KR102161331B1 - 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 WEE1 억제제의 투여에 의한 WEE1 키나제 연관 암의 치료 방법에 관한 것이며, 여기서 WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 억제제를 투여하는 것을 포함하는, WEE1 키나제 연관 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 치료될 상기 환자의 암 세포는 PKMYT1의 낮은 발현 수준을 특징으로 한다.

Description

암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER}
본 발명은 일반적으로, 항증식제, 특히 WEE1 억제제를 사용한 치료에 대한 환자의 반응을 예측하는데 유용한 발현 수준을 갖는 바이오마커의 확인에 관한 것이다. 바이오마커의 발현 수준은, 아폽토시스의 억제에 의해 매개되며 WEE1 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 암성 상태를 나타내는 환자를 예측하기 위해 이용될 수 있다.
다수의 통상적으로 사용되는 항암 약물은 분열하는 세포의 DNA를 무차별적으로 표적화하고, 궁극적으로 DNA 손상을 유발한다. 이어서, 이는 세포가 DNA 복제 또는 분열을 겪기 전에 DNA가 복구될 시간을 주기 위한 목적으로 세포 주기의 진행을 (G1, S 또는 G2/M 기에서) 정지시키는 세포 주기 체크포인트의 활성화를 일으킨다. 치료 관점에서, 세포 주기 정지를 매개하는 체크포인트 키나제의 억제는, 화학적으로-유발된 DNA 손상이 복구되기 전에 종양 세포가 세포 분열을 계속하게 만들어, 결국 아폽토시스 또는 유사분열 카타스트로피를 초래한다 (Medema, R.H. and Macurek, L., Oncogene, 2012, 31(21):2601-2613). 세포주 연구가 이 가설을 뒷받침하며, CHK1, WEE1, ATR 및 ATM을 비롯한 체크포인트 키나제 활성의 약리학적 또는 유전적 파괴에 의한 화학감작 및 방사선감작을 보여준다. 이들 키나제에 대한 억제제는 치료적 DNA 손상에 대해 종양 세포를 감작화하는 그의 능력에 대한 전임상 및 임상 개발의 다양한 단계에 있다.
체크포인트 키나제 WEE1은 티로신 15 상에서 CDK1 (CDC2) 및 CDK2 둘 다의 억제 인산화를 촉매화한다 (Parker, L. L. and Piwnica-Worms, H., Science, 1992, 257(5078):1955-1957; Watanabe, N., et al., Embo J., 1995, 14(9):1878-1891). CDK1 및 CDK2의 WEE1-의존성 억제는 외인성 유발된 DNA 손상에 반응하여 세포 주기를 정지시킨다 (Hamer, P.C.D., et al., Clin. Cancer Res., 2011, 17(13):4200-4207). WEE1 활성은 또한 비교란 세포 주기에 필수적이다 (Mcgowan, C.H. and Russell, P., Embo J., 1993, 12(1):75-85; Tominaga, Y., et al., Intl. J. Biol. Sci., 2006, 2(4):161-170). 정상 인간 섬유모세포에서의 세포 동기화 연구는 유사한 양의 WEE1 단백질이 S 및 G2/M 기 둘 다에서 검출되었지만 그의 최대 활성은 세포 주기의 S 기에 있었음을 밝혀냈다 (Watanabe, N, 1995). 또한, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)에서의 조건적 WEE1 녹아웃시에, 세포는 게놈 불안정성, 체크포인트 기능장애 및 조기 유사분열의 증거를 보여준다 (Tominaga, et al., 2006). 이러한 표현형은 DNA 합성에서의 WEE1에 대한 결정적 역할을 증명하는 최근의 발견에 의해 부분적으로 설명되었다. DNA 손상 작용제의 부재 하에서의 WEE1의 녹다운은 DNA 복제를 진행하는 S-기 세포에서 특이적으로 DNA 이중 가닥 절단의 신속하고 강력한 검출을 유도하였다 (Beck, H., et al., J. Cell Biol., 2010, 188(5):629-638; Dominguez-Kelly, R., et al., J. Cell Biol., 2011, 194(4):567-579). WEE1 녹다운 또는 억제가 CDK 1 및 2의 비정상적으로 높은 활성을 유발하여 과도한 DNA 복제 기점이 부적절한 시점에서 발화되게 하고, 이것이 뉴클레오티드 풀을 급격히 고갈시키고, WEE1 활성의 부재 하에 DNA 엑소뉴클레아제에 대한 기질인 지체된 복제 분기점을 유발하며, 이는 DNA 이중 가닥 절단으로 분해한다는 WEE1-의존성 게놈 안정성의 모델을 데이터가 뒷받침한다 (Beck, H., et al., 2012).
