ES2599362T3 - Alfa-glucano ramificado y uso del mismo - Google Patents

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ES2599362T3 ES08740806.8T ES08740806T ES2599362T3 ES 2599362 T3 ES2599362 T3 ES 2599362T3 ES 08740806 T ES08740806 T ES 08740806T ES 2599362 T3 ES2599362 T3 ES 2599362T3
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Takuo Yamamoto
Tomoyuki Nishimoto
Keiji Tsusaki
Kazuyuki Oku
Hiroto Chaen
Shigeharu Fukuda
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Hayashibara Co Ltd
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Abstract

A α-glucano ramificado, que está formado por moléculas de glucosa y se caracteriza mediante análisis de metilación del siguiente modo: (1) la relación entre 2,3,6-trimetil-1,4,5-triacetil-glucitol y 2,3,4-trimetil-1,5,6-triacetil-glucitol está en el intervalo de 1:0,6 a 1:4; (2) el contenido total de 2,3,6-trimetil-1,4,5-triacetil-glucitol y 2,3,4-trimetil-1,5,6-triacetil-glucitol es del 60 % o más en el los glucitol acetatos parcialmente metilados; (3) el contenido de 2,4,6-trimetil-1,3,5-triacetil-glucitol es de 0,5 % o más, pero inferior al 10 % en los glucitol acetatos parcialmente metilados; y (4) el contenido de 2,4-dimetil-1,3,5,6-tetraacetil-glucitol es de 0,5 % o más en los glucitol acetatos parcialmente metilados.

Description

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El α-glucano ramificado de la presente invención se caracteriza por que la isomaltosa se forma, por lo general, en una cantidad de 25 % (p/p) o más, pero menos de 50 % (p/p), en una base de sólido seco del hidrolizado, cuando la isomaltodextranasa (CE 3.2.1.94), que es una enzima capaz de hidrolizar los enlaces α-1,2, α-1,3, α-1,4, y α–1,6 en cuanto a que el enlace es adyacente al lateral terminal reductor de la estructura de la isomaltosa en un glucano, se
5 deja actuar sobre el α-glucano ramificado de la presente invención.
El α-glucano ramificado de la presente invención se caracteriza por que el contenido de WSDF es, por lo general, del 40 % (p/p) o superior cuando la WSDF se cuantifica de acuerdo con el método descrito en la Sección 8, Dietary fiber, (2) la cromatografía de líquidos de alta resolución (método enzima-HPLC), "Methods for analyzing nutritional components (Apéndice 1–3 de Nutrition Labeling Standard) en Nutrition Labeling Standard (notificación n.º 146 del Ministerio de Salud, trabajo y bienestar, 1986) ". El esquema del método de cromatografía de líquidos de alta resolución anterior (en adelante en el presente documento, abreviado como "Método enzima-HPLC") es el siguiente: Una muestra se hidroliza por una serie de tratamientos enzimáticos usando una α-amilasa, proteasa y amiloglucosidasa (glucoamilasa) termoestable. A continuación, las proteínas, los ácidos orgánicos y las sales
15 inorgánicas se eliminan de la mezcla tratada con enzimas resultante utilizando resinas de intercambio iónico para hacer una solución de muestra para la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Sucesivamente, la solución de muestra se somete a HPLC de filtración en gel para medir áreas del pico del glucano y la glucosa no digeridos en el cromatograma HPLC. Después, el contenido de WSDF de la muestra se calcula en base a las áreas de los picos y la cantidad de glucosa en la solución de muestra, determinado por separado mediante el método de oxidasa-peroxidasa de glucosa convencional. El método enzima-HPLC también se explica con detalle en los Experimentos descritos más adelante.
Como se muestra en el Experimento 9 descrito más adelante, el α-glucano ramificado de la presente invención apenas es digerido por la α-amilasa salival, la α-amilasa del páncreas y la α-glucosidasa del intestino delgado
25 cuando se ingiere por vía oral. En consecuencia, el α-glucano ramificado de la presente invención se puede utilizar como un WSDF bajo en calorías con una digestibilidad baja, que no estimula la rápida elevación del nivel de azúcar en sangre y la secreción de insulina. Además, el α-glucano ramificado tiene las características de no inducir la fermentación ácida por los microorganismos en la boca y la inhibición de la formación de glucanos insolubles, que es una causa de la placa dental cuando se utiliza junto con la sacarosa. Por lo tanto, el α-glucano ramificado de la presente invención se puede utilizar ventajosamente como un sacárido de anti-cariogénico o de baja actividad cariogénica. Además, el α-glucano ramificado de la presente invención no muestra toxicidad en el ensayo de toxicidad aguda usando ratones.
Como se muestra en los experimentos 20 y 21 descritos más adelante, ya que el α-glucano ramificado de la
35 presente invención inhibe la elevación del nivel de azúcar en sangre y el nivel de insulina cuando se ingiere, junto con una sustancia amilácea, en comparación con el caso de la ingestión de una sustancia amilácea solo, se puede utilizar como agente para inhibir la elevación del nivel de azúcar en sangre.
Como se muestra en el experimento 22 descrito más adelante, ya que el α-glucano ramificado de la presente invención inhibe la acumulación excesiva de lípidos en los cuerpos vivos, que puede usarse como agente para disminuir los lípidos en los cuerpos vivos.
En los casos de uso del α-glucano ramificado como el agente anterior para la inhibición de la elevación del nivel de azúcar en sangre o para la reducción de los lípidos en los cuerpos vivos, el α-glucano ramificado con un contenido
45 relativamente alto WSDF es preferible para ejercer los efectos. Por lo tanto, es preferible que el contenido de WSDF del α-glucano ramificado sea, por lo general, 40 % (p/p) o superior, de manera deseable, 50 % (p/p) o superior, más deseablemente, 60 % (p/p) o mayor.
La “α-glucosiltransferasa", como se hace referencia en la presente divulgación, significa cualquier enzima que actúa sobre la maltosa y/o el α-1,4 glucano que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior como sustrato y que forma α-glucano ramificado de la presente invención mediante la catálisis de la transferencia de glucosilo sin acción hidrolítica sustancial. La α-glucosiltransferasa de la presente divulgación es diferente de la α-glucosidasa conocida de hongos y dextrina-dextranasa del género Acetobacter en las características de mostrar actividad hidrolítica débil y actividad de transferencia eficiente en una concentración del sustrato baja y alta sin depender de la
55 concentración del sustrato y de la formación de los enlaces α–1,3 y α–1,3,6.
La actividad enzimática de la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación puede analizarse del siguiente modo: se prepara una solución de sustrato disolviendo maltosa en tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) para dar una concentración final de 1 % (p/v). se añade 0,5 ml de una solución de enzima a 5 ml de la solución del sustrato, y se incuba la solución de la mezcla a 40 ºC durante 30 minutos. Después de la reacción, 0,5 ml de la mezcla de reacción se mezclan con 5 ml de tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0) y se llevan a ebullición durante 10 minutos para detener la reacción. Sucesivamente, la cantidad de glucosa en la solución se mide por el método de la glucosa oxidasaperoxidasa de acuerdo con el método convencional y se calcula la cantidad de glucosa formada en la mezcla de reacción. Una unidad de la actividad α-glucosiltransferasa se define como la cantidad de enzima que forma un µmol
65 de glucosa por minuto en las condiciones anteriores.
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<C: Propiedades fisiológicas>
Prueba VP
Negativa
Formación de indol
Negativa
Formación de dihidroxilacetona
Negativa
Hidrólisis de almidón
Positiva
Formación de pigmentos
No forma pigmentos solubles
Ureasa
Negativa
Oxidasa
Negativa
Catalasa
Positiva
Intervalo de crecimiento
pH: de 5,5 a 10,0, temperatura: de15 a 37 °C
Formación de ácidos a partir de D-glucosa
Positiva
Formación de ácidos a partir de D-glucosa
Negativa
Utilización de ácido cítrico
Positiva
Descomposición de tirosina
Negativa
Desaminación de fenilalanina
Negativa
Reducción de nitrato
Positiva
Requisitos de oxígeno
Aerobia
Crecimiento en presencia de lisozima
Positivo
% en moles de guanina (G) más citosina (C) de ADN
53,4 %
Tabla 2
<A: Morfología>
Características de las células cuando se incuban a 27 ºC en agar nutriente
Existentes normalmente en forma de cocos o bacilos de 0,4 x 1,0 a 0,6 x 3,0 µm
Exhiben polimorfismo que muestra ciclo de bacilo-coco (fase temprana: forma de bacilo, fase tardía: forma de bacilo corto o coco), no poseen motilidad, forman esporas, grampositivos
<B: Propiedad de cultivo>
Características de las colonias formadas cuando se incuban a 27 ºC en placas con agar nutriente
Forma*
Colonia circular con un diámetro de 1 a 2 mm tras 2 días de incubación
Borde
Todo
Proyección
Semilenticular
Brillo
Brillo húmedo
Superficie
Lisa
Color
Translúcido, maíz
Características de las colonias formadas cuando se incuban a 27 ºC en cultivo inclinado con agar nutriente
Crecimiento
Medio
Forma*
Homogénea
Características de las colonias formadas cuando se incuban a 27 ºC en cultivo por picadura con gelatina nutriente
No licuado
<C: Propiedades fisiológicas>
Requisitos de oxígeno
Aerobia
Diaminoácido mayoritario en la pared celular
Lisina
Peptidoglucano
Lisina, alanina
Tipo N-acilo de la pared celular
Acetilo
Componentes de azúcar mayoritarios que construyen la pared celular
D–Galactosa, D–Glucosa
Catalasa
Positivo
ADNasa extracelular
Positivo
Hidrólisis de almidón
Positivo
Requisito de vitamina
Negativa
Homología del ARNr 16S con el del cultivo de tipo Arthrobacter globiformis (DSM20124)
97 %
5 Las propiedades bacteriológicas anteriores de las cepas PP710 y PP349 se compararon con las de los microorganismos conocidos con referencia a "Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2 (1986) " y "Ribosomal Database (URL:http://rdp. cme. msu. edu/index. jsp). Como resultado, se reveló que las cepas PP710 y
PP349 se identificaron, respectivamente, como Bacillus circulans y Arthrobacter globifomis. Basándose en estos resultados, los presentes inventores nombraron las dos cepas como "Bacillus circulans PP710" y "Arthrobacter globiformis PP349", y los depositaron el 1 de febrero de 2006, en Patent Organism, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1–1, Higashi 1–Chome Tsukuba–shi, Ibaraki–ken
5 Japón, y aceptados bajo los números de acceso FERM BP-10771 y FERM BP-10770, respectivamente. Los microorganismos capaces de producir la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación incluyen las cepas anteriores y sus mutantes capaces de producir la enzima en gran cantidad, que son obtenibles mediante inducción de mutaciones en las cepas anteriores y la detección selectiva de mutantes hiperproductores de enzimas.
Se puede utilizar cualquier medio de cultivo nutriente para el cultivo de cualquier microorganismo capaz de producir la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación, siempre que pueda crecer en el mismo y producir la αglucosiltransferasa: Por ejemplo, los medios de cultivo naturales y sintéticos pueden utilizarse como medios de cultivo nutrientes. Se puede usar cualquier fuente de carbono siempre que sea utilizado por los microorganismos: Ejemplos de tales fuentes de carbono son sacáridos tales como almidón y fitoglucógeno, obtenible a partir de
15 plantas; glucógeno y pululano, obtenibles a partir de animales y microorganismos; hidrolizados de los mismos, jarabes de glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, y sacáridos; y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico y ácido succínico. Las concentraciones de estas fuentes de carbono en medio de cultivo nutriente se eligen apropiadamente. Las fuentes de nitrógeno utilizables en la presente divulgación son, por ejemplo, compuestos de nitrógeno inorgánico, tales como sales de amonio y nitratos; compuestos de nitrógeno orgánico tales como urea, licor de macerado de maíz, caseína, peptona, extracto de levadura y extracto de carne. Los ingredientes inorgánicos utilizables en la divulgación son, por ejemplo, sales de calcio, sales de magnesio, sales de potasio, sales de sodio, fosfatos, sales de manganeso, sales de cinc, sales de hierro, sales de cobre, sales de molibdeno, y sales de cobalto. Si es necesario, se pueden usar adecuadamente aminoácidos y vitaminas.
25 Los microorganismos capaces de producir la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación se cultivan en condiciones aerobias, por lo general, a una temperatura en el intervalo de 15 a 37 ºC y a un pH en el intervalo de 5,5 a 10, preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 20 a 34 ºC y a un pH en el intervalo de 5,5 a 8,5. El tiempo de cultivo se establece en un tiempo más largo que el requerido para el crecimiento de los microorganismos, preferentemente de 10 a 150 horas. La concentración de oxígeno disuelto no se limita específicamente, pero, por lo general, es de 0,5 a 20 ppm. La concentración de oxígeno disuelto se puede mantener dentro del intervalo anterior mediante el control de la aireación y agitación. El cultivo puede llevarse a cabo por lotes o de manera continua.
Después de cultivar los microorganismos capaces de producir el α-glucosiltransferasa de acuerdo con el método descrito anteriormente, se recupera el cultivo que contiene la enzima de la presente divulgación. La principal 35 actividad de la α-glucosiltransferasa se encuentra en el sobrenadante libre de células en ambos casos de Bacillus circulans PP710, FERM BP–10771 y Arthrobacter globiformis PP349, FERM BP–10770. Tanto el sobrenadante libre de células como el caldo de cultivo se pueden utilizar como una preparación de enzima en bruto. Se pueden usar métodos de separación líquido-sólido convencionales para eliminar las células del cultivo. Por ejemplo, los métodos para centrifugar directamente el cultivo resultante, así como aquellos para filtrar el cultivo con filtros recubiertos previamente o para separar las células por filtración de membrana utilizando filtros planos o fibras huecas se pueden usar adecuadamente. Mientras que los sobrenadantes libres de células obtenidos de este modo se pueden usar intactos como una solución de enzima bruta, pueden concentrarse antes de su uso. Los métodos de concentración que puedan utilizarse en la divulgación son, por ejemplo, desplazamiento salino con sulfato de amonio, sedimentación utilizando acetona o alcohol, y concentración usando membranas, tales como filtros planos y fibras
45 huecas.
La α-glucosiltransferasa puede someterse a la inmovilización convencional usando sobrenadantes libres de células y sus concentrados. Los ejemplos de tales métodos convencionales son métodos de conjugación que usan intercambiadores iónicos, enlaces covalentes y adsorciones utilizando resinas y membranas, y los métodos de inclusión que utilizan sustancias de peso molecular alto.
