KR20100016213A - 분기 α-글루칸, 이를 생성하는 α-글루코실 전이 효소, 및 그의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

분기 α-글루칸, 이를 생성하는 α-글루코실 전이 효소, 및 그의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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다쿠오 야마모토
도모유키 니시모토
게이지 쓰사키
가즈유키 오쿠
히로토 차엔
시게하루 후쿠다
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가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Abstract

수용성 식물 섬유로서 유용한 글루칸과 그의 제조 방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 글루코오스를 구성 당으로 하는 α-글루칸으로서, 메틸화 분석에서, (1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1: 0.6 내지 1:4의 범위에 있고, (2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며, (3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고, (4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인 특징을 갖는 분기 α-글루칸; 상기 분기 α-글루칸을 생성하는 신규한 α-글루코실 전이 효소; 그의 제조 방법 및 용도를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

분기 α-글루칸, 이를 생성하는 α-글루코실 전이 효소, 및 그의 제조 방법 및 용도{BRANCHED α-GLUCAN, α-GLUCOSYLTRANSFERASE PRODUCING THE SAME, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF}
본 발명은 분기 α-글루칸, 이를 생성하는 α-글루코실 전이 효소, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 상세하게는 글루코오스를 구성 당(糖)으로 하는 α-글루칸으로서, 메틸화 분석에서
(1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1: 0.6 내지 1:4의 범위에 있고,
(2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며,
(3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고,
(4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인
것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸, 및 말토오스 및 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸에 작용하여 α-글루코실 전이함으로써 상기 분기 α-글루칸을 생성하는 작용을 갖는 α-글루코실 전이 효소, 그의 제조 방법, 상기 분기 α-글루칸을 함유하여 이루어지는 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
식물(食物) 섬유라고 함은 본래 동물이 소화하기 어려운 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 등 식물 세포 성분을 의미하지만, 광의로는 아밀라아제에 의해 소화되지 않는 난소화성 수용성 다당류도 포함되며, 이들이 수용성 식물 섬유라고 지칭된다. 최근, 식물 섬유는 그의 본래 기능인 정장 작용, 혈중 콜레스테롤 저하 작용, 혈당 조절 작용 등에 추가하여, 장내 세균(flora)을 개선하는 프리바이오틱스(prebiotics)로의 기능도 주목받고 있다. 그러나, 식물 섬유는 칼슘과 함께 일본인 식생활에서 부족한 영양소라고 말할 수 있으며, 현재 일본인의 평균적인 식물 섬유 섭취량은 1994년에 출판된 [일본인의 영양 소요량 제5차 개정판]에 기재된 식물 섬유의 목표 섭취량 20∼25g/일에 대하여 목표치의 5 내지 8%밖에 이르지 못한 것으로 지적되고 있다(예를 들면, 『식물 섬유의 시장 동향을 탐구한다』, [식품과 개발], 제34권, 제2호, 제24 내지 27페이지(1999년) 등을 참조). 이러한 상황에서 각종 음식물의 원료로 이용할 수 있고, 또한 수용성 식물 섬유로서 유용한 난소화성 다당류가 여러 가지 제안되고 있다.
예를 들면, 수용성 식물 섬유로서, 난소화성 전분(습열(濕熱) 처리된 하이아밀로오스콘스타치), 구아검 분해물, 글루코만난, 저분자 아르긴산 등, 자연계에 존 재하는 다당을 원료로 하는 것이 시장에 유통되고 있다. 그러나, 이들은 모두 점성이 높고, 식품 첨가시에 풍미·식감을 손상시키는 등의 결점을 가지므로 그 이용이 일부에 한정되고 있다. 한편, 저점도 수용성 식물 섬유로서 폴리덱스트로오스(미국 화이자사 개발) 또는 난소화성 덱스트린이 식품 분야에서 널리 이용되고 있다. 폴리덱스트로오스는 글루코오스와 소르비톨 및 구연산을 고진공하에 가열하고 화학 반응으로 중합시켜서 얻어진 합성 다당이며, 글루코오스가 1,2, 1,3, 1,4, 1,6, 1,2,6, 1,4,6 위치 등에 글루코시드 결합한 복잡한 분기를 갖는다고 알려져 있다. 또한, 난소화성 덱스트린은 화학 반응에 의해 전분을 분해함과 동시에 전이나 역합성 반응을 일으켜서 전분이 원래 갖지 않은 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,3,4의 각각의 글루코시드 결합을 도입함으로써 소화성을 저감시킨 합성 다당이다. 이 난소화성 덱스트린은 전분에 소량의 염산을 첨가하고 분말 상태에서 가열하여 얻은 배소(焙燒) 덱스트린을 물에 용해하고, α-아밀라아제를 첨가하여 가수 분해하여 얻은 저점도 용액을 정제하고, 농축, 분무 건조해서 제조하고 있다. 난소화성 덱스트린에는 소화성을 더 저감시킬 목적으로, 글루코 아밀라아제를 첨가해서 소화 가능 부분을 글루코오스로 분해하고, 글루코오스를 분리 제거해서 마찬가지로 정제, 분무 건조해서 제조한 제품도 있다. 그러나, 난소화성 덱스트린은 원료 전분으로부터의 수율이 낮고, 또한 착색이 쉬워서 공업 생산에 있어서 커다란 결점이 되고 있다. 이들 폴리덱스트로오스 또는 난소화성 덱스트린에 도입된 새로운 글루코시드 결합은 α- 및 β-의 양쪽 아노머(anomer)형이 함께 포함되고, 더욱이 환원성 말단 글루코오스 잔기는 부분적으로 1, 6-안하이드로-글루코오스로 변화한다고 한다(예를 들면, 『 저분자 수용성 식물 섬유』, 식품 성분 시리즈 「식물 섬유의 과학」, 제116 내지 131페이지, 아사쿠라 서점(1997년) 등을 참조).
글루칸에 있는 글루코오스 결합 양식인 글루코시드 결합(이하, 본 명세서에서는 「글루코시드 결합」을 간단히 「결합」이라고 약칭한다) 내에서 α-1, 6 결합은 α-1, 4 결합에 비해 아밀라아제로 분해되기 어렵기 때문에, α-1, 6 결합을 많이 함유하는 글루칸에도 수용성 식물 섬유로의 용도를 기대할 수 있다. 예를 들면, 유산균에 속하는 로이코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란 스쿠라아제(EC 2.4.1.5)에 의해 수크로오스를 원료로 하여 제조되는 덱스트란은 글루코오스가 주로 α-1, 6 결합으로 중합한 글루칸으로서, α-1, 2 결합 및 α-1, 3 결합의 분기를 갖는 경우도 있다. 로이코노스톡 메센테로이데스 B-512F주 유래의 덱스트란 스쿠라아제를 이용하는 경우, 얻어진 덱스트란에 있는 결합의 α-1, 6 결합의 함량은 90% 이상이어서 난소화성으로 기대된다. 그러나, 덱스트란은 수크로오스로부터의 수율이 낮고, 또한 점성이 높기 때문에 정제 조작이 번잡해서 비용이 높아지므로, 수용성 식물 섬유로서 이용하려는 시도는 거의 실시되지 않았다.
또한, 저렴한 전분에 아밀라아제를 작용시켜서 주로 α-1, 4 결합을 분해함으로써 α-1, 6 결합 함량을 높여 수용성 식물 섬유를 조제하려는 시도도 이루어졌다. 일본국 특개 제2001-11101호 공보에는 전분 액화액에 α-아밀라아제와 β-아밀라아제의 혼합물을 작용시킨 후에 잔존하는 덱스트린 부분을 회수함으로써 α-1, 4 결합에 대한 α-1, 6 결합의 비율을 10 내지 20%로 높인 분기 덱스트린을 조제하는 방법이 제안되었다. 그러나, 이 분기 덱스트린은 전분이 원래 가진 분기(α-1, 6 결합)를 유지하면서 글루코오스가 α-1, 4 결합으로 연결된 직쇄(直鎖) 부분을 제거함으로써 α-1, 6 결합의 비율을 높이는 방법으로 제조되기 때문에, 원료 전분으로부터의 수율이 낮고, 또한 대폭적인 소화성 저감을 기대할 수 없는 등의 과제가 있다. 또한, 전분 부분 분해물(덱스트린)에 작용하여 α-1, 6 결합을 도입하는 효소로서, 덱스트린덱스트라나아제(EC 2.1.1.2)가 알려져 있다(예를 들면, [야마모토 카즈야, 「바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리」, 제56권, (1992년), 제169 내지 173페이지 참조]). 덱스트린덱스트라나아제는 전분 부분 분해물에 작용하여 주로 α-1, 6 글루코실 전이 반응을 촉매함으로써 덱스트란 구조(글루코오스가 α-1, 6 결합으로 연결된 구조)를 생성하는 효소이지만, 종래에 알려져 있는 초산균에 속하는 아세토박터 캡슐라툼(Acetobacter capsulatum) 유래의 덱스트린덱스트라나아제는 α-1, 6 결합의 도입 비율이 적고(예를 들면, [스즈키 마사유키, 「응용 당과학 저널(Journal of Applied Glycoscience)」, 제48권, 제2호, 제143 내지 151페이지(2001년) 등 참조]), 효소 자체의 안정성이 낮은 것 등의 문제점이 있어서 현실에서 사용되지 못하고 있다. 이러한 상황에서, 수용성 식물 섬유의 선택 범위를 넓히는 의미에서도 신규한 난소화성 글루칸 및 이를 제조하는 수단의 제공이 강하게 요망된다.
본 발명은 수용성 식물 섬유로서 유용한 글루칸, 그의 제조 방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸을 원료(기질)로 해서 분기(본 명세서에서 「분기」라고 함은 글루칸에 있는 글루코오스 결합 양식 내에서 α-1, 4 결합 이외의 글루코오스 결합 양식을 의미한다)를 비교적 많이 갖는 분기 α-글루칸을 생성하는 효소에 기대를 하고, 이러한 효소를 산생(産生)하는 미생물을 널리 탐색하였다. 그 결과, 토양으로부터 단리시킨 미생물인 PP710주 및 PP349주가 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸에 작용하여, α-1, 4, α-1, 6, α-1, 3, α-1, 4, 6 및 α-1, 3, 6 결합을 갖는 분기 α-글루칸을 생성하는 신규한 α-글루코실 전이 효소를 균체 밖으로 산생하는 것을 발견하였다. 그리고, 이 신규 효소가 전분 부분 분해물 등의 α-1, 4 글루칸으로부터 글루코오스를 구성 당으로 하는 α-글루칸이며, 메틸화 분석에서
(1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1: 0.6 내지 1:4의 범위에 있고;
(2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며;
(3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고;
(4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인
것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸을 효율적으로 생성하는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 PP710주를 배양해서 얻은 α-글루코실 전이 효소의 조효소액에는 전분을 분해하는 아밀라아제가 혼재하고 있으며, 이 조효소액을 이용하든가, 또는 단리한 상기 아밀라아제를 α-글루코실 전이 효소와 병용함으로써 α-글루코실 전이 효소를 단독으로 이용하는 경우보다 수용성 식물 섬유 함량을 높인 분기 α-글루칸을 제조할 수 있음을 발견하였다. 또한, 상기 아밀라아제뿐만 아니라, 공지된 α-아밀라아제나 전분 지절(枝切) 효소 등을 α-글루코실 전이 효소와 병용함으로써, 얻어진 분기 α-글루칸의 중량 평균 분자량이나 수용성 식물 섬유 함량을 조정할 수 있는 것도 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 이러한 방법에 의해 얻어진 분기 α-글루칸은 원료 α-1, 4 글루칸에 비해 α-1, 6 결합의 비율이 대폭적으로 증가하고, 또한 α-1, 3 및 α-1, 3, 6 결합을 가지며, 현저한 난소화성을 나타내는 것으로부터 수용성 식물 섬유로서 유용하고, 혈당 상승 억제 작용이나 생체내 지질 저감 작용도 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 글루코오스를 구성 당으로 하는 α-글루칸이며, 메틸화 분석에서
(1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1:0.6 내지 1:4의 범위에 있고,
(2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며,
(3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고,
(4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인
것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸, 상기 분기 α-글루칸을 생성하는 신규한 α-글루코실 전이 효소, 그의 제조 방법 및 용도를 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.
본 발명에 의하면, 식품 분야를 비롯한 여러 분야에서 수용성 식물 섬유로서 유용하고 착색이 적은 난소화성 분기 α-글루칸을 양호한 수율로 대량·염가로 제조하여 공급할 수 있다.
도 1은 바실루스 서큐란스(Bacillus circulans) PP710 유래 및 아르스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소 표품(標品)을 각각 이용해서 전분 부분 분해물로부터 조제한 글루칸 A 및 B의 겔 여과 HPLC 크로마토그램을 기질(基質)인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이다.
도 2는 전분 부분 분해물 및 본 발명의 분기 α-글루칸의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 4는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 최적 pH를 나타낸 도면이다.
도 5는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 온도 안정성을 나타낸 도면이다.
도 6은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 7은 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 8은 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 최적 pH를 나타낸 도면이다.
도 9는 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 온도 안정성을 나타낸 도면이다.
도 10은 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 11은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제의 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 12는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제의 최적 pH를 나타낸 도면 이다.
도 13은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제의 온도 안정성을 나타낸 도면이다.
도 14는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 15는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제품과 아밀라아제 정제품을 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램을 기질인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이다.
도 16은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제품과 이소아밀라아제를 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램을 기질인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이다.
도 17은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제품과 α-아밀라아제를 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램을 기질인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이다.
도 18은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제품과 CGTase를 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램을 기질인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이다.
도 19는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제품, 이소아밀라아제 및 CGTase를 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC의 크로마토그램을 기질인 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램과 비교한 도면이 다.
부호의 설명
도 1 및 도 15 내지 도 19에서,
가: 분자량 1000,000 달톤에 상당하는 용출 위치
나: 분자량 100,000 달톤에 상당하는 용출 위치
다: 분자량 10,000 달톤에 상당하는 용출 위치
라: 분자량 1,000 달톤에 상당하는 용출 위치
마: 분자량 100 달톤에 상당하는 용출 위치
도 1에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 글루칸 A의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 글루칸 B의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
1: 글루코오스 중합도 499에 상당하는 위치
2: 글루코오스 중합도 6.3에 상당하는 위치
3: 글루코오스 중합도 384에 상당하는 위치
4: 글루코오스 중합도 22.2에 상당하는 위치
5: 글루코오스 중합도 10.9에 상당하는 위치
6: 글루코오스 중합도 1에 상당하는 위치
7: 글루코오스 중합도 433에 상당하는 위치
8: 글루코오스 중합도 22.8에 상당하는 위치
9: 글루코오스 중합도 10.9에 상당하는 위치
10: 글루코오스 중합도 1에 상당하는 위치
도 2에서,
1: 전분 부분 분해물의 모식도
2: 본 발명의 분기 α-글루칸의 모식도
a: 비환원성 말단 글루코오스 잔기
b: α-1, 3 결합한 글루코오스 잔기
c: α-1, 4 결합한 글루코오스 잔기
d: α-1, 6 결합한 글루코오스 잔기
e: α-1, 3, 6 결합한 글루코오스 잔기
f: α-1, 4, 6 결합한 글루코오스 잔기
경사 방향 파선: α-1, 3 결합
횡방향 실선: α-1, 4 결합
종방향 실선: α-1, 6 결합
도 13에서,
●: 칼슘 이온 비존재 하
○: 1mM 칼슘 이온 존재 하
도 15에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 아밀라아제를 0.1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 아밀라아제를 0.2 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
d: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 아밀라아제를 0.5 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
e: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 아밀라아제를 1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
도 16에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 50 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 200 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
d: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 500 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
e: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 1000 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
도 17에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, α-아밀라아제를 0.1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, α-아밀라아제를 0.2 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
d: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, α-아밀라아제를 0.5 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
e: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, α-아밀라아제를 1.0 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
도 18에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, CGTase를 0.1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, CGTase를 0.2 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
d: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, CGTase를 0.5 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
e: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, CGTase를 1.0 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
도 19에서,
a: 기질로 사용한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 50 단위, CGTase를 1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
c: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 200 단위, CGTase를 1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
d: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 500 단위, CGTase를 1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
e: 기질 1 그램당 α-글루코실 전이 효소를 10 단위, 이소아밀라아제를 1000 단위, CGTase를 1 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
본 발명에서 글루칸이라고 함은 글루코오스를 구성 당으로 하는 글루코오스 중합도 3 이상의 올리고당 내지는 다당을 의미한다. 본 발명의 분기 α-글루칸은 글루코오스를 구성 당으로 하는 α-글루칸이며, 메틸화 분석에서
(1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1:0.6 내지 1:4의 범위에 있고,
(2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며,
(3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고,
(4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 메틸화 분석이라고 함은 다당 또는 올리고당에서 이것을 구성하는 단당(單糖)의 결합 양식을 결정하는 방법으로 일반적으로 알려져 있는 방법이다. 메틸화 분석을 글루칸에 있는 글루코오스 결합 양식 분석에 이용할 경우, 우선, 글루칸을 구성하는 글루코오스 잔기에 있는 모든 유리(遊離) 수산기를 메틸화하고, 이어서 완전 메틸화한 글루칸을 가수 분해한다. 이어서, 가수 분해에 의해 얻은 메틸화 글루코오스를 환원해서 아노머형을 소거한 메틸화 글루시톨로 만들고, 또한 상기 메틸화 글루시톨에 있는 유리 수산기를 아세틸화함으로써 부분 메틸화 글루시톨아세테이트(이하, 본 명세서에서는 「부분 메틸화 글루시톨아세테이트」에 있는 아세틸화된 부위와 「글루시톨아세테이트」의 표기를 생략하고, 「부분 메틸화물」이라고 약칭할 경우가 있다)를 얻는다. 얻어진 부분 메틸화물을 가스 크로마토그래피로 분석함으로써, 글루칸에서 결합 양식이 각각 다른 글루코오스 잔기에서 유래하는 각종 부분 메틸화물은 가스 크로마토그램의 모든 부분 메틸화물의 피크 면적에서 차지하는 피크 면적의 백분율(％)로 나타낼 수 있다. 그리고, 이 피크 면적 ％로부터 상기 글루칸에 있는 결합 양식이 다른 글루코오스 잔기의 존재비, 즉, 각각의 글루코시드 결합의 존재 비율을 결정할 수 있다. 본원 명세서에서 부분 메 틸화물에 대한 「비」는 메틸화 분석의 가스 크로마토그램에서의 피크 면적의 비를 의미하고, 부분 메틸화물에 대한 「％」는 메틸화 분석의 가스 크로마토그램에서의 「면적 ％」를 의미한다.
상술한 (1)에서 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨(이하, 「2, 3, 6-트리메틸화물」이라고 약칭한다)이라고 함은 C-4 위치가 1, 4 결합에 관여하는 글루코오스 잔기를 의미하고, 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨(이하, 「2, 3, 4-트리메틸화물」이라고 약칭한다)은 C-6 위치가 1, 6 결합에 관여하는 글루코오스 잔기를 의미한다. 그리고, 「2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 비가 1:0.6 내지 1:4의 범위에 있다」라고 함은 메틸화 분석에서의 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 가스 크로마토그램에서, 본 발명의 분기 α-글루칸이 C-1 위치 이외에 C-4 위치만 결합에 관여하는 글루코오스 잔기와 C-1 위치 이외에 C-6 위치만 결합에 관여하는 글루코오스 잔기의 합계에 대한 C-1 위치 이외에 C-6 위치만이 결합에 관여하는 글루코오스 잔기의 비율이 37.5 내지 80.0%의 범위를 나타내는 것을 의미한다.
상술한 (2)에서 「2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계가 부분 메틸화물의 60% 이상을 차지한다」라고 함은 본 발명의 분기 α-글루칸이 C-1 위치 이외에 C-4 위치만이 결합에 관여하는 글루코오스 잔기와 C-1 위치 이외에 C-6 위치만이 결합에 관여하는 글루코오스 잔기의 합계가 글루칸을 구성하는 전체 글루코오스 잔기의 60% 이상을 차지하는 것을 의미한다.
마찬가지로, 상술한 (3)에서 「2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시 톨」(이하, 「2, 4, 6-트리메틸화물」이라고 약칭한다)이라고 함은 C-3 위치가 1, 3 결합에 관여하는 글루코오스 잔기를 의미하고, 「2, 4, 6-트리메틸화물이 부분 메틸화물의 0.5% 이상 10% 미만이다」라고 함은 본 발명의 분기 α-글루칸이 C-1 위치 이외에 C-3 위치만이 결합에 관여하는 글루코오스 잔기가 글루칸을 구성하는 전체 글루코오스 잔기의 0.5% 이상 10% 미만 존재하는 것을 의미한다.
또한, 마찬가지로, 상술한 (4)에서 「2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨」(이하, 「2, 4-디메틸화물로 약칭한다」)이라고 함은 C-3 위치 및 C-6 위치의 양쪽이 각각 1, 3 결합과 1, 6 결합에 관여하는 글루코오스 잔기를 의미하고, 「2, 4-디메틸화물이 부분 메틸화물의 0.5% 이상이다」라고 함은 본 발명의 분기 α-글루칸이 C-1 위치 이외에 C-3 위치와 C-6 위치가 결합에 관여하는 글루코오스 잔기가 글루칸을 구성하는 전체 글루코오스 잔기의 0.5% 이상 존재하는 것을 의미한다.
