CN103865967A - 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途 - Google Patents

支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103865967A
CN103865967A CN201410065367.1A CN201410065367A CN103865967A CN 103865967 A CN103865967 A CN 103865967A CN 201410065367 A CN201410065367 A CN 201410065367A CN 103865967 A CN103865967 A CN 103865967A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
glucan
side chain
chain alpha
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410065367.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103865967B (zh
Inventor
渡边光
山本拓生
西本友之
津崎桂二
奥和之
茶圆博人
福田惠温
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Original Assignee
Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd filed Critical Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Publication of CN103865967A publication Critical patent/CN103865967A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103865967B publication Critical patent/CN103865967B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/18—Carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A23C9/154—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives containing thickening substances, eggs or cereal preparations; Milk gels
    • A23C9/1544—Non-acidified gels, e.g. custards, creams, desserts, puddings, shakes or foams, containing eggs or thickening or gelling agents other than sugar; Milk products containing natural or microbial polysaccharides, e.g. cellulose or cellulose derivatives; Milk products containing nutrient fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/05—Mashed or comminuted pulses or legumes; Products made therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
    • A23L2/39—Dry compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A23L29/35—Degradation products of starch, e.g. hydrolysates, dextrins; Enzymatically modified starches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L9/20—Cream substitutes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/718—Starch or degraded starch, e.g. amylose, amylopectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/732—Starch; Amylose; Amylopectin; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/06—Arthrobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/09—Bacillus circulans
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)

Abstract

本发明提供支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途。所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中，具有下述特征：(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围；(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且小于10%；及(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。