탈조절된 WEE1 발현 또는 활성은 몇몇 유형의 암의 병리상태의 특징인 것으로 여겨진다. WEE1은 종종 교모세포종에서 과다발현되고, 그의 활성은 상기 종양 유형을 유사분열 카타스트로피로부터 보호하며 이에 따라 높은 WEE1 수준은 불량한 예후와 연관된다 (Mir, S.E., et al., Cancer Cell, 2010, 18(3):244-257). WEE1의 높은 발현은 악성 흑색종에서 발견되었고, 상기 집단에서의 불량한 무질환 생존과 상호관련되었다 (Magnussen, G.I., et al., Plos One, 2012, 7(6)). 비정상적 WEE1 발현은 추가적 종양 유형, 예컨대 간세포성 암종 (Masaki, T., et al., Hepatology, 2003, 37(3):534-543), 유방암 (Iorns, E., et al., Plos One, 2009, 4(4)), 결장 암종 (Backert, S., et al., Intl., J. Cancer, 1999, 82(6):868-874), 폐 암종 (Yoshida, T., et al., Annals of Oncology, 2004, 15(2):252-256) 및 두경부 편평 세포 암종 (Wu, Z.X., et al., Mol. & Cell. Proteomics, 2011, 10(12))에도 연루되어 왔다. 증가된 수준의 게놈 불안정성을 갖는 진행성 종양은 이러한 치사성 DNA 손상의 복구를 가능하게 하기 위해 기능적 체크포인트를 필요로 할 수 있다. 이와 같이, WEE1은 진행성 종양에 있어서 관심 대상이 되는 표적을 나타내며, 여기서 그의 억제는 복구불가능한 DNA 손상을 유발하는 것으로 여겨진다 (Sorensen, C.S. and Syljuasen, R.G., Nuc. Acids Res., 2012, 40(2):477-486).
어느 환자가 특정 요법을 이용한 치료에 순응성인지를, 특히 1차 요법에 비-반응성이거나 또는 그에 불응성이 될 가능성이 있는 환자를 예측하는데 이용될 수 있는 바이오마커에 대한 요구가 존재한다. 따라서, 본 발명의 대상은 WEE1 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 선택하기 위한 예측 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명은 일반적으로 WEE1 억제제를 사용한 치료에 대해 환자를 평가 및 분류하는데 유용한 발현 수준을 갖는 예측 바이오마커의 확인에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 예측 바이오마커, PKMYT1은 WEE1 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는데 사용되며, 여기서 WEE1 억제제는 WEE1-1이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 연관 암으로 진단된 환자를 WEE1 억제제를 사용하여 치료하는 방법이며, 여기서 상기 환자의 암 세포는 PKMYT1의 낮은 발현을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 억제제를 사용한 치료에 감수성인 암 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 상기 환자의 암 세포는 PKMYT1의 발현 수준이 참조 값의 수준 미만인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 키나제 연관 암을 치료하는데 사용하기 위한 WEE1 억제제를 확인하는 방법이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PKMYT1에 반응하는 시약을 포함하는, WEE1 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하기 위한 키트이다.
도 1은 WEE1 억제제에 의한 다양한 종양 세포주에서의 세포 증식의 붕괴의 그래픽 도시이다. 96-시간 윈도우에 걸친 증식을 WEE1-1의 9-점 적정으로 처리된 522개의 암 세포주에 대해 3회 반복으로 검정하였다. 세포주 반응 데이터를 기원 종양 조직으로 나누고, WEE1-1 농도의 함수로서 (DMSO-처리된 대조 세포와 비교하여) 분율 생존율로 나타내었다.
