KR20030007669A - α-이소말토실 전이 효소와 그 제조 방법 및 용도 - Google Patents

α-이소말토실 전이 효소와 그 제조 방법 및 용도 Download PDF

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니시모토도모유키
아가하지메
후쿠다시게하루
미야케도시오
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가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Abstract

본 발명은, α-이소말토실 전이 효소, 이 효소를 산생하는 미생물, 이 효소의 제조 방법, 이 효소를 이용해서 얻게 되는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질, 및 이들의 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의인 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이 효소, 이 효소, 이 효소를 산생하는 미생물, 이 효소의 제조 방법, 이 효소를 이용해서 얻게되는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질, 및 그것들의 용도를 확립함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다.

Description

α-이소말토실 전이 효소와 그 제조 방법 및 용도 {α-ISOMALTOSYLTRANSFERASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF}
글루코오스를 구성 당으로 하는 당질로서는, 예를 들면, 전분의 부분 분해물인 아밀로오스, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린스트린, 말토올리고당, 이소말토올리고당 등이 알려져 있다. 이들 당질은, 통상, 분자의 양단에 각각 비환원 말단과 환원 말단을 가지며, 환원성을 나타내는 것이 알려져 있다. 일반적으로 전분 부분 분해물은, 고형물당의 환원력이 큰 것은, 통상적으로 분자가 작고, 저점도이며 단 맛이 강하지만, 다른 화합물과의 반응성이 높아, 예를 들면, 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉽고, 갈변이나 악취를 발생하여 그 품질열화를 일으키기 쉬운 결점이 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 결점을 개선하기 위해서, 전분 부분 분해물의 구성당인 글루코오스를 바꾸지 않고 그 환원력을 저감 혹은 소멸시키는 방법이 오래전부터 요망되고 있었다. 예를 들면, 『저널 오브 아메리칸 케미칼 소사이어티(Journa1 of American ChemlcaI Society)』, 제71권, 353 내지 358 페이지 (1949년)에 개시되어 있는 바와 같이, 전분에 마세란스 아밀라아제(macerans amylase)를 작용시킴으로써 6 내지 8분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코실 결합한 α-, β- 또는 γ-환상 덱스트린을 생성시키는 방법이 알려져 있다. 현재, 전분으로부터 이들 환상 덱스트린이 공업적 규모로 생산되어, 이들 환상 덱스트린은 그것들이 가진 비환원성, 무미성(無味性), 포접능 등의 특성을 살린 용도에 이용되고 있다. 또한, 먼저 본 출원인이 일본국 특개 평7-143876호 공보, 특개 평7-213283호 공보 등에 개시한 바와 같이, 말토올리고당 등 전분 부분 분해물에 비환원성 당질 생성효소 및 트레할로오스 유리효소를 작용시킴으로써 2분자의 글루코오스가 α,α-결합한 트레할로오스를 생성시키는 방법이 알려져 있다. 현재는, α,α-트레할로오스는 전분으로부터 공업적 규모로 생산되며, 그 비환원성, 온화하고 고품질의 단 맛 특성 등을 살린 용도에 이용되고 있다. 이와 같이 글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질로서, 글루코오스 중합도가 2인 α,α-트레할로오스, 글루코오스 중합도가 6 내지 8의 α-, β-, γ-환상 덱스트린은 각각의 특성을 살려서 공업적 규모로 생산되어 이용되고 있지만, 그 종류가한정되어 있고, 더욱이 다양한 비환원성 당질 내지 저환원성 당질의 제공이 요망되고 있다.
한편, 최근, 글루코오스를 구성당으로 하는 새로운 환상의 4당류가 보고되었다. 즉, 『유러피언 저널 오브 바이오케미스트리(European Journal of Biochemlstry)』, 제226권, 641 내지 648 페이지 (1994년)에는, 주로 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합으로 교대로 연결되어 있는 알테르난(alternan)에 가수분해효소 알테르나아제(alternanase)를 작용시킴으로써 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당(본 명세서에 있어서는 이 당질을 「환상 4당」으로 약칭할 경우도 있음.)이 생성하고, 이것을 유기용매의 일종인 메탄올 공존하에서 결정석출 시키는 것이 나와 있다.
환상 4당은 환상구조를 가지기 때문에 각종 화합물을 포접하는 능력을 가짐과 아울러 비환원성이므로, 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고, 갈변, 열화를 우려함이 없이 각종 용도로 가공, 이용할 수 있는 것이 기대된다. 그러나, 환상 4당의 제조 원료로서의 알테르난이나, 환상 4당의 제조에 필요한 효소인 알테르나아제의 입수가 곤란한 외에, 이들을 산생하는 미생물도 용이하게 입수할 수 있는 상태는 아니다.
이와 같은 상황하에서, 이 분야에서는 환상 4당을 공업적 규모로 용이하게 실시할 수 있는 새로운 제조 방법의 확립과, 이화학적 성질이 해명된 환상 4당의 제공이 크게 기대된다.
본 발명은 α-이소말토실 전이 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 신규 α-이소말토실 전이 효소, 이 효소를 산생(産生)하는 미생물, 이 효소의 제조 방법, 이 효소를 사용하는 α-이소말토실 전이 반응 방법, 이 효소를 사용해서 얻게되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D- 글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질 및 그것들의 제조 방법, 더욱이는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1-}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질, 및 그 당질을 함유시킨 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소반응에 의해 얻어진 당질을 고속 액체 크로마토그래피로 처리했을 때의 용출 패턴을 나타내는 도면.
도 2는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵 자기 공명 스펙트럼(1H-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 3은 본 발명의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵 자기 공명 스펙트럼(13C-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 4는 환상 4당의 구조가 사이클로{-6)-α-D-글루코피라노실-(1,3)-α-D-글루코피라노실-(1,6)-α-D-글루코피라노실-(1,3)-α-D-글루코피라노실-(1-}인 것을 나타내는 도면.
도 5는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 6은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 7은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 8은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 9는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 10은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 11은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 12 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 13은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 14는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 15는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 16은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 17은 본 발명의 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 18은 본 발명의 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 19는 본 발명의 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 20은 본 발명의 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 21은 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 22는 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 23은 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실전이 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 24는 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 25는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소반응에 의해 얻어진 환상 4당 5 내지 6 함수결정상 분말의 현미경 사진을 디스플레이 위에 나타낸 중간조 화상.
도 26은 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소반응에 의해 얻어진 환상 4당 5 내지 6 함수결정상 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 27은 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소반응에 의해 얻어진 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
도 28은 본 발명의 환상 4당 1 함수결정 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 29는 본 발명의 환상 4당 1 함수결정 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
도 30은 본 발명의 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 40℃에서 진공건조해서 얻은 환상 4당 무수결정 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 31은 본 발명의 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 120℃에서 진공건조해서 얻은 환상 4당 무수결정 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 32는 본 발명의 무수환상 4당 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
이하, 본 발명을, 실험에 의해 상세히 설명한다.
실험 1: 배양물로부터의 비환원성 환상 당질의 조제
파노오스(주식회사 林原 생물화학 연구소 제조) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스토』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사 제조) 1.5w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염(水鹽) 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)을 접종하여, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 후, 원심분리하여 균체를 제거하여 배양 상청을 얻었다. 더욱이, 그 배양 상청을 오토클레이브(120℃, 15분간)하고, 방냉한 후, 불용물을 원심분리해서 제거하여 상청을 회수하였다.
얻어진 상청중의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘과 물의 혼합액(용량비로 6:4:1), 박층 플레이트로서 알루미늄 플레이트 『키젤 겔 60』(20 ×20cm, 메르크사 제조)을 사용하고, 2회 전개하는 실리카 겔 박층 크로마토그래피(이하, 「TLC」로 약기함.)를 하여, 상청 중의 당질을 분리하였다. 검출법으로서, 분리한 전체 당질을 황산-메탄올법에 의해 발색하고, 또한, 환원당질을 디페닐아민-아닐린법에 의해 발색해서 조사한 결과, Rf값이 약 0.31인 위치에서 황산-메탄올법에서는 양성이고, 또한, 디페닐아민-아닐린법에서는 음성인 비환원성 당질이 검출되었다.
얻어진 상청 약 90ml을 pH 5.0, 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 아마노』(일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1g당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사 판매)를 고형물 1g당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 이어서, 수산화 나트륨으로 pH 12로 조정하고, 2시간 펄펄 끓여 잔존하는 파노오스 등의 환원당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 이온교환 수지 『다이아이온 PK218』과 『WA30』(일본국의 三菱화학공업 주식회사 제조)을 사용해서 탈색·탈염하고, 더욱이, 활성탄으로 탈색한 후, 양이온 교환 수지 『다이아이온 SK-1B』(일본국의 三菱화학공업 주식회사 제조)와 음이온 교환 수지 『IRA411』(일본국의 오르가노 주식회사 제조)로써 다시 탈염하고, 정밀여과한 후, 에바포레이터에서 농축하고, 동결 진공건조하여 고형물으로서 약 O.5g의 당질분말을 얻었다.
얻어진 당질의 조성을 고속 액체 크로마트그래피법(이하, 「HPLC」로 약기함.)으로 조사한 결과, 도 1에 나온 바와 같이, 용출시간 10.84분에서 단일 피이크가 검출되었다. 이 피이크 면적으로부터, 이 당질의 순도는 99.9％ 이상인 것이 밝혀졌다. 그리고 HPLC는, 『S h o d e x KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사 제조)을 이용하고, 그 용출조건으로서는, 칼럼내 온도 60℃, 용출액으로서의 물의 유속을 0.5ml/min으로 하여, 용출되는 당질의 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 이용해서 하였다.
그리고 환원력을 소모기·넬슨법으로 측정한 결과, 그 환원력은 검출한계 이하이며, 이 표품(標品)은 실질적으로 비환원성의 당질이라고 판단하였다.
실험 2: 비환원성 당질의 구조해석
실험 1의 방법으로 얻어진 비환원성 당질에 대해서, 고속 원자 충격법에 의해 질량분석(통칭 FAB-MS) 한 결과, 질량수 649의 프로톤 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어, 이 당질의 질량수는 648인 것이 밝혀졌다.
또한, 통상적인 방법에 따라, 황산을 사용해서 가수분해 하여 가스 크로마토그래피법으로 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스만 검출되었으므로 이 당질의 구성당은 D-글루코오스인 것도 밝혀졌다. 질량수를 고려하면, 이 당질은 D-글루코오스 4분자로 된 환상 당질인 것을 알았다.
더욱이, 이 당질을 이용해서 핵 자기 공명법(이하, 「NMR」로 약기함)을 한 결과, 도 2에 나온1H-NMR 스펙트럼과, 도 3에 나온13C-NMR 스펙트럼이 얻어지고, 이들 스펙트럼에 대해 기지(旣知) 당질의 것과의 이동(異同)을 비교한 결과, 『유러피언 저널 오브 바이오케미스트리(European Journal of Biochemlstry)』, 641 내지 648 페이지(1994년)에 기재되어 있는 비환원성 환상 당질[사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}]의 스펙트럼과 일치하여, 이 당질의 구조가 도 4에 나온 환상 4당, 즉, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것이 밝혀졌다.
실험 3: 바실루스 글로비스포루스 C9로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 생산
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 4.Ow/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스토』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사 제조) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여, 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERMBP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양해서 종배양액을 얻었다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열 멸균하여 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 본 발명의 효소의 효소활성은 약 1.5 단위/ml 이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 약 1.5 단위/ml(총 활성 약 26,900 단위)이었다. 그리고 이 효소의 활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, 파노오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질용액으로 하였다. 그 기질용액 0.5ml에 효소용액을 0.5ml 첨가하고, 35℃에서 30분간 효소반응하였다. 이 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중의 글루코오스량을 글루코오스 옥시다제법으로 정량하였다. α-이소말토실 전이 효소의 효소활성 1 단위는, 상기한 조건하에서 1분간에 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 하였다. 본 명세서를 통해서, α-이소말토실 전이 효소의 효소활성은 이상의 방법으로해서 측정되는 단위를 의미하는 것으로 한다.
실험 4: 바실루스 글로비스포루스 C9로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 정제
실험 3에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여 본 발명의 효소활성 약 24,700 단위를 함유하는 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다.
이 조효소액을 『세파비이즈(Sepabeads) FP-DA13』 겔(일본국의 三菱화학 주식회사 제조)을 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 1000ml)에 사용하였다.
이 효소는,세파비이즈 FP-DA13 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사 제조)을 이용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다.
이 효소는, 세파크릴 HR S-200 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 OM 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이, 본 발명의 효소활성 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『부틸토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)을 이용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 본 발명의 효소는, 부틸 토요퍼얼 650M 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 세파크릴 HR S-200 겔을 이용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여 정제 α-이소말토실 전이 효소를 얻었다. 각 정제 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소의 활성량, 비활성(比活性) 및 수율을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
공 정 α-이소말토실 전이 효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이 효소의 비활성 (단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 26,900 0.41 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 24,700 1.85 91.8
이온교환 칼럼 용출액 19,400 3.41 72.1
어피니티 칼럼 용출액 13,400 18.6 49.8
소수 칼럼 용출액 10,000 21.3 37.2
어피니티 칼럼 용출액 6,460 26.9 24.0
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해, 본 발명의 실험에서 정제한 α-이소말토실 전이 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서, 순도가 높은 표품이었다.
실험 5: α-이소말토실 전이 효소의 성질
실험 4의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 SDS-PAGE(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏드·라보라토리즈 주식회사 제조)와 비교하여 이 효소 표품의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ±20,000 달톤이었다.
또한, 상기 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 처리한 후, 겔 중의 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소 표품의 등전점을 구한 결과, 그 등전점(pl)은 약 5.5 ±0.5이었다.
이 효소 표품의 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 5(온도의 영향), 도 6(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는, pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는, 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉(水冷) 한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 상이한 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 그 결과를 도 7(온도 안정성)과 도 8(pH 안정성)에 각각 나타내었다. 이들 도면으로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 온도영역은 약 40℃ 이하이며, 또한, 이 효소의 상기한 조건하에서있어서의 안정 pH 영역은 pH 약 4.0 내지 약 9.0이었다.
이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2＋ 1
Zn2+ 88 Ba2＋ 102
Mg2+ 98 Sr2＋ 101
Ca2+ 101 Pb2＋ 89
Co2+ 103 Fe2＋ 96
Cu2+ 57 Fe3＋ 105
Ni2+ 102 Mn2＋ 106
Al3+ 103 EDTA 104
표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에서 현저하게 저해되고, Cu2+에서도 저해되었다. 또한, Ca2+로써 활성화되지 않고, EDTA에서 저해되지 않는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 프로틴 시퀀서 『모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 분석한 결과, N 말단 아미노산 서열로서, 서열표에 있어서의 서열 번호 9에 나온, 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-아스파라긴-글리신으로 나타내지는 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.
실험 6: 바실루스 글로비스포루스 Cll로부터의 α-이소말토실 전이 효소의생산
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스토』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 Cll(FERM BP-7144)을 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃ 및 pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 이 효소활성은 약 1.8 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 1.7 단위/ml(총 효소활성 약 30,400 단위)이었다.
실험 7: 바실루스 글로비스포루스 Cll로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 정제
실험 6에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수해서 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 이 효소활성을 28,000 단위 함유하는 조효소액 약 416ml을 얻었다.
이 조효소액을 『세파비이즈(Sepabeads) FP-DA13』 겔(일본국의 三菱화학 주식회사 제조)을 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 1000ml)에 사용하였다. 이 효소는, 세파비이즈 FP-DA13 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 이용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소는, 세파크릴 HR S-200겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다.
더욱이, 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『부틸 토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 이용한 소수 칼럼 크로마트그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 부틸-토요퍼얼 650M 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 다시, 이 회수한 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 세파크릴 HR S-200겔을 이용하는 어피니티 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
공 정 α-이소말토실 전이 효소 활성량(단위) α-이소말토실전이 효소의비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 30,400 0.45 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 28,000 1.98 92.1
이온교환 칼럼용출액 21,800 3.56 71.7
어피니티 칼럼용출액 13,700 21.9 45.1
소수 칼럼 용출액 10,300 23.4 33.9
어피니티 칼럼용출액 5,510 29.6 18.1
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-PAGE에 의해, 정제한 α-이소말토실 전이 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 8: α-이소말토실 전이 효소의 성질
실험 7의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％）에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏드·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000 ±20,000 달톤이었다.
이 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 2w/v％ 『앰폴라인』(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점(pl)은 약 5.6 ±0.5이었다.
이 효소의 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서조사하였다. 그 결과를 도 9(온도의 영향), 도 10(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는 pH 6.0 및 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는, 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 상이한 50mM 완충액 중에서, 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 11(온도 안정성), 도 12(pH 안정성)에 나타내었다. 이들 도면에 나온 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 온도영역은 약 40℃ 이하이며, 또한, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 pH 영역은 pH 약 4.5 내지 약 9.0이었다.
이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재 하에 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2＋ 2
Zn2+ 83 Ba2＋ 90
Mg2+ 91 Sr2＋ 93
Ca2+ 91 Pb2＋ 74
Co2+ 89 Fe2＋ 104
Cu2+ 56 Fe3＋ 88
Ni2+ 89 Mn2＋ 93
Al3+ 89 EDTA 98
표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에서 현저하게 저해되고, Cu2+에서도 저해되었다. 또한, Ca2+로써 활성화되지 않고, EDTA에서 저해되지 않는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 프로틴 시퀀서 『모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 분석한 결과, 이 효소는 N 말단 아미노산 서열로서, 서열표에 있어서의 서열 번호 10에 나온, 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신으로 나타내지는 아미노산 서열을 가지는 것을 알았다.
실험 9: α-이소말토실 전이 효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 8의 방법으로 얻어진 정제 효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 동일 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 리실엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃에서 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서, 역상 HPLC를 하였다. 『마이크로본다팍 C18 칼럼』(지름 2.1mm ×길이 150mm, 워터스사제)을 이용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세토니트릴 용액의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건으로 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는, 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 좋게 분리한 3 펩티드 [P22(유지시간 약 22분), P63(유지시간 약 63분), P71(유지시간 약 71분)]을 분취하여, 각각 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로틴 시퀀서에 사용하여 각각 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 2 내지 4에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
P22 글리신-아스파라긴-글루탐산-메티오닌-아르기닌-아스파라긴-글루타민-티로신(서열표에서의 서열 번호 2)
P63 이소로이신-트레오닌-트레오닌-트립토판-프롤린-이소로이신-글루탐산-세린(서열표에서의 서열 번호 3)
P71 트립토판-알라닌-페닐알라닌-글리신-로이신-트립토판-메티오닌-세린(서열표에서의 서열 번호 4)
실험 10: 바실루스 글로비스포루스 N75로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 생산
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스토』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591)를 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고 27℃ 및 pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 이 효소활성은 약 1.1 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 1.1 단위/ml(총 효소활성 약 19,800 단위)이었다.
실험 11: 바실루스 글로비스포루스 N75로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 정제
실험 10에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 60％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.3)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 이 효소활성을 15,700 단위 함유하는 조(粗)효소액 약 450ml을 얻었다.