Description

支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途
本案是申请日为2008年4月23日，申请号为200880017583.1，发明名称为“支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途”的发明申请的分案申请。 
技术领域
本发明涉及一种支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途，详细来讲，涉及一种支链α-葡聚糖及具有通过与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用并进行α-葡糖基转移而生成该支链α-葡聚糖的作用的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法、以及含有该支链α-葡聚糖的组合物及其用途，所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中： 
(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围； 
(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； 
(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10%；及 
(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。 
背景技术
所谓食物纤维，本来是指动物难以消化的纤维素、木质素、半纤 维素、果胶等植物细胞成分，但是，广义来讲，也包含不能通过淀粉酶消化的难消化性的水溶性多糖类，它们被称为水溶性食物纤维。近年来，食物纤维在作为其原本的功能的整肠作用、血中胆固醇降低作用、血糖调节作用等的基础上，作为改善肠内菌丛的益生菌的功能也开始备受瞩目。但是，食物纤维与钙被并列认为是日本人的饮食生活中所缺少的营养素，现在的日本人的平均食物纤维摄取量相对平成6年提出的第5次修订“日本人的营养需要量”中所示的食物纤维的目标摄取量20～25g/日，仅达到目标的5～8成(参照例如《食物纤维的市场动向的调查》、“食品与开发”、第34卷、第2号、第24～27页(1999年)等)。在这种状况下，提出了各种可以用作各种饮食品的原料、且作为水溶性食物纤维有用的难消化性的多糖类。 
例如，作为水溶性食物纤维，市场上流通有难消化淀粉(湿热处理高直链淀粉玉米)、瓜尔胶分解物、葡甘露聚糖、低分子海藻酸等以存在于自然界的多糖为原料的水溶性食物纤维。但是，这些水溶性食物纤维均具有粘性高、添加于食品时有损味道、食感等缺点，因此，其利用只局限于一部分。另一方面，作为低粘度的水溶性食物纤维，在食品领域中广泛利用聚葡萄糖(美国辉瑞公司开发)或难消化性糊精。已知，聚葡萄糖是将葡萄糖和山梨糖醇及柠檬酸在高真空下进行加热、通过化学反应使其聚合而得到的合成多糖，葡萄糖在1,2、1,3、1,4、1,6、1,2,6、1,4,6位等具有糖苷键合成的支链。另外，难消化性糊精是在通过化学反应分解淀粉的同时使转移或逆合成反应发生，通过导入淀粉本来不具有的1,2、1,3、1,2,4、1,3,4的各糖苷键而降低消化性的合成多糖。该难消化性糊精如下操作进行制造，即，在淀粉中添加少量的盐酸，将以粉末状态进行加热而得到的焙烧糊精溶解于水，添加α-淀粉酶进行水解，对由此得到的低粘度溶液进行精制、凝缩、喷雾干燥。也有为了进一步降低消化性而在难消化性糊精中添加葡萄糖淀粉酶，使可消化部分分解至成为葡萄糖，分离除去葡萄糖，同样地进行精制、喷雾干燥而制得的制品。但是，难消化性糊精的来自原料淀粉的收率低，并且容易着色，在工业生产方面具有很大缺点。一 般认为，被导入这些聚葡萄糖或难消化性糊精中的新糖苷键同时含有α-端基及β-端基这双种端基差向异构体型，而且，还原末端葡萄糖残基部分地变化为1,6-脱水葡萄糖(参照例如《低分子水溶性食物纤维》、食品成分系列“食物纤维的科学”、第116页～131页、朝仓书店(1997年)等)。 
作为葡聚糖中的葡萄糖的键合方式的糖苷键(以下，在本说明书中将“糖苷键”简称为“键”。)中，由于α-1,6键与α-1,4键相比，通过淀粉酶难以使其分解，因此，含有较多α-1,6键的葡聚糖也可以期待用作水溶性食物纤维用途。例如，利用来自属于乳酸菌的肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖蔗糖酶(EC2.4.1.5)以蔗糖为原料制造的葡聚糖是葡萄糖主要以α-1,6键聚合的葡聚糖，有时也具有α-1,2键合及α-1,3键合的支链。使用来自肠膜明串珠菌B-512F株的葡聚糖蔗糖酶时，期待得到的葡聚糖中的键的α-1,6键的含量也达到90%以上，为难消化性。但是，葡聚糖因来自蔗糖的收率低，并且粘性高，所以精制操作繁琐，成本升高，因此，几乎没有进行作为水溶性食物纤维使用的尝试。 
另外，也进行了通过使淀粉酶与廉价的淀粉作用，主要分解α-1,4键，从而提高α-1,6键的含量，制备水溶性食物纤维的尝试。在日本特开2001-11101号公报中，提出了如下方法：通过使α-淀粉酶和β-淀粉酶的混合物与淀粉液化液作用后，回收残留的糊精部分，由此制备α-1,6键与α-1,4键的比提高至10～20%的支链糊精。但是，该支链糊精通过在保持淀粉本来具有的支链(α-1,6键)的同时除掉葡萄糖以α-1,4键连接的直链部分从而提高α-1,6键的比例的方法来制造，因此，存在来自原料淀粉的收率低、不能期待大幅度的消化性降低等问题。另外，作为与淀粉部分分解物(糊精)作用而导入α-1,6键的酶，已知有糊精葡聚糖酶(EC2.1.1.2)(参照例如山本一也等、“生物科学·生物技术·生物化学”、第56卷、(1992年)、第169页～173页)。虽然糊精葡聚糖酶是通过与淀粉部分分解物作用，主要催化α-1,6葡糖基键转移反应，从而生成葡聚糖结构(葡萄糖以α-1,6键 连接的结构)的酶，但是，目前已知的来自属于醋酸菌的荚膜醋杆菌(Acetobacter capsulatum)的糊精葡聚糖酶存在α-1,6键的的导入比例少(参照例如铃木雅之等、“应用糖质科学(Journal of Applied Glycoscience)”、第48卷、第2号、第143页～151页(2001年)等)、并且酶自身的稳定性低等问题，因此，未能应用于实际中。在这种状况下，即使在扩展水溶性食物纤维的选择范围的意义上，也强烈期望提供新的难消化性葡聚糖及制造其的方法。 
发明内容
本发明的课题在于，提供一种作为水溶性食物纤维有用的葡聚糖及其制造方法以及其用途。 
为了解决上述课题，本发明人等期待开发出以麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖为原料(基质)，生成具有较多支链(在本说明书中，所谓“支链”，是指在葡聚糖中的葡萄糖的键合方式中α-1,4键以外的葡萄糖的键合方式)的支链α-葡聚糖的酶，并对产生这种酶的微生物进行了广泛地探索。其结果发现，从土壤中分离出的微生物、PP710株及PP349株在菌体外产生与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用并生成具有α-1,4、α-1,6、α-1,3、α-1,4,6及α-1,3,6键的支链α-葡聚糖的新型α-葡糖基转移酶。而且发现，该新型酶可以由淀粉部分分解物等α-1,4葡聚糖有效地生成支链α-葡聚糖，所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中： 
(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围； 
(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； 
(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10%；及 
(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。 
另外，本发明人等发现，通过在培养PP710株而得到的α-葡糖基转移酶的粗酶液中预先混杂分解淀粉的淀粉酶，并使用该粗酶液、或将分离出的该淀粉酶与α-葡糖基转移酶并用，可以制造与单独使用α-葡糖基转移酶的情况相比水溶性食物纤维含量提高了的支链α-葡聚糖。而且还发现，除了可以并用该淀粉酶之外，通过将公知的α-淀粉酶或淀粉去分支酶等与α-葡糖基转移酶并用，也可以调节得到的支链α-葡聚糖的重均分子量或水溶性食物纤维含量。此外，本发明人等发现，通过这些方法而得到的支链α-葡聚糖与原料α-1,4葡聚糖相比，α-1,6键的比例大幅度地增大，而且具有α-1,3及α-1,3,6键，表现出显著的难消化性，因此，作为水溶性食物纤维是有用的，也具有血糖上升抑制作用及生物体内类脂质减少作用，从而完成了本发明。 
即，本发明通过提供一种支链α-葡聚糖和生成该支链α-葡聚糖的新型α-葡糖基转移酶、它们的制造方法以及用途来解决上述课题，所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中： 
(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围； 
(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； 
(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10%；及 
(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。 
根据本发明，可以收率良好且大量、廉价地制造并供给在以食品领域为主的各种领域中作为水溶性食物纤维是有用的、着色少的难消化性支链α-葡聚糖。 
附图说明
图1是将分别使用来自环状芽孢杆菌PP710及来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶样品、由淀粉部分分解物制成的葡聚糖A及B的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
图2是示意性地表示淀粉部分分解物及本发明的支链α-葡聚糖的结构的图。 
图3是表示来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的最适温度的图。 
图4是表示来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的最适pH的图。 
图5是表示来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的温度稳定性的图。 
图6是表示来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的pH稳定性的图。 
图7是表示来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的最适温度的图。 
图8是表示来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的最适pH的图。 
图9是表示来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的温度稳定性的图。 
图10是表示来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的pH稳定性的图。 
图11是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的最适温度的图。 
图12是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的最适pH的图。 
图13是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的温度稳定性的图。 
图14是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的pH稳定性的图。 
图15是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制品和淀粉酶精制品而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
图16是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制品和异淀粉酶而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
图17是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制品和α-淀粉酶而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
图18是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制品和CGTase而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
图19是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制品和异淀粉酶及CGTase而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。 
符号的说明 
在图1和图15～19中， 
1：相当于分子量1000,000道尔顿的洗脱位置 
2：相当于分子量100,000道尔顿的洗脱位置 
3：相当于分子量10,000道尔顿的洗脱位置 
4：相当于分子量1,000道尔顿的洗脱位置 
5：相当于分子量100道尔顿的洗脱位置 
在图1中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：葡聚糖A的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：葡聚糖B的凝胶过滤HPLC的色谱图 
1：相当于葡萄糖聚合度499的位置 
2：相当于葡萄糖聚合度6.3的位置 
3：相当于葡萄糖聚合度384的位置 
4：相当于葡萄糖聚合度22.2的位置 
5：相当于葡萄糖聚合度10.9的位置 
6：相当于葡萄糖聚合度1的位置 
7：相当于葡萄糖聚合度433的位置 
8：相当于葡萄糖聚合度22.8的位置 
9：相当于葡萄糖聚合度10.9的位置 
10：相当于葡萄糖聚合度1的位置 
在图2中， 
1：淀粉部分分解物的示意图 
2：本发明的支链α-葡聚糖的示意图 
a：非还原末端葡萄糖残基 
b：α-1,3键合的葡萄糖残基 
c：α-1,4键合的葡萄糖残基 
d：α-1,6键合的葡萄糖残基 
e：α-1,3,6键合的葡萄糖残基 
f：α-1,4,6键合的葡萄糖残基 
斜向虚线：α-1,3键合 
横向实线：α-1,4键合 
纵向实线：α-1,6键合 
在图13中， 
●：不存在钙离子的情况 
○：存在1mM钙离子的情况 
在图15中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.1单位淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.2单位淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
d：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.5单位淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
e：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、1单位淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
在图16中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、50单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、200单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
d：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、500单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
e：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、1000单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
在图17中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.1单位α-淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.2单位α-淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
d：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.5单位α-淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
e：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、1.0单位α-淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
在图18中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.1单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.2单位CGTase作 用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
d：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、0.5单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
e：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、1.0单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
在图19中， 
a：作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图 
b：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、50单位异淀粉酶、1单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
c：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、200单位异淀粉酶、1单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
d：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、500单位异淀粉酶、1单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图 
e：每1克基质使10单位α-葡糖基转移酶、1000单位异淀粉酶、1单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图具体实施方式 
本发明中所说的葡聚糖，是指以葡萄糖为构成糖的葡萄糖聚合度为3以上的寡糖或多糖。本发明的支链α-葡聚糖是以葡萄糖为构成糖的α-葡聚糖，其特征在于，在甲基化分析中： 
(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围； 
(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； 
(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10%；及 
(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。 
本发明中所说的甲基化分析，是通常公知的确定多糖或寡糖中构 成其的单糖的键合方式的方法。将甲基化分析用于葡聚糖中的葡萄糖的键合方式的分析时，首先，将构成葡聚糖的葡萄糖残基中的全部游离的羟基甲基化，接着，将完全甲基化了的葡聚糖水解。其次，将通过水解得到的甲基化葡萄糖还原，形成消除了端基差向异构体型的甲基化葡萄糖醇，而且，通过将该甲基化葡萄糖醇中的游离的羟基乙酰化，得到部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯(以下，在本说明书中，有时省略“部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯”中的被乙酰基化的部位和“葡萄糖醇乙酸酯”的标记，简称为“部分甲基化物”。)。通过用气相色谱法对得到的部分甲基化物进行分析，来自葡聚糖中键合方式各异的葡萄糖残基的各种部分甲基化物可以用占气相色谱图中的全部部分甲基化物的峰面积的峰面积的百分率(%)表示。而且，可以由该峰面积%确定该葡聚糖中的键合方式不同的葡萄糖残基的存在比、即各糖苷键的存在比率。在本说明书中，部分甲基化物的“比”，是指甲基化分析的气相色谱图中的峰面积之比，部分甲基化物的“%”，是指甲基化分析的气相色谱图中的“面积%”。 
上述(1)中的所谓2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇(以下，简称为“2,3,6-三甲基化物”)，是指C-4位参与1,4键合的葡萄糖残基，2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇(以下，简称为“2,3,4-三甲基化物”)是指C-6位参与1,6键合的葡萄糖残基。而且，所谓“2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物之比在1:0.6～1:4的范围”，即指在甲基化分析中的部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的气相色谱图中，对于本发明的支链α-葡聚糖，除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基与除C-1位以外仅C-4位参与键合的葡萄糖残基和除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基的总计的比例在37.5～80.0%的范围。 
上述(2)中的所谓“2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的60%以上”，是指对于本发明的支链α-葡聚糖，除C-1位以外仅C-4位参与键合的葡萄糖残基和除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基的总计占构成葡聚糖的总葡萄糖残基的60% 以上。 
同样，上述(3)中的所谓“2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇”(以下，简称为“2,4,6-三甲基化物”)，是指C-3位参与1,3-键合的葡萄糖残基，所谓“2,4,6-三甲基化物为部分甲基化物的0.5%以上且低于10%”，是指对于本发明的支链α-葡聚糖，除C-1位以外仅C-3位参与键合的葡萄糖残基为构成葡聚糖的总葡萄糖残基的0.5%以上且低于10%。 
进而，同样，上述(4)中的所谓“2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇”(以下，简称为“2,4-二甲基化物”)，是指C-3位及C-6位双方分别参与1,3键合和1,6键合的葡萄糖残基，所谓“2,4-二甲基化物为部分甲基化物的0.5%以上”，是指对于本发明的支链α-葡聚糖，除C-1位以外C-3位和C-6位参与键合的葡萄糖残基为构成葡聚糖的总葡萄糖残基的0.5%以上。 
完全满足上述(1)～(4)的条件的本发明的支链α-葡聚糖为目前为止所未知的新型葡聚糖。本发明的支链α-葡聚糖在甲基化分析中，只要满足上述(1)～(4)的条件，葡萄糖残基的键合顺序就没有特别限定。 
本发明的支链α-葡聚糖通常为具有葡萄糖聚合度为10以上的各种葡萄糖聚合度的支链α-葡聚糖的混合物的形态。另外，在本发明的支链α-葡聚糖中，其重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)通常小于20。 
进而，本发明的支链α-葡聚糖使具有即使为邻接于葡聚糖中的异麦芽糖结构的还原末端侧的α-1,2、α-1,3、α-1,4及α-1,6键的任一种键也进行水解的特征的异麦芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)作用时，每单位消化物的固体成分通常生成异麦芽糖25质量%以上50质量%以下。 
另外，对于本发明的支链α-葡聚糖，根据平成8年5月厚生省告示第146号的营养表示基准、“营养成份等的分析方法等(刊登于营养表示基准区别表第1的第3栏的方法)”中的第8项、记载于“食物纤维”的“高效液相色谱法(酶-HPLC法)”求出水溶性食物纤维含量时， 通常含有40质量%以上水溶性食物纤维。对上述高效液相色谱法(以下，在本说明书中简称为“酶-HPLC法”)的概略进行说明时，为如下方法：通过利用热稳定α-淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)进行的一系列酶处理对试样进行分解处理，利用离子交换树脂从处理液除去蛋白质、有机酸、无机盐类，由此，制备高效液相色谱(HPLC)用试样溶液，然后，供给到凝胶过滤HPLC中，求出色谱图中未消化葡聚糖和葡萄糖的峰面积，使用各自的峰面积、和预先另外利用常规方法的葡萄糖氧化酶法求出的试样溶液中的葡萄糖量，算出试样的水溶性食物纤维含量。对本方法的详细情况，将在后述的实验中进行说明。 
如后述的实验19所示，本发明的支链α-葡聚糖即使经口摄取也难以利用唾液α-淀粉酶、胰液α-淀粉酶或小肠粘膜α-糖甙酶进行分解，因此，难以被消化吸收，可以用作使血糖急剧上升少、刺激胰岛素的分泌少的低卡路里的水溶性食物纤维。另外，该支链α-葡聚糖利用口腔内的微生物，难以引起酸发酵，即使与蔗糖并用，也具有抑制成为牙垢的原因的不溶性葡聚糖的生成的作用，因此，也可以有利地用作低蛀牙性或抗致龋性糖质。进而，本发明的支链α-葡聚糖在使用小鼠的急性毒性试验中，为不显示任何毒性的葡聚糖。 
进而，如后述的实验20及21所示，同时摄取本发明的支链α-葡聚糖和通常的淀粉时，与仅摄取淀粉的情况相比，抑制血糖值或胰岛素量的上升，因此，也可以用作血糖上升抑制剂。 
而且，如后述的实验22所示，本发明的支链α-葡聚糖也具有通过摄取而抑制生物体内的类脂质的过剩蓄积的作用，因此，也可以用作生物体内类脂质减少剂。 
将本发明的支链α-葡聚糖用作上述血糖抑制剂或生物体内类脂质减少剂时，由于水溶性食物纤维含量越高，作用效果越优异，因此，支链α-葡聚糖通常可以优选利用含有40质量%以上、优选50质量%以上、进一步优选60质量%以上的水溶性食物纤维的支链α-葡聚糖。 
本发明中所说的α-葡糖基转移酶，是指通过与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用、基本上不进行水解地催化α-葡 糖基转移从而生成本发明的支链α-葡聚糖的酶。在水解活性弱方面、不依赖于基质溶液的浓度地由低浓度至高浓度均具有效率良好的转移活性方面及也生成α-1,3及α-1,3,6键方面，本发明的α-葡糖基转移酶为与来自以往公知的真菌的α-葡糖苷酶或来自醋酸菌的糊精葡聚糖酶不同的酶。 
本发明的α-葡糖基转移酶的酶活性可以如下测定。以最终浓度为1w/v%的方式使麦芽糖溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)并做成基质液，在该基质液5ml中加入酶液0.5ml，在40℃下进行酶反应30分钟，将该反应液0.5ml和5ml的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)混合，在沸水水浴中加热10分钟，由此使反应停止，然后，按照常规方法用葡萄糖氧化酶法测定反应液中的葡萄糖量，算出通过反应生成的葡萄糖量。α-葡糖基转移酶的活性1单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔的葡萄糖的酶量。 
作为本发明的α-葡糖基转移酶的一个具体例，可列举例如具有下述理化性质的α-葡糖基转移酶。 
(1)分子量 
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90,000±10,000道尔顿； 
(2)最适温度 
在pH6.0反应30分钟的条件下，为50～55℃； 
(3)最适pH 
在40℃反应30分钟的条件下，为5.0～6.3； 
(4)温度稳定性 
在pH6.0保持60分钟的条件下，在直至40℃稳定；及 
(5)pH稳定性 
在4℃保持24小时的条件下，至少在pH3.5～8.4的范围内稳定。 
作为本发明的α-葡糖基转移酶的其它具体例，可列举例如具有下述理化性质的α-葡糖基转移酶。 
(1)分子量 
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90,000±10,000道尔顿； 
(2)最适温度 
在pH6.0反应30分钟的条件下，为约50℃； 
(3)最适pH 
在40℃反应30分钟的条件下，为约6.0； 
(4)温度稳定性 
在pH6.0保持60分钟的条件下，在直至40℃稳定；及 
(5)pH稳定性 
在4℃保持24小时的条件下，至少在pH4.0～8.0的范围内稳定。 
虽然本发明的α-葡糖基转移酶不受其供给源的限制，但是，作为优选的供给源，可列举微生物，尤其优选使用本发明人等从土壤中分离出的微生物PP710株及PP349株。下面，将在本发明的具有α-葡糖基转移酶产生能力的微生物PP710株及PP349株的鉴定试验中判明的细菌学各种性质分别示于表1及2。需要说明的是，鉴定试验按照《微生物的分类和鉴定》(长谷川武治编、学会出版中心、1985年)进行。 
[表1] 
Figure BDA0000469697680000151
[表2] 
Figure BDA0000469697680000162
Figure BDA0000469697680000171