Como se ha descrito anteriormente, se puede usar una solución de enzima en bruto intacta después de concentrarla como la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación. Si es necesario, la enzima se puede usar ventajosamente después de la separación o la purificación de la solución de enzima bruta mediante métodos convencionales 55 adecuados usados en el material, por ejemplo, desplazamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, electroforesis preparativa, etc.
El α–1,4 glucano que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior, que puede usarse como un sustrato para la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación incluye almidón, amilosa, amilopectina, glucógeno y sus hidrolizados parciales tales como amilodextrinas, maltodextrinas, maltooligosacáridos, que se pueden obtener mediante hidrólisis parcial con amilasas y ácidos. Los hidrolizados parciales que se pueden obtener por hidrólisis de almidón, amilosa, amilopectina y glucógeno mediante el uso de amilasa, tal como α-amilasa (EC 3.2.1.1), β-amilasa, (EC 3.2.1,2), amilasa formadora de maltotetraosa (EC 3,2.1,60), amilasa formadora de maltopentaosa, amilasa formadora de maltohexaosa (EC3,2.1,98), ciclomaltodextrina glucanotransferasa (EC 2,4.1,19, en lo sucesivo en el 65 presente documento abreviado como "CGTasa" en esta memoria descriptiva), etc., descritos en "Handbook of Amylases and Related Enzymes" publicado por Pergamon Press Inc., (Tokio), 1988; se pueden usar como los
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Cien mililitros de la preparación de α-glucosiltransferasa, obtenida en el Experimento 2-1, se utilizó como una solución de enzima. "PINEDEX® #100", un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, se mezcló con la solución de enzima para dar una concentración final de 30 % (p/v), seguido de la reacción enzimática a 40 ºC durante 72 horas, y después se calentó a aproximadamente 100 ºC
5 durante 10 minutos para detener la reacción. Después de eliminar las sustancias insolubles resultantes por filtración, el filtrado se decoloró y se sometió a desplazamiento salino usando "DIAION™ SK–1B" y "DIAION™ WA30", resinas de intercambio iónico comercializadas por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japón, y "IRA 411", una resina de intercambio aniónico comercializada por Organo Corporation, Tokio, Japón. La solución resultante se filtró y se concentró usando un evaporador, y se obtuvo una solución de glucano al 30 % (p/p) con un rendimiento de 83,6 %, sobre una base de sólido seco, del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato.
En los siguientes experimentos 3 y 4, los glucanos, obtenidos en los experimentos 1-2 y 2-2, se denominaron "glucano A" y "glucano B", respectivamente, para distinguirlos.
15 Experimento 3
Evaluación del glucano A y B como WSDF
De acuerdo con el método descrito en la Sección 8, Dietary fiber, (2) cromatografía de líquidos de alta resolución (método enzima-HPLC), "Methods for analyzing nutritional components (Apéndice 1–3 de Nutrition Labeling Standard) en Nutrition Labeling Standard (notificación n.º 146 del Ministerio de Salud, trabajo y bienestar,) ", el contenido de WSDF de glucanos A y B se determinó como sigue: Se usó el "KIT DE CONTROL DE LA FIBRA DE LA DIETA, VALORACIÓN TOTAL", un kit para determinar la cantidad total de la fibra de la dieta, comercializado por Sigma-Aldrich Japón, como kit para tratamientos enzimáticos. "PINEDEX® z100", como control 1 se usó un
25 hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, que se utiliza para la preparación de glucanos A y B como sustrato. "PINEFIBER®", un glucano poco digerible disponible en el mercado comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, se utilizó como control 2.
<Preparación de la solución de muestra para análisis>
A un tubo de ensayo se tomaron muestras de 0,1 g de sólido seco de cada glucano y después se mezclaron con 5 ml de tampón de fosfato de sodio 0,08 M para ajustar el pH a 6,0. Sucesivamente, se mezclaron 0,01 ml de una solución de α-amilasa termoestable (que deriva de Bacillus licheniformis y comercializada por Sigma-Aldrich Japón), unida al kit, con la solución anterior y, a continuación, el tubo que contenía la mezcla se envolvió con papel de 35 aluminio y a ello le siguió la reacción enzimática en un baño de agua en ebullición con agitación a intervalos de 5 minutos durante 30 minutos. Después de la reacción, la mezcla de reacción se enfrió y se ajustó el pH a 7,5 añadiendo 1 ml de la solución de hidróxido sódico 0,275 M. La solución resultante se mezcló adicionalmente con 0,01 ml de una solución de proteasa (que deriva de Bacillus licheniformis y comercializada por Sigma-Aldrich Japón), unida al kit, y, a continuación, el tubo que contenía la mezcla se envolvió con papel de aluminio, y a ello le siguió la reacción enzimática en un baño de agua con agitación a 60 ºC durante 30 minutos, y después se enfrió. Después de ajustar el pH de la solución resultante después del tratamiento con la proteasa a 4,3 mediante la adición de aproximadamente 1 ml de solución de ácido clorhídrico 0,325 M, la solución resultante se mezcló adicionalmente con 0,01 ml de la solución de amiloglucosidasa (que deriva de Aspergillus niger y comercializada por Sigma-Aldrich Japón), unida al kit, y, a continuación, el tubo que contenía la mezcla se envolvió con papel de aluminio, y a ello le
45 siguió la reacción enzimática en un baño de agua con agitación a 60 ºC durante 30 minutos, y después se enfrió. Sucesivamente, se sometieron aproximadamente 7 ml de la mezcla de reacción resultante a una columna de intercambio iónico, que se prepara mediante la mezcla de "AMBERLITE ™ IRA-67" (forma OH) y "AMBERLITE™ 200CT" (forma H), ambos comercializados por Organo Corporation, Tokio, Japón, en una proporción de 1:1, se eluyó a 1,0 SV para el desplazamiento salino y se eluyó adicionalmente con un volumen de aproximadamente 3 veces de agua desionizada, y después se cargó hasta el volumen total de aproximadamente 28 ml. El eluato se concentró usando un evaporador, se filtró utilizando un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm y después se cargó hasta 25 ml para convertirlo en una solución de muestra para el análisis.
<Condiciones de la cromatografía de líquidos de alta resolución>
55 La solución de la muestra de ensayo, obtenida mediante el método descrito anteriormente, se sometió a una cromatografía de líquidos de alta resolución en las siguientes condiciones:
Columna: "TSK gel™ G2500PWXL" (DI 7,8 mm x longitud 300 mm), producido por Tosoh Corporation, Tokio, Japón; dos columnas se conectaron en serie Eluyente: Agua desionizada Concentración de sacárido de la muestra de ensayo: 0,8 % (p/p) Temperatura de la columna: 80 °C Caudal: 0,5 ml/min
65 Detector: Detector del índice de refracción Inyección: 20 µl
Tiempo para el análisis: 50 minutos
<Cálculo del contenido de la fibra dietética en las muestras de ensayo>
5 En el cromatograma obtenido por la HPLC anterior, el glucano no digerido que permaneció después de los tratamientos enzimáticos se supuso que era WSDF. Se midieron las áreas de los picos de la WSDF y la glucosa formadas por la digestión, respectivamente. Por separado, la cantidad de glucosa en la muestra de ensayo se determinó por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa convencional. Utilizando los valores de las áreas de los picos anteriores y la cantidad de glucosa, la cantidad de la WSDF se calculó mediante la siguiente fórmula 1.
10 Después, el contenido de WSDF en la muestra de ensayo se calculó mediante la siguiente fórmula 2.
Fórmula 1
La cantidad de WSDF* (mg)
15 = {(el área del pico de WSDF) /(el área del pico de glucosa) } x (La cantidad de glucosa en la solución de la muestra de ensayo) **(mg)
*: Fibra de la dieta hidrosoluble 20 **: Concentración de glucosa en la solución de la muestra de ensayo (mg/ml) x 25 ml
Fórmula 2
La cantidad de WSDF* (%, p/p) 25 = {(La cantidad de WSDF en la muestra de ensayo) (mg) /(La cantidad de la muestra de ensayo) (mg) } x 100
El contenido de WSDF de los glucanos A y B, calculado por el método enzima-HPLC anterior fue del 42,1 % (p/p) y 41,8 % (p/p), respectivamente. Mientras, en el caso del hidrolizado parcial de almidón, control 1, se hidrolizó 30 completamente en glucosa mediante los tratamientos enzimáticos y se estimó que el contenido de WSDF del hidrolizado parcial de almidón que era cero % (p/p). El de "PINEFIBER®", una dextrina poco digerible comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, Control 2, se estimó en 48,7 % (p/p). Estos resultados indican que un glucano que muestra el contenido de WSDF casi igual con una dextrina poco digerible comercial se puede preparar fácilmente permitiendo que la α-glucosiltransferasa de la presente invención
35 actúe sobre un hidrolizado parcial de almidón, que no comprende WSDF, como sustrato.
Experimento 4
Análisis estructurales de los glucanos A y B 40 Experimento 4-1
Análisis de la metilación
45 Según el método convencional, los glucanos A y B, obtenidos respectivamente en los experimentos 1-2 y 2-2, se sometieron a análisis de la metilación y los productos parcialmente metilados resultantes se sometieron a la cromatografía de gases en las siguientes condiciones, y los resultados se exponen en la Tabla 3.
<Condiciones para la cromatografía de gases>
50 Columna: "DB–15" (DI 0,25 mm x longitud 30 m, espesor de la película 1 µm), una columna capilar producida por J&W Scientific, Tokio, Japón; Gas portador: Helio Temperatura de la columna: se mantuvo a 130 °C durante 2 minutos, se calentó a 250 ºC a una velocidad de 5
55 ºC/min, y después se mantuvo a 250 ºC durante 20 minutos Caudal: 1,0 ml/min Detector: FID Inyección: 3 µl (división: 1/30) Tiempo para el análisis: 46 minutos
60
Tabla 3
Producto metilado parcialmente
Glc correspondiente** Composición (área del pico en %)
Hidrolizado parcial de almidón* (Material)
Glucano A Glucano B
Producto 2,3,4,6– tetrametilado
Glc terminal no reductora 5,8 10,1 9,8
Producto 3,4,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,2 0,0 0,0 0,0
Producto 2,4,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,3 0,0 1,1 0,9
Producto 2,3,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,4 89,8 51,5 49,1
Producto 2,3,4–trimetilado
Glc que implica enlace 1,6 0,0 32,2 33,9
Producto 2,4-dimetilado
Glc que implica enlace 1,3,6 0,0 0,8 1,1
Producto 2,3-dimetilado
Glc que implica enlace 1,4,6 4,4 4,5 5,2
*: PINEDEX® #100, un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd. **: Resto de glucosa Glucano A: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa de la cepa PP710 Glucano B: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa de la cepa PP349
Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 3, en ambos casos de los glucanos A y B, el producto 2,3,6trimetilado se redujo significativamente y el producto 2,3,4-trimetilado aumentó significativamente a 30 % o más en 5 comparación con los resultados de análisis de la metilación de los glucanos A y B, que se prepararon, respectivamente, utilizando α-glucosiltransferasa derivada de Bacillus cruculans PP710 y Arthrobacter globiformis PP349; y los del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. Estos resultados indican que el hidrolizado parcial de almidón que tiene una estructura de polimerización de glucosas principalmente a través de enlaces α-1,4 se convierte en el α-glucano ramificado que tiene 30 % o más de enlaces α–1,6 mediante la reacción de α10 glucosiltrasferasa de Bacillus circulans PP710 y Arthrobacter globiformis PP349. También se reveló que los extremos no reductores, los enlaces α-11,3 y los enlaces α–1,3,6, se formaron recientemente debido a que el producto 2,3,4,6-tetrametilado, el producto 2,4,6-trimetilado y el producto 2,4-dimetilado también se incrementaron. El contenido del producto 2,4,6-trimetilado y el producto de 2,4-dimetilado en los productos parcialmente metilados del glucano A fueron 1,1 % y 0,8 %, respectivamente. El contenido del producto 2,4,6-trimetilado y el producto de 15 2,4-dimetilado en los productos parcialmente metilados del glucano B fueron 0,9 % y 1,1 %, respectivamente. Además, se consideró que el contenido del enlace α-1,4,6, que está inherentemente presente en el sustrato como un punto ramificado, no estaba tan cambiado porque los contenidos de producto 2,3-dimetilado en los productos parcialmente metilados de los glucanos A y B no eran tan diferentes a los del sustrato. A partir de estos resultados, se reveló que los glucanos A y B eran un glucano ramificado (α-glucano ramificado) que tiene enlaces α–1,4 y
20 enlaces α–1,6 como enlace glucosídico mayoritario y enlace α-1,3 y enlace α-1,3,6 como menor enlace glucosídico minoritario diferente del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. También se reveló a partir de sus espectros de RMN de 1H obtenidos mediante análisis de RMN que todas las formas anoméricas de la posición C-1 de la glucosa, que constituyen los glucanos A y B, estaban en la forma α.
25 Experimento 4-2
Digestión con isomaltodextranasa del α-glucano ramificado A y B
Con el fin de caracterizar las estructuras de los α–glucanos ramificados A y B, se llevó a cabo la digestión de las
30 mismas con isomaltodextranasa. Una solución acuosa del α-glucano ramificado A o B con una concentración final de 1 % (p/v) se mezcló con 100 unidades/g de sustrato sólido de isomaltodextranasa, derivados de Arthrobacter globiformis y se preparó en Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón; y le siguió la reacción enzimática a pH 5,0 y 50 ºC durante 16 horas. Después de detener la reacción, manteniendo a 100 ºC durante 10 minutos, la composición de sacáridos en la mezcla de reacción resultante se determinó usando cromatografía de
35 líquidos de alta resolución (en adelante en el presente documento, abreviado como "HPLC") y cromatografía de gases (en adelante en el presente documento, abreviado como "GC"). La HPLC se llevó a cabo en las siguientes condiciones:
<Condiciones de HPLC>
40 Columna: "MCI GEL CK04SS", producido por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japón; dos columnas se conectaron en serie
Eluyente: Agua Temperatura de la columna: 80 °C Caudal: 0,4 ml/min Detector: "RID-10A", un detector de índice de refracción producido por Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón.
5 La GC se llevó a cabo después de la conversión de los sacáridos derivados de trimetilsililo (derivados de TMS) y en las siguientes condiciones:
<Condiciones para GC>
Columna: "2 % de silicio OV-17 Chromosorb W/AW-DMS", producida por GL Science, Tokio, Japón; Temperatura de la columna: se elevó 160 ºC a 320 ºC a una velocidad de 7,5 ° C/min del gas portador: Nitrógeno Detector: FID.