상기 (1) 내지 (4)의 조건을 모두 충족하는 본 발명의 분기 α-글루칸은 지금까지 알려지지 않은 신규한 글루칸이다. 본 발명의 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서 상기 (1) 내지 (4)의 조건을 충족하는 한, 글루코오스 잔기의 결합 순서는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 분기 α-글루칸은 통상 글루코오스 중합도가 10 이상인 여러 글루코오스 중합도를 갖는 분기 α-글루칸의 혼합물 형태로 있다. 또한, 본 발명의 분기 α-글루칸에서 그 중량 평균 분자량(Mw)을 수 평균 분자량(Mn)으로 나눈 값(Mw/Mn)은 보통 20 미만이다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 글루칸에 있는 이소말토오스 구조의 환원 말단 측에 인접하는 α-1, 2, α-1, 3, α-1, 4 및 α-1, 6 결합의 어느 쪽의 결합이어도 가수 분해하는 특징을 갖는 이소말토덱스트라나아제(EC 3.2.1.94)를 작용시키면 소화물 고형물당 이소말토오스를 보통 25 질량％ 이상 50 질량％ 이하 생성한다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 1996년 5월 일본국 후생성 고시 제146호의 영양 표시 기준, 「영양 성분 등의 분석 방법 등(영양 표시 기준 별표 제1의 제3란에 기재된 방법)」의 제8항, 「식물 섬유」에 기재된 「고속 액체 크로마토그래프법(효소-HPLC 방법)」에 준해서 수용성 식물 섬유 함량을 구하면, 수용성 식물 섬유를 통상 40 질량％ 이상 함유한다. 상기 고속 액체 크로마토그래프법(이하, 본 명세서에서는 「효소-HPLC 방법」이라고 약칭한다)의 개략을 설명하면, 시료를 열 안정 α-아밀라아제, 프로테아제 및 아밀로글루코시다아제(글루코아밀라아제)에 의한 일련의 효소 처리에 의해 분해 처리하고, 이온 교환 수지에 의해 처리액으로부터 단백질, 유기산, 무기 염류를 제거함으로써 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)용의 시료 용액을 조제한다. 이어서, 겔 여과 HPLC에 공여하여, 크로마토그램에서 소화되지 않은 글루칸과 글루코오스의 피크 면적을 구하고, 각각의 피크 면적과, 별도, 통상적인 방법의 글루코오스 옥시다아제법에 의해 구한 시료 용액중 글루코오스량을 이용하여, 시료의 수용성 식물 섬유 함량을 산출하는 방법이다. 상기 방법의 상세한 설명에 대해서는 후술하는 실험 항목에서 설명한다.
본 발명의 분기 α-글루칸은 후술하는 실험 19에 나타낸 바와 같이 경구 섭 취하여도 타액 α-아밀라아제, 췌액 α-아밀라아제나 소장 점막 α-글루코시다아제에 의해 분해되기 어렵기 때문에 소화 흡수되기 어려워서, 혈당을 급격하게 상승시키거나 인슐린 분비를 자극하는 것이 적은 저칼로리 수용성 식물 섬유로서 이용할 수 있다. 또한, 상기 분기 α-글루칸은 구강내 미생물에 의해 산 발효를 일으키기 어렵고, 수크로오스와 병용한 경우에도 치석 원인이 되는 불용성 덱스트란의 생성을 억제하는 작용을 가지므로, 낮은 충치 유발성 또는 항충치 당질로도 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 마우스(mouse)를 이용한 급성 독성 시험에서 아무런 독성을 나타내지 않는 글루칸이다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 후술하는 실험 20 및 21에 나타낸 바와 같이 통상의 전분질과 함께 섭취하면, 전분질만을 섭취하였을 경우에 비해 혈당값이나 인슐린량의 상승을 억제하기 때문에 혈당 상승 억제제로 사용할 수도 있다.
또한, 더욱이, 본 발명의 분기 α-글루칸은 후술하는 실험 22에 나타낸 바와 같이, 섭취에 의해 생체내 지질의 과잉 축적을 억제하는 작용도 가지므로 생체내 지질 저감제로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 분기 α-글루칸을 상기 혈당 억제제나 생체내 지질 저감제로서 이용할 경우, 분기 α-글루칸은 수용성 식물 섬유 함량이 높을수록 작용 효과가 우수하기 때문에, 수용성 식물 섬유로서 통상 40 질량％ 이상, 바람직하게는 50 질량％ 이상, 더욱 바람직하게는 60 질량％ 이상 함유하는 것이 적당하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 α-글루코실 전이 효소라고 함은 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용하여 실질적으로 가수 분해하지 않고 α- 글루코실 전이를 촉매함으로써 본 발명의 분기 α-글루칸을 생성하는 효소를 의미한다. 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 가수 분해 활성이 약한 점, 저농도로부터 고농도까지 기질 용액 농도에 좌우되지 않고 효율이 좋은 전이 활성을 갖는 점, 및 α-1, 3 및 α-1, 3, 6 결합도 생성하는 점에서, 종래 공지의 진균 유래의 α-글루코시다아제 또는 초산균 유래의 덱스트린덱스트라나아제와는 다른 효소이다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 효소 활성은 다음과 같이 해서 측정할 수 있다. 말토오스를 최종 농도 1 w/v％가 되도록 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 5ml에 효소액 0.5ml를 더해 40℃에서 30분간 효소 반응시키고, 그 반응액 0.5ml와 20mM 인산 완충액(pH 7.0) 5ml을 혼합하고, 비등 수욕(水浴) 중에서 10분간 가열함으로써 반응 정지시킨 후, 반응액중 글루코오스량을 통상적인 방법에 따라 글루코오스 옥시다아제법으로 측정하여, 반응에 의해 생성된 글루코오스량을 산출한다. α-글루코실 전이 효소의 활성 1 단위는 상기 조건하에서 1분동안 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 1개의 구체예로는 예를 들면, 하기의 이화학적 성질을 갖는 α-글루코실 전이 효소를 들 수 있다.
(1) 분자량
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에서 90,000±10,000 달톤;
(2) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서 50 내지 55℃;
(3) 최적 pH
40℃, 30분간 반응 조건 하에서 5.0 내지 6.3;
(4) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지 조건 하에서 40℃까지 안정; 및
(5) pH 안정성
4℃, 24시간 유지 조건 하에서 pH 3.5 내지 8.4의 범위에서 안정.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 다른 구체예로는 하기의 이화학적 성질을 갖는 α-글루코실 전이 효소를 들 수 있다:
(1) 분자량
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에서 90,000±10,000 달톤;
(2) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서 약 50℃;
(3) 최적 pH
40℃, 30분간 반응 조건 하에서 약 6.0;
(4) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지 조건 하에서 40℃까지 안정, 및
(5) pH 안정성
4℃, 24시간 유지 조건 하에서 pH 4.0 내지 8.0의 범위에서 안정.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 그 공급원에 의해 제한되지 않지만, 바람직한 공급원으로서 미생물을 들 수 있고, 특히, 본 발명자들이 토양으로부터 단리한 미생물 PP710주 또는 PP349주가 바람직하게 이용된다. 이하, 본 발명의 α-글 루코실 전이 효소의 산생 능력을 갖는 미생물 PP710주 및 PP349주의 동정(同定) 시험에서 판명된 균학적 성질 전반을 표 1 및 2에 각각 나타냈다. 또한, 동정 시험은 『미생물의 분류와 동정』, 하세가와 타케하루 편, 학회 출판 센터, 1985년에 준해서 실시하였다.
<A: 세포 형태>
육즙 한천 배양 27℃ 통상, 0.5×1.0 내지 2.0×6.0㎛의 간균(桿菌) 운동성 없음. 포자를 형성함. 그램 양성.
<B: 배양 성질>
육즙 한천 평판 배양 27℃
형상 원형 크기는 이틀만에 1 내지 2mm
주연(周緣) 전연(全緣)
융기 반 렌즈 형상
광택 둔광(鈍光)
표면 평활(平滑)
색조 반투명, 회백색
육즙 한천 사면 배양 27℃
생육 중 정도
형상 실 형상
육즙 젤라틴 천자(穿刺) 배양 27℃ 액화되지 않음
<C: 생리학적 성질>
VP 시험 음성
인돌의 생성 음성
디하이드록시아세톤의 생성 음성
전분의 가수 분해 양성
색소의 생성 가용성 색소의 생성은 없음
우레아제(urease) 음성
옥시다아제 음성
카타라아제(catalase) 양성
생육 범위 pH 5.5 내지 10.0, 온도 15 내지 37℃
글루코오스로부터의 산 생성 양성
글루코오스로부터의 가스 생성 음성
구연산의 이용 양성
타이로신(tyrosine)의 분해 음성
페닐아라닌(phenylalanine)의 탈아미노화 음성
질산염의 환원 양성
산소에 대한 태도 호기성
리튬 존재하의 생육 양성
DNA의 GC함량 53.4%
<A: 세포 형태>
육즙 한천 배양 27℃ 통상, 0.4×1.0 내지 0.6×3.0㎛의 구균(球菌) 또는 간균이며, 배양 초기에 주로 간균, 배양 종기에 단간균 또는 구균으로 형태를 변경하는 간균-구균 사이클을 갖는 다형성을 나타냄. 운동성 없음. 포자를 형성하지 않음. 그램 양성.
<B: 배양 성질>
육즙 한천 평판 배양 27℃
형상 원형 크기는 이틀만에 1 내지 2mm
주연 전연
융기 반 렌즈 형상
광택 습광(濕光)
표면 평활
색조 반투명, 옅은 황색
육즙 한천 사면 배양 27℃
생육 중 정도
형상 균질
육즙 젤라틴 천자 배양 27℃ 액화되지 않음
<C: 생리학적 성질>
산소에 대한 태도 호기성
세포벽 주요 디아미노산 리신
펩티도글리칸 리신, 알라닌
세포벽 N-아실형 아세틸형
세포벽 구성 주요 당 성분 갈락토오스, 글루코오스
카탈라아제 양성
세포외 DNase 양성
전분의 가수 분해 양성
비타민 요구성 음성
아르스로박터 글로비포르미스 표준 균주(DSM20124)의 16S rRNA와의 상동성 97%
이상의 균학적 성질에 근거하여, 『세균계통분리학의 버지즈 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)』, 제2권(1986년) 및 『리보소말데타베스』(URL:http://rdp．cme．msu．edu/index．jsp)를 참고로 해서, 미생물 PP710주 및 PP349주와 공지균의 이동(異同)을 각각 검토하였다. 그 결과, 미생물 PP710주는 바실루스 서큐란스에 속하는 미생물이며, 미생물 PP349주는 아르스로박터 글로비포르미스에 속하는 미생물로 판명되었다. 본 발명자 등은 이들 2균주를 각각 신규 미생물 바실루스 서큐란스 PP710 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349라고 명명하고, 모두 2006년 2월 1일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1가 1번지 1 중앙 제6소재의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁하여, 각각 수탁번호 FERM BP-10771 및 FERM BP-10770로 수탁되었다. 본 발명의 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물에는, 상기 균주는 처음부터, 상기 균주에 돌연 변이를 유발하여 선발해서 얻은 효소 고산생 변이주 등도 포함된다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물의 배양에 이용하는 배지는 미생물을 생육할 수 있고, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 산생할 수 있는 영양 배지이면 좋으며, 합성 배지 및 천연 배지의 어느 하나이어도 좋다. 탄소원으로는 미생물 생육에 이용할 수 있는 것이면 좋으며, 예를 들면, 식물 유래의 전분이나 피드글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀룰란(pullulan), 또한 이들의 부분 분해물이나 글루코오스, 프락토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질, 또한, 구연산, 숙신산 등의 유기산도 사용할 수 있다. 배지에 있는 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 의해 적당히 선택할 수 있다. 질소원으로는 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물 및 예를 들면, 요소, 콘 스티프 리커(corn steep liquor), 카제인, 펩톤, 효모 엑기스, 육류 엑기스 등의 유기 질소 함유물을 적당히 이용할 수 있다. 또한, 무기 성분으로는 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등의 염류를 적당히 이용할 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 아미노산, 비타민 등도 적당히 이용할 수 있다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물의 배양은 통상 온도 15 내지 37℃에서 pH 5.5 내지 10의 범위, 바람직하게는 온도 20 내지 34℃에서 pH 5.5 내지 8.5의 범위로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 실시된다. 배양 시간은 상기 미생물이 증식할 수 있는 시간이면 좋으며, 바람직하게는 10시간 내지 150시간이다. 또한, 배양 조건에서 배양액의 용존 산소 농도에는 특별한 제한은 없지만, 통상적으로는 0.5 내지 20ppm이 바람직하다. 그 때문에, 통기량을 조절하거나, 교반하는 등의 수단을 적당히 채용한다. 또한, 배양 방식은 회분(回分) 배양, 반연속 배양 또는 연속 배양의 어느 하나이어도 좋다.
이렇게 하여 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물을 배양한 후, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 함유하는 배양물을 회수한다. α-글루코실 전이 효소의 활성은 배양 미생물이 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771) 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770)의 모든 경우가, 주로 배양물의 제균액(除菌液)으로 인정받아, 제균액을 조효소액으로서 채취하는 것도, 배양물 전체를 조효소액으로서 이용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하기 위해서는 통상적인 방법인 고액(固液) 분리법이 채용된다. 예를 들면, 배양물 바로 그것을 원심 분리하는 방법 혹은 프리코트 필터(precoat filter) 등을 이용해서 여과 분리하는 방법, 평막(平膜), 중공사막(中空絲膜) 등의 막 여과에 의해 분리하는 방법 등이 적절하게 채용된다. 제균액은 그대로 조효소액으로서 이용할 수 있지만, 일반적으로는 농축해서 이용된다. 농축법으로는 황산 암모늄 염석법(鹽析法), 아세톤 및 알코올 침전법, 평막, 중공 막 등을 이용한 막 농축법 등을 채용할 수 있다.
또한, α-글루코실 전이 효소 활성을 갖는 제균액 및 그의 농축액을 이용하고, α-글루코실 전이 효소를 당업계에서 상용되고 있는 적당한 방법에 의해 고정화할 수도 있다. 고정화의 방법으로는 예를 들면, 이온 교환체에의 결합법, 수지 및 막 등과의 공유 결합법·흡착법, 고분자 물질을 이용한 포괄법 등을 적당히 채용할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 조효소액을 그대로 또는 농축해서 이용할 수 있지만, 필요에 따라 당업계에서 상용되고 있는 적당한 방법, 예를 들면, 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수(疏水) 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 조제용 전기 영동 등의 방법에 의해 추가로 분리·정제해서 이용할 수도 있다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 기질이 되는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸으로는 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 글리코겐 등이나, 이들을 아밀라아제 또는 산 등에 의해 부분적으로 가수 분해해서 얻은 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 및 말토오스 이상의 말토 올리고당 등의 전분 부분 분해물을 들 수 있다. 아밀라아제로 분해한 부분 분해물로는 예를 들면, 『아밀라아제 및 관련 효소의 핸드북(Handbooｋ of Amylases and Related Enzymes)』(1988년) 파가몬·프레스사(동경)]에 기재되어 있는 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 말토테트라오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.60), 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.98), 시클로 말토덱스트린글루카노트란스페라제(EC 2.4.1.19, 이하, 본 명세서에서는 「CGTase」라고 약칭한다) 등의 아밀라아제를 이용해서 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 글리코겐 등을 분해해서 얻어진 부분 분해물을 이용할 수 있다. 또한, 부분 분해물을 조제할 때, 풀루라나아제(EC 3.2.1.41), 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68) 등의 전분 지절(枝切) 효소를 작용시키는 것도 임의적이다. 전분은 예를 들면, 옥수수, 밀, 쌀 등 유래의 지상 전분이어도 좋고, 또한, 감자, 고구마, 타피오카 등 유래의 지하 전분이어도 좋다. 전분으로부터 본 발명의 글루칸을 제조할 때에는 상기와 같은 원료 전분을 통상적으로 호화 및/또는 액화해서 이용하는 것이 바람직하다. 전분의 호화·액화의 방법 자체는 공지된 방법을 채용할 수 있다. 또한, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 기질은 에테르화 전분(히드록시 프로필 전분, 카르복시메틸 전분, 아세트산 전분 등), 에스테르화 전분(인산화 전분, 옥테닐 호박산 전분 등) 및 가교 전분(아세틸화 아지핀산 가교 전분, 인산 가교 전분, 히드록시 프로필화 인산 가교 전분 등) 등, 전분의 일부를 화학적 방법에 의해 유도체화한 화공 전분이어도 좋다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 기질에 작용시킬 때에, 그 기질 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 기질 농도 0.5%(w/v)의 비교적 저농도의 용액을 이용한 경우에도 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 반응은 진행해서 분기 α-글루칸을 생성한다. 공업적으로, 기질 농도는 1%(w/v) 이상, 바람직하게는 5 내지 60%(w/v), 더욱 바람직하게는 10 내지 50%(w/v)의 범위로부터 선택되는 농도가 바람직하고, 이 조건 하에서 본 발명의 분기 α-글루칸을 유리하게 생성시킬 수 있다. 반응 온도는 반응이 진행되는 온도, 즉 60℃ 부근의 온도에서 실시하면 좋다. 바람직하게는 30 내지 50℃ 부근의 온도를 이용한다. 반응 pH는 통상적으로 4 내지 8의 범위, 바람직하게는 pH 5 내지 7의 범위로 조정하는 것이 좋다. 효소 사용량과 반응 시간은 밀접하게 관련되어 있으며, 목적하는 효소 반응의 진행에 의해 적당히 선택하면 좋다.
예를 들면, 전분 또는 그의 부분 분해물이나 아밀로오스의 수용액에 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 작용시켰을 경우의 분기 α-글루칸의 생성 메카니즘은 아래와 같이 추측된다.
1) 본 효소는 기질로서 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용하여, 비환원성 말단 글루코오스 잔기를 다른 α-1, 4 글루칸의 비환원성 말단 글루코오스 잔기에 주로 α-1, 4 또는 α-1, 6 글루코실 전이함으로써, 비환원성 말단 글루코오스 잔기의 4 위치 또는 6 위치 수산기에 글루코오스가 α-결합한 α-1, 4 글루칸(글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 α-1, 4 글루칸을 생성한다.
2) 본 효소는 또한, 1)에서 생긴 글루코오스 중합도가 1 감소한 α-1, 4 글루칸에 작용하여, 1)에서 생긴 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸에 대하여, 1)과 마찬가지로 분자간 α-1, 4 또는 α-1, 6 글루코실 전이함으로써, 1)에서 생성된 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸의 비환원성 말단 글루코오스 잔기의 4 위치 또는 6 위치 수산기에 글루코오스를 추가로 전이하여 쇄 길이를 증가시킨다.
3) 상기 1) 및 2)의 반응을 반복함으로써, 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸으로부터 α-1, 4 및 α-1, 6 결합을 갖는 글루칸을 생성한다.
4) 본 효소는 또한 빈도는 낮으면서도 α-1, 3 글루코실 전이나 글루칸의 내부에 있는 α-1, 6 결합한 글루코오스 잔기에 대한 α-1, 4 또는 α-1, 3 글루코실 전이를 촉매함으로써 α-1, 3 결합, α-1, 4, 6 결합 및 α-1, 3, 6 결합도 갖는 글루칸을 생성한다.
5) 상기 1) 내지 4)의 반응이 반복되는 결과로서, 글루코오스가 주로 α-1, 4 결합 및 α-1, 6 결합으로 결합하여, 약간이지만 α-1, 3 결합, α-1, 4, 6 결합 및 α-1, 3, 6 결합을 갖는 본 발명의 분기 α-글루칸을 생성한다.
또한, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)은 그 배양물 중에 본 발명의 α-글루코실 전이 효소뿐만 아니라, 어느 종류의 아밀라아제도 동시에 산생하고, 의외로도, α-글루코실 전이 효소와 이 아밀라아제를 병용해서 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용시키면, α-글루코실 전이 효소를 단독으로 작용시켰을 경우보다도 수용성 식물 섬유 함량을 더욱 높인 분기 α-글루칸을 제조할 수 있는 것으로 판명되었다.
바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)이 산생하는 아밀라아제로는 하기의 이화학적 성질을 갖는 것을 들 수 있다:
(1) 작용
전분을 가수 분해함과 더불어 글리코실기의 전이를 촉매하여, 시클로 덱스트린도 생성한다. 풀룰란을 가수 분해하여 파노스(panose)를 생성한다;
(2) 분자량
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에서 58,000±10,000 달톤;
(3) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서 55℃;
(4) 최적 pH
35℃, 30분간 반응 조건 하에서 6 내지 7;
(5) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지 조건 하에서 40℃까지 안정,
pH 6.0, 1mM Ca2+ 이온 존재 하에서 50℃까지 안정; 및
(6) pH 안정성
4℃, 24시간 유지 조건 하에서 pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 안정.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 이 아밀라아제를 병용해서 전분 부분 분해물에 작용시켰을 경우에 얻어진 분기 α-글루칸의 수용성 식물 섬유 함량이 α-글루코실 전이 효소만을 이용해서 조제한 분기 α-글루칸의 경우보다도 높은 이유는 α-글루코실 전이 효소의 작용으로 생성하는 분기 α-글루칸에 대하여 아밀라아제가 추가로 글리코실기를 전이하여, 글루칸에서의 분기 정도(빈도)를 더욱 향상시키기 때문으로 추측된다.
또한, 효소 반응에 의해 본 발명의 분기 α-글루칸을 조제할 때, 다른 공지의 아밀라아제를 병용해서 반응시킴으로써 분기 α-글루칸의 분자량 분포를 조절하는 것도, 또한, 소화성을 더욱 저감시킨 분기 α-글루칸으로 하는 것도, 추가로 환원력을 저감시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 전분 액화액에 본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 함께, α-아밀라아제나 CGTase 등, 전분 내부의 α-1, 4 결합을 가수 분해하여, 신규한 비환원성 말단 글루코오스 잔기를 생기게 하는 효소를 병용해서 작용시킴으로써 분자량 분포 폭을 좁히고, 점도를 저감시켜서 소화성 저감에 기여하는 α-1, 3, α-1, 6 및 α-1, 3, 6 결합의 비율을 더욱 증가시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 이소아밀라아제 등의 전분 지절 효소를 병용함으로써 분자량 분포 폭을 좁히고 점도를 저감시키거나, 일본국 특개평 제7-143876호 공보 등에 개시된 비환원성 당질 생성 효소(별명: 말토올리고실트레할로오스 생성 효소(EC 5.4.99.15))를 병용함으로써 환원성 말단부분을 부분적으로 트레할로오스 구조로 변환해서 환원력을 저감시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸을 함유하는 영양 배지에서 본 발명의 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 배양액 중에 생성하는 분기 α-글루칸을 채취하여서도 제조할 수 있다.