基于以上的细菌学性质，参考《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)、第2卷(1986年)及《核糖体数据库》(URL:http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)，分别研究微生物PP710株及PP349株与公知细菌的异同。其结果，判明，微生物PP710株为属于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的微生物，微生物PP349株为属于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的微生物。本发明人等将这2种菌株分别命名为新型微生物环状芽孢杆菌PP710及球形节杆菌PP349，它们都在平成19年2月1日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，分别以保藏编号FERM BP-10771及FERM BP-10770保藏。具有本发明的α-葡糖基转移酶产生能力的微生物包含上述菌株，也包含将上述菌株诱发突变、并进行选择而得到的酶高产生变异株等。 
用于具有本发明的α-葡糖基转移酶产生能力的微生物的培养的培养基，只要是微生物可以生长发育、可以产生本发明的α-葡糖基转移酶的营养培养基即可，可以为合成培养基及天然培养基中的任一种。作为碳源，只要是可以应用于微生物生长发育的碳源即可，例如，来自植物的淀粉或植物糖原、来自动物或微生物的糖原或普鲁兰多糖，另外还可以使用这些部分分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖醇、山梨糖醇、糖浆等糖质；以及柠檬酸、琥珀酸等有机酸。培养基中的这些碳源的浓度可以根据碳源的种类适当选择。作为氮源，可以适当使用例如铵盐、硝酸盐等无机氮化合物；以及例如尿素、玉米浆、酪蛋白、胨、酵母浸膏、肉浸膏等含有机氮物质。另外，作为无机成分，可以适当使用例如：钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰 盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐等盐类。而且，可以根据需要也适当使用氨基酸、维生素等。 
具有本发明的α-葡糖基转移酶产生能力的微生物的培养通常在选自温度15～37℃、pH5.5～10的范围、优选温度20～34℃、pH5.5～8.5的范围中的条件下，在有氧的情况下进行。培养时间只要是该微生物可以增殖的时间即可，优选为10小时～150小时。另外，培养条件中的培养液的溶存氧浓度没有特别限制，通常优选0.5～20ppm。因此，适当采用调节通气量或搅拌等方法。另外，培养方式可以为分批培养、半连续培养或连续培养中的任一种。 
由此培养具有α-葡糖基转移酶产生能力的微生物后，回收含有本发明的α-葡糖基转移酶的培养物。为培养微生物为环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)及球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)中的任一种的情况，α-葡糖基转移酶活性都主要在营养物的除菌液中被识别，可以提取除菌液作为粗酶液，也可以将全部培养物用作粗酶液。从培养物除去菌体时，采用常规方法的固液分离法。例如，可以适当采用对培养物本身进行离心分离的方法，或使用预涂过滤器等进行过滤分离的方法，利用平板膜、中空纤维膜等通过膜过滤进行分离的方法等。虽然除菌液可以直接用作粗酶液，但是，一般浓缩之后再使用。作为浓缩法，可以采用硫酸铵盐析法；丙酮及乙醇沉淀法；使用平板膜、中空膜等的膜浓缩法等。 
而且，也可以使用具有α-葡糖基转移酶活性的除菌液及其浓缩液，利用该领域常用的适当的方法将α-葡糖基转移酶固定化。作为固定化的方法，可以适当采用例如对离子交换体的结合法；与树脂及膜等的共有结合法、吸附法；使用高分子物质的包埋法等。 
如上所述，本发明的α-葡糖基转移酶虽然可以将粗酶液直接或浓缩而使用，但也可以根据需要利用该领域常用的适当的方法例如盐析、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法、制备用电泳等方法进行进一步分离、精制而利用。 
作为成为本发明的α-葡糖基转移酶的基质的葡萄糖聚合度为3 以上的α-1,4葡聚糖，可列举：淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等或利用淀粉酶或酸等将它们部分水解而得到的淀粉糊精、麦芽糊精及麦芽糖以上的麦芽寡糖等淀粉部分分解物。作为通过淀粉酶分解而成的部分分解物，可以采用例如记载于《淀粉酶和相关酶手册》(Handbook of Amylases and Related Enzymes)(1988年)パーガモン·プレス公司(东京)的、使用α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)、麦芽四糖生成淀粉酶(EC3.2.1.60)、麦芽五糖生成淀粉酶、麦芽六糖生成淀粉酶(EC3.2.1.98)、环麦芽糊精葡聚糖转移酶(EC2.4.1.19，以下，在本说明书中，简称为“CGTase”)等淀粉酶将淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等分解而得到的部分分解物。进而，在制备部分分解物时，也可以使支链淀粉酶(EC3.2.1.41)、异淀粉酶(EC3.2.1.68)等淀粉去分支酶作用。淀粉可以为来自例如玉米、小麦、稻米等的地上淀粉，还可以为来自马铃薯、甘薯、木薯等的地下淀粉。在由淀粉制造本发明的葡聚糖时，通常优选将如上所述的原料淀粉糊化和/或液化而使用。淀粉的糊化、液化的方法本身可以采用公知的方法。进而，本发明的α-葡糖基转移酶的基质可以是将醚化淀粉(羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、醋酸淀粉等)、酯化淀粉(磷酸化淀粉、辛烯基琥珀酸淀粉等)及交联淀粉(乙酰基化己二酸交联淀粉、磷酸交联淀粉、羟丙基化磷酸交联淀粉等)等淀粉的一部分利用化学方法进行衍生物化而成的化工淀粉。 
在使本发明的α-葡糖基转移酶作用于基质时，其基质浓度没有特别限定，例如，即使在使用基质浓度0.5%(w/v)的较低浓度的溶液的情况下，也促进本发明的α-葡糖基转移酶的反应而生成支链α-葡聚糖。工业上优选基质浓度选自1%(w/v)以上、优选5～60%(w/v)以上、进一步优选10～50%(w/v)的范围的浓度，在该条件下，可以有利地生成本发明的支链α-葡聚糖。反应温度只要在反应进行的温度、即至60℃左右的温度下进行即可。优选使用30～50℃左右的温度。反应pH通常调整为4～8的范围、优选pH5～7的范围。酶的使用量和反应时间存在密切的关系，根据作为目的的酶反应的促进适当选择即可。 
例如，使本发明的α-葡糖基转移酶与淀粉或其部分分解物或直链淀粉的水溶液作用时的支链α-葡聚糖的生成机理推测如下。 
(1)本酶与作为基质的麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用，将非还原末端葡萄糖残基主要α-1,4或α-1,6葡糖基转移到其它的α-1,4葡聚糖的非还原末端葡萄糖残基上，由此生成非还原末端葡萄糖残基的4位或6位羟基上α-键合有葡萄糖的α-1,4葡聚糖(葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖)和葡萄糖聚合度减少1的α-1,4葡聚糖。 
(2)本酶进一步与(1)中产生的葡萄糖聚合度减少1的α-1,4葡聚糖作用，相对(1)中产生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖，与(1)同样地进行分子间α-1,4或α-1,6葡糖基转移，由此，在(1)中产生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖的非还原末端葡萄糖残基的4或6位羟基上进一步转移葡萄糖，使链长延长。 
(3)通过重复上述(1)及(2)的反应，由麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖生成具有α-1,4及α-1,6键的葡聚糖。 
(4)虽然频率低，但是，本酶通过进一步催化α-1,3葡糖基转移或相对位于葡聚糖的内部的α-1,6键合的葡萄糖残基的α-1,4或α-1,3葡糖基转移，生成也具有α-1,3键、α-1,4,6键及α-1,3,6键的葡聚糖。 
(5)作为重复上述(1)～(4)的反应的结果，葡萄糖主要以α-1,4键及α-1,6键键合，生成具有少量α-1,3键、α-1,4,6键及α-1,3,6键的支链α-葡聚糖。 
另外判明，具有本发明的α-葡糖基转移酶产生能力的环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)，在其培养物中不仅产生本发明的α-葡糖基转移酶，同时还产生某种淀粉酶，并意外地并用α-葡糖基转移酶和该淀粉酶使其与麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用时，与单独使α-葡糖基转移酶作用的情况相比，可以制造水溶性食物纤维含量进一步提高了的支链α-葡聚糖。 
作为环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)产生的淀粉酶，可列举 具有下述理化性质的淀粉酶。 
(1)作用 
在水解淀粉的同时，催化葡糖基的转移，生成环糊精。水解普鲁兰多糖，生成潘糖； 
(2)分子量 
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为58,000±10,000道尔顿； 
(3)最适温度 
在pH6.0反应30分钟的条件下，为55℃； 
(4)最适pH 
在35℃、30分钟反应的条件下，为6～7； 
(4)温度稳定性 
在pH6.0保持60分钟的条件下，在直至40℃的范围稳定， 
在pH6.0、1mM Ca2+离子存在下，在直至50℃的范围稳定；及 
(6)pH稳定性 
在4℃保持24小时的条件下，在pH6.0～8.0的范围内稳定。 
作为在并用本发明的α-葡糖基转移酶和该淀粉酶并使其与淀粉部分分解物作用时得到的支链α-葡聚糖的水溶性食物纤维的含量比仅使用α-葡糖基转移酶制成的支链α-葡聚糖的情况高的理由，推测为：相对通过α-葡糖基转移酶的作用生成的支链α-葡聚糖，淀粉酶进一步转移葡糖基，进一步提高了葡聚糖中的支链的程度(频率)。 
另外，通过酶反应制备本发明的支链α-葡聚糖时，通过并用其它公知的淀粉酶来使其反应，可以有利地实施支链α-葡聚糖的分子量分布的调节、以及消化性进一步降低了的支链α-葡聚糖的形成、进而还原能力的降低。例如，通过在淀粉液化液中并用本发明的α-葡糖基转移酶、和α-淀粉酶或CGTase等水解淀粉内部的α-1,4键而产生新的非还原末端葡萄糖残基的酶，并使其作用，也可以有利地实施使分子量分布的幅度变窄、使粘度降低并进一步增加有助于消化性的降低的α-1,3、α-1,6及α-1,3,6键的比例。另外，通过并用异淀粉酶等淀粉去分支酶，使分子量分布的幅度变窄，使粘度降低，或通过并用日 本特开平7-143876号公报等中公开的非还原性糖质生成酶(别名：麦芽寡糖基海藻糖生成酶(EC5.4.99.15))，可以有利地实施将还原末端部分部分地变换为海藻糖结构而使还原能力降低。 
另外，本发明的支链α-葡聚糖也可以通过在含有麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖的营养培养基中培养具有本发明的α-葡糖基转移酶产生能力的微生物，提取在培养液中生成的支链α-葡聚糖来制造。 
通过上述反应或培养而得到的支链α-葡聚糖也可以直接做成支链α-葡聚糖制品。另外，也可以根据需要使选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及α-葡糖苷酶中的1种或2种以上与反应液作用，水解可消化部分后，通过分级回收非消化部分，或通过使用了酵母等的发酵处理除去以葡萄糖为主的分解物，由此制备消化性进一步降低的支链α-葡聚糖。一般而言，含有支链α-葡聚糖的反应液可进一步精制后再使用。作为精制方法，适当采用用于糖的精制中使用的通常的方法即可，例如，可以适当采用利用活性炭进行的脱色；利用H型、OH型离子交换树脂进行的脱盐；利用醇及丙酮等有机溶剂进行的分离、利用具有适当的分离性能的膜进行的分离等1种或2种以上的精制方法。 
本发明的α-葡糖基转移酶与糊化淀粉或较低DE(Dextrose Equivalent)、优选低于DE20的淀粉部分分解物作用时，几乎不生成葡萄糖或麦芽糖等低分子寡糖，因此，虽然不特别需要用柱色谱法等精制方法精制得到的反应生成物，但是，可以根据用途等目的进一步分级。在分级中采用离子交换色谱法时，可以有利地采用使用例如日本特开昭58-23799号公报、日本特开昭58-72598号公报等中公开的强酸性阳离子交换树脂的柱色谱法。此时，可以采用固定床方式、移动床方式、模拟移动床方式中的任一种方式。 
由此得到的本发明的支链α-葡聚糖虽然可以以溶液的方式直接利用，但是，为了有利于保存、且容易根据用途利用，优选进行干燥形成粉末品。干燥通常可以使用冷冻干燥或喷雾干燥或滚筒干燥等方 法。干燥物也可以根据需要有利地实施粉碎而进行粉末化、或筛选或制粒而调整为特定粒度的范围。 
另外，本发明的支链α-葡聚糖具备浸透压调节性、赋形性、光泽赋予性、保湿性、粘度赋予性、胶粘性、其它糖的结晶抑制性、难发酵性等性质。因此，本发明的支链α-葡聚糖或含有其的糖质可以以水溶性食物纤维、品质改良剂、稳定剂、赋形剂等有利地应用于饮食品、嗜好品、饲料、饵料、化妆品、医药品等各种组合物。 
本发明的支链α-葡聚糖也可以与例如粉糖、葡萄糖、果糖、异性化糖、砂糖、麦芽糖、海藻糖、蜂蜜、槭糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、二氢查尔酮、甜菊糖、α-葡糖基甜菊糖、罗汉果甜味剂、甘草甜素、甜蛋白、三氯蔗糖、天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等之类的甜味剂和糊精、淀粉、葡聚糖、乳糖等之类的增量剂混合使用。 
另外，本发明的支链α-葡聚糖的粉末状制品可以直接或根据需要与增量剂、赋形剂、粘合剂等混合，成形为颗粒、球状、短棒状、板状、立方体等各种形状而使用。 
另外，本发明的支链α-葡聚糖即使经口摄取也难以被消化，因此，可以作为水溶性食物纤维有利地应用于普通的饮食品等。可以有利地用作例如酱油、粉末酱油、豆酱、粉末豆酱、未过滤的酒、酱、撒在饭上的粉状食品、蛋黄酱、调味汁、食醋、三杯醋、寿司醋粉、中国调料、高汤、面条汤、辣酱油、番茄酱、烧烤酱、咖喱炒面、炖肉料、汤料、海带木鱼汤料、复合调味品、料酒、新鲜料酒、蔗糖、咖啡糖等各种调味剂的品质改良剂等。另外，可以有利地用作例如煎饼、炸碎块年糕、米花糖、皮糖样的点心、饼类、豆沙包、米粉糕、馅类、羊羹、软羊羹、锦玉、果冻、蛋糕、糖果等各种点心、面包、饼干、椒盐饼干、小甜饼、馅饼、布丁、掺糖奶油、乳蛋糕乳脂、奶油馅点心、蛋奶烘饼、海绵松蛋糕、炸面饼圈、巧克力、口香糖、焦糖、杏仁糖、冰棒等各种西式点心、冰激凌、果子露等冰点心、果实罐头、冰蜜等糖浆类、面粉膏、花生膏、果实膏等膏类；果酱、橘皮果酱、 罐头、糖果等果实、蔬菜的加工食品类；什锦八宝酱菜、用少量盐和曲子渍的萝卜、千层咸菜等咸菜类；腌萝卜调料、腌白菜调料等咸菜调料；火腿、香肠等肉制品类；鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼糕、烤成的筒状鱼卷、炸虾等鱼肉制品、海胆、咸墨鱼、醋海带、炸鱿鱼、鳕鱼、加级鱼、虾等鱼松等各种珍味类；用海苔、蔬菜、干鱿鱼、小鱼、贝等制造的咸烹海味类；煮豆菜、炸马铃薯(土豆)片、海带卷等家常菜食品；乳制品、鱼肉、畜肉、果实、蔬菜的瓶装、罐头类、合成酒、增酿酒、清酒、果酒、发泡酒、啤酒等酒类；咖啡、可可茶、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料等清凉饮料水、布丁混合粉Purin Mix、热香饼混合粉、快餐果汁、快餐咖啡、快餐年糕小豆汤、快餐汤等快餐食品；还有断奶食品、医疗食品、清凉剂、肽食品、冷冻食品等各种饮食品中可以配合的水溶性食物纤维。 
另外，作为用于家畜、家禽、其它蜜蜂、蚕、鱼等饲养动物的饲料、饲料等，也可以以改善整肠、便秘、防止肥胖为目的而使用。此外，可以以香烟、牙膏、口红、润唇膏、内服药、药片、片剂、肝油丸、口气清新剂、口香糖、含漱剂等各种固体成分、膏状、液体状等形态有利地用作对嗜好品、化妆品、医药品等各种组合物的品质改良剂、稳定剂等。 
作为品质改良剂、稳定剂，可以有利地应用于容易失去有效成分、活性等的各种生理活性物质或含有其的健康食品、功能性食品、医药品等。例如，干扰素-α、-β、-γ、肿瘤坏死因子-α、-β、巨噬细胞、巨噬细胞游走抑制因子、菌落刺激因子、转移因子、白细胞介素Ⅱ等淋巴因子含有液、胰岛素、成长激素、催乳激素、红细胞生成素、卵细胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛痘疫苗、破伤风类毒素、波布抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂含有液、青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、肝油、类胡萝卜素、麦角甾醇、生育酚等维生素含有液、EPA、DHA、花生酸等高度不饱和脂肪酸或其酯衍生物、脂酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、 β-淀粉酶、异淀粉酶、葡糖酶、乳糖酶等酶含有液、药用人参浸膏、龟浸膏、小球藻浸膏、芦荟浸膏、蜂胶浸膏等浸膏类、病毒、乳酸菌、酵母等活菌疫苗膏、蜂王浆等各种生理活性物质都将本发明的支链α-葡聚糖用作品质改良剂、稳定剂，由此，其有效成分、活性不会丧失，可以容易地制造稳定且高品质的液体状、膏状或固体状的健康食品、功能性食品或医药品等。 
作为在如上所述的各种组合物中含有本发明的支链α-葡聚糖的方法，只要在其制品完成的步骤之前含有即可，可以选择例如混合、混捏、溶解、熔化、浸渍、浸透、分散、涂敷、被覆、喷雾、注入、固化等公知的方法。其量通常优选含有0.1质量%以上、优选1质量%以上。 
另外，本发明的α-葡糖基转移酶与含有麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用时，将α-1,4葡聚糖变换为本发明的支链α-葡聚糖，因此，也可以用作含有麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖的组合物的改性剂。 
而且，本发明的α-葡糖基转移酶与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用时，生成本发明的支链α-葡聚糖，另一方面，本发明的支链α-葡聚糖通过异麦芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)消化时，每基质固体成分生成异麦芽糖25质量%以上50质量%以下，因此，对本发明的α-葡糖基转移酶，可以以麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖为原料，通过这2个段的酶反应来制造异麦芽糖或含有其的糖质。 
下面，利用实验对本发明进行详细说明。 
<实验1：使用来自环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)的α-葡糖基转移酶的葡聚糖的制备> 
<实验1-1：来自环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)的α-葡糖基转移酶的制备> 
在1个500ml容积三角烧瓶中加入由淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃4》、松谷化学工业株式会社出售)1.5w/v%、酵母萃 取物(商品名《聚胨》、日本制药株式会社出售)0.5w/v%、酵母萃取物(商品名《酵母浸膏S》、日本制药株式会社出售)0.1w/v%、磷酸二钾0.1w/v%、磷酸一钠·2水合物0.06w/v%、硫酸镁·7水合物0.05w/v%、硫酸锰·5水合物0.00w/v%、硫酸亚铁·7水合物0.001w/v%及水构成的液体培养基100ml，用高压灭菌器在121℃灭菌20分钟并冷却，接种环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)，将在27℃以230rpm旋转振荡培养48小时得到的产物作为菌种培养。 
在12个500ml容积三角烧瓶中加入与菌种培养相同组成的液体培养基各100ml，进行加热灭菌、冷却并设定为27℃后，接种各菌种培养液约1ml，在温度27℃旋转振荡培养24小时。培养后，从三角烧瓶抽出培养液，进行离心分离(8,000rpm、20分钟)并除去菌体，测定得到的培养上清液的α-葡糖基转移酶活性，结果为2.8单位/ml。在该培养上清液约1L中以成为80%饱和的方式添加硫酸铵并溶解，在4℃放置24小时，由此进行盐析。通过离心分离(11,000rpm、30分钟)回收沉淀的盐析物，将其溶解于20mM醋酸缓冲液(pH4.5)后，相对同缓冲液进行透析，得到粗酶液约20ml。将该粗酶液供给到使用用20mM醋酸缓冲液(pH4.5)平衡化了的东苏株式会社制《CM-トヨパール650S》凝胶的阳离子交换柱色谱法(凝胶容量20ml)。将非吸附蛋白质洗脱后，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，回收在食盐浓度约0.18M左右～0.45M左右洗脱的组分，相对20mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行透析。将得到的透析液作为α-葡糖基转移酶样品。 
<实验1-2：使用α-葡糖基转移酶的支链α-葡聚糖的制备> 
将由实验1-1得到的α-葡糖基转移酶样品100ml用作酶液，其中以终浓度为30w/v%的方式添加淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)，在40℃下反应72小时后，在约100℃下热处理10分钟，由此停止反应。过滤不溶物并除去后，使用三菱化学制离子交换树脂《ダイヤイオンSK-1B》和《ダイヤイオンWA30》及オルガノ制阴离子交换树脂《IRA411》进行脱色、脱盐并精密过滤，然后，用蒸发器浓缩，从用作基质的淀粉部分分解物以每固体成分 85.8%的收率得到固体成分浓度30质量%的葡聚糖溶液。 
<实验2：使用来自球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)的α-葡糖基转移酶的葡聚糖的制备> 
<实验2-1：来自球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)的α-葡糖基转移酶的制备> 
取代环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)，接种球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)，除此之外，将与实验1-1同样地培养成的产物作为菌种培养。 
在12个500ml容积三角烧瓶中加入与菌种培养相同的液体培养基各100ml，进行加热灭菌、冷却并设定为27℃后，接种各菌种培养液约1ml，在温度27℃旋转振荡培养24小时。培养后，从三角烧瓶抽出培养液，进行离心分离(8,000rpm、20分钟)并除去菌体，测定得到的培养上清液的α-葡糖基转移酶活性，结果为0.53单位/ml。在该培养上清液约1L中以成为80%饱和的方式添加硫酸铵并溶解，在4℃放置24小时，由此进行盐析。通过离心分离(11,000rpm、30分钟)回收沉淀的盐析物，将其溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，相对同缓冲液进行透析。将该粗酶液供给到使用用20mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡化了的东苏株式会社制《DEAE-トヨパール650S》凝胶的阴离子交换柱色谱法(凝胶容量20ml)。将非吸附蛋白质洗脱后，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，回收在食盐浓度约0.05M左右～0.2M左右洗脱的组分，相对20mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行透析。将得到的透析液作为α-葡糖基转移酶样品。 
<实验2-2：使用α-葡糖基转移酶的葡聚糖的制备> 
将由实验2-1得到的α-葡糖基转移酶样品20ml用作酶液，其中以终浓度为30w/v%的方式添加淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)，在40℃下使其反应72小时后，在约100℃下热处理10分钟，由此停止反应。过滤不溶物并除去后，使用三菱化学制离子交换树脂《ダイヤイオンSK-1B》和《ダイヤイオンWA30》及オルガノ制阴离子交换树脂《IRA411》进行脱色、 脱盐并精密过滤，然后，用蒸发器浓缩，从用作基质的淀粉部分分解物以每固体成分83.6%的收率得到固体成分浓度为30质量%的葡聚糖溶液。 
在以下的实验3及4中，为了区别由实验1-2得到的葡聚糖和由实验2-2得到的葡聚糖，将各自称为“葡聚糖A”和“葡聚糖B”。 
<实验3：作为葡聚糖A及B的水溶性食物纤维的评价> 
将得到的葡聚糖的水溶性食物纤维含量按照营养表示基准(平成8年5月厚生省告示第146号)中的营养成份等分析方法等(刊登于营养表示基准区别表第1的第3栏的方法)”、8.食物纤维、(2)高效液相色谱法(酶-HPLC法)记载的方法，利用下述方法进行研究。作为酶处理用的试剂盒，使用总食物纤维测定的试剂盒(Dietary Fiber,Total,Assay,Control Kit、Sigma公司制造)。另外，以作为用于葡聚糖A及B的制备的基质的淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)为对照1，以市售的难消化性葡聚糖(商品名《パイファイバー》松谷化学工业株式会社出售)为对照2，同样地研究各自的水溶性食物纤维含量。 
<分析用试样溶液的制备> 
在试管中取固体成分0.1g的葡聚糖作为被检试样，添加0.08M磷酸缓冲液5ml，将pH调整为6.0。其中，加入附有食物纤维测定试剂盒的热稳定α-淀粉酶(来自地衣芽孢杆菌的耐热性α-淀粉酶、Sigma公司制造)溶液0.01ml，用铝箔覆盖，在沸腾水浴中每5分钟进行搅拌，同时使其反应30分钟并冷却。在得到的反应液中添加0.275M氢氧化钠溶液约1ml，将pH调整为7.5后，加入附有试剂盒的蛋白酶(来自地衣芽孢杆菌、Sigma公司制造)溶液0.01ml，用铝箔覆盖，在60℃的水浴中振荡，同时使其反应30分钟并冷却。在得到的蛋白酶处理液中添加0.325M盐酸约1ml，将pH调整为4.3后，加入附有试剂盒的淀粉葡糖苷酶(来自黑曲霉、Sigma公司制造)溶液0.01ml，用铝箔覆盖，在60℃的水浴中振荡，同时使其反应30分钟并冷却。接着，将得到的反应液约7ml以SV1.0通液到离子交换树脂(将オルガノ株式 会社出售的アンバーライトIRA-67(OH型)和アンバーライト200CT(H型)以1:1混合)，由此进行脱盐，进一步用3倍量的去离子水洗脱，将洗脱液的总量设定为约28ml。用蒸发器浓缩得到的洗脱液，用孔径0.45μm的膜滤器进行过滤后，将用量瓶定容为25ml的洗脱液作为分析用试样溶液。 
<高效液相色谱法条件> 
将上述得到的分析用试样溶液供给到述条件的高效液相色谱法。 
柱：串联连接2根TGKgel G2500PWXL(内径7.8mm×长度300mm，株式会社东苏製)而得到的色谱图 
洗提液：去离子水 
试样糖浓度：0.8质量% 
柱温度：80℃ 
流速：0.5ml/分钟 
检测：差示折射计 
注入量：20μl 
分析时间：50分钟 
<被检试样的水溶性食物纤维含量的计算> 
在由上述得到的色谱图中，将通过酶处理也不被分解而残留的未消化葡聚糖作为水溶性食物纤维。分别求出被分解成水溶性食物纤维而生成的葡萄糖的峰面积，另外，使用通过常规方法的葡萄糖氧化酶法进行定量的分析用试样溶液中的葡萄糖量，利用下述式1求出水溶性食物纤维量。而且，利用下述式2求出被检试样的水溶性食物纤维含量。 
式1： 
[数1] 
水溶性食物纤维量(mg)=水溶性食物纤维的峰面积/葡萄糖的峰面积×分析用试样溶液中的葡萄糖质量*(mg) 
*：(分析用试样溶液中的葡萄糖浓度(mg/ml)×25ml) 
式2： 
[数2] 
水溶性食物纤维含量(质量%)＝被检试样水溶性食物纤维量(mg)/被检试样固体成分质量(mg)×100 
利用上述酶-HPLC法求出的葡聚糖A及葡聚糖B的水溶性食物纤维含量分别为42.1质量%及41.8质量%。另一方面，对照1的淀粉部分分解物通过酶处理全部分解为葡萄糖，水溶性食物纤维含量评价为0质量%。另外，对照2的市售的难消化性糊精(商品名《パイファイバー》松谷化学工业株式会社出售)的水溶性食物纤维含量为48.7质量%。这些结果显示：通过以不含有水溶性食物纤维的淀粉部分分解物为基质使本发明的α-葡糖基转移酶作用，可以容易地制备表示与市售的难消化性糊精几乎同等的水溶性食物纤维含量的葡聚糖。 
<实验4：葡聚糖A及B的结构分析> 
<实验4-1：甲基化分析> 
在用实验1-2及2-2的方法得到的葡聚糖A及B中，按照常规方法进行甲基化分析，用下述条件的高效液相色谱法研究部分甲基化物。将结果汇总于表3。 
<气相色谱法条件> 
柱：DB-5毛细管柱(内径0.25mm×长度30m×膜厚1μm，J&W Scientific公司制造) 
载气：氦 
柱温度：在130℃下保持2分钟后，以5℃/分钟升温至250℃，在250℃下保持20分钟 
流速：1.0ml/分钟 
检测：FID 
注入量：3μl(分流1/30) 
分析时间：46分钟 
[表3] 
Figure BDA0000469697680000311
*：パインデックス＃100 
葡聚糖A：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶制成的葡聚糖 
葡聚糖B：由来自PP349株的α-葡糖基转移酶制成的葡聚糖 
由表3的结果得知，将利用来自环状芽孢杆菌PP710及来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶分别制成的葡聚糖A及B的甲基化分析结果与作为基质的淀粉部分分解物的甲基化分析结果比较时，任一种葡聚糖的情况都显著降低2,3,6-三甲基化物，另一方面，2,3,4-三甲基化物显著增加至30%以上。该情况表明：通过来自环状芽孢杆菌PP710及来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的反应，具有主要通过α-1,4键聚合有葡萄糖的结构的淀粉部分分解物变换为含有30%以上α-1,6键的支链α-葡聚糖。另外也判明：由于2,3,4,6-四甲基化物、2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物增加，因此，重新生成非还原末端葡萄糖、α-1,3键及α-1,3,6键。葡聚糖A中的部分甲基化物中的2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物的含量分别为1.1%及0.8%，葡聚糖B中的2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物的含量分别为0.9%及1.1%。而且，在葡聚糖A及B中，2,3-二甲基化物的存在比与基质几乎没有差异，因此认为，在原来存在于基质的作为支链的α-1,4,6键上没有大的变化。由该结果判明：葡聚糖A及B与作为基质的淀粉部分分解物有很大差异，葡萄糖的键合方式为以α-1,4键及α-1,6键为主体、也稍微具有α-1,3键及α-1,3,6键的支链葡聚糖(支链α-葡聚糖)。需要说明的是，构成支链α-葡聚糖A及B的葡萄糖的 1位的端基差向异构体型在核磁共振(NMR)分析中，从1H-NMR光谱来看，全部为α型。 