Mediante la digestión con isomaltodextranasa, no se formó isomaltosa a partir del hidrolizado parcial de almidón, el
15 sustrato utilizado para la preparación de α-glucano ramificado. Por el contrario, la isomaltosa en cantidades de 28,4 % (p/p) y 27,2 % (p/p) se formó a partir α-glucano ramificado A y B, respectivamente, mediante la digestión. Estos resultados indican que el α-glucano ramificado A y B tiene una estructura de isomaltosa en cantidades de aproximadamente 28,4 % (p/p) y 27,2 % (p/p). Además, apoyan los resultados de los análisis de metilación en el Experimento 4-1, que muestran que la proporción de enlaces α–1,6 está incrementada en el α-glucano ramificado. Dado que la isomaltodextranasa tiene una especificidad de hidrolizar el enlace α-glucosídico adyacente al extremo reductor de la estructura de isomaltosa en el glucano sin distinción de enlaces αα–1,3, α–1,4, y α–1,6, no está claro con detalle cómo la isomaltosa resultante está unida a través de uno cualquiera de los enlaces anteriores.
Experimento 4-2
25 Digestión doble con α–glucosidasa/glucoamilasa del α–glucano ramificado A y B
El ensayo de digestión doble con α–glucosidasa/glucoamilasa del α–glucano ramificado A o B se llevó a cabo dejando que "TRANSGLUCOSIDASA AMANO L", α–glucosidasa de Aspergillus niger y glucoamilasa de Rhizopus sp. Actuaran simultáneamente en el α–glucano ramificado A o B. La solución acuosa que contiene α-glucano ramificado A o B se mezcló con 5.000 unidades/g de sustrato sólido de α-glucosidasa y 100 unidades/g de sustrato sólido de glucoamilasa y a ello le siguió la reacción enzimática a pH 5,5 y 50 ºC durante 16 horas. Después de detener la reacción manteniendo la mezcla de reacción a 100 ºC durante 10 minutos, la composición de sacáridos de la mezcla de reacción se analizó por HPLC en las mismas condiciones en el Experimento 4-2. Como resultado,
35 los α-glucanos ramificados A y B se hidrolizaron sustancialmente en glucosa como en el caso del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato para la preparación de los α-glucanos ramificados. Estos resultados indican que el α-glucano ramificado tanto A como B son α-glucanos construidos por moléculas de glucosa como azúcar componente.
Experimento 4-4
Análisis de la distribución del peso molecular
Las distribuciones de peso molecular de los α-glucanos ramificados A y B se analizaron mediante la HPLC de 45 filtración en gel convencional. La HPLC de filtración en gel se llevó a cabo mediante las siguientes condiciones:
<Condiciones de HPLC de filtración de gel>
Columna: "TSK GEL α–M”, producido por Tosoh Corporation, Tokio, Japón; dos columnas se conectaron en serie Eluyente: Tampón fosfato sódico 10 mM (pH 7,0) Temperatura de la columna: 40 °C Caudal: 0,3 ml/min Detector: "RID-10A", un detector de índice de refracción producido por Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón.
55 El peso molecular de los glucanos en las muestras se calculó basándose en la curva de calibración del peso molecular preparada sometiendo al mismo análisis de HPLC de filtración en gel al "pululano estándar para medir el peso molecular", comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón. La figura 1 muestra cromatogramas comparativos de HPLC de filtración en gel de α-glucanos ramificados A y B (símbolos "b" y "c" en la Figura 1), y "PINEDEX® # 100", el hidrolizado parcial de almidón (símbolo "a" en la Figura 1) que se utiliza como sustrato para la preparación de α-glucano ramificado A y B. En la figura 1, los símbolos "A", "B", "C", "D", y "E" significan las posiciones del glucano que eluye que tiene un peso molecular de 1.000.000, 100.000, 10.000, 1.000, y 100 dalton, respectivamente. (Asimismo, en los casos de las Figuras 15 y 19 que se mencionan más adelante). Los resultados del análisis de la distribución de peso molecular de las muestras basándose en los cromatogramas de HPLC de filtración en gel se exponen en la Tabla 4.
65
Tabla 4
Datos analíticos
Hidrolizado parcial de almidón* (material) Glucano A Glucano B
Peso molecular promedio en número (Mn) (dalton)
6, 680 3.840 4.050
Peso molecular promedio en peso (Mw) (dalton)
98.890 59.000 65.700
Mw/Mn
14,8 15,4 16,2
Grado promedio de los picos de la polimerización de la glucosa
449 y 6,3 384, 22,2, 10,9, y 1 433, 22,8, 10,9, y 1
*: PINEDEX® #100, un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón Glucano A: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa de la cepa PP710 Glucano B: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa de la cepa PP349.
En el análisis de la distribución del peso molecular, el hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato se caracterizó como una mezcla de sacáridos que muestra dos picos (símbolos "1" y "2" en el cromatograma "a" en la 5 Figura 1) que corresponde al grado de polimerización de glucosa de 499 y 6,3. El α-glucano ramificado A se caracterizó como una mezcla de sacáridos que muestra cuatro picos (los símbolos "3", "4", "5" y "6" en el cromatograma "b" en la Figura 1) que corresponde al grado de polimerización de glucosa de 384, 22,2, 10,9, y 1. El α-glucano ramificado B se caracterizó como una mezcla de sacáridos que muestra cuatro picos (los símbolos "7", "8", "9", y "10" en el cromatograma "c" en la Figura 1) que corresponde al grado de polimerización de glucosa de 10 433, 22.8, 10.9, y 1. Los picos del símbolo "6" y "10" corresponden a la glucosa y los hechos que las cantidades de glucosa son bajas indican que la enzima de Bacillus criculans PP710 y Arthrobacter globiformis PP349 tiene una actividad hidrolítica relativamente débil. Como es evidente a partir de la Tabla 4, tanto el peso molecular promedio en número como el peso molecular promedio en peso del glucano A y B se redujeron a aproximadamente un 60 % de los del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato, y el glucano A y el glucano B se convirtieron en
15 moléculas con un peso molecular bajo como un todo. El valor de dividir el peso molecular promedio en peso con el peso molecular promedio en número (Mw/Mn), que es un índice de la distribución del peso molecular, no se cambió tanto entre el hidrolizado parcial de almidón, glucano A y glucano B. A partir de los resultados, se consideró que los dos alfa-glucosiltransferasas de Bacillus circulans PP710 y Arthrobacter globiformis PP349 actúan específicamente sobre los extremos no reductores del hidrolizado parcial de almidón.
20 A partir de los resultados de la Tabla 3, se reveló que, en el hidrolizado parcial de almidón usado como sustrato, aproximadamente el 90 % de los enlaces glucosídicos α–1, 4 vínculos y α-1, 4, 6 están ligeramente presentes en la molécula. Por el contrario, se reveló que, en los glucanos A y B, la proporción de enlaces alfa-1,6 con enlaces α-1,4 es significativamente alta, y el glucano A y el glucano B también tienen enlaces α1,3 y enlaces α 1,3,6, además de
25 los enlaces α–1,4,6. El α-glucano ramificado que tiene una estructura, como tal, ha sido hasta ahora desconocido.
La estructura del α-glucano ramificado de la presente invención se dedujo en base a los resultados obtenidos por el análisis de metilación. El diagrama de referencia del α-glucano ramificado se muestra en la figura. 2 junto con el del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. En la figura. 2, los símbolos "1" y "2" representan, 30 respectivamente, los diagramas de referencia del hidrolizado parcial de almidón usado como sustrato y el α-glucano ramificado. Además, en la figura 2, los símbolos "a", "b", "c", "d", "e", y "f" representan el resto de glucosa terminal no reductor, el resto de glucosa que implica el enlace α-1,3 vinculación, que implica el enlace de α-1,4, que implica el enlace α-1,6, que implica el enlace α-1,4,6, respectivamente, en el hidrolizado parcial de almidón y el α-glucano ramificado de la presente invención. Además, en los diagramas de referencia, la línea diagonal discontinua, la línea
35 continua horizontal y la línea sólida vertical, entre los restos de glucosa representan el enlace α-1,3, el enlace α-1,4, y el enlace α-1,6, respectivamente
Experimento 5
40 Preparación de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710
Se introdujo un medio de cultivo líquido consistente en 1,5 % (p/v) de "PINEDEX® # 4", un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, 0,5 % (p/v) de "POLYPEPTONE®", un extracto de levadura comercializado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japón, 0,1 45 % (p/v) de" EXTRACTO DE LEVADURA", un extracto de levadura comercializado por Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japón, 0.1 % (p/v) de fosfato dipotásico, 0,06 % (p/v) de dihidrato de fosfato de sodio, 0,05 % (p/v) de sulfato de magnesio heptahidrato, 0,001 % (p/v) de sulfato de manganeso pentahidrato, 0,001 % (p/v) de sulfato ferroso heptahidrato y agua en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml en una cantidad de 100 ml, esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos, y se enfrió. Sucesivamente, el medio de cultivo se inoculó con Bacillus
50 circulans PP710, FERM BP–10771, y seguido por el cultivo en condiciones de agitación rotatorio a 27 ºC y 230 rpm durante 48 horas para obtener un cultivo de siembra.
Aproximadamente 20 l de una preparación reciente del mismo medio de cultivo líquido tal como se utiliza en el cultivo de siembra anterior se introdujeron en un fermentador de 30 l, se esterilizaron por calentamiento, y después se enfriaron a 27 ° C y se inocularon con aproximadamente 200 ml del cultivo de siembra, a lo que le siguió el cultivo a 27 º C y a un pH de 5,5 a 8,0 durante 24 horas en condiciones de aireación-agitación. Después de completado el 5 cultivo, el caldo de cultivo resultante se destiló del fermentador y se eliminaron las células mediante centrifugación a 8000 rpm durante 20 minutos y se obtuvieron aproximadamente 18 l de sobrenadante de cultivo. Las actividades de α-glucosiltransferasa en el caldo de cultivo y el sobrenadante del cultivo se analizaron. Se detectaron aproximadamente 2,7 unidades/ml y aproximadamente 2,6 unidades/ml de las actividades enzimáticas en el caldo de cultivo y el sobrenadante de cultivo, respectivamente. Se reveló que gran parte de la α-glucosiltransferasa de la
10 presente invención, producido por Bacillus circulans PP710, se secretó extracelularmente.
Experimento 6
Purificación de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710
15 Aproximadamente cuatro litros (actividad total: aproximadamente 1.400 unidades) del sobrenadante del cultivo obtenido en el experimento 5 se sometió a desplazamiento salino mediante la adición de sulfato de amonio para dar, finalmente, 80 % de saturación y mediante reposo a 4 ºC durante 24 horas. Los precipitados resultantes se recogieron por centrifugación a 11.000 rpm durante 30 minutos, se disolvieron en tampón de acetato 20 mM (pH 4,5)
20 y se dializaron frente al mismo tampón para obtener aproximadamente 65 ml de una solución de enzima en bruto. La solución de enzima bruta tenía aproximadamente 74 unidades/ml (actividad total: aproximadamente 4.780 unidades) de la α-glucosiltransferasa. La solución de enzima en bruto se sometió a cromatografía en columna de intercambio catiónico utilizando 70 ml de gel "CM Toyopearl 650S ™", un gel de intercambio catiónico comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La actividad α-glucosiltransferasa se adsorbió sobre el gel "CM–TOYOPEARL™ 650S”
25 pre-equilibrado con tampón de acetato 20 mM (pH 4,5) y se eluyó a aproximadamente 0,4 M de cloruro de sodio cuando la elución se llevó a cabo con un gradiente lineal de cero a 0,5 M de cloruro de sodio. Las fracciones activas se recogieron y se mezclaron con sulfato de amonio para dar una concentración final de 1 M, y después se dejaron reposar a 4 ºC durante 24 horas. La solución enzimática se centrifugó para eliminar los precipitados y se sometió a cromatografía en columna hidrófoba usando 9 ml de gel "BUTYL–TOYOPEARL™ 650M", un gel comercializado por
30 Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La actividad α-glucosiltransferasa se adsorbió sobre gel "BUTYL–TOYOPEARL™ 650M" pre equilibrado con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contiene 1 M de sulfato de amonio y cuando se eluyó con un gradiente lineal decreciente de 1 M a cero M de amonio sulfato, la actividad enzimática eluyó a aproximadamente 0,2 M de sulfato de amonio. Se recogieron las fracciones activas, se dializaron frente a tampón acetato 20 mM (pH 4,5), y se sometieron a cromatografía en columna de intercambio catiónico utilizando 3,3 ml de
35 gel "CM–5PW™", un gel comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La actividad α-glucosiltransferasa se adsorbió sobre el gel "CM–5PW™” pre-equilibrado con tampón de acetato 20 mM (pH 4,5) y cuando eluyó a con un gradiente lineal de cero a 1 M de cloruro de sodio, la actividad enzimática eluyó a aproximadamente 0,4 M de cloruro de sodio. Las fracciones activas se recogieron y dializaron frente a tampón de acetato 20 mM (pH 6,0). La cantidad de actividad enzimática, la actividad específica y el rendimiento de la α-glucosiltransferasa en cada etapa de
40 purificación se encuentran en la Tabla 5.
Tabla 5
Etapa de purificación
Actividad de α– Glucosil–transferasa (unidades) Actividad específica de α–Glucosil–transferasa (unidades/mg de proteína) Rendimiento (%)
Sobrenadante del cultivo
10.400 10 100
Solución dializada después del desplazamiento salino con sulfato de amonio
4.780 22,8 46,0
Eluato de la cromatografía de columna de intercambio iónico
3.960 265 38,1
Eluato de la cromatografía en columna hidrofóbica
3.800 307 36,5
Eluato de la cromatografía de columna de intercambio iónico
3.300 327 31,7
La preparación de enzima purificada finalmente de la α-glucosiltransferasa se analizó para determinar la pureza por 45 electroforesis en gel usando un gradiente de 5-20 % (p/v) en gel de poliacrilamida y se detectó en el gel como una única banda de proteína, es decir, una preparación de alta pureza.
Experimento 7
50 Propiedades de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710 Experimento 7-1
Peso molecular
La preparación de enzima purificada de la α-glucosiltransferasa, obtenida por el método del Experimento 6, se sometió a SDS-PAGE (un gradiente en gel de 5 a 20 % (p v) ) y el peso molecular de la enzima se midió en 5 comparación con los marcadores del peso molecular, comercializados por Bio-Rad Japan, Tokio, Japón. Se reveló que la α-glucosiltransferasa tiene un peso molecular de 90.000 ± 10.000 dalton.