상기의 반응 또는 배양에 의해 얻은 분기 α-글루칸은 그대로 분기 α-글루칸 제품으로 할 수도 있다. 또한, 필요에 따라서, 반응액에 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코 아밀라아제 및 α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 작용시켜서, 소화 가능 부분을 가수 분해한 후, 비소화 부분을 분획에 의해 회수하거나, 효모 등을 이용한 발효 처리에 의해 글루코오스를 비롯한 분해물을 제거함으로써 소화성이 더욱 저감된 분기 α-글루칸을 조제할 수도 있다. 일반적으로는, 분기 α-글루칸을 함유하는 반응액은 더욱 정제되어서 이용된다. 정제 방법으로는 당의 정제에 이용되는 통상의 방법을 적당히 채용하면 좋으며, 예를 들면, 활성탄에 의한 탈색, H형, OH형 이온 교환 수지에 의한 탈염, 알코올 및 아세톤 등의 유기 용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 갖는 막에 의한 분리 등의 1종 또는 2종 이상의 정제 방법을 적당히 채용할 수 있다.
본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 호화 전분이나 비교적 낮은 DE(Dextrose Equivalent), 바람직하게는 DE 20 미만의 전분 부분 분해물에 작용시켰을 경우, 글루코오스나 말토오스 등의 저분자 올리고당을 거의 생성하지 않으므로, 얻어진 반응 생성물을 칼럼 크로마토그래피 등의 정제 수단으로 정제할 필요는 특별히 없지만, 용도 등 목적에 따라서 추가로 분획하는 것도 임의적이다. 분획에 이온 교환 크로마토그래피를 채용하는 경우, 예를 들면, 일본국 특개소 제58-23799호 공보, 일본국 특개소 제58-72598호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 유리하게 이용할 수 있다. 이 때, 고정상 방식, 이동상 방식, 유사 이동상 방식중 어떠한 방식을 채용하는 것도 임의적이다.
이렇게 하여 얻은 본 발명의 분기 α-글루칸은 용액인 채로 이용할 수 있지만, 보존에 유리하고, 용도에 따라 이용하기 쉽도록 건조하여 분말 제품으로 하는 것이 바람직하다. 건조에는 통상적으로 동결 건조, 혹은 분무 건조나 드럼 건조 등의 방법을 이용할 수 있다. 건조물은 필요에 따라 분쇄하여 분말화하는 것도, 체질(篩別) 또는 조립해서 특정 입도 범위로 조절하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 침투압 조절성, 부형성(賦形性), 광택 부여성, 보습성, 점도 부여성, 접착성, 다른 당의 결정 방지성, 난발효성 등의 성질을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 분기 α-글루칸 또는 이것을 함유하는 당질은 수용성 식물 섬유, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 분기 α-글루칸은 예를 들면, 가루 엿, 포도당, 과당, 이성화당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스, 벌꿀, 메이플 슈가, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드(stevioside), α-글리코실스테비오시드, 라칸카 감미물, 글리틸리틴, 소마틴(thaumatin), 스쿠랄로오스, L-아스팔라틸페닐알라닌메틸에스테르, 사카린, 글라이신, 알라닌 등과 같은 감미료와, 또한, 덱스트린, 전분, 덱스트란, 락토오스 등과 같은 증량제(增量劑)와 혼합해서 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸의 분말상 제품은 그대로 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여, 과립(顆粒), 구상(球狀), 단봉상(短棒狀), 판상(板狀), 입방체 등 각종 형상으로 성형해서 사용하는 것도 임의적이다.
또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 경구 섭취해도 소화되기 어려우므로, 수용성 식물 섬유로서 일반 음식물 등에 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 거르지 않은 간장, 소금 절임, 가루 식품, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 분말 초밥용 초, 중화요리의 프리믹스, 튀김용 간장, 국수용 간장, 소스, 케첩, 불고기용 조미 국물, 카레루, 스튜의 프리믹스, 수프의 프리믹스, 우려낸 국물의 프리믹스, 복합 조미료, 미림, 신 미림, 테이블 슈가, 커피 슈가 등의 각종 조미료에서 품질 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 예를 들면, 센베이, 주사위 모양 과자, 밥풀 과자, 찹쌀 과자, 떡류, 만두, 막대 모양 시루떡, 팥소류, 양갱, 물양갱, 여름용 조림 과자, 젤리, 카스테라, 눈깔 사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스킷, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈 크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜릿, 츄잉 검, 캐러멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스크림, 샤벳 등의 빙과, 과실의 시럽 절임, 꿀 얼음 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마말레이드, 시럽 절임, 당과(糖菓) 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진즈께, 무 절임, 순무 김치 등의 절임류, 단무지 절임의 프리믹스, 배추 절임의 프리믹스 등 절임물의 프리믹스, 햄, 소세지 등의 육제품류, 어육 햄, 피시 소시지, 가마보꼬, 치크와, 튀김 등의 어육제품, 성게, 물오징어 젓, 초 다시마, 말린 갑오징어, 대구, 도미, 새우 등의 조리 생선 등의 각종 진미류(珍味類), 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬 식품, 유제품, 어육, 축육(畜肉), 과실, 야채 병조림, 통조림류, 합성주, 증양주(增釀酒), 청주, 과실주, 발포주, 맥주 등의 주류, 커피, 코코아, 주스, 탄산 음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸딩 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 주스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석 식품, 또한 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등의 각종 음식물에 배합 가능한 수용성 식물 섬유로서 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 가축, 가금(家禽), 기타 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등으로서 정장, 변비 개선, 비만 방지 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 립스틱, 립크림, 내복액, 정제, 트로키(troche), 간유 드롭스, 구강 청량제, 구강 향기제, 양치제 등 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등의 형태로 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 품질 개량제, 안정화제 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
품질 개량제, 안정화제로는 유효 성분, 활성 등을 잃기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유하는 건강 식품, 기능성 식품, 의약품 등에 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들면, 인터페론-α, -β, -γ, 종양 괴사 인자-α, -β, 매크로파지 유주 저지 인자(macrophage migration inhibition factor), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor), 전달 인자(transfer factor), 인터루킨 Ⅱ 등의 림포카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴(prolactin), 에리트로포에틴(erythropoietin), 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 두묘(痘苗), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 허브 항독소, 인간 면역 글로불린 등의 생물제제 함유액, 페니실린, 에리트로마이신(erythromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 테트라사이클린(tetracycline), 스트렙토마이신, 황산 카나마이신(kanamycin) 등의 항생 물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드(carotenoid), 엘고스테롤(ergosterol), 토코페롤 등의 비타민 함유액, EPA, DHA, 아라키돈산(arachidonic acid) 등의 고도 불포화지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파제, 에스테라제, 우로키나아제, 프로테아제, α-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 약용 인삼 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스(propolis) 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트, 로열 젤리 등의 각종 생리 활성 물질도 본 발명의 분기 α-글루칸을 품질 개량제, 안정화제로서 이용함으로써, 그 유효 성분, 활성을 잃지 않고 안정적으로 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강 식품, 기능성 식품이나 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있다.
이상, 설명한 바와 같은 각종 조성물에 본 발명의 분기 α-글루칸을 함유시키는 방법으로는 그 제품이 완성될 때까지의 공정에 함유시키면 좋으며, 예를 들면, 혼화, 혼날(混捏), 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 고화(固化) 등 공지의 방법이 적당히 선택된다. 그 양은 통상적으로는 조성물의 0.1 질량％ 이상, 바람직하게는 1 질량％ 이상 함유하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸을 함유하여 이루어지는 조성물에 작용시키면 α-1, 4 글루칸을 본 발명의 분기 α-글루칸으로 변환시키기 때문에 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸을 함유하여 이루어지는 조성물의 개질제로서 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용시키면 본 발명의 분기 α-글루칸을 생성하고, 한편 본 발명의 분기 α-글루칸은 이소말토덱스트라나아제(EC 3.2.1.94)에 의해 소화되면 이소말토오스가 기질 고형물당 25 질량％ 이상 50 질량％ 이하 생성되기 때문에, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸을 원료로 해서, 이것들 2단계의 효소 반응에 의해 이소말토오스 또는 이것을 함유하는 당질을 제조할 수 있다.
이하, 실험에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.
<실험 1: 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771) 유래 α-글루코실 전이 효소를 이용한 글루칸의 조제>
<실험 1-1: 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771) 유래 α-글루코실 전이 효소의 조제>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매) 1.5 w/v％, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 일본 제약 주식회사 판매) 0.5 w/v％, 효모 추출물(상품명 『효모 엑기스 S』, 일본 제약 주식회사 판매) 0.1 w/v％, 인산 2칼륨 0.1 w/v％, 인산 1나트륨·2수화물 0.06 w/v％, 황산 마그네슘·7수화물 0.05 w/v％, 황산 망간·5수화물 0.001 w/v％, 황산 제1철·7수화물 0.001 w/v％ 및 물로 이루어진 액체 배지를 500ml들이 삼각플라스크 1개에 100ml 넣어, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여, 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)을 접종하고, 27℃, 230rpm으로 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양(種培養; starter culture)으로 하였다.
500ml들이 삼각플라스크 12개에 종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 100ml씩 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 약 1ml씩 접종하고, 온도 27℃, 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 후, 삼각플라스크로부터 배양액을 뽑아내, 원심 분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제거하고, 얻은 배양 상청의 α-글루코실 전이 효소 활성을 측정한 바, 2.8 단위/ml이었다. 이 배양 상청 약 1L에 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가, 용해하고, 4℃, 24시간 방치함으로써 염석(鹽析)하였다. 침전된 염석물을 원심 분리(11,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이것을 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석(透析)하여, 조효소액 약 20ml를 얻었다. 이 조효소액을 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 토소 주식회사제 『CM-토요팔 650S』 겔을 이용한 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 20ml)에 제공하였다. 비흡착 단백질을 용출한 후, 식염 농도 0M으로부터 0.5M의 리니어그라디엔트(Linear Gradient)로 용출시켜, 식염 농도 약 0.18M 부근으로부터 0.45M 부근에 용출한 획분을 회수하여, 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석하였다. 얻은 투석액을 α-글루코실 전이 효소 표품(標品)으로 하였다.
<실험 1-2: α-글루코실 전이 효소를 이용한 분기 α-글루칸의 조제>
실험 1-1에서 얻은 α-글루코실 전이 효소 표품 100ml를 효소액으로 이용하고, 이것에 최종 농도 30 w/v％가 되도록 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)을 첨가하고, 72시간, 40℃로 반응시킨 후, 약 100℃로 10분간 열처리함으로써 반응을 정지하였다. 불용해물을 여과해서 제거한 후, 미쓰비시 화학제 이온 교환 수지 『다이야 이온 SＫ-1B』와 『다이야 이온 WA30』 및 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA 411』을 이용해서 탈색, 탈염하고, 정밀 여과한 후, 증발기로 농축하여, 고형분 농도 30 질량％의 글루칸 용액을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물로부터 고형물당 85.8%의 수율로 얻었다.
<실험 2: 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770) 유래 α-글루코실 전이 효소를 이용한 글루칸의 조제>
<실험 2-1: 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770) 유래 α-글루코실 전이 효소의 조제>
바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)을 대신하여 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770)를 접종한 것 이외는 실험 1-1과 마찬가지로 배양한 것을 종배양으로 하였다.
500ml들이 삼각플라스크 12개에 종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 100ml씩 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 약 1ml씩을 접종하고, 온도 27℃, 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 후, 삼각플라스크로부터 배양액을 뽑아내, 원심 분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제거하고, 얻은 배양 상청의 α-글루코실 전이 효소 활성을 측정한 바, 0.53 단위/ml이었다. 이 배양 상청 약 1L에, 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가, 용해하여, 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 침전한 염석물을 원심 분리(11,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이것을 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해한 후에 동일 완충액에 대하여 투석하였다. 이 조효소액을 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 토소 주식회사제 『DEAE-토요팔 650S』 겔을 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 20ml)에 제공하였다. 비흡착 단백질을 용출한 후, 식염 농도 0M으로부터 0.5M의 리니어 그라디엔트로 용출시켜, 식염 농도 약 0.05M 부근으로부터 0.2M 부근에서 용출한 획분을 회수하고, 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석하였다. 얻은 투석액을 α-글루코실 전이 효소 표품으로 하였다.
<실험 2-2: α-글루코실 전이 효소를 이용한 글루칸의 조제>
실험 2-1에서 얻은 α-글루코실 전이 효소 표품 20ml를 효소액으로 이용하고, 이것에 최종 농도 30 w/v％가 되도록 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)을 첨가하여, 72시간, 40℃로 반응시킨 후, 약 100℃로 10분간 열처리함으로써 반응을 정지하였다. 불용해물을 여과해서 제거한 후, 미쓰비시 화학제 이온 교환 수지 『다이야 이온 SＫ-1B』와 『다이야 이온 WA30』 및 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA 411』을 이용해서 탈색, 탈염하고, 정밀 여과한 후, 증발기에서 농축하여, 고형분 농도 30 질량％의 글루칸 용액을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물로부터 고형물당 83.6% 수율로 얻었다.
이하의 실험 3 및 4에서는 실험 1-2에서 얻은 글루칸과 실험 2-2에서 얻은 글루칸을 구별할 목적으로 각각 「글루칸 A」 및 「글루칸 B」라고 호칭한다.
<실험 3: 글루칸 A 및 B의 수용성 식물 섬유로서의 평가>
얻은 글루칸의 수용성 식물 섬유 함량을 영양 표시 기준(1996년 5월 일본국 후생성 고시 제146호)에서의 영양 성분 등의 분석 방법 등(영양 표시 기준별 표 제1의 제3란에 기재된 방법), 8. 식물 섬유, (2) 고속 액체 크로마토그래프법(효소-HPLC 방법) 기재의 방법에 준해서 하기의 방법에 의해 조사하였다. 효소 처리용 키트(kit)로서, 총 식물 섬유 측정 키트(Dietary Fiber, Total, Assay, Control Ｋit, 시그마사제)를 이용하였다. 또한, 글루칸 A 및 B의 조제에 이용한 기질인 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)을 대조 1로 하고 시판되는 난소화성 글루칸(상품명 『파인 파이버』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)을 대조 2로 해서, 마찬가지로 각각의 수용성 식물 섬유 함량을 조사하였다.
<분석용 시료 용액의 조제>
피험 시료로서 고형분 0.1g의 글루칸을 시험관에 취해, 0.08M 인산 완충액 5ml를 첨가해 pH 6.0으로 조정하였다. 이것에, 식물 섬유 측정 키트 부속의 열 안정 α-아밀라아제(바실루스 리케니포르미스 유래 내열성 α-아밀라아제, 시그마사제) 용액 0.01ml를 더해, 알루미늄 호일로 싸고, 비등 수욕 중에서 5분마다 교반하면서 30분간 반응시켜 냉각하였다. 얻은 반응액에 0.275M 수산화나트륨 용액 약 1ml를 첨가해 pH 7.5로 조정한 후, 키트 부속의 프로테아제(바실루스 리케니포르미스 유래, 시그마사제) 용액 0.01ml를 더해, 알루미늄 호일로 싸고, 60℃의 수욕 중에서 진탕하면서 30분간 반응시켜 냉각하였다. 얻은 프로테아제 처리액에 0.325M 염산을 약 1ml 첨가하여, pH 4.3으로 조정한 후, 키트 부속의 아밀로글루코시다아제(아스페르길루스 니거 유래, 시그마사제) 용액 0.01ml를 더해, 알루미늄 호일로 싸고, 60℃ 수욕 중에서 진탕하면서 30분간 반응시켜 냉각하였다. 이어서, 얻은 반응액 약 7ml를, 이온 교환 수지(오르가노 주식회사 판매의 앰버 라이트 IRA-67(OH형)과 앰버 라이트 200CT(H형)를 1:1로 혼합)에 SV 1.0으로 통액함으로써 탈염하고, 추가로 약 3배량의 탈이온수로서 용출하여, 용출액의 총량을 약 28ml로 하였다. 얻은 용출액을 증발기로 농축하여, 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과시킨 후, 메스 플라스크에서 25ml로 일정 용량으로 한 것을 분석용 시료 용액으로 하였다.
<고속 액체 크로마토그래피 조건>
상기에서 얻은 분석용 시료 용액은 하기 조건에 의한 고속 액체 크로마토그래피에 제공하였다.
칼럼: TGＫgel G2500PWXL(내경 7.8mm×길이 300mm, 주식회사 토소제) 2개를 직렬로 연결한 것
용리액: 탈이온수
시료당 농도: 0.8 질량％
칼럼 온도: 80℃
유속: 0.5ml/분
검출: 시차 굴절계
주입량: 20μl
분석 시간: 50분
<피험 시료의 수용성 식물 섬유 함량의 산출>
상기에서 얻은 크로마토그램에서 효소 처리에 의해 분해되지 않고 잔존하는 소화되지 않은 글루칸을 수용성 식물 섬유라고 하였다. 이 수용성 식물 섬유와 분해되어 생성된 글루코오스의 피크 면적을 각각 구해, 각각 통상적인 방법의 글루코오스 옥시다아제법으로 정량한 분석용 시료 용액 중의 글루코오스량을 이용하여, 하기 수학식 1에 의해 수용성 식물 섬유량을 구하였다. 또한, 하기 수학식 2에 의해 피험 시료의 수용성 식물 섬유 함량을 구하였다.
Figure 112009067734358-PCT00001
*: (분석용 시료 용액중 글루코오스 농도(mg/ml)×25ml)
Figure 112009067734358-PCT00002
상기 효소-HPLC 방법에 의해 구한 글루칸 A 및 글루칸 B의 수용성 식물 섬유 함량은 각각 42.1 질량％ 및 41.8 질량％이었다. 한편, 대조 1의 전분 부분 분해물은 효소 처리에 의해 모두 글루코오스로 분해되어, 수용성 식물 섬유 함량은 0 질량％로 평가되었다. 또한, 대조 2의 시판되는 난소화성 덱스트린(상품명 『파인 파이버』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)의 경우에는 48.7 질량％이었다. 이러한 결과는 수용성 식물 섬유를 함유하지 않은 전분 부분 분해물을 기질로서 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 작용시킴으로써 시판되는 난소화성 덱스트린과 거의 동등한 수용성 식물 섬유 함량을 나타내는 글루칸을 용이하게 조제할 수 있음을 나타낸다.
<실험 4: 글루칸 A 및 B의 구조 해석>
<실험 4-1: 메틸화 분석>
실험 1-2 및 2-2의 방법으로 얻은 글루칸 A 및 B에 대해서 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석을 하고, 하기 조건에 의한 가스 크로마토그래피법으로 부분 메틸화물을 조사하였다. 결과를 표 3에 정리하였다.
<가스 크로마토그래피 조건>
칼럼: DB-5 모세관 칼럼(내경 0.25mm×길이 30m×막 두께 1㎛, J&W Scientific사제)
캐리어 가스: 헬륨
칼럼 온도: 130℃로 2분간 유지한 후, 250℃까지 5℃/분으로 승온(昇溫)하여 250℃로 20분간 유지
유속: 1.0ml/분
검출: FID
주입량: 3μl(스플릿 1/30)
분석 시간: 46분
부분 메틸화물의 종류 대응하는 글루코오스 잔기 존재비(면적%)
원료 전분* 부분 분해물 글루칸A 글루칸B
2, 3, 4, 6-테트라메틸화물 비환원성 말단 글루코오스 잔기 5.8 10.1 9.8
3, 4, 6-트리메틸화물 1, 2 결합한 글루코오스 잔기 0.0 0.0 0.0
2, 4, 6-트리메틸화물 1, 3 결합한 글루코오스 잔기 0.0 1.1 0.9
2, 3, 6-트리메틸화물 1, 4 결합한 글루코오스 잔기 89.8 51.5 49.1
2, 3, 4-트리메틸화물 1, 6 결합한 글루코오스 잔기 0.0 32.2 33.9
2, 4-디메틸화물 1, 3, 6 결합한 글루코오스 잔기 0.0 0.8 1.1
2, 3-디메틸화물 1, 4, 6 결합한 글루코오스 잔기 4.4 4.5 5.2
*: 파인덱스 #100 글루칸 A: PP710주 유래 α-글루코실 전이 효소로 조제한 글루칸 글루칸 B: PP349주 유래 α-글루코실 전이 효소로 조제한 글루칸
표 3의 결과로부터 명확한 바와 같이, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소에 의해 각각 조제한 글루칸 A 및 B의 메틸화 분석의 결과를, 기질인 전분 부분 분해물의 경우와 비교하면, 모든 글루칸의 경우에서 2, 3, 6-트리메틸화물이 현저하게 감소하는 반면, 2, 3, 4-트리메틸화물이 30% 이상까지 현저하게 증가되었다. 이는, 바실루스 서큐란스 PP710 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 반응에 의해, 글루코오스가 주로서 α-1, 4 결합에 의해 중합한 구조를 갖는 전분 부분 분해물이 α-1, 6 결합을 30% 이상 함유하는 분기 α-글루칸으로 변환된 것을 의미한다. 또한, 2, 3, 4, 6-테트라메틸화물, 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물이 증가하는 것으로부터, 비환원성 말단 글루코오스, α-1, 3 결합 및 α-1, 3, 6 결합이 새롭게 생성되는 것도 판명되었다. 글루칸 A의 부분 메틸화물에서 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물의 함량은 각각 1.1% 및 0.8%이며, 글루칸 B의 부분 메틸화물에 있는 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물의 함량은 각각 0.9% 및 1.1%이었다. 또한, 글루칸 A 및 B에서 2,3-디메틸화물의 존재비는 기질과 거의 차이가 없는 것으로부터, 기질에 원래 존재하는 분기인 α-1, 4, 6 결합에 커다란 변화는 없다고 생각되었다. 이 결과로부터, 글루칸 A 및 B는 기질인 전분 부분 분해물과 크게 차이나고, 글루코오스 결합 양식이 α-1, 4 결합 및 α-1, 6 결합을 주체로 해서 α-1, 3 결합 및 α-1, 3, 6 결합도 약간 갖는 분기 글루칸(분기 α-글루칸)인 것으로 판명되었다. 또한, 분기 α-글루칸 A 및 B를 구성하는 글루코오스의 1위의 아노머형은 핵자기 공명(NMR) 분석의 1H-NMR 스펙트럼으로부터 모두 α 형으로 판명되었다.