이 조효소액을 『세파비이즈(Sepabeads) FP-DA13』 겔을 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 1000ml)에 사용하였다. 이 효소는, 세파비이즈 FP-DA13 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 이용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소는, 세파크릴 HR S-200 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이, 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『부틸-토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 이용한 소수칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는, 부틸-토요퍼얼 650M 겔에 흡착하고, 황산암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 이 회수한 효소액을 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『슈퍼 Q-토요퍼얼(Super Q-T oyopearl) 650C』 겔을 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔량 380mL)에 사용하였다. 이 효소는, 슈퍼 Q-토요퍼얼 650C 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하며, 얻어진 용출획분을 회수하여 정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 6에 나타낸다.
[표 6]
공 정 α-이소말토실 전이 효소 활성량(단위) α-이소말토실전이 효소의 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 19,000 0.33 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.64 82.6
이온교환 칼럼용출액 12,400 3.56 65.3
어피니티 칼럼용출액 8,320 11.7 43.8
소수 칼럼 용출액 4,830 15.2 25.4
어피니티 칼럼용출액 3,850 22.6 20.3
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-PAGE에 의해, 본 실험에서 정제한 α-이소말토실 전이 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 12: α-이소말토실 전이 효소의 성질
실험 11의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏드·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ±20,000 달톤이었다.
이 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 2w/v％ 『앰폴라인』(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사 제조)함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점(pl)은 약 7.8 ±0.5이었다.
이 효소의 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 13(온도의 영향), 도 14(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는 pH 6.0 및 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃ 및 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 상이한 50mM 완충액 중에서 4℃ 및 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 15(온도 안정성), 도 16(pH 안정성)에 나타내었다. 이들 도면에 나온 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 온도영역은 약 45℃ 이하이며, 또한, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 pH 영역은 pH 약 4.5 내지 약 10.0이었다.
이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재 하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[표 7]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2＋ 0.5
Zn2+ 75 Ba2＋ 102
Mg2+ 95 Sr2＋ 91
Ca2+ 100 Pb2＋ 69
Co2+ 92 Fe2＋ 97
Cu2+ 15 Fe3＋ 90
Ni2+ 91 Mn2＋ 101
Al3+ 94 EDTA 92
표 7의 결과로 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에서 현저하게 저해되고, Cu2+에서도 저해되었다. 또한, Ca2+로써 활성화되지 않는 것도, EDTA에서 저해되지 않는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 프로틴 시퀀서 『모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 분석한 결과, 이 효소의 N 말단 아미노산 서열은, 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신이며, 실험 8에서 밝혀진, 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 이 효소의 N 말단 아미노산 서열(서열표에 있어서의 서열 번호 10)과 일치하는 것이 밝혀졌다.
상기한 N 말단 아미노산 서열의 분석 결과와, 실험 5 및 실험 8에 각각 나온 바실루스 글로비스포루스 C9 및 Cll 유래의 α-이소말토실 전이 효소의 N 말단 아미노산 서열의 분석 결과를 종합하면, 바실루스 글로비스포루스에 속하는 미생물유래의 α-이소말토실 전이 효소는, N 말단 아미노산 서열로서, 통상, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열을 가진다고 생각되었다.
실험 13: α-이소말토실 전이 효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 11의 방법으로 얻어진 정제 효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 동일 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석 하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 리실엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃에서 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 『마이크로본다팍 C18 칼럼』(지름 2.1mm ×길이 150mm, 워터스사제)을 이용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-4％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-42.4％ 아세토니트릴 용액의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건으로 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 좋게 분리한 3 펩티드 [PN21(유지시간 약 21분), PN38(유지시간 약 38분), PN69(유지시간 약 69분)]을 분취하고, 각각 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로틴 시퀀서에 사용하여 6 잔기 또는 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 5 내지 7에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 8에 나타낸다.
[표 8]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
PN21 아스파라긴-트립토판-트립토판-메티오닌-세린-리신(서열표에서의 서열 번호 5)
PN38 트레오닌-아스파라긴산-글리신-글루타민산-메티오닌-발린-트립토판(서열표에서의 서열 번호 6)
PN69 아스파라긴-이소로이신-티로신-로이신-프롤린-글루타민-글리신-아스파라긴산(서열표에서의 서열 번호 7)
실험 14: 아르드로박터 라모서스 Sl로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 생산
전분 부분 분해물 『파인덱스 ＃4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스토』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 라모서스 Sl(FERM BP-7592)을 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각하여 27℃으로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃ 및 pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 이 효소활성은 약 0.45 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 0.44 단위/ml (총 효소활성 약 7,920 단위)이었다.
실험 15: 아르드로박터 라모서스 Sl로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 정제
실험 14에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여 이 효소활성을 6,000 단위 함유하는 조효소액 약 380ml를 얻었다.
이 조효소 액을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거한 후, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 이용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소는, 세파크릴 HR S-200 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트 및, 여기에 계속하여 말토테트라오스 Ow/v％로부터 5w/v％의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 말토테트라오스농도 약 2w/v％ 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이, 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『부틸-토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 이용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 제공하였다.
이 효소는, 부틸-토요퍼얼 650M 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하며, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하여 정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 9에 나타낸다.
[표 9]
공 정 α-이소말토실 전이 효소 활성량(단위) α-이소말토실전이 효소의 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 7,920 0.47 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 6,000 3.36 75.8
어피니티 칼럼용출액 5,270 29.9 66.5
소수 칼럼 용출액 4,430 31.1 55.9
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-PAGE에 의해, 본 실험에서 정제한 α-이소말토실 전이 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 16: α-이소말토실 전이 효소의 성질
실험 15의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏드·라보러토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 116,000 ±20,000 달톤이었다.
이 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 2w/v％ 『앰폴라인』(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점(pI)은 약 4.2±0.5이었다.
이 효소의 효소활성에 미치는 온도와 pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 17(온도의 영향), 도 18(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는, pH 6.0 및 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는, 35℃ 및 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 상이한 50mM 완충액 중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 19(온도 안정성), 도 20(pH 안정성)에 나타내었다. 이들 도면에 나온 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 온도영역은 약 45℃ 이하이며, 또한, 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 pH 영역은 pH 약 3.6 내지 약 9.0이었다.
이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2＋ 0.1
Zn2+ 78 Ba2＋ 97
Mg2+ 99 Sr2＋ 101
Ca2+ 103 Pb2＋ 85
Co2+ 91 Fe2＋ 105
Cu2+ 2 Fe3＋ 75
Ni2+ 87 Mn2＋ 98
Al3+ 93 EDTA 91
표 10의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에서 현저하게 저해되고, Cu2+에서도 저해되었다. 또한, Ca2+로써 활성화되지 않는 것도, EDTA에서 저해되지 않는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 프로틴 시퀀서 『모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 분석하였다. 이 효소의 N 말단 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 8에 나온, 아스파라긴산-트레오닌-로이신-세린-글리신-발린-페닐알라닌-히스티딘-글리신-프롤린으로 나타내지는 서열인 것이 밝혀졌다.
실험 17: 아르드로박터 글로비포르미스 A19로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 생산
전분 부분 분해물 『파인덱스 ＃4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스토』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃ 및 pH 6.0 내지 9.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 이 효소활성은 약 1.7 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 16 단위/ml(총 효소활성 약 28,800 단위)이었다.
실험 18: 아르드로박터 글로비포르미스 A19로부터의 α-이소말토실 전이 효소의 부분 정제
실험 17에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 60％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수하고 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여 이 효소활성을 15,700 단위 함유하는 조효소액 약 850ml을 얻었다. 이 조효소액을, 『DEAE-토요퍼얼(Toyopearl) 650S』 겔을 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는 DEAE-토요퍼얼 650S 겔에 흡착하고, NaCl 농도 OM으로부터 0.5M의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, NaCl 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이, 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 이용한 어피니티-칼럼 크로마토그래피(겔량 500mL)에 제공하였다.
이 효소는, 세파크릴 HR S-200 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 OM 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출 하고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하여 이 효소의 부분 정제 표품을 얻었다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 11에 나타낸다.
[표 11]
공 정 α-이소말토실전이 효소 활성량(단위) α-이소말토실전이 효소의 비활성(단위/mg단백) 수율(%)
배양 상청 28,800 0.18 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.97 54.5
이온교환 칼럼 용출액 7,130 4.01 24.8
어피니티 칼럼 용출액 1,800 11.9 6.3
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-PAGE에 의해, 본 실험에서 부분 정제한 α-이소말토실 전이 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소의 것으로 생각되는 주된 단백 밴드 이외에, 3종의 마이너한 단백 밴드가 나타났다.
실험 19: α-이소말토실 전이 효소의 성질
실험 18의 방법으로 얻은 부분 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 사용하고, 이 효소의 효소활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 21(온도의 영향), 도 22(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는, pH 6.0에서 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는, 35℃에서 30분간 반응에서 약 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 상이한 50mM 완충액 중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 23(온도 안정성), 도 24(pH 안정성)에 나타내었다. 이들 도면에 나온 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 온도영역은 약 45℃ 이하이며, 또한, 이 효소의 상기한 조건하에서 있어서의 안정 pH 영역은 pH 약 4.5 내지 약 9.0이었다.
실험 20: 각종 당질에의 작용
각종 당질을 사용하여 이 효소의 기질로 될 수 있을 것인가 아닌가의 시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스,말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소말토실말토오스, 이소파노오스, α,α-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, α,β-트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, α-환상 덱스트린, β-환상 덱스트린, γ-환상 덱스트린, 가용성 전분, 풀룰란, 또는 덱스트란의 용액을 조제하였다.
이들 용액에, 실험 4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 7의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 11의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 15의 방법으로 얻은 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 및 실험 18의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 부분 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 중의 어느 하나를, 기질 고형물 1g당 각각 2 단위씩 가하여 기질농도를 2w/v％가 되도록 조정하고, 이것을 30℃, pH 6.0에서 24시간 반응시켰다. 효소반응 전후의 반응액을, 실험 1에 기재한 TLC법으로 분석하여 각각의 당질에 대한 효소작용의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[표 12]
기 질 효소작용(환상 4당의 생성)의 유무
C9 효소 C11 효소 N75 효소 S1 효소 A19 효소
말토오스 - - - - -
말토트리오스 - - - - -
말토테트라오스 - - - - -
말토펜타오스 - - - - -
말토헥사오스 - - - - -
말토헵타오스 - - - - -
이소말토오스 - - - - -
이소말토트리오스 - - - - -
파노오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
이소말토실말토오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
이소파노오스 - - - - -
트레할로오스(α,α) - - - - -
코지비오스 - - - - -
니게로오스 - - - - -
네오트레할로오스 - - - - -
셀로비오스 - - - - -
겐티비오스 - - - - -
말티톨 - - - - -
말토트리이톨 - - - - -
락토오스 - - - - -
수크로오스 - - - - -
α-환상 덱스트린 - - - - -
β--환상 덱스트린 - - - - -
γ--환상 덱스트린 - - - - -
가용성 전분 - - - - -
풀룰란 - - - - -
덱스트란 - - - - -
주) 「-」은 반응 전후에 기질이 변화하지 않았음을 나타내고, 「+」은 반응 후에 기질의 감소와 더불어 환상 4당의 생성이 나타났음을 나타내고 있음.
표 12의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 시험한 각종 당질 중에서, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질이며, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합의 이소말토실기를 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진 파노오스(별명, 「이소말토실글루코오스」), 이소말토실말토오스에 작용하여 환상 4당을 생성하는 것이 밝혀졌다. 이들 당질로부터의 환상 4당의 생성율을, 실험 1의 방법에 준해서 HPLC에 의해서 측정하여 얻어진 당조성으로부터 구한 결과, 본 실험에서 사용한 모든 효소의 경우도, 파노오스로부터의 생성율은 약 43 내지 44％이고, 이소말토실말토오스로부터의 생성율은 약 31％이었다.
한편, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지지만, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 더욱이 α-1,6 글루코실 결합하고 있는 이소말토트리오스에는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 작용하지 않음을 알수 있었다. 또한, 고분자 글루칸인 가용성 전분, 풀룰란, 덱스트란의 경우, 상기한 시험에서는 적어도 TLC로써 확인할 수 있는 환상 당질 등의 저분자 당질은 생성하지 않는 것이 밝혀졌다. 이들 고분자 당질이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 작용으로 환원력을 증가하지 않고, 가수분해 되지 않는 것을 확인하기 위해서, 아래의 시험을 하였다. 즉, 가용성 전분, 풀룰란, 덱스트란의 용액에, 실험 4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 7의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 11의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 및 실험 15의 방법으로 얻은 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 중의 어느 하나를, 기질 고형물 1g당 각각 12 단위씩 가하여, 기질농도를 1w/v％가 되도록 조정하고, 이것을 35℃, pH 6.0에서 4시간 작용시켰다. 이 효소반응에 의한 반응액의 환원당량을 경시적(經時的)으로 소모기·넬슨법으로 측정하였다. 또한, 동시에 반응액의 전체 당량(糖量)을 안트론법으로서 측정하였다. 환원력 생성율(％)은 아래에 나온 계산식을 이용해서 산출하고, 이들 결과를 표 13에 정리하였다.
[계산식]
환원력 생성율(%)
= [(반응 전후의 환원 당량/반응후의 전체 당량) -(반응전의 환원 당량/반응전의 전체 당량)] ×100
[표 13]
효소 기질 환원력 생성율(%)
0시간* 1시간* 2시간* 4시간*
C9 효소 가용성 전분 0.0 0.0 0.0 0.0
풀룰란 0.0 0.0 0.0 0.0
덱스트란 0.0 0.0 0.1 0.0
C11 효소 가용성 전분 0.0 0.1 0.0 0.0
풀룰란 0.0 0.0 0.0 0.0
덱스트란 0.0 0.0 0.0 0.0
N75 효소 가용성 전분 0.0 0.0 0.0 0.0
풀룰란 0.0 0.0 0.0 0.0
덱스트란 0.0 0.0 0.0 0.0
S1 효소 가용성 전분 0.0 0.0 0.0 0.0
풀룰란 0.0 0.0 0.0 0.0
덱스트란 0.0 0.0 0.0 0.0
*: 반응 개시후의 시간을 나타내고 있음.
표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, 가용성 전분, 풀룰란, 덱스트란 모두 환원력의 증가는 실질적으로 보여지지 않고, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 이들 고분자 당질을 실질적으로 가수분해 하지 않는 것이 판명되었다.
이상의 표 12, 표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단의 결합 양식 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질에 작용해서 환상 4당을 생성하는 것이라고 판단된다.
실험 21: 파노오스로부터의 생성물
농도 5％의 파노오스 수용액에, 실험 4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 7의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 11의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 15의 방법으로 얻은 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 및 실험 18의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 부분 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 중의 어느 하나를, 기질 고형물 1g당 4 단위 가하고, 30℃ 및 pH 6.0 에서 1 내지 12시간 작용시켰다. 효소반응액의 당조성(％)은 실험 1에 기재한 HPLC에 의하여 분석하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
효소 반응시간(hr) 당 조성(%)
Glc* Pan* CTS* A* B* C* 기타
C9 효소 1 5.3 80.4 4.1 4.5 3.3 2.0 0.4
12 31.9 5.0 43.0 0.0 6.0 2.4 11.7
C11 효소 1 5.2 80.5 4.0 4.6 3.3 1.9 0.5
12 32.2 4.6 43.5 0.0 5.8 2.3 11.6
N75 효소 1 5.5 80.0 4.2 4.4 3.5 2.0 0.4
12 31.8 4.4 43.2 0.0 6.5 2.4 11.7
S1 효소 1 5.0 81.1 3.8 4.2 3.8 1.9 0.2
12 32.5 4.0 43.0 0.0 6.8 2.3 11.4
A19 효소 1 5.2 80.7 4.0 4.3 3.6 1.9 0.3
12 32.2 4.2 43.1 0.0 6.6 2.3 11.6
*: Glc는 글루코오스를, Pan은 파노오스를, CTS는 환상 4당을 각각 나타내고 있음.A, B, C는 각각 미확인의 성분 A, B, C를 나타내고 있음.
표 14의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 α-이소말토실 전이 효소의 작용에 의해, 기질인 파노오스량의 감소와 함께 글루코오스와 환상 4당의 생성량이 현저하게 증가하였다. 이로부터, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 기질인 파노오스에 있어서의 이소말토실기와 환원 말단의 글루코오스와의 사이의 결합을 절단해서 글루코오스를 유리함과 동시에 이소말토실 전이를 포함하는 반응을 촉매함으로써 파노오스로부터 환상 4당을 생성한다고 생각되었다.
또한, 상기한 반응 중에 생성한 기타의 성분에 대해서 보면, 반응 초기(반응 개시 후 1시간)에는 3 종류의 미확인의 성분 A, B, C의 생성이 나타났다. 상기한 5 종류의 효소 표품에 의한 반응액에 있어서의 성분 A 끼리, 성분 B 끼리, 성분 C 끼리는 HPLC에 있어서의 유지시간이 서로 일치하고, 이로부터 상기한 5 종류의 반응액 중에 생성한 성분 A 끼리, 성분 B 끼리, 성분 C 끼리는 각각 동일한 물질이라고 판단되었다. 이들 3 종의 성분의 중에서, 성분 A는 반응 후기(반응 개시 후 12시간)에는 소실했지만, 성분 B 및 C는 얼마 정도 잔존하고 있었다. 이로부터, 이 효소에 의한 파노오스로부터의 환상 4당의 생성은, 이 효소에 의한 이소말토실 전이에 의해 생성하는 성분 A를 중간체로 하여 경유하는 한편, 성분 B 및 C는 이 효소의 작용에 의한 생성물이지만 환상 4당으로 변환되기 어려운 중간체라고 추측되었다.
상기한 미확인의 성분 A, B 및 C를 확인하기 위해서, 분취용 HPLC 칼럼『YMC-P ack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 와이에무시 제조)을 이용하고, 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소에 의한 상기한 반응 1시간의 반응물로부터 각각을 단리하고, 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석(표 15)과13C-NMR 분석(표 16)을 하였다.
[표 15]
메틸화 알디톨 아세테이트의 종류 조성비(몰비)
성분 A 성분 B 성분 C
2,3,4-트리메틸화물 2.00 2.00 2.00
2,3,6-트리메틸화물 1.00 2.12 1.00
2,4,6-트리메틸화물 1.03 0.00 0.00
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.74 0.81 1.78
[표 16]
글루코오스 번호 탄소번호 NMR 화학 시프트값(ppm)
성분 A 성분 B 성분 C
a 1a 100.8 100.8 100.7
2a 74.3 74.4 74.0
3a 75.8 75.8 75.8
4a 72.3 72.2 72.2
5a 74.5 74.5 74.5
6a 63.2 63.2 63.2
b 1b 102.5 102.7 102.7
2b 74.3 74.1 74.2
3b 75.8 75.8 75.8
4b 72.6 72.2 71.8
5b 74.0 74.1 74.2
6b 67.9 68.6 67.8
c 1c 100.6 100.6 100.7
2c 72.8 74.2 74.0
3c 83.1 76.1 75.8
4c 72.0 80.1 72.2
5c 73.1 73.0 74.5
6c 63.0 63.2 63.2
d 1d 102.2 102.7 102.4
2d 74.3 74.0 74.3
3d 75.8 75.8 75.8
4d 72.1 72.1 72.1
5d 74.3 73.9 74.2
6d 68.4 69.0 68.5
e 1e 94.6 (α) 94.6 (α) 105.3
98.5 (β) 98.5 (β)
2e 74.3 (α) 74.3 (α) 75.7
76.7 (β) 76.7 (β)
3e 75.8 (α) 75.9 (α) 78.5
78.9 (β) 78.9 (β)
4e 80.0 (α) 80.3 (α) 79.4
79.9 (β) 80.1 (β)
5e 72.6 (α) 72.7 (α) 77.4
77.2 (β) 77.3 (β)
6e 63.5 (α) 63.6 (α) 63.2
63.4 (β) 63.6 (β)
이들 결과로부터, 성분 A는, 파노오스의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치 히드록실기에 이소말토실기가 α결합한 5당이고, 아래에 나온 화학식 1로 나타내어지는 3-0-α-이소말토실파노오스인 것이 밝혀지고, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 파노오스의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치 히드록실기에 이소말토실기를 전이하는 작용을 가지는 것이 밝혀졌다.