Experimento 7-2
10 Temperatura óptima y el pH óptimo para la reacción enzimática
Los efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima se investigaron mediante la preparación de la enzima purificada de la α-glucosiltransferasa, obtenida por el método del Experimento 6, mediante la variación de la temperatura y el pH en el ensayo de la enzima. Los resultados están en la figura 3 (temperatura óptima) y la figura 4
15 (pH óptimo), respectivamente. Se reveló que la temperatura óptima de la α-glucosiltransferasa fue de 50 a 55 ºC cuando se hizo reaccionar a pH 6,0 durante 30 minutos y el pH óptimo fue de 5,0 a 6,3 cuando se hizo reaccionar a 40 ºC durante 30 minutos.
Experimento 7-3
20 Estabilidades térmicas y al pH de la enzima
La estabilidad térmica y la estabilidad al pH de la enzima se investigaron usando la preparación de enzima purificada de la α-glucosiltransferasa, obtenida por el método del Experimento 6. La estabilidad térmica de la enzima se 25 determinó mediante las etapas de incubar una solución de enzima (tampón de acetato 20 mM, pH 6,0) a diversas temperaturas durante 60 minutos, enfriar en agua, y medir actividad enzimática residual. La estabilidad al pH de la enzima se determinó mediante las etapas de incubar solución de enzima en tampón 20 mM a diversos valores de pH, y a 4 ºC durante 24 horas, ajustando el pH a 6,0 y midiendo la actividad enzimática residual. Los resultados están en la figura 5 (estabilidad térmica) y la figura 6 (estabilidad al pH), respectivamente. Como es evidente a partir
30 de los resultados en las figuras 5 y 6, la α-glucosiltransferasa es estable hasta 40 ºC y en el intervalo de pH 3,5 a 8,4.
Experimento 7-4
35 Efectos de iones metálicos sobre la actividad de la enzima
Efectos de iones metálicos sobre la actividad de la enzima se investigaron usando la preparación de enzima purificada de la α-glucosiltransferasa, obtenida mediante el método del Experimento 6, en presencia de 1 mM de los respectivos iones metálicos de acuerdo con el método de ensayo. Los resultados se indican en la tabla 6.
40 Tabla 6
Sal metálica
Actividad relativa (%) Sal metálica Actividad relativa (%)
Ninguna
100 MgCl2 102
CaCl2
101 MnCl2 99
CoCl2
100 NiCl2 102
CuCl2
52 ZnCl2 101
FeCl2
91 PbCl2 97
FeCl3
94 EDTA 99
HgCl2
3
Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 6, se reveló que la actividad α-glucosiltransferasa fue notablemente inhibida por iones Hg2y moderadamente por iones Cu2+, respectivamente. 45 Experimento 8
Preparación de la α-glucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP394 (FERM BP–10700)
50 A excepción de la inoculación de Arthrobacter globiformis PP349, FERM BP–10770, en lugar de Bacillus circulans PP710, FERM BP–10771, se preparó un cultivo de siembra de acuerdo con el método del Experimento 1-1.
Aproximadamente 20 l de una preparación reciente del mismo medio de cultivo líquido tal como se utiliza en el cultivo de siembra anterior se introdujeron en un fermentador de 30 l, se esterilizaron por calentamiento, y después 55 se enfriaron a 27 ° C y se inocularon con aproximadamente 200 ml del cultivo de siembra, a lo que le siguió el cultivo
a 27 º C y a un pH de 5,5 a 7,0 durante 24 horas en condiciones de aireación-agitación. Después de completado el cultivo, el caldo de cultivo resultante se destiló del fermentador y se eliminaron las células mediante centrifugación a 8000 rpm durante 20 minutos y se obtuvieron aproximadamente 18 l de sobrenadante de cultivo. Las actividades de α-glucosiltransferasa en el caldo de cultivo y el sobrenadante del cultivo se analizaron. Se detectaron
5 aproximadamente 0,36 unidades/ml y aproximadamente 0,42 unidades/ml de las actividades enzimáticas en el caldo de cultivo y el sobrenadante de cultivo, respectivamente. Se reveló que gran parte de la α-glucosiltransferasa, producida por Arthrobacter globiformis PP349, se secretó extracelularmente.
Experimento 9
10 Purificación de la α-glucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP394
Aproximadamente 18 litros (actividad total: aproximadamente 7.560 unidades) del sobrenadante del cultivo obtenido en el experimento 8 se sometió a desplazamiento salino mediante la adición de sulfato de amonio para dar, 15 finalmente, 80 % de saturación y mediante reposo a 4 ºC durante 24 horas. Los precipitados resultantes se recogieron por centrifugación a 11.000 rpm durante 30 minutos, se disolvieron en tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) y se dializaron frente al mismo tampón para obtener aproximadamente 500 ml de una solución de enzima en bruto. La solución de enzima bruta tenía aproximadamente 14 unidades/ml (actividad total: aproximadamente 7.000 unidades) de la α-glucosiltransferasa. La solución de enzima en bruto se mezcló con sulfato de amonio para dar una 20 concentración final de 2 M, se centrifugó para eliminar precipitados y después se sometió a cromatografía en columna hidrofóbica utilizando 300 ml de gel "PHENYL–TOYOPEARL™ 650M", un gel comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La actividad α-glucosiltransferasa se adsorbió sobre gel "PHENYL–TOYOPEARL™ 650M" preequilibrado con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contiene 2 M de sulfato de amonio y cuando se eluyó con un gradiente lineal decreciente de 2 M a cero M de amonio sulfato, la actividad enzimática eluyó a 25 aproximadamente 0,6 M de sulfato de amonio. Se recogieron las fracciones activas, se dializaron frente a tampón acetato 20 mM (pH 6,0), y se sometieron a cromatografía en columna de intercambio aniónico utilizando 100 ml de gel "DEAE–TOYOPEARL™ 650S", un gel comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La actividad αglucosiltransferasa se adsorbió sobre el gel "DEAE–TOYOPEARL™ 650S” pre-equilibrado con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) y cuando eluyó a con un gradiente lineal de cero a 0,5 M de cloruro de sodio, la actividad enzimática
30 eluyó a aproximadamente 0,1 M de cloruro de sodio. La cantidad de actividad enzimática, la actividad específica y el rendimiento de la α-glucosiltransferasa en cada etapa de purificación se encuentran en la Tabla 7.
Tabla 7
Etapa de purificación
Actividad de α– Glucosil–transferasa (unidades) Actividad específica de α–Glucosil– transferasa (unidades/mg de proteína) Rendimiento (%)
Sobrenadante del cultivo
7.560 1,6 100
Solución dializada después del desplazamiento salino con sulfato de amonio
7.000 5,4 92,6
Eluato de la cromatografía en columna hidrofóbica
3.870 130 54,2
Eluato de la cromatografía de columna de intercambio iónico
2.710 415 35,8
35 La preparación de enzima purificada finalmente de la α-glucosiltransferasa se analizó para determinar la pureza por electroforesis en gel usando un gradiente de 5-20 % (p/v) en gel de poliacrilamida y se detectó en el gel como una única banda de proteína, es decir, una preparación de alta pureza.
Experimento 10
40 Propiedades de la α-glucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP394
Experimento 10-1
45 Peso molecular
La preparación de enzima purificada de la α-glucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP349, obtenida por el método del Experimento 9, se sometió a SDS-PAGE (un gradiente en gel de 5 a 20 % (p v) ) y el peso molecular de la enzima se midió en comparación con los marcadores del peso molecular, comercializados por Bio-Rad Japan,
50 Tokio, Japón. Se reveló que la α-glucosiltransferasa tiene un peso molecular de 90.000 ± 10.000 dalton.
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Como es evidente a partir de los resultados de las Tablas 11 y 12, en la etapa inicial (después de una hora) de la reacción, se formaron, preferentemente, un oligosacárido cuyo grado de polimerización de glucosa es mayor en uno que el del sustrato y cuyo grado de polimerización de glucosa es inferior en uno que el del sustrato. Basándose en el hecho, se confirmó que la enzima cataliza la transglucosilación. Acompañando con el progreso de la reacción, se 5 formaron productos de reacción con diversos grados de polimerización de glucosa y el contenido de glucanos con un grado de polimerización de glucosa de 9 o más alto alcanzó el 21,1 % a las 24 horas. A partir de los resultados del análisis de metilación, se reveló que acompañando al progreso de la reacción, el contenido de resto de glucosa que implica enlace 1, 4 se disminuyó con el aumento significativo del contenido de resto de glucosa que implica enlace 1,6; y el contenido del resto de glucosa que implica enlace 1,3, que implica enlace 1,4,6 y que implica enlace 1,3,6
10 aumentaron gradualmente en los productos de reacción. También se reveló que el contenido de isomaltosa después de la digestión con isomaltodextranasa del producto de reacción se incrementó de manera significativa acompañando al progreso de la reacción. Casi los mismos resultados se obtuvieron en el caso de utilizar la αglucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP349 para los mismos ensayos.
15 A partir de los resultados de los experimentos 12-1 y 12-2, el mecanismo de reacción de la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación se estimó como sigue:
(1)
La enzima actúa sobre la maltosa y/o el α–1,4 glucano que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3
o superior como el sustrato y forma el α–1,4 glucano donde un resto de glucosa se une a través de un enlace α
20 al grupo hidroxilo en la posición C–4 o C–6 del resto de glucosa terminal no reductor (α–glucano cuyo grado de polimerización de glucosa se incrementa en uno y el α–1,4 glucano de polimerización de glucosa se disminuye en uno, principalmente transfiriendo el resto de glucosa terminal no reductor del otro α–1,4 glucano mediante transglucosilación α–1,4 o α–1,6.
(2) La enzima actúa además sobre el α-1,4 glucano, cuyo grado de polimerización de glucosa se reduce en uno,
25 formado en la etapa (1) anterior; y transfiere un resto de glucosa al grupo hidroxilo en C-4 o C-6 del resto de glucosa terminal no redactor del α-glucano cuyo grado de polimerización de glucosa se incrementa en uno, también formado en la etapa anterior (1), mediante transglucosilación intermolecular α–1, 4 o α–1, 6 para alargar la cadena de glucosa.
(3) Mediante la repetición de las reacciones en las etapas anteriores (1) y (2), la enzima forma un glucano que
30 tiene enlaces α–1,4 y α–1,6 de la maltosa y/o α-glucano que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior.
(4) Aunque la frecuencia es baja, la enzima forma un glucano que tiene enlaces α–1,3, α–1,4,6 y α–1,36, además de los enlaces α–1,4 y α–1,6 catalizando la transglucosilación α-1,3 y la transglucosilación α-1,9 o α-1,3 a los restos internos de glucosa que implican enlaces α–1,6, en el glucano
35 (5) Como resultado de la repetición de las reacciones en las etapas anteriores (1) a (4), la enzima forma el αglucano ramificado de la presente invención, donde la glucosa está unida principalmente a través de α–1,4 y α– 1,6 y que tiene enlaces α-1,3, α-1,4,6 y enlaces α-1,3,6 en una frecuencia baja.
Experimento 13 40 Reacción de transferencia de la α–glucosilo y el cambio del poder reductor de la mezcla de reacción
Se prepararon soluciones de sustrato mezclando una solución acuosa de maltosa y tampón acetato (pH 6,0), para dar concentraciones finales de 1 % o 30 % (p/v) y 20 mM, respectivamente. Sucesivamente, la solución de sustrato 45 resultante se mezcló con 4 unidades/g de sustrato sólido de la preparación purificada de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710, obtenida mediante el método del Experimento 6, seguida de la reacción de la enzima a pH 6,0 y 40 ºC. La evolución temporal de la reacción se investigó como sigue: Se extrajeron muestras de la mezcla de reacción en diversos momentos y se mantuvieron a 100 ºC durante 10 minutos para detener la reacción. La cantidad de maltosa residual en las mezclas de reacción se determinó mediante HPLC y GC descritas en el Experimento 4-2.
50 Las cantidades de sacárido reductor y el sacárido totales se determinaron mediante el método de Somogyi-Nelson y el método de antrona-ácido sulfúrico, respectivamente; y, después, se calculó el poder reductor de la mezcla de reacción usando la siguiente fórmula:
Poder reductor = 55 {(La cantidad de sacárido reductor/La cantidad de sacárido total) }x 100
Los resultados se indican en la tabla 13.
60
Tabla 13
Tiempo de reacción (h)
Concentración de maltosa
1 % (p/p)
30 % (p/p)
Cantidad de maltosa residual (%)
Poder reductor (% relativa) Cantidad de maltosa residual (%) Poder reductor (% relativa)
0
99,7 43,6 (100 %) 99,7 43,6 (100 %)
4
64,2 45,0 (103 %) 68,8 43,6 (100 %)
8
43,0 46,0 (106 %) 51,8 43,6 (100 %)
16
20,9 46,7 (107 %) 28,8 43,7 (100 %)
24
8,1 47,9 (109 %) 13,3 43,8 (101 %)
Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 13, cuando se permitió que la α-glucosiltransferasa de la presente invención actuara sobre maltosa, el poder reductor de la mezcla de reacción se aumentó ligeramente en el 5 caso de utilizar el sustrato con una concentración relativamente baja, 1 % (p/v) y no aumentó sustancialmente en el caso de utilizar el sustrato con una concentración relativamente alta, 30 % (p/v). El hecho de que el poder reductor de la mezcla de reacción aumentó solo ligeramente mayor en el caso de la concentración de sustrato relativamente baja y la cantidad de maltosa residual era de menos de 10 % significa que la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación es una enzima que cataliza de forma inherente la reacción de transferencia y casi no hidroliza el sustrato
10 durante la reacción. Casi los mismos resultados se obtuvieron en el caso de utilizar la α-glucosiltransferasa de Arthrobacter globiformis PP349 para los mismos ensayos.