<实验4-2：支链α-葡聚糖A及B的异麦芽糖糊精酶消化试验> 
为了使支链α-葡聚糖A及B的结构带有特征，进行异麦芽糖糊精酶消化试验。在支链α-葡聚糖A及B的水溶液(最终浓度1w/v%)中每1克基质固体成分加入100单位的来自球形节杆菌的异麦芽糖糊精酶(在株式会社林原生物化学研究所内制备)，在50℃、pH5.0下作用16小时，在100℃下保持10分钟并停止反应后，使用高效液相色谱法(以下简称为“HPLC法”。)及气相色谱法研究该反应液中的糖组成。HPLC在柱中使用2根“MCI GEL CK04SS”(株式会社三菱化学制造)，在洗提液中使用水，在柱温度80℃、流速0.4ml/分钟的条件下进行，使用差示折射计RID-10A(株式会社岛津制作所制造)进行检测。GC按照常规方法将糖质进行三甲基甲硅烷基化(TMS化)后，在柱中使用《2%硅OV-17Chromosorb W/AW-DMS》(株式会社ジー·エル·サイエンス制造)，每1分钟以7.5℃的升温速度从温度160℃升温至320℃。使用氮气作为载气，用FID法进行检测。在异麦芽糖糊精酶消化中，由作为用于支链α-葡聚糖的制备的基质的淀粉部分分解物没有完全生成异麦芽糖，与此相对，由支链α-葡聚糖A生成作为糖组成的28.4质量%的异麦芽糖，另外，由α-葡聚糖B生成作为糖组成的27.2质量%的异麦芽糖。该结果显示，α-葡聚糖A及B分别至少含有异麦芽糖结构28.4质量%及27.2质量%左右，支链α-葡聚糖支持显示有α-1,6键的比例增加的实验4-1中的甲基化分析的结果。需要说明的是，异麦芽糖糊精酶如果为连接于葡聚糖中的异麦芽糖结构的还原末端侧的α-葡糖基键，则具有其为α-1,3、α-1,4及α-1,6键的任一种都进行水解的特异性，因此，得到的异麦芽糖在α-葡聚糖A及B中以怎样的键合方式键合，其详细情况不清楚。 
<实验4-3：支链α-葡聚糖A及B的α-葡糖苷酶及葡萄糖淀粉酶消化试验> 
在支链α-葡聚糖A及B的水溶液(最终浓度1w/v%)中使来自黑曲 霉(Aspergillus niger)的α-葡糖苷酶(商品名《反式葡糖苷酶端基差向异构体Ｌ》、天野酵素制)及来自海洋真菌属(Rhizopus sp.)的葡萄糖淀粉酶同时作用，进行消化试验。每1克基质固体成分加入5,000单位的α-葡糖苷酶和100单位的葡萄糖淀粉酶，在50℃、pH5.0下作用16小时，在100℃下保持10分钟并停止反应后，在与实验4-2相同的条件下使用HPLC研究其酶反应液的糖组成。其结果，α-葡聚糖A及B都与作为基质的淀粉部分分解物的情况同样，基本上完全被分解为葡萄糖。该结果显示，α-葡聚糖A及B都是以葡萄糖为构成糖的α-葡聚糖。 
<实验4-4：分子量分布分析> 
对支链α-葡聚糖A及B用常规方法的凝胶过滤HPLC法分析分子量分布。凝胶过滤HPLC法在柱中使用连接有2根《TSK GELα-M》(株式会社东苏制)的柱，在洗提液中使用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)，在柱温度40℃、流速0.3ml/分钟的条件下进行，使用差示折射计RID-10A(株式会社岛津制作所制造)进行检测。需要说明的是，试样中的葡聚糖的分子量基于将分子量测定用普鲁兰样品(株式会社林原生物化学研究所出售)同样地供给到凝胶过滤分析并制成的分子量的标准曲线算出。图1将支链α-葡聚糖A及B的凝胶过滤HPLC色谱图(图1中的符号b及c)与用作基质的淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》的凝胶过滤HPLC色谱图(图1中的符号a)比较，同时分别表示。需要说明的是，图1中的符号イ、ロ、ハ、ニ及びホ分别是指相当于分子量1,000,000、100,000、10,000、1,000及100道尔顿的洗脱位置(在后述的图15～19中也同样)。另外，表4表示基于用凝胶过滤HPLC得到的色谱图分析有各试样的分子量分布的结果。 
[表4] 
Figure BDA0000469697680000331
*：パインデックス＃100 
葡聚糖A：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶制成的葡聚糖 
葡聚糖B：由来自PP349株的α-葡糖基转移酶制成的葡聚糖 
用作基质的淀粉部分分解物为在分子量分布分析中在相当于葡萄糖聚合度499及6.3的位置上具有2个峰值(图1的色谱图a中的符号1及2)的糖质混合物，与此相对，支链α-葡聚糖A为在相当于葡萄糖聚合度384、22.2、10.9及1的位置上具有4个峰值(图1的色谱图b中的符号3、4、5及6)的糖质混合物，另外，支链α-葡聚糖B为在相当于葡萄糖聚合度433、22.8、10.9及1的位置上具有4个峰值(图1的色谱图c中的符号7、8、9及10)的糖质混合物。虽然符号6及10的峰值相当于葡萄糖，但是，其含量极少，因此得知，来自环状芽孢杆菌PP710及球形节杆菌PP349的酶的水解作用微小。由表4得知，与作为基质的淀粉部分分解物相比，葡聚糖A及B的数均分子量及重均分子量同时减少至60%程度，作为主体进行低分子化。另外认为，由于作为分子量分布的扩展的指标的重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)在淀粉部分分解物和葡聚糖A及B之间没怎么变化，因此，来自环状芽孢杆菌PP710及球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶仅作用于淀粉部分分解物的非还原末端。 
由表3的结果判明：在用作基质的淀粉部分分解物中，葡萄糖的键合方式的90%为α-1,4键，稍微具有α-1,4,6键，与此相对，葡聚糖A及B为相对α-1,4键的α-1,6键的比例非常高、含有在α-1,4,6键的基础上也具有α-1,3键及α-1,3,6键的支链的葡聚糖。具有这种结构的支链α-葡聚糖迄今为止还不为人知。 
基于甲基化分析的结果推定本发明的支链α-葡聚糖结构，将示意性地表示其结构的图与作为基质的淀粉部分分解物的图一同示于图2。图2中，符号1及2分别为各自原料淀粉部分分解物及本发明的支链α-葡聚糖的示意图。需要说明的是，在图2中，符号a、b、c、d、e及f分别是指淀粉部分分解物或本发明的支链α-葡聚糖中的非还原末端葡萄糖残基、α-1,3键合的葡萄糖残基、α-1,4键合的葡萄糖残 基、α-1,6键合的葡萄糖残基、α-1,3,6键合的葡萄糖残基及α-1,4,6键合的葡萄糖残基。另外，同示意图中的葡萄糖间的斜虚线、横实线及纵实线分别是指α-1,3键合、α-1,4键合及α-1,6键合。 
<实验5：来自环状芽孢杆菌PP710株的α-葡糖基转移酶的生产> 
在2个500ml容积三角烧瓶中加入由淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃4》松谷化学工业株式会社制造)1.5w/v%、酵母萃取物(商品名《聚胨》、日本制药株式会社制造)0.5w/v%、酵母萃取物(商品名《酵母浸膏S》、日本制药株式会社制造)0.1w/v%、磷酸二钾0.1w/v%、磷酸一钠·2水合物0.06w/v%、硫酸镁·7水合物0.05w/v%、硫酸锰·5水合物0.001w/v%、硫酸亚铁·7水合物0.001w/v%及水构成的液体培养基各100ml，用高压灭菌器在121℃灭菌20分钟并冷却，接种环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)，将在27℃以230rmp旋转振荡48小时培养成的产物作为菌种培养。 
在容量30L的发酵罐中加入与菌种培养相同组成的液体培养基约20L，进行加热灭菌、冷却并设定为27℃后，接种菌种培养液约200ml，保持在温度27℃、pH5.5～8.0，同时通气搅拌培养24小时。培养后，从酵母罐抽出培养液，进行离心分离(8,000rpm、20分钟)并除去菌体，得到培养上清液约18L。对培养液及培养上清液测定α-葡糖基转移酶活性，结果培养液的该酶活性约为2.7单位/ml，培养上清液的该酶活性约为2.6单位/ml。判明：由环状芽孢杆菌PP710生产的本发明的α-葡糖基转移酶的大部分存在于菌体外。 
<实验6：来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的精制> 
在由实验5得到的培养上清液中，在约4L(总活性约10,400单位)中以成为80%饱和的方式添加并溶解，4℃放置24小时，由此进行盐析。通过离心分离(11,000rpm、30分钟)回收沉淀的盐析物，将其溶解于20mM醋酸缓冲液(pH4.5)后，相对同缓冲液进行透析，得到粗酶液约65ml。粗酶液中的α-葡糖基转移酶活性约为74单位/ml(总活性约4,780单位)。将该粗酶液供给到使用东苏株式会社制《CM-トヨパール650S》凝胶的阳离子交换柱色谱法(凝胶容量70ml)。α-葡糖基 转移酶活性吸附于用20mM醋酸缓冲液(pH4.5)平衡化的《CM-トヨパール650S》凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果在食盐浓度约0.4M左右洗脱。回收该活性组分，以终浓度为1M的方式添加硫酸铵，在4℃放置24小时，然后进行离心分离，除去不溶物，供给到使用东苏株式会社制《丁基-トヨパール650M》凝胶的疏水柱色谱法(凝胶容量9ml)。本发明的α-葡糖基转移酶活性吸附于用含有1M硫酸铵的20mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡化的《CM-トヨパール650M》凝胶，以硫酸铵浓度1M～0M的线性梯度使其洗脱，结果在硫酸铵浓度约0.2M左右洗脱。回收该活性组分，将其相对20mM醋酸缓冲液(pH4.5)透析后，供给到使用东苏株式会社制《CM-5PW》凝胶的阴离子交换柱色谱法(凝胶容量3.3ml)。α-葡糖基转移酶活性吸附于用20mM醋酸缓冲液(pH4.5)平衡化的《CM-5PW》凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果食盐浓度在约0.4M左右洗脱。回收该活性组分，将其相对20mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行透析。将各精制的各步骤中的α-葡糖基转移酶活性、α-葡糖基转移酶活性的比活性及收率示于表5。 
[表5] 
Figure BDA0000469697680000361
对精制好的α-葡糖基转移酶样品，利用5～20w/v%浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳检定酶样品的纯度，结果为蛋白键单一、纯度高的样品。 
<实验7：来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的性质> 
<实验7-1：分子量> 
将由实验6得到的来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精 制样品供给到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(5～20w/v%浓度梯度)，同时与泳动的分子量标记(日本バイオ·ラッド·ラボラトリーズ株式会社制)比较并测定分子量，结果判明，本α-葡糖基转移酶的分子量为90,000±10,000道尔顿。 
<实验7-2：酶反应的最适温度及最适pH> 
使用由实验6得到的来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制样品，按照活性测定的方法研究温度、pH给酶活性带来的影响。将这些结果示于图3(最适温度)及图4(最适pH)。判明：本α-葡糖基转移酶的最适温度在pH6.0反应30分钟的条件下，为50～55℃，最适pH在40℃反应30分钟的条件下，为5.0～6.3。 
<实验7-3：酶的温度稳定性及pH稳定性> 
使用由实验6得到的α-葡糖基转移酶精制样品研究本酶的温度稳定性及pH稳定性。温度稳定性通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)保持在各温度60分钟并进行水冷后、测定残留的酶活性来求出。pH稳定性通过将本酶在各pH的20mM醋酸缓冲液中、在4℃保持24小时后、将pH调整为6.0并测定残留的酶活性来求出。将这些结果示于图5(温度稳定性)及图6(pH稳定性)。由图5及图6得知，本α-葡糖基转移酶在40℃之前稳定，另外，在pH3.5～8.4内稳定。 
<实验7-4：金属盐给酶活性带来的影响> 
使用由实验6得到的α-葡糖基转移酶精制样品，在浓度1mM的各金属盐存在下，按照活性测定的方法研究金属盐给酶活性带来的影响。将结果示于表6。 
[表6] 
金属盐 相对活性(%) 金属盐 相对活性(%)
无添加 100 MgCl2 102
CaCl2 101 MnCl2 99
CoCl2 100 NiCl2 102
CuCl2 52 ZnCl2 101
FeCl2 91 PbCl2 97
FeCl3 94 EDTA 99
HgCl2 3    
[0291] 由表6的结果判明：本α-葡糖基转移酶的活性受到Hg2＋离子显著阻碍，受到Cu2＋离子阻碍。 
<实验8：来自球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)的α-葡糖基转移酶的制备> 
取代环状芽孢杆菌PP710，接种球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)，除此之外，与实施例5同样地培养，作为菌种培养。 
在容量30L的发酵罐中加入与菌种培养相同组成的液体培养基约20L，进行加热灭菌、冷却并设定为27℃后，接种菌种培养液约200ml，保持在温度27℃、pH5.5～7.0，同时通气搅拌培养24小时。培养后，从酵母罐抽出培养液，进行离心分离(8,000rpm、20分钟)并除去菌体，得到培养上清液约18L。对培养液及培养上清液测定α-葡糖基转移酶活性，结果培养液的该酶活性约为0.36单位/ml，培养上清液的该酶活性约为0.42单位/ml。判明：由球形节杆菌PP349生产的本发明的α-葡糖基转移酶其大部分存在于菌体外。 
<实验9：来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的精制> 
在由实验8得到的培养上清液约18L(总活性约7,560单位)中，以成为80%饱和的方式添加并溶解，放置24小时，由此进行盐析。通过离心分离(11,000rpm、30分钟)回收沉淀的盐析物，将其溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，相对同缓冲液进行透析，进行离心分离而除去不溶物，得到粗酶液约500ml。粗酶液中的α-葡糖基转移酶活性约为14单位/ml(总活性约7,000单位)。将该粗酶液以终浓度为2M的方式添加硫酸铵，进行离心分离而除去不溶物，供给到用使用含有2M硫酸铵的20mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡化的东苏株式会社制《苯基-トヨパール650M》凝胶的疏水柱色谱法(凝胶容量300ml)。α-葡糖基转移酶活性吸附于凝胶，以硫酸铵浓度2M～0M的线性梯度使其洗脱，结果在硫酸铵浓度约0.6M左右洗脱。回收该活性组分，将其相对20mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行透析后，供给到使用东苏株式会社制《DEAE-ヨパール650S》凝胶的阴离子交换柱色谱法(凝胶容量100ml)。α-葡糖基转移酶活性吸附于用20mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡化的《DEAE-ヨパー ル650S》凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果在食盐浓度约0.4M左右洗脱。将各精制的各步骤中的α-葡糖基转移酶活性、α-葡糖基转移酶活性的比活性及收率示于表7。 
[表7] 
Figure BDA0000469697680000391
对精制好的α-葡糖基转移酶样品，利用5～20w/v%浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳检定酶样品的纯度，结果为蛋白键单一、纯度高的样品。 
<实验10：来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的性质> 
<实验10-1：分子量> 
将由实验9得到的来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶精制样品供给到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(5～20w/v%浓度梯度)中，同时与泳动的分子量标记(日本バイオ·ラッド·ラボラトリーズ株式会社制)比较并测定分子量，结果判明，本α-葡糖基转移酶的分子量为90,000±10,000道尔顿。 
<实验10-2：酶反应的最适温度及最适pH> 
使用由实验9得到的来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶精制样品，按照活性测定的方法研究温度、pH给酶活性带来的影响。将这些结果示于图7(最适温度)及图8(最适pH)。判明：本α-葡糖基转移酶的最适温度在pH6.0反应30分钟的条件下，为约50℃，最适pH在40℃反应30分钟的条件下，为约6.0。 
<实验10-3：酶的温度稳定性及pH稳定性> 
使用由实验9得到的α-葡糖基转移酶精制样品研究本酶的温度稳定性及pH稳定性。温度稳定性通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)保持在各温度60分钟并进行水冷后、测定残留的酶活性来求出。pH稳定性通过将本酶在各pH的20mM醋酸缓冲液中、在4℃保持 24小时后、将pH调整为6.0并测定残留的酶活性来求出。将这些结果示于图9(温度稳定性)及图10(pH稳定性)。由图9及图10得知，本发明的来自球形节杆菌的α-葡糖基转移酶在40℃之前稳定，另外，在pH4.0～8.0的范围内稳定。 
<实验10-4：金属盐给酶活性带来的影响> 
使用由实验9得到的α-葡糖基转移酶精制样品，在浓度1mM的各金属盐存在下，按照活性测定的方法研究金属盐给酶活性带来的影响。将结果示于表8。 
[表8] 
金属盐 相对活性(%) 金属盐 相对活性(%)
无添加 100 MgCl2 104
CaCl2 104 MnCl2 103
CoCl2 98 NiCl2 100
CuCl2 45 ZnCl2 100
FeCl2 91 PbCl2 96
FeCl3 95 EDTA 99
Hg Cl2 2    
由表8的结果判明：本α-葡糖基转移酶的活性受到Hg2＋离子显著阻碍，受到Cu2＋离子阻碍。 
<实验11：对各种糖质的作用> 
使用各种糖质研究本发明的α-葡糖基转移酶的基质特异性。制备含有甲基-α-葡糖基、甲基-β-葡糖基、对硝基苯基-α-葡糖基、对硝基苯基-β-葡糖基、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、曲二糖、黑霉糖、新海藻糖、纤维二糖、乳糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、异麦芽三糖或异潘糖的水溶液。在这些基质溶液中加入最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，每1克基质固体成分分别加入各10单位由实验6得到的来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制样品，以成为1w/v%的方式调制基质浓度，使其在40℃、pH6.0下作用24小时。为了研究酶反应前后的反应液的糖质，使用作为展开溶剂的正丁醇、吡啶、水混合溶液(容量比6:4:1)、另外作为薄层板的メルク公司制造《キーゼルゲル60》(铝 板、10×20cm)，进行展开2次的硅胶薄层色谱法(以下，简称为TLC)，将10%硫酸-甲醇溶液进行喷雾后，进行加热，由此检测糖质。研究TLC中的基质糖质以外的反应生成物的生成的有无，确认对各自的糖质的酶作用的有无或强度的程度。将其结果示于表9。需要说明的是，对来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶，也同样地研究基质特异性，结果与来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶同样。 
[表9] 
基质 作用 基质 作用
甲基-α-葡糖基 - 纤维二糖 -
甲基-β-葡糖基 - 蔗糖 -
PNP*-α-葡糖基 - 乳糖 -
PNP*-β-葡糖基 - 麦芽三糖 ++
葡萄糖 - 麦芽四糖 ++
海藻糖 - 麦芽五糖 ++
新海藻糖 + 麦芽六糖 ++
曲二糖 ± 麦芽七糖 ++
黑霉糖 + 异麦芽三糖 +
麦芽糖 ++ 异潘糖 +
异麦芽糖 +    
注)表中，－表示“没有作用”，±表示“稍微作用”，＋表示“作用”，＋＋表示“充分作用”。 
*：对硝基苯基 
由表9的结果得知，本发明的α-葡糖基转移酶在试验过的糖质中与麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖充分作用，另外，与黑霉糖、异麦芽糖、新海藻糖、异麦芽三糖、异潘糖作用。而且，与曲二糖也稍微作用。从作用的糖质来看，均为发现分解生成物的同时，也发现糖转移生成物。另一方面，没有发现本发明的α-葡糖基转移酶与甲基-α-葡糖基、甲基-β-葡糖基、对硝基苯基-α-葡糖基、对硝基苯基-β-葡糖基、新海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖等作用。由这些结果及本α-葡糖基转移酶与淀粉部分分解物作用而生成支链α-葡聚糖判明：本酶与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖或由葡萄糖构成的α-葡萄寡糖广泛地作用。 
<实验12：作用机理> 
为了研究本发明的α-葡糖基转移酶的作用机理，研究与作为最小的基质的麦芽糖作用时的生成糖的结构，需要说明的是，使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的情况和使用来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的情况的结果相同。在本实验中，表示使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制样品的结果。 
<实验12-1：来自麦芽糖的生成物> 
在最终浓度1w/v%的麦芽糖水溶液中加入最终浓度10mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，每1克基质固体成分加入10单位用实验6的方法得到的α-葡糖基转移酶精制样品，在40℃、pH6.0下作用，经时进行取样，在100℃下保持10分钟并停止反应。使用HPLC及GC测定其酶反应液的糖组成。HPLC及GC使用实验4-2中记载的条件进行，将结果示于表10。 
[表10] 
Figure BDA0000469697680000421
DP：葡萄糖聚合度 
由表10的结果得知，在反应初期(反应1时间)中，利用本发明的α-葡糖基转移酶的作用，由基质麦芽糖主要生成葡萄糖、麦芽糖及潘糖。进而，从反应2小时及4小时生成葡萄糖聚合度为4及5的寡糖。反应进行时，麦芽三糖在反应2小时(14.4%)后减少到峰值，潘糖在反应4小时(29.3%)后减少到峰值，在其减少的同时，发现异麦芽糖增加。而且，反应至48小时时，发现异麦芽糖及聚合度为4以上的寡糖的增 加。 
由这些结果推测时得知，本发明的α-葡糖基转移酶与麦芽糖作用，在反应初期催化α-1,4葡糖基转移和α-1,6葡糖基转移的两葡糖基转移，由此生成葡萄糖、麦芽三糖及潘糖，伴随着反应的进行，在葡萄糖中生成α-1,6葡糖基转移的异麦芽糖或在该异麦芽糖中生成α-1,4葡糖基转移及α-1,6葡糖基转移的异潘糖及异麦芽三糖。在本实验中，难以鉴定多种存在的聚合度为4以上的寡糖，因此，在实验12-2中，以聚合度比麦芽糖高的麦芽五糖为基质，进一步分析反应机理。 
<实验12-2：来自麦芽糖的生成物> 
在最终浓度1w/v%的麦芽五糖水溶液中加入最终浓度10mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，每1克基质固体成分加入10单位用实验6的方法得到的α-葡糖基转移酶精制样品，在40℃、pH6.0下作用，经时进行取样，在100℃下保持10分钟并停止反应。使用HPLC测定其酶反应液的糖组成。HPLC使用实验4-2中记载的条件进行。另外，对酶反应液按照常规方法进行甲基化分析，用气相色谱法研究部分甲基化物。由生成的部分甲基化物的组成求出葡萄糖的键合方式中的各葡糖基键的存在比。另外，与实验4-2同样地也进行异麦芽糖糊精酶消化试验。将反应中的糖组成的变化示于表11，将反应生成物的甲基化分析和异麦芽糖糊精酶试验的结果示于表12。 
[表11] 
Figure BDA0000469697680000431
DP：葡萄糖聚合度 
[表12] 
Figure BDA0000469697680000441
*：异麦芽糖糊精酶消化后 
由表11及12的结果得知，在反应初期(反应1小时)，由基质麦芽五糖优先生成葡萄糖聚合度比基质小1的寡糖和葡萄糖聚合度比基质大1的寡糖，因此确认，该酶催化葡糖基转移。进一步进行反应时，生成具有各种葡萄糖聚合度的反应生成物，在反应24小时后，葡萄糖聚合度为9以上的葡聚糖也达到21.1%。由甲基化分析的结果判明，随着反应进行，在反应生成物中1,4键合的葡萄糖残基减少，同时，1,6键合的葡萄糖残基显著增加，另外，1,3键合的葡萄糖残基、1,4,6键合的葡萄糖残基及1,3,6键合的葡萄糖残基缓慢增加。另外，异麦芽糖糊精酶消化后的糖组成中的异麦芽糖含量也与反应的进行同时显著增加。需要说明的是，使用来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶同样地进行试验的情况也可得到大致同样的结果。 
由实验12-1及12-2的结果来看，认为本发明的α-葡糖基转移酶的反应机理如下。 
(1)本酶与作为基质的麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖作用，将非还原末端葡萄糖残基主要α-1,4或α-1,6葡糖基转移到其它的α-1,4葡聚糖的非还原末端葡萄糖残基上，由此生成非还原末端葡萄糖残基的4位或6位羟基上α-键合有葡萄糖的α -1,4葡聚糖(葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖)和葡萄糖聚合度减少1的α-1,4葡聚糖。 
(2)本酶进一步与(1)中产生的葡萄糖聚合度减少1的α-1,4葡聚糖作用，相对(1)中产生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖，与(1)同样地进行分子间α-1,4或α-1,6葡糖基转移，由此，在(1)中产生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖的非还原末端葡萄糖残基的4或6位羟基上进一步转移葡萄糖，使链长延长。 
(3)通过重复上述(1)及(2)的反应，由麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖生成具有α-1,4及α-1,6键的葡聚糖。 
(4)虽然频率低，但是，本酶通过进一步催化α-1,3葡糖基转移或相对位于葡聚糖的内部的α-1,6键合的葡萄糖残基的α-1,4或α-1,3葡糖基转移，生成也具有α-1,3键、α-1,4,6键及α-1,3,6键的葡聚糖。 
(5)作为重复上述(1)～(4)的反应的结果，葡萄糖主要以α-1,4键及α-1,6键键合，生成具有少量α-1,3键、α-1,4,6键及α-1,3,6键的支链α-葡聚糖。 
<实验13：α-葡糖基转移反应和反应液的还原力的变化> 
在麦芽糖水溶液(最终浓度1或30w/v%)中加入最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，每1克基质固体成分加入4单位用实验6的方法得到的来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制样品，在40℃、pH6.0下作用，经时进行取样，在100℃下保持10分钟并停止反应。用实验4-2记载的HPLC法及GC法进行定量。另外，用somogyi-nelson method定量酶反应液的还原糖量，用蒽酮法定量总糖量，用下式：还原力＝(还原糖量/总糖量)×100算出还原力。将其结果示于表13。 
[表13] 
Figure BDA0000469697680000461
由表13的结果得知，使本发明的α-葡糖基转移酶与麦芽糖作用，结果在麦芽糖浓度为1w/v%比较低的情况下，发现极少的还原力的增加，另外，麦芽糖浓度为30w/v%比较高的情况下，几乎没有发现反应液的还原力的增加。麦芽糖浓度为较低，为1w/v%、且麦芽糖的残留量在10%以下的情况下，反应液的还原力的增加极少，是指本发明的α-葡糖基转移酶为基本上催化转移反应的酶，在反应时几乎不进行水解。得知，本发明的α-葡糖基转移酶为有效地进行α-葡糖基转移的酶。需要说明的是，使用来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶同样地进行试验时，也可得到大致同样的结果。 
<实验14：支链α-葡聚糖的生成中的精制α-葡糖基转移酶和粗酶液的比较> 
考虑支链α-葡聚糖的工业生产时，只要可以使用α-葡糖基转移酶的粗酶，就会节省精制酶的麻烦和劳力，更优选。因此，使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶研究是否可得到与由实验1-2制成的葡聚糖A同等的支链α-葡聚糖。用实验1-1中记载的方法培养PP710，将上清液进行硫酸铵盐析，将相对20mM醋酸缓冲液(pH4.5)进行透析而得到的透析液作为α-葡糖基转移酶的粗酶液。用 实验1-2中记载的方法使该粗酶液与淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)作用，从用作基质的淀粉部分分解物以每固体成分88.2%的收率得到固体成分浓度30%的葡聚糖溶液。将得到的支链α-葡聚糖命名为“葡聚糖C”，将进行其甲基化分析的结果示于表14，另外，将利用实验4及实验3中记载的方法测定分子量分布及水溶性食物纤维含量的结果分别示于表15。需要说明的是，为了进行比较，表14及表15分别表示使用表3及表4制备的原料的淀粉部分分解物和部分精制α-葡糖基转移酶制成的葡聚糖A的数据。 