화학식 1:
또한, 성분 B는, 파노오스의 비환원 말단 글루코오스의 4 위치 히드록실기에 이소말토실기가 α결합한 5당이고, 아래에 나온 화학식 2로 나타내어지는 4-0-α-이소말토실파노오스인 것이 밝혀지고, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 파노오스의 비환원 말단 글루코오스의 4 위치 히드록실기에 이소말토실기를 전이하는 작용을 가지는 것이 밝혀졌다.
화학식 2:
또한, 성분 C는, 파노오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치 히드록실기에 이소말토실기가 α결합한 5당이고, 아래에 나온 화학식 3을 나타내어지는 1-0-α-이소말토실 β-파노시드인 것이 밝혀지고, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 파노오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치 히드록실기에 이소말토실기를 전이하는 작용을 가지는 것이 밝혀졌다.
화학식 3:
이어서, 상기에서 확인된 성분 A, B 및 C로부터의 환상 4당의 생성을 정제 α-이소말토실 전이 효소를 사용하여 아래와 같이 해서 조사하였다. 즉, 성분 A(3-0-α-이소말토실파노오스, 화학식 1), 성분 B(4-0-α-이소말토실파노오스, 화학식 2) 및 성분 C(1-0-α-이소말토실 β-파노시드, 화학식 3) 중의 어느 하나의 1w/v％ 수용액(pH 6.0)을 조제하여 기질용액으로 하였다. 이들 기질용액에, 실험 4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 및 실험 7의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 중의 어느 하나를 기질 고형분 1g당 1 단위 가하고, 35℃ 에서 8시간 작용시킨 후, HPLC에 의하여 반응후의 당조성(％)을 조사하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.
[표 17]
효소 기질*1 반응후의 당 조성*3(%)
기질*2 글루코오스 환상 4당 기타
C9 효소 성분 A 9.3 17.2(1.00) 67.6(1.09) 5.9
성분 B 77.1 0.7 5.1 17.1
성분 C 55.8 0.2 6.0 38.0
C11 효소 성분 A 9.0 17.4(1.00) 67.4(1.08) 6.2
성분 B 77.0 0.6 5.0 17.4
성분 C 56.0 0.2 5.9 37.9
*1: 성분 A는 3-0-α-이소말토실파노오스(화학식 1)을, 성분 B는 4-0-α-이소말토실파노오스(화학식 2)를, 성분 C는 1-0-α-이소말토실 β-파노시드(화학식 3)을 각각 의미한다.
*2: 반응 후에 잔존한 기질(성분 A, B 또는 C)의 전체 당질에 대한 비율을 나타내고 있다.
*3: 괄호속에 글루코오스와 환상 4당의 상성 몰비를 나타내고 있다.
표 17로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 성분 A에 잘 작용하고, 이 효소작용에 의해 등(等) 몰의 글루코오스와 환상 4당이 생성하였다. 한편, 성분 B 및 C에 대하여는 이 효소는 비교적 작용하기 어렵고, 성분 A를 기질로 할 경우와 비교하면 환상 4당의 생성은 적고, 또한, α-이소말토실 전이에 의한 또 다른 생성물로 생각되는 기타의 올리고당의 생성도 비교적 많이 나타났다.
이상으로부터, 이 효소의 작용에 의한 파노오스로부터의 환상 4당의 생성반응은, 주로 성분 A를 중간체로 하여 경유하고, 일부는 성분 B 및 C를 중간체로 하여 경유하고 있는 것이라고 추측되었다.
이상으로부터, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 파노오스에 대한 주된 작용은 아래와 같이 판단되었다.
(1) 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 파노오스에 작용해서 이소말토실기와 환원 말단 글루코오스와의 사이의 α-1,4 글루코실 결합을 절단하고, 분자간의 α-이소말토실 전이 반응에 의해, 이소말토실기를 파노오스의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치 또는 4 위치의 히드록실기 혹은 파노오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치의 히드록실기에 전이하여, 각각, 3-0-α-이소말토실파노오스(위에서 확인한 성분 A, 화학식 1), 4-0-α-이소말토실파노오스(위에서 확인한 성분 B, 화학식 2), 및 1-0-α-이소말토실 β-파노시드(위에서 확인한 성분 C, 화학식 3)을 생성한다.
(2) 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 상기한 생성물에도 작용하고, 이 효소가 3-0-α-이소말토실파노오스에 작용하면, 이 당질에 있어서의 α-이소말토실(1→3)-이소말토실기와 환원 말단 글루코오스와의 사이의 α-1,4 글루코실 결합을 절단하고, 분자내 전이의 환화반응에 의해, α-이소말토실(1→3)-이소말토실기에 있어서의 환원 말단의 1 위치의 원자를 그 자신의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치의 히드록실기에 전이해서 환을 닫아[폐환(閉環)하여], 환상 당질인 환상 4당을 생성한다.
이와 같이 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 분자간 전이와 분자내 전이의 두가지의 전이 작용을 가지고 있고, 이 효소의 분자간 전이는, 비환원 말단의 이소말토실기에 인접하는 α-1,4 글루코실 결합에 작용하여 그 이소말토실기를 다른 분자의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치 또는 4 위치의 히드록실기 혹은 환원 말단 글루코오스의 1 위치 히드록실기에 전이하는 분자간 이소말토실 전이 작용이고, 또한, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 분자내 전이는, 주로, 비환원 말단의 α-이소말토실-(1→3)-이소말토실기에 인접하는 α-1,4 글루코실 결합에 작용하여, α-이소말토실-(1→3)-이소말토실기에 있어서의 환원 말단을 그 자신의 비환원 말단 글루코오스의 3 위치 히드록실기에 분자내 전이하여, 환상 당질인 환상 4당을 생성하는 작용인 것이 밝혀졌다.
이상, 실험 20 및 실험 21의 결과로부터, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질에 작용해서 환상 4당을 생성하는 것이라고 판단된다.
실험 22: 전이 수용체 특이성
각종 당질이 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 전이 수용체에 될 수 있는가의 여부에 대해서, 아래의 시험을 하였다. 즉, 피험(被驗) 당질로서, D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸-α-D-글루코시드, 메틸-β-D-글루코시드, N-아세틸-D-글루코사민, D-리보오스, L-리보오스, D-프시코오스, 소르비톨, 크실리톨, 만니톨, 아라비톨, 리비톨, 에리드리톨, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 이소파노오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 이소말토실글루코시드, α-환상 덱스트린, β-환상 덱스트린, γ-환상 덱스트린, 및 L-아스코르브산을 사용하고, 이들 중의 어느 하나를 함유하는 수용액을 조제하였다.
이들 피험 당질의 수용액 각각에, 당공여체로서 파노오스를 등(等) 농도가되도록 가하고, 또한, 실험 4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 7의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 11의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 실험 15의 방법으로 얻은 아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품, 및 실험 18의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 부분 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품 중의 어느 하나를, 당질 고형물 1g당 10 단위씩 가하여, 당농도를 3.2w/v％가 되도록 조정하였다.
이상의 반응액을 30℃, pH 6.0에서 24시간 유지해서 효소반응에 사용하였다. 효소반응후의 반응액을, 피험 당질이 단당 또는 2당인 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 「GLC법」이라 약기한다.)에 의하고, 그리고 피험 당질이 3당 이상인 경우는 HPLC법에 의하여 분석하여, 당전이물이 생성한 것인가 아닌가에 의해, 각각의 피험 당질이 이 효소의 전이 수용체가 될 수 있는 것인가 아닌가를 조사하였다.
그리고 GLC에서는, GLC 장치는 일본국의 주식회사 島津제작소제 『GC-16A』, 칼럼은 지·엘·사이언스 주식회사제 『2％ 실리콘 OV－17/크로모졸브W』를 충전한 스테인레스 칼럼(3mmφ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40ml/분으로 160℃에서부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온 검출기로 분석하였다. HPLC에 있어서, HPLC 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(주식회사 와이 에무 시사 제조), 용리액은 물을 유속 0.5ml/분으로, 검출은 시차(示差) 굴절계로 분석하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
[표 18]
(1)
피험 당질 전이 생성물
C9 효소 C11 효소 N75 효소 S1 효소 A19 효소
D-글루코오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
D-크실로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
L-크실로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
D-갈락토오스 - - - ＋ ±
D-프룩토오스 - - - ＋ ±
D-만노오스 - - - - -
D-아라비노오스 ± ± ± ＋ ±
D-푸코오스 ± ± ± ＋ ±
L-소르보오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
L-람노오스 ± ± ± ＋ ±
메틸-α-글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
메틸-β-글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋
N-아세틸-글루코사민 - - - - -
D-리보오스 - - - ＋ ±
L-리보오스 - - - ＋＋ ±
D-프시코오스 - - - ± ±
소르비톨 - - - ± ±
크실리톨 - - - ± ±
만니톨 - - - - -
아라비톨 - - - ± -
리비톨 - - - ± -
에리드리톨 ＋ ＋ ＋ ＋ ±
말토오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
말토트리오스 ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋
주) 표 중에서, 「-」는 당전이물이 생성하지 않은 것을,「±」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 1％ 미만 생성한 것을, 「+」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 1％ 이상 10％ 미만 생성한 것을, 「++」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 10％ 이상 생성한 것을 나타내고 있다.
(2)
피험 당질 전이 생성물
C9 효소 C11 효소 N75 효소 S1 효소 A19 효소
말토테트라오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
말토펜타오스 ＋ ＋ ＋ ± ＋
이소말토오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
이소말토트리오스 ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋
트레할로오스(α,α) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
네오트레할로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
코지비오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
니게로오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
셀로비오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
겐티비오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋
이소파노오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
말티톨 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
말토트리이톨 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
락토오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
수크로오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
에를로오스 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
이소말토실글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
α-환상 덱스트린 - - - - -
β-환상 덱스트린 - - - - -
γ-환상 덱스트린 - - - - -
L-아스코르브산 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
주) 표 중에서, 「-」는 당전이물이 생성하지 않은 것을,「±」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 1％ 미만 생성한 것을, 「+」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 1％ 이상 10％ 미만 생성한 것을, 「++」는 당전이물이 전체 당질에 대하여 10％ 이상 생성한 것을 나타내고 있다.
표 18의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 전이 수용체로서 여러 가지의 당질을 이용할 수 있는 것이 밝혀졌다. 상세하게는, 바실루스 글로비스포루스에 속하는 미생물인 C9주, Cl1주 및 N75주 유래의 이 효소는, 특히, D-글루코오스, D- 및 L-크실로오스, 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, 이소말토오스, 네오트레할로스, 겐티비오스, 이소말토실글루코시드, 및 L-아스코르브산에 잘 전이하고, 이어서, L-소르보오스, 말토오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 셀로비오스, 락토오스, 수크로오스, 말토트리오스, 이소말토트리오스, 이소파노오스, 에를로오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 에리드리톨, 말티톨, 말토트리이톨에 전이하고, 더욱이는, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-람노오스에도 전이하는 것이 밝혀졌다.
아르드로박터 라모서스 Sl 유래의 이 효소는, 특히, D-글루코오스, D- 및 L-크실로오스, 메틸-α-글루코시드, L-리보오스, 이소말토오스, 네오트레할로스, 말토트리오스, 이소말토트리오스, 이소말토실글루코시드, L-아스코르브산에 잘 전이하고, 이어서, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸-β-글루코시드, D-리보오스, 말토오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 락토오스, 수크로오스, 이소파노오스, 에를로오스, 말토테트라오스, 에리드리톨, 말티톨, 말토트리이톨에 전이하며, 더욱이는, D-프시코오스, 말토펜타오스, 소르비톨, 크실리톨, 아라비톨, 리비톨에도 전이하는 것이 밝혀졌다.
아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 이 효소는, 특히, D-글루코오스, D- 및 L-크실로오스, 메틸-α-글루코시드, 이소말토오스, 네오트레할로스, 이소말토실글루코시드에 잘 전이하고, 이어서, L-소르보오스, 메틸-β-글루코시드, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 이소말토트리오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 이소파노오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, L-아스코르브산에 전이하고, 더욱이는, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-람노오스,D-리보오스, L-리보오스, D-프시코오스, 소르비톨, 크실리톨, 에리드리톨에도 전이하는 것이 밝혀졌다.
이상 설명한 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 성질 중에서, 정제 표품에 대해서 얻어진 것을, 먼저 알테르난으로부터 환상 4당의 생성이 보고되어 있는 『유러피안 저널 오브 바이오케미스트리』, 제226권, 633 내지 639 페이지 (1994년) 기재의 가수분해 효소 알테르나아제의 경우와 비교하였다. 그 결과를 표 19에 정리하였다.
[표 19]
성 질 α-이소말토실 전이 효소 알테르나아제
C9 효소 C11 효소 N75 효소 S1 효소
효소의 종류 전이효소 전이효소 전이효소 전이효소 가수분해 효소
등전점(pI) 5.5 ±0.5 5.6 ±0.5 7.8 ±0.5 4.2 ±0.5 약 4
반응 최적 pH 약 6.0 약 5.5∼6.0 약 6.0 약 6.0 약 7
Ca2+에 의한 활성화 없음 없음 없음 없음 있음
Fe2+, Mn2+, EDTA에 의한 저해 없음 없음 없음 없음 있음
가용성 전분, 풀룰란의 가수분해 하지않음 하지않음 하지않음 하지않음 약하게 함
표 19로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는 알테르나아제와는 전혀 다른 성질을 가진 신규의 효소라고 할 수 있다.
실험 23: 환상 4당의 조제
파노오스(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 7의 방법으로 얻은 본 발명의 정제 α-이소말토실 전이 효소 표품을 파노오스 1g당 2 단위 가하고, 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이 반응액의 일부를 취하여, HPLC에 의해 환상 4당 생성량을 조사한 결과, 당조성으로서 약 44％이었다.
이 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 처리(고형물 1g당 1500 단위를 첨가)와 일본국의 나가세 생화학 공업사제 글루코아밀라아제제(글루코자임) 처리(고형물 1g당 75 단위를 첨가)를 24시간 하여 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해 하고, 다시, 수산화 나트륨으로 pH 5.8로 조정하여 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시키고, 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막을 사용하여 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 3650g을 함유하는 당액 약 6.1kg을 얻었다. 얻어진 당액을, 일본국의 오르가노사제 이온교환 수지(앰버라이트 CR-1310, Na형)를 충전한 칼럼(겔량: 약 225L)에 사용하고, 칼럼내 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건으로 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당 조성을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 모니터하여, 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하고, 통상적인 방법에 따라 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 1000g을 함유하는 당액 약 3kg을 얻었다. 얻어진 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.2％이었다.
실험 24: 수용액으로부터의 결정화
실험 23의 방법으로 얻은 환상 4당 수용액을 에바포레이터에서 농도 약 50％로 농축한 후, 얻어진 농축 당액 약 2kg을 원통상의 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전하면서 약 20시간 동안에서 온도를 65℃로부터 20℃까지 내려서 결정을 석출시켜, 건조하여 백색의 결정상 분말을 얻었다. 그 현미경 사진을 도 25에 나타낸다.
계속해서, 원심여과기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 결정상물을 습중량으로 542g 회수하였다. 더욱이, 60℃에서 3시간 건조해서 환상 4당 결정상 분말을 456g 얻었다. 얻어진 결정상 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도이었다.
이 환상 4당의 결정상 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 도 26에 나온 바와 같이, 주(主)회절각(2θ）으로서, 10.1°, 15.2°, 20.3° 및 25.5°를 가진 것을 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 그리고 이 결정상 분말의 수분을 카알 피셔법에 의해 측정한 결과, 그 수분은 13.0％이고, 또한, 환상 4당 1분자당 5 내지 6분자의 물을 함유하는 결정인 것이 밝혀졌다.
더욱이, 이 환상 4당의 결정 분말을 열중량 측정한 결과, 도 27에 나타내는 열중량곡선을 얻을 수 있고, 그 중량변화와 온도와의 관계로부터 150℃까지 온도를 상승시켰을 때, 4 내지 5분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 이어서, 250℃ 부근에서 1분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나며, 더욱이, 280℃ 부근에서부터 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 환상 4당 5 내지 6 함수결정은, 상압에서, 온도를 150℃까지 상승시킴으로써 결정 분자당 4 내지 5분자의 물이 이탈해서 1분자의 물을 함유하는 결정이 되고, 더욱이 250℃ 부근에서 1분자의 물이 결정으로부터 이탈해서 무수결정으로 되는 것이 밝혀졌다.
실험 25: 환상 4당 1 함수결정으로의 변환
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 유리 용기에 넣고, 미리 온도 140℃로 보온한 오일 배스(oil bath) 중에서 그 유리 용기를 30분간 유지하였다. 얻어진 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 열처리전의 5 내지 6 함수결정의 분말 X선 회절과는 전혀 다르고, 도 28에 나온 바와 같이, 주회절각(2θ)으로서, 8.3°, 16.6°, 17.0° 및 18.2°를 가진 것을 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 또한, 이 결정상 분말의 수분을 카알 피셔법에 의해 측정한 결과, 그 수분은 약 2.7％ 이어서, 환상 4당 1분자당 1분자의 결정수를 함유하는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 이 결정 분말을 열중량 측정한 결과, 도 29에 나온 열중량 곡선이 얻어지고, 그 중량변화와 온도의 관계로부터 온도 270℃ 부근에서 1분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 더욱이, 온도 290℃ 부근에서부터 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들 결과로부터, 본 실험 예에서 얻은 환상 4당 결정상물은 1 함수결정인 것이 밝혀졌다.
실험 26: 무수결정으로의 변환
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 온도 40℃ 또는 120℃에서 각각 16시간 진공건조하였다. 얻어진 환상 4당 분말의 수분을 카알 피셔법에 의해 측정한 결과, 진공건조 온도 40℃의 경우는 수분이 약 4.2％이며, 진공건조 온도 120℃의 경우는 수분이 약 0.2％ 이어서, 실질적으로 무수(無水)인것이 밝혀졌다. 이들 진공건조한 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 진공건조전의 5 내지 6 함수결정의 분말 X선 회절 및 1 함수결정의 것과는 전혀 다르고, 도 30(진공건조 온도 40℃), 도 31(진공건조 온도 120℃)에 나온 바와 같이, 주회절각(2θ)으로서, 10.8°, 14.7°, 15.0°, 15.7° 및 21.5°를 가진 것을 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 양(兩) 회절 스펙트럼 사이의 피이크 강도에 강약이 나타나기는 하지만, 기본적으로 피이크의 회절각(2θ)은 동일하여, 결정학적으로 동일한 무수결정이라고 판단되었다. 또한, 회절 스펙트럼의 베이스 라인은 산 모양을 나타내고, 진공건조 전의 환상 4당 5 내지 6 함수결정의 것, 및 1 함수결정의 것과 비교하여 결정화도가 저하하고 있어, 비결정 상태의 환상 4당이 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 이로부터, 진공건조 40℃의 경우의 수분을 약 4.2％ 함유하는 환상 4당 분말은, 그 수분을 함유하는 환상 4당 비결정과 환상 4당 무수결정이 혼재하는 분말이라고 추측되었다.
