JPH06505560A

JPH06505560A - カルシウム測定に関する試薬及び方法

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Publication number: JPH06505560A
Application number: JP4509562A
Authority: JP
Inventors: デニー，ジェリー　ダブリュ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-10
Publication date: 1994-06-23
Also published as: DE69119410T2; WO1992011524A2; EP0517914A1; CA2071206A1; DE69119410D1; US5057435A; WO1992011524A3; EP0517914B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】カルシウム測定に関する試薬及び方法本発明は体液中におけるカルシウムイオンのアッセイに関する。

血清カルシウムは主に２つの形で存在している。血清中におけるカルシウムの約半分は遊離イオンとして循環し、残り半分は循環タンパク質に結合している。血液中における少量のカルシウムは副甲状腺及び血清全タンバク質しベルにより調節される。カルシウムイオンは血液凝固、神経筋伝達、膜機能の維持、腺分泌の細胞内調節、骨格及び心筋収縮性のコントロールに関与している。

血清のカルシウム含有率を測定するための比色法では、カルシウムアッセナゾＩＩ＋のようなカルシウム−発色原錯体の分光スペクトル測定吸光度と脂血症、ビリルビン血症及び溶血による分光スペクトル＃１定干渉とを区別しなければならない。更に、アルカリｐＨ条件下でマグネシウムイオンは発色原と競合的に結合し、それによりアッセイ干渉を生じる。８−ヒドロキシキノリンはマグネシウムイオンと効果的に結合し、それによりカルシウムアッセイで干渉剤としてそれを除去する。

８−ヒドロキシキノリンを含有したカルシウム試薬はネリ（Ｎｅｒｉ）らの米国特許第４，４４８，８８９号、ミゼイ（Ｍｅｚｅｉ）らの米国特許第４，３８２，１２２号、ギンドラ−（Ｇｉｎｄｌｅｒ）の米国特許第３．７５４，８６５号及びスタフロポウロス（Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｒｏｓ）らの米国特許第３゜９３８．９５４号明細書で開示されている。しかしながら、これらの参考文献はカルシウムアッセイ用の単一試薬について開示していない。それどころか、２種の試薬か血清中におけるカルシウムの測定用に要求される。一方の試薬は発色原、界面活性剤及び８−ヒドロキシキノリンを含有した酸性色素試薬である。他方の試薬はアルカリ性緩衝剤を含有した緩衝剤試薬である。

単一カルシウム試薬はクリ−バー（Ｃ１ｅａｖｅｒ）の米国特許第３．９３４．９７７号明細書で開示されている。しかしながら、クリ−バーにより開示された試薬は酸性緩衝剤を含有している。更に、クリ−バーで開示されたカルシウムアッセイ法で利用される試薬ブランクル１定は高い分光スペクトル測定吸光度を生じてしまう。

モリン（Ｍａｒｉｎ）の米国特許第３，８２２，１１６号明細書でもカルシウムアッセイ用の単一試薬について開示している。モリンにより開示された試薬は８ −ヒドロキシキノリンをａイ１していない。

ヘルガー（ｌｌｅｌｇｅｒ）の米国特許第３，７９８，０００号明細書でもカルシウムアッセイ用の単一試薬について開示している。その試薬はアルカルｐＨを有し、８−ヒドロキシキノリン硫酸塩又は８−ヒドロキシキノリンのいずれかを含有している。

ベーテス（Ｂａｔｅｓ）らの欧州特許出願第８８１１３７５４．１号明細書でもカルシウムアッセイ用の単一試薬について開示している。その試薬はアルセナゾＩＩ＋を含有しているが、但し酸性緩衝剤を利用せず、しかも８−ヒドロキシキノリンを含有していない。

Ｂａｇｊｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、”Ｄｌｒｅｃｔ　ＭｌｃｒｏｄｅｔｅｒＩＩｉｎａｔｌｏｎ　ｏｆＳｅｒｕｍ　Ｃａｌｃｉｕｍ−（血清カルシウムの直接微量測定）、Ｃｌ１ｎ。

ＣｈｉＩ！、＾ｅｔａ、４６．４９−５４（１９７３）　ではカルシウム測定用の多数試薬系について開示している（第５０頁）。その試薬の１つは８−ヒドロキシキノリン、ジメチルスルホキシド及び酸（濃塩酸）を含有している（第５０頁）。

本発明は血清、ヘパリン添加血漿及び尿のような水性サンプル中におけるカルシウムのアッセイに関する単一の安定試薬及びその試薬を利用した自動化方法である（水性サンプルはタンパク質をほとんど又は全く含有していない）。

本試薬はアルセナゾＩ１１．８−ヒドロキシキノリン、緩衝剤、ジメチルスルホキシド及び水を含有している。

緩衝剤は試薬ｐＨを約８．５〜約１０、更に好ましくは約８．５〜約９．５、最も好ましくは約８．８〜約９にしなければならず、しかもその試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０，１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量でなければならない。

単一試薬の重要性はそれがアッセイオペレーターにとり多数試薬よりも使用上簡単なことであり、安定試薬の重要性はそれが正確なアッセイを繰返し実施可能にして試薬浪費及び費用を最小にできることである。

新規試薬の重要な面は、感受性着色錯体カルシウムーアルセナゾＩＩ＋の分光スペクトル測定吸光度が最大であるアルカリｐＨで緩衝化された単一の安定試薬中に難溶性８−ヒドロキシキノリンを配合させうるジメチルスルホキシドの含有である。試薬はｐＨ約９で緩衝化されることが好ましい。ｐＨ約９のとき、カルシウムーアルセナゾＩＩ＋は脂血症、溶血及びビリルビン血症による干渉を最少にてきる波長で光を最大に吸収する。８−ヒドロキシキノリンはアルセナゾＩＩ＋　との錯体化に関してアルカリｐＨでカルシウムと競合するマグネシウムと結合し、カルシウムに関するアッセイで干渉剤としてそれを除去する。