[表14] 
Figure BDA0000469697680000471
*パインデックス＃100 
葡聚糖A：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶(部分精制酶)制成的葡聚糖 
葡聚糖C：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶(粗酶)制成的葡聚糖 
[表15] 
*パインデックス＃100 
葡聚糖A：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶(部分精制酶)制成的葡聚糖 
葡聚糖C：由来自PP710株的α-葡糖基转移酶(粗酶)制成的葡聚糖 
如表14所示，使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶制成的葡聚糖C在甲基化分析中，相当于非还原末端葡萄糖残基的2,3,4,6-四甲基化物和相当于α-1,6键合的葡萄糖残基的2,3,4-三甲基化物的含量与葡聚糖A相比，意外地增加。该结果表明，葡聚糖C与葡聚糖A相比，非还原末端多，另外，存在更多的α-1,6键。而且，在葡聚糖C中，2,4-二甲基化物为4.8%时，与葡聚糖A的0.8相比增加了。该结果显示，参与1,3键合和1,6键合双方的葡萄糖残基增加。 
另外，由表15得知，葡聚糖C与葡聚糖A相比，数均分子量及重均分子量都小(葡萄糖聚合度小)，显示远远高的水溶性食物纤维含量。该结果表明，在来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶中预先混杂与α-葡糖基转移酶不同的其它酶，该混杂酶有助于支链α-葡聚糖中的α-1,6键的增加、参与1,3键合和1,6键合双方的葡萄糖残基增加、低分子化及水溶性食物纤维含量的增加。 
<实验15：混杂于来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶的酶的鉴定和分离、精制> 
与来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶混杂，鉴定与支链α-葡聚糖中的α-1,6键的增加、参与1,3键合和1,6键合双方的葡萄糖残基增加、低分子化及水溶性食物纤维含量的增加有关的酶，进行分离、精制的实验。 
<实验15-1：混杂的酶的鉴定和活性测定> 
用与实验1-1同样的方法培养环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)，将得到的上清液约3L进行硫酸铵盐析后，将相对含有1mM氯化钙的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)进行透析而得到的透析液约40ml 作为粗酶液。使该粗酶液与2w/v%可溶性淀粉溶液或2w/v%淀粉溶液在pH6.0、40℃下作用16小时，在100℃加热10分钟使反应停止，然后，供给到使用纵10cm、横20cm的硅胶60F254(メルク公司制造)TLC板的TLC。使用作为展开溶剂的正丁醇:吡啶:水(容量比6:4:1)进行2次展开，喷雾20%硫酸-甲醇溶液后，在100℃下加热5分钟，检测生成物的斑点。其结果发现，由可溶性淀粉生成麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的麦芽糖寡糖，另外，由普鲁兰多糖生成很少的麦芽糖和潘糖。判明：在来自环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)的α-葡糖基转移酶的粗酶中混杂分解淀粉、而且也分解普鲁兰多糖的淀粉酶。 
混杂的淀粉酶的活性如下测定。即，以最终浓度为1w/v%的方式使短链直链淀粉(商品名“直链淀粉EX-I”、株式会社林原生物化学研究所出售、平均聚合度17)溶解于含有1mM氯化钙的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)并作为基质液，在该基质液2ml中加入酶液0.2ml，在35℃下进行酶反应30分钟，将该反应液0.2ml与8ml的0.02N硫酸溶液混合并使反应停止后，添加0.2ml的0.1N碘溶液，在25℃下保持15分钟后，测定660nm的吸光度。对另外反应0小时的反应液同样地进行测定，测定每反应时间的碘呈色度的减少。淀粉酶的活性1单位定义为：在上述条件下使20mg的短链直链淀粉的660nm处的吸光度(碘呈色)降低10%的酶量的10倍量。 
<实验15-2：混杂淀粉酶的分离、精制> 
将由实验15-1制成的粗酶液供给到使用东苏株式会社制《DEAE-トヨパール650S》凝胶的阳离子交换柱色谱法(凝胶容量70ml)。具有淀粉酶活性的组分不吸附于用1mM的氯化钙20mM三-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化了的《DEAE-トヨパール650S》凝胶，在非吸附组分洗脱。回收该组分，以终浓度为1.5M的方式添加硫酸铵，在4℃放置24小时后，进行离心分离而除去不溶物，供给到使用ファルマシアバイオテク制《リソースPHE》凝胶的疏水柱色谱法(凝胶容量1ml)。具有目的的淀粉酶活性的组分吸附于用含有1.5M硫酸铵、1mM氯化钙的20mM三-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化了的《リソースPHE》凝胶，以 硫酸铵浓度1.5M～0M的线性梯度洗脱，结果在硫酸铵浓度约0.3M左右洗脱。回收、浓缩该活性组分后，供给到使用ファルマシアバイオテク制《スーパーデックス200pg》凝胶的凝胶过滤柱色谱法(凝胶容量118ml)，在含有0.2M食盐、1mM氯化钙的20mM三-盐酸缓冲液(pH7.5)中洗脱。回收活性组分，供给到使用ファルマシアバイオテク制《リソースQ》凝胶的阴离子交换柱色谱法(凝胶容量1ml)。具有淀粉酶活性的组分不吸附于用1mM的氯化钙20mM三-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化了的《リソースQ》凝胶，在非吸附组分洗脱。将得到的活性组分作为淀粉酶精制样品。将各精制的各步骤中的淀粉酶活性、淀粉酶的比活性及收率示于表16。 
[表16] 
Figure BDA0000469697680000501
对精制好的淀粉酶样品，利用5～20w/v%浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳检定酶样品的纯度，结果为蛋白键单一、纯度高的样品。 
<实验16：来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的性质> 
<实验16-1：分子量> 
将由实验15-2得到的淀粉酶精制样品供给到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(5～20w/v%浓度梯度)，同时与泳动的分子量标记(日本バイオ·ラッド·ラボラトリーズ株式会社制)比较并测定分子量，结果判明，该淀粉酶的分子量为58,000±10,000道尔顿。 
<实验16-2：淀粉酶反应的最适温度及最适pH> 
使用由实验15-2得到的来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶精制样品，按照活性测定的方法研究温度、pH给淀粉酶活性带来的影响。将这些结果示于图11(最适温度)及图12(最适pH)。判明：该淀粉酶的最适温度在pH6.0反应30分钟的条件下，为55℃，最适pH在35℃反 应30分钟的条件下，为6.0～7.0。 
<实验16-3：淀粉酶的温度稳定性及pH稳定性> 
使用由实验15-2得到的淀粉酶精制样品研究温度稳定性及pH稳定性。温度稳定性通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0或含有1mM氯化钙的同缓冲液)保持在各温度60分钟并进行水冷后、测定残留的酶活性来求出。pH稳定性通过将本酶在各pH的20mM醋酸缓冲液中、在4℃保持24小时后、将pH调整为6.0并测定残留的酶活性来求出。将这些结果示于图13(温度稳定性)及图14(pH稳定性)。由图13及图14得知，该淀粉酶在钙离子的非存在下、在40℃之前稳定，另外，在1mM钙离子的存在下、在50℃之前稳定。另外，该淀粉酶在pH6.0～8.0的范围内稳定。 
<实验16-5：淀粉酶的基质特异性> 
使用由实验15-2得到的淀粉酶精制样品研究对该淀粉酶的各种基质的作用，结果判明，该淀粉酶在水解淀粉、麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖的同时，也催化葡糖基转移。另外也判明，该淀粉酶具有由淀粉生成环糊精、水解普鲁兰多糖并生成潘糖的作用。 
<实验17：并用α-葡糖基转移酶和淀粉酶的支链α-葡聚糖的制备> 
使用用实验6的方法得到的来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶精制样品和由实验15-2得到的淀粉酶精制样品，研究是否可以再现使用实验14中记载的来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶的葡聚糖C的制备。即，以浓度为30w/v%的方式使淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)溶解于水，将其调整为pH6.0，每1克固体成分加入10单位用实验6的方法得到的来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶精制样品，每1克固体成分进一步加入0、0.1、0.2、0.5或1.0单位由实验15-2得到的淀粉酶精制样品，在40℃、pH6.0下作用72小时，然后，将该反应液煮沸10分钟，使反应停止。将根据各反应条件分别得到的支链α-葡聚糖供给到实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法，将得到的色谱图与用作基质的淀粉部分分解物的色谱图一同示于图15。在图15中，符号a为作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC色谱图，符号b、c、d及e分别为将α-葡糖基转移酶全 部设定为10单位、使0.1单位、0.2单位、0.5单位及1.0单位淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图(仅使10单位α-葡糖基转移酶作用的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图与图1所示的葡聚糖A的色谱图大致同样，在图5中省略。对后述的图16～19也同样)。将基于由这些凝胶过滤HPLC得到的色谱图的各支链α-葡聚糖的分子量分布分析的结果和用实验3记载的酶-HPLC法得到的水溶性食物纤维含量一同示于表17。另外，将对用作基质的淀粉部分分解物研究的分子量分布分析和水溶性食物纤维含量的结果(α-葡糖基转移酶0单位、淀粉酶0单位)同时记载于表6。 
[表17] 
由表17的结果得知，与α-葡糖基转移酶并用淀粉酶时，得到的支链α-葡聚糖的分子量降低，水溶性食物纤维含量迅速增加。另外判明，随着淀粉酶的作用量增多，得到的支链α-葡聚糖的数均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度变窄。淀粉酶的作用量为每1克固体成分0.5单位时，Mw/Mn降低至2.1。而且，得到的支链α-葡聚糖中的水溶性食物纤维的含量在淀粉酶的作用量为每1克固体成分0.5单位以上达到约76质量%。 
由该结果确认，在实验14中，在使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的粗酶而得到的葡聚糖C中，分子量小、食物纤维升高是由混杂于粗酶中的淀粉酶引起的。推测为，混杂的淀粉酶部分地水 解作为基质的淀粉部分分解物及作为α-葡糖基转移酶的产物的支链α-葡聚糖，由此，使支链α-葡聚糖的分子量降低，另外，通过将葡糖基进一步转移到支链α-葡聚糖，结果，以提高食物纤维含量的方式作用。而且，该结果显示，通过使淀粉酶与α-葡糖基转移酶组合，可以制造分子量小、提高了水溶性食物纤维含量的支链α-葡聚糖。 
<实验18：并用α-葡糖基转移酶和其它公知的淀粉酶的支链α-葡聚糖的制备> 
并用本发明的α-葡糖基转移酶和其它公知的淀粉酶，使其与淀粉部分分解物作用而制备支链α-葡聚糖，研究其结构的特征及水溶性食物纤维含量。需要说明的是，使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶的情况和使用来自球形节杆菌PP349的α-葡糖基转移酶的情况的结果相同，因此，在本实验中，表示使用来自环状芽孢杆菌PP710的α-葡糖基转移酶精制样品的结果。 
<实验18-1：并用α-葡糖基转移酶和异淀粉酶的支链α-葡聚糖的制备和得到的支链α-葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纤维含量> 
变更来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶，每1克固体成分加入0、50、200、500或1,000单位来自淀粉皮假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)的异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制)，除此之外，与实验17同样地反应。将根据各反应条件分别得到的支链α-葡聚糖供给到实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法，将得到的色谱图与用作基质的淀粉部分分解物的色谱图一同示于图16。在图16中，符号a为作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC色谱图，符号b、c、d及e分别为将α-葡糖基转移酶全部设定为10单位、使50单位、200单位、500单位及1,000单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图。另外，将基于由这些凝胶过滤HPLC得到的色谱图的各支链α-葡聚糖的分子量分布分析的结果和用实验3记载的酶-HPLC法得到的水溶性食物纤维含量一同示于表18。 
[表18] 
由表18的仅使α-葡糖基转移酶与淀粉部分分解物作用时的结果得知，虽然仅α-葡糖基转移酶给分子量分布带来很大影响，但是，由表18及图16的结果判明：随着异淀粉酶的作用量增多，得到的支链α-葡聚糖的数均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度变窄。异淀粉酶的作用量为每1克固体成分1000单位时，Mw/Mn降低至1.9，支链α-葡聚糖显示在葡萄糖聚合度20.6处具有峰值的分子量分布。另一方面，根据各反应条件得到的支链α-葡聚糖中的水溶性食物纤维的含量不怎么受异淀粉酶的作用量的影响，为40～44质量%左右。 
由该结果判明，通过在本发明的α-葡糖基转移酶进一步并用异淀粉酶并使其与淀粉部分分解物作用，可以制造几乎不使水溶性食物纤维含量变化的分子量降低了的支链α-葡聚糖。 
<实验18-2：与α-葡糖基转移酶并用α-淀粉酶的支链α-葡聚糖的制备和得到的支链α-葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纤维含量> 
取代来自淀粉皮假单胞菌的异淀粉酶，每1克固体成分加入0、0.1、0.2、0.5或1.0单位的市售的α-淀粉酶(商品名“ネオスピターゼPK2”ナガセ生物化学工业株式会社制)，除此之外，与实验18-1同样地反应。将根据各反应条件分别得到的支链α-葡聚糖供给到实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法，将得到的色谱图与用作基质的淀粉部分分解物的色谱图一同示于图17。在图17中，符号a为作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC色谱图，符号b、c、d及e分别为将α-葡糖基转移酶全部设定为10单位、使0.1单位、0.2单位、0.5单位及1.0单位α-淀 粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图。另外，将基于由这些凝胶过滤HPLC得到的色谱图的各支链α-葡聚糖的分子量分布分析的结果和用实验3记载的酶-HPLC法得到的水溶性食物纤维含量一同示于表19。 
[表19] 
Figure BDA0000469697680000551
由图17及表19的结果判明：随着α-淀粉酶的作用量增多，得到的支链α-葡聚糖的数均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度变窄。α-淀粉酶的作用量为每1克固体成分1.0单位(图17的符号e)时，Mw/Mn降低至2.4，支链α-葡聚糖显示在葡萄糖聚合度11.8处具有峰值的分子量分布。另一方面，发现，有α-淀粉酶的作用量越多，根据各反应条件得到的支链α-葡聚糖中的水溶性食物纤维的含量越增加的倾向。 
由该结果判明，通过在本发明的α-葡糖基转移酶中进一步并用α-淀粉酶并使其与淀粉部分分解物作用，可以制造水溶性食物纤维含量增加、分子量降低了的支链α-葡聚糖。 
<实验18-3：并用α-葡糖基转移酶和CGTase的支链α-葡聚糖的制备和得到的支链α-葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纤维含量> 
取代来自淀粉皮假单胞菌的异淀粉酶，每1克固体成分加入0、0.1、0.2、0.5或1.0单位的来自环状芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)的CGTase(株式会社林原生物化学研究所制)，除此之外，与实验18同样地反应。将根据各反应条件分别得到的支链α-葡聚糖供给到实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法，将得到的色谱图与用作基质的淀粉部分分解 物的色谱图一同示于图18。在图18中，符号a为作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC色谱图，符号b、c、d及e分别为将α-葡糖基转移酶全部设定为10单位、使0.1单位、0.2单位、0.5单位及1.0单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图。另外，将基于由这些凝胶过滤HPLC得到的色谱图的各支链α-葡聚糖的分子量分布分析的结果和用实验3记载的酶-HPLC法得到的水溶性食物纤维含量一同示于表20。 
[表20] 
Figure BDA0000469697680000561
CGTase：环糊精糖基转移酶 
由图18及表20的结果判明：随着CGTase的作用量增多，数均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度变窄。CGTase的作用量为每1克固体成分1.0单位(图18的符号e)时，Mw/Mn降低至3.2，支链α-葡聚糖显示在葡萄糖聚合度79.1处具有峰值的分子量分布。另一方面，发现，CGTase的作用量越多，支链α-葡聚糖中的水溶性食物纤维的含量增加得越多的倾向，与并用实验18-2的α-淀粉酶的情况相比显著增加，每1克固体成分使用1.0单位CGTase时，水溶性食物纤维含量达到70.5质量%。 
由该结果判明，通过与本发明的α-葡糖基转移酶并用CGTase并与淀粉部分分解物作用，可以制备分子量降低、水溶性食物纤维含量显著增加的支链α-葡聚糖。CGTase与α-1,4键的水解作用同时也具有转移作用，因此，与α-淀粉酶相比，不使分子量非常降低并生成非还原末 端葡萄糖残基，因此推测，α-葡糖基转移酶作用的频率升高，与α-淀粉酶添加相比，可得到水溶性食物纤维含量增加的支链α-葡聚糖。 
<实验18-4：并用α-葡糖基转移酶和异淀粉酶及CGTase的支链α-葡聚糖的制备和得到的支链α-葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纤维含量> 
在记载于实验18-1的实验中，每1克固体成分进一步加入0或1.0单位来自嗜热脂肪芽孢杆菌的CGTase，除此之外，与实验18-1同样地反应。将根据各反应条件分别得到的支链α-葡聚糖供给到实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法，将得到的色谱图与用作基质的淀粉部分分解物的色谱图一同示于图19。在图19中，符号a为作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC色谱图，符号b、c、d及e为将全部α-葡糖基转移酶和CGTase分别设定为10单位及1单位、使50单位、200单位、500单位及1,000单位异淀粉酶作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC色谱图。另外，将基于由这些凝胶过滤HPLC得到的色谱图的各支链α-葡聚糖的分子量分布分析的结果和用实验3记载的酶-HPLC法得到的水溶性食物纤维含量一同示于表21。 
[表21] 
Figure BDA0000469697680000571
CGTase：环糊精糖基转移酶 
由图19及表21的结果得知，并用本发明的α-葡糖基转移酶和每1克固体成分1单位的CGTase制成的支链α-葡聚糖的重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)降低至3.2，而且，在并用每1克固体成分1000单位的异淀粉酶时(图19的符号e)，降低至1.9。组合α- 葡糖基转移酶和CGTase而制成的支链α-葡聚糖的水溶性食物纤维含量增加至70质量%，而且，并用异淀粉酶时也不降低，维持高的含量。 
由该结果判明，通过并用本发明的α-葡糖基转移酶和异淀粉酶及CGTase并使其与淀粉部分分解物作用，可以制备分子量显著降低、同时水溶性食物纤维含量显著增加的支链α-葡聚糖。 
<实验19：支链α-葡聚糖的功能性> 
作为水溶性食物纤维含量最高、分子量比较小的支链α-葡聚糖，选择在实验18-4中组合每1克固体成分10单位的α-葡糖基转移酶、50单位的异淀粉酶及1单位CGTase而制成的支链α-葡聚糖，研究该支链α-葡聚糖的消化性及结构的特征及功能性。 
<实验19-1：并用α-葡糖基转移酶和异淀粉酶及CGTase的支链α-葡聚糖的精制> 
使用每1克固体成分10单位的α-葡糖基转移酶、50单位的异淀粉酶，及1单位的CGTase，与实验18-4同样地反应，将得到的支链α-葡聚糖的反应液过滤并除去不溶物后，使用三菱化学离子交换树脂《ダイヤイオンSK-1B》和《ダイヤイオンWA30》及オルガノ制阴离子交换树脂《IRA411》进行脱色、脱盐并精密过滤，然后，用蒸发器浓缩，从使用的淀粉以每固体成分85.8%的收率得到固体成分浓度为30质量%的支链α-葡聚糖含有液。将用实验4-1记载的方法进行得到的支链α-葡聚糖的甲基化分析的结果示于表22。另外，用实验4-4记载的凝胶过滤HPLC法进行的分子量分布分析、用实验3记载的酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量、用实验4-2记载的异麦芽糖糊精酶消化试验的结果汇总于表23。 
[表22] 
部分甲基化物的种类 对应的葡萄糖残基 存在比(面积%)
2,3,4,6-四甲基化物 非还原末端葡萄糖残基 13.7
3,4,6-三甲基化物 1,2键合的葡萄糖残基 0
2,4,6-三甲基化物 1,3键合的葡萄糖残基 1.6
2,3,6-三甲基化物 1,4键合的葡萄糖残基 22.8
2,3,4-三甲基化物 1,6键合的葡萄糖残基 54.7
2,4-二甲基化物 1,3,6键合的葡萄糖残基 2.4
2,3-二甲基化物 1,4,6键合的葡萄糖残基 4.8
[0421] [表23] 
由表22及23的结果得知，得到的支链α-葡聚糖在甲基化分析中，以1:2.4的比例含有作为部分甲基化物的2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的77.5%。支链α-葡聚糖中，2,4,6-三甲基化物和2,4-二甲基化物分别显示为部分甲基化物的1.6%和2.4%。另外，本支链α-葡聚糖为显示重均分子量5,480道尔顿、Mw/Mn2.3、利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量为68.6质量%、通过异麦芽糖糊精酶消化、每糖组成生成异麦芽糖36.4质量%的葡聚糖。 
为了评价本发明的支链α-葡聚糖的有用性，使用由实验19-1制成的支链α-葡聚糖，在实验19-2～19-7中研究给致龋性、消化性、血糖值和胰岛素量带来的影响及急性毒性。 
<实验19-2：利用支链α-葡聚糖的致龋菌的酸发酵性试验> 
使用用实验19-1的方法得到的支链α-葡聚糖，按照《感染与免疫》(Infection and Immunity)第39卷、43～49页(1983年)记载的大岛等方法，进行使用致龋菌的酸发酵性试验。作为致龋菌，使用远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)6715株及变形链球菌(Streptococcus mutans)OMZ-176株的2株。作为对照，使用蔗糖同样地操作。将结果示于表24。 
[表24] 
Figure BDA0000469697680000592
由表24的结果得知，进行酸发酵的蔗糖的情况降低至pH约4，与此相对，本发明的支链α-葡聚糖几乎不进行由远缘链球菌及变形链球菌引起的酸发酵，pH维持约6，为牙齿的珐琅质脱灰的临界pH即高于5.5的pH。确认本发明的支链α-葡聚糖的致龋性非常低。 
<实验19-3：支链α-葡聚糖的消化性试验> 
使用用实验19-1的方法得到的支链α-葡聚糖，按照日本营养粮食学会志、第43卷、第23～29页(1990年)记载的冈田等方法，在试管内研究利用唾液淀粉酶、人工胃液、胰液淀粉酶及小肠粘膜酶的本发明的支链α-葡聚糖的消化性。作为对照，使用市售的难消化性糊精(商品名《パインファイバー》、松谷化学工业株式会社制造)。将结果示于表25。 
[表25] 
Figure BDA0000469697680000601
由表25的结果得知，本发明的支链α-葡聚糖利用唾液淀粉酶、人工胃液时完全不能消化，利用胰液淀粉酶时极少被分解。另外，利用对照的难消化性糊精的小肠粘膜酶的分解率为41.1%，与此相对，支链α-葡聚糖的分解率低至16.4%，判明本发明的支链α-葡聚糖比市售的难消化性糊精更难消化。 
<实验19-4：支链α-葡聚糖的摄取对血糖值及胰岛素量产生的影响> 
使用用实验19-1的方法得到的支链α-葡聚糖研究血糖值的上升及胰岛素的上升。使用7周龄的Wistar系雄大鼠各组5只，禁食1天后，用胃探针经口给药支链α-葡聚糖溶液。给药量每大鼠体重1kg设定为固体成分为1.5g。在经口给药之前、经口给药15分钟后、30分钟后、60分钟后、120分钟后，从尾静脉采集血液。将各自的血液采取到肝素 处理剂采血管，进行离心分离(2,000rpm、10分钟)，得到血浆。血糖值用葡萄糖氧化酶法进行测定，胰岛素量使用大鼠胰岛素测定试剂盒(株式会社森永生科学研究所制造)进行测定。作为对照1，使用葡萄糖，作为对照2，使用市售的难消化性糊精(商品名《パインファイバー》、松谷化学工业株式会社制造)。将结果示于表26及表27。 
[表26] 
[表27] 
Figure BDA0000469697680000612
由表26及表27到结果判明：本发明的支链α-葡聚糖与市售的难消化性糊精同样，血糖值的上升及胰岛素量的上升比葡萄糖低。 
<实验19-5：急性毒性试验> 
使用小鼠，经口给药用实验19-1的方法得到的支链α-葡聚糖，进行急性毒性试验。其结果，本发明的支链α-葡聚糖为无毒性，在可以给药的最大量中没有出现死亡例，其LD50值为5g/kg—小鼠体重以上。 
<实验20：支链α-葡聚糖的血糖上升抑制作用> 
在实验19-4中，判明：通过支链α-葡聚糖的摄取，血糖值及胰岛素量的上升比葡萄糖低，因此，使用用后述的实施例5的方法得到的支链α-葡聚糖，进一步详细地研究支链α-葡聚糖的摄取对血糖上升产生的影响。 
<实验20-1：支链α-葡聚糖的摄取对淀粉部分分解物摄取时的血糖值及胰岛素量产生的影响> 
研究本发明的支链α-葡聚糖对淀粉部分分解物(商品名《パイン》、松谷化学工业株式会社制造)摄取后的血糖上升产生的影响。用大鼠饲养用饲料(株式会社林原生物化学研究所制备、“AIN-93G”；参照营养学杂志(Journal of Nutrition)、第123卷、第1939-1951(页)（1993）、以下称为“精制饲料”。参照后述的表33所示的配合组成)，使用预先饲养了1周的7周龄的Wistar系雄性大鼠(日本チャールスリバー株式会社出售)3组各组5只，禁食1天后，用胃探针经口给药溶解有淀粉部分分解物(作为固体成分为1.5g/kg·体重)和支链α-葡聚糖的水溶液。支链α-葡聚糖的给药量设定为每大鼠体重1kg为固体成分0.15g、0.30g或0.75g。在经口给药之前、经口给药15分钟后、30分钟后、60分钟后、120分钟后、180分钟后、240分钟后，从尾静脉采集大鼠的血液。将各自的血液采取到肝素处理剂采血管，进行离心分离(2,000rpm、10分钟)，得到血浆。用与实验19-4同样的方法测定血糖值和胰岛素量。作为对照1，对1组5只大鼠仅经口给药固体成分为1.5g/kg·体重的淀粉部分分解物。另外，作为对照2，取代葡萄糖，将市售的难消化性糊精(商品名《フイバ一ソノレ2》、松谷化学工业株式会社制造)与淀粉部分分解物同时，对2组各组5只的大鼠每体重1kg经口给药固体成分为0.15g或0.75g的任一个。将各自的试验体系中的血糖值的变化、血糖值的AUC值(血中浓度-时间曲线下面积)、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的测定结果分别示于表28、表29、表30及表31。 
[表28] 
*：相对难消化性糊精(0.75g/kg·体重)为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
[表29] 
Figure BDA0000469697680000632
*：相对难消化性糊精(0.75g/kg·体重)为显著性差异(p<0.01) 
[表30] 
Figure BDA0000469697680000641
*：相对难消化性糊精(0.75g/kg·体重)为显著性差异(p<0.05) 
[表31] 
Figure BDA0000469697680000642
－：由于胰岛素浓度比给药之前低，因此，不计算AUC。 
由表28～31的结果判明：与单独摄取淀粉部分分解物的情况(对照1)相比，本发明的支链α-葡聚糖与市售的难消化性糊精(对照2)同样，用量依赖性地抑制糖质(淀粉部分分解物)负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升。另外，将这些上升抑制效果的程度进行比较时，在测定的任一种指标中都显示本发明的支链α-葡聚糖一方比市售的难消化性糊精具有强的抑制效果。 