이상으로부터, 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 진공건조함으로써 환상 4당 5 내지 6 함수결정은 물분자를 상실하여 비결정 상태의 아모르퍼스(amorphous)와 무수결정으로 변환하는 것이 밝혀졌다. 또한, 수분 0.2％의 무수환상 4당 분말에 대해서 실험 24와 마찬가지로 열중량 분석한 결과, 도 32에 나온 바와 같이, 온도 270℃ 부근에서부터 환상 4당의 열분해로 생각되는 중량감소만이 관찰되었다.
실험 27: 물에 대한 포화농도
온도 10 내지 90℃에서의 물에 대한 환상 4당의 포화농도를 조사하기 위해서 밀폐마개가 있는 유리제 용기에 물 10ml을 넣고, 거기에 실험 24의 방법으로 얻은환상 4당 5 내지 6 함수결정을, 각 온도에서 완전히 용해하는 양 이상의 양을 가한 후, 유리 용기를 밀봉하고, 포화에 달할때 까지 온도 10 내지 90℃에서 보온하면서 2일간 교반하였다. 각각의 온도의 환상 4당 포화용액을 정밀여과해서 미용해의 환상 4당을 제거한 후, 그 여액의 수분을 건조 감량법(120℃에서 진공건조)으로 조사하여 각 온도에서의 포화농도(무수물 환산)를 구하였다. 그 결과를 표 20에 나타낸다.
[표 20]
온도(℃) 환상 4당의 포화농도(%) 물 100g에 용해하는 환상 4당의 중량(g)
10 30.3 43.5
30 34.2 51.9
50 42.6 74.2
70 53.0 112.7
90 70.5 239.0
실험 28: 열안정성
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 물에 용해하여 농도 10w/v％의 환상 4당 수용액을 조제하고, 이 용액 8ml을 유리제 시험관에 취하여 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 방냉(放冷) 후, 이들 용액의 착색도의 측정과, 실험 1 기재의 액체 크로마토그래피법에 의한 순도측정을 하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로 하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[표 21]
가열시간(분) 착색도(A480nm) 순도(%)
0 0.00 100
30 0.00 100
60 0.00 100
90 0.00 100
표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당 수용액은 120℃의 고온가열에서도 착색은 없고, 당 조성의 순도의 저하도 없으므로 환상 4당은 열에 대하여 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 29: pH 안정성
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 각종 완충액(20mM)에 용해하고, 환상 4당을 농도 4w/v％, pH 2 내지 10으로 조정한 환상 4당 용액을 조제하였다. 각각의 용액 8ml을 유리제 시험관에 취하여 밀봉한 후, 100℃에서 24시간 가열하였다. 방냉 후, 이들 용액의 착색도의 측정과, 실험 1에 기재한 액체 크로마토그래피법에 의한 순도측정을 하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로 하였다. 그 결과를 표 22에 나타낸다.
[표 22]
pH(완충액의 종류) 착색도(A480nm) 순도(%)
2.0(아세트산) 0.00 93
3.0(아세트산) 0.00 100
4.0(아세트산) 0.00 100
5.0(아세트산) 0.00 100
6.0(트리스-염산) 0.00 100
7.0(트리스-염산) 0.00 100
8.0(트리스-염산) 0.00 100
9.0(암모늄) 0.00 100
10.0(암모늄) 0.00 100
표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 120℃의 고온에서 24시간가열하여도 pH 2 내지 10의 넓은 범위해서 착색은 없고, pH 2에서 당 조성의 순도는 약간 저하하지만, pH 3 내지 10의 범위에서는 전혀 당 조성의 순도는 저하하지 않고, 환상 4당은 넓은 pH 범위에서, 환언하면, pH 3 내지 5의 산성쪽, pH 6 내지 8의 중성쪽, pH 9 내지 10의 알칼리쪽에서 펄펄 끓여도 극히 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 30: 아미노카르보닐 반응
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 물에 용해하고, 더욱이, 거기에 시판 시약 특급인 글라이신과 인산 완충액을 가하고, 50mM 인산 완충액으로 pH 7.0으로 조정한 1w/v％ 글리신을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을 조제하였다. 그 용액 4ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 100℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 이들의 착색도를 측정하여 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로 하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다.
[표 23]
가열시간(분) 착색도(A480nm)
0 0.00
30 0.00
60 0.00
90 0.00
표 23의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 글라이신 공존하에서 가열해도 착색은 없고, 글라이신과의 갈변을 일으키지 않는, 바꾸어 말하면 아미노카르보닐 반응(메일라아드 반응이라고도 한다)을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 31: 아미노카르보닐 반응
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정과 시판 폴리펩톤(일본제약제)을 탈이온수에 용해하고, 5w/v％ 폴리펩톤을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을 조제하였다. 이 용액 4ml을 유리제 시험관에 취하여 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 이들의 착색도를 측정하여 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 동시에, 폴리펩톤만을 함유하는 용액을 블랭크로 하여 마찬가지로 가열하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로 하고, 블랭크의 흡광도를 뺀 값으로 하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
[표 24]
가열시간(분) 착색도(A480nm)
0 0.00
30 0.00
60 0.00
90 0.00
표 24의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 폴리펩톤 공존하에서 가열하여도 폴리펩톤과의 갈변을 일으키지 않는, 바꾸어 말하면, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 32: 포접 작용
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 탈이온수에 용해하여 20％ 수용액을 조제하였다. 이 수용액 100g당, 메탄올은 2g, 에탄올은 3g, 아세트산은 4.6g을 가하여 포접(包接)을 하였다. 그 후, 각각을 여과하고, 여액을 동결건조하여 미포접물을 제거하였다. 대조로서, 포접능을 가진 것이 알려져 있는 분기 시클로덱스트린(상품명 『이소에리이토 P』, 일본국의 마루하 주식회사 판매)을 사용하여 마찬가지로 하였다.
동결 건조 분말중의 포접물의 량을 측정하기 위해서, 각각의 동결 건조분말 1g을 5ml의 탈이온수에 용해하고, 거기에 5ml의 디에틸 에테르를 가하여 추출을 하고, 다시, 추출을 반복한 후, 디에틸 에테르중의 추출물을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다. 그 결과를 표 25에 나타낸다.
[표 25]
포접물 포접량(mg/g-동결건조 분말)
환상 4당 이소에리이토 P(대조)
메탄올 6.71 2.92
에탄올 17.26 8.92
아세트산 67.74 30.57
표 25의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 포접능을 가지고 있고, 그 포접능은, 분기 사이클로덱스트린의 그것과 비교하여 중량당 약 2배의 강도인 것이 밝혀졌다.
실험 33: 감미도
실험 24의 방법으로 얻어진 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 탈이온수에 용해하여 고형물당 10％ 수용액을 조제하고, 이 환상 4당 10％ 수용액을 기준으로 하여 수크로오스(시판 그래뉼러당)의 농도를 변화시켜, 패널리스트 5명에 의해 관능시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당의 감미도는 수크로오스의 약 20％이었다.
실험 34: 소화성 시험
실험 14의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 사용하고, 『일본 영양식량학회지』, 제43권, 23 내지 29 페이지 (1990년)에 기재한 오카다 등의 방법에 준하여, 시험관내에서의 타액 아밀라아제, 합성 위액, 췌액 아밀라아제, 소장점막 효소에 의한 환상 4당의 소화성을 조사하였다. 대조로서, 난(難)소화성 당질로서 알려져 있는 말티톨을 사용하였다. 그 결과를 표 26에 나타낸다.
[표 26]
소화효소 소화효소에 의한 분해율(%)
환상 4당 말티톨(대조)
타액 아밀라아제 0.0 0.0
합성 위액 0.0 0.0
췌액 아밀라아제 0.0 0.0
소장점막 효소 0.74 4.0
표 26의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은, 타액 아밀라아제, 합성 위액, 췌액 아밀라아제에 의해 전혀 소화되지 않고, 소장점막 효소에 의해 약간 소화되었지만, 그 정도는 0.74％로서 낮은 값이며, 대조의 난(難)소화성 당질 말티톨의 1/5 이하이어서 환상 4당이 극히 소화되기 어려운 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 35: 발효성 시험
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 사용하고, 『저널 오브 뉴트리쇼날 사이언스 앤드 비타미놀로지(Jourmal of Nutritional Science and Vitaminology)』, 제37권, 529 내지 544 페이지 (1991년)에 기재한 Oku 등의 방법에 준하여 래트 맹장 내용물에 의한 환상 4당의 발효성을 조사하였다. 맹장 내용물은, 위스타계 수컷 래트를 에테르 마취하에서 도살하여 혐기적으로 채취하고, 4 배량의 0.1M 탄산 수소 나트륨 수용액에 현탁한 것을 사용하였다. 환상 4당은 맹장 내용물 중량당 약 7％을 첨가하고, 첨가 직후 및 12시간 후에 잔존하는 환상 4당의 량은 가스 크로마트그래피법으로 정량 하였다. 그 결과, 첨가 직후의 환상 4당 농도는 맹장 내용물 g당 68.Omg, 12시간후의 환상 4당 농도는 맹장 내용물 1g당 63.0mg 이며, 93％가 발효되지 않고 잔존하고 있는 것을 알 수 있어, 환상 4당은 극히 발효되기 어려운 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 36: 자화성(資化性) 시험
실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 사용하고, 『장내 플로라와 식물인자』, 光岡知足편, 학회출판 센터 (1984년)에 기재된 방법에 준하여 각종 장내 세균에 의한 자화성을 조사하였다. 즉, 미리 배양해 둔 신선한 균을, 환상 4당을 0.5％ 첨가한 PYF 배지 5ml에 약 107CFU 접종하고, 혐기 조건하에서 37℃에서 4일간 배양하였다. 대조로서, 자화되기 쉬운 당질 글루코오스를 사용하였다. 자화성의 판정은, 배양후의 배양액의 pH가 6.0 이상의 경우, 자화되지 않음 (-)로 하고, 6.0 미만의 경우, 자화됨 (+)로 하였다. 더욱이, 배양액 중에 잔존하는 당질을 안드론법으로 측정하여 당질의 감소량을 조사하고, 자화성의 판정을 추인하였다. 그 결과를 표 27에 나타낸다.
[표 27]
장내 세균주 자 화 성
환상 4당 글루코오스(대조)
Bacteroides vulgatus JCM5826 - ＋
Bifidobacterium adolescentis JCM1275 - ＋
Clostridium perfringens JCM3816 - ＋
Escherichia coli IFO3301 - ＋
Eubacterium aerofaciens ATCC25986 - ＋
Lactobacillus acidophilus JCM1132 - ＋
표 27의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은, 시험한 장내 세균식의 어느 것에도 자화(資化)되지 않고, 대조의 글루코오스는 어느 것에도 자화되었으므로, 환상 4당이 장내 세균에게 극히 자화되기 어려운 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 37: 급성독성 시험
마우스를 사용하고, 실험 24의 방법으로 얻은 환상 4당 고함수 결정을 경구투여해서 급성독성 시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당은 저독성의 물질이고, 투여가능한 최대 투여량에서도 사망예는 나타나지 않았다. 따라서, 그 LD50값은 50g/kg 마우스 체중 이상인 것이 밝혀졌다.
이상의 실험 33 내지 37의 결과로부터, 환상 4당은 경구섭취하여도, 소화, 흡수되기 어렵고, 무(無)칼로리 내지 저칼로리의 가식(可食) 소재로서, 다이어트 감미료, 고감미도 감미료의 부형제, 다이어트 음식물의 증점제, 증량제, 부형제, 더욱이는 식물(食物) 섬유, 지방대체 식품재료 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 환상 4당, 그것을 함유하는 당질의 제조 방법을 실시예 A에서, 그리고 환상 4당, 그것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물을 실시예 B에서 나타낸다.
실시예 A-1
바실루스 글로비스포루스 Cll(FERM BP-7144)을 실험 6의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양 후, SF막을 이용해서 제균 여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 다시, 그 여액을 UF막 농축하여, 본 발명의 조(粗)α-이소말토실 전이 효소액 약 1L(30.2 단위/ml)을 회수하였다. 이어서, 파노오스(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 10％ 농도가 되도록 물에 용해시킨 후, pH 6.0, 온도 35℃로 조정하고, 여기에 상기의 방법으로 조제한 조α-이소말토실 전이 효소를 파노오스 1g당 2 단위의 비율이 되도록 첨가하고, 36시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻은 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여 건조하고, 분쇄하여, 환상 4당 함유 분말을 고형물당 수율 약 91％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 34％, 이소말토오스 2.l％, 파노오스 2.3％, 환상 4당 45.0％, 이소말토실파노오스 4.8％, 이소말토실파노시드 1.8％, 및 그 밖의 당질을 10.0％ 함유하고 있고, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-2
분말 말토오스(주식회사 林原 제조, 등록상표 『산말토』)를 30％ 수용액으로 하고, 여기에 α-글루코시다아제를 함유하는 효소제(天野제약 주식회사, 상품명 『트란스글루코시다아제 L 아마노』를 말토오스 고형물당 0.08％ 가하고, pH 5.5로 조정하여 55℃에서 18시간 반응시키고, 이어서 가열 실활시킨 후, pH 6.0, 온도 35℃로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 조제한 조(粗)α-이소말토실 전이 효소를 고형물 1g당 2 단위의 비율이 되도록 첨가하고, 36시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하고 10분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻은 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제 하고, 더욱이 농축해서 농도 70％의 시럽을 고형물당 수율 약 92％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 32.5％, 말토오스 15.7％, 이소말토오스 9.8％, 말토트리오스 4.0％, 파노오스 0.3％, 이소말토트리오스 1.6％, 환상 4당 17.5％, 이소말토실파노오스 1.2％, 이소말토실파노시드 0.7％, 및 그 밖의 당질을 16.7％ 함유하고 있어, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지고, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-3
풀룰란(주식회사 林原 제조)을 5％ 수용액으로 하고, 여기에 β-아밀라아제(일본국의 生化學공업 주식회사 제조) 및 풀룰라나아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 풀룰란 고형물 1g당 각각 500 단위, 20 단위의 비율로 가하여, pH 6.0으로 조정하고, 45℃에서 48시간 반응시킨 다음에 가열 실활시킨 후, pH6.0, 온도 35℃로 조정하고, 여기에 실험 4의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실 전이 효소를 고형물 1g당 2 단위의 비율이 되도록 첨가하고, 36시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻은 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 70％의 시럽을 고형물당 수율 약 90％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 10.7％, 말토오스 62.7％, 말토트리오스 0.1％, 환상 4당 22.6％, 이소말토실말토오스 1.0％, 및 그 밖의 당질을 2.9％ 함유하고 있어, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지고, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-4
옥수수 전분을 농도 33％ 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 농도 0.1％가 되도록 탄산 칼슘을 가해서 pH 6.5로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제제(劑)(노보사제, 상품명 『쿠마밀 60L』) 전분 1g당 0.2％가 되도록 가하여, 95℃에서 15분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 55℃로 급냉하여, 여기에 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 1g당 1,000 단위 및 β-아밀라아제(나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 1g당 60 단위의 비율이 되도록 가하고, 24시간 반응시킨 다음 가열 실활시켰다. 이것을 농도 30％, pH 5.5, 온도 55℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』를 말토오스 고형물 1g당 0.08％ 가하고, 18시간 반응시킨 다음, 가열 실활시킨 후, pH 6.0, 온도 35℃로 조정하고, 여기에 실험 7의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실 전이 효소를 고형물 1g당 2 단위의 비율이 되도록 첨가하고, 36시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻은 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 0형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 70％의 시럽을 고형물당 수율 90％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 25.1％, 말토오스 13.8％, 이소말토오스 13.9％, 말토트리오스 3.5％, 파노오스 0.2％, 이소말토트리오스 2.0％, 환상 4당 14.5％, 이소말토실파노오스 2.5％, 이소말토실파노시드 1.7％, 및 그 밖의 당질을 22.8％ 함유하고 있어, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지고, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-1의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 분말을, 농도 5％, pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, 여기에 α-글루코시다아제제 『트란스글루코시다아제 L 아마노』,글루코아밀라아제제(나가세 생화학공업 주식회사 제조, 상품명 『글루코자임』)를 고형물 1g당 각각 1500 단위 및 75 단위 첨가하여 24시간 반응하고, 그 반응액을 95℃로 가열하고, 10분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻은 여액을 통상적인방법에 따라 활성탄으로 탈색하여 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60％의 시럽을 얻었다. 얻어진 당액을 강산성 양이온 교환 수지 『앰버라이트 CR-1310. Na형』(오르가노 주식회사 제조)을 이용해서 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 5.4cm의 쟈켓부 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하고, 직렬로 연결하여 수지층의 전체 길이를 20m로 하였다. 칼럼내 온도를 60℃로 유지하면서, 당액을 수지에 대하여 5v/v％ 가하고, 여기에 60℃의 온수를 S V O.13에서 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하여, 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 환상 4당 고함유액을 고형물당 수율 약 28％로 얻었다. 이 고함유액은 고형물당 약 99％의 환상 4당을 함유하고 있었다.
이 용액을 농도 약 70％로 농축한 후, 결정석출 관(瓘)에 넣고, 종정으로서 환상 4당 5 내지 6 함수결정 약 2％을 가하여 서냉함으로써, 결정석출율 약 45％의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑 위의 노즐로부터 150kg/cm2의 고압으로 분무 하였다. 이와 동시에 85℃의 열풍을 건조탑의 상부에서 송풍하고, 저부에 설치한 이송용 철망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하며, 컨베이어 아래로부터 45℃의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 꺼냈다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하고 온풍을 보내면서 10시간 숙성시켜, 결정화와 건조를 완료하여 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다.
이 제품은 실질적으로 환원성을 나타내지 않고, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한점도, 보습성, 포접성, 난(難)소화성을 가지고, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-6
실시예 A-3의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽을 실시예 A-5의 방법에 준해서 α-글루코시다아제처리와 글루코아밀라아제처리를 한 후, 통상적인 방법에 따라, 여과하고, 활성탄으로 탈색, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하고, 농축하여 농도 65％의 당액을 얻었다. 이 당액을 실시예 A-5의 방법에 준해서 강산성 양이온 교환 수지를 이용한 칼럼 분획을 하여 환상 4당 고함유 획분을 채취함으로써, 환상 4당 고함유액을 고형물당 수율 약 10.5％로 얻었다. 이 고함유액은 고형물당 약 98％의 환상 4당을 함유하고 있었다.
이 용액을 농도 약 80％로 농축한 후, 이어서 결정석출기에 옮기고, 여기에 종정으로서 환상 4 당 5 내지 6 함수결정 1％ 가하고, 80℃에서 5분간 교반 조정(助晶)하고, 이어서, 알루미늄제 배트에 꺼내고, 실온에서 24시간 결정석출 숙성시켜 블록을 조제하였다. 이어서, 이 블록을 절삭기에서 분쇄하고, 유동상 건조하여 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다.