도 2a 및 2b는 WEE1 억제제를 사용한 처리로 인해 발생하는 S 기에서의 DNA 손상의 도시이며, 여기서 ES-2, A2058, A431, A427, KNS62 및 NCI-H460 세포를 DMSO (-) 또는 증가하는 농도의 WEE1-1로 2시간 동안 처리하였다. 단백질 용해물을 인산화 CHK1S345, 인산화 CDK1Y15, 인산화 CDK1T14, 또는 로딩 대조군으로서의 액틴에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다 (도 2a). TOV-21G 세포를 DMSO 또는 150 nM WEE1-1로 2 또는 6시간 이하 동안 처리하였다 (도 2b). DNA 복제가 활발히 진행되는 S 기 세포를 표지하기 위해, 수확 1시간 전에 세포를 BrdU로 펄스-표지하였다. 세포를 총 DNA 함량에 대한 DNA 이중 가닥 절단 (γH2AX) (도 2b, 좌측 패널) 또는 BrdU 흡수에 대한 γH2AX (도 2b, 우측 패널)에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. γH2AX-염색 세포의 백분율은 DNA 이중 가닥 절단을 함유하는 세포 집단을 나타내며, 각각의 처리 조건에 대해 표시되어 있고, 우측 패널에서 BrdU 상태에 의해 분리하였다.
도 3a-3c는 WEE1 억제제를 사용한 처리로 인해 발생하는 S 기 진행의 지연의 도시이다. ES-2 세포를 36시간 혈청 회수 후에 동기화하였다. 도 3a 및 3b에서, 레인 1-6에서는 비히클 (DMSO) 또는 레인 7-11에서는 500 nM WEE1-1의 첨가된 존재 하에 주기를 재개시키기 위해 20% FBS를 사용하여 세포를 자극하였다. FBS 자극 후 수확 시간을 나타내었다. 수확 1시간 전에, 세포를 BrdU로 펄스-표지하였고, BrdU-염색 세포의 백분율을 상부 패널에 나타내었다. 동시에 처리된 ES-2 세포로부터의 단백질 용해물을 수집한 후, 나타낸 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 비히클-처리된 대조군과 비교하여, WEE1-1 처리는 S 기를 통한 진행 (도 3a, 상부 패널 및 도 3b) 및 S 기 BrdU 흡수 (도 3a, 상부 패널)를 지연시켰으며, 이는 DNA 복제의 저속화를 나타낸다. WEE1-1 처리는 시클린 A 발현을 지연시키고, pChk1S345에 의해 입증된 바와 같이 DNA 손상 신호전달을 유도한다 (도 3a, 좌측 하단 패널). 도 3b는 BrdU-염색 및 DNA 함량을 비교하는 파트 A로부터의 선택 샘플에서의 유동 세포측정법 분석 (4, 12 및 24시간 처리)을 보여준다. 도 3c에서의 데이터는 20% FBS의 존재 또는 부재 하에 500 nM WEE1-1이 첨가된 혈청-고갈 ES-2 세포를 나타낸다. 24시간 후, DNA 함량 및 γH2AX (DNA 이중 가닥 절단)를 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 세포의 전체 집단의 백분율이 차트에 제시되며 (도 3c), 이는 집단이 20% FBS에 의해 자극될 경우에 WEE1-1이 더 많은 세포에서 DNA 이중 가닥 절단을 유도한다는 것을 입증한다.
도 4a 및 4b는 WEE1 억제를 이용하여 세포독성을 유도하는데 있어서 조기 유사분열이 필요하지 않다는 것을 도시한다. A2058, HT-29 및 LoVo 세포를 DMSO (- WE1-1) 또는 WEE1-1로 약물의 EC90 농도에서 24시간 동안 처리하였다. 유동 세포측정법을 이용하여 유사분열 마커 인산화 히스톤 H3 (pHH3S10, 도 4a) 또는 DNA 이중 가닥 절단 마커 γH2AX (도 4b)에 대해 양성인 세포의 집단을 확인하였다. 상부 패널에서, 우측 게이트는 예상된 유사분열 집단 (4N DNA 함량)을 나타내고, 좌측 게이트는 4N 미만의 DNA 함량을 갖는 pHH3에 대해 양성인 세포를 나타낸다.