<实验20-2：支链α-葡聚糖的分子量对淀粉部分分解物摄取时的血糖值及胰岛素量的影响> 
在实验20-1中，判明：本发明的支链α-葡聚糖都抑制糖质(淀粉 部分分解物)负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升，因此，研究该支链α-葡聚糖的分子量的差异给糖质负荷时的血糖值及胰岛素量的上升抑制作用带来的影响。即，调整α-葡糖基转移酶、淀粉酶的使用量，制备表32所示的重均分子量的支链α-葡聚糖。与实验20-1同样，使用用精制饲料预先饲养了1周的7周龄的Wistar系雄性大鼠(日本チャールスリバー株式会社出售)9组各组5只，禁食1天后，对8组各组5只的大鼠用胃探针经口给药溶解有淀粉部分分解物(作为固体成分为1.5g/kg·体重)或表32所示的支链α-葡聚糖的任一种的水溶液。支链α-葡聚糖的给药量设定为每大鼠体重1kg为固体成分0.75g。对剩余的1组5只大鼠仅经口给药淀粉部分分解物每大鼠体重1kg为固体成分1.5g，设定为对照组。在经口给药之前及给药30分钟后从尾静脉采集这些大鼠的血液。将各自的血液采取到肝素处理剂采血管，进行离心分离(2,000rpm、10分钟)，得到血浆。将各组中的血糖值及胰岛素量的测定结果一同示于表32。需要说明的是，在仅给药淀粉部分分解物时，给药后的采血时间设定为血糖值及血中胰岛素量为峰值的给药30分钟后。 
[表32] 
Figure BDA0000469697680000651
由表32的结果得知，重均分子量在1,168～200,000的范围的本发明的支链α-葡聚糖均可以抑制经口给药淀粉部分分解物后的血糖值及 胰岛素量的上升。另外，用该血糖值及胰岛素量的上升抑制效果的强度的程度进行比较时，支链α-葡聚糖的分子量在1,168～60,000(水溶性食物纤维含量为58.1～80.4质量%)时，抑制效果显著，在2,670～44,151(水溶性食物纤维含量为64.2～80.4质量%)时，发现特别强的抑制效果。 
<实验20-3：支链α-葡聚糖的长期摄取对淀粉部分分解物摄取时的血糖值及胰岛素量产生的影响> 
在实验20-1中，判明：通过本发明的支链α-葡聚糖的摄取，抑制糖质负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升，因此，研究在长期摄取该支链α-葡聚糖后(8周)，糖质负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升抑制作用。使用用精制饲料预先饲养了1周的7周龄的Wistar系雄性大鼠(日本チャールスリバー株式会社出售)5组各组5只。将3组各组5只的大鼠用配合有各个表33所示的支链α-葡聚糖(固体成分换算)1、2或5质量%的三种试验饲料的任一种饲养8周。饲养期间中的饲料及水为自由摄取。在试验饲料中的饲养4周和8周，禁食1天后，以固体成分为1.5g/kg·体重的方式用胃探针经口给药淀粉部分分解物的水溶液。在经口给药之前、给药15分钟后、30分钟后、60分钟后、120分钟后、180分钟后、240分钟后，从尾静脉采集大鼠的血液。将各自的血液采取到肝素处理剂采血管，进行离心分离(2,000rpm、10分钟)，得到血浆。用与实验19-4同样的方法测定血糖值和胰岛素量。作为对照1，仅用精制饲料饲养1组5只的大鼠。另外，将余下的1组5只大鼠作为对照2，用以市售的难消化性糊精(商品名《パインファイバー2》、松谷化学工业株式会社制造)取代了一部分精制饲料的玉米淀粉的表33所示的配合组成的饲料饲养。由于饲养4周和8周为大致相同的结果，因此，将用试验饲料饲养4周时的各自的试验体系中的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的测定结果分别示于表34、表35、表36及表37。 
[表33] 
Figure BDA0000469697680000671
[表34] 
*：相对配合有5质量%难消化性糊精的饲料为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
[表35] 
Figure BDA0000469697680000681
*：相对配合有5质量%难消化性糊精的饲料为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
[表36] 
Figure BDA0000469697680000682
*：相对配合有5质量%难消化性糊精的饲料为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
[表37] 
Figure BDA0000469697680000691
*：相对配合有5质量%难消化性糊精的饲料为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
由表33～37的结果判明：与仅用精制饲料饲养的情况(对照1)相比，本发明的支链α-葡聚糖与市售的难消化性糊精(对照2)同样地抑制糖质(淀粉部分分解物)负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升。另外，这些数值上升的抑制依赖于配合于饲料的支链α-葡聚糖的浓度，其效果在配合有固体成分为2质量%的支链α-葡聚糖时显著，如果为5质量%，则发现特别强的抑制效果。另外，发现用配合有固体成分为5质量%的市售的难消化性糊精的饲料饲养的大鼠中的这些指标的抑制程度与配合有固体成分为1质量%的支链α-葡聚糖的饲料同程度的抑制，因此确认，本发明的支链α-葡聚糖与该难消化性糊精相比，糖质(淀粉部分分解物)负荷时的血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值的上升抑制效果优异。而且也得知，将淀粉部分分解物给药前的血糖值及胰岛素量进行比较时，摄取了配合有固体成分为2质量%或5质量%的支链α-葡聚糖的饲料的组比摄取了仅精制饲料或含有固体成分为5质量%的难消化性糊精的饲料的组低，与市售的难消化性糊精相比，本发明的支链α-葡聚糖具有通过长期摄取而有效地抑制空腹时血糖值及血中胰岛素量的作用。需要说明的是，在用试验饲料或对照饲料饲养4周及8周比较大鼠的体重，结果，在任一个组间都没有发现平均体重上的差异，因此判断，由本实验确认的支 链α-葡聚糖引起的血糖值及胰岛素量的上升抑制作用对大鼠的健康状态没有产生任何影响。 
<实验21：支链α-葡聚糖的摄取对人体的血糖值及胰岛素量产生的影响> 
得知：使大鼠摄取支链α-葡聚糖时，与摄取淀粉部分分解物的情况相比，抑制血糖值及胰岛素量的增加，因此，进行了研究支链α-葡聚糖的摄取对人体的血糖值及血中胰岛素量产生的影响的试验。使用市售的淀粉部分分解物(松谷化学工业株式会社制造、商品名《パインデックス#1》)及根据后述的实施例5的方法制成的支链α-葡聚糖，研究人体中的血糖值及胰岛素量的上升。以健康的志愿者的男性12名(年龄26～54岁、平均41±7岁)为被检者，在试验前一天的21点以后至第二天的试验开始时(9点钟)之间，禁止水以外的饮食品的摄取。对该被检者，首先在摄取开始至2分钟以内摄取将淀粉部分分解物50g(固体成分换算)溶解于水并设定为总量200ml的试验样品。在经口给药之前、经口给药15分钟后、30分钟后、45分钟后、60分钟后、120分钟后采集血液。然后，空出1周以上的间隔，对相同的被检者使用将淀粉部分分解物50g(固体成分换算)溶解于水并设定为总量200ml的试验样品，除此之外，与淀粉部分分解物同样地进行试验、采血。将各自的血液的血糖值及胰岛素量委托给民间的临床检查机关(社团法人冈山市医师会综合医药中心)并进行测定。将试验样品摄取时的血糖值及胰岛素量的经时变化及基于该数值计算出的摄取之后至摄取120分钟血糖值的AUC值(血中浓度-时间曲线下面积:AUC0－2hr(mg·hr/dl))及胰岛素量的AUC0-2hr(μU·hr/dl)值、摄取之后至120分钟血糖值的AUC值的增加量及胰岛素量的AUC值的增加量(ΔAUC0－2hr)汇总于表38表示。 
[表38] 
Figure BDA0000469697680000711
*：相对对照为显著性差异(p<0.05或p<0.01) 
由表38的结果判明：在摄取本发明的支链α-葡聚糖时，与使用大鼠的实验(实验20)同样，血糖值、血糖值的AUC值、胰岛素量及胰岛素量的AUC值与摄取了淀粉部分分解物的情况相比显著低。 
<实验22：支链α-葡聚糖的生物体内类脂质减少作用> 
在实验19-4、实验21中，判明：通过摄取支链α-葡聚糖，降低血糖值及血中胰岛素量的上升，因此，对该支链α-葡聚糖的摄取给生物体内类脂质带来的影响进行研究。 
<实验22-1：支链α-葡聚糖的摄取对脂肪吸收产生的影响> 
使用用后述的实验例5的方法制成的支链α-葡聚糖，将7周龄的Wistar系雄性大鼠(日本チャールスリバー株式会社出售)随机分为4组各组15只，用表33所示的精制饲料饲养1周后，2组各15只用同表所示的配合有固体成分为5质量%的支链α-葡聚糖的组成的饲料饲养4周或8周。剩余的2组各15只作为对照，用精制饲料同样地饲养4周或8周。将用支链α-葡聚糖配合饲料饲养的1组15只在饲养开始4周及将剩余1组15只在饲养开始8周，分别在乙醚麻醉下由大静脉采血后进行屠宰、解剖，研究内脏蓄积脂肪量、血清类脂质、肠粘膜湿质量及盲肠内容物等。对照的大鼠也同样地进行处理。将其结果示于表39。大鼠的饲养在整个试验期间过程中每2或3天测定体重和摄取量，并且与实验20-1同样地在整个试验期间过程中自由摄取饲料及水。另外，解剖前禁食一晚上。将支链α-葡聚糖配合饲料饲养4周及8周的体重 增加量、摄料量、饲料利用率(体重增加量/摄料量)、解剖时的体重、脏器等质量、肠粘膜质量、内脏脂肪质量、盲肠内的内容物的质量、水分、pH示于表39。另外，血清类脂质的测定结果也一同示于表39。需要说明的是，在血清类脂质中，中性脂肪、总胆固醇及HDL-胆固醇的测定分别使用市售的中性脂肪甘油三酯测定用试剂盒(商品名“甘油三酯E-テストワコー”、和光纯药工业株式会社出售)及HDL-胆固醇测定用试剂盒(商品名“HDL-胆固醇E-テストワコー”、和光纯药工业株式会社出售)。另外，由总胆固醇值减去HDL-胆固醇值而设定为LDL-胆固醇值。 
[表39] 
Figure BDA0000469697680000721
*：相对对照，p<0.05显著 
**：相对对照，p<0.01显著 
由表39的结果得知，摄取配合有固体成分为5%的本发明的支链α-葡聚糖的饲料时，与仅用精制饲料饲养的情况相比，在摄取4周后，肾脏周围及睾丸周围脂肪质量显示低值，在摄取8周后，肾脏周围及睾丸周围脂肪都显著地显示低值，其降低在睾丸周围脂肪尤其显著。另外，在摄取4周及摄取8周后肠粘膜质量显著地增加，其增加在摄取8周后变显著。另外，在摄取8周后盲肠内pH显著地降低。而且，观察血清类脂质时，中性脂肪值在摄取8周后、总胆固醇在摄取4周及8周后都显示降低倾向，LDL-胆固醇也降低。除此以外的测定值与对照没有差异。需要说明的是，虽然没有表示出具体的数据，但盲肠内的有机酸浓度与对照的没有差异。该结果表明，本发明的支链α-葡聚糖具有减少生物体内类脂质的作用。另外，推测为：由于肠粘膜的质量增加，因此，对于支链α-葡聚糖引起的类脂质的过剩蓄积的抑制或由实验20～21确认的耐糖性的增强，伴随由该试验确认的粘蛋白分泌的增大的小肠粘膜层的肥厚引起的消化酶的作用性降低或被消化成的葡萄糖或脂肪的消化、吸收阻碍、延迟起重要的作用。 
<实验22-2：支链α-葡聚糖的分子量对生物体内类脂质的过剩蓄积抑制产生的影响> 
在实验22-1中，判明：通过本发明的支链α-葡聚糖的摄取，抑制生物体内类脂质的过剩蓄积，因此，研究该支链α-葡聚糖的重均分子量的不同产生的作用。即，制备在精制饲料中分别配合有固体成分为5质量%的与实验20-2中使用的支链α-葡聚糖相同的重均分子量不同的8种支链α-葡聚糖的8种试验饲料。将7周龄的Wistar系雌性大鼠(日本チャールスリバー株式会社出售)45只随机分为9组各组5只，用精制饲料预先饲养1周。在该大鼠中，对8组用配合有表40所示的重均分子量不同的支链α-葡聚糖的任一种的试验饲料(试验饲料1～8)饲养8周。剩余的1组5只大鼠用精制饲料照原样饲养8周，设定为对照组。将摄取配合有支链α-葡聚糖的饲料并经过了8周的大鼠及摄取精制饲料并经过了8周的对照组的大鼠分别在乙醚麻醉下采血后，进行屠宰， 用与实验22-1相同的方法测定其肠间膜周围、肾脏周围及睾丸周围的脂肪质量(湿质量)以及血清中的中性脂肪及总胆固醇。将结果示于表40。 
[表40] 
由表40的结果得知，摄取重均分子量不同的支链α-葡聚糖时，在任一个组中，与对照组相比，内脏脂肪质量及血清脂质量都为低值，本发明的支链α-葡聚糖抑制内脏脂肪质量及血清脂质量的上升。另外，以该抑制效果的程度进行比较时，支链α-葡聚糖的重均分子量为2,670～44,151，效果显著，在2,670～25,618时具有特别强的效果。 
由以上的实验19-2～19-5的结果判明，本发明的支链α-葡聚糖即使经口摄取，也难以成为龋齿，难以被消化吸收，可以有利地用作低卡路里的水溶性食物纤维。另外，由实验20～22的结果也判明，本发明的支链α-葡聚糖可以用作血糖上升抑制剂及生物体内类脂质减少剂。 
下面，将本发明的α-葡糖基转移酶的制造例示于实施例1及2，将本发明的支链α-葡聚糖的制造例示于实施例3～6。另外，将本发明的 支链α-葡聚糖的物理化性质例示于实施例7。将含有本发明的α-葡糖基转移酶的品质改良剂示于实施例8，而且，将含有本发明的支链α-葡聚糖的组合物示于实施例9～22。 
实施例1 
按照实验5的方法，在发酵罐中培养环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)约24小时。培养后，进行离心分离，回收上清液，以成为80%饱和的方式添加硫酸铵，在4℃放置24小时，由此进行盐析。将盐析物进行离心分离并回收，其中溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，相对同缓冲液进行透析、膜浓缩，制备粗酶液。本浓缩粗酶液的α-葡糖基转移酶活性为200单位/ml。另外，在本浓缩粗酶液中也具有约25单位/ml的淀粉酶活性。本品可以有利地应用于使用淀粉的基质的本发明的支链α-葡聚糖的制造、还有饮食品中所含的淀粉的品质改良剂等。 
实施例2 
按照实验8的方法，在发酵罐中培养球形节杆菌PP349(FERM BP-10770)约24小时。培养后，进行离心分离，回收上清液，以成为80%饱和的方式添加硫酸铵，在4℃放置24小时，由此进行盐析。将盐析物进行离心分离并回收，其中溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)后，相对同缓冲液进行透析、膜浓缩，制备粗酶液。本浓缩粗酶液的α-葡糖基转移酶活性为50单位/ml。本品可以有利地应用于使用淀粉的基质的本发明的支链α-葡聚糖的制造、还有饮食品中所含的淀粉的品质改良剂等。 
实施例3 
将淀粉部分分解物(商品名《パインデックス＃100》松谷化学工业株式会社出售)以浓度为30质量%的方式溶解于水，将其调整为pH6.0，加入用实施例1的方法得到的浓缩粗酶液每1克基质固体成分为10单位作为α-葡糖基转移酶活性，在40℃作用48小时。反应结束后，将反应液加热到95℃，保持10分钟后，进行冷却、过滤，将得到的滤液按照常规方法用活性炭进行脱色，利用H型及OH型离子树脂进行脱盐并精制、进一步浓缩，得到浓度50质量%的支链α-葡聚糖溶液。本支链α-葡聚糖在甲基化分析中，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物之比显示1:1.3，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲 基化物的70.3%。另外，2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物分别为部分甲基化物的3.0%及4.8%。另外，本支链α-葡聚糖的重均分子量为6,220道尔顿，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)为2.2。而且，本支链α-葡聚糖通过异麦芽糖糊精酶的消化，每消化物的固体成分生成异麦芽糖35.1质量%，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量为75.8质量%。本品具有非致龋性、难消化性的性质、适当的粘度，可以以水溶性食物纤维、脂肪替代食物材料、日常饮食用饮食品、品质改良剂、稳定剂、赋形剂、增粘剂、增量剂等有利地应用于食品、化妆品、医药品等各种组合物。 
实施例4 
在30%木薯淀粉乳中以最终浓度为0.1质量%的方式加入碳酸钙后，调整为pH6.5，在其中以每1克淀粉为0.2质量%的方式加入α-淀粉酶(ノボ公司制造、商品名ターマミール60L)，在95℃下使其反应15分钟。将该反应液进行高压灭菌器(120℃)10分钟后，冷却至40℃，在其中加入用实施例2的方法制成的α-葡糖基转移酶的浓缩粗酶液每1克固体成分为10单位，进一步加入来自嗜热脂肪芽孢杆菌的CGTase(株式会社林原生物化学研究所制)每1克固体成分为1单位，在40℃、pH6.0下作用72小时。将该反应液在95℃下保持10分钟后，进行冷却、过滤，将得到的滤液按照常规方法用活性炭进行脱色，利用H型及OH型离子树脂进行脱盐并精制、进一步进行浓缩、喷雾干燥，得到支链α-葡聚糖粉末。本支链α-葡聚糖在甲基化分析中，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物之比显示1:1.6，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的80.0%。另外，2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物分别显示部分甲基化物的1.4及1.7%。另外，本支链α-葡聚糖的重均分子量为10,330道尔顿，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)为2.9。而且，本支链α-葡聚糖在异麦芽糖糊精酶的消化中，每消化物的固体成分生成异麦芽糖40.7质量%，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量为68.6质量%。本支链α-葡聚糖具有非致龋性、难消化性的性质、适当的粘度，可以以水溶性食物纤维、脂肪替代食物材料、日常饮食用饮食品、品质改良剂、稳定剂、赋形剂、增粘 剂、增量剂等有利地应用于食品、化妆品、医药品等各种组合物。 
实施例5 
在27.1质量%玉米淀粉液化液(水解率3.6%)中以最终浓度为0.3质量%的方式加入亚硫酸氢钠，另外，以最终浓度为1mM的方式加入氯化钙后，冷却至50℃，在其中加入用实施例1的方法制成的浓缩粗酶液每1克固体成分为11.1单位，进一步在50℃、pH6.0下作用68小时。将该反应液在80℃下保持60分钟后，进行冷却、过滤，将得到的滤液按照常规方法用活性炭进行脱色，利用H型及OH型离子树脂进行脱盐并精制、进一步进行浓缩、喷雾干燥，得到支链α-葡聚糖粉末。本支链α-葡聚糖在甲基化分析中，作为部分甲基化物的2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物之比显示1:2.5，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的68.4%。另外，2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物分别显示部分甲基化物的2.6及6.8%。另外，本支链α-葡聚糖的重均分子量为4,097道尔顿，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)为2.1。而且，本支链α-葡聚糖在异麦芽糖糊精酶的消化中，每消化物的固体成分生成异麦芽糖35.6质量%，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量为79.4质量%。本支链α-葡聚糖具有非致龋性、难消化性的性质、适当的粘度，可以以水溶性食物纤维、脂肪替代食物材料、日常饮食用饮食品、品质改良剂、稳定剂、赋形剂、增粘剂、增量剂等有利地应用于食品、化妆品、医药品等各种组合物。 
实施例6 
取代浓缩粗酶液，使用用实验6的方法制成的来自环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)的精制α-葡糖基转移酶，加入来自淀粉皮假单胞菌的异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制)每1克固体成分为1,000单位，除此之外，与实施例5同样地操作，得到支链α-葡聚糖粉末。本支链α-葡聚糖在甲基化分析中，作为部分甲基化物的2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物之比显示1:4，2,3,6-三甲基化物和2,3,4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的67.9%。另外，2,4,6-三甲基化物及2,4-二甲基化物分别显示部分甲基化物的2.3及5.3%。另外，本支链α-葡聚糖的重均分子量为2,979道尔顿，重均分子量(Mw)除以 数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)为2.0。而且，本支链α-葡聚糖在异麦芽糖糊精酶的消化中，每消化物的固体成分生成异麦芽糖40.6质量%，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纤维含量为77质量%。本支链α-葡聚糖具有非致龋性、难消化性的性质、适当的粘度，可以以水溶性食物纤维、脂肪替代食物材料、日常饮食用饮食品、品质改良剂、稳定剂、赋形剂、增粘剂、增量剂等有利地应用于食品、化妆品、医药品等各种组合物。 
实施例7 
对由实施例5制成的支链α-葡聚糖，按照常规方法研究理化性质，作为本发明的支链α-葡聚糖的性质的一例汇总于表41。 
[表41] 
实施例8 
<品质改良剂> 
将无水麦芽糖(注册商标《ファイントース》、株式会社林原商事出售)400质量份、海藻糖(注册商标《トレハ》、株式会社林原商事出售)200质量份及用实验6的方法制成的来自环状芽孢杆菌PP710(FERM BP-10771)的精制α-葡糖基转移酶2质量份均匀混合，利用常规方法进 行通风干燥，制备含有α-葡糖基转移酶的酶剂。通过在制造含有淀粉的饮食品时配合本品，可以将淀粉改性，抑制淀粉的老化，因此，可以有利地用作品质改良剂、尤其是抗淀粉老化剂。 
实施例9 
<年糕> 
将糯米粉500质量份和上新粉500质量份均匀混合后，加入水700质量份并混合，用水蒸气蒸40分钟。用搅拌机(ACM20LVW、株式会社爱工舍制作所)搅拌蒸好的物质，并且质地约55℃时，以α-葡糖基转移酶活性最终为每1克淀粉为50单位的方式将蔗糖360质量份、海藻糖(注册商标《トレハ》、株式会社林原商事出售)240质量份及用实验6的方法精制而得到的本发明的α-葡糖基转移酶分成4次而添加、混合，其后，混合30分钟后，装入塑料制的内径60mm、高度22mm的容器中进行成形、自然冷却并保存。本品为通过α-葡糖基转移酶的作用将淀粉改性为支链α-葡聚糖的抑制老化、使柔韧度持续而具有拉伸性、松脆的高品质的年糕。 
实施例10 
<糯米饭团> 
将麦芽糖(注册商标《サンマルト》、株式会社林原商事出售)350质量份、海藻糖(注册商标《トレハ》、株式会社林原商事出售)150质量份溶解于温水，制备浓度70质量%的糖液并保温于55℃。然后，利用常规方法用蒸笼蒸煮预先在水中浸渍过的1000质量份的年糕米，冷却至55℃后，以每1克淀粉为25单位的方式加入上述糖液500质量份和用实验9的方法精制而得到的本发明的α-葡糖基转移酶并均匀地搅拌。将其放入保温容器保持在45～50℃约1小时后，取出，使用豆沙馅制备糯米饭团。本品为通过α-葡糖基转移酶的作用将糊化淀粉改性为支链α-葡聚糖并抑制老化、在冷藏或冷冻保存后即使解冻也不产生失水等、保持制备之后的柔韧度的高品质的糯米饭团。 
实施例11 
<加糖炼乳> 
在原乳100质量份中溶解用实施例3的方法得到的支链α-葡聚糖 溶液2质量份及蔗糖3重量，用片式加热器进行加热灭菌，然后，浓缩为浓度70%，在无菌状态下装罐，得到制品。本品为温和的甜味且味道也好，作为较多地含有水溶性食物纤维的加糖炼乳，可以有利地应用于水果、咖啡、可可茶、红茶等调味用。 
实施例12 
<乳酸菌饮料> 
将脱脂粉乳175质量份、用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末50质量份及乳果糖高含有粉末(株式会社林原商事出售、注册商标《乳果寡糖》)50质量份溶解于水1,500质量份，在65℃下杀菌30分钟，冷却至40℃后，其中按照常规方法植菌乳酸菌的发酵剂30质量份，在37℃下培养8小时，得到乳酸菌饮料。本品味道良好，含有作为水溶性食物纤维的支链α-葡聚糖或寡糖，作为不仅稳定地保持乳酸菌、而且具有双尾菌增殖促进作用、整肠作用的乳酸菌饮料优选。 
实施例13 
<粉末果汁> 
相对通过喷雾干燥制成的橙果汁粉末33质量份，将用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末10质量份、含水结晶海藻糖20质量份、无水结晶麦芽糖20质量份、柠檬酸酐0.65质量份、苹果酸0.1质量份、2-O-α-葡糖基-L-抗坏血酸0.2质量份、柠檬酸钠0.1质量份及适量的粉末香料充分混合搅拌并粉碎，做成微粉末，将其放入流动层制粒机，设定为排风温度40℃，其中适量喷雾用实施例3的方法得到的支链α-葡聚糖溶液作为粘合剂，制粒30分钟并计量、包装，得到制品。本品为果汁含量约30%的粉末果汁。另外，本品作为没有异味、异臭，高品质、较多地含有水溶性食物纤维的低卡路里的果汁，为商品价值高的制品。 
实施例14 
<卡士达酱> 
将玉米淀粉100质量份、用实施例3的方法得到的支链α-葡聚糖溶液30质量份、海藻糖含水结晶70质量份、蔗糖40质量份及食盐1质量份充分混合，加入鸡蛋280质量份并搅拌，其中缓慢地加入沸腾的 牛奶1,000质量份，进一步火焰加热并搅拌，在玉米淀粉完全糊化、全部为半透明时关火，将其冷却并加入适量的华尼拉香料，进行测量、填充、包装，得到制品。本品为具有平滑的光泽、味道良好、较多地含有水溶性食物纤维的高品质的卡士达酱。 
实施例15 
<馅> 
在原料小豆10质量份中按照常规方法加水并煮沸、除涩、去涩味，除去水溶性夹杂物，得到小豆粒馅约21质量份。在该生馅中加入蔗糖14质量份、用实施例3的方法得到的支链α-葡聚糖溶液5质量份和水4质量份并煮沸，在其中加入少量的色拉油以不使粒馅变质的方式精炼，得到制品的馅约35质量份。本品都不褪色、失水，稳定，较多地含有作为水溶性食物纤维的支链α-葡聚糖，味觉、味道良好，作为带馅面包、团子、豆馅糯米点心、冰点心等制点心材料优选。 
实施例16 
<面包> 
将小麦粉100质量份、酵母菌2质量份、蔗糖5质量份、用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末1质量份及无机食物0.1质量份按照常规方法用水柔和，在26℃下使菌种发酵2小时，其后，成熟、烧制30分钟。本品为色泽、形状都良好、含有较多作为水溶性食物纤维的支链α-葡聚糖、具有适当的弹力、温和的甜味的高品质的面包。 
实施例17 
<粉末肽> 
将用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末2质量份与40%食品用大豆肽溶液(不二制油株式会社出售、商品名《ハイニュートS》)1质量份混合，放入塑料制大桶中，在50℃下进行减压干燥并粉碎，得到肽。本品味道良好，不仅作为预混合物、冰激凌等低卡路里制点心材料是有用的，而且，作为经口流动食物、用于经管流动食物的食物纤维或整肠剂量也是有用的。 
实施例18 
<化妆用霜> 
将单硬脂酸聚氧乙二醇2质量份、自乳化型单硬脂酸甘油5质量份、用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末2质量份、α-葡糖基芦丁(株式会社林原出售、商品名αG芦丁)1质量份、流动石蜡1质量份、三辛酸甘油10质量份及适量的防腐剂按照常规方法进行加热熔解，在其中加入L-乳酸2质量份、1,3-丁二醇5质量份及蒸馏水66质量份，用均化器乳化，进一步加入适量的香料进行搅拌混合，制造化妆用霜。本品因配合支链α-葡聚糖而具有优异的保湿性，稳定性高，可以有利地用作高品质的防晒、美肤剂、美白剂等。 
实施例19 
<牙膏> 
将磷酸氢钙45质量份、月桂基硫酸钠1.5质量份、甘油25质量份、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯0.5质量份、用实施例3的方法得到的支链α-葡聚糖溶液15质量份、糖精0.02质量份与水18质量份混合，得到牙膏。本品不使表面活性剂的清洁力降低，使用后感觉也良好。 
实施例20 
<流食用固体制剂> 
制备由用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末100质量份、海藻糖含水结晶200质量份、含有较多麦芽四糖的粉末200质量份、蛋黄粉270质量份、脱脂粉乳209质量份、氯化钠4.4质量份、氯化钙1.8质量份、硫酸镁4质量份、硫胺素0.01质量份、L-抗坏血酸钠0.1质量份、维生素E乙酸酯0.6质量份剂烟酰胺0.04质量份构成的配合物，将钙配合物填充于各25克的防湿性层叠体小袋并进行热密封，得到制品。本品将水溶性食物纤维进行强化，作为整肠作用优异的流食，通过经口或向鼻腔、胃、肠等经管的使用方法进行利用，可以有利地应用于对生物体的能量补充。 
实施例21 
<片剂> 
在阿司匹林50质量份中充分混合海藻糖含水结晶粉末14质量份、用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末4质量份后，按照常规方法利用压片机压片，制造厚度5.25mm、1片680mg的药片。由于本品利 用难消化性葡聚糖和海藻糖的赋形性，因此，没有吸湿性，物理强度也充分，而且水中的崩解也非常良好。另外，由于支链α-葡聚糖作为水溶性食物纤维起作用，因此，是也具有整肠作用的药片。 
实施例22 
<外伤治疗用膏药> 
在麦芽糖400质量份中加入溶解有碘3质量份碘甲醇50质量份并混合，进一步加入用实施例4的方法得到的支链α-葡聚糖粉末10w/v%水溶液20质量份并混合，得到显示适当的拉伸性、附着性的外伤治疗用药膏。本品为具有支链α-葡聚糖引起的适当的粘度、保湿性、经时变化少、商品价值高的膏药。另外，本品不仅具有由碘产生的杀菌作用，而且也作为利用麦芽糖对细胞补充能量的能量补充剂起作用，因此，治疗时间缩短，创面也全部治愈。 
工业上应用的可能性 
本发明的支链α-葡聚糖由于安全性高，消化性也不比市售的难消化性糊精差，因此，充分具备作为水溶性食物纤维的功能。另外，本发明的支链α-葡聚糖也具有血糖上升抑制作用或生物体内类脂质减少作用，因此，作为健康食品也是有用的。根据本发明，目前，可以以淀粉部分分解物为基质，用酶法大量且效率好地制造具有与利用化学反应或繁琐且效率低的方法由淀粉制成的难消化性糊精同等的难消化性的支链α-葡聚糖。提供难消化性的支链α-葡聚糖和其制造方法的本发明，对饮食品、化妆品、医药品等应用领域有较大贡献，其工业意义非常重大。 