新規試薬を利用した自動アッセイ法では、錯体が光を最大に吸収して脂血症、ビリルビン血症及び溶血による分光スペクトル？ｉｐ１定干渉が減少されるｐＨ及び波長においてカルシウムーアルセナゾＩＩＩ錯体を分光スペクトル干渉定することにより、シグナル（カルシウムーアルセナ’／　ｌ　Ｉ　ｌ錯体による分光スペクトルＭｊ定吸光度）対ノイズのようなスペクトル干渉は、二色吸光度測定（２つの異なる波長における吸光度測定）を行いかっ血清ブランク測定を行うことによって更に減少される。

本発明は血清及び尿のような水性サンプル中におけるカルシウムのアッセイに関する単一の安定試薬及びその試薬を利用した方法である（水性サンプルはタンパク質をほとんど又は全く含有していない）。

カルシウム試薬カルシウム試薬に関する一般的要求はすぐ下に示され１、アルセナゾＩＩ＋　未知カルシウム含有率のサンプル［２，２−−（１，８−中におけるすべてのカルシウムとジヒドロキシ−３，６−反応する上で充分な量ジスルホナフチレン− ２，７−ビスアゾ）ビスベンゼンアルソン酸としても知られる〕２．８−ヒドロキシキノリン　未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量３、約８．５〜約１０の試薬　試薬が未知カルシウム含有率のすｐＨを与える緩衝剤　ンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０，１ｐ）ｆ単位内にｐＨを維持する上で充分な量４、ジメチルスルホキシド　８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量５、溶媒としての水好ましくは、ポリオキシエチレンアルコール（ポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテル類；エトキシル化脂肪アルコール類；マクロゴール脂肪アルコールエーテル類）のような少なくとも１種の非イオン系界面活性剤が脂質混濁を最少化する上で充分な量で試薬に加えられる。更に好ましくは、ポリオキシエチレンアルコールのような第−非イオン系界面活性剤及びオクトキシノール（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル）のような第二非イオン系界面活性剤が脂質混濁を最少化させかつ試薬に第−及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な混合濃度で試薬に加えられる。最も好ましい態様における第二非イオン系界面活性剤はＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−＋００　Ｃシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＣｏＩＩｐａｎｙ）から市販〕であるが、ソノ理由はそれか良好な高脂肪血清澄化剤たからである（しかしながら、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００は温度変化で混濁溶液を形成することかある）。最も好ましい態様における第−非イオン系界面活性剤はＢＲＩＪ界面活性剤（シグマ・ケミカル・カンパニーから市販のポリオキシエチレンエーテル）であって、これはＴＲＩＴＯＮ　Ｘ −１００混濁を防止して脂質混濁を清澄化する上で役立つ。

全界面活性剤濃度は、自動化装置から分配される試薬を不正確かつ不精密にするほと試薬粘度を増加させることなく脂質混濁を最少化する上で充分であるべきである。

試薬中における全界面活性剤濃度は約０．１〜約２％（容量）であるべきである。全界面活性剤濃度が約２％（容ｆｆ１）を超えると試薬コストを増加させてしまい、しかも脂質清澄化効果かほとんど追加されない。更に、全界面活性剤濃度が約２％を超えると次のアッセイに界面活性剤“キャリーオーバー”を生じてしまい、そのアッセイは反応容器及び／又はキュベツトを自動的に洗浄及び再使用してランダム式にアッセイを行う自動化装置において界面活性剤により悪影響をうける。

好ましい緩衝剤は２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）であるが、その理由はそれが試薬ｐＨをカルシウムーアルセナゾ１１１錯体の分光スペクトル測定にとり最も望ましい範囲内（約８．８〜約９のｐＨ）にし、しかもそのｐＨ範囲内で強い緩衝能力を資するからである。試薬ｐＨを約８．８〜約９にする上で充分なＡＭＰＤ濃度は約０．２モルである。この緩衝剤濃度はこのｐＨ範囲をしっかりと維持する上で必要な経済的濃度として選択される。

それより低い濃度をより大きな経済性のために用いてもよいが、但し水性及びタンパク質含有（例えば、血清）サンプルの分光スペクトルＭ１定吸光度ｖｓ、　ａ度線勾配の間には有意の格差が生しるかもしれない。それより高い緩衝剤濃度も用いてよいが、但し試薬のコストは増加してしまい、それ以上の利益はほとんど又は全くない。

試薬ｐＨを約８．５〜約１０にできる他の緩衝剤も用いてよいが、但しその試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０，１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量で用いられるべきである。更に、用いられる緩衝剤はアルセナゾＩＩ＋と競合してカルシウムに結合してはならない。

試薬ｐＨを約８．５〜約９．５にできかつアルセナゾＩＩ＋　と競合してカルシウムに結合したりしない緩衝剤は、試薬ｐＨを約９．５〜約１０にするような緩衝剤よりも好ましい。使用可能な緩衝剤の例はジメチルアミノメタノール、エタノールアミン及びアミノプロパツールである。

上記すべての緩衝剤は望ましい試薬ｐＨを達成するため酸の添加を要するが、これもアルセナゾＩＩ＋　と競合してカルシウムに結合してはならない。許容される酸の例は塩酸、硫酸及び酢酸である。塩酸からの塩化物イオンの“キャリーオーバー”が反応容器及び／又はキュベツトを自動的に洗浄及び再使用してランダム式に試験を行う自動アナライザーにおいて特に問題である場合には、酢酸又は硫酸が用いられる。（カルシウムイオンと結合しうるそれらの能力のため）使用すべきでない酸はクエン酸、シュウ酸、エデト酸及びリン酸である。