<실험 4-2: 분기 α-글루칸 A 및 B의 이소말토덱스트라나아제 소화 시험>
분기 α-글루칸 A 및 B의 구조를 특징지을 목적으로, 이소말토덱스트라나아제 소화 시험을 실시하였다. 분기 α-글루칸 A 및 B의 수용액(최종 농도 1 w/v％)에 아르스로박터 글로비포르미스 유래의 이소말토덱스트라나아제(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소 내에서 조제)를 기질 고형물 1 그램당 100 단위 가하고, 50℃, pH 5.0으로 16시간 작용시켜, 100℃로 10분간 유지해서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액중 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피(이하, 「HPLC」라고 약칭한다) 및 가스 크로마토그래피(이하, 「GC」라고 약칭한다)를 이용해서 조사하였다. HPLC는 칼럼으로 『MCI GEL CＫ04SS』(주식회사 미쓰비시 화학 제조) 2개를 이용하고, 용리액으로 물을 이용하며, 칼럼 온도 80℃, 유속 0.4ml/분의 조건으로 실시하고, 검출은 시차 굴절계 RID-10A(주식회사 시마즈 제작소 제조)를 이용하여 실시했다. GC는 통상적인 방법에 따라 당질을 트리메틸실릴화(TMS화)한 후, 칼럼에 『2% 실리콘 OV-17 Chromosorb W/AW-DMS』(주식회사 지 엘 사이언스 제조)를 이용하여, 1분에 7.5℃ 승온 속도로 온도 160℃로부터 320℃까지 승온하였다. 캐리어 가스로서 질소 가스를 이용하고, 검출은 FID법으로 실시하였다. 이소말토덱스트라나아제 소화에서 분기 α-글루칸의 조제에 이용한 기질인 전분 부분 분해물로부터는 이소말토오스가 전혀 생성되지 않은 것에 비하여, 분기 α-글루칸 A로부터는 당 조성으로서 28.4 질량％의 이소말토오스가, 또한, 분기 α-글루칸 B로부터는 당 조성으로서 27.2 질량％의 이소말토오스가 각각 생성되었다. 이 결과는 분기 α-글루칸 A 및 B가 이소말토오스 구조를 각각 적어도 28.4 질량％ 및 27.2 질량％ 정도 함유하고 있음을 나타내며, 분기 α-글루칸에서는 α-1, 6 결합 비율이 증가함을 나타내는 실험 4-1의 메틸화 분석 결과를 지지한다. 또한, 이소말토덱스트라나아제는 글루칸에 있는 이소말토오스 구조의 환원성 말단 측에 인접한 α-글루코시드 결합인 경우, 그것이 α-1, 3, α-1, 4 및 α-1, 6 결합의 어느 하나이더라도 가수 분해하는 특이성을 가지므로, 얻은 이소말토오스가 분기 α-글루칸 A 및 B에서 어떠한 결합 양식으로 결합하는지에 대한 상세는 불분명하다.
<실험 4-3: 분기 α-글루칸 A 및 B의 α-글루코시다아제 및 글루코 아밀라아제 소화 시험>
분기 α-글루칸 A 또는 B의 수용액(최종 농도 1 w/v％)에 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 유래 α-글루코시다아제(상품명 『트랜스글루코시다아제 아마노 L』, 아마노 엔자임제) 및 리조푸스 속(Rhizopus sp.) 유래 글루코 아밀라아제를 동시에 작용시켜 소화 시험을 실시하였다. 기질 고형물 1 그램당 α-글루코시다아제를 5,000 단위와 글루코 아밀라아제를 100 단위 더하여, 50℃, pH 5.0으로 16시간 작용시켜, 100℃로 10분간 유지해서 반응을 정지시킨 후, 그 효소 반응액의 당 조성을 실험 4-2와 동일한 조건으로 HPLC를 이용해서 조사하였다. 그 결과, 글루칸 A 및 B는 모두, 기질인 전분 부분 분해물의 경우와 마찬가지로 실질적으로 전부 글루코오스로 분해되었다. 이 결과는 분기 α-글루칸 A 및 B가 모두 글루코오스를 구성 당으로 하는 α-글루칸임을 나타낸다.
<실험 4-4: 분자량 분포 분석>
분기 α-글루칸 A 및 B에 대해서, 분자량 분포를 통상적인 방법의 겔 여과 HPLC 방법으로 분석하였다. 겔 여과 HPLC는 칼럼에 『TSＫ GEL α-M』(주식회사 토소제)을 2개 연결한 것을 이용하고, 용리액에 10mM 인산 완충액(pH 7.0)을 이용하여, 칼럼 온도 40℃, 유속 0.3ml/분의 조건으로 실시하고, 검출은 시차 굴절계 RID-10A(주식회사 시마즈 제작소 제조)를 이용하여 실시했다. 또한, 시료중의 글루칸 분자량은 분자량 측정용 풀룰란 표준품(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소 판매)을 마찬가지로 겔 여과 분석에 제공해서 작성한 분자량의 검량선(檢量線)에 근거하여 산출하였다. 도 1에 분기 α-글루칸 A 및 B의 겔 여과 HPLC 크로마토그램(도 1의 부호 b 및 c)을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』)의 경우(도 1의 부호 a)와 비교하면서 각각 나타냈다. 또한, 도 1의 부호 가, 나, 다, 라 및 마는 각각 분자량 1,000,000, 100,000, 10,000, 1,000 및 100 달톤에 상당하는 용출 위치를 의미한다(후술하는 도 15 내지 도 19에서도 동일함). 또한, 겔 여과 HPLC에서 얻은 크로마토그램에 근거해 각 시료의 분자량 분포를 분석한 결과를 표 4에 나타냈다.
분석 항목 원료 전분 * 부분 분해물 글루칸 A 글루칸 B
수 평균 분자량(Mn) (달톤) 6,680 3,840 4,050
중량 평균 분자량(Mw) (달톤) 98,890 59,000 65,700
Mw/Mn 14.8 15.4 16.2
피크의 글루코오스 중합도(개) 499 및 6.3 384, 22.2, 10.9 및 1 433, 22.8, 10.9 및 1
*: 파인덱스 #100 글루칸 A: PP710주 유래 α-글루코실 전이 효소로 조제한 글루칸 글루칸 B: PP349주 유래 α-글루코실 전이 효소로 조제한 글루칸
기질로 이용한 전분 부분 분해물이 분자량 분포 분석에서 글루코오스 중합도 499 및 6.3에 상당하는 위치에 2개의 피크(도 1의 크로마토그램 a에서 부호 1 및 2)를 갖는 당질 혼합물인 것에 대해서, 분기 α-글루칸 A는 글루코오스 중합도 384, 22.2, 10.9 및 1에 상당하는 위치에 4개의 피크(도 1의 크로마토그램 b에서 부호 3, 4, 5 및 6)를 갖는 당질의 혼합물, 또한 분기 α-글루칸 B는 글루코오스 중합도 433, 22.8, 10.9 및 1에 상당하는 위치에 4개의 피크(도 1의 크로마토그램 c에서 부호 7, 8, 9 및 10)를 갖는 당질의 혼합물이었다. 부호 6 및 10의 피크는 글루코오스에 상당하지만 그 함량이 매우 약간이므로, 바실루스 서큐란스 PP710 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 효소의 가수 분해 작용은 얼마 안 되는 것을 알 수 있다. 표 4로부터 명확한 바와 같이, 기질인 전분 부분 분해물에 비해 글루칸 A 및 B의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 함께 60% 정도로 감소하고, 전체적으로 저분자화되었다. 또한, 분자량 분포 확장의 지표인 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)이 전분 부분 분해물과 글루칸 A 및 B 간에서 그다지 변화하지 않으므로, 바실루스 서큐란스 PP710 및 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소는 전분 부분 분해물의 비환원성 말단에만 작용한다고 생각되었다.
표 3의 결과로부터, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물에서 글루코오스 결합 양식의 약 90%가 α-1, 4 결합이며, α-1, 4, 6 결합을 약간 갖는 것에 대하여, 글루칸 A 및 B는 α-1, 4 결합에 대한 α-1, 6 결합의 비율이 지극히 높고, α-1, 4, 6 결합에 부가하여, α-1, 3 결합 및 α-1, 3, 6 결합도 갖는 분기를 가진 글루칸인 것으로 판명되었다. 이러한 구조를 갖는 분기 α-글루칸은 지금까지 전혀 알려져 있지 않다.
메틸화 분석 결과에 근거하여 본 발명의 분기 α-글루칸의 구조를 추정하고, 그 구조를 모식적으로 나타낸 도면을 기질인 전분 부분 분해물의 구조와 함께 도 2에 나타냈다. 도 2의 부호 1 및 2는 각각 원료 전분 부분 분해물 및 본 발명의 분기 α-글루칸의 모식도이다. 또한, 도 2의 부호 a, b, c, d, e 및 f는 각각 전분 부분 분해물 또는 본 발명의 분기 α-글루칸에서 비환원성 말단 글루코오스 잔기, α-1, 3 결합한 글루코오스 잔기, α-1, 4 결합한 글루코오스 잔기, α-1, 6 결합한 글루코오스 잔기, α-1, 3, 6 결합한 글루코오스 잔기 및 α-1, 4, 6 결합한 글루코오스 잔기를 의미한다. 또한, 동일 모식도에서 글루코오스 간의 경사 파선, 가로 실선 및 세로 실선은 각각 α-1, 3 결합, α-1, 4 결합 및 α-1, 6 결합을 의미한다.
<실험 5: 바실루스 서큐란스 PP710주 유래 α-글루코실 전이 효소의 생산>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 제조) 1.5 w/v％, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 일본 제약 주식회사 제조) 0.5 w/v％, 효모 추출물(상품명 『효모 엑기스 S』, 일본 제약 주식회사 제조) 0.1 w/v％, 인산 2칼륨 0.1 w/v％, 인산 1나트륨·2수화물 0.06 w/v％, 황산 마그네슘·7수화물 0.05 w/v％, 황산 망간·5수화물 0.001 w/v％, 황산 제1철·7수화물 0.001 w/v％ 및 물로 이루어진 액체 배지를 500ml들이 삼각플라스크 2개에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)을 접종하고, 27℃, 230rpm으로 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 발효기에 종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 약 200ml를 접종하고, 온도 27℃, pH 5.5 내지 8.0으로 유지하면서, 24시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 발효기로부터 배양액을 뽑아내, 원심 분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제외하고, 배양 상청 약 18L를 얻었다. 배양액 및 배양 상청에 대해서, α-글루코실 전이 효소 활성을 측정한 바, 배양액의 상기 효소 활성은 약 2.7 단위/ml, 배양 상청의 상기 효소 활성은 약 2.6 단위/ml이었다. 바실루스 서큐란스 PP710에 의해 생산되는 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 그 대부분이 균체 밖에 존재하는 것으로 판명되었다.
<실험 6: 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 정제>
실험 5에서 얻은 배양 상청 중, 약 4L(총 활성 약 10,400 단위)에, 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가, 용해하여, 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 침전한 염석물을 원심 분리(11,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이것을 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석하고, 조효소액 약 65ml를 얻었다. 조효소액중 α-글루코실 전이 효소 활성은 약 74단위/ml이었다(총 활성 약 4,780 단위). 이 조효소액을 토소 주식회사제 『CM-토요팔 650S』 겔을 이용한 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 70ml)에 제공하였다. α-글루코실 전이 효소 활성은 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 『CM-토요팔 650S』 겔에 흡착하고, 식염 농도 0M으로부터 0.5M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 식염 농도 약 0.4M 부근에서 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하고, 최종 농도 1M이 되도록 황산 암모늄을 첨가해서 4℃, 24시간 방치한 후, 원심 분리하여 불용해물을 제외하고, 토소 주식회사제 『부틸-토요팔 650M』 겔을 이용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 9ml)에 제공하였다. 본 발명의 α-글루코실 전이 효소 활성은 1M 황산 암모늄을 함유하는 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 『부틸-토요팔 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 농도 1M으로부터 0M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 황산 암모늄 농도 약 0.2M 부근에서 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하고, 이것을 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 대하여 투석한 후, 토소 주식회사제 『CM-5PW』 겔을 이용한 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 3.3ml)에 제공하였다. α-글루코실 전이 효소 활성은 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 『CM-5PW』 겔에 흡착하고, 식염 농도 0M으로부터 0.5M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 식염 농도 약 0.4M 부근에서 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하고, 이것을 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석하였다. 각 정제의 각 공정에서 α-글루코실 전이 효소 활성, α-글루코실 전이 효소의 비활성 및 수율을 표 5에 나타낸다.
공 정 α-글루코실 전이 효소 활성 (단위) α-글루코실 전이 효소 비활성 (단위/mg단백) 수율 (%)
배양 상청 10,400 10 100
황산 암모늄 염석후 투석액 4,780 22.8 46.0
이온 교환 칼럼 용출액 3,960 265 38.1
소수 칼럼 용출액 3,800 307 36.5
이온 교환 칼럼 용출액 3,300 327 31.7
정제한 α-글루코실 전이 효소 표품을 5 내지 20 w/v％ 농도 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 바, 단백 밴드는 단일이며, 순도가 높은 표품이었다.
<실험 7: 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 성질>
<실험 7-1: 분자량>
실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래의 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(5 내지 20 w/v％ 농도 구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(일본 바이오 랏드 라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 분자량을 측정한 바, 본 α-글루코실 전이 효소의 분자량은 90,000±10,000 달톤으로 판명되었다.
<실험 7-2: 효소 반응의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 끼치는 온도, pH의 영향을 활성 측정 방법에 준해서 조사하였다. 이들의 결과를 도 3(최적 온도) 및 도 4(최적 pH)에 나타냈다. 본 α-글루코실 전이 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서 50 내지 55℃이며, 최적 pH는 40℃, 30분간 반응 조건 하에서 5.0 내지 6.3으로 판명되었다.
<실험 7-3: 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 6의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 본 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소 용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후에 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 본 효소를 각 pH의 20mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이러한 결과를 도 5(온도 안정성) 및 도 6(pH 안정성)에 나타냈다. 도 5 및 도 6으로부터 명확한 바와 같이, 본 α-글루코실 전이 효소는 40℃까지 안정적이며, 또한 pH 3.5 내지 8.4 범위에서 안정적이었다.
<실험 7-4: 효소 활성에 끼치는 금속염의 영향>
실험 6의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 끼치는 금속염의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재 하에서 활성 측정 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 6에 나타냈다.
금속염 상대 활성(%) 금속염 상대 활성(%)
무첨가 100 MgCl2 102
CaCl2 101 MnCl2 99
CoCl2 100 NiCl2 102
CuCl2 52 ZnCl2 101
FeCl2 91 PbCl2 97
FeCl3 94 EDTA 99
HgCl2 3
표 6의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 α-글루코실 전이 효소의 활성은 Hg2+ 이온에 의해 현저하게 저해되고, Cu2+ 이온에 의해 저해되는 것으로 판명되었다.
<실험 8: 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770) 유래 α-글루코실 전이 효소의 조제>
바실루스 서큐란스 PP710을 대신하여 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770)를 접종한 것 이외는 실험 5와 마찬가지로 배양해서 종배양으로 하였다.
용량 30L의 발효기에 종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 약 200ml를 접종하고, 온도 27℃, pH 5.5 내지 7.0으로 유지하면서, 24시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 발효기로부터 배양액을 뽑아내, 원심 분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제거하고, 배양 상청 약 18L를 얻었다. 배양액 및 배양 상청에 대해서, α-글루코실 전이 효소 활성을 측정한 바, 배양액의 상기 효소 활성은 약 0.36단위/ml, 배양 상청의 상기 효소 활성은 약 0.42 단위/ml이었다. 아르스로박터 글로비포르미스 PP349에 의해 생산되는 본 α-글루코실 전이 효소는 그 대부분이 균체 밖에 존재하는 것으로 판명되었다.
<실험 9: 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 정제>
실험 8에서 얻은 배양 상청 약 18L(총 활성 약 7,560 단위)에, 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가, 용해하고, 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 침전한 염석물을 원심 분리(11,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이를 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석하고, 원심 분리해서 불용해물을 제거하고, 조효소액 약 500ml를 얻었다. 조효소액중 α-글루코실 전이 효소 활성은 약 14단위/ml이었다(총 활성 약 7,000 단위). 이 조효소액에 최종 농도 2M이 되도록 황산 암모늄을 첨가하고, 원심 분리해서 불용해물을 제거하고, 2M 황산 암모늄을 함유하는 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 토소 주식회사제 『페닐-토요팔 650M』 겔을 이용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 300ml)에 제공하였다. α-글루코실 전이 효소 활성은 겔에 흡착되어 황산 암모늄 농도 2M으로부터 0M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 황산 암모늄 농도 약 0.6M 부근에서 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하고, 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 대하여 투석한 후, 토소 주식회사제 『DEAE-토요팔 650S』 겔을 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 100ml)에 제공하였다. α-글루코실 전이 효소 활성은 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 『DEAE-토요팔 650S』 겔에 흡착되고, 식염 농도 0M으로부터 0.5M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 식염 농도 약 0.1M 부근에서 용출하였다. 각 정제의 각 공정에서의 α-글루코실 전이 효소 활성, α-글루코실 전이 효소의 비활성 및 수율을 표 7에 나타냈다.
공 정 α-글루코실 전이 효소 활성 (단위) α-글루코실 전이 효소 비활성 (단위/mg단백) 수율 (%)
배양 상청 7,560 1.6 100
황산 암모늄 염석후 투석액 7,000 5.4 92.6
소수 칼럼 용출액 3,870 130 54.2
이온 교환 칼럼 용출액 2,710 415 35.8
정제한 α-글루코실 전이 효소 표품을 5 내지 20 w/v％ 농도 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 바, 단백 밴드는 단일이며, 순도가 높은 표품이었다.
<실험 10: 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래 α-글루코실 전이 효소의 성질>
<실험 10-1: 분자량>
실험 9의 방법으로 얻은 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(5 내지 20 w/v％ 농도 구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(일본 바이오 랏드 라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 분자량을 측정한 바, 본 α-글루코실 전이 효소의 분자량은 90,000±10,000 달톤으로 판명되었다.
<실험 10-2: 효소 반응의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 9의 방법으로 얻은 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 끼치는 온도, pH의 영향을 활성 측정 방법에 준해서 조사하였다. 이러한 결과를 도 7(최적 온도) 및 도 8(최적 pH)에 나타냈다. 본 α-글루코실 전이 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응의 조건 하에서 약 50℃이며, 최적 pH는 40℃, 30분간 반응 조건 하에서 약 6.0으로 판명되었다.
<실험 10-3: 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 9의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 본 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소 용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후에 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 본 효소를 각 pH의 20mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이러한 결과를 도 9(온도 안정성) 및 도 10(pH 안정성)에 나타냈다. 도 9 및 도 10으로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 아르스로박터 글로비포르미스 유래 α-글루코실 전이 효소는 40℃까지 안정적이며, pH 4.0 내지 8.0의 범위에서 안정적이었다.
<실험 10-4: 효소 활성에 끼치는 금속염의 영향>
실험 9의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 끼치는 금속염의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재 하에서 활성 측정 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 8에 나타냈다.
금속염 상대 활성(%) 금속염 상대 활성(%)
무첨가 100 MgCl2 104
CaCl2 104 MnCl2 103
CoCl2 98 NiCl2 100
CuCl2 45 ZnCl2 100
FeCl2 91 PbCl2 96
FeCl3 95 EDTA 99
HgCl2 2
표 8의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 α-글루코실 전이 효소의 활성은 Hg2+ 이온에 의해 현저하게 저해되고, Cu2+ 이온에 의해 저해되는 것으로 판명되었다.
<실험 11: 각종 당질에의 작용>
각종 당질을 이용하여, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 기질 특이성을 조사하였다. 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, 파라니트로페닐-α-글루코시드, 파라니트로페닐-β-글루코시드, 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 이소말토오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로스, 셀로비오스, 락토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토트리오스 또는 이소파노스를 함유하는 수용액을 조제하였다. 이들 기질 용액에, 최종 농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)을 더한 후, 실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 기질 고형물 1 그램당 각각 10 단위씩 가하여 기질 농도를 1 w/v％가 되도록 조제하고, 이것을 40℃, pH 6.0으로 24시간 작용시켰다. 효소 반응 전후의 반응액의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물의 혼합액(용량비 6:4:1)을 또한 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤겔 60』(알루미늄 플레이트, 10×20cm)을 이용하여, 2회 전개하는 실리카겔 박층 크로마토그래피(이하, TLC로 약칭한다)를 실시하고, 10% 황산-메탄올 용액을 분무한 후에 가열함으로써 당질을 검출하였다. TLC에서 기질 당질 이외의 반응 생성물의 생성 유무를 조사하고, 각각의 당질에 대한 효소 작용의 유무 또는 강도의 정도를 확인하였다. 결과를 표 9에 나타냈다. 또한, 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소에 대해서도 기질 특이성을 마찬가지로 해서 조사한 결과, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소와 마찬가지이었다.
기질 작용 기질 작용
메틸-α-글루코시드 - 셀로비오스 -
메틸-β-글루코시드 - 수크로오스 -
PNP*-α-글루코시드 - 락토오스 -
PNP*-β-글루코시드 - 말토트리오스 ++
글루코오스 - 말토테트라오스 ++
트레할로오스 - 말토펜타오스 ++
네오트레할로오스 + 말토헥사오스 ++
코지비오스 ± 말토헵타오스 ++
니게로오스 + 이소말토트리오스 +
말토오스 ++ 이소파노스 +
이소말토오스 +
주) 표에서 -는 「작용하지 않음」을 나타내고, ±는 「약간 작용함」을 나타내며, +는 「작용함」을 나타내고, ++는 「잘 작용함」을 나타낸다. *: 파라니트로페닐
표 9의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 시험한 당질중 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에 잘 작용하고, 또한 니게로오스, 이소말토오스, 네오트레할로스, 이소말토트리오스, 이소파노스에 작용하였다. 또한, 코지비오스에도 약간 작용하였다. 작용한 당질로부터는, 모두 분해 생성물과 함께 당 전이 생성물도 인지되었다. 한편, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, 파라니트로페닐-α-글루코시드, 파라니트로페닐-β-글루코시드, 트레할로오스, 셀로비오스, 수크로오스, 락토오스 등에는 작용이 인정되지 않았다. 이러한 결과 및 본 α-글루코실 전이 효소가 전분 부분 분해물에 작용해 분기 α-글루칸을 생성하는 것으로부터, 본 효소는 말토오스 및 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸 또는 글루코오스로 구성되는 α-글루코 올리고당에 폭넓게 작용하는 것이 판명되었다.