Claims (11)

1.一种支链α-葡聚糖，其以葡萄糖为构成糖，其特征在于，
在甲基化分析中，所述支链α-葡聚糖是通过下述α-葡糖基转移酶作用于麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖得到的，所述的α-葡糖基转移酶对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1,4葡聚糖的非还原末端具有α-1,6葡糖基转移活性和α-1,3葡糖基转移活性；
所述的支链α-葡聚糖具有下述特征：
(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围；
(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且小于10%；及
(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
2.如权利要求1所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，葡萄糖聚合度为10以上，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)小于20。
3.如权利要求1或2所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，通过异麦芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)消化，每单位消化物的固体成分生成异麦芽糖25质量%以上50质量%以下。
4.如权利要求1～3中任一项所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，利用高效液相色谱法(酶-HPLC法)求出的水溶性食物纤维含量为40质量%以上。
5.一种α-葡糖基转移酶，其特征在于，对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1,4葡聚糖的非还原末端具有α-1,6葡糖基转移活性及α-1,3葡糖基转移活性，且具有下述理化性质：
(1)分子量
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90,000±10,000道尔顿；
(2)最适温度
在pH6.0反应30分钟的条件下，为50～55℃；
(3)最适pH
在40℃反应30分钟的条件下，为5.0～6.3；
(4)温度稳定性
在pH6.0保持60分钟的条件下，直到40℃稳定；及
(5)pH稳定性
在4℃保持24小时的条件下，至少在pH4.0～8.0内稳定。
6.一种支链α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，使对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1,4葡聚糖的非还原末端具有α-1,6葡糖基转移活性及α-1,3葡糖基转移活性的α-葡糖基转移酶作用于麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α-1,4葡聚糖、生成权利要求1～4中任一项所述的生成葡聚糖的步骤、和获得该葡聚糖的步骤。
7.如权利要求6所述的支链α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，在生成权利要求1～4中任一项所述的葡聚糖的步骤中，并用选自淀粉酶、淀粉去分支酶及环糊精葡萄糖转位酶中的1种或2种以上。
8.如权利要求6所述的支链α-葡聚糖的制造方法，其为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)PP710(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERM BP-10771)、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)PP349(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERM BP-10770)或它们的变异株。
9.含有如权利要求1～4的任一项所述的支链α-葡聚糖的组合物，其特征在于，为饮食品、化妆品、医药品、医药部外品或工业原料的形态。
10.一种血糖上升抑制剂，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的支链α-葡聚糖作为有效成分。
11.一种生物体内类脂质减少剂，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的支链α-葡聚糖作为有效成分。
CN201410065367.1A 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途 Active CN103865967B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007117369 2007-04-26
JP2007-117369 2007-04-26
CN200880017583.1A CN101932719B (zh) 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880017583.1A Division CN101932719B (zh) 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103865967A true CN103865967A (zh) 2014-06-18
CN103865967B CN103865967B (zh) 2018-08-31