Experimento 14
15 Comparación de la α-glucosiltransferasa purificada y la enzima en bruto en la formación del α-glucano ramificado
Desde el punto de vista de la producción industrial del α-glucano ramificado la enzima en bruto de la αglucosiltransferasa es preferible siempre que se pueda usar para la producción, ya que no es necesario purificar la enzima. En consecuencia, se investigó si el α-glucano ramificado que tiene características casi iguales con glucano 20 A, preparado en el Experimento 1-2, se puede obtener o no mediante el uso de la enzima en bruto de la αglucosiltransferasa de Bacillus circulans. La solución de α-glucosiltransferasa en bruto se preparó mediante las etapas de cultivo de Bacillus circulans PP710 mediante el método del Experimento 1-1, desplazamiento salino del sobrenadante del cultivo resultante con sulfato de amonio y diálisis de los precipitados resultantes contra tampón acetato 20 mM (pH 4,5). Se dejó que la solución de enzima en bruto actuara sobre "PINEDEX #100®", un 25 hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, y se obtuvo una solución de glucano con una concentración de 30 % (p/p) a partir del hidrolizado parcial de almidón como sustrato con un rendimiento de 88,2 %, sobre una base sólida seca. El α-glucano ramificado resultante se denominó "Glucano C" y se sometió al análisis de metilación. El resultado se encuentra en la Tabla 14. La distribución del peso molecular y el contenido de glucano C de WSDF, medido mediante los métodos descritos en los Experimentos 3 y 4,
30 se encuentran en la Tabla 15. En las tablas 14 y 15, los datos del hidrolizado parcial de almidón utilizado como material y glucano A preparado utilizando α-glucosiltransferasa parcialmente purificada se copiaron de las tablas 3 y 4 como datos comparativos.
Tabla 14
Producto metilado parcialmente
Glc correspondiente** Composición (área del pico en %)
Hidrolizado parcial de almidón* (material)
Glucano A Glucano C
Producto 2,3,4,6– tetrametilado
Glc terminal no reductora 5,8 10,1 16,0
Producto 3,4,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,2 0,0 0,0 0,0
Producto 2,4,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,3 0,0 1,1 3,0
Producto 2,3,6–trimetilado
Glc que implica enlace 1,4 89,8 51,5 30,0
Producto 2,3,4–trimetilado
Glc que implica enlace 1,6 0,0 32,2 40,3
Producto 2,4-dimetilado
Glc que implica enlace 1,3,6 0,0 0,8 4,8
Producto 2,3-dimetilado
Glc que implica enlace 1,4,6 4,4 4,5 5,8
*: "PINEDEX® #100", un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón. **: Resto de glucosa Glucano A: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa (enzima parcialmente purificada) de la cepa PP710 Glucano C: glucano preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa (enzima en bruto) de la cepa PP7
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imagen19
peso molecular de 58.000 ± 10.000 dalton.
Experimento 16-2
5 Temperatura y pH óptimos de la amilasa
Los efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima se investigaron mediante la preparación de la enzima purificada de la amilasa de Bacillus circulans PP710, obtenida por el método del Experimento 15-2, mediante la variación de la temperatura y el pH en el ensayo de la enzima. Los resultados están en la figura 11 (temperatura óptima) y la figura 12 (pH óptimo), respectivamente. Se reveló que la temperatura óptima de la amilasa fue de aproximadamente 55 ºC cuando se hizo reaccionar a pH 6,0 durante 30 minutos y el pH óptimo fue de aproximadamente 6,0 a 7,0 cuando se hizo reaccionar a 35 ºC durante 30 minutos.
Experimento 16-3
15 Estabilidades térmicas y al pH de la amilasa
La estabilidad térmica y la estabilidad al pH de la enzima se investigaron usando la preparación de enzima purificada de la amilasa, obtenida por el método del Experimento 15-2. La estabilidad térmica de la enzima se determinó mediante las etapas de incubar una solución de enzima (tampón de acetato 20 mM, pH 6,0 o el mismo tampón que contiene CaCl2 1 mM) a diversas temperaturas durante 60 minutos, enfriar en agua, y medir actividad enzimática residual. La estabilidad al pH de la enzima se determinó mediante las etapas de incubar la solución de enzima en tampón 20 mM a diversos valores de pH, y a 4 ºC durante 24 horas, ajustando el pH a 6,0 y midiendo la actividad enzimática residual. Los resultados están en la figura 13 (estabilidad térmica) y la figura 14 (estabilidad al pH),
25 respectivamente. Como es evidente a partir de los resultados en las figuras 13 y 14, la amilasa es estable hasta 40 ºC en ausencia de iones de calcio y hasta 50 ºC en presencia de iones de calcio 1 mM, y estable en el intervalo de pH 6,0 a 8,0.
Experimento 16-5
Especificidad de sustrato de la amilasa
La acción de la amilasa sobre varios sustratos se investigó mediante la preparación purificada de la amilasa, obtenida mediante el método del Experimento 15-2. Como resultado, se reveló que la amilasa hidroliza almidón,
35 maltosa, y α-1,4 glucano que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior, y también cataliza la transglucosilación. También se reveló que la amilasa forma ciclodextrinas a partir de almidón y formas panosa mediante hidrólisis de pululano.
Experimento 17
Preparación del α-glucano ramificado mediante el uso de α-glucosiltransferasa y la amilasa en combinación
Uso de la preparación purificada de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710, obtenida mediante el método del Experimento 6 y la preparación purificada de la amilasa, obtenida mediante el método del Experimento 45 15-2, se investigó si el glucano C en el Experimento 14, que se produjo mediante el uso de la preparación de enzima bruta de α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710, se puede producir o no. "PINEDEX® #100", un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, se disolvió en agua para dar una concentración de 30 % (p/p) y se ajustó el pH de la solución a 6,0. A la solución de sustrato, se añadieron 10 unidades/g de sólido de la preparación purificada de la α-glucosiltransferasa de Bacillus criculans PP710, obtenida mediante el método del Experimento 6; y 0,1, 0,2, 0,5 o 1,0 unidades/g de sólido de la amilasa obtenida mediante el método en 15-2, seguido de la reacción de la enzima a pH 6,0 y 40 ºC durante 72 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se llevó a ebullición durante 10 minutos para detener la reacción. Las mezclas de reacción que contienen el α-glucano ramificado, obtenido mediante las respectivas condiciones de reacción, se sometieron a HPLC de filtración en gel descrita en el Experimento 4-4 y los cromatogramas se 55 muestran en la figura 15 junto con el del hidrolizado parcial de almidón usado como sustrato. En la figura 15, el, símbolo "a" es la cromatografía de HPLC de filtración en gel del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato y los símbolos "b", "c", "d" y "e" son los de los α-glucanos ramificados obtenidos mediante el uso de 10 unidades/g de sólido de la α-glucosiltransferasa y 0,1, 0,2, 0,5, o 1,0 unidades/g de sólido de la amilasa, respectivamente. (Puesto que el cromatograma de HPLC de filtración en gel del α-glucano ramificado, que se obtiene mediante el uso de 10 unidades/g de sólido de la α-glucosiltransferasa solamente, es casi igual al del glucano A en la figura 1, se omite en la figura 15, y también en las siguientes figuras 16 a 19.) Los resultados de los análisis de la distribución del peso molecular basados en los cromatogramas de HPLC de filtración en gel y el contenido de WSDF medido mediante el método enzima-HPLC en el Experimento 3 de los α-glucanos ramificados están en la Tabla 17. Los del hidrolizado parcial de almidón se utilizan como sustrato (cero unidad/g de sólido de α
65 glucosiltransferasa, y cero unidad de amilasa) también se encuentran en la Tabla 17.
Tabla 17
Cantidad de enzima (unidad/g de sustrato)
Distribución del peso molecular de glucano Contenido de WSDF (% p/p)
α–Glucosil transferasa
Amilasa Peso molecular promedio en número (Mn) (dalton) Peso molecular promedio en peso (Mw) (dalton) Mw/Mn
0
0,0 6.670 100.340 15,0 0,0
10
0,0 5.530 97.450 17,6 41,1
10
0,1 3.235 7.799 2,4 71,5
10
0,2 3.013 6.627 2,2 73,7
10
0,5 2.789 5.894 2,1 76,7
10
1,0 2.544 5.304 2,1 76,8
Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 17, en el caso de la utilización de la α-glucosiltransferasa y la amilasa en combinación, el peso molecular del α-glucano ramificado formado se disminuyó y el contenido de WSDF 5 se incrementó de manera significativa. El peso molecular promedio en número, el peso molecular promedio en peso, y el valor de la división del peso molecular promedio en peso con el peso molecular promedio en número, Mw/Mn, del α-glucano ramificado se redujeron con el aumento de la cantidad de la amilasa. A partir de los resultados, se reveló que el intervalo de la distribución del peso molecular del α-glucano ramificado se convirtió en más estrecha con el aumento de la cantidad de la amilasa. En el caso de la utilización de 0,5 unidades/g de sólido de la amilasa, el
10 valor de Mw/Mn se disminuyó a 2,1. Además, en los casos de la utilización de 0,5 unidades /g de sólido o superior de la amilasa, el contenido de WSDF del α-glucano ramificado se alcanzó aproximadamente al 76 % (p/p) .
De los resultados, se confirmó que la disminución del peso molecular y el aumento del contenido de WSDF en el glucano C, obtenido en el Experimento 14 mediante el uso de la preparación de enzima en bruto de la α15 glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710, se produjo por la amilasa concomitante en la preparación de enzima en bruto. Se considera que la amilasa concomitante hidroliza parcialmente el hidrolizado parcial de almidón como sustrato y el α-glucano como un producto por la α-glucosiltransferasa para disminuir el peso molecular y actúa para aumentar el contenido de WSDF mediante la transferencia de grupo glucosilo al α-glucano ramificado. Además, los resultados indican que el α-glucano ramificado, que tiene un peso molecular bajo y un alto contenido de WSDF se
20 puede producir mediante el uso de la amilasa y la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación en combinación.
Experimento 18
Preparaciones del α-glucano ramificado mediante el uso de α-glucosiltransferasa y otras amilasas bien conocidas en 25 combinación
Se prepararon varias α-glucanos ramificados dejando que la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación y otras amilasas conocidas actuaran en combinación sobre el hidrolizado parcial de almidón y se investigaron las características y los contenidos de WSDF del α–glucano ramificado. Se obtuvieron resultados casi iguales en los
30 casos de utilización de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710 y de Arthrobacter globiformis PP349. Por lo tanto, en este experimento, se describieron los resultados obtenidos mediante el uso de la α-glucosiltransferasa de Bacillus circulans PP710.
Experimento 18-1
35 Preparación del α-glucano ramificado mediante el uso de α-glucosiltransferasa e isoamilasa en combinación; y distribución del peso molecular y el contenido de WSDF del α-glucano ramificado resultante
Excepto por la utilización de cero, 50, 200, 500, o 1000 unidades/g de sólido de isoamilasa de Pseudomonas
40 amyloderamosa, preparado por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón, como un sustituto de la amilasa de Bacillus circulans PP710, el α-glucano ramificado se preparó según el método del Experimento 17. Cada α-glucano ramificado, preparado mediante cada condición de reacción, se sometió a HPLC de filtración en gel en el Experimento 4-4, y el cromatograma se mostró en las figuras 16 junto con el del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. En la figura 16, el, símbolo "a" es un cromatograma de HPLC de filtración en gel del
45 hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato y los símbolos "b", "c", "d" y "e" son cromatogramas de HPLC de filtración en gel de los α-glucanos ramificados obtenidos mediante el uso de 10 unidades/g de sólido de la αglucosiltransferasa y 50, 200, 500, y 1.000 unidades/g de sólido de la isoamilasa en combinación, respectivamente. Los resultados de los análisis de la distribución de peso molecular análisis basados en los cromatogramas de HPLC de filtración en gel y el contenido de WSDF determinados mediante el método Enzima-HPLC en el Experimento 3
50 están en la Tabla 18.
Tabla 18
Cantidad de enzima (unidad/g de sustrato)
Distribución del peso molecular de glucano Contenido de WSDF (% p/p)
α–Glucosil transferasa
Isoamilasa Peso molecular promedio en número (Mn) (dalton) Peso molecular promedio en peso (Mw) (dalton) Mw/Mn
0
0
6.670 100.340 15,0 0,0
10
0 5.530 97.450 17,6 41,1
10
50 3.490 19.980 5,7 40,6
10
200 2.560 6.580 2,6 42,7
10
500 2.230 4.340 1,9 43,7
10
1.000 2.140 4.020 1,9 41,6
Como es evidente a partir del resultado en el caso de permitir que la α-glucosiltransferasa actuara solamente sobre el hidrolizado parcial de almidón en la Tabla 18, la α-glucosiltransferasa no ejerció una influencia en la distribución 5 del peso molecular del α-glucano ramificado. Sin embargo, como se desprende de los resultados de la Tabla 18 y la figura 16, tanto el peso molecular promedio en número como el peso molecular promedio en peso, y Mw/Mn, el valor de la división del peso molecular promedio en peso por el peso molecular promedio en número se redujo con el aumento de la cantidad de isoamilasa. A partir de los resultados, se reveló que el intervalo de la distribución del peso molecular del α-glucano ramificado se convirtió en más estrecha con la acción de la isoamilasa. En el caso de la
10 utilización de 1.000 unidades/g de sólido de la isoamilasa, Mw/Mn del α-glucano ramificado se redujo a 1,9 y el αglucano ramificado mostró una distribución del peso molecular con un pico en grado de polimerización de glucosa de 20,2. Mientras, el contenido de WSDF de los α-glucanos ramificados, obtenidos por las condiciones de reacción, no se vieron influidos por la cantidad de isoamilasa y eran aproximadamente de 40 a 44 % (p /p).
15 A partir de estos resultados, se reveló que el α-glucano ramificado con un peso molecular bajo puede producirse sin alterar el contenido de WSDF al permitir que la α-glucosiltransferasa de la presente invención y la isoamilasa actuaran en combinación sobre el hidrolizado parcial de almidón.