이 제품은 환원성이 극히 낮고, 실질적으로 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난(難)소화성을 가지고, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-7
실시예 A-6의 방법으로 얻어진 환상 4당 고함유액을 농축하면서 연속 결정석출시켜 얻은 매스키트를 바스켓형 원심분리기에서 분밀(分蜜)하고, 결정을 소량의 물로 스프레이 하고, 세정해서 고순도의 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 고형물당 약 55％의 수율로 얻었다.
이 제품은 고형물당 순도 98％ 이상의 고순도 환상 4당 5 내지 6 함수결정이며, 환원성이 극히 낮고, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난(難)소화성을 가지고, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이는 공업시약, 화학원료 등에도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-8
옥수수 전분을 농도 33％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 농도 0.1％가 되도록 가하여 pH 6.5에 조정하고, 더욱이, α-아밀라아제제(노보사제, 상품명 『쿠마밀 60L』)를 전분 1g당 0.2％가 되도록 가하고, 95℃에서 15분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 오토클레이브후의 반응액을 약 55℃까지 급냉하고, pH 5.5로 조정한 후, 여기에 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 1g당 500 단위와, β-아밀라아제(나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 1g당 60 단위의 비율이 되도록 가하여 24시간 반응시키고, 이어서 열실활시켰다. 여기에 α-글루코시다아제제(劑) 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』를 고형물 1g당 O.08％ 첨가하고, 또한, 실험 11의 방법으로 조제한 정제 α-이소말토실 전이 효소를 고형물 1g당 1.5 단위의 비율이 되도록 가하고, 48시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃로 가열해서 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과하여 얻어진 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄에 의한 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 70％의 시럽을 고형물당 수율 약 90％로 얻었다. 이 제품은 고형물당, 글루코오스 23.7％, 말토오스 13.8％, 이소말토오스 14.1％, 말토트리오스 3.2％, 파노오스 0.3％, 이소말토트리오스 2.1％, 환상 4당 14.0％, 이소말토실파노오스 2.4％, 이소말토실파노시드 1.9％, 및 그 밖의 당질을 24.5％ 함유하고 있어, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지고, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-9
아르드로박터 라모서스 Sl(FERM BP-7592)을 실험 14의 방법에 준해서 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 얻어진 배양물 약 20L을 SF막을 이용해서 제균 여과하고, 또한, 그 여액을 UF막 농축하여 본 발명의 조(粗)α-이소말토실 전이 효소액을 약 1L(8.0 단위/ml)을 얻었다. 이어서, 파노오스(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 농도 25％가 되도록 물에 용해시킨 후, pH 5.5, 온도 45℃로 조정하고, 여기에 위에서 얻은 조(粗)α-이소말토실 전이 효소액을 파노오스 1g당 1.5 단위의 비율이 되도록 첨가하고, 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열해서 10분간 유지한 후, 냉각하여 여과하고, 얻어진 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 정제하고, 더욱 농축하여 건조하고, 분쇄하여 환상 4당 함유 분말을 고형물당 수율 약 93％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 33.3％, 이소말토오스 2.5％, 파노오스 2.0％, 환상 4당 44.5％, 이소말토실파노오스 5.2％, 이소말토실파노시드 1.3％, 및 그 밖의 당질을 11.3％ 함유하고 있어, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지고, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-1: 감미료
실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 O.8 중량부에, 트레할로로오스 함수결정(주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『Treha』) 0.2 중량부, α-글리코실스테비오시드(東洋精糖주식회사 판매, 상품명 『αG스위트』) 0.01 중량부, 및 L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸에스테르(상품명 『아스파르테임』) 0.01 중량부를 균일히 혼합하고, 과립 성형기에서 과립상 감미료를 얻었다.
이 제품은 단 맛의 질이 좋고, 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지고 있다. 이 제품의 칼로리는, 환상 4당 5 내지 6 함수결정이 난(難)소화성, 난(難)발효성이고 실질적으로 무칼로리이므로, 감미도당 수크로오스의 약 10분의 1이다. 더욱이, 이 제품은 실온보존하에서 변질 열화의 우려가 없고, 안정하다. 따라서, 이 제품은 고품질의 저칼로리, 낮은 충치 유발성 감미료로서 적합하다.
실시예 B-2: 하드 캔디
농도 55％ 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 50 중량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에 수분 2％ 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 중량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하여 통상적인 방법에 따라 형성하여 제품을 얻었다.
이 제품은 깨물기, 정미, 풍미가 모두 양호하고, 수크로오스의 결정석출도 일으키지 않으며, 흡습성이 적고, 늘어쳐짐도 일으키지 않는 안정한 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 B-3: 츄잉검
츄잉검 베이스 3 중량부를 연해질 정도로 가열 용융하고, 여기에 무수결정 말티톨 2 중량부, 크실리톨 2 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부, 및 트레할로오스 함수결정 1 중량부를 가하고, 더욱이 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여 통상적인 방법에 따라 로울러 의해 혼련하고, 성형, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 텍스처, 정미, 풍미가 양호하고, 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 츄잉검으로서 적합하다.
실시예 B-4: 가당 연유(煉乳)
원유 100 중량부에 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부 및 수크로오스 2 중량부를 용해하고, 플레이트 히터에서 가열 살균하고, 이어서 농도 70％로 농축하고, 무균상태로 통조림 해서 제품을 얻었다.
이 제품은 온화한 단 맛이고 풍미도 좋으며, 후루츠, 커피, 코코아, 홍차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-5: 유산균 음료
탈지 분유 175 중량부, 실시예 A-4의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 130 중량부 및 락토수크로오스 고함유 분말(주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『乳果 올리고』) 50 중량부를 물 1,150 중량부에 용해하여 65℃에서 30분간 살균하고, 40℃로 냉각 후, 여기에, 통상적인 방법에 따라, 유산균의 스타아터를 30 중량부 식균하고, 37℃에서 8시간 배양해서 유산균 음료를 얻었다.
이 제품은 풍미 양호하고, 올리고당, 환상 4당을 함유하며, 유산균을 안정하게 유지할 뿐만 아니라, 비피더스균 증식 촉진 작용, 정장 작용을 가지는 유산균 음료로서 적합하다.
실시예 B-6: 분말 쥬우스
분무건조에 의해 제조한 오렌지 과즙분말 33 중량부에 대하여, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 50 중량부, 무수결정 말티톨 10 중량부, 무수 시트르산 0.65 중량부, 사과산 0.1 중량부, 2-0-α-글루코실-L-아스코르브산 0.2 중량부, 시트르산 소다 0.1 중량부, 풀룰란 0.5 중량부 및 분말향료 적당량을 잘 혼합교반하고, 분쇄하여 미세한 미분말로 해서, 이것을 유동층조립기(造粒機)에 넣어, 배풍(排風)온도 40℃로 하고, 여기에 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당 고함유액을 바인더로 하여 적당량 스프레이 하고, 30분간 조립(造粒)하고, 계량, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 과즙 함유율 약 30％의 분말 쥬우스이다. 또한, 이 제품은 이상한 맛, 이상한 냄새가 없고, 고품질이어서 저칼로리의 쥬우스로서 상품가치가 높은 것이다.
실시예 B-7: 카스터드 크림
콘 스타치 100 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 100 중량부, 트레할로오스 함수결정 60 중량부, 수크로오스 40 중량부, 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하고, 계란 280 중량부를 가하여 교반하고, 여기에 비등한 우유 1,000 중량부를 서서히 첨가하고, 더욱이 불에 올려서 교반을 계속하여 콘 스타치가 완전히 풀로 변해서 전체가 반투명해졌을 때에 불을 끄고, 이것을 냉각해서 적당량의 바닐라 향료를 가하고, 계량, 충전, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 매끈매끈한 광택을 가지고, 풍미 양호하며, 전분의 노화도 억제되어, 고품질의 카스터드 크림이다.
실시예 B-8: 초콜렛
카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부 및 실험 15의 방법에 준해서 제조한 환상 4당 1 함수결정 50 중량부를 혼합해서 리파이너를 통과시켜서 입도를 저하한 후, 콘체에 넣어서 50℃에서 2주야 혼련하였다. 이 사이에 레시틴 0.5 중량부를 첨가해서 충분히 분산시켰다. 이어서, 온도 조절기로 31℃로 조절하고,버터가 굳어지기 직전에 모울드에 주입하고, 기포를 제거한 후, 10℃의 냉각 터널을 통과시켜서 고화시켰다. 이것을 모울드로부터 꺼내어 포장하여 제품을 얻었다.
이 제품은 흡습성이 없고, 색, 광택 모두 양호하고, 내부조직도 양호하며, 입안에서 매끈매끈하게 녹고, 고상한 단 맛과 부드러운 풍미를 가진다. 그리고 이 제품은 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 초콜렛으로서 유용하다.
실시예 B-9: 우이로노 모토
쌀가루 90 중량부에, 콘 스타치 20 중량부, 무수결정 말티톨 70 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 분말 50 중량부, 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합해서 우이로노 모토를 제조하였다. 우이로노 모토와 적당량의 분말차와 물을 혼련하고, 이것을 용기에 넣어서 60분간 증기로 찜하여 분말차 우이로를 제조하였다. 이 제품은 광택 입맛도 양호하고, 풍미도 좋다. 또한, 전분의 노화도 억제되고, 저장도 좋으며, 저칼로리의 우이로로서도 적합하다.
실시예 B-10: 팥소
원료 팥 10 중량부에, 통상적인 방법에 따라 물을 가하여 펄펄 끓이고, 떫은 맛과 거품을 제거하고, 수용성 협잡물을 제거하여, 팥소 약 21 중량부를 얻었다. 이 생(生) 팥소에 수크로오스 14 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 5 중량부 및 물 4 중량부를 가하여 펄펄 끓이고, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가해 원료 팥소를 부수지 않도록 하여 혼합하여, 제품 팥소를 약 35 중량부를 얻었다. 이 제품은 탄 색깔, 이수(離水)도 없이 안정하고, 혀의 촉감, 풍미가 양호하여, 팥소 빵, 만두, 경단, 빙과 등의 제과재료로서 적합하다.
실시예 B-11: 빵
밀가루 100 중량부, 이스트 2 중량부, 수크로오스 5 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 분말 1 중량부 및 무기 후드 0.1 중량부를, 통상적인 방법에 따라 물로 반죽하고, 중종(中種)을 26℃에서 2시간 발효시킨 후 30분간 숙성하여 구웠다. 이 제품은 색상, 부풀음 모두 양호하고, 적당한 탄력, 온화한 단 맛을 가진 고품질의 빵이다.
실시예 B-12: 햄
돼지 넓적다리 고기 1000 중량부에 식염 15 중량부 및 질산 칼륨 3 중량부를 균일히 혼합하여 냉실에서 1주야 퇴적한다. 이것을 물 500 중량부, 식염 100 중량부, 질산 칼륨 3 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 40 중량부 및 향신료로 된 염지액에 냉실에서 7일간 담그고, 이어서, 통상적인 방법에 따라 냉수로 세정하고, 끈으로 감아 졸라 훈연하여 쿠킹하고, 냉각, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 색조도 좋고, 풍미 양호한 고품질의 햄이다.
실시예 B-13: 분말 펩티드
40％ 식품용 대두 펩티드 용액(후일본국의 不二製油 주식회사 판매, 상품명 『하이뉴트 S』) 1 중량부에, 실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부를 혼합하고, 플라스틱제 바트에 넣어 50℃에서 감압건조하고, 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다.
이 제품은 풍미 양호하고, 프레믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난(難)소화성의 식물(食物) 섬유, 정장재료로서도 유용하다.
실시예 B-14: 분말난황
날달걀로부터 조제한 난황을 플레이트식 가열 살균기에서 60 내지 64℃에서 살균하여 얻은 액상 난황 1 중량부에 대하여, 실험 16의 방법에 준해서 제조한 환상 4당 무수결정 함유 분말 4 중량부의 비율로 혼합한 후, 바트에 옮기고, 하룻밤 방치하여 환상 4당 5 내지 6 함수결정으로 변환시켜서 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말난황을 얻었다.
이 제품은 프레믹스, 빙과, 구운 과자, 유화제 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난(難)소화성 식물 섬유, 정장재료로서도 유용하다. 또한, 피부 미화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-15: 목욕용 조성물
유자의 껍질 쥬우스 1 중량부에 대하여, 실험 16의 방법에 준해서 제조한 환상 4당 무수결정 함유 분말 10 중량부의 비율로 혼합하고, 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 결정석출시켜, 숙성시킨 후, 분말화하여 유자의 껍질 엑기스 함유 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다. 이 분말 5 중량부에, 소염(燒鹽) 90 중량부, 트레할로오스 함수결정 2 중량부, 무수 규산 1 중량부 및 α-글루코실헤스페리딘(주식회사 林原 판매, 상품명 αG-헤스페리딘) 0.5 중량부를 혼합해서 목욕용제를 제조하였다.
이 제품은 유자의 향기도 풍부해서, 입욕용의 온수에 100 내지 10,000배로희석해서 이용하면 좋고, 입욕후는, 피부가 산뜻하거나 매끈매끈하며 한기를 느끼지 않는 고품질의 목욕용제다.
실시예 B-16: 피부외용 크림
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌글리콜 2 중량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부, α-글루코실루틴(주식회사 林原 판매, 상품명 αG 루틴) 1 중량부, 유통 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세린 10 중량부 및 방부제 적당량을 통상적인 방법에 따라 가열 용해하고, 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 5 중량부 및 정제스 66 중량부를 가하고, 호모게나이저에서 유화하고, 더욱이 향료 적당량을 가하여 교반혼합하여 화장용 크림을 제조하였다.
이 제품은 항산화성을 가지고, 안정성이 높고, 고품질의 햇볕에 탐 방지, 피부 미화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-17: 치약
제2인산 칼슘 45 중량부, 라우릴황산 나트륨 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 15 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부를 물 13 중량부와 혼합해서 치약을 얻었다.
이 제품은 계면활성제의 세정력을 저하함이 없고, 혐오스런 맛을 개량하며, 사용후의 느낌도 양호하다.
실시예 B-18: 유동식용 고체제제
실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 100 중량부, 트레할로오스 함수결정 200 중량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25g씩을 방습성 라미네이트 백(bag)에 충전하고, 히이트 시일해서 제품을 얻었다.
이 제품은 환상 4당에 의해 난(難)소화성의 식물(食物) 섬유를 강화하고, 정장작용이 우수한 유동식이다. 1 자루분을 약 150 내지 300ml의 물에 용해해서 유동식으로 하여 경구적, 또는 비강, 위, 장 등에 경관적 사용방법에 의해 이용되며, 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-19: 피부외용 로션
아래의 성분을 아래의 배합에 따라서 통상적인 방법에 의해 혼합하여 로션을 제조하였다.
1 ％ 히알루론산 나트륨 수용액 18 중량부
실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 1 중량부
DL -세린 0.05 중량부
말티톨 0.2 중량부
글리세린 2 중량부
파라옥시벤조산 메틸 0.05 중량부
수산화 칼륨 0.01 중량부
폴리옥시에틸렌(15몰 부가) 올레일 에테르 0.3 중량부
에탄올 3 중량부
향료 적당량
정제수 나머지
합계 100 중량부
이 로션은 피부에 대한 수분의 침투성이 우수하고, 피부의 보습성이 우수하므로 기초 화장품으로서 유용하다. 또한, 이 로션은 피부의 각질층을 연화하는 작용도 비교적 현저하게 발휘하므로, 한랭 계절에 이용하는 화장품이나, 중노년층을 대상으로 하는 화장품으로서도 유용하다.
실시예 B-20: 피부외용 크림
메틸 폴리실록산 0.3 중량부, 스테아르산 6 중량부, 친유성 모노스테아르산 글리세린 3.5 중량부, 스콸란 2.5 중량부, 2-에틸헥센산 세틸 5.5 중량부, 모노스테아르산 폴리옥시에틸렌(20몰 부가) 소르비탄 3 중량부를 85℃로 가열하면서 균일히 혼합하였다(A액). 별도로, 95％ 글리세린 2 중량부, 말티톨 2 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 35 중량부에 적당량의 정제수를 첨가해서 70℃로 가열하면서 충분히 용해시켰다(B액).
이 A액과 B액을 혼합하고, 균일히 교반한 후, 여기에 34 중량부의 정제수를 첨가하고, 유화 믹서를 이용해서 통상적인 방법에 의해 유화하였다. 이 유화물을 35℃까지 냉각하고, 여기에, 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르브산 2 중량부를 첨가한후, 적당량의 시트르산을 가해서 pH 약 6으로 조정하고, 다시 정제수를 가해서 전체량을 100 중량부로 하여 크림을 제조하였다.
이 크림은 피부의 보습성이 우수한 외에, 피부에 대한 자극성이 극히 낮으므로 기초 화장품으로서 유용하다. 또한, 이 제품은 유화 상태가 안정하게 유지되므로 비교적 장기간의 보존에도 견디어낸다는 특징을 가지고 있다.
실시예 B-21: 피부 청정용 액상 조성물
30％ 야자유 지방산 메틸타우린나트륨 수용액 20 중량부, 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄베타인 5 중량부, 폴리옥시에틸렌디올레산 메틸 글루코시드 4 중량부를 70℃로 가온하면서 혼합·용해하고, 적당량의 물을 가하고, 여기에 실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부, 프로필파라벤 0.2 중량부, 10％ 시트르산 수용액 1 중량부를 가하고, 다기 정제수를 첨가해서 전체량을 100 중량부로 하여 액상 조성물을 얻었다.
이 액상 조성물은 우수한 피부청정 효과를 발휘하는 외에, 피부의 보습성이 우수하므로 일상적으로 이용하는 보디 소프로서 유용하다.
실시예 B-22: 목욕용 조성물
건조 황산 나트륨 60 중량부, 염화수소 나트륨 30 중량부, 트레할로오스 5 중량부, 실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 5 중량부, 시트라스계 조합 향료 1 중량부, 및 청색2호(인디고카르민) 0.5 중량부를 균일히 혼합하여 분말의 본 발명의 체취 억제제를 얻었다.
이 제품은 욕탕 100 리터당 약 20g의 비율로 첨가하여 용해시켜서 이용한다.이 제품은 피부에서의 보습효과가 우수한 외에, 피부로부터의 체취의 발생 또는 휘산도 잘 억제하며, 피부에의 자극성이 극히 낮으므로 목욕용제로서 일상적으로 이용할 수 있다.
실시예 B-23: 정제
아스피린 50 중량부에 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 14 중량부, 콘 스타치 4 중량부를 충분히 혼합한 후, 통상적인 방법에 따라 타정기(打綻機)로 타정해서 두께 5.25mm, 1정당 680mg의 정제를 제조하였다.
이 제품은 환상 4당의 부형성을 이용한 것으로, 흡습성이 없고, 물리적 강도도 충분하며, 더욱이 수중에서의 붕괴는 극히 양호하다.