Family

ID=39943442

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410065367.1A Active CN103865967B (zh) 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途
CN200880017583.1A Active CN101932719B (zh) 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880017583.1A Active CN101932719B (zh) 2007-04-26 2008-04-23 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途

Country Status (7)

Country Link
US (5) US8324375B2 (zh)
EP (2) EP3115452B1 (zh)
JP (10) JPWO2008136331A1 (zh)
KR (1) KR101540230B1 (zh)
CN (2) CN103865967B (zh)
ES (2) ES2599362T3 (zh)
WO (1) WO2008136331A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108025019A (zh) * 2015-09-18 2018-05-11 株式会社林原 血糖值升高抑制剂及含其的经口组合物

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9107436B2 (en) 2011-02-17 2015-08-18 Purecircle Sdn Bhd Glucosylated steviol glycoside as a flavor modifier
US8257948B1 (en) 2011-02-17 2012-09-04 Purecircle Usa Method of preparing alpha-glucosyl Stevia composition
US9386797B2 (en) 2011-02-17 2016-07-12 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl stevia composition
US9392799B2 (en) 2011-02-17 2016-07-19 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl stevia composition
US8790730B2 (en) 2005-10-11 2014-07-29 Purecircle Usa Process for manufacturing a sweetener and use thereof
US8318459B2 (en) 2011-02-17 2012-11-27 Purecircle Usa Glucosyl stevia composition
JP2010100583A (ja) * 2008-10-24 2010-05-06 Hayashibara Biochem Lab Inc 脂質代謝改善剤
JP5507107B2 (ja) * 2009-03-26 2014-05-28 昭和産業株式会社 澱粉分解物、該澱粉分解物を含有する食品添加剤、飲食物、薬剤、及び澱粉分解物製造方法
JP5507105B2 (ja) * 2009-03-26 2014-05-28 昭和産業株式会社 新規な澱粉分解物、該澱粉分解物を含有する食品添加剤、飲食物、及び薬剤
EP2248907A1 (en) 2009-05-08 2010-11-10 Rijksuniversiteit Groningen Gluco-oligosaccharides comprising (alpha 1-->4) and (alpha 1-->6) glycosidic bonds, use thereof, and methods for providing them
MX2012002696A (es) * 2009-09-03 2012-08-15 Hayashibara Biochem Lab Composicion particulada que contiene ácido 2-0-alfa-d-glucosil-l-a scórbico anhidro cristalino, procedimiento para la producción de la misma, y sus usos.
US8617636B2 (en) * 2009-10-01 2013-12-31 Roquette Freres Carbohydrate compositions having a greater impact on the insulinemic response than on the glycemic response, their preparation and their uses
EP3461342A1 (en) 2009-11-12 2019-04-03 PureCircle USA Inc. Granulation of a stevia sweetener
JP4971511B2 (ja) * 2010-03-02 2012-07-11 昭和産業株式会社 糖組成物及び飲食品
EP4108668A1 (en) 2010-03-12 2022-12-28 PureCircle USA Inc. High-purity steviol glycosides
US10696706B2 (en) 2010-03-12 2020-06-30 Purecircle Usa Inc. Methods of preparing steviol glycosides and uses of the same
US9510611B2 (en) 2010-12-13 2016-12-06 Purecircle Sdn Bhd Stevia composition to improve sweetness and flavor profile
US9029426B2 (en) 2010-12-13 2015-05-12 Purecircle Sdn Bhd Highly soluble Rebaudioside D
JP5860480B2 (ja) 2011-01-11 2016-02-16 キャプシュゲル・ベルジウム・エヌ・ヴィ プルランを含む新しい硬カプセル
WO2012105542A1 (ja) 2011-02-01 2012-08-09 株式会社林原生物化学研究所 皮膚外用剤
KR20140020849A (ko) * 2011-02-04 2014-02-19 아마노 엔자임 가부시키가이샤 말토트리오실 전이 효소의 신규 용도
MX362676B (es) 2011-02-10 2019-01-31 Purecircle Usa Composición de estevia.
US9474296B2 (en) 2011-02-17 2016-10-25 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl stevia composition
US9603373B2 (en) 2011-02-17 2017-03-28 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl stevia composition
US11690391B2 (en) 2011-02-17 2023-07-04 Purecircle Sdn Bhd Glucosylated steviol glycoside as a flavor modifier
US9894922B2 (en) 2011-05-18 2018-02-20 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl rebaudioside C
ES2727031T3 (es) 2011-05-31 2019-10-11 Purecircle Usa Inc Composición de Estevia
EP2713762B1 (en) 2011-06-03 2016-03-30 Purecircle USA Stevia composition
MX364306B (es) 2011-06-20 2019-04-22 Purecircle Usa Inc Composición de estevia.
US9771434B2 (en) 2011-06-23 2017-09-26 Purecircle Sdn Bhd Products from stevia rebaudiana
US10480019B2 (en) 2011-08-10 2019-11-19 Purecircle Sdn Bhd Process for producing high-purity rubusoside
MX2014002462A (es) 2011-09-07 2014-05-07 Purecircle Usa Inc Edulcorante de estevia altamente soluble.
EP3501528B1 (en) * 2011-10-19 2020-10-07 PureCircle USA Inc. Glucosyl stevia composition
EP2666788A1 (en) 2012-05-21 2013-11-27 Nederlandse Organisatie voor toegepast -natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Glucan fibre
CN110358795A (zh) 2012-05-22 2019-10-22 谱赛科有限责任公司 高纯度的甜菊醇糖苷
US9752174B2 (en) 2013-05-28 2017-09-05 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
JP6072499B2 (ja) * 2012-10-17 2017-02-01 松谷化学工業株式会社 分岐デキストリン及びその用途
JP6236670B2 (ja) * 2012-12-21 2017-11-29 松谷化学工業株式会社 ビール様アルコール飲料およびその製造方法
JP6475610B2 (ja) * 2013-03-01 2019-02-27 株式会社林原 抗生活習慣病用剤及びそれを含んでなる経口組成物
US10952458B2 (en) 2013-06-07 2021-03-23 Purecircle Usa Inc Stevia extract containing selected steviol glycosides as flavor, salty and sweetness profile modifier
MX2015016791A (es) 2013-06-07 2016-09-09 Purecircle Usa Inc Extracto de estevia que contiene glicosidos de esteviol seleccionados como modificador del perfil de sabor, salado y de dulzura.
JP6513908B2 (ja) * 2014-05-29 2019-05-15 日本食品化工株式会社 起泡・泡持ち向上剤
CN114794444A (zh) 2014-09-02 2022-07-29 谱赛科美国股份有限公司 富含莱鲍迪苷d、e、n和/或o的甜菊提取物及其制备方法
JP6479405B2 (ja) * 2014-10-17 2019-03-06 日本食品化工株式会社 タンパク質凝固抑制剤およびタンパク食品の製造方法
JP6711539B2 (ja) * 2015-04-03 2020-06-17 日本食品化工株式会社 難消化性グルカンを含有する血糖上昇抑制剤およびその用途
US20170002335A1 (en) * 2015-06-17 2017-01-05 E I Du Pont De Nemours And Company Glucosyltransferase amino acid motifs for enzymatic production of linear poly alpha-1,3-glucan
CN108495559A (zh) 2015-10-26 2018-09-04 谱赛科美国股份有限公司 甜菊醇糖苷组合物
CN106632721B (zh) * 2015-11-03 2020-08-21 华仁药业股份有限公司 葡萄糖聚合物、其制备方法及用途
AU2016348441B2 (en) * 2015-11-05 2020-10-22 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Dextran-poly alpha-1,3-glucan graft copolymers and synthesis methods thereof
US11408019B2 (en) * 2015-12-04 2022-08-09 Hayashibara Co., Ltd. Alpha-glucan mixture, its preparation and uses
US10266861B2 (en) * 2015-12-14 2019-04-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production and composition of fructose syrup
RU2764635C2 (ru) 2015-12-15 2022-01-19 ПЬЮРСЁРКЛ ЮЭсЭй ИНК. Композиция стевиол гликозида
WO2017122777A1 (ja) * 2016-01-13 2017-07-20 株式会社林原 ビールテイスト飲料とその製造方法
AU2017240068B2 (en) 2016-03-31 2022-12-15 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating cleansing composition
WO2017173241A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
JP6868340B2 (ja) * 2016-04-04 2021-05-12 株式会社林原 バターケーキの冷蔵保存時の硬化抑制剤、これを含んでなるバターケーキ用プレミックス及びこれを用いた冷蔵保存時の硬化が抑制されたバターケーキの製造方法
JP6830762B2 (ja) * 2016-04-15 2021-02-17 昭和産業株式会社 糖組成物及びその製造方法
CA3025953C (en) * 2016-06-02 2024-01-16 Nestec S.A. Method of producing alpha glucans containing alpha 1-3 linked d-glucose units, and alpha glucans
JP2018024619A (ja) * 2016-08-12 2018-02-15 株式会社林原 持久力向上剤
JP6936659B2 (ja) * 2016-08-26 2021-09-22 株式会社林原 結着剤、結着成形食品、及びその製造方法
JP6962674B2 (ja) * 2016-09-21 2021-11-05 株式会社林原 分岐α−グルカン混合物シラップとその用途
US11330828B2 (en) 2016-10-07 2022-05-17 Hayashibara Co., Ltd. Powdery plant extract for beverages and process for producing the same
CN106706527B (zh) * 2016-11-17 2019-04-05 扬州大学 一种高直链淀粉各组分含量的分析方法
EP3544575A1 (en) 2016-11-23 2019-10-02 GOJO Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
EP3601476A4 (en) * 2017-03-28 2021-01-06 Cargill, Incorporated COMPOSITION WITH BETA-GLUCANE AND ENZYME AND REACTION PRODUCTS THEREOF
WO2018190310A1 (ja) * 2017-04-11 2018-10-18 株式会社林原 品質改善剤並びにその用途
US11576870B2 (en) 2017-04-14 2023-02-14 Capsugel Belgium Nv Pullulan capsules
CN110678555B (zh) 2017-04-14 2023-10-13 比利时胶囊公司 制作普鲁兰的方法
WO2018193897A1 (ja) * 2017-04-21 2018-10-25 株式会社林原 生体内フェノール化合物低減剤
WO2018212118A1 (ja) * 2017-05-15 2018-11-22 株式会社林原 結着剤、結着成形食品、及びその製造方法
JP6366781B1 (ja) * 2017-06-02 2018-08-01 株式会社ロッテ ほぐれやすい冷菓及びその製造方法
JP7144167B2 (ja) * 2018-03-22 2022-09-29 株式会社Adeka 製パン改良材
JPWO2019189065A1 (ja) * 2018-03-26 2021-03-18 味の素株式会社 澱粉含有食品の製造方法
JP7268942B2 (ja) * 2018-05-31 2023-05-08 日本食品化工株式会社 造粒用バインダー並びに造粒物およびその製造方法
EP3817565A1 (en) * 2018-07-05 2021-05-12 DuPont Nutrition Biosciences ApS Use of glucosyl transferase to provide improved texture in fermented milk based products
JP7294826B2 (ja) * 2018-07-10 2023-06-20 アサヒ飲料株式会社 水溶性食物繊維含有炭酸飲料
JPWO2020017395A1 (ja) * 2018-07-19 2021-08-02 株式会社林原 離水抑制剤並びにその用途
US20210403967A1 (en) * 2018-09-27 2021-12-30 Archer Daniels Midland Company Dietary fiber production using a glycosyl-transferase
WO2020122050A1 (ja) 2018-12-13 2020-06-18 株式会社林原 シクロイソマルトテトラオース、シクロイソマルトテトラオース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
KR20210118176A (ko) * 2019-05-13 2021-09-29 소와산교주식회사 개질제, 해당 개질제를 함유하는 개질용 조성물, 및 이들을 사용한 음식품, 의약품, 화장품, 공업 제품, 사료, 배지, 또는 비료, 그리고 이들의 제품의 개질 방법
CN110184248B (zh) * 2019-05-27 2023-04-25 甘肃省商业科技研究所有限公司 一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法
US20220370511A1 (en) * 2019-11-05 2022-11-24 Myos Corp. Methods and compositions for enhancing overall health and longevity in mammals
CN114990173A (zh) * 2021-03-01 2022-09-02 广州华汇生物实业有限公司 ɑ-葡聚糖的制备方法
WO2022259909A1 (ja) * 2021-06-09 2022-12-15 伊藤忠製糖株式会社 吸湿を抑制したオリゴ糖粉末
FR3126229A1 (fr) * 2021-08-23 2023-02-24 Roquette Freres Procédé d’obtention de fibres solubles par voie enzymatique
CN115926015B (zh) * 2023-01-30 2023-06-27 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种低聚合度聚葡萄糖及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006054474A1 (ja) * 2004-11-17 2006-05-26 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo デキストリンデキストラナーゼとその製造方法並びに用途

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823799A (ja) 1981-08-03 1983-02-12 株式会社林原生物化学研究所 高純度マルト−スの製造方法
JPS5872598A (ja) 1981-10-26 1983-04-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 高純度イソマルト−スの製造方法
US5344824A (en) * 1990-02-02 1994-09-06 Matsutani Chemical Industries Co., Ltd. Method for reducing insulin secretion
EP0691344B1 (en) 1992-12-28 2003-03-19 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Purification of trehalose
JP4230498B2 (ja) * 1994-06-15 2009-02-25 キリンホールディングス株式会社 新規トランスフェラーゼ及びアミラーゼ、それらの製造法及び利用、並びに該新規酵素類の遺伝子
JP3107358B2 (ja) * 1994-09-13 2000-11-06 江崎グリコ株式会社 環状構造を有するグルカンおよびその製造方法
CZ301410B6 (cs) * 1998-07-21 2010-02-17 Alpenstock Holdings Limited Biokompatibilní intermolekulární polymerní komplex, kompozice a prostredky ho obsahující
JP3961157B2 (ja) * 1999-07-01 2007-08-22 佐々木化学工業株式会社 高分岐デキストリン及びその製造法
JP3934851B2 (ja) * 2000-05-23 2007-06-20 日本食品化工株式会社 新規シクロテ゛キストリン・ク゛ルカノトランスフェラーセ゛、その製造方法及びこの酵素を用いるシクロテ゛キストリンの製造方法
US6486314B1 (en) * 2000-05-25 2002-11-26 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Glucan incorporating 4-, 6-, and 4, 6- linked anhydroglucose units
JP2002034587A (ja) * 2000-07-26 2002-02-05 National Agricultural Research Organization 可溶性分岐α−グルカンの製造方法、可溶性分岐α−グルカンおよびα−グルカンの老化抑制処理剤
US20060100171A1 (en) * 2002-09-09 2006-05-11 Ekhart Peter F Branched alpha-glucans for weight management
JP4728950B2 (ja) * 2003-03-10 2011-07-20 ジェネンコー・インターナショナル・インク プレバイオティックであるイソマルトオリゴ糖を含む穀物組成物、及び、この製造方法、並びに、その用途
FR2864088B1 (fr) 2003-12-19 2006-04-28 Roquette Freres Polymeres solubles de glucose hautement branches
CN1663959A (zh) * 2004-03-27 2005-09-07 中国海洋大学 一种β－葡聚糖肽及其制备方法和应用
JP4893980B2 (ja) 2005-04-08 2012-03-07 株式会社林原生物化学研究所 分岐澱粉とその製造方法並びに用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006054474A1 (ja) * 2004-11-17 2006-05-26 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo デキストリンデキストラナーゼとその製造方法並びに用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIKARU WATANABE ET AL: "An enzymatically produced novel cyclomaltopentase cyclized from amylase by anα-(1→6)-linkage,cyclo-｛→6) -α-D-Glcp-(1→4)- α-D-Glcp-(1→4)- α-D-Glcp-(1→4)- α-D-Glcp-(1→4)- α-D-Glcp-(1→｝", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》 *
KRALJ S ET AL: "Molecular characterization of a novel glucosyltransferase from Lactobacillus reuteri strain 121 synthesizing a unique,highly branched glucan with alpha-(1--4) and alpha(1--6) glucosidic bonds", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
MARUTA ET AL: "Formation of trehalose from maltooligosaccharides by a novel enzymatic system．", 《BIOSCI．BIOTECH．BIOCHEM．》 *
TSUSAKI K ET AL: "Structure of a novel highly branched alpha-glucan enzymatically produced from maltodextrin", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》 *
WATANABE H ET AL: "A novel glucanotransferase that products a cyclomaltopentaose cyclized by alpha-1,6-linkage", 《J APPLIED GLYCOSCI》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108025019A (zh) * 2015-09-18 2018-05-11 株式会社林原 血糖值升高抑制剂及含其的经口组合物
CN115475177A (zh) * 2015-09-18 2022-12-16 株式会社林原 血糖值升高抑制剂及含其的经口组合物

Also Published As

Publication number Publication date
US9090923B2 (en) 2015-07-28
WO2008136331A1 (ja) 2008-11-13
US20150267234A1 (en) 2015-09-24
JP5918813B2 (ja) 2016-05-18
US8673608B2 (en) 2014-03-18
ES2599362T3 (es) 2017-02-01
US10076130B2 (en) 2018-09-18
CN103865967B (zh) 2018-08-31
JP2013252137A (ja) 2013-12-19
CN101932719B (zh) 2014-04-02
JP5858547B2 (ja) 2016-02-10
US8324375B2 (en) 2012-12-04
JP2016116532A (ja) 2016-06-30
US20100120710A1 (en) 2010-05-13
US20140134676A1 (en) 2014-05-15
JP5449604B2 (ja) 2014-03-19
US9528134B2 (en) 2016-12-27
EP3115452A1 (en) 2017-01-11
CN101932719A (zh) 2010-12-29
EP2151500A1 (en) 2010-02-10
JP2010202883A (ja) 2010-09-16
JP2010202884A (ja) 2010-09-16
EP3115452B1 (en) 2019-10-16
US20130065293A1 (en) 2013-03-14
JP4755295B2 (ja) 2011-08-24
JPWO2008136331A1 (ja) 2010-07-29
KR101540230B1 (ko) 2015-07-29
EP2151500B1 (en) 2016-09-28
KR20100016213A (ko) 2010-02-12
JP2011078426A (ja) 2011-04-21
JP2014230542A (ja) 2014-12-11
JP2014218677A (ja) 2014-11-20
ES2763306T3 (es) 2020-05-28
JP6457009B2 (ja) 2019-01-23
US20170049142A1 (en) 2017-02-23
JP4755310B2 (ja) 2011-08-24
EP2151500A4 (en) 2010-10-13
JP2017137506A (ja) 2017-08-10
JP2010202882A (ja) 2010-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101932719B (zh) 支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途
CN101044244B (zh) 异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶以及其制备方法和用途
WO2006054474A1 (ja) デキストリンデキストラナーゼとその製造方法並びに用途
JPWO2002057011A1 (ja) 脱水剤及びそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品
JP4568035B2 (ja) 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
JP2010100583A (ja) 脂質代謝改善剤
JP3557287B2 (ja) 耐熱性非還元性糖質生成酵素とその製造方法並びに用途
JP5255603B2 (ja) 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
CN108025019A (zh) 血糖值升高抑制剂及含其的经口组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant