合，以作为单一试剂使用。
实施例二：
1、IgM反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 5mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 0.1％
NaCL(电解质) 0.1％
PEG-6000(高分子加速剂) 7％
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.01％
聚凝胺(反应促进剂) 0.1％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 1.0％
2、抗IgM抗体试剂(R2)
磷酸盐缓冲液 5mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 0.1％
NaCL(电解质) 0.1％
PEG-6000(高分子加速剂) 7％
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.01％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 2％
羊抗人IgM抗血清 45％
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂) 0.5％
氯化镁(稳定剂) 1％
3、液体血清型恒定值IgM校准液
缓冲液 CAPSO 20mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 1％
稳定剂 丙三醇 1％
稳定剂 牛血清白蛋白 1％
防霉剂 脱氧乙酸 0.1％
将IgM抗原按照第1点为0g/L，第2点为0.6g/L；第3点为1.15g/L；第4点为2.0g/L；第5点为选3.0g/L加入上述溶液中，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。也可将试剂(R1)与(R2)按7：1的体积比例混合，以作为单一试剂使用。
实施例三：
1、IgM反应剂(R1)
磷酸盐缓冲液 200mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 10％
NaCL(电解质) 5％
PEG-6000(高分子加速剂) 2％
广谱杀菌剂(防腐剂) 1％
聚凝胺(反应促进剂) 0.5％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 1％
2、抗IgM抗体试剂(R2)
磷酸盐缓冲液 200mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂) 10％
NaCL(电解质) 5％
PEG-6000(高分子加速剂) 2％
广谱杀菌剂(防腐剂) 1％
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.05％
马抗人IgM抗血清 25％
二丁基羟基甲苯(抗氧化剂) 0.3％
丙三醇(稳定剂) 10％
3、液体血清型恒定值IgM校准液
缓冲液 CAPSO 100mmol/L
防腐剂 广谱杀菌剂 0.06％
稳定剂 乙二胺四乙酸二钠 0.5％
稳定剂 牛血清白蛋白 0.5％.
防霉剂 丙酸钠 0.8％
将IgM抗原按照第1点为0g/L，第2点为0.6g/L；第3点为1.15g/L；第4点为2.0g/L；第5点为选3.0g/L加入上述溶液中，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。也可将试剂(R1)与(R2)按4：1的体积比例混合，以作为单一试剂使用。
以下描述测定的具体操作步骤：
一、双试剂基本操作：
(仪器：具有340nm波长，37℃恒温装置的生化分析仪)
结果计算：
式中：ΔAU以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS校准液中IgM的浓度
二、单试剂基本操作：
(仪器：具有340nm波长，37℃恒温装置的生化分析仪)
结果计算：
式中：ΔAU以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS校准液中IgM的浓度
储存及稳定性：本发明提供的试剂盒在2～8℃避光保存可稳定一年。
Claims (10)
1.一种免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于包括：
a、一种使样品中IgM抗原位点充分暴露，有利于与抗IgM抗体试剂充分结合的IgM反应剂，包括占其质量百分比为：0.01％-1％防腐剂、0.05％-1％的稳定剂、0.1-10％电解质、2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂、0.1％-0.5％反应促进剂，还包括5-200mmol/L缓冲液；
b、一种与人血清中的IgM抗原有高度特异反应性的抗IgM抗体试剂，包括占其质量百分比为：5％-50％抗IgM抗体、0.001％-5％的抗氧化剂和0.05％-20％稳定剂、0.01％-1％防腐剂、0.1-10％电解质和2％-8％高分子加速剂、0.1-10％的表面活性剂，还包括5-200mmol/L缓冲液；
c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括占其质量百分比为0.01％-1％防腐剂、0.05-0.1％防霉剂、0.1％-1％稳定剂、0.02-0.6％IgM抗原，还包括缓冲液20-100mmol/L。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述抗IgM抗体来自羊、马、鼠或兔等哺乳动物。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述抗IgM抗体试剂中的稳定剂可以由乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛或人血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或多种构成。
4.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液，PH值为5-10。
5.根据权利要求4所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为7.4-8.1。
6.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的免疫球蛋白M检测试剂，其特征为：所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M检测试剂，其特征为：所述电解质可以是阴离子或阳离子。
9.根据权利要求8所述的免疫球蛋白M检测试剂，其特征为：所述电解质为氯化钠。
10.根据权利要求1所述的免疫球蛋白M的检测试剂，其特征在于：
所述防腐剂选自叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090218 |