<실험 12: 작용 메카니즘>
본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 작용 메카니즘을 검토하기 위해서, 최소 기질인 말토오스에 작용시켰을 경우의 생성 당의 구조를 조사하였다. 또한, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소를 이용하였을 경우와, 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소를 이용하였을 경우의 결과는 동등하였다. 본 실험에서는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용한 결과를 나타냈다.
<실험 12-1: 말토오스로부터의 생성물>
최종 농도 1 w/v％의 말토오스 수용액에 최종 농도 10mM 아세트산 완충액(pH 6.0)을 더한 후, 실험 6의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 기질 고형분 1 그램당 10 단위 가하고, 40℃, pH 6.0으로 작용시켜, 경시적으로 샘플링을 실시하고, 100℃로 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당 조성을 HPLC 및 GC를 이용하여 측정하였다. HPLC 및 GC는 실험 4-2에 기재한 조건을 이용하여 실시했다. 결과를 표 10에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00003
표 10의 결과로부터 명확한 바와 같이, 반응 초기(반응 1시간)에 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 작용에 의해 기질 말토오스로부터 주로 글루코오스, 말토트리오스 및 파노스가 생성되었다. 또한, 반응 2시간 및 4시간부터는 글루코오스 중합도가 4 및 5인 올리고당이 생성되었다. 반응이 진행되면, 말토트리오스는 반응 2시간(14.4%)을 피크로, 또한 파노스는 반응 4시간(29.3%)을 피크로 감소하고, 그 감소와 함께 이소말토오스 증가가 인지되었다. 또한, 반응 48시간까지 이소말토오스 및 중합도 4 이상의 올리고당의 증가가 인지되었다.
이러한 결과로부터 추측하면, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 말토오스에 작용하여, 반응 초기에 α-1, 4 글루코실 전이와 α-1, 6 글루코실 전이의 양쪽 글루코실 전이를 촉매함으로써, 글루코오스, 말토트리오스 및 파노스를 생성하고, 반응의 진행에 따라, 글루코오스에 α-1, 6 글루코실 전이한 이소말토오스나, 그 이소말토오스에 α-1, 4 글루코실 전이 및 α-1, 6 글루코실 전이한 이소파노스 및 이소말토트리오스가 생성하는 것을 알았다. 본 실험에서 다종류 존재하는 중합도 4 이상의 올리고당을 동정(同定)하는 것은 곤란하기 때문에, 실험 12-2에서 말토오스보다 중합도가 높은 말토펜타오스를 기질로 해서, 추가로 반응 메카니즘을 해석하였다.
<실험 12-2: 말토펜타오스로부터의 생성물>
최종 농도 1 w/v％의 말토펜타오스 수용액에 최종 농도 10mM 아세트산 완충액(pH 6.0)을 더한 후, 실험 6의 방법으로 얻은 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 기질 고형분 1 그램당 10 단위 가하고, 40℃, pH 6.0에서 작용시켜, 경시적으로 샘플링을 실시하고, 100℃로 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당 조성을 HPLC를 이용하여 측정하였다. HPLC는 실험 4-2에 기재한 조건을 이용하여 실시했다. 또한, 효소 반응액에 대해서 통상적인 방법을 따라 메틸화 분석을 실시하여 가스 크로마토그래피법으로 부분 메틸화물을 조사하였다. 생성된 부분 메틸화물의 조성으로부터 글루코오스 결합 양식에 있는 각 글루코시드 결합의 존재 비를 구하였다. 또한, 실험 4-2와 마찬가지로 이소말토덱스트라나아제 소화 시험도 실시하였다. 반응중 당 조성의 변화를 표 11에, 반응 생성물의 메틸화 분석과 이소말토덱스트라나아제 소화 시험의 결과를 표 12에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00004
Figure 112009067734358-PCT00005
표 11 및 표 12의 결과로부터 명확한 바와 같이, 반응 초기(반응 1시간)에 기질 말토펜타오스로부터, 기질보다 글루코오스 중합도가 1 작은 올리고당 및 글루코오스 중합도가 1 큰 올리고당이 우선적으로 생성된 점으로부터 본 효소가 글루코실 전이를 촉매하고 있음이 확인되었다. 반응이 더 진행하면, 여러 글루코오스 중합도를 갖는 반응 생성물이 생성되고, 반응 24시간 후에는 글루코오스 중합도 9 이상의 글루칸이 21.1%에 도달하였다. 메틸화 분석 결과로부터, 반응이 진행함에 따라 반응 생성물에서는 1, 4 결합한 글루코오스 잔기가 감소함과 더불어 1, 6 결합한 글루코오스 잔기가 현저하게 증가하고, 또한 1, 3 결합한 글루코오스 잔기, 1, 4, 6 결합한 글루코오스 잔기 및 1,3,6 결합한 글루코오스 잔기가 서서히 증가하는 것으로 판명되었다. 또한, 이소말토덱스트라나아제 소화 후의 당 조성에서 이소말토오스 함량도 또한 반응 진행과 함께 현저하게 증가하는 것으로 판명되었다. 또한, 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소를 이용해서 마찬가지로 시험한 경우에도 거의 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.
실험 12-1 및 12-2의 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 반응 메카니즘은 아래와 같이 생각되었다.
1) 본 효소는 기질로서 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용하고, 비환원성 말단 글루코오스 잔기를 다른 α-1, 4 글루칸의 비환원성 말단 글루코오스 잔기에 주로 α-1, 4 또는 α-1, 6 글루코실 전이함으로써, 비환원성 말단 글루코오스 잔기의 4 위치 또는 6 위치 수산기에 글루코오스가 α-결합한 α-1, 4 글루칸(글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 α-1, 4 글루칸을 생성한다.
2) 본 효소는 또한 1)에서 생성된 글루코오스 중합도가 1 감소한 α-1, 4 글루칸에 작용하고, 1)에서 생성된 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸에 대하여, 1)과 마찬가지로 분자간 α-1, 4 또는 α-1, 6 글루코실 전이함으로써 1)에서 생성된 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-글루칸의 비환원성 말단 글루코오스 잔기의 4 또는 6 위치 수산기에 글루코오스를 추가로 전이하여 쇄 길이를 증가시킨다.
3) 상기 1) 및 2)의 반응을 반복함으로써 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸으로부터 α-1, 4 및 α-1, 6 결합을 갖는 글루칸을 생성한다.
4) 본 효소는 또한 빈도는 낮으면서도 α-1, 3 글루코실 전이나 글루칸의 내부에 있는 α-1, 6 결합한 글루코오스 잔기에 대한 α-1, 4 또는 α-1, 3 글루코실 전이를 촉매함으로써 α-1, 3 결합, α-1, 4, 6 결합 및 α-1, 3, 6 결합도 갖는 글루칸을 생성한다.
5) 상기 1) 내지 4)의 반응이 반복되는 결과로서, 글루코오스가 주로 α-1, 4 결합 및 α-1, 6 결합으로 결합하고, α-1, 3 결합, α-1, 4, 6 결합 및 α-1, 3, 6 결합을 약간 갖는 본 발명의 분기 α-글루칸을 생성한다.
<실험 13: α-글루코실 전이 반응과 반응액 환원력의 변화>
말토오스 수용액(최종 농도 1 또는 30 w/v％)에, 최종 농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)을 더한 후, 실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 기질 고형물 1 그램당 4단위 더하고, 40℃, pH 6.0에서 작용시켜, 경시적으로 샘플링을 실시하고, 100℃로 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 반응액 중에 잔존하는 말토오스량을 실험 4-2에 기재한 HPLC 방법 및 GC법으로 정량하였다. 또한, 효소 반응액의 환원 당량을 소모기 넬슨법(Somogvi-Nelson method)으로, 전체 당량을 안트론법(anthrone method)으로 정량하고, 환원력=(환원 당량/전당량)×100 식으로 환원력을 산출하였다. 결과를 표 13에 나타냈다.
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표 13의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 말토오스에 작용시킨 바, 말토오스 농도가 1 w/v％로 비교적 낮은 경우에는 지극히 약간의 환원력 증가가 인지되고, 또한 말토오스 농도가 30 w/v％로 비교적 높은 경우에는 대부분 반응액의 환원력 증가가 인지되지 않았다. 말토오스 농도가 1 w/v％로 비교적 낮고, 또한 말토오스 잔존량이 10% 이하인 경우에도 반응액의 환원력 증가가 지극히 약간인 것은 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 본질적으로 전이 반응을 촉매하는 효소이며, 반응에 즈음해서 대부분 가수 분해를 실시하지 않음을 의미한다. 본 발명의 α-글루코실 전이 효소는 효율 좋게 α-글루코실 전이를 실시하는 효소인 것을 알았다. 또한, 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소를 이용하여 마찬가지로 시험한 경우에도 거의 마찬가지인 결과를 얻을 수 있었다.
<실험 14: 분기 α-글루칸의 생성에서 정제 α-글루코실 전이 효소와 조효소의 비교>
분기 α-글루칸의 공업적 생산을 고려한 경우, α-글루코실 전이 효소의 조효소를 사용할 수 있으면 효소를 정제하는 수고와 노력을 덜 수 있으므로 더욱 바람직하다. 그래서, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소를 이용하여, 실험 1-2에서 조제한 글루칸 A와 동등한 분기 α-글루칸을 얻을 수 있는지 여부를 검토하였다. 실험 1-1에 기재한 방법으로 바실루스 서큐란스 PP710을 배양하고, 배양 상청을 황산 암모늄 염석하여, 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 대하여 투석한 것을 α-글루코실 전이 효소의 조효소액으로 하였다. 이 조효소액을 실험 1-2에 기재한 방법으로 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)에 작용시켜, 고형분 농도 30%의 글루칸 용액을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물로부터 고형물당 88.2%의 수율로 얻었다. 얻은 분기 α-글루칸을 「글루칸 C」라고 명명하고, 그 메틸화 분석을 실시한 결과를 표 14에, 또한 실험 4 및 실험 3에 기재한 방법에 의해 분자량 분포 및 수용성 식물 섬유 함량을 측정한 결과를 표 15에 각각 나타냈다. 또한, 표 14 및 표 15에는 비교를 위해 표 3 및 표 4로부터 조제 원료로 한 전분 부분 분해물과 부분 정제 α-글루코실 전이 효소를 이용하여 조제한 글루칸 A의 데이터를 각각 재게시하였다.
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표 14에 나타낸 바와 같이, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소를 이용해서 조제한 글루칸 C는 의외로 메틸화 분석에서 비환원성 말단 글루코오스 잔기에 상당하는 2, 3, 4, 6-테트라메틸화물과, α-1, 6 결합한 글루코오스 잔기에 상당하는 2, 3, 4-트리메틸화물의 함량이 글루칸 A에 비해 증가하였다. 이 결과는 글루칸 C에는 글루칸 A에 비해 비환원성 말단이 많고, 또한 α-1, 6 결합이 더 많이 존재함을 의미한다. 또한, 글루칸 C에서는 2, 4-디메틸화물이 4.8%로, 글루칸 A의 0.8%에 비해 증가하였다. 이 결과는 1, 3 결합과 1, 6 결합의 양쪽에 관여하는 글루코오스 잔기가 증가한 것을 나타낸다.
또한, 표 15로부터 명확한 바와 같이, 글루칸 C는 글루칸 A에 비해 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 모두 작고(글루코오스 중합도가 작고), 훨씬 높은 수용성 식물 섬유 함량을 나타냈다. 이 결과는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소에는 α-글루코실 전이 효소와 다른 그 밖의 효소가 혼재하여, 그 혼재 효소가 분기 α-글루칸에 있는 α-1, 6 결합의 증가, 1, 3 결합과 1, 6 결합의 양쪽에 관여하는 글루코오스 잔기의 증가, 저분자화 및 수용성 식물 섬유의 함량 증가에 기여함을 시사한다.
<실험 15: 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소에 혼재하는 효소의 동정과 단리·정제>
바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소에 혼재하여, 분기 α-글루칸에 있는 α-1, 6 결합의 증가, 1, 3 결합과 1, 6 결합의 양쪽에 관여하는 글루코오스 잔기의 증가, 저분자화 및 수용성 식물 섬유 함량의 증가에 관여하는 효소를 동정하여, 단리·정제하는 실험을 실시하였다.
<실험 15-1: 혼재하는 효소의 동정과 활성 측정>
실험 1-1과 동일한 방법으로 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)을 배양하여, 얻은 배양 상청 약 3L를 황산 암모늄 염석한 후, 1mM의 염화 칼슘을 함유하는 20mM 트리스 염산(Tris-HCL) 완충액에 대하여 투석해서 얻은 투석액 약 40ml를 조효소액으로 하였다. 이 조효소액을 2 w/v％ 가용성 전분 용액 또는 2 w/v％ 풀룰란 용액에 pH 6.0, 40℃에서 16시간 작용시켜, 100℃, 10분간 가열해서 반응을 정지시킨 후, 세로 10cm, 가로 20cm의 실리카겔 60F254(메르크사제) TLC 플레이트를 이용한 TLC에 제공하였다. 전개 용매로서 n-부탄올:피리딘:물(용량비 6:4:1)을 이용해서 2회 전개를 실시하고, 20% 황산-메탄올 용액을 분무한 후, 100℃에서 5분간 가열해서 생성물의 스포트(spot)를 검출하였다. 그 결과, 가용성 전분으로부터는 말토오스 및 글루코오스 중합도 3 이상의 말토올리고당의 생성이, 또한 풀룰란으로부터는 약간의 이소말토오스와 파노스의 생성이 인지되었다. 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)의 α-글루코실 전이 효소의 조효소에는 전분을 분해하고, 또한 풀룰란도 분해하는 아밀라아제가 혼재하는 것으로 판명되었다.
혼재하는 아밀라아제의 활성은 아래와 같이 해서 측정하였다. 즉, 단쇄 아밀로오스(상품명 「아밀로오스 EX-I」, 주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소판매, 평균 중합도 17)를 최종 농도 1 w/v％가 되도록 1mM의 염화 칼슘을 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 2ml에 효소액 0.2ml를 더해 35℃에서 30분간 효소 반응시켜, 그 반응액 0.2ml를 8ml의 0.02N 황산 용액에 혼합하고, 반응 정지시킨 후, 0.2ml의 0.1N 옥소 용액을 첨가하고, 25℃에서 15분간 유지한 후에 660nm의 흡광도를 측정하였다. 별도 반응 0시간의 반응액에 대해서 마찬가지로 측정하고, 반응 시간당 옥소 정색(呈色)의 감소를 측정하였다. 아밀라아제 활성 1 단위는 상기 조건 하에서 20mg의 단쇄 아밀로오스의 660nm 흡광도(옥소 정색)를 10% 저하시키는 효소량의 10배량으로 정의하였다.
<실험 15-2: 혼재 아밀라아제의 단리·정제>
실험 15-1에서 조제한 조효소액을 토소 주식회사제 『DEAE-토요팔 650S』 겔을 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 70ml)에 제공하였다. 아밀라아제 활성을 갖는 획분은 1mM의 염화 칼슘 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 『DEAE-토요팔 650S』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하고, 최종 농도 1.5M이 되도록 황산 암모늄을 첨가해서 4℃, 24시간 방치한 후, 원심 분리해서 불용해물을 제거하고, 파마시아 바이오테크놀러지(Pharmacia biotechnology)제 『리소스 PHE』 겔을 이용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 1ml)에 제공하였다. 원하는 아밀라아제 활성을 갖는 획분은 1.5M 황산 암모늄, 1mM 염화 칼슘을 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 『리소스 PHE』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 농도 1.5M으로부터 0M의 리니어 그라디엔트로 용출시킨 바, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 이 활성 획분을 회수하여 농축한 후, 파마시아 바이오테크놀러지제 『수파텍스 200pg』 겔을 이용한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 118ml)에 제공하고, 0.2M 식염, 1mM 염화 칼슘을 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 용출하였다. 활성 획분을 회수하여, 파마시아 바이오테크놀러지제 『리소스 Q』 겔을 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 1ml)에 제공하였다. 아밀라아제 활성을 갖는 획분은 1mM의 염화 칼슘 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 『리소스 Q』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 얻은 활성 획분을 아밀라아제 정제 표품으로 하였다. 각각의 정제 공정에서의 아밀라아제 활성, 아밀라아제 비활성 및 수율을 표 16에 나타냈다.
공 정 아밀라아제 활성 (단위) 아밀라아제 비활성 (단위/mg 단백) 수율 (%)
황산 암모늄 염석후 투석액 358 3.4 100
이온 교환 칼럼 용출액 174 30.9 48.6
소수 칼럼 용출액 56.8 42.5 15.9
겔 여과 칼럼 용출액 34.4 51.8 9.6
이온 교환 칼럼 용출액 32.8 52.6 9.2
정제한 아밀라아제 표품을 5 내지 20 w/v％ 농도 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 바, 단백 밴드는 단일했고, 순도가 높은 표품이었다.
<실험 16: 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제의 성질>
<실험 16-1: 분자량>
실험 15-2의 방법으로 얻은 아밀라아제 정제 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(5 내지 20 w/v％ 농도 구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(일본국 바이오 랏드 라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 분자량을 측정한 바, 이 아밀라아제의 분자량은 58,000±10,000 달톤으로 판명되었다.
<실험 16-2: 아밀라아제의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 15-2의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제 정제 표품을 이용하여, 아밀라아제 활성에 끼치는 온도, pH의 영향을 활성 측정 방법에 준해서 조사하였다. 이러한 결과를 도 11(최적 온도) 및 도 12(최적 pH)에 나타냈다. 이 아밀라아제의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서 55℃이며, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응 조건 하에서 6.0 내지 7.0으로 판명되었다.
<실험 16-3: 아밀라아제의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 15-2의 방법으로 얻은 아밀라아제 정제 표품을 이용하여, 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소 용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0 또는 1mM 염화 칼슘을 함유하는 동일 완충액)을 각각의 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후에 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 본 효소를 각 pH의 20mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이러한 결과를 도 13(온도 안정성) 및 도 14(pH 안정성)에 나타냈다. 도 13 및 도 14로부터 명확한 바와 같이, 이 아밀라아제는 칼슘 이온 비존재 하에서는 40℃까지 안정적이며, 1mM 칼슘 이온 존재 하에서는 50℃까지 안정적이었다. 또한, 이 아밀라아제는 pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 안정적이었다.
<실험 16-5: 아밀라아제의 기질 특이성>
실험 15-2의 방법으로 얻은 아밀라아제 정제 표품을 이용하여, 이 아밀라아제의 각종 기질에의 작용을 조사한 바, 이 아밀라아제는 전분, 말토오스 및 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸을 가수 분해함과 더불어 글리코실 전이도 촉매하는 것으로 판명되었다. 또한, 이 아밀라아제는 전분으로부터 시클로 덱스트린을 생성하고, 풀룰란을 가수 분해해서 파노스를 생성하는 작용을 갖는 것으로 판명되었다.
<실험 17: α-글루코실 전이 효소와 아밀라아제를 병용한 분기 α-글루칸의 조제>
실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품과 실험 15-2의 방법으로 얻은 아밀라아제 정제 표품을 이용하여, 실험 14에 기재한 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소를 이용한 글루칸 C의 조제를 재현할 수 있는지 여부를 검토하였다. 즉, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마츠타니 화학 주식회사 판매)을 농도 30 질량％가 되도록 물에 용해하고, 이것을 pH 6.0으로 조정하여, 실험 6의 방법으로 얻은 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 고형물 1 그램당 10 단위 더하고, 또한, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아밀라아제를 고형물 1 그램당 0, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1.0 단위 더해, 40℃, pH 6.0에서 72시간 작용시킨 후, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시켰다. 각각의 반응 조건에 의해 각각 얻은 분기 α-글루칸을 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법에 제공해서 얻은 크로마토그램을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물의 크로마토그램과 함께 도 15에 나타냈다. 도 15에서 부호 a는 기질로 한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이며, 부호 b, c, d 및 e는 각각 α-글루코실 전이 효소를 모두 10 단위로 하여, 아밀라아제를 0.1 단위, 0.2 단위, 0.5 단위 및 1.0 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이다(α-글루코실 전이 효소만 10 단위 작용시킨 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램은 도 1에 나타낸 글루칸 A의 크로마토그램과 거의 동일하며, 도 15에서는 생략하였다. 후술하는 도 16 내지 19에 대해서도 마찬가지임). 이러한 겔 여과 HPLC로 얻은 크로마토그램에 근거한 각각의 분기 α-글루칸의 분자량 분포 분석의 결과와, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 조사한 수용성 식물 섬유 함량을 아울러 표 17에 나타냈다. 또한, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물에 대해서 조사한 분자량 분포 분석과 수용성 식물 섬유 함량의 결과(α-글루코실 전이 효소 0 단위, 아밀라아제 0 단위)를 표 6에 병기하였다.
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표 17의 결과로부터 명확한 바와 같이, α-글루코실 전이 효소에 아밀라아제를 병용하면, 얻어진 분기 α-글루칸의 분자량이 감소하고, 수용성 식물 섬유 함량은 비약적으로 증가하였다. 또한, 아밀라아제의 작용량이 많아짐에 따라, 얻어진 분기 α-글루칸의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 함께 감소하고, 또한 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)도 감소한 것으로부터, 분자량 분포 폭이 좁아지는 것으로 판명되었다. 아밀라아제의 작용량이 고형물 1 그램당 0.5 단위인 경우, Mw/Mn은 2.1까지 감소하였다. 또한, 얻은 분기 α-글루칸에 있는 수용성 식물 섬유의 함량은 아밀라아제의 작용량이 고형물 1 그램당 0.5 단위 이상으로 약 76 질량％에 이르렀다.