실시예 B-24: 당의제
중량 150mg의 소저(素錠)을 심제(芯劑)로 하고, 여기에 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 20만) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄늄 3 중량부로 된 밑바탕 액을 사용해서 정제 중량이 약 230mg이 될 때 까지 당의(糖衣)하고, 이어서, 같은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 위바탕 액을 사용하여 당의하고, 더욱이, 왁스액으로 윤기내기 해서 광택이 있는 외관이 좋은 당의제를 얻었다. 이 제품은 내충격성도 우수하며, 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-25: 외상치료용 고약
실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 100 중량부및 말토오스 300 중량부에, 옥소 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 더욱이 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 중량부를 가해서 혼합하여, 적당한 퍼짐, 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다. 이 제품은 환상 4당에 의하여 옥소, 메탄올의 휘산을 방지하고, 경시 변화가 적은 상품가치가 높은 고약이다.
또한, 이 제품은 옥소에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되고, 창면(創面)도 깨끗하게 낫는다.
본 발명의 목적은, 입수가 용이한 당질로부터 환상 4당을 생성하는 신규 효소, 이 효소의 제조 방법, 이 효소를 사용하는 α-이소말토실 전이 반응 방법, 이 효소를 사용해서 얻게 되는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질 및 그 제조 방법, 및 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물을 제공함에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서, 이소말토올리고당에 착안하고, 그 중에서, 파노오스로부터 환상 4당을 생성하는 신규한 효소를 얻는 것을 목적으로 하여 널리 미생물을 검색해 왔다. 그 결과, 일본국의 岡山현 岡山시의 토양으로부터 단리한 바실루스(Bacillus)속(屬)에 속하는 신규 미생물(「C9주」, 「Cll주」 및 「N75주」) 및 長野현 下高井군의 토양 및 岡山현 岡山시의 토양으로부터 각각 단리한 아르드로박터(Arthrobacter)속에 속하는 신규 미생물(「Sl주」 및 「A19주」)이 상기 효소의 산생능을 가지는 것을 발견하였다.
본 발명자들은, 상기 미생물 C9주, Cll주, N75주, Sl주, 및 A19주의 어느 주라도 신규효소, 즉, 신규의 α-이소말토실 전이 효소를 생산하고, 이 신규 효소는 파노오스나 이소말토실말토오스 등의 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가지고 있는, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질(본 명세서에 있어서는 이 당질을 「α-이소말토실글루코 당질」이라고 약칭할 경우도 있음.)에 작용해서 환상 4당을 생성하는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 이 효소의 여러 가지 성질을 밝힘과 아울러 그 제조 방법을 확립하고, 또한, 이 효소에 의한 전이 반응 방법, 및 이 효소를 사용한 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법을 확립하였다. 더욱이, 본 발명자들은 이 환상 4당의 이화학적 성질을 조사한 결과, 환상 4당의 형태로서 5 내지 6 함수결정, 1 함수결정, 무수결정 등의 결정 및 비정질의 형태의 것이 존재하는 것, 그리고 메틸 알코올이나 에틸 알코올 등의 유기용매를 사용하지 않고 환상 4당의 과포화 수용액으로부터 상기 결정을 용이하게 결정석출 시켜 채취할 수 있는 것을 발견하였다. 더욱이, 이렇게 하여 얻게 되는 환상 4당은, 예를 들면, 에틸 알코올이나 아세트산 등의 휘발 성분을 포접(包接)하는 능력을 가지고, 또한, 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않으며, 그 자체가 갈변이나 열화가 비교적 적으며, 열이나 pH에 안정하고, 더욱이는 식품 본래의 풍미를 손상하지 않는 온화하고 낮은 단 맛의 당질이라는 것, 난(難)발효성, 난(難)소화성 이어서 식물(食物) 섬유로서 적합한 등의 여러 가지의 유용한 특성을 가지고 있는 것을 발견하였다. 그리고 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물, 예를 들면, 풍미 양호한 고품질의 식품, 저칼로리 식품, 다이어트 식품, 안정한 고품질의 화장품, 더욱이, 높은 활성이고 안정한 의약품과 이들의 제조 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
이하, 본 발명에 의한 미생물 C9주, Cll주 및 N75주[이상, 바실루스속(屬)] 및 미생물 Sl주 및 A19주(이상, 아르드로박터속)의 확인시험 결과를 나타낸다. 또한, 확인시험은, 『미생물의 분류와 동정』(長谷川武治편, 學會出版센터, 1985년)에 준하여 하였다.
<미생물 C9주>
A, 세포형태
(1) 육즙한천 배양, 27℃
보통 0.5 내지 1.0㎛ ×l.5 내지 5.0㎛의 간균(桿菌).
다형성 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
B. 배양 성질
(1) 육즙한천 평판 배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 2일간에서 1 내지 2mm
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半)렌즈상
광택: 둔광
표면: 평활
색조: 불투명, 연한 황색
(2) 육즙한천 사면 배양, 27℃
생육: 중정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃: 액화함.
C. 생리학적 성질
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 양성
(7) 옥시다제: 양성
(8) 카탈라제: 양성
(9) 생육의 범위： pH 5.5 내지 9.0, 온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성의 유무
이용성 산생성
D -글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12）DNA의 GC함량: 40％
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌『Bergey's Manual of Systematic Bacteriology』, 제2권 (1986년)을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은, 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 신규 미생물이며, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여환상 4당을 생성하는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 산생(産生)하는, 문헌에 기재되지 아니한 특징을 가진 미생물인 것이 밝혀졌다.
이들의 결과로부터, 본 발명자들은 이 균을 바실루스 글로비스포루스 C9로 명명하고, 평성 12년 4월 25일에 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 東1町 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁 센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-7143로서 수탁되었다.
<미생물 Cll주>
A, 세포형태
(1) 육즙한천 배양, 27℃
보통 0.5 내지 1.0㎛ ×l.5 내지 5.0㎛의 간균(桿菌).
다형성 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
B. 배양 성질
(1) 육즙한천 평판 배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 2일간에서 1 내지 2mm
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半)렌즈상
광택: 둔광
표면: 평활
색조: 불투명, 연한 황색
(2) 육즙한천 사면 배양, 27℃
생육: 중정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃: 액화함.
C. 생리학적 성질
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 양성
(7) 옥시다제: 양성
(8) 카탈라제: 양성
(9) 생육의 범위： pH 5.5 내지 9.0, 온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성의 유무
이용성 산생성
D -글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12）DNA의 GC함량: 39％
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌『Bergey's Manual of Systematic Bacteriology』, 제2권 (1986년)을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은, 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 신규 미생물이며, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여 환상 4당을 생성하는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 산생(産生)하는, 문헌에 기재되지 아니한 특징을 가진 미생물인 것이 밝혀졌다.
이들의 결과로부터, 본 발명자들은 이 균을 신규 미생물 바실루스 글로비스포루스 C11로 명명하고, 평성 12년 4월 25일에 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 東1町 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁 센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-7144로서 수탁되었다.
<미생물 N75주>
A, 세포형태
(1) 육즙한천 배양, 27℃
보통 0.5 내지 1.0㎛ ×l.5 내지 5.0㎛의 간균(桿菌).
다형성 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
B. 배양 성질
(1) 육즙한천 평판 배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 2일간에서 1 내지 2mm
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半)렌즈상
광택: 둔광
표면: 평활
색조: 불투명, 연한 황색
(2) 육즙한천 사면 배양, 27℃
생육: 중정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃: 액화함.
C. 생리학적 성질
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 양성
(7) 옥시다제: 양성
(8) 카탈라제: 양성
(9) 생육의 범위： pH 5.7 내지 9.0, 온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성의 유무
이용성 산생성
D -글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12）DNA의 GC함량: 40％
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌『Bergey's Manual of Systematic Bacteriology』, 제2권 (1986년)을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은, 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 신규 미생물이며, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여 환상 4당을 생성하는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 산생(産生)하는, 문헌에 기재되지 아니한 특징을 가진 미생물인 것이 밝혀졌다.
이들의 결과로부터, 본 발명자들은 이 균을 바실루스 글로비스포루스 N75로 명명하고, 평성 13년 5월 16일에 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 東1町 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁 센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-7591로서 수탁되었다.
<미생물 Sl주>
A, 세포형태
(1) 육즙한천 배양, 27℃
보통 0.3 내지 0.7㎛ ×0.8 내지 3.5㎛의 간균(桿菌).
다형성 있음. 운동성 없음. 무포자. 그램 양성.
(2) EYG 한천배지, 27℃
간균(桿菌)-구균의 새육 사이클을 나타냄.
B. 배양 성질
(1) 육즙한천 평판 배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 1일간에서 2 내지 3mm
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半)렌즈상
광택: 둔광
표면: 평활
색조: 불투명, 연한 황색
(2) 육즙한천 사면 배양, 27℃
생육: 중정도
형상: 실형상(絲狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃: 액화하지 않음.
C. 생리학적 성질
(1) 전분의 가수분해: 음성
(2) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(3) 우레아제: 양성
(4) 옥시다제: 양성
(5) 카탈라제: 양성
(6) 산소에 대한 태도: 호기성
(7) 세포벽의 주요 아미노산: 리신
(8) 세포벽의 펩티드 글리칸형: 리신-알라닌
(9) 세포벽의 N-아실형: 아세틸
(10) 세포벽의 구성당: 갈락토오스, 글루코오스, 람노오스, 만노오스
(11) 비타민 요구성: 없음
(12）DNA의 GC함량: 65％
(13）DNA-DNA 호몰로지: 아르드로박터 라모서스(ATCC 13727)과의 사이에 84.4%의 DNA-DNA 호몰로지를 나타냄.
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌『Bergey's Manual of Systematic Bacteriology』, 제2권 (1986년)을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은, 아르드로박터 라모서스(Bacillus ramosus)에 속하는 신규 미생물이며, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여 환상 4당을 생성하는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 산생(産生)하는, 문헌에 기재되지 아니한 특징을 가진 미생물인 것이 밝혀졌다.
이들의 결과로부터, 본 발명자들은 이 균을 아르드로박터 라모서스 S1으로 명명하고, 평성 13년 5월 16일에 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 東1町 1번지 1, 중앙제6소재의 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁 센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-7592로서 수탁되었다.
<미생물 A19주>
A, 세포형태
(1) 육즙한천 배양, 27℃
보통 0.4 내지 0.8㎛ ×1.0 내지 4.0㎛의 간균(桿菌).
다형성 있음. 운동성 없음. 무포자. 그램 양성.
(2) EYG 한천배지, 27℃
간균(桿菌)-구균의 생육 사이클을 나타냄.
B. 배양 성질
(1) 육즙한천 평판 배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 1일간에서 2 내지 3mm
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半)렌즈상
광택: 둔광
표면: 평활
색조: 불투명, 황색
(2) 육즙한천 사면 배양, 27℃
생육: 중정도
형상: 실형상(絲狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃: 액화하지 않음.
C. 생리학적 성질
(1) 전분의 가수분해: 음성
(2) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(3) 우레아제: 양성
(4) 옥시다제: 양성
(5) 카탈라제: 양성
(6) 산소에 대한 태도: 호기성
(7) 세포벽의 주요 아미노산: 리신
(8) 세포벽의 펩티드 글리칸형: 리신-알라닌
(9) 세포벽의 N-아실형: 아세틸
(10) 세포벽의 구성당: 갈락토오스, 글루코오스, 람노오스, 만노오스
(11) 비타민 요구성: 없음
(12）DNA의 GC함량: 62％
(13）DNA-DNA 호몰로지: 아르드로박터 글로비포르미스(ATCC 8010)과의 사이에 66.5%의 DNA-DNA 호몰로지를 나타냄.
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌『Bergey's Manual of Systematic Bacteriology』, 제2권 (1986년)을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은, 아르드로박터 글로비포르미스(Bacillus globiformis)에 속하는 신규 미생물이며, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여 환상 4당을 생성하는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 산생(産生)하는, 문헌에 기재되지 아니한 특징을 가진 미생물인 것이 밝혀졌다.
이들의 결과로부터, 본 발명자들은 이 균을 아르드로박터 글로비포르미스 A19로 명명하고, 평성 13년 5월 16일에 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 東1町 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁 센터에 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-7590로서 수탁되었다.
본 발명에는, 상기 균주는 물론이고, 이들의 변이주, 더욱이는 α-이소말토실 전이 효소 산생능을 가지는 기타의 미생물 및 그것들의 변이주도 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용하는 배지는, 이 미생물을 생육할 수 있고, α-이소말토실 전이 효소를 산생할 수 있는 영양배지이면 좋고, 합성배지 및 천연배지 모두를 사용할 수 있다. 탄소원으로서는, 이 미생물의 생육에 이용할 수 있는 것이면 좋은데, 예를 들면, 식물 유래의 전분이나 피토글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀룰란, 그리고 이들의 부분 분해물, D-글루코오스, D-프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, L-소르비톨, 당밀 등의 당질, 또한, 시트르산, 숙신산 등의 유기산 등을 적당히 이용할 수 있다. 배지중의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적당히 선택하면 좋다. 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물, 및 뇨소, 콘 스티이프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑기스, 육류 엑기스 등의 유기 질소 함유물 등을 적당히 이용할 수 있다. 그리고 무기성분으로서는, 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염,인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염 및 코발트염 등의 염류를 적당히 이용할 수 있다. 더욱이, 필요에 따라 아미노산류, 비타민류 등도 적당히 이용할 수 있다.
본 발명의 미생물의 배양은, 통상, 4 내지 40℃, 바람직하게는, 20 내지 37℃, pH 4 내지 10, 바람직하게는, pH 5 내지 9로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 실시된다. 배양 시간은, 이 미생물이 증식할 수 있는 시간이면 좋은데, 적절하게는, 10시간 내지 150시간으로 한다. 또한, 배양액의 용존산소 농도는 특히 제한은 없지만, 통상, 0.5 내지 20ppm의 범위가 되도록 통기량을 조절하거나, 교반하거나, 통기에 산소를 사용 또는 추가하거나, 또한, 퍼멘터내의 압력을 높이는 등의 수단을 적당히 채용한다. 또한, 배양 방식은, 회분 배양 또는 연속 배양의 어느 것이어도 좋다.
이 효소활성은, 균체를 포함하여 배양물 전체에서 나타나므로, 이렇게 하여 얻어지는 배양물을 그대로 조(粗)효소액으로서 이용하는 것도, 또한, 이와 같은 배양물로부터 균체를 파쇄 또는 제거한 후의 배양액을 조효소액으로서 사용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하는 방법으로서는, 공지의 고액 분리법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 배양물 그 자체를 원심분리하는 방법, 혹은, 프리코우트 필터 등을 사용해서 여과 분리하는 방법, 평막, 중공사막 등의 막(膜) 여과에 의해 분리하는 방법 등이 적당히 채용된다. 위에서 설명한 바와 같이 균체 제거후의 배양액은 조효소액으로서 사용할 수 있고, 일반적으로는, 황산 암모늄 염석법, 아세톤 및 알코올 침전법, 평막, 중공막 등의 막 농축법에 의해 이 효소를 농축해서 이용한다.
상기 조효소액, 농축 효소액 중에 함유되는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소, 및 아래에서 설명하는 정제 α-이소말토실 전이 효소는 공지의 방법에 의해 고정화해서 사용할 수도 있다. 그 고정화 방법으로서는, 예를 들면, 이온 교환체에의 결합법, 수지 및 막 등과의 공유결합법·흡착법, 고분자 물질을 사용하는 포괄법 등을 적당히 채용할 수 있다.
본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 분리·정제하기 위해서는, 효소나 단백질을 분리·정제하기 위한 공지의 방법을 적당히 조합해서 실시할 수 있다. 그 구체 예로서는, 예를 들면, 상기 조효소액이나 농축 효소액을 황산 암모늄 염석해서 농축하고, 투석후, 『세파비이즈(Sepabeads) FP-DA13』 겔을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용하는 어피니티 크로마토그래피, 『부틸-토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피, 및 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용하는 어피니티 크로마토그래피를 순차 적용함으로써 전기영동적으로 단일인 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 얻을 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소는, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해 환상 4당을 생성하는 효소이며, 상세하게는, 아래의 이화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가지는, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성한다.
(2) 분자량
SDS-겔 전기영동법에서 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내에서 확인되는 분자량을 가진다.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기영동법에서 pl 약 3.7 내지 pl 약 8.3의 범위내에서 확인되는 등전점을 가진다.
(4) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 확인되는 최적 온도를 가진다.
(5) 최적 pH
35℃, 30분간 반응의 조건하에서 pH 약 5.5 내지 pH 약 6.5의 범위내에서 확인되는 최적 pH를 가진다.
(6) 온도 안정성
pH 6.0. 60분간 유지의 조건하에서의 안정 온도영역을 약 45℃ 이하로 가진다.
(7）pH 안정성
4℃, 24시간 유지의 조건하에서의 안정 pH 영역을 pH 약 3.6 내지 pH 약 10.0의 범위내에서 가진다.
(8) N 말단 아미노산 서열
N 말단 아미노산 서열로서, 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린(서열표에 있어서의 서열 번호 1) 또는 아스파라긴산-트레오닌-로이신-세린-글리신-발린-페닐알라닌-히스티딘-글리신-프롤린(서열표에 있어서의 서열 번호 8)으로 나타내어지는 아미노산 서열을 가질 경우가 있다.
본 발명의 α-이소말토실 전이효소를 작용시켜서 환상 4당을 생성시키기 위한 기질로서는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가지고 있는, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질, 예를 들면, 파노오스, 이소말토실말토오스 등이 유리하게 이용된다. 파노오스를 조제하기 위해서는, 예를 들면, 풀룰란을 산가수분해 하거나, 풀룰란을 더어모악티노마이세스(Thermoactinomyces) α-아밀라아제나 네오풀룰라나아제에 의해 분해하거나, 말토오스에 α-글루코시다아제를 작용시키거나, 말토오스와 수크로오스의 혼합물에 덱스트란수크라아제를 작용시켜 전이시키는 등의 방법을 유리하게 채용할 수 있다. 이소말토실말토오스를 조제하기 위해서는, 예를 들면, 풀룰란에 β-아밀라아제와 풀룰라나아제를 동시에 작용시켜 가수분해하거나, 아밀로펙틴이나 글리코겐을 세균 당화형 α-아밀라아제로써 가수분해하거나, 말토트리오스에 α-글루코시다아제를 작용시키거나, 말토트리오스와 수크로오스의 혼합물에 덱스트란수크라아제를 작용시키는 등의 방법을 유리하게 채용할 수 있다.
본 발명의 α-이소말토실 전이 효소를 기질에 작용시킬 때에, 그 기질농도 는 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 기질농도 0.1w/v％의 비교적 저농도의 용액을 사용한 경우라도, 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소의 반응이 진행하여 환상 4당을 생성한다. 공업적으로는, 기질농도 1w/v％ 이상, 바람직하게는, 10w/v％ 이상이 적합하고, 이 조건하에서 환상 4당을 유리하게 생성할 수 있다. 또한, 기질용액으로서는, 완전히 끝까지 용해하지 않는 불용성의 기질을 함유할 때까지의 고농도의 기질용액이어도 좋다. 반응 온도는 반응이 진행할 수 있는 온도, 즉, 60℃ 부근 이하의 온도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 30 내지 50℃ 부근의 온도가 이용된다.
반응 pH는, 통상, pH 3.6 내지 9의 범위로 조정하면 좋고, 바람직하게는 pH 약 5.5 내지 pH 7의 범위로 한다. 효소의 사용량과 반응 시간은 밀접하게 관계하고 있어, 목적으로 하는 효소반응의 진행의 정도에 따라 적당히 선택하면 좋다.