Experimento 18-2
20 Preparación del α-glucano ramificado mediante el uso de α-glucosiltransferasa y α-amilasa en combinación; y distribución del peso molecular y el contenido de WSDF del α-glucano ramificado resultante
Excepto por la utilización de cero, 0,1, 0,2, 0,5, o 1,0 unidades/g de sólido de “NEOSPITASE PK2”, una α-amilasa
25 comercializada por Nagase ChemteX Corporation, Osaka, Japón, como sustituto de isoamilasa de Pseudomonas amyloderamosa, como un sustituto de la amilasa de Bacillus circulans PP710, el α-glucano ramificado se preparó según el método del Experimento 18-º. Cada α-glucano ramificado, preparado mediante cada condición de reacción, se sometió a HPLC de filtración en gel en el Experimento 4-4, y el cromatograma se mostró en las figuras 17 junto con el del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. En la figura 17, el, símbolo "a" es un cromatograma
30 de HPLC de filtración en gel del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato y los símbolos "b", "c", "d" y "e" son cromatogramas de HPLC de filtración en gel de los α-glucanos ramificados obtenidos mediante el uso de 10 unidades/g de sólido de la α-glucosiltransferasa y 0,1, 0,2, 0,5, y 1,0 unidades/g de –amilasa en combinación, respectivamente. Los resultados de los análisis de la distribución de peso molecular análisis basados en los cromatogramas de HPLC de filtración en gel y el contenido de WSDF determinados mediante el método Enzima
35 HPLC en el Experimento 3 están en la Tabla 19.
Tabla 19
Cantidad de enzima (unidad/g de sustrato)
Distribución del peso molecular de glucano Contenido de WSDF (% p/p)
α–Glucosil transferasa
Isoamilasa Peso molecular promedio en número (Mn) (dalton) Peso molecular promedio en peso (Mw) (dalton) Mw/Mn
0
0
6.670 100.340 15,0 0,0
10
0 5.530 97.450 17,6 41,1
10
50 3.490 19.980 5,7 40,6
10
200 2.560 6.580 2,6 42,7
10
500 2.230 4.340 1,9 43,7
10
1.000 2.140 4.020 1,9 41,6
Como es evidente a partir del resultado en el caso de permitir que la α-glucosiltransferasa actuara solamente sobre
40 el hidrolizado parcial de almidón en la Tabla 18, la α-glucosiltransferasa no ejerció una influencia en la distribución del peso molecular del α-glucano ramificado. Sin embargo, como se desprende de los resultados de la Tabla 18 y la figura 16, tanto el peso molecular promedio en número como el peso molecular promedio en peso, y Mw/Mn, el valor de la división del peso molecular promedio en peso por el peso molecular promedio en número se redujo con el aumento de la cantidad de isoamilasa. A partir de los resultados, se reveló que el intervalo de la distribución del peso
45 molecular del α-glucano ramificado se convirtió en más estrecha con la acción de la isoamilasa. En el caso de la
imagen20
Experimento 18-4 Preparación del α-glucano ramificado mediante el uso de α-glucosiltransferasa isoamilasa y CGTasa en
combinación; y distribución del peso molecular y el contenido de WSDF del α-glucano ramificado resultante
5 Excepto por la adición de cero o 1,0 unidades/g de sólido de CGTasa de Bacillus stearothermophilus, al sistema de reacción en el Experimento 18-1. Cada α-glucano ramificado, preparado mediante cada condición de reacción, se sometió a HPLC de filtración en gel en el Experimento 4-4, y el cromatograma se mostró en las figuras 19 junto con el del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato. En la figura 19, el, símbolo "a" es un cromatograma de
10 HPLC de filtración en gel del hidrolizado parcial de almidón utilizado como sustrato y los símbolos "b", "c", "d" y "e" son cromatogramas de HPLC de filtración en gel de los α-glucanos ramificados obtenidos mediante el uso de 10 unidades/g de sólido y 1,0 unidad/g de sólido de la α-glucosiltransferasa y CGTasa, y 50, 200, 500, y 1.000 unidades/g de sólido de la isoamilasa en combinación, respectivamente. Los resultados de los análisis de la distribución de peso molecular análisis basados en los cromatogramas de HPLC de filtración en gel y el contenido de
15 WSDF determinados mediante el método Enzima-HPLC en el Experimento 3 están en la Tabla 21.
Tabla 21
Cantidad de enzima (unidad/g de sustrato)
Distribución del peso molecular de glucano Contenido de WSDF (% p/p)
α–Glucosil transferasa
Isoamilasa CGTasa Peso molecular promedio en número (Mn) (dalton) Peso molecular promedio en peso (Mw) (dalton) Mw/Mn
0
0
0,0 6.670 100.340 15,0 0,0
10
0 0,0 5.530 97.450 17,6 41,1
10
0 1,0 4.401 14.107 3,2 70,5
10
50 1,0 2.423 5.445 2,2 74,0
10
200 1,0 1.956 4.021 2,1 73,8
10
500 1,0 1.705 3.367 2,0 72,3
10
1000 1,0 1.601 3.086 1,9 70,6
CGTasa: ciclomaltodextrina glucanotransferasa
Como es evidente por los resultados en la figura 19 y en la Tabla 21, la relación Mw/Mn, el valor de la división del
20 peso molecular promedio en peso por el peso molecular promedio en número del α-glucano ramificado, preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa de la presente divulgación y 1,0 unidad/g de sólido de CGTasa en combinación, se disminuyó a 3,2. En el caso de la adición de 1.000 unidades/g de sólido de isoamilasa al sistema de reacción (símbolo "e" en la Figura 19), la relación Mw/Mn se redujo adicionalmente a 1,9. El contenido de WSDF en el α-glucano ramificado, preparado utilizando la α-glucosiltransferasa de la presente descripción y CGTasa en
25 combinación, se incrementó hasta aproximadamente 70 % (p/p), y los contenidos mantuvieron los valores relativamente altos mediante la adición de isoamilasa a los sistemas de reacción.
A partir de estos resultados, se reveló que el α-glucano ramificado con un peso molecular significativamente bajo y un contenido de WSDF significativamente incrementado puede producirse sin alterar el contenido de WSDF al 30 permitir que la α-glucosiltransferasa de la presente divulgación y la isoamilasa actuaran en combinación sobre el hidrolizado parcial de almidón.
Experimento 19
35 Funciones del α-glucano ramificado
El α-glucano ramificado, preparado en el Experimento 18-4 mediante el uso de 10 unidades/g de sólido de la αglucosiltransferasa, 50 unidades/g de sólido de la isoamilasa y 1,0 unidades/g de sólido de CGTasa en combinación se seleccionaron como el α-glucano ramificado con el contenido de WSDF más alto y un peso molecular
40 relativamente bajo; y se investigaron la digestibilidad, las características estructurales y las funciones del α-glucano ramificado.
Experimento 19-1
45 Purificación del α-glucano ramificado preparado mediante el uso de α-glucosiltransferasa, isoamilasa y CGTasa en combinación
Una mezcla de reacción que contiene el α-glucano ramificado se preparó mediante la misma reacción en el Experimento 18-4 usando 10 unidades/g de sólido de la α-glucosiltransferasa, 50 unidades/g de sólidos de 50 isoamilasa y 1,0 unidad/g de sólido de CGTasa en combinación. Después de eliminar las sustancias insolubles de la mezcla de reacción mediante filtración, el filtrado resultante se decoloró y se desionizó usando "DIAION™ SK–1B" y "DIAION™ WA30", ambas resinas de intercambio iónico comercializadas por Mitsubishi Chemical Corporation,
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Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 24, en el caso de la sacarosa, los valores de pH del caldo de cultivo inoculado con las bacterias cariogénicas se redujeron mediante la formación de ácido. En el caso del αglucano ramificado de la presente invención, el sacárido no se fermentó para formar ácidos por Streptococcus sobrinus y Streptococcus mutans y los valores de pH del caldo de cultivo se mantuvieron a aproximadamente 6. El
5 pH es mayor que 5,5, que es pH crítico de la descalcificación del esmalte de los dientes. A partir de los resultados se confirmó que el α-glucano ramificado de la presente invención muestra una cariogenicidad significativamente baja.
Experimento 19-3
10 Digestibilidad del α-glucano ramificado
De acuerdo con el método de Okada et al., descrito en Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Sciences, vol. 43, pág. 23–29 (1990), se investigaron la digestibilidad del α-glucano ramificado mediante α-amilasa salival, el jugo gástrico artificial, amilasa pancreática y las enzimas del intestino delgado in vitro usando el α-glucano
15 ramificado, obtenido en el Experimento 19-1. Se usó "PINEFIBER®", una dextrina poco digerible comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, como control. Los resultados se indican en la tabla 25.
Tabla 25
Enzima digestiva
Digestión (%)
α-glucano ramificado (presente invención)
Dextrina poco digerible (control)
Amilasa salival
0,0 0,3
Jugo gástrico artificial
0,0 0,0
Amilasa pancreática
0,2 2,4
Enzimas del intestino delgado
16,4 41,1
20 Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 25, el α-glucano ramificado de la presente invención no se digirió mediante ninguna de amilasa salival y el jugo gástrico artificial, y fue ligeramente digerido por la amilasa pancreática. La digestión (%) del α-glucano ramificado por las enzimas del intestino delgado fue del 16,4 % y mucho menor que 41,4 %, de la de la dextrina poco digerible utilizada como control. Se reveló que la digestibilidad del αglucano ramificado de la presente invención es mucho menor que la de la dextrina poco digerible disponible
25 comercialmente.
Experimento 19-4
Efectos de la ingestión del α-glucano ramificado sobre el nivel de azúcar en sangre y los niveles de insulina
30 Los efectos del α-glucano ramificado sobre la elevación del nivel de azúcar en sangre y el nivel de insulina se investigaron mediante el α-glucano ramificado obtenido por el método del Experimento 19-1. Cinco ratas Wistar macho (siete semanas de edad) /grupo se dejaron preliminarmente en ayunas durante un día y, después, se administró a las ratas una solución acuosa que contiene α-glucano ramificado por vía oral usando una sonda
35 gástrica. La dosis se estableció en 1,5 g de sólido/kg de peso de la rata. Se extrajeron muestras de sangre de la vena caudal de ratas justo antes de la administración, 15 minutos después, 30 minutos después, 60 minutos después, y 120 minutos después de la administración. Cada muestra de sangre se recogió en un tubo tratado con heparina y después se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos para obtener el plasma sanguíneo. El nivel de azúcar en sangre en el plasma sanguíneo se midió mediante el método de glucosa oxidasa-peroxidasa y el nivel de
40 insulina se midió usando un kit para la medición de la insulina en ratas, comercializado por Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Kanagawa, Japón. Se usaron glucosa y PINEFIBER®", una dextrina poco digerible comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, como control 1 y 2, respectivamente. El nivel de azúcar en sangre y el nivel de insulina de cada grupo de ensayo se encuentran en las tablas 26 y 27, respectivamente.
45 Tabla 26
Nivel de azúcar en sangre (mg/dl)
α–glucano ramificado (presente invención)
Glucosa (Control 1) Dextrina poco digerible (Control 2)
Justo antes de la ingestión
68 ± 17 76 ± 17 66 ± 15
15
121 ± 18 115 ± 24 109 ± 20
30
156 ± 29 210 ± 29 151 ± 18
60
150 ± 11 191 ± 8 150 ± 4
120
114 ± 9 144 ± 29 112 ± 15
180
80 ± 10 105 ± 17 90 ± 10
Tabla 27
Nivel de insulina (ng/ml)
α–glucano ramificado (presente invención)
Glucosa (Control 1) Dextrina poco digerible (Control 2)
Justo antes de la ingestión
0,14 ± 0,07 0,33 ± 0,06 0,24 ± 0,21
15
0,73 ± 0,29 1,06 ± 0,44 0,46 ± 0,12
30
0,89 ± 0,26 1,46 ± 0,29 0,95 ± 0,40
60
0,60 ± 0,09 1,00 ± 0,26 0,48 ± 0,25
120
0,63 ± 0,2 0,67 ± 0,21 0,31 ± 0,22
180
0,43 ± 0,12 0,47 ± 0,04 0,27 ± 0,1
Como es evidente a partir de los resultados de las Tablas 26 y 27, se reveló que, en el caso del α-glucano ramificado de la presente invención, la elevación del nivel de azúcar en sangre y del nivel de insulina se inhibió como en el caso 5 de dextrina poco digerible disponible comercialmente en comparación con el caso de la glucosa.
Experimento 19-5
Ensayo de toxicidad aguda
10 Mediante el uso de ratones, el α-glucano ramificado obtenido por el método del Experimento 19-1 se administró por vía oral a los ratones durante su prueba de toxicidad aguda. Como resultado, se reveló que el α-glucano ramificado de la presente invención es una sustancia segura con una toxicidad relativamente baja, y que ningún ratón murió incluso cuando se administró la dosis más alta posible. El valor de DL50 del α-glucano ramificado fue de 5 g/kg de
15 peso del ratón o superior.
Experimento 20
Efecto inhibidor del α-glucano ramificado sobre la elevación del nivel de azúcar en sangre
20 En el Experimento 19-4, se reveló que la elevación del nivel de azúcar en sangre y el valor de la insulina se inhibía mediante la ingestión del α-glucano ramificado en comparación con el caso de la ingestión de glucosa. Basándose en los resultados, el efecto de la ingestión del α-glucano ramificado sobre la elevación del nivel de azúcar en sangre se investigó adicionalmente con detalle.
25 Experimento 20-1
Efectos de la ingestión del α-glucano ramificado sobre el nivel de azúcar en sangre y el nivel de insulina cuando el αglucano ramificado se ingiere junto con el hidrolizado parcial de almidón
30 Se investigó el efecto del α-glucano ramificado sobre la elevación del nivel de azúcar en sangre después de la ingestión de "PINEDEX® # 1", un hidrolizado parcial de almidón comercializado por Matsutani Chemical Industries Matsutani chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón. Tres grupos de cinco ratas macho Wistar (de siete semanas de edad) /grupo, adquiridas en Charles river Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japón, se criaron previamente
35 durante una semana usando "AIN-93G", un alimento para ratas preparado en Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayam, Japón, (Ref. Journal of Nutrition, vol.123, pág. 1939–1951 (1993) ; en lo sucesivo en el presente documento denominado "dieta purificada") y, a continuación, se dejaron en ayunas durante un día. Sucesivamente, se administró a las ratas una solución acuosa preparada mediante disolución del hidrolizado parcial de almidón y el α-glucano ramificado por vía oral utilizando una sonda gástrica. La dosis del hidrolizado parcial de almidón se
40 estableció en 1,5 g de sólido/kg de peso corporal. Las dosis del α-glucano ramificado se fijaron en 0,15, 0,30 o 0,75 g de sólido/kg de peso corporal para cada grupo. Se extrajeron muestras de sangre de la vena caudal de ratas justo antes de la administración, 15 minutos después, 30 minutos después, 60 minutos después, 120 minutos después, 180 minutos después y 240 minutos después de la administración. Cada muestra de sangre se recogió en un tubo tratado con heparina y después se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos para obtener el plasma sanguíneo. El
45 nivel de azúcar en sangre y el nivel insulina en el plasma sanguíneo se midieron mediante el método descrito en el Experimento 19-4. Como control 1, se administraron cinco ratas (un grupo) con 1,5 g/kg de peso corporal del hidrolizado parcial de almidón. Como control 2 se usó "FIBERSOL®-2", una dextrina poco digerible comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, como un sustituto del α-glucano ramificado y la dextrina poco digerible se administró a los dos grupos de ratas (cinco ratas/grupo) junto con el hidrolizado parcial de almidón.