이 결과로부터, 실험 14에서 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소의 조효소를 이용해서 얻은 글루칸 C에 있어서, 분자량이 작고, 식물 섬유 함량이 높아진 것은 조효소에 혼재하는 아밀라아제에 기인한 것으로 확인되었다. 혼재하는 아밀라아제가, 기질인 전분 부분 분해물 및 α-글루코실 전이 효소의 산물인 분기 α-글루칸을 부분적으로 가수 분해함으로써 분기 α-글루칸의 분자량을 감소시키고, 또한 글리코실기를 더욱 분기 α-글루칸에 전이함으로써, 결과적으로 식물 섬유 함량을 높이도록 작용하는 것으로 추측된다. 또한, 이 결과는, 아밀라아제를 본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 조합함으로써 분자량이 작고, 수용성 식물 섬유 함량을 높인 분기 α-글루칸을 제조할 수 있음을 나타낸다.
<실험 18: α-글루코실 전이 효소와 다른 공지의 아밀라아제를 병용한 분기 α-글루칸의 조제>
본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 다른 공지의 아밀라아제를 병용하여, 전분 부분 분해물에 작용시켜서 분기 α-글루칸을 조제하고, 그 구조적인 특징 및 수용성 식물 섬유 함량을 검토하였다. 또한, 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소를 이용한 경우와, 아르스로박터 글로비포르미스 PP349 유래의 α-글루코실 전이 효소를 이용한 경우의 결과가 동등한 것으로부터, 본 실험에서는 바실루스 서큐란스 PP710 유래 α-글루코실 전이 효소 정제 표품을 이용한 결과를 나타낸다.
<실험 18-1: α-글루코실 전이 효소와 이소아밀라아제를 병용한 분기 α-글루칸의 조제와 얻은 분기 α-글루칸의 분자량 분포와 수용성 식물 섬유 함량>
바실루스 서큐란스 PP710 유래 아밀라아제로 변경하여, 슈도모나스·아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa) 유래의 이소아밀라아제(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소제)를 고형물 1 그램당 0, 50, 200, 500 또는 1,000 단위 더한 것 이외에는 실험 17과 동일하게 반응시켰다. 각각의 반응 조건에 의해 각각 얻은 분기 α-글루칸을 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법에 제공해서 얻은 크로마토그램을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물의 크로마토그램과 함께 도 16에 나타냈다. 도 16에 있어서, 부호 a는 기질로 한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이며, 부호 b, c, d 및 e는 각각 α-글루코실 전이 효소를 모두 10 단위로 하고, 이소아밀라아제를 50 단위, 200 단위, 500 단위 및 1,000 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이다. 또한, 이들 겔 여과 HPLC로 얻은 크로마토그램에 근거한 각각의 분기 α-글루칸의 분자량 분포 분석의 결과와, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 조사한 수용성 식물 섬유 함량을 아울러 표 18에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00010
표 18의 α-글루코실 전이 효소만을 전분 부분 분해물에 작용시켰을 경우의 결과로부터 명확한 바와 같이, α-글루코실 전이 효소만으로는 분자량 분포에 큰 영향을 끼치지 않지만, 표 18 및 도 16의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소아밀라아제의 작용량이 많아짐에 따라, 얻어진 분기 α-글루칸의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 동시에 감소하고, 또한 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)도 감소한 것으로부터, 분자량 분포 폭이 좁아진 것으로 판명되었다. 이소아밀라아제의 작용량이 고형물 1 그램당 1000 단위인 경우, Mw/Mn은 1.9까지 감소하고, 분기 α-글루칸은 글루코오스 중합도 20.6에 피크를 갖는 분자량 분포를 나타냈다. 한편, 각각의 반응 조건에 의해 얻은 분기 α-글루칸에 있는 수용성 식물 섬유의 함량은 이소아밀라아제의 작용량에 그다지 영향을 주지 않고, 40 내지 44 질량％ 정도이었다.
이 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소에 추가로 이소아밀라아제를 병용해서 전분 부분 분해물에 작용시킴으로써, 수용성 식물 섬유 함량을 거의 변화시키지 않고 분자량이 감소된 분기 α-글루칸을 제조할 수 있는 것으로 판명되었다.
<실험 18-2: α-글루코실 전이 효소에 α-아밀라아제를 병용한 분기 α-글루칸의 조제와 얻은 분기 α-글루칸의 분자량 분포와 수용성 식물 섬유 함량>
슈도모나스 아밀로데라모사 유래의 이소아밀라아제로 변경하여 시판되는 α-아밀라아제(상품명 「네오스피타아제 PＫ2」, 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1 그램당 0, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1.0 단위 더한 것 이외는 실험 18-1과 동일하게 반응시켰다. 각각의 반응 조건에 의해 각각 얻은 분기 α-글루칸을 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법에 제공해서 얻은 크로마토그램을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물의 크로마토그램과 함께 도 17에 나타냈다. 도 17에서 부호 a는 기질로 한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이며, 부호 b, c, d 및 e는 각각 α-글루코실 전이 효소를 모두 10 단위로 해서, α-아밀라아제를 0.1 단위, 0.2 단위, 0.5 단위 및 1.0 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이다. 또한, 이들 겔 여과 HPLC로 얻은 크로마토그램에 근거한 각각의 분기 α-글루칸의 분자량 분포 분석의 결과와, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 조사한 수용성 식물 섬유 함량을 함께 표 19에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00011
도 17 및 표 19의 결과로부터 명확한 바와 같이, α-아밀라아제의 작용량이 많아짐에 따라 얻어진 분기 α-글루칸의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동시에 감소하고, 또한 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)도 감소한 것으로부터, 분자량 분포 폭이 좁아진 것으로 판명되었다. α-아밀라아제의 작용량이 고형물 1 그램당 1.0 단위(도 17의 부호 e)의 경우, Mw/Mn은 2.4까지 감소하고, 분기 α-글루칸은 글루코오스 중합도 11.8에 피크를 갖는 분자량 분포를 나타냈다. 한편, 각각의 반응 조건에 의해 얻은 분기 α-글루칸에 있는 수용성 식물 섬유의 함량은 α-아밀라아제의 작용량이 많아질수록 증가하는 경향이 인지되었다.
이 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소에 α-아밀라아제를 병용해서 전분 부분 분해물에 작용시킴으로써 수용성 식물 섬유 함량이 증가하여, 분자량이 감소된 분기 α-글루칸을 제조할 수 있는 것으로 판명되었다.
<실험 18-3: α-글루코실 전이 효소와 CGTase를 병용한 분기 α-글루칸의 조제와 얻은 분기 α-글루칸의 분자량 분포와 수용성 식물 섬유 함량>
슈도모나스 아밀로데라모사 유래의 이소아밀라아제로 변경해서 바실루스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 CGTase(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소제)를 고형물 1 그램당 0, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1.0 단위 더한 것 이외는 실험 18-1과 동일하게 반응시켰다. 각각의 반응 조건에 의해 각각 얻은 분기 α-글루칸을 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법에 제공해서 얻은 크로마토그램을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물의 크로마토그램과 함께 도 18에 나타냈다. 도 18에서 부호 a는 기질로 한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이며, 부호 b, c, d 및 e는 각각 α-글루코실 전이 효소를 모두 10 단위로 해서, CGTase를 0.1 단위, 0.2 단위, 0.5 단위 및 1.0 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이다. 또한, 이들 겔 여과 HPLC로 얻은 크로마토그램에 근거한 각각의 분기 α-글루칸의 분자량 분포 분석의 결과와, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 조사한 수용성 식물 섬유 함량을 함께 표 20에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00012
도 18 및 표 20의 결과로부터 명확한 바와 같이, CGTase의 작용량이 많아짐에 따라, 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동시에 감소하고, 또한 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)도 감소한 것으로부터, 분자량 분포 폭이 좁아진 것으로 판명되었다. CGTase의 작용량이 고형물 1 그램당 1.0 단위(도 18의 부호 e)의 경우, Mw/Mn은 3.2까지 저하하고, 분기 α-글루칸은 글루코오스 중합도 79.1에 피크를 갖는 분자량 분포를 나타냈다. 한편, 분기 α-글루칸에 있는 수용성 식물 섬유의 함량은 CGTase의 작용량이 많아질수록 증가하는 경향이 인지되고, 실험 18-2의 α-아밀라아제를 병용한 경우보다 현저하게 증가하여, CGTase를 고형물 1 그램당 1.0 단위 이용한 경우에는 수용성 식물 섬유 함량은 70.5 질량％에 이르렀다.
이 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소에 CGTase를 병용해서 전분 부분 분해물에 작용시킴으로써, 분자량이 감소하고, 수용성 식물 섬유 함량이 현저하게 증가한 분기 α-글루칸을 조제할 수 있는 것으로 판명되었다. CGTase는 α-1, 4 결합의 가수 분해 작용과 함께 전이 작용도 가지므로, α-아밀라아제와 비교해서 극단적으로 분자량을 감소시키지 않고, 비환원성 말단 글루코실 잔기를 생성하므로, α-글루코실 전이 효소의 작용 빈도가 높아져서, α-아밀라아제 첨가보다 수용성 식물 섬유 함량이 증가한 분기 α-글루칸을 얻은 것으로 추측된다.
<실험 18-4: α-글루코실 전이 효소와 이소아밀라아제 및 CGTase를 병용한 분기 α-글루칸의 조제와 얻은 분기 α-글루칸의 분자량 분포와 수용성 식물 섬유 함량>
실험 18-1에 기재한 실험에서, 추가로 바실루스 스테아로서모필러스 유래의 CGTase를 고형물 1 그램당 0 또는 1.0 단위를 더한 것 이외는 실험 18-1과 동일하게 반응시켰다. 각각의 반응 조건에 의해 각각 얻은 분기 α-글루칸을 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법에 제공해서 얻은 크로마토그램을, 기질로서 이용한 전분 부분 분해물의 크로마토그램과 함께 도 19에 나타냈다. 도 19에서 부호 a는 기질로 한 전분 부분 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이며, 부호 b, c, d 및 e는 모두 α-글루코실 전이 효소와 CGTase를 각각 10 단위 및 1 단위로 해서, 이소아밀라아제를 50 단위, 200 단위, 500 단위 및 1,000 단위 작용시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 겔 여과 HPLC 크로마토그램이다. 또한, 이들 겔 여과 HPLC로 얻은 크로마토그램에 근거한 각각의 분기 α-글루칸의 분자량 분포 분석의 결과와, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 조사한 수용성 식물 섬유 함량을 함께 표 21에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00013
도 19 및 표 21의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 고형물 1 그램당 1 단위의 CGTase를 병용해서 조제한 분기 α-글루칸의 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)은 3.2까지 감소하고, 추가로 고형물 1 그램당 1000 단위의 이소아밀라아제를 병용한 경우(도 19의 부호 e)에는 1.9까지 감소하였다. α-글루코실 전이 효소와 CGTase를 조합해서 조제한 분기 α-글루칸의 수용성 식물 섬유 함량은 약 70 질량％에까지 증가하고, 추가로 이소아밀라아제를 병용한 경우에도 감소하지 않고 높은 함량을 유지하였다.
이 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소와 이소아밀라아제 및 CGTase를 병용해서 전분 부분 분해물에 작용시킴으로써, 분자량이 현저하게 감소하는 동시에 수용성 식물 섬유 함량이 현저하게 증가한 분기 α-글루칸을 조제할 수 있는 것으로 판명되었다.
<실험 19: 분기 α-글루칸의 기능성>
수용성 식물 섬유 함량이 가장 높고, 분자량이 비교적 작은 분기 α-글루칸으로서, 실험 18-4에서 고형물 1 그램당 10 단위의 α-글루코실 전이 효소, 50 단위의 이소아밀라아제 및 1 단위 CGTase를 조합해서 조제한 분기 α-글루칸을 선택하고, 이 분기 α-글루칸의 소화성 및 구조적인 특징 및 기능성을 검토하였다.
<실험 19-1: α-글루코실 전이 효소와 이소아밀라아제 및 CGTase를 병용한 분기 α-글루칸의 정제>
고형물 1 그램당 10 단위의 α-글루코실 전이 효소, 50 단위의 이소아밀라아제 및 1 단위의 CGTase를 이용하여, 실험 18-4와 동일하게 반응시켜서 얻은 분기 α-글루칸의 반응액을 여과해서 불용해물을 제거한 후, 미쓰비시 화학제 이온 교환 수지 『다이야 이온 SＫ-1B』와 『다이야 이온 WA30』 및 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA 411』을 이용해서 탈색, 탈염하고, 정밀 여과한 후, 농축기로 농축하여, 고형분 농도 30%의 분기 α-글루칸 함유액을, 이용한 전분으로부터 고형물당 85.8%의 수율로 얻었다. 얻은 분기 α-글루칸의 메틸화 분석을 실험 4-1 기재의 방법으로 실시한 결과를 표 22에 나타냈다. 또한, 실험 4-4 기재의 겔 여과 HPLC 방법으로 실시한 분자량 분포 분석, 실험 3 기재의 효소-HPLC 방법으로 구한 수용성 식물 섬유 함량, 실험 4-2 기재의 이소말토덱스트라나아제 소화 시험의 결과를 표 23에 정리하였다.
부분 메틸화물 대응하는 글루코오스 잔기 존재비(면적%)
2, 3, 4, 6-테트라메틸화물 비환원성 말단 글루코오스 잔기 13.7
3, 4, 6-트리메틸화물 1, 2 결합한 글루코오스 잔기 0
2, 4, 6-트리메틸화물 1, 3 결합한 글루코오스 잔기 1.6
2, 3, 6-트리메틸화물 1, 4 결합한 글루코오스 잔기 22.8
2, 3, 4-트리메틸화물 1, 6 결합한 글루코오스 잔기 54.7
2, 4-디메틸화물 1, 3, 6 결합한 글루코오스 잔기 2.4
2, 3-디메틸화물 1, 4, 6 결합한 글루코오스 잔기 4.8
분자량 분포 수용성 식물 섬유 함량 (질량%) 이소말토덱스트라나아제 소화후 이소말토오스 함량 (질량%)
수 평균 분자량(Mn) (달톤) 중량 평균 분자량(Mw) (달톤) Mw/Mn
2,400 5,480 2.3 68.6 36.4
표 22 및 23의 결과로부터 명확한 바와 같이, 얻은 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서, 부분 메틸화물인 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물을 1 대 2.4의 비로 함유하고, 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계는 부분 메틸화물의 77.5%를 차지하였다. 또한, 본 분기 α-글루칸에서 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물은 각각 부분 메틸화물의 1.6% 및 2.4%를 나타냈다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 중량 평균 분자량 5,480 달톤, Mw/Mn 2.3을 나타내고, 효소-HPLC 방법에 의해 구한 수용성 식물 섬유 함량이 68.6 질량％, 이소말토덱스트라나아제 소화에 의해, 당 조성당 이소말토오스를 36.4 질량％ 생성하는 글루칸이었다.
본 발명의 분기 α-글루칸의 유용성을 평가할 목적으로, 실험 19-1에서 조제한 분기 α-글루칸을 이용하여, 우식원성(cariogenicity), 소화성, 혈당값과 인슐린량에 끼치는 영향, 및 급성 독성을 실험 19-2 내지 19-7로 조사하였다.
<실험 19-2: 분기 α-글루칸의 우식원성 균에 의한 산 발효성 시험>
실험 19-1의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸을 이용하여, 『감염과 면역(Infection and Immunity)』, 제39권, 43 내지 49페이지(1983년)에 기재한 오시마들의 방법에 준하여, 우식원성 균을 이용한 산 발효성 시험을 실시하였다. 우식원성 균으로서, 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 6715주 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) OMZ-176주의 2주를 이용하였다. 대조로서, 수크로오스를 이용해서 마찬가지로 조작하였다. 결과를 표 24에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00014
표 24의 결과로부터 명확한 바와 같이, 산 발효를 받는 수크로오스의 경우는 pH 약 4까지 감소하는 것에 대해서, 본 발명의 분기 α-글루칸은 스트렙토코쿠스 소브리누스 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 의해 거의 산 발효되지 않고, pH 약 6을 유지하여, 치아 에나멜질이 탈회(脫灰)하는 임계 pH인 5.5보다 높은 pH이었다. 본 발명의 분기 α-글루칸은 우식원성이 지극히 낮은 것으로 확인되었다.
<실험 19-3: 분기 α-글루칸의 소화성 시험>
실험 19-1의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸을 이용하여, [일본국 영양 식량학회지, 제43권, 제23 내지 29페이지(1990년)]에 기재한 오카다들의 방법에 준하여, 시험관 내에서 타액 아밀라아제, 인공 위액, 췌액 아밀라아제 및 소장 점막 효소에 의한 본 발명의 분기 α-글루칸의 소화성을 조사하였다. 대조로서, 시판되는 난소화성 덱스트린(상품명 『파인 파이버』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 제조)을 이용하였다. 결과를 표 25에 나타냈다.
소화 효소 분해율(%)
분기 α-글루칸(본 발명) 난소화성 덱스트린 (대조)
타액 아밀라아제 0.0 0.3
인공 위액 0.0 0.0
췌액 아밀라아제 0.2 2.4
소장 점막 효소 16.4 41.1
표 25의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸은 타액 아밀라아제, 인공 위액에 의해서는 전혀 소화되지 않고, 췌액 아밀라아제로 지극히 조금 분해되었다. 또한, 대조의 난소화성 덱스트린의 소장 점막 효소에 의한 분해율이 41.1%인 것에 대해서, 분기 α-글루칸의 분해율은 16.4%로 낮아, 본 발명의 분기 α-글루칸은 시판되는 난소화성 덱스트린보다도 더욱 소화되기 어려운 것으로 판명되었다.
<실험 19-4: 분기 α-글루칸의 섭취가 혈당값 및 인슐린량에 끼치는 영향>
실험 19-1의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸을 이용하여 혈당값 상승 및 인슐린 상승을 조사하였다. 7주령의 위스타계 수컷 래트 각각의 군(群) 5마리를 이용하여, 1일 절식 후에 위 존데(sonde)로 분기 α-글루칸의 수용액을 경구 투여하였다. 투여량은 래트 체중 1kg당 고형물로서 1.5g으로 하였다. 경구 투여 직전, 경구 투여 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후에 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하였다. 각각의 혈액을 헤파린 처리된 채혈관으로 채취하여 원심 분리(2,000rpm, 10분간)하고 혈장을 얻었다. 혈당값은 글루코오스 옥시다아제법으로 측정하고, 인슐린량은 래트 인슐린 측정 키트(주식회사 모리나가 생과학 연구소 제조)를 이용해서 측정하였다. 대조 1로서 글루코오스를, 또한, 대조 2로서 시판되는 난소화성 덱스트린(상품명 『파인 파이버』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 제조)을 이용하였다. 각각의 시험계의 혈당값 및 인슐린량의 결과를 각각 표 26 및 표 27에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00015
Figure 112009067734358-PCT00016
표 26 및 표 27의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸은 시판되는 난소화성 덱스트린과 마찬가지로, 혈당값 상승 및 인슐린량 상승이 글루코오스에 비해 낮은 것으로 판명되었다.
<실험 19-5: 급성 독성 시험>
마우스를 사용하여 실험 19-1의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸을 경구 투여 해서 급성 독성 시험을 실시하였다. 그 결과, 본 발명의 분기 α-글루칸은 무독성이며, 투여 가능한 최대량에서도 사망 예가 인지되지 않았고, 그 LD50 값은 5g/kg-마우스 체중 이상이었다.
<실험 20: 분기 α-글루칸의 혈당 상승 억제 작용>
실험 19-4에서 분기 α-글루칸의 섭취에 의해 혈당값 및 인슐린량 상승이 글루코오스에 비해 낮은 것으로 판명되었으므로, 후술하는 실시예 5의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸을 이용해서 분기 α-글루칸의 섭취가 혈당 상승에 끼치는 영향을 더욱 상세히 검토하였다.
<실험 20-1: 분기 α-글루칸의 섭취가 전분 부분 분해물 섭취 시의 혈당값 및 인슐린량에 끼치는 영향>
본 발명의 분기 α-글루칸이 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #1』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매) 섭취 후의 혈당 상승에 끼치는 영향을 검토하였다. 래트 사육용 사료(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소 조제, 「AIN-93G」; 영양 저널(Journal of Nutrition), 제123권, 제1939-1951페이지(1993년) 참조, 이하 「정제 사료」라고 한다. 후술하는 표 33에 나타내는 배합 조성을 참조)로 1주간 예비 사육한 7주령 위스타계 수컷 래트(일본 챨스리바 주식회사 판매) 3군 각군 5마리를 이용하여, 1일 절식 후에 위 존데로 전분 부분 분해물(고형물로서 1.5g/ｋg·체중)과 분기 α-글루칸을 용해한 수용액을 경구 투여하였다. 분기 α-글루칸의 투여량은 래트 체중 1kg당 고형물로서, 0.15g, 0.30g 또는 0.75g으로 하였다. 경구 투여 직전, 경구 투여 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후, 180분 후, 240분 후에 꼬리 정맥으로부터 래트 혈액을 채혈하였다. 각각의 혈액을 헤파린 처리된 채혈 관으로 채취하고, 원심 분리(2,000rpm, 10분간)하여 혈장을 얻었다. 혈당값과 인슐린량을 실험 19-4와 동일한 방법으로 측정하였다. 대조 1로서, 1군 5마리의 래트에 전분 부분 분해물만을 고형물로서 1.5g/ｋg·체중 경구 투여하였다. 또한, 대조 2로서, 분기 α-글루칸으로 바꾸어, 시판되는 난소화성 덱스트린(상품명 『파이버 솔 2』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 제조)을, 전분 부분 분해물과 동시에, 2군 각군 5마리의 래트에, 체중 1kg당 고형물로서 0.15g 또는 0.75g중 하나를 경구 투여하였다. 각각의 시험계의 혈당값 변화, 혈당값의 AUC값(혈중 농도-시간 곡선아래 면적), 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값의 측정 결과를 각각 표 28, 표 29, 표 30 및 표 31에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00017
Figure 112009067734358-PCT00018
Figure 112009067734358-PCT00019
Figure 112009067734358-PCT00020
표 28 내지 표 31의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸은 시판되는 난소화성 덱스트린(대조 2)과 마찬가지로, 용량 의존적으로, 당질(전분 부분 분해물) 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값 상승을, 전분 부분 분해물을 단독 섭취시킨 경우(대조 1)에 비해 억제하는 것으로 판명되었다. 또한, 이들의 상승 억제 효과 정도를 비교하면, 측정한 어느 지표에 있어서도 본 발명의 분기 α-글루칸이 시판되는 난소화성 덱스트린보다 강한 억제 효과를 나타냈다.
<실험 20-2: 전분 부분 분해물 섭취 시의 혈당값 및 인슐린량에의 분기 α-글루칸 분자량의 영향>
실험 20-1에서 본 발명의 분기 α-글루칸이 당질(전분 부분 분해물) 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC 상승을 모두 억제한 것으로 판명되었으므로, 이 분기 α-글루칸의 분자량의 차이가 당질 부하시의 혈당값 및 인슐린량의 상승 억제 작용에 끼치는 영향을 검토하였다. 즉, 원료 전분 부분 분해물, α-글루코실 전이 효소, 아밀라아제의 사용량 등을 조정하여, 표 32에 나타내는 중량 평균 분자량의 분기 α-글루칸을 조제하였다. 실험 20-1과 마찬가지로, 정제 사료로 1주간 예비 사육한 7주령의 위스타계 수컷 래트(일본 챨스리바 주식회사 판매) 9군 각군 5마리를 이용하여, 1일 절식 후, 8군 각군 5마리의 래트에 위 존데로 전분 부분 분해물(고형물로서 1.5g/kg·체중) 또는 표 32에 나타낸 분기 α-글루칸중 하나를 용해한 수용액을 경구 투여하였다. 분기 α-글루칸의 투여량은 래트 체중 1kg당 고형물로서 0.75g으로 하였다. 나머지 1군 5마리의 래트에는, 전분 부분 분해물만을 래트 체중 1kg당 고형물로 1.5g 경구 투여하고, 대조군으로 하였다. 상기 래트 혈액을 경구 투여 직전 및 투여 30분 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다. 각각의 혈액을 헤파린 처리된 채혈관으로 채취하고, 원심 분리(2,000rpm, 10분간)하여 혈장을 얻었다. 각군의 혈당값 및 인슐린량의 측정 결과를 표 32에 함께 나타냈다. 또한, 투여 후의 채혈 시간은 전분 부분 분해물만을 투여한 경우에 혈당값 및 혈중 인슐린량이 피크가 되는 투여 30분후로 하였다.
Figure 112009067734358-PCT00021
표 32의 결과로부터 명확한 바와 같이, 중량 평균 분자량이 1,168 내지 200,000의 범위에 있는 본 발명의 분기 α-글루칸은 모두 전분 부분 분해물을 경구 투여한 후의 혈당값 및 인슐린량의 상승을 억제하였다. 또한, 이 혈당값 및 인슐린량의 상승 억제 효과의 강도의 정도로 비교하면, 분기 α-글루칸의 분자량이 1,168 내지 60,000(수용성 식물 섬유 함량이 58.1 내지 80.4 질량％)인 경우에 억제 효과가 현저하게 되고, 2,670 내지 44,151(수용성 식물 섬유 함량이 64.2 내지 80.4 질량％)인 경우에 특히 강한 억제 효과가 인지되었다.
<실험 20-3: 분기 α-글루칸의 장기 섭취가 전분 부분 분해물 섭취 시의 혈당값 및 인슐린량에 끼치는 영향>
실험 20-1에 있어서, 본 발명의 분기 α-글루칸의 섭취에 의해 당질 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값의 상승이 억제되는 것으로 판명되었으므로, 이 분기 α-글루칸을 장기 섭취 후(8주간)에 당질 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값의 상승 억제 작용을 검토하였다. 정제 사료로 1주간 예비 사육한 7주령 위스타계 수컷 래트(일본 챨스리바 주식회사 판매) 5군 각군 5마리를 사용하였다. 3군 각군 5마리의 래트를, 각각 표 33에 나타낸 분기 α-글루칸(고형물 환산)을 1, 2 또는 5 질량％ 배합한 3종류의 시험 사료중 하나로 8주간 사육하였다. 사육 기간중에 사료 및 물은 자유 섭취하였다. 시험 사료에 의한 사육 4주 및 8주동안 1일 절식 후에 위 존데로 전분 부분 분해물의 수용액을 고형물로서 1.5g/kg·체중이 되도록 경구 투여하였다. 투여 직전, 투여 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후, 180분 후, 240분 후에 꼬리 정맥으로부터 래트 혈액을 채혈하였다. 각각의 혈액을 헤파린 처리된 채혈관으로 채취하고, 원심 분리(2,000rpm, 10분간)하여 혈장을 얻었다. 혈당값과 인슐린량을 실험 19-4와 동일한 방법으로 측정하였다. 대조 1로서, 1군 5마리의 래트를 정제 사료만으로 사육하였다. 또한, 나머지 1군 5마리의 래트는 대조 2로서, 정제 사료의 콘스타치 일부를, 시판되는 난소화성 덱스트린(상품명 『파이버 솔 2』, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매)으로 치환하여 표 33에 나타낸 배합 조성의 사료로 사육하였다. 사육 4주간과 8주간은 거의 동일한 결과로 되었으므로, 시험 사료로 사육 4주간의 각 시험계의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값의 측정 결과를 각각 표 34, 표 35, 표 36 및 표 37에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00023
Figure 112009067734358-PCT00024
Figure 112009067734358-PCT00025
표 33 내지 표 37의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸은 시판되는 난소화성 덱스트린(대조 2)과 마찬가지로 당질(전분 부분 분해물) 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC의 상승을, 정제 사료만으로 사육한 경우(대조 1)에 비해 억제하는 것으로 판명되었다. 또한, 이러한 수치 상승 억제는 사료에 배합한 분기 α-글루칸의 농도에 의존하며, 그 효과는 고형물로서 분기 α-글루칸을 2 질량％ 배합한 경우에 현저해지고, 5 질량％에서는 특히 강한 억제가 인지되었다. 또한, 시판되는 난소화성 덱스트린을 고형물로서 5 질량％ 배합한 사료로 사육한 래트에서 이러한 지표 억제 정도는 분기 α-글루칸을 고형분으로서 1 질량％ 배합한 사료와 동일한 정도의 억제가 인지된 것으로부터, 본 발명의 분기 α-글루칸은 상기 난소화성 덱스트린보다 당질(전분 부분 분해물) 부하시의 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC의 상승 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 전분 부분 분해물 투여 전의 혈당값 및 인슐린량을 비교하면, 분기 α-글루칸을 고형물로서 2 질량％ 또는 5 질량％ 배합한 사료를 섭취시킨 군에서는 정제 사료만 혹은 난소화성 덱스트린을 고형물로서 5 질량％ 함유하는 사료를 섭취시킨 군보다도 낮고, 본 발명의 분기 α-글루칸은 장기 섭취에 의해 공복시 혈당값 및 혈중 인슐린량을 시판되는 난소화성 덱스트린보다도 효과적으로 억제하는 작용을 갖는 것으로 판명되었다. 또한, 시험 사료 또는 대조 사료에 의한 사육 4주간 및 8주동안 래트 체중을 비교한 바, 모든 군간에서 평균 체중 차이가 인지되지 않았으므로, 본 실험으로 확인된 분기 α-글루칸에 의한 혈당값 및 인슐린량의 상승 억제 작용은 래트 건강 상태에는 조금도 영향을 끼치지 않았다고 판단하였다.
<실험 21: 분기 α-글루칸의 섭취가 인간의 혈당값 및 인슐린량에 끼치는 영향>
분기 α-글루칸을 래트에 섭취시키면 전분 부분 분해물을 섭취시킨 경우에 비해, 혈당값 및 인슐린량의 증가가 억제되는 것으로 판명되었으므로, 분기 α-글루칸의 섭취가 인간의 혈당값 및 혈중 인슐린량에 끼치는 영향을 조사하는 시험을 실시하였다. 시판되는 전분 부분 분해물(마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매, 상품명 「파인덱스 #1」) 및 후술하는 실시예 5의 방법에 준해서 조제한 분기 α-글루칸을 이용하여, 인간 혈당값 및 인슐린의 상승을 조사하였다. 건강한 남성 지원자 12명(연령 26 내지 54세, 평균 41±7세)을 피험자로 해서, 시험 전일 21시 이후부터 다음날 시험 시작시(9시경)까지 물 이외의 음식물 섭취를 금지하였다. 이 피험자에게 우선 전분 부분 분해물 50g(고형물 환산)을 물에 용해해서 전량 200ml로 한 시험 표품을 섭취 개시시부터 2분 이내에 섭취시켰다. 경구 투여 직전, 경구 투여 15분 후, 30분 후, 45분 후, 60분 후, 90분 후, 120분 후에 혈액을 채혈하였다. 이어서, 1주 이상의 간격을 두고, 동일 피험자에게 분기 α-글루칸 50g(고형물 환산)을 물에 용해해서 전량 200ml로 한 시험 표품을 이용한 것 이외는 전분 부분 분해물의 경우와 마찬가지로 시험하여 채혈하였다. 각각의 혈액의 혈당값 및 인슐린량을 민간 임상 검사 기관(사단법인 오까야마시 의사회 종합 메디컬 센터)에 위탁해서 측정하였다. 시험 표품 섭취시의 혈당값 및 인슐린량의 경시적인 변화 및 그 수치에 근거하여 계산한 섭취 직후 내지 섭취 120분간 혈당값의 AUC값(혈중 농도-시간 곡선아래 면적: AUC0-2hr(mg·hr/dl)) 및 인슐린량의 AUC0-2hr(μU·hr/dl)값, 섭취 직후 내지 섭취 120분간의 혈당값의 AUC값의 증가량 및 인슐린량의 AUC값의 증가량(△AUC0-2hr)을 표 38에 정리해서 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00027
표 38의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸을 섭취한 경우에는, 래트를 이용한 실험(실험 20)과 마찬가지로, 혈당값, 혈당값의 AUC값, 인슐린량 및 인슐린량의 AUC값이 전분 부분 분해물을 섭취시킨 경우에 비해 유의하게 낮은 것으로 판명되었다.
<실험 22: 분기 α-글루칸의 생체내 지질 저감 작용>
실험 19-4, 실험 21에서, 분기 α-글루칸을 섭취함으로써 혈당값 및 혈중 인슐린량의 상승이 낮아지는 것으로 판명되었으므로, 이 분기 α-글루칸의 섭취가 생체내 지질에 끼치는 영향에 대해서도 검토하였다.
<실험 22-1: 분기 α-글루칸의 섭취가 지방 흡수에 끼치는 영향>
후술하는 실시예 5의 방법으로 조제한 분기 α-글루칸을 이용하여, 7주령의 위스타계 수컷 래트(일본 챨스리바 주식회사 판매)를 무작위로 4군 각군 15마리로 나누어, 1주동안 표 33에 나타낸 정제 사료로 예비 사육 후, 2군 각 15마리는 동일한 표에 나타낸 분기 α-글루칸을 고형물로서 5 질량％ 배합한 조성의 사료로 4주 또는 8주동안 사육하였다. 나머지 2군 각 15마리는 대조로서 정제 사료로 마찬가지로 4주 또는 8주동안 사육하였다. 분기 α-글루칸 배합 사료로 사육한 1군 15마리를 사육 개시 4주후에 및 나머지 1군 15마리를 8주후에 각각 에테르 마취하에서 하대 정맥으로부터 채혈한 후에 도살하고, 해부해서, 내장 축적 지방량, 혈청 지질, 장 점막 습질량 및 맹장 내용물 등을 조사하였다. 대조 래트도 마찬가지로 처리하였다. 그 결과를 표 39에 나타냈다. 또한, 래트의 사육은 시험 기간내내 2 또는 3일 걸러 체중과 섭취 사료량을 측정하면서, 실험 20-1과 마찬가지로 사료 및 물은 사육 기간내내 자유 섭취하도록 하였다. 또한, 해부 전에는 하룻밤동안 절식시켰다. 분기 α-글루칸 배합 사료 사육 4주 및 8주동안의 체중 증가량, 사료 섭취량, 사료 이용 효율(체중 증가량/사료 섭취량), 해부시의 체중, 장기 등의 질량, 장 점막 질량, 내장 지방 질량, 맹장내 내용물 질량, 수분, pH를 표 39에 나타냈다. 또한, 혈청 지질의 측정 결과도 표 39에 함께 나타냈다. 또한, 혈청 지질중 중성 지방, 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤의 측정은 각각 시판되는 중성 지방 트리글리세라이드 측정용 키트(상품명 「트리글리세라이드 E-테스트 와코」, 와코 쥰야쿠 공업 주식회사 판매), 총 콜레스테롤 측정용 키트(상품명 「콜레스테롤 E-테스트 와코」, 와코 쥰야쿠 공업 주식회사 판매) 및 HDL-콜레스테롤 측정용 키트(상품명 「HDL-콜레스테롤 E-테스트 와코」, 와코 쥰야쿠 공업 주식회사 판매)를 사용하였다. 또한, 총 콜레스테롤 값으로부터 HDL-콜레스테롤 값을 빼서 LDL-콜레스테롤 값으로 하였다.
Figure 112009067734358-PCT00028
표 39의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 분기 α-글루칸을 고형물로서 5% 배합한 사료를 섭취시키면, 정제 사료만으로 사육한 경우에 비해, 섭취 4주후에는 신장 주위 및 고환 주위 지방질량이 낮은 값을 나타내고, 섭취 8주후에서는 신장 주위 및 고환 주위 지방 모두 유의하게 낮은 값을 나타내며, 그 저하는 특히 고환 주위 지방에서 현저하였다. 또한, 섭취 4주 및 8주후에 장 점막 질량이 유의하게 증가하였고, 그 증가는 섭취 8주후에 현저하였다. 또한, 섭취 8주후에 맹장내 pH가 유의하게 감소하였다. 또한, 혈청 지질에 대해서 보면, 중성 지방 값이 섭취 8주후에, 총 콜레스테롤이 섭취 4주 및 8주후에, 모두 저하 경향을 나타냈고, LDL-콜레스테롤도 저하하였다. 이들 이외의 측정값은 대조와 차이가 인지되지 않았다. 또한, 구체적인 데이터는 나타내지 않았으나, 맹장내 유기산 농도는 대조와 차이가 인지되지 않았다. 이 결과는 본 발명의 분기 α-글루칸이 생체내 지질의 저감 작용을 가짐을 의미한다. 또한, 장 점막의 질량 증가가 인지되는 것으로부터, 분기 α-글루칸에 의한 지질 과잉 축적의 억제 또는 실험 20 내지 21에서 확인된 내당성(耐糖性) 증강에는 이 시험으로 확인된 뮤신 분비의 증대를 수반하는 소장 점막 층의 비후(肥厚)에 기인하는 소화 효소의 작용성 저하나 소화된 글루코오스나 지방의 소화·흡수 저해, 지연이 중요한 역할을 한 것으로 추측된다.
<실험 22-2: 생체내 지질의 과잉 축적 억제에 끼치는 분기 α-글루칸의 분자량의 영향>
실험 22-1에서, 본 발명의 분기 α-글루칸의 섭취에 의해 생체내 지질의 과잉 축적이 억제되는 것으로 판명되었으므로, 상기 분기 α-글루칸의 중량 평균 분자량의 차이에 의한 작용을 검토하였다. 즉, 정제 사료에, 실험 20-2에서 사용한 것과 동일한 중량 평균 분자량을 갖는 8종류의 다른 분기 α-글루칸을 각각 고형물로서 5 질량％ 배합한 8종류의 시험 사료를 조제하였다. 위스타계 래트 암컷 7주령(일본 챨스리바 주식회사 판매) 45마리를 무작위로 9군 각군 5마리로 나누고, 1주일동안 정제 사료로 예비 사육하였다. 이 래트중 8군에 대해서는 표 40에 나타낸 중량 평균 분자량이 다른 분기 α-글루칸의 임의의 것을 배합한 시험 사료(시험 사료 1 내지 8)로 8주동안 사육하였다. 나머지 1군 5마리의 래트는 정제 사료로 그대로 8주간 사육하고, 대조군으로 하였다. 분기 α-글루칸을 배합한 사료를 섭취해서 8주간 경과한 래트 및 정제 사료를 섭취해서 8주간 경과한 대조군의 래트를 각각 에테르 마취하에서 채혈한 후에 도살하여 그 장간막 주위, 신장 주위 및 고환 주위의 지방질량(습질량) 및 혈청중 중성 지방 및 총 콜레스테롤을 실험 22-1과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 표 40에 나타냈다.
Figure 112009067734358-PCT00029
표 40의 결과로부터 명확한 바와 같이, 중량 평균 분자량이 다른 본 발명의 분기 α-글루칸을 섭취시킨 경우, 모든 군에서 내장 지방질량 및 혈청 지방질량이 대조군보다도 낮은 값으로 되고, 본 발명의 분기 α-글루칸이 내장 지방질량 및 혈청 지방질량의 상승을 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 이 억제 효과 정도에서 비교하면, 분기 α-글루칸의 중량 평균 분자량이 2,670 내지 44,151의 것에서 효과가 현저해지고, 2,670 내지 25,618의 경우에 특히 강한 효과가 인지되었다.
이상의 실험 19-2 내지 19-5의 결과로부터 본 발명의 분기 α-글루칸은 경구 섭취해도 충치를 발생시키기 어렵고, 소화 흡수되기 어려우며, 저칼로리의 수용성 식물 섬유로서 유리하게 이용할 수 있는 것으로 판명되었다. 또한, 실험 20 내지 22의 결과로부터, 본 발명의 분기 α-글루칸은 혈당 상승 억제제 및 생체내 지질 저감제로서 이용할 수 있는 것으로 판명되었다.
이하에, 본 발명의 α-글루코실 전이 효소의 제조예를 실시예 1 및 2에, 본 발명의 분기 α-글루칸의 제조예를 실시예 3 내지 6에 나타냈다. 또한, 본 발명의 분기 α-글루칸의 물리 화학적 성질을 실시예 7에 예시하였다. 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 함유하여 이루어지는 품질 개량제를 실시예 8에, 또한 본 발명의 분기 α-글루칸을 함유시킨 조성물을 실시예 9 내지 22에 나타냈다.
[실시예 1]
바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771)을 실험 5의 방법에 준하여 발효기에서 약 24시간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리해서 배양액 상청을 회수하고, 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가해서 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 염석물을 원심 분리해서 회수하고, 이것에 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석하여, 막 농축해서 농축 조효소액을 조제하였다. 본 농축 조효소액의 α-글루코실 전이 효소 활성은 200 단위/ml이었다. 또한, 본 농축 효소액에는 약 25 단위/ml의 아밀라아제 활성도 인지되었다. 본 품은 전분질 기질을 이용한 본 발명의 분기 α-글루칸의 제조에, 또한 음식물에 포함되는 전분질의 품질 개량제 등에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 2]
아르스로박터 글로비포르미스 PP349(FERM BP-10770)를 실험 8의 방법에 준하여, 발효기에서 약 24시간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리해서 배양액 상청을 회수하고, 80% 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가해서 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 염석물을 원심 분리해서 회수하고, 이것에 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석하고, 막 농축해서 농축 효소액을 조제하였다. 본 농축 효소액의 α-글루코실 전이 효소 활성은 50 단위/ml이었다. 본 품은 전분질 기질을 이용한 본 발명의 분기 α-글루칸의 제조에, 또한 음식물에 포함되는 전분질의 품질 개량제 등에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 3]
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 마츠타니 화학 주식회사 판매)을 농도 30 질량％가 되도록 물에 용해하고, 이것을 pH 6.0으로 조정하여, 실시예 1의 방법으로 얻은 농축 조효소액을 α-글루코실 전이 효소 활성으로서 기질 고형물 1 그램당 10 단위 더해, 40℃, 48시간 작용시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 95℃로 가열하여, 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어진 여액을 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 또한 농축해서 농도 50 질량％의 분기 α-글루칸 용액을 얻었다. 본 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 비가 1 대 1.3을 나타내고, 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계는 부분 메틸화물의 70.3%를 차지하였다. 또한, 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물은 각각 부분 메틸화물의 3.0% 및 4.8%이었다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 중량 평균 분자량 6,220 달톤이며, 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)은 2.2이었다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 이소말토덱스트라나아제 소화에 의해, 소화물 고형물당 이소말토오스를 35.1 질량％ 생성하고, 효소-HPLC 방법에 의해 구한 수용성 식물 섬유 함량은 75.8 질량％이었다. 본 품은 비우식성, 난소화성 성질, 적당한 점도를 갖고, 수용성 식물 섬유, 지방 대체 식품 재료, 다이어트용 음식물, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 증점제, 증량제 등으로서 식품, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 4]
30% 타피오카 전분유(澱粉乳)에 최종 농도 0.1 질량％가 되도록 탄산 칼슘을 첨가한 후, pH 6.5로 조정하고, 이것에 α-아밀라아제(노보사 제조, 상품명 타마밀 60L)를 전분 그램당 0.2 질량％가 되도록 더해, 95℃에서 15분간 반응시켰다. 그 반응액을 오토클레이브(120℃)를 10분동안 실시한 후에 40℃로 냉각하고, 여기에 실시예 2의 방법으로 조제한 α-글루코실 전이 효소의 농축 조효소액을 고형물 1 그램당 10 단위 첨가하고, 또한, 바실루스 스테아로서모필러스 유래의 CGTase(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소제)를 고형물 1 그램당 1 단위 더해, 40℃, pH 6.0으로 72시간 작용시켰다. 그 반응액을 95℃에서 10분동안 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어진 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 또한 농축, 분무 건조해서 분기 α-글루칸 분말을 얻었다. 본 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 비가 1:1.6을 나타내고, 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계는 부분 메틸화물의 80.0%를 차지하였다. 또한, 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물은 각각 부분 메틸화물의 1.4 및 1.7%를 나타냈다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 중량 평균 분자량 10,330 달톤이며, 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)은 2.9이었다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 이소말토덱스트라나아제 소화에서 소화물 고형물당 이소말토오스를 40.7 질량％ 생성하고, 효소-HPLC 방법에 의해 구한 수용성 식물 섬유 함량은 68.6 질량％이었다. 본 분기 α-글루칸은 비우식성, 난소화성 성질, 적당한 점도를 갖고, 수용성 식물 섬유, 지방 대체 식품 재료, 다이어트용 음식물, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 증점제, 증량제 등으로서 식품, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 5]
27.1 질량％ 옥수수 전분 액화액(가수 분해율 3.6%)에, 최종 농도 0.3 질량％가 되도록 아황산 수소 나트륨을, 또한, 최종 농도 1mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가한 후, 50℃로 냉각하고, 추가로 실시예 1의 방법으로 조제한 농축 조효소액을 고형물 1 그램당 11.1 단위 첨가하고, 또한 50℃, pH 6.0으로 68시간 작용시켰다. 그 반응액을 80℃로 60분간 유지한 후에 냉각하고, 여과해서 얻어진 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 또한 농축, 분무 건조해서 분기 α-글루칸 분말을 얻었다. 본 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서 부분 메틸화물인 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 비가 1:2.5를 나타내고, 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계는 부분 메틸화물의 68.4%를 차지하였다. 또한, 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물은 각각 부분 메틸화물의 2.6 및 6.8%를 나타냈다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 중량 평균 분자량 4,097 달톤이며, 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)은 2.1이었다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 이소말토덱스트라나아제 소화에서 소화물 고형물당 이소말토오스를 35.6 질량％ 생성하고, 효소-HPLC 방법으로 구한 수용성 식물 섬유 함량은 79.4 질량％이었다. 본 분기 α-글루칸은 비 우식성, 난소화성 성질, 적당한 점도를 갖고, 수용성 식물 섬유, 지방 대체 식품 재료, 다이어트용 음식물, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 증점제, 증량제 등으로서, 식품, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 6]
농축 조효소액으로 변경해서 실험 6의 방법으로 조제한 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771) 유래의 정제 α-글루코실 전이 효소를 이용하고, 슈도모나스 아밀로데라모사 유래의 이소아밀라아제(주식회사 하야시바라 생물 화학 연구소제)를 고형물 1 그램당 1,000 단위 더한 것 이외는 실시예 5와 동일하게 하여 분기 α-글루칸 분말을 얻었다. 본 분기 α-글루칸은 메틸화 분석에서 부분 메틸화물인 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 비는 1:4를 나타내고, 2, 3, 6-트리메틸화물과 2, 3, 4-트리메틸화물의 합계는 부분 메틸화물의 67.9%를 차지하였다. 또한, 2, 4, 6-트리메틸화물 및 2, 4-디메틸화물은 각각 부분 메틸화물의 2.3 및 5.3%를 나타냈다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 중량 평균 분자량 2,979 달톤이며, 중량 평균 분자량을 수 평균 분자량으로 나눈 값(Mw/Mn)은 2.0이었다. 또한, 본 분기 α-글루칸은 이소말토덱스트라나아제 소화에서 소화물 고형물당 이소말토오스를 40.6 질량％ 생성하고, 효소-HPLC 방법으로 구한 수용성 식물 섬유 함량은 77 질량％이었다. 본 분기 α-글루칸은 비우식성, 난소화성 성질, 적당한 점도를 갖고, 수용성 식물 섬유, 지방 대체 식품 재료, 다이어트용 음식물, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 증점제, 증량제 등으로서 식품, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 7]
실시예 5에서 조제한 분기 α-글루칸에 대하여 통상적인 방법에 따라 물리 화학적 성질을 조사하고, 본 발명의 분기 α-글루칸의 성질의 일례로서 표 41에 정리하였다.
성상 백색 무정형 분말로 무미 무취
용해성 알코올, 아세톤, 헥산, 벤젠, 초산에틸, 4염화 탄소, 클로로포름 및 에테르에 불용, 물, 포름아미드 및 디메틸술폭시드에 가용
수용액의 pH 약산성
구성 당 글루코오스만
비선광도 +194,1°~ +194.4°(농도, 20℃)
정색 반응 안트론 황산 반응 및 페놀 황산 반응이 양성 뷰렛 반응, 로리·포린 반응 및 엘손·모르간 반응이 음성
융점 명확한 융점을 나타내지 않음
메틸화 분석 비환원성 말단, 1, 3 결합, 1, 4 결합, 1, 6 결합, 1, 3, 6 결합 및 1, 4, 6 결합의 글루코오스 잔기의 존재를 나타냄
적외선 흡수 스펙트럼 844cm 부근에서 D-글루코피라노오스의 α-아노머에 특징적인 흡수를 나타냄
C-NMR 스펙트럼 68ppm 부근에서 α-1, 6 결합에 특징적인 시그널을 검출함
효소 소화성 덱스트라나아제 처리에 의해 이소말토오스를 생성함
[실시예 8]
<품질 개량제>
무수 말토오스(등록 상표 『파인토스』, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 400 질량부, 트레할로오스(등록 상표 『트레하』, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 200 질량부 및 실험 6의 방법으로 조제한 바실루스 서큐란스 PP710(FERM BP-10771) 유래의 정제 α-글루코실 전이 효소액 2 질량부를 균일하게 혼합하고, 통상적인 방법에 의해 통풍 건조해서 α-글루코실 전이 효소를 함유하는 효소제를 조제하였다. 본 품은 전분질을 함유하는 음식물을 제조할 때에 배합함으로써 전분질을 개질(改質)하고 전분 노화를 억제할 수 있으므로, 품질 개량제, 특히 전분 노화 방지제로서 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 9]
<떡>
찹쌀 가루 500 질량부와 정백미 가루 500 질량부를 균일하게 혼합한 후, 물 700 질량부를 더해서 혼합하고, 수증기로 40분간 쪘다. 이어서, 찐 것을 믹서(ACM 20LVW, 주식회사 아이코샤 제작소)로 교반하면서 생지(生地)가 약 55℃가 되었을 때, 수크로오스 360 질량부, 트레할로오스(등록 상표 『트레하』, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 240 질량부 및 실험 6의 방법으로 정제해서 얻은 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를, α-글루코실 전이 효소 활성이 최종으로 전분질 1 그램당 50 단위가 되도록 4회로 나누어서 첨가·혼합하고, 그 후 추가로 3분간 혼합한 후에 내경 60mm, 높이 22mm의 플라스틱제 용기에 채워서 성형하고, 방치 냉각해 보존하였다. 본 품은 α-글루코실 전이 효소의 작용에 의해 전분질이 분기 α-글루칸으로 개질되어서 노화가 억제되어, 부드러움이 지속되고 늘어날 수 있어서 씹기가 좋은 고품질의 떡이다.
[실시예 10]
<찹쌀 떡>
말토오스(등록 상표 『산말토』, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 350 질량부, 트레할로오스(등록 상표 『트레하』, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 150 질량부를 온수에 용해하고, 농도 70 질량％의 당액(糖液)을 조제해서 55℃로 보온하였다. 이어서, 미리 물에 침지해 둔 1000 질량부의 떡쌀을 통상적인 방법에 의해 찜통으로 쪄내, 55℃까지 냉각한 후, 상기 당액 500 질량부와 실험 9의 방법으로 정제해서 얻은 본 발명의 α-글루코실 전이 효소를 전분질 1 그램당 25 단위로 되도록 더해서 균질하게 교반하였다. 이것을 보온 용기에 넣어서 약 1시간, 45∼50℃로 유지한 후에 꺼내고, 찰기 팥소를 이용해서 찹쌀 떡을 조제하였다. 본 품은 α-글루코실 전이 효소의 작용에 의해 호화 전분이 분기 α-글루칸으로 개질되어서 노화가 억제되어, 냉장, 혹은 냉동 보존 후에 해동해도 이수(離水) 등이 발생하지 않고, 조제 직후의 부드러움이 유지되는 고품질 찹쌀 떡이다.
[실시예 11]
<가당 연유>
원유 100 질량부에 실시예 3의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 용액 2 질량부 및 자당 3중량을 용해하고, 플레이트 히터로 가열 살균하고, 이어서 농도 70%로 농축하여, 무균 상태로 통조림 가공하여 제품을 얻었다. 본 품은 온화한 단맛으로 풍미도 좋고, 수용성 식물 섬유를 많이 함유하는 가당 연유로서, 후루츠, 커피, 코코아, 홍차 등의 조미용에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 12]
<유산균 음료>
탈지 분유 175 질량부, 실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 50 질량부 및 락토스크로오스 고함유 분말(주식회사 하야시바라 상사 판매, 등록 상표 『유과 올리고』) 50 질량부를 물 1,500 질량부에 용해하고, 65℃로 30분간 살균하고, 40℃로 냉각한 후, 여기에 통상적인 방법에 따라 유산균 스타터를 30 질량부 식균(食菌)하여, 37℃로 8시간 배양해서 유산균 음료를 얻었다. 본 품은 풍미가 양호하고, 수용성 식물 섬유로서의 분기 α-글루칸이나 올리고당을 함유하여, 유산균을 안정적으로 유지할 뿐만 아니라, 비피더스균 증식 촉진 작용, 정장 작용을 갖는 유산균 음료로서 바람직하다.
[실시예 13]
<분말 주스>
분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33 질량부에 대하여, 실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 10 질량부, 함수 결정 트레할로오스 20 질량부, 무수 결정 말티톨 20 질량부, 무수 구연산 0.65 질량부, 사과산 0.1 질량부, 2-O-α-글루코실-L-아스코르브산 0.2 질량부, 구연산 소다 0.1 질량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합 교반하고, 분쇄하여 미세 분말로 하고, 이것을 유동층 조립기에 넣어, 배풍 온도 40℃로 해서, 이것에 실시예 3의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 용액을 바인더로서 적당량 분무하고, 30분간 조립(造粒)하여, 계량하고, 포장해서 제품을 얻었다. 본 품은 과즙 함유율 약 30%의 분말 주스이다. 또한, 본 품은 다른 맛, 다른 냄새가 없고, 고품질로 수용성 식물 섬유를 많이 함유하는 저칼로리 주스로서 상품 가치가 높다.
[실시예 14]
<카스터드 크림>
콘스타치 100 질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 용액 30 질량부, 트레할로오스 함수 결정 70 질량부, 자당 40 질량부 및 식염 1 질량부를 충분히 혼합하고, 계란 280 질량부를 더해서 교반하고, 이것에 비등(沸騰)한 우유 1,000 질량부를 서서히 첨가하고, 또한 불에 올려서 교반을 계속하여 콘스타치가 완전히 호화해서 전체가 반투명하게 되었을 때에 불을 끄고, 이것을 냉각해서 적당량의 바닐라 향료를 더해, 계량, 충전, 포장해서 제품을 얻었다. 본 품은 매끈매끈한 광택을 갖고, 풍미가 양호하며, 수용성 식물 섬유를 많이 함유하는 고품질 카스터드 크림이다.
[실시예 15]
<팥소>
원료 팥 10 질량부에 통상적인 방법에 따라 물을 더해 펄펄 끓여서 떫은 맛을 없애고 쓴맛을 제거하며 수용성 협잡물을 제거하여, 팥의 팥소 약 21 질량부를 얻었다. 이 생팥소에 자당 14 질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 용액 5 질량부와 물 4 질량부를 더해서 펄펄 끓이고, 이것에 소량의 샐러드 오일을 첨가해서 팥소를 부숴지지 않도록 반죽해서, 제품 팥소를 약 35 질량부 얻었다. 본 품은 퇴색, 이수도 없이 안정적으로, 수용성 식물 섬유로서의 분기 α-글루칸을 많이 함유하고, 맛, 풍미가 양호하여, 팥빵, 만두, 경단, 모나카, 빙과 등의 제과 재료로서 바람직하다.
[실시예 16]
<빵>
밀가루 100 질량부, 이스트균 2 질량부, 자당 5 질량부, 실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 1 질량부 및 무기 푸드 0.1 질량부를 통상적인 방법에 따라 물로 반죽하고, 중종(中種)을 26℃로 2시간 발효시키고, 그 후 30분간 숙성하고 구웠다. 본 품은 색상, 독립성도 양호하고, 수용성 식물 섬유로서의 분기 α-글루칸을 많이 함유하여 적당한 탄력, 온화한 단맛을 갖는 고품질 빵이다.
[실시예 17]
<분말 펩티드>
40% 식품용 대두 펩티드 용액(후지 제유 주식회사 판매, 상품명 『하이뉴트 S』) 1 질량부에, 실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 2 질량부를 혼합하여, 플라스틱제 배트에 넣고, 50℃에서 감압 건조하고, 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다. 본 품은 풍미가 양호하고, 프리믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과 재료로서 유용할 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 식물 섬유 또는 정장제량(整腸劑量)으로도 유용하다.
[실시예 18]
<화장용 크림>
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌글리콜 2 질량부, 자기 유화형(自己 乳化型) 모노스테아르산 글리세린 5 질량부, 실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 2 질량부, α-글루코실 루틴(주식회사 하야시바라 판매, 상품명 aG 루틴) 1 질량부, 유동 파라핀 1 질량부, 트리옥탄산 글리세린 10 질량부 및 방부제 적정량을 통상적인 방법에 따라 가열 용해하고, 이것에 L-락트산 2 질량부, 1, 3-부틸렌 글리콜 5 질량부 및 정제수 66 질량부를 가하여, 호모게나이저(homogenizer)에 걸어 유화하고, 또한 향료 적정량을 더해서 교반 혼합하여 화장용 크림을 제조하였다. 본 품은 분기 α-글루칸을 배합한 것이므로 우수한 보습성을 가지며, 안정성이 높고, 고품질의 햇볕 거슬림 방지, 피부 미용제, 미백제 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 19]
<치약>
제2인산 칼슘 45 질량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 질량부, 글리세린 25 질량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5 질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 용액 15 질량부, 사카린 0.02 질량부를 물 18 질량부와 혼합해서 치약을 얻었다. 본 품은 계면 활성제의 세정력이 감소되지 않고 사용 후 느낌도 양호하다.
[실시예 20]
<유동식용 고체제제>
실시예 4의 방법으로 얻은 분기 α-글루칸 분말 100 질량부, 트레할로오스 함수결정 200 질량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 질량부, 분말 난황 270 질량부, 탈지 분유 209 질량부, 염화나트륨 4.4 질량부, 염화 칼륨 1.8 질량부, 황산 마그네슘 4 질량부, 티아민 0.01 질량부, L-아스코르브산 나트륨 0.1 질량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 질량부 및 니코틴산 아미드 0.04 질량부로 이루어진 배합물을 조제하고, 이 배합물을 25그램씩 방습성 라미네이트 소포에 충전하고, 열 밀봉(heat seal)해서 제품을 얻었다. 본 품은 수용성 식물 섬유를 강화하고, 정장 작용에 우수한 유동식으로서, 경구적, 또는 비강(鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 의해 이용되어, 생체 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 21]
<정제>
아스피린 50 질량부에 트레할로오스 함수결정 분말 14 질량부, 실시예 4의 방법으로 조제한 분기 α-글루칸 분말 4 질량부를 충분히 혼합한 후, 통상적인 방법을 따라 타정기에 의해 타정해서 두께 5.25mm, 1정 680mg의 정제를 제조하였다. 본 품은 난소화성 글루칸과 트레할로오스의 부형성을 이용한 것으로, 흡습성이 없고, 물리적 강도도 충분히 있으며, 게다가 물속에서의 붕괴가 지극히 양호하다. 또한, 분기 α-글루칸이 수용성 식물 섬유로서 작용하기 때문에 정장 작용도 갖는 정제이다.
[실시예 22]
<외상 치료용 고약>
말토오스 400 질량부에, 옥소 3 질량부를 용해한 메탄올 50 질량부를 더해 혼합하고, 또한 실시예 4의 방법으로 조제한 분기 α-글루칸 분말의 10 w/v％ 수용액 200 질량부를 더해서 혼합하여, 적당한 신장성, 부착성을 나타내는 외상 치료용 고약을 얻었다. 본 품은 분기 α-글루칸에 의한 적당한 점도, 보습성을 가지며, 경시 변화가 적어 상품 가치가 높은 고약이다. 또한, 본 품은 옥소에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로도 작용하기 때문에 치유 기간이 단축되고 상처 표면도 깨끗하게 치료된다.
본 발명의 분기 α-글루칸은 안전성이 높고, 소화성도 시판되는 난소화성 덱스트린과 비해 손색없기 때문에, 수용성 식물 섬유로서의 기능을 충분히 구비하고 있다. 또한, 본 발명의 분기 α-글루칸은 혈당 상승 억제 작용이나 생체내 지질의 저감 작용도 갖고 있으므로 건강 식품으로도 유용하다. 본 발명에 의하면, 종래 화학 반응이나 번잡하고 효율이 나쁜 방법에 의해 전분으로부터 제조되었던 난소화성 덱스트린과 동등한 난소화성을 갖는 분기 α-글루칸을 전분 부분 분해물을 기질로 해서 효소법에 의해 대량으로 효율좋게 제조할 수 있다. 난소화성 분기 α-글루칸과 그의 제조 방법을 제공하는 본 발명은 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 이용 분야에 공헌하게 되어, 그의 산업적 의의가 매우 크다.

Claims (24)

  1. 글루코오스를 구성 당(糖)으로 하는 α-글루칸으로서 메틸화 분석에서,
    (1) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 비가 1:0.6 내지 1:4의 범위에 있고,
    (2) 2, 3, 6-트리메틸-1, 4, 5-트리아세틸글루시톨과 2, 3, 4-트리메틸-1, 5, 6-트리아세틸글루시톨의 합계가 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 60% 이상을 차지하며,
    (3) 2, 4, 6-트리메틸-1, 3, 5-트리아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상 10% 미만이고,
    (4) 2, 4-디메틸-1, 3, 5, 6-테트라아세틸글루시톨이 부분 메틸화 글루시톨아세테이트의 0.5% 이상인
    특징을 갖는 분기 α-글루칸.
  2. 제1항에 있어서,
    글루코오스 중합도가 10 이상이며, 중량 평균 분자량(Mw)을 수평균 분자량(Mn)으로 나눈 값(Mw/Mn)이 20 미만인 분기 α-글루칸.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    이소말토덱스트라나아제(EC 3.2.1.94) 소화에 의해, 소화물의 고형물당 이소 말토오스를 25 질량％ 이상 50 질량％ 이하 생성하는 것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    고속 액체 크로마토그래프법(효소-HPLC 방법)에 의해 구한 수용성 식물 섬유 함량이 40 질량％ 이상인 것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸.
  5. 말토오스 및 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에 작용하여 α-글루코실 전이함으로써, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸을 생성하는 작용을 갖는 α-글루코실 전이 효소.
  6. 제5항에 있어서,
    하기의 이화학적 성질을 갖는 α-글루코실 전이 효소:
    (1) 분자량
    SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에서, 90,000±10,000 달톤;
    (2) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서, 50 내지 55℃;
    (3) 최적 pH
    40℃, 30분간 반응 조건 하에서 5.0 내지 6.3;
    (4) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지 조건 하에서 40℃까지 안정; 및
    (5) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지 조건 하에서 적어도 pH 4.0 내지 8.0에서 안정.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    바실루스 속(屬) 또는 아르스로박터 속에 속하는 미생물에서 유래하는 α-글루코실 전이 효소.
  8. 제7항에 있어서,
    바실루스 속 미생물이 바실루스 서큐란스(Bacillus circulans) PP710(일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁번호 FERM BP-10771) 또는 그 변이주인 α-글루코실 전이 효소.
  9. 제7항에 있어서,
    아르스로박터 속 미생물이 아르스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) PP349(일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁번호 FERM BP-10770) 또는 그 변이주인 α-글루코실 전이 효소.
  10. 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소의 산생(産生) 능력을 갖는 미생물을 배양해서 얻어진 배양물로부터 α-글루코실 전이 효 소를 채취하는 것을 특징으로 하는 α-글루코실 전이 효소의 제조 방법.
  11. 바실루스 서큐란스 PP710(일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁번호 FERM BP-10771), 아르스로박터 글로비포르미스 PP349(일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁번호 FERM BP-10770), 또는 이들의 변이주인 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물.
  12. 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸에, 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소를 작용시켜서, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 글루칸을 생성시키는 공정과, 이것을 채취하는 공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 글루칸을 생성시키는 공정에서, 아밀라아제, 전분 지절(枝切) 효소 및 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스페라아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 병용하는 것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    아밀라아제가 하기의 이화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸의 제조 방법:
    (1) 작용
    전분을 가수 분해함과 더불어 글리코실기의 전이를 촉매하고, 시클로덱스트린도 생성하고, 풀룰란을 가수 분해하여 파노스를 생성함;
    (2) 분자량
    SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에서, 58,000±10,000 달톤;
    (3) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응 조건 하에서, 55℃;
    (4) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응 조건 하에서 6 내지 7;
    (5) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지 조건 하에서 40℃까지 안정적이고,
    pH 6.0, 1mM Ca2+ 이온 존재 하에서 50℃까지 안정; 및
    (6) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지 조건 하에서 적어도 pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 안정.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    아밀라아제가 바실루스 속에 속하는 미생물에서 유래하는 분기 α-글루칸의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    바실루스 속 미생물이 바실루스 서큐란스 PP710(일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁번호 FERM BP-10771) 또는 그 변이주인 분기 α-글루칸의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸을 함유하여 이루어진 영양 배지를 이용하여 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소 산생 능력을 갖는 미생물을 배양하는 공정과, 배양액 중에서 생성하는 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸을 채취하는 공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분기 α-글루칸의 제조 방법.
  18. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸을 함유하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    음식물, 화장품, 의약품, 의약 부외품 또는 공업 원료인 조성물.
  20. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸을 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 혈당 상승 억제제.
  21. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 분기 α-글루칸을 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 생체내 지질 저감제.
  22. 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소를 유효 성분으로 하고 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸을 위한 품질 개량제.
  23. 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1, 4 글루칸의 개질(改質) 방법.
  24. 말토오스 및/또는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-1, 4 글루칸에, 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 기재한 α-글루코실 전이 효소와 함께 이소말토덱스트라나아제를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키는 공정과, 얻어진 이소말토오스 또는 이것을 함유하는 당질을 회수하는 공정을 포함하여 이루어진, 이소말토오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
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