상기의 효소반응에 의해 얻어진 용액은, 통상, 환상 4당과 함께 글루코오스, 말토오스, 더욱이는 잔존하는 기질로서의 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질 등을 함유하고 있어, 그대로 환상 4당 함유용액으로서 이용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 α-이소말토실 전이 효소를 작용시킨 후에, 예를 들면, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 작용시켜서, 협잡하는 올리고당을 가수분해한 환상 4당 함유액으로 하여 사용할 수도 있다. 일반적으로는, 더욱 정제해서 사용한다. 그 정제 방법으로서는, 공지의 방법을 적당히 채용하면 좋은데, 예를 들면, 활성탄에 의한 탈색, H형, OH형 이온교환 수지에 의한 탈염, 이온교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 더욱이는 환상 4당을 이용하지 않고 협잡당질을 자화(資化) 또는 분해하는 미생물, 예를 들면, 유산균, 아세트산균, 효모 등에 의한 발효 처리, 알칼리 처리 등에 의해 잔존하는 환원성 당질을 분해 제거하는 등의 1종 또는 2종 이상의 정제 방법을 적당히 채용할 수 있다.
특히, 환상 4당의 공업적 대량 제조방법으로서는, 이온교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피가 바람직하며, 예를 들면, 일본국 특개 소58-23799호 공보 또는 특개 소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해, 환상 4당 이외의 협잡 당류를 제거하여 함유량을 높인 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질 수용액을 유리하게 제조할 수 있다. 이 칼럼 크로마토그래피에 있어서는, 고정상 방식, 이동상 방식, 유사 이동상 방식, 뱃치 방식, 반연속 방식, 연속 방식 중의 어느 방식이라도 적당히 채용할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 환상 4당을 함유하는 수용액, 또는 그 함량을 향상시킨 당질 수용액은, 통상, 환상 4당을, 고형물당, 10w/w％(이하, 본 명세서에서는 특히 별달리 명시하지 않는 한, 「w/w％」을 「％」로 약기함.) 이상, 바람직하게는 40％ 이상 함유하는 당질 수용액이며, 통상, 이것을 농축하여 시럽상 제품으로 한다.이 시럽상 제품을 더욱 건조해서 분말상 제품으로 하는 것도 마음대로이다.
더욱이는 본 발명에 있어서의 환상 4당의 결정을 제조하기 위해서는, 통상, 상기 정제방법에 의해 얻게되는 환상 4당을 함유하는 당질 수용액, 바람직하게는, 환상 4당을 고형물당 약 40％ 이상, 더욱이 바람직하게는 50％ 이상 함유하는 당질 수용액이 적절하게 이용된다. 결정 형태로서, 5 내지 6 함수결정을 제조할 경우에는, 통상, 이와 같은 당질 수용액을 환상 4당의 과포화 수용액, 예를 들면, 농도 약 40％ 내지 90％ 환상 4당 수용액으로 하고, 이것을 결정석출 관(罐)에서, 약 0.1 내지 20％의 종결정 공존하에서, 과포화를 유지할 수 있는 온도, 바람직하게는, 10 내지 90℃의 범위에서 교반하면서 서냉하여 결정을 함유하는 매스키트를 제조한다. 환상 4당 1 함수결정이나 무수결정을 결정석출 시킬 경우에는, 일반적으로는, 보다 고농도, 고온도에서의 과포화 조건이 채용된다. 매스키트로부터 환상 4당의 결정 또는 이것을 함유하는 함밀(含蜜) 결정을 제조하는 방법은, 예를 들면, 분밀(分蜜)방법, 블록 분쇄 방법, 유동 조립(造粒)방법, 분무건조 방법 등의 공지의 방법을 적당히 채용하면 좋다. 환상 4당 1 함수결정이나 무수결정은, 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 탈수 또는 건조시켜서 제조할 수도 있다. 이렇게 하여 제조되는 본 발명의 환상 4당 결정 또는 그 고함유 분말은 상품이고 온화한 저감미(低甘味)를 가진 비환원성 내지 저환원성의 백색분말 내지 고형물이며, 내산성, 내열성이 우수한 안정한 당질이고, 다른 소재, 특히 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 함유 물질과 혼합하여 가공해도, 갈변이나 이상한 냄새를 발생하는 일은 적고, 혼합한 기타의 소재를 손상하는 일도 거의 없다. 또한, 자체 흡습성도 낮아분말상이더라도 부착, 고결 방지성을 가지고 있다.
또한, 본 발명의 환상 4당은, 포접능을 가지고 있으므로, 특히, 휘산하기 쉬운 향기성분, 유효성분 등의 휘산 방지, 품질열화 방지, 안정화 유지 등에 극히 우수한 효과를 발휘하므로 보향제(保香劑), 안정제 등으로서 적절하게 사용할 수 있다. 이 경우에 있어서, 필요에 따라, 다른 환상 당질, 예를 들면, 환상 덱스트린류, 분기 환상 덱스트린류, 환상 덱스트란류, 환상 푸락탄류 등과 병용하여 안정성을 강화하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
더욱이, 아밀라아제나 α-글루코시다아제에 의해 실질적으로 분해되지 않으므로, 경구섭취해도 실질적으로 소화 흡수되지 않고, 또한, 장내 세균에 의해 발효 되기 어려우므로, 극히 저칼로리의 수용성 식물(食物) 섬유로서 이용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 환상 4당을 경구섭취하면, 당질로서의 중량, 용량(容量)이 있기 때문에 만복감(滿腹感)을 얻게되는 한편, 본 발명의 환상 4당은 실질적으로 소화되지 않기 때문에 저칼로리 식품소재, 다이어트 식품소재로서도 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 충치 유발균 등에 의해서도 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 적절하게 이용할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 환상 4당은, 내산성, 내알카리성, 내열성이 우수한 무독, 무해한 안전한 천연 감미료이기 때문에, 결정 제품의 경우, 풀룰란, 히드록시에틸스타치, 및 폴리비닐피롤리돈 등의 1종 또는 2종 이상의 결합제와 병용해서 정제(錠劑)나 당의정으로서 이용할 수도 있다. 또한, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 이수(離水) 방지성, 고결 방지성, 보향성, 변색 방지성, 안정성, 다른 당의 결정석출 방지성, 난(難)발효성, 전분노화 방지성, 단백질 변성 방지성, 지질(脂質) 열화 방지성 등의 여러 가지 성질도 구비하고 있다.
따라서, 본 발명의 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질은, 감미료, 난(難)발효성 식품소재, 난(難)소화성 식품소재, 낮은 충치 유발성 식품소재, 저칼로리 식품소재, 정미(呈昧) 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 고결 방지제, 보향제, 변색 방지제, 전분노화 방지제, 단백질 변성 방지제, 지질 열화 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 그대로, 또는 필요에 따라 이 당질과 공지재료와 적당히 병용하여, 예를 들면, 음식물, 기호물, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다. 공지의 재료로서는, 예를 들면, 정미료, 착색료, 착향료, 강화제, 유화제, 산화 방지제, 자외선 방지제, 또는 약효성분 등을 적당히 이용할 수 있다.
본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 그대로 단 맛 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 예를 들면, 가루엿, 포도당, 과당, 이성화당, 설탕, 맥아당, α,α-트레할로오스, 벌꿀, 메이플 슈거, 에리드리톨, 크실리톨, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 라칸카 감미물, 글리시리진, 소마틴, L-아스파르틸-L-페닐알아라닌메틸에스테르, 사카린, 아세술팜 K, 스쿠라로스, 글리신, 알라닌 등의 다른 감미료와 병용하는 것도, 또한, 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 병용할 수도 있다. 특히, 에리드리톨, 크실리톨, 말티톨 등의 저칼로리 감미료나 α-글리코실스테비오시드, 소마틴, L-아스파르틸-L-페닐알아라닌메틸에스테르, 사카린, 아세술팜 K및 스쿠라로스 등의 1종 또는 2종 이상의 고감미도 감미료와 병용하여, 저칼로리 감미료 또는 다이어트 감미료 등으로서 적절하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 분말 내지 결정상 제품은, 그대로, 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 또는 결합제 등과 혼합하여 과립상, 구상(球狀), 단봉상, 판상, 입방체상, 또는 정제 등의 각종 형상으로 성형해서 사용하는 것도 마음대로이다.
또한, 본 발명의 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로움, 쓴 맛 등의 기타의 맛을 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 내산성, 내열성도 크므로 일반 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량, 풍미 개량, 혹은 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
예를 들면, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용의 분말 식초, 츄카노 모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 케첩, 야키니쿠노 타레, 커레 루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물 믹스, 복합 조미료, 미린, 신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료에 감미료, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제 등으로서 이용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 센배이, 아라레, 오코시, 큐유히, 떡류, 만두, 우이로, 팥소류, 양갱, 물양갱, 킹쿄쿠, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸린, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스 크림, 샤베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 수밀도 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩페이스트, 후루츠 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마멀레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진츠케, 베타라츠케, 센마이츠케, 랏쿄오츠케 등의 절인 야채류, 단무지 믹스, 배추절임 믹스 등의 절인 야채류의 믹스, 햄, 소세지 등의 축육제품류, 어육 햄, 어육 소시지, 가마보코, 치쿠와, 튀김 등의 어육제품, 성게, 물오징어의 젓갈, 슈콤부, 말린 오징어, 말린 조미복어, 대구, 도미, 새우 등의 전부 등의 각종 진미류, 김, 산나물, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 합성주, 양조주, 청주, 과실술, 발포술, 맥주 등의 주류, 코피, 코코아, 쥬우스, 탄산음료, 락트산음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸린 믹스, 핫 케이크 믹스, 즉석 쥬우스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석 식품, 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제, 아미노산 함유 음료, 펩티드 식품, 냉동 식품 등의 각종 음식물에의 단 맛 부여, 정미 개량, 풍미 개량, 혹은 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 가축, 집에서 기르는 새, 그 외, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상 또는 칼로리를 저감시키는 등의 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등, 고형물, 분말, 페이스트상, 액상 등의 각종 형태로 있는 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에의 감미제로서, 또는 정미 개량제, 교미제(矯味劑)로서, 더욱이는 품질 개량제, 안정제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
품질 개량제나 안정제에의 용도로서는, 각종 유용성분이나 활성을 상실하기 쉬운 각종 생리활성 물질, 또는 이것을 함유하는 건강식품, 화장품 및 의약품 등에 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 종양괴사 인자 α, 종양괴사 인자 β, 마크로파아지 유주(遊走) 저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터류킨 등의 사이토카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 백신, 두묘, 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로불린 등의 생물제제(製劑) 함유액, 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액, EPA, DHA, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파아제, 에스테라아세, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 약용 인삼 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 얼룩 조릿대 엑기스, 복숭아 잎 엑기스, 비파잎 엑기스, 유자껍질 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트, 로얄 젤리 등의 각종 생리활성 물질에 본 발명의 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을 배합함으로써 그것들의 유효성분과 활성을 상실함이 없이, 안정하고 고품질의 액상, 페이스트상, 고상 또는 분말상의 건강식품, 화장품, 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있다.
위에서 설명한 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질에 의한 향기성분의 휘산 방지(보향), 활성성분의 열화 방지, 보습, 이수 방지, 다른 당질의 결정석출 방지, 단백질 변성 방지, 지질 열화 방지, 유화 상태의 안정화 등의 효과나, 그 자체의 안정성·부형성 등은, 당연한 것이지만 피부 외용(外用)에 보통 이용되는 기타의 성분과 배합했을 경우에도 효과적으로 발휘된다. 그리고 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 기타의 천연의 당질과 마찬가지로, 피부에 적용했을 때의 자극이 극히 낮고, 또한, 피부에 있어서의 수분의 유지에도 현저한 효과를 발휘하므로, 이 당질을 피부 외용 조성물에 배합해서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 이와 같은 피부 외용 조성물에 있어서, 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 통상, 피부에 대한 적용이 허용되는 기타의 성분의 1종 또는 2종 이상, 예를 들면, 피부에 대한 외용이 허용되는 유지류, 왁스류, 탄화수소류, 지방산류, 에스테르류, 알코올류, 계면활성제, 색소, 향료, 호르몬류, 비타민류, 식물 엑기스, 동물 엑기스, 미생물 엑기스, 염류, 자외선 흡수제, 감광 색소, 항산화제, 방부·살균제, 땀제거·소취제, 청량제, 킬레이트제, 당질, 아미노산류, 증점제 등으로부터 적절히 선택되는 1종 또는 2종 이상과 함께 배합된다.
이 피부 외용 조성물은, 예를 들면, 화장품 분야에 있어서는, 로션, 크림, 유액, 겔, 분말, 페이스트, 블록 등의 형태로, 비누, 화장 비누, 피부세정 분말, 세수 크림, 세수 폼, 페이셜 린스, 보디샴푸, 보디 린스, 샴푸, 린스, 머리세정 분말 등의 청정용 화장품, 세트 로션, 헤어 블로우, 코스메틱, 헤어 크림, 포마드, 헤어 스프레이, 헤어 리퀴드, 헤어 토닉, 헤어 로션, 양모료(養毛料), 모발염료, 두피용 트리트먼트, 채유(菜油)와 목랍으로 된 머릿기름, 윤기내기 기름, 머리기름, 머리빗을 때 사용하는 밀기름 등의 두발 화장품, 화장수, 배니싱 크림, 에몰리엔트 크림, 에몰리엔트 로션, 팩용 화장료(젤리상 필 오프 타이프, 젤리상 닦아내기형, 페이스트상 씻어 버리기형, 분말상 등), 클렌징 크림, 콜드 크림, 핸드 크림, 핸드 로션, 유액, 보습액, 애프터 쉐이빙 로션, 쉐이빙 로션, 프리쉐이브 로션, 애프터 쉐이빙 크림, 애프터 쉐이빙 폼, 프리쉐이브 크림, 화장용 기름, 베이비 오일 등의 기초 화장품, 파운데이션(액상, 크림상, 고형 등), 탤컴 파우더, 베이비 파우더, 보디 파우더, 포퓸 파우더, 메이크 업 베이스, 분(크림상, 페이스트상, 액상, 고형, 분말 등), 아이 섀도, 아이 크림, 마스카라, 눈썹 그리는 먹, 속눈썹 화장료, 볼 연지, 볼화장수 등의 메이크 업 화장품, 향수, 무늬향수, 분말향수, 오데코롱, 퍼퓸코론, 오데뚜왈렛 등의 방향(芳香) 화장품, 선탠 크림, 선탠 로션, 선탠 오일, 햇볕에 탐 방지 크림, 햇볕에 탐 방지 로션, 햇볕에 탐 방지 오일 등의 선탠 및 햇볕에 탐 방지 화장품, 매니큐어, 페디큐어, 네일 칼라, 네일 래커, 에나멜 리무버, 네일 크림, 손톱 화장료 등의 손톱 화장품, 아니 라이너 화장품, 입술 연지, 립 크림, 연지, 립 글로스 등의 입술 화장품, 치약, 입세척제 등의 구강 화장품, 바드(bath) 솔트, 바드 오일, 목욕용 화장료 등의 입욕용 화장품 등의 용도에 이용되도록 제공된다. 또한, 예를 들면, 의약품 분야에 있어서는, 이 피부 외용 조성물은, 찜질제, 분무제, 도포제, 욕제, 첨부제, 연고제, 파스타제, 리니멘트제, 로션제, 팝제 등의 형태로 제공된다.