カルシウムは１：１の比率でアルセナゾ１１１と結合することから、カルシウムアッセイのために（以下のカルシウムアッセイセクションで記載される）試験サンプル中において少なくともカルシウムと同じくらい多いモル数のアルセナゾＩＩ＋が存在していなければならない。血清中におけるカルシウムの正常上限は約１２ミリグラム（ｍｇ）パーセント（％）である。しかしながら、未知カルシウム含有率のサンプル中において異常に高いカルシウムレベルにも対応するため、試験サンプル中におけるアルセナゾＩｌ＋の量は少なくとも約１５ｍｇ％カルシウムのモル相当量であるべきである（１５ｍｇ％もの高い異常カルシウムレベルにもよく出会う）。更に、はとんどの臨床化学者は少なくとも約２０ｍｇ％カルシウムまで直線性を望むため、試験サンプル中におけるアルセナゾＩ１１の量は少なくとも約２０ｍｇ％カルシウムのモル相当量であることが好ましい。

具体的なカルシウム試薬は下記ステップを実施することにより製造されるニステップ１−説イオン水８００ミリリットル（−１）にＡ　Ｍ　Ｐ　Ｄ　２１グラム（ｇ）、アルセナゾｌｌＩ８０ｉｇ、ＢＲＩＪ３５　（３０％ｗｔ／ｖｏｌ溶液＞（ＢＲＩＪ３５はポリオキシエチレン２３ラウリルエーテルである）２１、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００１、２ｍｌを加え、均一溶液が得られるまで攪拌する。

ステップ２−ステップ１の均一溶液にＣＩＩＥＬＥＸ　１００１０ｇを加え、３０分間にわたり充分にミックスする〔カリフォルニア州、リッチモンドのバイオ −ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｒａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販のＣＨＥＬＥＸ　１００は二価カルシウム及びマグネシウムイオン物を除去するために用いられる陽イオン交換樹脂である〕　ニステップ３−　ＣＩＩＥＬＥＸ　１００を濾去し、濃塩酸の添加で濾液のｐＨを約９に調整する；ステップ４−８−ヒドロキシキノリン　ｌ／２　ｇをジメチルスルホキシド１００ｉ１に溶解し、得られた溶液をステップ３から得たｐＨ９濾液に加える；ステップ５−約１リツトルの全容量が得られるまで脱イオン水をステップ４の溶液に加える。

新規試薬の重要な面は、試薬中におけるジメチルスルホキシドの含有かカルシウムの１ｌｌｌ定（カルシウムーアルセナゾＩＩＩ錯体の最良感度）にとり最適なアルカリｐＨて緩衝化された単一の安定試薬中に８−ヒドロキシキノリンを配合させうろことである。ジメチルスルホキシドの含ａがなければ、単一のカルシウム試薬は酸性でなければならず、又は８−ヒドロキシキノリンを含有した別の試薬か製造されなければならない。

単一試薬の重要性は、それがアッセイオペレーターにとり多数試薬よりも使用上簡単なことである。更に、安定な試薬は正確なアッセイを繰返し実施可能にして試薬浪費を最少化しうる。本新規試薬は室温で少なくとも１年間安定である。

カルシウムアッセイ血清はヘモグロビン、ビリルビン及び脂肪白物質のような固有分光スペクトル吸収物質を含有している。これらの干渉物質は可視スペクトルの短（赤色）波長側で最も強く光を吸収する。カルシウムイオンと錯体化した場合に可視スペクトルの長（青色）波長側で光を吸収する発色原を選択すれば、重要なことにこれらの固有血清物質からのスペクトル干渉のほとんどを回避することができる。アルセナゾＩＩ＋はこのような発色原であって、カルシウムイオンと錯体化した場合に可視スペクトルの青色領域で２つの吸光最大を有する（一方の最大は約５９５〜６００ｎｍ及び他方の最大は約６５０〜６５５ｎ會）。更に、カルシウムーアルセナゾＩＩＩ錯体の吸光度はｐＨ約９で最も強い。しかしながら、アルカリ条件下で、同じく血清中に固有のマグネシウムイオンはカルシウムーアルセナゾＩＩＩ錯体によるカルシウムのＭ」定を妨げるが、その理由はマグネシウムがアルセナゾ１１１　との結合に関してカルシウムと競合するからである。下記アッセイ法及び上記試薬はシグナル（カルシウムーアルセナゾＩＩＩ錯体による分光スペクトル測定吸光度）対ノイズ（脂血症、ビリルビン血症、溶血及びマグネシウムによる干渉分光スペクトル測定吸光度）比を最大にするように協働しあい、それによりカルシウムに関する高感度で正確な分光スペク、トル測定アッセイを生み出す。

カルシウムアッセイのもう１つの重要な特徴は自動化に対するその適合能である。一部の自動アナライザーでは約１０分間以上の反応時間を要するアッセイを行うことができるが、圧倒的多数の（日立７０４．７０７．７］７及び７４７アナライザーとオリンパスＡＵ５０００のような）市販自動アナライザーでは約１０分間以上の反応時間を要するアッセイを行えず、１０分間未満の反応時間が非常に好ましい（タカノら、米国特許第４，５８８．６９５号明細書、第３欄、第２９−３１行目参照）。本発明試薬を利用したアッセイ法は自動化に適合可能であり、約１０分間以下の反応時間を要する自動アナライザーで実施することができる。

本発明の最も基本的なカルシウムアッセイは下記ステップで実施されるニステップ１−未知カルシウム含有率のサンプル（血清又は水性サンプル）をカルシウム試薬（前記）に加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ステップ２−脱イオン水をカルシウム試薬に加えることにより試験ブランク（ｔｂ）を調製する。

ステップ３−既知カルシウム濃度のカルシウム標準をカルシウム試薬に加えることにより試験標準（ｔｓｔａｎｄ）を調製する；ステップ４−試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）を約６００〜約６７０　ｒｖの波長で分光スペクトル干渉定する；ステップ５−下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する；具体的には、上記アッセイは血清サンプル２０マイクロリツトル（μＬ）、脱イオン水２０μＬ及びカルシウム標／＄２０μＬを前記の具体的なカルシウム試薬２１と共に用いることにより行われる（サンプル；試薬の１ユ１００　（ｖｏｌ：ｖｏｌ）希釈）。

一般に、前記いずれの試薬もカルシウムアッセイで用いてよく、分光スペクトル測定は約６００〜約６７０　ｎｓて行われ、好ましくは約６５０〜約６６０　ｎｓで行われるか、その理由は高脂肪面による干渉がこの波長範囲で最少化されるからである。

カルシウム標準は既知カルシウム濃度の参照血清であることが好ましい。カルシウム濃度はほぼ正常血清の濃度であるべきである。正常血清中におけるカルシウムの上限濃度は約１２Ｂ％であり、約１５−ｇ％カルシウムの２照血清が適切なカルシウム標準を与える。ヒト血清中におけるタンパク質は緩衝剤が約０．２モル濃度で用いられた場合であってもｐＨにややシフトを生じるかもしれないが、但し患者毎のサンプル間のタンパク質の偏差はｐＨに関して有意の偏差を生じない。更に、自動臨床分析を行う実験室では１つだけの標準を用いる効率性のために様々なアッセイを較正する上でタンパク質ベース膠照血清を通常用いる。水性標準がカルシウム標準として用いられる場合には、吸光度対濃度のグラフの勾配に関してわずかな差異が血清サンプルと水性標準との間に存在するかもしれない。

混濁又は溶血血清サンプル、ヘパリン添加血漿サンプル及び混濁床サンプルでみられるスペクトル干渉はアッセイにおいて血清ブランク（ｓｂ）を用いることにより減少される。血清ブランクが前記アッセイで用いられる場合、ステップ１の試験サンプルは第一部分の血清サンプル（未知カルシウム含有率のサンプル）をカルシウム試薬に加えることにより調製される。別のステップ（ステップＩＡ）において、血清ブランクは第二部分の血清サンプル（第一部分と同容量）を塩水（ステップ１におけるカルシウム試薬と同容量）に加えることにより調製される。ステップ２及び３は前記のように行われる。次いで（ステップ３Ｂ）、試験標準ブランクＮ　５ｔａｎｄ　ｂ）はカルシウム標／￥（ステップ３におけるカルシウム標準と同容量）を塩水（ステップ１におけるカルシウム試薬と同容量）に加えることにより調製される。ステップ４において、血清ブランク及び試験標準ブランクの吸光度が試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度と共に（前記波長範囲内の波長で）分光スペクトル測定される。

次いでステップ５において、試験サンプルのカルシウム濃度が下記式により計算される：固有スペクトル干渉を減少させるもう１つの手段は二色測定を用いることによる。二色ａ＞＋定は、最初に一次波長（１″λ）で試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度を測定し、しかる後二次波長（２″λ）で試　−験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度を測定することにより行われる。−次波長は約６４０〜約６６０ｎｍであり、二次波長は約７００〜約８０００−である。

この操作は、カルシウムアッセナゾＩＩ＋によるスペクトル吸光度が一次波長から二次波長にかけて急速に減少するが、混濁による吸光度が一次から二次波長にかけて比較的一定のままであるため、混濁からのスペクトル干渉を更に減少させる。次いで試験サンプル中におけるカ（Ａｔｓｌ’　ｌ　−Ａｔｂｌ’　ｌ　） −（Ａｔｓ２°１−Ａｔｂ２’ｌ）好ましくは、−次波長は約６５０ｎ−であり、二次波長は約７００　ｔｖである。

表■　（下記）は高脂肪面（混濁）及び溶血からのスペクトル測定を減少させる上で二色測定の有効性について示している。上記アッセイ操作を利用して下記試験サンプルが測定された：１２ｇｇ％カルシウムサンプル、１０００■ｇ％トリグリセリドサンプル［ＣＡ９４５０１゜アラメダのカビ・ビトラム社（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ、ｌｎｃ、）から入手されるイントラリビド（ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ））及び９００ｎ１ｇ％ヘモグロビンサンプル。アッセイは二色測定で及びそれなしで双方によりこれらのサンプルに関して行われた。

スペクトル測定が６５０　ｔｖのみで行われた場合、混濁（イントラリビド）によるエラーは３４．２％（見掛は上のカルシウムーアルセナゾ１１１形成）であり、溶血（ヘモグロビン）によるエラーは２，４％（見掛は上のカルシウムーアルセナゾＩ１１形成）であった。しかしながら、スペクトル測定ｌ定が７００　ｎｉても行われて、７００ｎ１こおける吸光度が６５０　ｎｌこおける吸光度から差し引かれた場合（二色ＩＩ定に関する前記式参照）、混濁によるエラーはわずかに５．５％であり、溶血によるエラーは０　％であった。

表■ 二色ｌＪ＋定　二色測定せず　（１″　λ−６５０ｎ■ 吸光度　（６５０ｎｍ）　２＠　λ−７００ｎｗ）１２１ｇ９６カルシウム　０．８０１吸光度（Ａ）　０．７９２Ａ９００１ｇ％ヘモグロビン　０．００２Ａ　Ｏ，００１＾エラーイントラリビド　３４．２％　５．５％９００　ｍｇ’、６ヘモグロビン　２．４％　０％［］立系の自動アナライザーが広く用いられている。その系の１つ日立７１７自動アナライザーは二色測定を行う。本発明のカルシウム試薬は２試薬に分けて、下記によりＨ立７１７てカルシウムアッセイを行う上で利用してもよい・ａ、第一試薬ｐＨを約８．５〜約１０、更に好ましくは約８．５〜約９．５、最も好ましくは約８．８〜約９にする上で充分なタイプであってかつ第一試薬ｐＨの＋／−０、１，ｐ　Ｈ単位内でアッセイ中にｐＨを維持する上で充分な濃度の緩衝剤、少なくとも１種の非イオン系界面活性剤、ジメチルスルホキシド及び水を含有した第一試薬に未知カルシウム含有率のサンプルを加えることにより試験ブランクを調製する；ｂ、アルセナゾ１１１、ジメチルスルホキシド、少なくとも１種の非イオン系界面活性剤、８−ヒドロキシキノリン及び水を含有した第二試薬に試験ブランクを加えることにより試験サンプルを調製する：Ｃ９第−試薬に既知カルシウム濃度の標準を加えることにより試験標準ブランクを調製する；ｄ、第二試薬に試験標準ブランクを加えることにより試験標準を調製する；ｅ、試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度を一次波長（１°λ）で分光スペクトル測定する：ｆ　試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度を二次波長（２°λ）で分光スペクトル４？１定する；及びｇ、下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する・（Ａｔｓｌｏｌ　−Ａｔｂｌｏｌ　）”ｔｓ２°ｌ　’ｔｂ２°λ）カルシウム試薬の記載で示されたように、非イオン系界面活性剤の含有はカルシウム試薬において不要であるが、但し好ましい。ＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）及びＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００（カルシウム試薬の記載参照）のような２種の非イオン系界面活性剤がカルシウム試薬に含有されることが最も好ましい。更に、非イオン系界面活性剤が第一試薬中にある場合には、分光スペクトル測定に際して混濁清浄化を比較的一定に保つため第二試薬中に非イオン系界面活性剤を含有させることが好ましい。

日立７１７自動二色アナライザーに適用可能な試薬の具体的処方及び具体的アッセイはすぐ下で記載されている。

第一試薬（Ｒ１）ＡＭＰＤ２４ｇ、３０％（ｖｔ／ｖｏｌ溶液）ＢＲＩＪ３５２１、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００１、２ｍｌ及びジメチ／１．スルホキシド１００１が脱イオン水８００１に加えられる。得られた溶液は均一になるまでミックスされる。均一な溶液はＣＩＩＥＬＥＸ　１００　１０　ｇと共に３０分間ミックスされ、しかる後ＣＩＩＥＬＥＸ　１００を除去するため濾過される。濾液のｐＨは濃塩酸の添加で約９に調整される。次いでｐＨ９濾過溶液は脱イオン水の添加で約１リツトル容量に調整される。

第二試薬（Ｒ２）アルセナゾＩＩＩ　８００＋ｇ、　３０％（ｗｔ／ｖｏｌ溶液）ＢＲＩＪ３５　２ｍｌ、ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００１、２ｓｌ及び８−ヒドロキシキノリン４ｇがジメチルスルホキシド約２００ｇ＋１に加えられる。得られた混合液は均一溶液が得られるまで攪拌され、均一溶液の容量は脱イオン水の添加で約１リツトルに調整される。

日立７１７において、未知カルシウム含有率のサンプルは試験ブランク（ｔｂ）を形成するため第一試薬に加えられる。試験サンプル（ｉｓ）は第二試薬を試験ブランクに加えることにより調製される。試験標準ブランク（ｔ　５ｔａｎｄｂ）は既知カルシウム濃度のカルシウム標準を第一試薬に加えることにより調製される。試験標準（ｔ　５ｔａｎｄ）は試験標準ブランクを第二試薬に加えることにより調製される。二色補正のため、試験ブランク、試験サンプル、試験標準ブランク及び試験標準吸光度の分光スペクトル測定か前記のように一次及び二次波長（１″λ及び２ｅλ）で行われる。吸光度が比較され、試験サンプル中におけるカルシウムの濃度が下記式により計算される。

具体的には、当業者は前記試薬及び下記例示化学パラメーター（アナライザーセツティング）を用いて日立７１７でカルシウムアッセイを行う：日立７１７化学パラメーター試験　［ＣＡ］アッセイコード　［２］　：　［２４］−［５０］サンプル容量（μＬ）　［３］Ｒ１容ｊｌ　（ｔｔ　Ｌ）　［２５０］［１００］［０］Ｒ２容量（μＬ）　［７０］［２０］　［０］波長（ｎｓ）　［７５０］［８６０］較正法　［１１−［０］−［０］Ｓｔｄ　Ｉ　Ｃｏｎｅ−Ｐｏｓ　［０１−［１］Ｓｔｄ　２　Ｃｏｎｅ−Ｐｏｓ　［＊ｌ−［２］Ｓｔｄ　３　Ｃｏｎｅ−Ｐｏｓ　［０］−［０］Ｓｔｄ　４　Ｃｏｎｅ−Ｐｏｓ　［０１−［０］Ｓｔｄ　５　Ｃｏｎｅ−Ｐｏｓ　［０１−［０］Ｓｔｄ　６　Ｃｏｎｃ−Ｐｏｓ　［０］−［０］ＳＤ限界　［０，１］反復限界　［１００］感度限界　［０］＾ｂｓ、限界（Ｉｎｃ／Ｄｅｃ）　［０］［０］プロシン限界　［０１［０１予測値（ｕ　ｍｏｌ／Ｌ）　［２，０２１−［２，［ｉ０］パニック値（μｍｏｌ／Ｌ）　［＊］−［＊］装置ファクター　［ＩＯ］本ユーザーの具体的セツティングを示す日立７１７て前記のようにかつ表Ｉで示されたア・ソセイと同様に行われたカルシウムアッセイ（１２ＩＩｇ％カルシウム、イントラリビド及び９００＋ｎｇ％ヘモグロビンについて分析）では、イントラリビドによるエラーが１％未満てあり、ヘモグロビンによるエラーはなかった。

本試薬は、試験サンプルスペクトル測定前よりもむしろ後に試験ブランクスベクトル測定を行う日立７０５のような自動アナライザーでも利用してよい。このような方法において、試験サンプルは未知カルシウム含有率のサンプルを単一の安定カルシウム試薬（カルシウム試薬セクション下で記載）に加えることで形成される。試験ブランクは試験サンプルをカルシウム錯体化試薬に加えることで形成される。試験標準及び試験標準ブランク（よ、最初に既知カルシウム濃度のカルシウム標準を単一の安定カルシウム試薬に加え（試験標準を形成する）、シカする後勾ルシウム錯体化試薬を加える（試験標準ブランクを形成する）ことにより同様に形成される。