50 Las dosis de la dextrina poco digerible se fijaron en 0,15 y 0,75 g de sólido/kg de peso corporal para los dos grupos de ratas, respectivamente. El nivel de azúcar en la sangre, el valor de la AUC (área bajo la curva de concentración sanguínea-tiempo) del nivel de azúcar en sangre, el nivel de insulina, y el valor de la AUC de cada uno de los grupos se encuentran en las Tablas 28, 29, 30, y 31, respectivamente.
55
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Tabla 30
Nivel de insulina (ng/ml)
Hidrolizado parcial de almidón solo (Control 1)
α–glucano ramificado (presente invención) (g/kg de peso corporal) Dextrina poco digerible (Control 2) (g/kg de peso corporal)
0,15
0,30 0,75 0,15 0,75
Justo antes de la ingestión
0,67 ± 0,02 0,65 ± 0,04 0,67 ± 0,06 0,67 ± 0,10 0,68 ± 0,05 0,67 ± 0,06
15
1,14 ± 0,34 0,72 ± 0,10 0,80 ± 0,01 0,81 ± 0,08 0,94 ± 0,10 1,08 ± 0,33
30
2,54 ± 0,21 1,23 ± 0,36 1,14 ± 0,30 1,04 ± 0,04 1,65 ± 0,25 1,02 ± 0,07
60
1,06 ± 0,16 0,86 ± 0,07 0,83 ± 0,06 0,81 ± 0,11* 1,02 ± 0,19 0,95 ± 0,05
120
0,81 ± 0,07 0,75 ± 0,03 0,76 ± 0,03 0,73 ± 0,03* 0,82 ± 0,06 0,79 ± 0,60
180
0,50 ± 0,03 0,69 ± 0,08 0,56 ± 0,03 0,52 ± 0,26 0,57 ± 0,05 0,54 ± 0,04
240
0,51 ± 0,08 0,54 ± 0,05 0,53 ± 0,02 0,54 ± 0,03* 0,50 ± 0,02 0,51 ± 0,01
*: Significativamente diferente del caso de una dextrina poco digerible (0,75 g/kg de peso corporal) (P<0,05)
Tabla 31
Tiempo (min)
Valor de la AUC del nivel de insulina (ng/ml min)
Hidrolizado parcial de almidón solo (Control 1)
α–glucano ramificado (presente invención) (g/kg de peso corporal) Dextrina poco digerible (Control 2) (g/kg de peso corporal)
0,15
0,30 0,75 0,15 0,75
Justo antes de la ingestión
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
15
3,5 ± 2,6 0,5 ± 0,8 0,9 ± 0,5 1,1 ± 1,1 2,0 ± 1,2 3,1 ± 2,7
30
21,1 ± 5,9 5,4 ± 4,3 5,4 ± 2,2 4,9+3,1 11,3 ± 2,1 8,8 ± 6,1
60
54,9 ± 6,1 17,1 ± 10,3 14,9 ± 6,1 12,7 ± 6,9 31,0 ± 6,6 18,2 ± 8,3
120
70,7 ± 4,6 26,2 ± 11,7 22,5 ± 7,2 19,7 ± 12,8 45,7 ± 12,4 30,2 ± 12,3
180
74,9 ± 6,8 30,8 ± 12,9 25,2 ± 8,6 23,0 ± 16,8 49,9 ± 13,1 34,0 ± 14,7
240
– 32,4 ± 13,8 – 24,2 ± 19,2 – –
–: El valor de la AUC no se calculó porque el nivel de insulina se redujo al de justo antes de la ingestión.
5 Como es evidente a partir de los resultados de las Tablas 28 a 31, se reveló que el α-glucano ramificado de la presente invención mostraba inhibición dependiente de la dosis de la elevación del nivel de azúcar en sangre, el valor de la AUC del nivel de azúcar en sangre, el nivel de insulina y el valor de la AUC del nivel de insulina cuando se cargó un sacárido (hidrolizado parcial de almidón) en comparación con el caso de la administración del hidrolizado parcial de almidón únicamente (control 1), de manera similar al caso de la administración de dextrina
10 poco digerible (control 2). Comparando el grado de los efectos inhibidores entre el α-glucano ramificado y la dextrina poco digerible, el α-glucano ramificado de la presente invención muestra efectos relativamente más fuertes que la dextrina poco digerible.
Experimento 20-2
15 Efectos del peso molecular del α-glucano ramificado sobre el nivel de azúcar en sangre y el nivel de insulina cuando el α-glucano ramificado se ingiere junto con el hidrolizado parcial de almidón
En el Experimento 20-1, se reveló que el α-glucano ramificado de la presente invención inhibe la elevación del nivel
20 de azúcar en sangre, el valor de la AUC de nivel de azúcar en sangre, el nivel de insulina, y el valor de la AUC del nivel de insulina cuando se ingirió junto con un sacárido (hidrolizado parcial de almidón). Sucesivamente, se investigó el efecto del peso molecular del α-glucano ramificado sobre el efecto inhibidor sobre el nivel del azúcar en sangre y el nivel de insulina. Variando los tipos de hidrolizado parcial de almidón material y las cantidades de la αglucosiltransferasa y la amilasa se prepararon diversos varios alfa-glucanos ramificados que tienen los pesos
25 moleculares promedio en peso que se muestran en la Tabla 32. Del mismo modo que en el Experimento 20-1, nueve grupos de cinco ratas macho Wistar (de siete semanas de edad) /grupo, adquiridas en Charles River Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japón, se criaron previamente durante una semana utilizando la dieta purificada y después se dejaron en ayunas durante un día. Sucesivamente, se administró a los 8 grupos de ratas una solución acuosa preparada mediante disolución del hidrolizado parcial de almidón y uno cualquiera del α-glucano ramificado
30 mostrado en la tabla 32 por vía oral utilizando una sonda gástrica. Las dosis del hidrolizado parcial de almidón y el αglucano ramificado se establecieron, respectivamente, en 1,5 g de sólido/kg de peso corporal y 0,75 g de sólido/kg de peso corporal para cada grupo. Al grupo restante de las ratas se administraron 1,5 g/kg de peso de cuerpo del
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valor de la AUC del nivel de insulina en el punto de crianza de 4 semanas para cada grupo se encuentran en las Tablas 34, 35, 36, y 37, respectivamente.
Tabla 33
Ingrediente
Composición (% p/p)
Dieta purificada
α–glucano ramificado (% p/p) Dextrina poco digerible (% p/p)
1
2 5 5
Almidón de maíz
39,7486 38,7486 37,7486 34,7486 34,7486
α–almidón
13,2 13,2 13,2 13,2 13,2
Caseína
20 20 20 20 20
Sacarosa
10 10 10 10 10
Aceite de soja
7 7 7 7 7
Celulosa
5 5 5 5 5
Mezcla mineral
3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Mezcla de vitaminas
1 1 1 1 1
L-cistina
0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Bitratrato de colina
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
t–Butil–hidroquinona
0,0014 0,0014 0,0014 0,0014 0,0014
α–glucano ramificado
0 1 2 5 0
Dextrina poco digerible
0 0 0 0 5
Tabla 34
Tiempo (min)
Nivel de azúcar en sangre (mg/dl)
Dieta purificada (Control 1)
Dieta que contiene 1 % (p/p) α–glucano ramificado Dieta que contiene 2 % (p/p) α–glucano ramificado Dieta que contiene 5 % (p/p) α–glucano ramificado Dieta que contiene 5 % (p/p) dextrina poco digerible (control 2)
Justo antes de la ingestión
80 ± 4 66 ± 5 53 ± 4 54 ± 4 59 ± 5
15
180 ± 8 123 ± 16 70 ± 8 79 ± 8* 97 ± 19
30
245 ± 11 184 ± 16 122 ± 17 120 ± 17 120 ± 14
60
218 ± 13 190 ± 15 142 ± 29 126 ± 29* 161 ± 26
120
149 ± 10 162 ± 12 108 ± 32 101 ± 32* 154 ± 12
180
115 ± 9 120 ± 9 88 ± 19 84 ± 19* 111 ± 9
240
91 ± 8 87 ± 10 71 ± 18 65 ± 18* 95 ± 4
*: Significativamente diferente del caso de la dieta que contenía 5 % (p/p) de dextrina poco digerible (P<0,05 o P<0,01)
Tabla 35
Tiempo (min)
Valor de la AUC del nivel de azúcar en sangre (mg/dl min)
Dieta purificada (Control 1)
Dieta que contiene 1 % (p/p) de – glucano ramificado Dieta que contiene 2 % (p/p) de – glucano ramificado Dieta que contiene 5 % (p/p) de – glucano ramificado Dieta que contiene 5 % (p/p) de dextrina poco digerible (control 2)
Justo antes de la ingestión
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
15
751 ± 59 427 ± 158 126 ± 26 184 ± 98 272 ± 69
30
2.746 ± 179 1.746 ± 299 772 ± 85 860 ± 272* 986 ± 268
60
7.303 ± 526 5.394 ± 273 3.147 ± 425 2.925 ± 510* 3.368 ± 820
120
13.525 ± 1.032 12.012 ± 1.177 7.457 ± 1.308 6.488 ± 1.002* 9.141 ± 2.311
180
16.661 ± 1.216 16.520 ± 1.476 10.153 ± 1.670 8.791 ± 1.450* 13.413 ± 3.479
240
18.073 ± 1.262 18.778 ± 1.717 11.771 ± 1.933 10.022 ± 1.734 15.939 ± 4.382
*: Significativamente diferente del caso de la dieta que contenía 5 % (p/p) de dextrina poco digerible (P<0,05 o P<0,01)
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Efecto de la ingestión del α–glucano ramificado sobre la absorción de lípidos
Ratas macho Wistar de siete semanas de edad, adquiridas en Charles River Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japón, se dividieron al azar en cuatro grupos, 15 ratas/grupo, y se criaron preliminarmente durante una semana 5 utilizando la dieta purificada que se muestra en la Tabla 33. El α-glucano ramificado preparado por el método del Ejemplo 5 descrito más adelante se utilizó en este experimento. A continuación, se criaron dos grupos de ratas de 4 semanas u 8 semanas de edad utilizando las dietas de ensayo a las que se ha incorporado el α-glucano ramificado en una cantidad de 5 % (p/p), mostrados en la Tabla 33. Los dos grupos restantes de ratas se criaron durante 4 semanas u 8 semanas utilizando la dieta purificada como grupos de control. Después de la cría de 4 semanas u 8 10 semanas, las ratas en el grupo de ensayo criadas usando la dieta de ensayo a la que se ha incorporado el α-glucano ramificado y se sacrificó a aquellas del grupo control mediante la obtención de sangre de la vena poscaval cpm anestesia con éter y se diseccionaron; y, después se investigó la cantidad de lípidos acumulados en el órgano interno, el nivel de lípidos séricos, el peso húmedo de la mucosa intestinal, el contenido en el ciego, etc. Los resultados se indican en la Tabla 39. Se crio a las ratas se midiendo el peso corporal y el consumo de alimento a un 15 intervalo de 2 o 3 días y se dejó que ingirieran la dieta y agua libremente durante el período de ensayo. Se dejó a las ratas en ayunas durante una noche antes de su disección. La ganancia de peso corporal, el consumo de alimento, la eficacia de los alimentos (ganancia de peso corporal/consumo de alimento), el peso corporal en el momento de la disección, los pesos de los órganos, el peso de la mucosa intestinal, los pesos de los lípidos de los órganos internos, el peso del contenido del ciego, el contenido de humedad en el contenido del ciego y el pH del contenido del ciego 20 se encuentran en la Tabla 39. Los niveles de lípidos en suero también se encuentran en la Tabla 39. En los lípidos séricos, los niveles de triglicéridos, de colesterol total y de HDL-colesterol se determinaron mediante el uso de "TRIGLYCERIDE E–TEST WAKO", un kit para la medición de los triglicéridos comercializado por Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japón, "CHOLESTEROL E–TEST WAKO", un kit para medir el colesterol total comercializado por Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japón, y "HDL–CHOLESTEROL E–TEST WAKO", 25 un kit para la medición de HDL-colesterol comercializado por Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japón,
respectivamente. El nivel de LDL-colesterol se calculó restando el valor de HDL-colesterol del de colesterol total.
Tabla 39
Medición
Cría de 4 semanas Cría de 8 semanas
Dieta purificada (Control)
Dieta que contiene 5 % (p/p) de –glucano ramificado Dieta purificada (control) Dieta que contiene 5 % (p/p) de –glucano ramificado
Eficacia del alimento
Ganancia de peso corporal (g) 107,7 ± 9,0 109,0 ± 16,9 174,1 ± 21,2 171,8 ± 11,6
ingesta (g)
486,7 ± 32,2 488,7 ± 53,1 938,2 ± 43,6 962,1 ± 80,7
Eficacia
0,22 ± 0,01 0,22 ± 0,01 0,19 ± 0,02 0,18 ± 0,02
Peso del órgano interno
Peso corporal (g) 348,0 ± 11,6 345,0 ± 24,9 429,2 ± 22,6 424,6 ± 13,1
Hígado
9,76 ± 0,85 9,59 ± 1,49 10,44 ± 0,74 10,42 ± 0,98
Riñón
1,28 ± 0,11 1,23 ± 0,19 2,84 ± 0,30 2,43 ± 0,89
Bazo
0,86 ± 0,09 0,82 ± 0,10 0,90 ± 0,08 0,85 ± 0,06
Peso de la mucosa intestinal
Mucosa del yeyuno (g) 1,06 ± 0,16 1,31 ± 0,25* 1,26 ± 0,14 1,55 ± 0,23**
Mucosa del íleon (g)
0,96 ± 0,22 1,15 ± 0,12* 1,10+0,22 1,51 ± 0,20**
Tejido del ciego (g)
0,99 ± 0,18 1,03 ± 0,16 1,11 ± 0,20 1,46 ± 0,21**
Peso de los lípidos en el órgano interno
Alrededor del mesenterio (g) 4,37 ± 1,40 4,49 ± 0,84 6,02 ± 1,19 6,99 ± 1,37
Alrededor del riñón (g)
6,24 ± 3,36 4,15 ± 0,98 8,05 ± 2,69 4,74 ± 1,70*
Alrededor del testículo (g)
5,70*1,86 3,32 ± 1,12* 9,25 ± 2,23 3,68 ± 0,84**
Contenido en el ciego
Peso (g) 2,17 ± 0,70 2,17 ± 0,70 2,37 ± 0,73 2,39 ± 0,74
Contenido de humedad (%)
76,8 ± 3,0 76,3 ± 4,0 76,7 ± 3,1 77,2 ± 3,7
pH
8,75 ± 0,23 8,59 ± 0,19 8,70 ± 0,35 8,28 ± 0,48*
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productos parcialmente metilados. Adicionalmente, el contenido del producto 2,4,6-trimetilado y el producto de 2,4dimetilado fue del 2,6 % y 6,8 %, respectivamente, en los productos parcialmente metilados. El peso molecular promedio en peso del α-glucano ramificado fue de 4.097 dalton y el valor de dividir el peso molecular promedio en peso por el peso molecular promedio en número (Mw/Mn) fue de 2,1. Además, 35,6 % (p/p) de isomaltosa, sobre 5 una base sólida seca del hidrolizado, se formó del α-glucano ramificado por digestión con isomaltodextranasa. El contenido de WSDF del α-glucano ramificado fue 79,4 % (p/p) mediante el método Enzima-HPLC. Dado que el α– glucano ramificado tiene una propiedad no cariogénica, es difícilmente digerible y tiene una viscosidad adecuada, puede usarse ventajosamente en diversas composiciones, tales como alimentos y bebidas, cosméticos y productos farmacéuticos como WSDF, sustituto de grasa de alimentos, bebidas y alimentos, como agente mejorador de la
10 calidad, estabilizante, excipiente, espesante, y agente de carga.
Ejemplo 6
Excepto por el uso de α-glucosiltransferasa purificada de Bacillus circulans PP710, FERM BP-10771, preparada
15 mediante el método del Experimento 6, en lugar de la preparación de enzima bruta concentrada, y el uso de 1.000 unidades/g de sólido de la isoamilasa de Pseudomonas amyloderamosa, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón; el α-glucano ramificado en polvo se obtuvo de acuerdo con el método del Ejemplo 5. En el análisis de metilación del α-glucano ramificado, una proporción del producto 2,3,6trimetilado y el producto 2,3,4-trimetilado fue de 1: 4, y el contenido total del producto 2,3,6-trimetilado y el producto
20 2,3,4-trimetilado fue del 67,9 % en los productos parcialmente metilados. Adicionalmente, el contenido del producto 2,4,6-trimetilado y el producto de 2,4-dimetilado fue del 2,3 % y 5,3 %, respectivamente, en los productos parcialmente metilados. El peso molecular promedio en peso del α-glucano ramificado fue de 2.979 dalton y el valor de dividir el peso molecular promedio en peso por el peso molecular promedio en número (Mw/Mn) fue de 2,0. Además, 40,6 % (p/p) de isomaltosa, sobre una base sólida seca del hidrolizado, se formó del α-glucano ramificado
25 por digestión con isomaltodextranasa. El contenido de WSDF del α-glucano ramificado fue 77 % (p/p) mediante el método Enzima-HPLC. Dado que el α–glucano ramificado tiene una propiedad no cariogénica, es difícilmente digerible y tiene una viscosidad adecuada, puede usarse ventajosamente en diversas composiciones, tales como alimentos y bebidas, cosméticos y productos farmacéuticos como WSDF, sustituto de grasa de alimentos, bebidas y alimentos, como agente mejorador de la calidad, estabilizante, excipiente, espesante, y agente de carga.
30 Ejemplo 7
De acuerdo con los métodos convencionales, se investigaron las propiedades fisicoquímicas del α-glucano ramificado preparado en el Ejemplo 5 y los resultados se resumen en la Tabla 41 como un ejemplo de las
35 propiedades del α-glucano ramificado de la presente invención.
Tabla 41
Aspecto
Polvo amorfo blanco insípido e inodoro
Solubilidad
No es soluble en alcohol, acetona, hexano, benceno, acetato de etilo, tetracloruro de carbono, cloroformo y éter. Soluble en agua, formamida y dimetilsulfóxido
pH de la solución acuosa
Ligeramente ácido
Azúcar componente
Solo glucosa
Rotación óptica específica
+194,1° a +194,4° (Concentración, 20 °C)
Reacción de color
Positiva: Reacción antrona-sulfato, reacción fenol-sulfato Negativa: Reacción de Biuret, reacción de Lowry-Foline, reacción de Elson-Morgan
Punto de fusión
No muestra el punto de fusión definido
Análisis de la metilación
Muestra la presencia de restos de glucosa que implican extremo no reductor, enlace 1,3, enlace 1,4, enlace 1,6, enlace 1,3,6 y enlace 1,4,6
Espectro de resonancia infrarroja
Muestra una absorción característica en el anómero α de la D-glucosa alrededor de 844 cm-1
Espectro de RMN-C
Muestra una señal característica para el enlace alfa-1,6 aproximadamente a 68 ppm
Digestibilidad enzimática
Forma isomaltosa mediante tratamiento con dextranasa
Ejemplo 8 40 Agente mejorador de la calidad
Cuatrocientas partes en peso de "FINETOSE®", una maltosa anhidro comercializada por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japón, 200 partes en peso de "TREHA®", trehalosa comercializada por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, 45 Japón, y dos partes en peso de solución de α-glucosiltransferasa purificada, preparada a partir de Bacillus circulans PP710 (FERM BP-10771) mediante el método del Ejemplo 6, se mezclaron hasta la homogeneidad y se secaron mediante secado por circulación convencional para obtener una preparación enzimática que comprende α
glucosiltransferasa. El producto se puede utilizar para la modificación de sustancias amiláceas y la inhibición de la retrogradación del almidón mediante la incorporación en sustancias amiláceas para la producción de alimentos y bebidas. Por lo tanto, se puede utilizar ventajosamente como un agente mejorador de la calidad, en particular, como un agente inhibidor de la retrogradación de almidón.
5 Ejemplo 9
"Mochi" (torta de arroz)
Quinientos partes en peso de "shiratamako"(Harina de arroz) y 500 partes en peso de "joshinko"(harina de arroz) se mezclaron hasta la homogeneidad, a continuación, se mezclaron 700 partes en peso de agua con la mezcla y se cocieron al vapor durante 40 minutos. Sucesivamente, la harina de arroz cocido al vapor se amasó hasta una pasta con "ACM20LVW", un mezclador comercializado por Aicoh, Saitama, Japón. Después de enfriar la pasta hasta aproximadamente 55 ºC, 360 partes en peso de sacarosa y 240 partes en peso de "TREHA®", trehalosa
15 comercializada por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japón, se mezclaron con la pasta. A continuación, la αglucosiltransferasa de la presente invención, purificada mediante el método del Experimento 6, se mezcló con la mezcla anterior para dar una actividad enzimática final de 50 unidades/g de sustancia de almidón dividiendo por cuatro. Sucesivamente, la mezcla se amasó adicionalmente durante tres minutos y después se le dio forma cargando la pasta en un recipiente de plástico con el diámetro interno de 60 mm y la altura de 22 mm, y se enfrió y se conservó. El producto es un "mochi" (torta de arroz) con una calidad alta, textura suave y capacidad de extensión, porque la sustancia amilácea en la pasta se convierte en α-glucano ramificado por la acción de la αglucosiltransferasa e inhibe la retrogradación del almidón.
Ejemplo 10
25 "Ohagi" (nola de masa de arroz cubierta con mermelada de judías)
Trescientas cincuenta partes en peso de "SUNMALT®", maltosa comercializada por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japón, y 150 partes en peso de "TREHA®", trehalosa comercializada por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japón, se disolvieron en agua caliente para fabricar una solución de sacárido con una concentración de 70 % (p/p), y, después, se mantuvo a una temperatura de 55 ºC. Sucesivamente, 1000 partes en peso de arroz glutinoso, que se había empapado en agua, se trataron con vapor por el método convencional utilizando un vaporero y después se enfrió a 55 ºC. Con el arroz glutinoso cocido al vapor, 500 partes en peso de la solución de sacárido anterior y 25 unidades/g de sustancia de almidón de la α-glucosiltransferasa de la presente invención, purificada por
35 el método del Experimento 9, se mezclaron y se agitaron hasta homogeneidad. Después de mantener la mezcla a 45-50 ºC durante aproximadamente una hora en un recipiente calentado, se convirtió en "ohagi" (bola de masa de arroz cubierta de la mermelada de judías) con mermelada de judías. El producto es "ohagi" con una alta calidad, lo que mantiene la textura suave justo después de la preparación y no muestra sinéresis cuando se descongela después de la refrigeración o congelación, porque el almidón gelatinizado se convierte en α-glucano ramificado mediante la acción de α-glucosiltransferasa e inhibe la retrogradación del almidón.
Ejemplo 11
Leche condensada edulcorada
45 Dos partes en peso del α-glucano ramificado, obtenido por el método del Ejemplo 3, y tres partes en peso de sacarosa se disolvieron en 100 partes en peso de leche del material. La mezcla resultante se esterilizó mediante calentamiento con un calentador de placas, se concentró hasta dar una concentración de 70 %, y después se envasó en una lata en condiciones de esterilidad para convertirlo en un producto. Dado que el producto tiene un dulzor suave y buen sabor, se puede usar ventajosamente como una leche condensada azucarada rica en WSDF para especiar frutas, café, cacao, té negro, y similares.
Ejemplo 12
55 Bebida de bacterias de ácido láctico
Ciento setenta y cinco partes en peso de leche desnatada, 50 partes en peso del α-glucano ramificado en polvo, obtenido por el método del Ejemplo 4, y 50 partes en peso de "NYUKA-OLIGO®", un polvo con un contenido alto de lactosacarosa comercializado por Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japón, se disolvió en 1.500 partes en peso de agua, y, después, la mezcla resultante se esterilizó a 65 ºC durante 30 minutos. Después de enfriar la mezcla a 40 °C, 30 partes en peso de una bacteria del ácido láctico se inocularon en la mezcla como iniciador de acuerdo con el método convencional, y se cultivaron a 37 ºC durante ocho horas para obtener una bebida de bacterias de ácido láctico. El producto tiene un sabor satisfactorio y mantiene la bacteria del ácido láctico de forma estable porque comprende α-glucano ramificado como una WSDF y oligosacárido. Además, el producto se usa, preferentemente,
65 como una bebida de bacterias del ácido láctico que tiene una actividad promotora del crecimiento para las bifidobacterias y una actividad de regulación de la función del intestino.
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como material para productos de confitería con un nivel bajo de calorías y de premezcla, para postres helados. Además, el producto es útil como fibra dietética y antiflatulento para una dieta de fluidos para ingesta oral o por sonda.
5 Ejemplo 18
Crema cosmética
Según el método convencional, dos partes en peso de monoestearato de polioxietilenglicol, cinco partes en peso de monoestearato de glicerina autoemulsionado, dos partes en peso del α-glucano ramificado en polvo, obtenido por el método del Ejemplo 4, una parte en peso de "αG–RUTIN", α-glucosilrutina, comercializado por Hayashibara Inc., Okayama, Japón, una parte en peso de parafina líquida, 10 partes en peso de trioctanoato de glicerina y una cantidad adecuada de conservante se mezclaron y se disolvieron por calentamiento. La mezcla resultante se mezcló adicionalmente con dos partes en peso de ácido L-láctico, cinco partes en peso de 1,3-butilenglicol y 66 partes en
15 peso de agua purificada, y la mezcla resultante se emulsionó utilizando un homogeneizador. La mezcla homogeneizada se mezcló adicionalmente con una cantidad adecuada de aroma y se agitó para hacer una crema cosmética. El producto tiene una propiedad de retención de humedad satisfactoria porque comprende el α-glucano ramificado. El producto tiene una estabilidad satisfactoria y se puede utilizar ventajosamente como un agente de cuidado de la piel preventivo de quemaduras solares y agente de blanqueamiento de la piel.
Ejemplo 19
Pasta de dientes
25 Cuarenta y cinco partes en peso de monohidrogenofosfato de calcio, 1,5 partes en peso de laurilsulfato de sodio, 25 partes en peso de glicerina, 0,5 partes en peso de laurato de polioxietileno sorbitán, 15 partes en peso de la solución que comprende α-glucano ramificado, obtenidos por el método del Ejemplo 3, 0,02 parte en peso de sacarina, y 18 partes en peso de agua se mezclaron para hacer una pasta de dientes. El producto es pasta de dientes que muestra una disponibilidad satisfactoria sin perder la propiedad de lavado de agente tensioactivo.
Ejemplo 20
Agente sólido para una dieta fluida
35 Cien partes en peso del α-glucano ramificado en polvo, obtenido por el método del Ejemplo 4, 200 partes en peso de trehalosa cristalina hidratada, 200 partes en peso de polvo con un contenido alto de amaltotetraosa, 270 partes en peso de polvo de yema de huevo, 209 partes en peso de leche desnatada, 4,4 partes en peso de cloruro de sodio, 1,8 partes en peso de cloruro de potasio, cuatro partes en peso de sulfato de magnesio, 0,01 parte en peso de tiamina, 0,1 parte en peso de L-ascorbato sódico, 0,6 partes en peso de acetato de vitamina E y 0,04 partes en peso de ácido nicotínico-amida se mezclaron para hacer una composición. Veinticinco gramos de cada de la composición se envasaron en una bolsa de laminada a prueba de humedad y la bolsa se selló con calor para hacer un producto. El producto contiene WSDF y se puede utilizar ventajosamente para el suministro de energía para los cuerpos vivos como una dieta de fluido para regular la función del intestino mediante ingestión oral o a través de una sonda en la cavidad nasal, el estómago, y el intestino.
45 Ejemplo 21
Comprimido
A 50 partes en peso de aspirina, 14 partes en peso de polvo de trehalosa cristalina hidratada y cuatro partes en peso del α-glucano ramificado en polvo, obtenido por el método del Ejemplo 4, se mezclaron hasta la homogeneidad. De acuerdo con el método convencional, la mezcla resultante se convirtió en un comprimido con 680 mg/comprimido y un espesor de 5,25 mm usando una máquina de formación de comprimidos. El producto se fabricó usando el glucano apenas digerible y trehalosa como excipientes. El producto no muestra higroscopicidad ni una resistencia
55 física satisfactoria, pero se rompe fácilmente en el agua. Además, puesto el α-glucano ramificado actúa como WSDF, el comprimido se puede utilizar para regular las funciones del intestino.
Ejemplo 22
Pomada para curar heridas
A 400 partes en peso de maltosa, 50 partes en peso de una solución de metanol que contiene tres partes en peso de yodo y 200 partes en peso de 10 % (p/v) de solución acuosa que contiene α-glucano ramificado en polvo, obtenido por el método en el Ejemplo 4, se mezclaron para hacer una pomada para la curación de heridas con una 65 propiedad de extensibilidad y adhesiva adecuadas. El producto muestra una viscosidad y propiedades de retención de humedad adecuadas, y es una pomada con un alto valor comercial y menos cambios en el tiempo. Puesto que el
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