본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질과 함께 피부외용 조성물에 배합할 수 있는 기타의 성분을 아래에서 구체적으로 설명하면, 유지류로서는, 예를들면, 아보가도유, 아몬드유, 올리브유, 참깨 기름, 사플라워기름, 대두유, 동백 기름, 파시크 기름, 피마자 기름, 면실유 등의 식물유(상온에서 액체), 카카오 버터, 야자 지방, 파암유, 목랍 등의 식물유(상온에서 고체), 밍크유, 난황유, 터틀 유 등의 동물유를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 왁스류로서는, 예를 들면, 호호바 기름, 카르나우바 왁스, 칸델리라 왁스 등의 식물성 왁스, 맛코고래 기름, 망치고래 기름, 밀랍, 고래 왁스, 라놀린 등의 동물성 왁스, 몬탄 왁스 등의 광물성 왁스를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 탄화 수소류로서는, 예를 들면, 파라핀(별명 「고형 파라핀」), 유동 파라핀, 세레신, 마이크로크리스탈린 왁스, 바셀린 등의 광물성 탄화수소, 스콸란, 스콸렌 등의 동물 기원의 탄화수소를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 지방산류로서는, 예를 들면, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 베헨산, 운데실렌산, 라놀린 지방산, 경질 라놀린 지방산, 연질 라놀린 지방산, 이소스테아르산 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 알코올류로서는, 예를 들면, 라우릴 알코올, 세탄올, 세트스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 얼레일 알코올, 베헤닐 알코올, 라놀린 알코올, 수첨(水添) 라놀린 알코올, 헥실데칸올, 옥틸도데칸올, 폴리에틸렌글리콜 등의 고급 알코올(다가 알코올을 포함함), 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세린 등의 저급 알코올(다가 알코올을 포함함) 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 에스테르류로서는, 예를 들면, 라우르산 헥실, 미리스트산 이소프로필, 미리스트산 미리스틸, 미리스트산 세틸, 미리스트산 옥틸도데실, 팔미트산 이소프로필, 스테아르산 부틸, 스테아르산 콜레스테릴, 아세트산 콜레스테릴, n-부티르산 콜레스테릴, 카프론산 콜레스테릴, 라우르산 콜레스테릴, 미리스트산 콜레스테릴, 팔미트산 콜레스테릴, 스테아르산 콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산 콜레스테릴, 올레산 데실, 올레산 옥틸도데실, 라놀린 지방산 이소프로필, 트리미리스트산 글리세린, 디올레산 프로필렌글리콜, 락트산 미리스틸, 락트산 세틸, 아세트산 라놀린, 디메틸옥탄산 헥실데실 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 계면활성제로서는, 예를 들면, 라우르산 아연, 미리스트산 아연, 팔미트산 아연, 스테아르산 마그네슘, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 트리에탄올아민, 세틸 황산 나트륨, 폴리옥시에틸렌라우릴 에테르 황산 나트륨, 폴리옥시에틸렌라우릴 에테르 황산 트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌세틸 에테르 인산, 폴리옥시에틸렌알킬페닐 에테르 인산, 라우로일사르코신 나트륨, 야자유 지방산 사르코신트리에탄올아민, 야자유 지방산 메틸타우린 나트륨, 대두 인지질 등의 음이온성 계면활성제, 염화 스테아릴트리메틸암모늄, 염화 디스테아릴디메틸암모늄, 염화 벤즈알코늄, 염화 세틸피리디늄, 브롬화 알킬이소퀴놀리늄, 도데실디메틸2-페녹시에틸암모늄움 브로마이드 등의 양이온성 계면활성제, β-라우릴아미노프로피온산 나트륨, 라우릴디메틸아미노아세트산 베타인,2-알킬-N-카로복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인 등의 양(兩)이온성 계면활성제, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린, 친유형 모노스테아르산 글리세린, 디올레산 프로필렌글리콜, 모노라우르산 소르비탄, 모노올레산 소르비탄, 수크로오스 지방산 에스테르, 운데실렌산 모노에탄올아미드, 야자유 디에탄올아미드, 모노올레산 폴리에틸렌글리콜, 락트산 미리스틸, 락트산 세틸, 폴리옥시에틸렌세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐 에테르, 모노라우르산 폴리옥시에틸렌 소르비트, 모노라우르산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 모노스테아르산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 트리올레산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 테트라올레산 폴리옥시에틸렌 소르비트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 계면활성제나, 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 색소로서는, 예를 들면, 아마란스, 에리스로신, 로즈 벵골, 애시드 레드, 레이크 레드 C, 리솔 레드, 로다민, 브릴리안트 레이크 레드, 에오신 YS, 비오라민 R, 브릴리안트 파스트 스칼렛, 본소어 R 등의 적색 타르계 색소, 디브로모플루오레세인, 퍼머넌트 오렌지, 에리스로신황 NA, 오렌지 I 등의 귤색 타르계 색소, 타트라진, 선셋 옐로, 우라닌, 벤티딘 옐로 G, 나프톨 옐로 S, 옐로 AB 등의 황색 타르계 색소, 파스트 그린 FCF, 알리자닌시아닌그린 F, 라이트 그린 SF 황, 나프톨 그린 B 등의 녹색 타르계 색소, 브릴리언트 불루 FCF, 인디고카르민, 인디고, 패턴트 불루 NA, 카르반스렌 불루, 스단 불루 등의 청색 타르계 색소, 레조르신 브라운 등의 갈색 타르계 색소, 아리즈린 퍼플, 아리즈롤 퍼플 등의 보라색 타르계 색소, 나프톨 블루 블랙 등의 흑색 타르계 색소, 산화 아연, 산화 티탄늄, 수산화 코발트, 수산화 알루미늄, 탈크, 카올린, 운모, 벤토나이트, 망간 바이올렛, 운모 티탄 등의 무기안료, β-카로틴, 리코핀, 쿠로신 등의 카로티노이드계 색소, 시소닌, 사프롤 옐로우, 루틴, 케르세틴 등의 플라보노이드계 색소, 리보플라빈 등의 플라빈계 색소, 코테닐, 알리자닌, 시코닌 등의 퀴논계 색소나, 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
피부외용 혹은 화장품용으로 일반적으로 이용되는 향료는, 대별하면, 천연향료인 동물성 향료 및 식물성 향료 이외에, 합성 향료 및 이들을 적당히 배합한 조합 향료로 분류된다. 본 발명에서 이용할 수 있는 동물성 향료로서는, 예를 들면, 사향, 영묘향, 해묘향, 용연향 등을 들 수 있다. 식물성 향료로서는, 예를 들면, 아니스 열매, 바질의 잎, 캐러웨이 과실, 시나몬 나무 껍질, 코리앤더 종자, 라벤더 꽃, 너트메그 종자, 페퍼민트 잎, 장미 꽃, 로즈메리 꽃종 또는 잎, 타임의 잎 등으로부터 수증기 증류 등에 의해 얻게되는 증류물[정유류(精油類)], 히아신스의 꽃, 재스민의 꽃, 미모사의 꽃, 장미 꽃, 바닐라의 종자 등으로부터 얻게되는 추출물(일반적으로 성상, 제법에 따라 앱솔루트류, 레지노이드류, 올레오레진류, 팅크류로 분류됨) 등을 들 수 있다. 합성 향료로서는, 예를 들면, 아세토페논, 아네솔, 벤질알코올, 아세트산 부틸, 캠퍼, 시트랄, 시트로네롤, 쿠민 알데히드, 에스트라골, 에틸바닐린, 아세트산 게라닐, 리날롤, 멘톨, 메틸 p-크레졸, 살리실산 메틸, 페닐 아세트산, 바닐린 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 이상과 같은 향료를 적당히 배합한 조합 향료를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 호르몬류로서는, 예를 들면, 에스트론, 에스트라디올 등의 난포 호르몬류, 프로게스트론, 프레그노론 등의 황체 흐르몬류, 코르티존, 히드로코르티존, 프레도니존, 프레도니졸론 등의 부신피질 호르몬류를 들 수 있고, 비타민류로서는, 예를 들면, 레티놀, 레티노인산, α-, β- 및 γ-카로텐, 이들의 유도체 등의 비타민 A에 속하는 화합물, 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 피리독신, 피리독살, 피리독사민(이상 비타민 B6), 이들의 유도체 등의 비타민 B에 속하는 화합물, L-아스코르브산이나, 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르브산을 비롯한 글리코실-L-아스코르브산, L-아스코르빈 혹은 글리코실-L-아스코르브산의 아실화 유도체(별명 「지용성 비타민 C」), L -아스코르브산 황산 에스테르 등의 L-아스코르브산 유도체 등의 비타민 C에 속하는 화합물, 에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤, 이들의 유도체 등의 비타민 D에 속하는 화합물, α-, β-, γ-, 및 ∂－토코페롤, α-, β-, γ-, 및 ∂-토코트리에놀, 이들의 유도체 등의 비타민 E에 속하는 화합물을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 식물 추출물로서는, 위에서 설명한 향료로서 이용되는 식물 추출물 이외에, 예를 들면, 카밀레 추출물, 세이지 추출물, 알로에 추출물, 샐비어 추출물, 아시타바 추출물, 아보가도 추출물, 쐐기풀 추출물, 회향풀 추출물, 우론차 추출물, 황벽 추출물, 보리 추출물, 오크라 추출물, 오리스 추출물, 해조(海藻) 추출물, 카린 추출물, 감초 추출물, 퀸스 시이트 추출물, 치자나무 추출물, 알룩조릿대 추출물, 계피 추출물, 홍차 추출물, 쌀겨 추출물, 쌀겨 발효 추출물, 스테비아 추출물, 셀러리 추출물, 용담과의 월년초 추출물, 콩 추출물, 타임 추출물, 차 추출물, 동백 추출물, 토키 추출물, 옥수수 추출물, 당근 추출물, 해당화 추출물, 노송나무 추출물, 수세미 추출물, 잇꽃 추출물, 소나무 추출물, 복숭아 추출물, 유칼리 추출물, 범의귀 추출물, 유자 추출물, 백합 추출물, 율무쌀 추출물, 쑥 추출물, 남조 추출물, 해조 추출물, 사과 추출물, 여주 추출물, 레터스 추출물 외에, 히노키티올, 아즈렌, 클로로필, 글리시리진 등의 식물로부터의 단리 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 동물 추출물로서는, 예를 들면, 태반 추출물을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 미생물 엑기스로서는, 예를 들면, 효모 엑기스를 들 수 있다.
이 피부외용 조성물에 있어서, 염류로서는, 피부외용이 보통 허용되어 있는 염류를 일반적으로 이용할 수 있는 이외에, 바닷물, 해양 심층물, 해수 건조물, 광천염 등의 천연염(용액을 포함함)도 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 자외선 흡수제로서는, 예를 들면, 파라아미노 안식 향산 에틸, 파라디메틸아미노벤조산 에틸헥실 에스테르, 시녹세이트, 파라 메톡시 계피산 에틸헥실 에스테르, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸, 옥시벤조존, 우로카닌산, 우로카닌산 에틸 및 이들의 화합물의 유도체 외에, 5-클로로우라실, 구아닌, 시토신 등의 자외선 차폐능을 가진 유기물질을 들 수 있고, 감광 색소로서는, 예를 들면, 2,2′[3′－［2-(3-헵틸-4-메틸-2-티아졸린-2-일리덴)에틸리덴]프로페닐렌]비스[3-헵틸-4-메틸]티아졸리늄 요다이드(별명 "푸라토닌"), 2-[2-(3-헵틸-4-메틸-2-티아졸린-2-일리덴)메틴]-3-헵틸-4-메틸티아졸리늄 요다이드(별명 "피오닌"), 6- [2- [(5-브로모-2-피리딜)아미노]비닐]-1-에틸-2-피콜리늄 요다이드(별명 "타카날"), 2-(2-아닐리노비닐)-3,4-디메틸옥사졸리늄 요다이드(별명 "루미네키스") 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 항산화제로서는, 이미 설명한 성분으로 항산화 작용을 가진 것 외에, 예를 들면, 몰식자산 프로필, 몰식자산 부틸, 몰식자산 옥틸, 몰식자산 도데실, 노르디히드로가이아렌산(별명「NDGA」), 부틸히드록시아니솔(별명 「BHA」), 디부틸히드록시톨루엔(별명 「BHT」), 4-히드록시메틸 1-2, 6디터셔리부틸페놀 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 방부·살균제로서는, 이미 설명한 성분으로 방부 또는 살균 작용을 가지는 것 외에, 예를 들면, 페놀, 파라 클로로메타크레졸, 레조르신, 파라 옥시벤조산 에스테르, 크레졸 등의 페놀류, 벤조산, 소르브산, 살리실산, 붕산 등의 산류(모두 염의 형태를 포함함), 헥사클로로펜, 비티오놀, 디클로로펜 등의 할로겐화 비스페놀류, 3,4,4′-트리클로로카르바닐리드, 운데실렌산 모노에탄올아미드 등의 아미드류, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 염화 데칼리늄 등의 4급 암모늄 화합물 외에, 염산 클로르헥시딘, 1-하이드록시피리딘-2-티온, 염화 리소자임이나, 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 땀제거·소취제로서는, 염화 알루미늄, 염화아연, 클로로히드록시알루미늄, 알란토인클로로히드록시알루미늄, 알란토인디히드록시알루미늄, 알루미늄클로로히드레이트류 등을 들 수 있고, 청량제로서는, 예를 들면, 멘톨, 박하 기름, 페퍼민트 기름, 캠퍼, 티몰, 스피란톨, 살리실산 메틸 등을 들 수 있고, 킬레이트제로서는, 예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산 유도체, 트리풀리인산, 헥사메타쿠인산, 디히드로에틸글리신, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 당산(糖酸)을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 당질로서는, 수크로오스, 말토오스, 프룩토오스, 락토오스, 트레할로오스 등의 소당류, 시클로덱스트린류 등의 환상 4당 이외의 환상 당질류, 말티톨, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨, 아라비톨 등의 당 알코올류, 히알루론산, 콘드로이틴 황산, 풀룰란, 셀루롤, 덱스트란, 펙틴, 카라기난, 구아검, 물엿, 아라비아 검, 츄잉검, 트라간트 검, 키틴 등의 다당류 및 그것들의 유도체 또는 부분 분해물을 들 수 있고, 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 시스틴, 아스파라긴, 글루타민, 피롤리돈카르본산, 히드록시프롤린, 피페콜산, 사르코신, 호모시스테인, 호모세린, 시트롤린, 아스파라긴산, 글루탐산, 시스테인술핀산, 아르기니노숙신산, 아르기닌, 리진, 히스티딘, 오르니틴, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 페닐아라닌, 트립토판, 프롤린, β-알라닌, 타우린, β-아미노부티르산, γ-아미노부티르산이나, 이상의 화합물의 염을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 증점제로서는, 앞서 설명한 성분으로써 증점작용을 가진 것 외에, 예를 들면, 퀸스 시이드, 아르긴산 나트륨, 양이온화 셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸 전분, 아르긴산 프로필렌글리콜, 콜라겐, 케라틴, 카제인, 알부민, 젤라틴, 히드록시프로필트리메틸암모늄 클로라이드 에테르, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리비닐 메틸 에테르, 카르복시비닐 폴리머 등의 수용성 고분자, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 황산 나트륨 등의 전해질의 외에, 각종의 기름 성분 등을 들 수 있다.
이상 설명한 바와 같은 각종 조성물에 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시키는 방법으로서는, 그 제품이 완성될때 까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 혼날(混捏), 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등의 공지의 방법이 적절히 선택된다. 환상 4당의 여러 가지 특성, 특히 포접 작용이나, 경구섭취되는 조성물에 있어서의 정미 개량, 풍미개량 등의 특성을 보다 효과적으로 발휘시키기 위해서는, 환상 4당으로서, 고형물당, 통상, 0.1％ 이상, 보다 바람직하게는 1％ 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은, 신규의 α-이소말토실 전이 효소, 이 효소의 제조 방법, 및 용도를 제공하는 발명이다. 본 발명의 신규의 α-이소말토실 전이 효소를 이용함으로써 산업상 유용한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 이것을 함유하는 당질 및 조성물을 공업적으로 저렴하고도 대량으로 제조하는 것이 가능해 졌다.
이와 같은 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 실질적으로 비환원성 내지 저환원성이고, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난(難)소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물,화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 가진 발명이어서, 이 기술분야에 공헌하는 바 실로 다대한 의의가 있는 발명이다.

Claims (42)

  1. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로｛→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이 효소.
  2. 제1항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질이, 파노오스, 이소말토실말토오스, 이소말토실파노오스 및 이소말토실파노시드로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 α-이소말토실 전이 효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-이소말토실 전이 효소가, 미생물 유래의 효소인 α-이소말토실 전이 효소.
  4. 아래의 이화학적 성질을 가지는 α-이소말토실 전이 효소.
    (1) 작용
    비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성함.
    (2) 분자량
    SDS -겔 전기영동법에 있어서 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내에서 확인되는 분자량을 가짐.
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기영동법에 있어서 pI 약 3.7 내지 pI 약 8.3의 범위내에서 확인되는 등전점을 가짐.
    (4) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 확인되는 최적 온도를 가짐.
    (5) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응의 조건하에서 pH 약 5.5 내지 pH 약 6.5의 범위내에서 확인되는 최적 pH를 가짐.
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지의 조건하에서의 안정 온도영역을 약 45℃ 이하로 가짐.
    (7）pH 안정성
    4℃, 24시간 유지의 조건하에서의 안정 pH 영역을 pH 약 3.6 내지 약 pH lO.0의 범위 내에서 가짐.
  5. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α－D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성하는 작용을 가지고, 서열표에 있어서의 서열 번호 1 내지 8에 나온 아미노산 서열로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 서열을 가지는 이소말토실 전이 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, α-이소말토실 전이 효소가 정제 효소 또는 조(粗)효소인 것을 특징으로 하는 α-이소말토실 전이 효소.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 기재한 α-이소말토실 전이 효소 산생능을 가진 미생물을 영양배지에서 배양해서 얻게되는 배양물로부터, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한 α-이소말토실 전이 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 α-이소말토실 전이 효소의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물이 바실루스속 또는 아르드로박터속의 미생물인 α-이소말토실 전이 효소의 제조 방법.
  9. 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9(독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-7143), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) Cll(독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-7144), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) N75,(독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-7591), 아르드로박터 라모서스(Arthrobacter ramosus) S1(독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-7592), 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19(독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-7590), 또는 이들의 변이주인 α-이소말토실 전이 효소 산생능을 가진 미생물.
  10. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한 α-이소말토실 전이 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 α-이소말토실 전이 반응 방법.
  11. 제10항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질이, 파노오스, 이소말토실말토오스, 이소말토실파노오스, 및 이소말토실파노시드로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 α-이소말토실 전이 반응 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제10항 또는 제11항 기재의 α-이소말토실 전이 반응에 있어서, D -글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, D-리보오스, L-리보오스, D-프시코오스, 소르비톨, 크실리톨, 아라비톨, 리비톨, 에리드리톨, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 이소파노오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 이소말토실글루코시드, 및 L-아스코르브산으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 수용체 공존하에 반응시켜 당전이물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 α-이소말토실 전이 반응 방법.
  13. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한α-이소말토실 전이 효소를 작용시키고, 수득되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  14. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한 α-이소말토실 전이 효소를 작용시켜, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당과 함께 기타의 당질을 함유하는 용액으로 하고, 이것을 강산성 양이온 교환수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 처리하여, 수득되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당의 함량을 향상시킨 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당을, 고형물당 10w/w％ 이상 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  16. 제13항, 제14항 또는 제15항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질이, 시럽, 매스키트, 비정질 분말, 비정질 고상물, 결정 분말, 또는 결정 고상물의 형태로 있는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  17. 제16항에 있어서, 결정이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 5 내지 6 함수결정, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 1 함수결정, 및 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 무수결정으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 형태로 있는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 결정이, 유기용매를 사용함이 없이 수용액으로부터 결정석출시킨 것인 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  19. 제13항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 환상 4당을 함유하는 당질이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당과 함께, 글루코오스, 말토오스, 및 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 함유하는 당질인 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질.
  20. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한 α-이소말토실 전이 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질이, 파노오스, 이소말토실말토오스, 이소말토실파노오스 및 이소말토실파노시드로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, α-이소말토실 전이 효소를 작용시킨 후, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, α-이소말토실 전이 효소를 작용시킨 후, 탈색, 탈염, 칼럼 크로마그래피에 의한 분획, 막에 의한 분리, 미생물에 의한 발효처리 및 알칼리 처리에 의한 분해 제거로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 정제 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당을, 고형물당 10w/w％ 이상 함유하고 있는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 형태가, 시럽, 매스키트, 비정질 분말, 비정질 고상물, 결정 분말, 또는 결정 고상물인 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 결정이, 유기용매를 사용함이 없이 수용액으로부터 결정석출시킨 것인 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
  27. 제13항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 기재한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를가지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을, 감미성, 난(難)발효성, 낮은 충치 유발성, 저칼로리성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 이수 방지성, 고결 방지성, 포접성, 보향성, 안정성, 다른 당의 결정석출 방지성, 전분노화 방지성, 단백질 변성 방지성, 지방질 열화 방지성, 내산성, 내열성, 혹은 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려운 특성을 가지는 당질로서, 또는, 감미료, 낮은 충치 유발성 식품소재, 저칼로리 식품 소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 보향제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 혹은 분말화 기제로서 함유시킨 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 조성물이, 음식물, 화장품 또는 의약품인 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 기재한 조성물이 피부외용 조성물인 조성물.
  31. 제27항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 기재한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 고형물당 0.1w/w％ 이상 함유시킨 조성물.
  32. 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당과 함께, 글루코오스, 말토오스, 파노오스, 이소말토실말토오스, 이소말토실파노오스, 및 이소말토실파노시드로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 함유하고 있는 당질.
  33. 제32항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(l→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당을, 고형물당 10w/w％ 이상 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 당질.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 형태가, 시럽, 매스키트, 비결정 분말, 비결정 고상물, 결정 분말, 또는 결정 고상물인 당질.
  35. 제34항에 있어서, 결정이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→｝의 구조를 가지는 환상 4당 5 내지 6 함수결정, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6）－α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 1 함수결정, 또는 사이클로{→6）－α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 무수결정인 당질.
  36. 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 5 내지 6 함수결정, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 1 함수결정, 또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당 무수결정.
  37. 제34항, 제35항 또는 제36항에 있어서, 유기용매를 사용하지 않고 수용액으로부터 결정석출시킨 것인 당질.
  38. 제32항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 당질이, 감미료, 낮은 충치 유발성 식품소재, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 보향제, 안정제, 부형제, 포접제, 또는 분말화 기재인 당질.
  39. 제32항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 기재한 당질을 함유시킨 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 조성물이, 음식물, 화장품 또는 의약품인 조성물.
  41. 제39항 에 있어서, 조성물이, 피부외용 조성물인 조성물.
  42. 제39항, 제40항 또는 제41항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을, 고형물당 0.1w/w％ 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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