カルシウム錯体化試薬はカルシウムを錯体化させ、それによりカルシウムーアルセナゾ１１１錯体を分解させる。

錯体化試薬は錯体化物質、アジ化ナトリウムのような公知抗菌剤及び脱イオン水を含有している。錯体化物質はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であってもよ００しかしながら、ＥＤＴＡの二ナトリウム、四ナトリウム、ニカリウム及び四カリウム塩のようなＥＤＴＡ塩は、それらが水により可溶性であるため遊離酸形よりも好ましい。

適切なカルシウム錯体化試薬はＥＤＴＡ約０．３ミリモル（１Ｍ）及びアジ化ナトリウム約８ＩＩＭである。ＥＤＴＡはもっと用いてもよい。しかしながら、反応容器／キュヘットを洗浄及び再使用する自動アナライザーにおい□て過剰のＥＤＴＡの使用を回避するため注意が払われねばならないが、その理由はＥＤＴＡが容器／キュベツトから洗い出す上で困難であり、しかもその存在が一部の分析物のアッセイに悪影響を与えるからである。

具体的には、当業者は下記例示化学パラメーターを用いて日立７０５でカルシウムアッセイを行う；日立７０５に関する化学的パラメーター試験　：ＣＡアッセイコート　：終点サンプル容量（μＬ）二３Ｒ１容量（μＬ）　：３５０Ｒ２容ｆｆ１（μＬ）　：　５０Ｒ３容量波長１　：　７００ｎ膳波長２　：　６６０ｎｉｔ？ｇｔ、ＢＩｋ、Ａｂｓ、　：　−−−Ｒｇｔ、Ｂｌｋ、Ｃｏｎｃ、　：　ロＳｔｄ、Ｃｏｎｃ、　：　＊本本ファクター　二ミー− Ｓｔｄ、Ａｂｓ、Ａ１１ｏｖａｎｃｅ　：　１０％正常範囲Ｌ　（ｕ　ｓｏｌ／Ｌ）　：　２．０２正常範囲Ｈ（μ層ｏｆ／Ｌ）　’　：　２．８０＾ｂｓ、限界（率）　゛コントロール１．Ｄ、Ｎｏ、：　＊＊＊本本本ユーザーの具体的セツティングを示すミー一装置により決定される［）立７０５に関する上記パラメーターにおいて、Ｒ１はカルシウム試薬セクションで記載された具体的力°ルシウム試薬である。Ｒ２はカルシウム錯体化試薬であって、これはＥＤＴＡ四ナトジナトリウム約０Ｍ及びアジ化ナトリウム８■ Ｍの水溶液である。日立７０５は試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの二色スペクトル吸光度（吸光度）を行う。次いで、試験サンプルのカルシウム濃度が■立７１７で行われるカルシウムアッセイに関して前記式により計算される。

試験サンプルのスペクトル吸光度後に試験ブランクのスペクトル１ｌ１１定を行う日立７０５のようなアナライザーの操作原理は、試験サンプルのスペクトル吸光度がアルセナゾＩＩ＋−カルシウム錯体及び試験サンプル中に存在するかもしれないいずれか他の発色物質によることである。

カルシウム錯体化試薬の添加はアルセナゾｌｌｌ−カルシウム錯体による色を消して、試験サンプル中の他の発色物質による色の控除を可能にする。

多くの変更が上記操作で行え、本発明の多くの見掛は上広い異なる態様がその範囲から逸脱することなく行えるが、上記記載に含まれるすべての事項は説明として解釈されるべきであり、限定的意味ではない。

国際調査報告　＋１．Ｔ／ＩＩｃ　０１　／ｎ７＋ｌ７１１ｏｒｒｌｕｚ　（Ｎ／ｎ７ａ７１１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのカルシウムと反応する上で充分な量のアルセナゾｌｌｌ；ｂ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量の８−ヒドロキシキノリン；ｃ．アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−１．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量である）；ｄ．８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量のジメチルスルホキシド；及びｅ．水からなるカルシウムのアッセイ用試薬。２．ｆ．脂質混濁を最少化する上で充分な量の少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を更に含む、請求項１に記載の試薬。３．ｆ．第一非イオン系界面活性剤；及びｇ．第二非イオン系界面活性剤（第一及び第二非イオン系界面活性剤の混合濃度は脂質混濁を最少化させかつ試薬に第一及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な濃度である）を更に含む、請求項１に記載の試薬。４．緩衝剤が試薬ｐＨを約８．５〜約９．５にするようなものである、請求項１、２又は３に記載の試薬。５．緩衝剤が試薬ｐＨを約８．８〜約９にするようなものである、請求項１、２又は３に記載の試薬。６．試薬がリットル当たりでアルセナゾｌｌｌ約８０ｍｇ；８−ヒドロキシキノリン約１／２ｇ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール約２１ｇ；約９の試薬ｐＨを得る上で充分な量の塩酸；ジメチルスルホキシド約１００ｍｌ；ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル約２ｍｌ；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル約１．２ｍｌ；及び約１リットルの試薬容量を得る上で充分な量の水からなる、請求項１に記載の試薬。７．ａ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのカルシウムと反応する上で充分な量のアルセナゾｌｌｌ；未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量の８−ヒドロキシキノリン；アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量である）；８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量のジメチルスルホキシド；及び水からなるカルシウムのアッセイ用試薬を用意する；ｂ．未知カルシウム含有率のサンプルを上記試薬に加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ｃ．脱イオン水を上記試薬に加えることにより試験プランク（ｔｂ）を調製する；ｄ．既知カルシウム濃度のカルシウム標準を上記試薬に加えることにより試験標準（ｔ　ｓｔａｎｄ）を調製する；ｅ．試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）を約６００〜約６７０ｎｍの波長で分光スペクトル測定する；ｆ．下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する：Ａｔｓ−Ａｔｂ／Ａｔ　ｓｔａｎｄ−Ａｔｂ×カルシウム標準の既知カルシウム濃度＝試験サンプル中におけるカルシウムの濃度ステップからなる、カルシウムのアッセイ方法。８．試薬が脂質混濁を最少化するために充分な量で少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を含有する、請求項７に記載の方法。９．試薬が第一非イオン系界面活性剤及び第二非イオン系界面活性剤（第一及び第二非イオン系界面活性剤の混合濃度は脂質混濁を最少化させかつ試薬に第一及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な濃度である）を含有する、請求項７に記載の方法。１０．試験サンプル、試験ブランク及び試験標準が約６００〜約６７０ｎｍの波長で分光スペクトル測定される、請求項７、８又は９に記載の方法。１１．試験サンプル、試験ブランク及び試験標準が約６５０〜約６６０ｎｍの波長で分光スペクトル測定される、請求項７、８又は９に記載の方法。１２．試薬がリットル当たりでアルセナゾｌｌｌ約８０ｍｇ：８−ヒドロキシキノリン約１／２ｇ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール約２１ｇ；約９の試薬ｐＨを得る上で充分な量の塩酸；ジメチルスルホキシド約１００ｍｌ；ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル約２ｍｌ；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル約１．２ｍｌ；及び約１リットルの試薬容量を得る上で充分な量の水からなり；試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）が約６５０〜約６６０ｎｍの波長で分光スペクトル測定される、請求項７に記載の方法。１３．ａ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのカルシウムと反応する上で充分な量のアルセナゾｌｌｌ；未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量の８−ヒドロキシキノリン；アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量である）；８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量のジメチルスルホキシド；及び水からなるカルシウムのアッセイ用試薬を用意する；ｂ．未知カルシウム含有率のサンプルを上記試薬に加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ｃ．脱イオン水を上記試薬に加えることにより試験ブランク（ｔｂ）を調製する；ｄ．既知カルシウム濃度のカルシウム標準を上記試薬に加えることにより試験標準（ｔ　ｓｔａｎｄ）を調製する；ｅ．試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）を一次波長（１°λ）で分光スペクトル測定する；ｆ．試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）を二次波長（２° λ）で分光スペクトル測定する；及びｇ．下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する：（Ａｔｓ１°λ−Ａｔｂ１°λ）−（Ａｔｓ２°λ−Ａｔｂ２°λ）／（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　１°λ−Ａｔｂ１°λ）−（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　２°λ−Ａｔｂ２ °λ）×カルシウム標準の既知カルシウム濃度＝試験サンプル中におけるカルシウムの濃度ステップからなる、カルシウムのアッセイ方法。１４．試薬が脂質混濁を最少化するために充分な量で少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を含有する、請求項１３に記載の方法。１５．試薬が第一非イオン系界面活性剤及び第二非イオン系界面活性剤（第一及び第二非イオン系界面活性剤の混合濃度は脂質混濁を最少化させかつ試薬に第一及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な濃度である）を含有する、請求項１３に記載の方法。１６．試薬がリットル当たりでアルセナゾｌｌｌ約８０ｍｇ；８−ヒドロキシキノリン約１／２ｇ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール約２１ｇ；約９の試薬ｐＨを得る上で充分な量の塩酸；ジメチルスルホキシド約１００ｍｌ；ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル約２ｍｌ；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル約１．２ｍｌ；及び約１リットルの試薬容量を得る上で充分な量の水からなる、請求項１３に記載の方法。１７．一次波長が約６４０〜約６６０ｎｍであり、二次波長が約７００〜約８００ｎｍである、請求項１３、１４、１５又は１６に記載の方法。１８．一次波長が約６５０ｎｍであり、二次波長が約７００ｎｍである、請求項１３、１４、１５又は１６に記載の方法。１９．ａ．アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ第一試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は第一試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に第一試薬ｐＨの＋／−０．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量である）、ジメチルスルホキシド及び水を含有した第一試薬に未知カルシウム含有率のサンプルを加えることにより試験ブランク（ｔｂ）を調製する；ｂ．アルセナゾｌｌｌ、ジメチルスルホキシド、８−ヒドロキシキノリン及び水を含有した第二試薬に試験ブランクを加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ｃ．第一試薬に既知カルシウム濃度の標準を加えることにより試験標準ブランク（ｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ）を調製する；ｄ．第二試薬に試験標準ブランクを加えることにより試験標準（ｔ　ｓｔａｎｄ）を調製する；ｅ．試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度（Ａ）を一次波長（１°λ）で分光スペクトル測定する；ｆ．試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度（Ａ）を二次波長（２°λ）で分光スペクトル測定する；及びｇ．下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する：（Ａｔｓ１°λ−Ａｔｂ１°λ）−（Ａｔｓ２°λ−Ａｔｂ２°λ）／（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　１°λ−Ａｔ　ｓｔａｎｄ　１°λ）−（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　２° λ−Ａｔ　ｓｔａｎｄ　２°λ）×カルシウム標準の既知カルシウム濃度＝試験サンプル中におけるカルシウムの濃度ステップからなる、カルシウムのアッセイ方法。２０．試験ブランク（ｔｂ）及び試験サンプル（ｔｓ）の各々が少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を更に含有する、請求項１９に記載の方法。２１．一次波長が約６４０〜約６６０ｎｍであり、二次波長が約７００〜約８００ｎｍである、請求項１９又は２０に記載の方法。２２．一次波長が約６５０ｎｍであり、二次波長が約７００ｎｍである、請求項１９又は２０に記載の方法。２３，ａ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのカルシウムと反応する上で充分な量のアルセナゾｌｌｌ；未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量の８−ヒドロキシキノリン；アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な量である）；８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量のジメチルスルホキシド：及び水からなるカルシウムのアッセイ用試薬を用意する；ｂ．未知カルシウム含有率の血清サンプルの第一部分を上記試薬に加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ｃ．血清サンプルの第二部分を塩水に加えることにより血清ブランク（ｓｂ）を調製する；ｄ．脱イオン水を上記試薬に加えることにより試験ブランク（ｔｂ）を調製する；ｅ．既知カルシウム濃度のカルシウム標準を上記試薬に加えることにより試験標準（ｔ　ｓｔａｎｄ）を調製する；ｆ．カルシウム標準を塩水に加えることにより試験標準ブランク（ｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ）を調製する；ｇ．試験サンプル、試験ブランク、血清ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度（Ａ）を約６００〜約６７０ｎｍの波長で分光スペクトル測定する；及びｈ．下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する：Ａｔｓ−（Ａｔｂ＋Ａｓｂ）／Ａｔ　ｓｔａｎｄ−（Ａｔｂ＋Ａｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ）×カルシウム標準の既知カルシウム濃度＝試験サンプル中におけるカルシウムの濃度ステップからなる、カルシウムのアッセイ方法。２４．試薬が脂質混濁を最少化するために充分な量で少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を含有する、請求項２３に記載の方法。２５．試薬が第一非イオン系界面活性剤及び第二非イオン系界面活性剤（第一及び第二非イオン系界面活性剤の混合濃度は脂質混濁を最少化させかつ試薬に第一及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な濃度である）を含有する、請求項２３に記載の方法。２６．試験サンプル、試験プランク、血清ブランク、試験標準及び試験標準ブランクが約６５０〜約６６０ｎｍの波長で分光スペクトル測定される、請求項２３又は２４に記載の方法。２７．試薬がリットル当たりでアルセナゾｌｌｌ約８０ｍｇ；８−ヒドロキシキノリン約１／２ｇ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール約２１ｇ；約９の試薬ｐＨを得る上で充分な量の塩酸；ジメチルスルホキシド約１００ｍｌ；ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル約２ｍｌ；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル約１．２ｍｌ；及び約１リットルの試薬容量を得る上で充分な量の水からなり；試験サンプル、試験ブランク及び試験標準の吸光度（Ａ）が約６５０〜約６６０ｎｍの波長で分光スペクトル測定される、請求項２３に記載の方法。２８．ａ．未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのカルシウムと反応する上で充分な量のアルセナゾｌｌｌ；未知カルシウム含有率のサンプル中におけるすべてのマグネシウムと結合する上で充分な量の８−ヒドロキシキノリン；アルセナゾｌｌｌと競合してカルシウムに結合せずかつ試薬ｐＨを約８．５〜約１０にする緩衝剤（その緩衝剤は試薬が未知カルシウム含有率のサンプルに加えられた場合に試薬ｐＨの＋／−０．１ｐＨ単位内にｐＨを維持する上で充分な童である）；８−ヒドロキシキノリンを試薬に溶解させる上で充分な量のジメチルスルホキシド；及び水からなるカルシウムのアッセイ用試薬を用意する；ｂ．未知カルシウム含有率のサンプルを上記試薬に加えることにより試験サンプル（ｔｓ）を調製する；ｃ．カルシウム錯体化試薬を試験サンプルに加えることにより試験ブランク（ｔｂ）を調製する（カルシウム錯体化試薬はアルセナゾｌｌｌ−カルシウム錯体を分解させる錐体化物質及び抗菌剤からなる水溶液である）；ｄ．既知カルシウム濃度の標準を上記カルシウム試薬に加えることにより試験標準（ｔ　ｓｔａｎｄ）を調製する；ｅ．カルシウム錯体化試薬を試験標準に加えることにより試験標準ブランク（ｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ）を調製する；ｆ．試験サンプル、試験ブランク、試験標準及び試験標準ブランクの吸光度（Ａ）を一次及び二次波長（１°λ及び２°λ）で分光スペクトル測定する；及びｇ．下記式により試験サンプル中におけるカルシウムの濃度を計算する：（Ａｔｓ１°λ−Ａｔｂ１°λ）−（Ａｔｓ２°λ−Ａｔｂ２°λ）／（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　１°λ−Ａｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ　１°λ）−（Ａｔ　ｓｔａｎｄ　２°λ−Ａｔ　ｓｔａｎｄ　ｂ　２°λ）×カルシウム標準の既知カルシウム濃度＝試験サンプル中におけるカルシウムの濃度ステップからなる、カルシウムのアッセイ方法。２９．試薬が脂質混濁を最少化するために充分な量で少なくとも１種の非イオン系界面活性剤を含有する、請求項２８に記載の方法。３０．試薬が第一非イオン系界面活性剤及び第二非イオン系界面活性剤（第一及び第二非イオン系界面活性剤の混合濃度は脂質混濁を最少化させかつ試薬に第一及び第二非イオン系界面活性剤を相互溶解させる上で充分な濃度である）を含有する、請求項２８に記載の方法。３１．試薬がリットル当たりでアルセナゾｌｌｌ約８０ｍｇ；８−ヒドロキシキノリン約１／２ｇ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール約２１ｇ；約９の試薬ｐＨを得る上で充分な量の塩酸；ジメチルスルホキシド約１００ｍｌ；ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル約２ｍｌ；ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル約１．２ｍｌ；及び約１リットルの試薬容量を得る上で充分な量の水からなる、請求項２８に記載の方法。３２．一次波長が約６４０〜約６６０ｎｍであり、二次波長が約７００〜約８００ｎｍである、請求項２８、２９、３０又は３１に記載の方法。３３．一次波長が約６５０ｎｍであり、二次波長が約７００ｎｍである、請求項２８、２９、３０又は３１に記載の方法。