도 5a - 5d는 WEE1-1 단일 작용제 처리의 생체내 효능의 도시이며, 여기서 A427 이종이식편 보유 마우스에게 비히클 (0.5% 메틸셀룰로스) 또는 60 mg/kg의 WEE1-1을 투여하였다. 비히클 및 화합물 둘 다는 연속 28일 동안 BID로 투여하였다. 이종이식 종양 부피를 주 2회 측정하고, 비히클 (n=10) 및 WEE1-1 (n=10) 처리된 마우스에 대한 처리 일수에 대해 플롯팅하였다 (평균 부피 -/+ SEM) (도 5a). 도 5b는 비히클 또는 MK-1775로 28일 동안 처리된 개별 A427 이종이식편의 최종 종양 부피를 플롯팅한 것을 보여준다. 연구 시작시에 평균 종양 부피는 164 mm3였고, 파선으로 나타내었다. 도 5c 및 5d는, WEE1-1 처리를 LoVo 이종이식편 연구 13일째 (별표로 표시함)에 중단하고 추가로 2주 동안 종양 부피를 측정한 것을 제외하고는 도 5a에 대해 기재된 바와 같은 SK-MES-1 (c) 및 LoVo (d) 이종이식편 모델에서 수행된 추가적 생체내 효능 연구를 도시한다.
도 6a 및 6b는, PKMYT1 녹다운이 WEE1-1에 대한 감수성을 선택적으로 증가시켰고 CDK1의 억제 인산화를 감소시켰음을 도시한다. 도 6a는 상대적 WEE1-1 내성을 나타내는 2개의 세포주 H460 및 KNS62에서의 PKMYT1의 녹다운을 도시한다. 세포를 비-표적화 대조군 (CT) 또는 PKMYT1 서열을 함유하는 siRNA 풀로 형질감염시켰다. 세포를 WEE1-1, 카르보플라틴, MEK 억제제 (PD0325901) 또는 독소루비신으로 72시간 동안 처리한 후, 비아라이트(ViaLight) ATP 검정으로 증식에 대해 검정하였다. PKMYT1의 녹다운은 WEE1-1 단독에 대해 증식 EC50을 낮추었으며, 시험된 다른 화합물에 대해서는 그렇지 않았다. 도 6b에서, KNS62 세포를 비-표적화 대조군 (CT) 또는 PKMYT1 siRNA 풀로 형질감염시키고, 나타낸 시간 동안 400 nM WEE1-1로 처리하였다.
도 7a 및 7b는 낮은 PKMYT1 발현이 WEE1-1에 대한 감수성을 증진시켰음을 도시한다. 도 7a에서, 상대적 PKMYT1 발현 (CCLE 데이터베이스, 브로드-노파르티스(Broad-Novartis))을 각각 단일 도트로 표시된 305개의 세포주에서의 400 nM WEE1-1 처리에 대한 반응에 대해 플롯팅하였다. WEE1-1에 대한 반응 (x-축)은 96-시간 증식 검정을 기초로 하여 조정된 값이며, 여기서 1의 값은 DMSO 처리된 세포와 비교하여 성장 속도에서 변화가 없음을 나타내고, 0.25 (수직 파선) 또는 그 미만의 값은 음성 성장 속도 또는 세포 사멸을 나타낸다. 305개의 세포주 중에서의 평균 상대적 PKMYT1 발현은 413이다. 도 7b는 상기 도 7a에서 분석에 포함되지 않았던 13개의 세포주에 대한 PKMYT1 mRNA (좌측 패널) 또는 PKMYT1 단백질 (우측 패널)의 상대적 발현에 대해 플롯팅된 EC50 값 (μM)으로 측정된, WEE1-1에 대한 증식 반응을 도시한다.
도 8a 및 8b는 WEE1-1에 의한 WEE1의 억제가 증가된 CDK1 및 2 활성을 유도한다는 것을 도시한다. ES-2 세포를 DMSO 또는 250 nM WEE1-1로 24시간 동안 처리하고, 수집하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 용해시켰다. 도 8a에서, 용해물을 WEE1 기질 (pCDK1Y15), DDR 마커 (pCHK1S345), 또는 CDK1 및 2 기질 (각각 p스타트민S38 및 p라민A/CS22)에 대한 개별 항체로 프로빙하였다. 도 8b에서, 용해물을 범 CDK-기질 모티프 항체로 프로빙하였다.
도 9a 및 9b는 WEE1-1 처리에 의해 유도된 DNA 손상이 미토겐 자극을 필요로 한다는 것을 도시한다. ES-2 세포를 36시간 동안 혈청 고갈시키고, 상기 시점에 이를 비자극 하에 두거나 또는 20% FBS로 처리하였다. 양쪽 조건 하에 배양된 세포에 DMSO 또는 500 nM WEE1-1을 24시간 동안 제공한 후, DNA 함량 (7-AAD) 및 DNA 이중 가닥 절단 (γH2AX)의 유동 세포측정법 분석을 위해 수집하였다. 도 9a는 세포 주기 분포의 히스토그램을 도시한다. 도 9b는 γH2AX 집단을 나타내는 게이트를 이용한 산포 플롯을 도시한다. 전체 세포의 백분율은 세포 주기 단계로 또는 γH2AX 양성으로서 나타낸다.
많은 항암 치료는 DNA를 손상시킴으로써 작용하는데, 후속으로 DNA 손상 반응 (DDR)이 개시되고, 체크포인트 키나제가 활성화되어 DNA가 복구되는 동안 분열을 정지시킨다. 티로신 키나제인 WEE1은 DDR에 의해 활성화되어 시클린 의존성 키나제 (CDK) 1 및 2를 인산화시키고 억제하며, 이로써 세포 분열이 정지된다. WEE1의 억제는 세포 주기 정지 및 적절한 DNA 복구를 저지함으로써 DNA 손상 치료를 강화한다.
2-알릴-1-[6-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-2-일]-6-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온으로도 공지되어 있는 WEE1-1은 WEE1의 강력한 (IC50 = 5.2 nM) 선택적 ATP-경쟁적 소분자 억제제이며 (Hirai, H., et al., Mol. Cancer Ther., 2009, 8(11):2992-3000), 이는 현재 표준 치료 (SOC) 화학요법제와 조합되어 항종양제로서 임상 개발 하에 있다 (Stathis, A. and Oza A., Drug News & Perspectives, 2010, 23(7):425-429; Schellens, J.H.M., et al., J. Clin.Oncol., 2011, 29:2011 (suppl; abstr 3068); Mizuarai, S., et al., Mol. Cancer, 2009, 8:34). WEE1-1에 대한 이전 연구는, 궁극적으로 아폽토시스 또는 유사분열 카타스트로피를 유발하는 비계획 유사분열을 강제하는 그의 능력에 의한, 현재 사용되는 표준 치료 (SOC) 화학요법제에 대한 보조약 또는 증감제로서의 그의 잠재력을 입증하였다 (Hirai, H., et al., Cancer Biol. & Ther., 2010, 9(7):514-522; Aarts, M., et al., Cancer Discovery, 2012, 2(6):524-539; Indovina, P. and Giordano A., Cancer Biol. & Ther., 2010, 9(7);523-525; Wang, Y.L., et al., Cancer Biol. & Ther., 2004, 3(3):305-313). 그러나, SOC 화학요법 부재 하의 WEE1 억제의 잠재적 치료 효과는 별로 규정되어 있지 않다. WEE1의 RNAi 녹다운은 암 세포주의 증식을 억제하였고 (Iorns, E., et al., Cancer Targets, 2009, Plos One, 4(4); Murrow, L.M., et al., Breast Cancer Research and Treatment, 2010, 122(2):347-357), 최근에는 단독 WEE1-1이 시험관내 처리된 육종 세포주에서 아포토시스를 유도할 수 있다는 것이 입증되었다 (Kreahling, J.M., et al., Mol. Cancer Ther., 2012, 11(1):174-182).
본 출원인은 본원에서, 단일 작용제로서의 WEE1-1의 사용을 통한 단독 WEE1의 약리학적 억제가 광범위한 패널의 종양 세포주에 걸쳐 세포독성이었으며 DNA 이중 가닥 절단을 강하게 유도하였음을 입증한다. 두드러지게, WEE1-1은, SOC 화학요법 또는 방사선요법과 독립적이며 S-기 세포에서 발생하고 활성 DNA 복제에 의존적인 DNA 손상을 유도하였다. 허용 용량에서, WEE1-1 단일 작용제 요법은 이종이식 종양 성장 억제 또는 퇴행을 유발한다. WEE1과 기능적으로 관련된 키나제인 PKMYT1의 녹다운은 WEE1-1에 대해 암 세포를 선택적으로 감작화하였지만, 다른 세포독성제에 대해서는 이를 감작화하지 못했다. 본원에 기재된 바와 같이, PKMYT1의 발현은 WEE1-1에 가장 반응성인 암 세포주의 대략 3/4에서 평균 미만이었다. 낮은 PKMYT1 발현 수준을 갖는 세포주의 선택으로 WEE1-1에 대한 이들 세포주의 시험관내 감수성을 예측하였다. 이와 함께, 이들 발견은, 강력한 단일 작용제 항암 요법으로서의 WEE1 억제의 이용, 및 WEE1-1 단일 작용제 요법에 가장 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하고 선택하기 위한 낮은 PKMYT1 발현의 이용에 대한 근거를 제공한다.
따라서, 본 발명은 WEE1 억제제를 사용한 암의 치료 방법에 관한 것이며, 여기서 WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 억제제에 의한 WEE1 억제에 감수성인 발현을 갖는 예측 바이오마커, PKMYT1에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 키나제 연관 암의 치료를 필요로 하는, WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 환자를 WEE1 억제제를 사용하여 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 환자의 암 세포는 PKMYT1의 낮은 발현을 특징으로 하고, 상기 WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 억제제를 사용한 치료에 감수성인 암 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 상기 환자의 암 세포는 PKMYT1의 발현 수준이 참조 값의 수준 미만인 것을 특징으로 하고, 상기 WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 키나제 연관 암을 치료하는데 사용하기 위한 PKMYT1 억제제를 확인하는 방법이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PKMYT1에 반응하는 시약을 포함하는, WEE1 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하기 위한 키트이다.
본 발명의 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, WEE1 억제제는 하루에 100 mg 내지 하루에 200 mg의 용량으로 투여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 2.5일에 걸쳐 1일 2회 (BID) (총 5회 용량의 경우) 또는 2일에 걸쳐 1일 1회 (QD) (총 2회 용량의 경우) 투여될 수 있다.
본 설명에서 언급되는 용어 "암"은 다양한 육종 및 암종을 포함하고, 고형 암 및 조혈암을 포함한다. 본원에 언급된 고형 암은, 예를 들어 뇌암, 뇌경부암, 식도암, 갑상선암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 자궁내막암, 폐암, 위암, 담낭/담관암, 간암, 췌장암, 결장암, 직장암, 난소암, 융모막암종, 자궁체암, 자궁경부암, 신우/요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환암, 태아암, 윌름스 종양, 피부암, 악성 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 유잉 종양, 연부 육종을 포함한다. 다른 한편으로는, 조혈암은 예를 들어 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 진성 다혈구혈증, 악성 림프종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종을 포함한다.
본 설명에서 언급되는 용어 "WEE1 키나제 연관 암"은 WEE1 키나제의 활성 또는 억제와 연관된 암, 예를 들어 비제한적으로 뇌암, 뇌경부암, 식도암, 갑상선암, 소세포 암, 비소세포 암, 유방암, 폐암, 위암, 담낭/담관암, 간암, 췌장암, 결장암, 직장암, 난소암, 융모막암종, 자궁체암, 자궁경부암, 신우/요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환암, 태아암, 윌름스 암, 피부암, 악성 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 유잉 종양, 연부 육종, 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 호지킨 림프종을 포함한다. 특히, 본 발명의 WEE1 억제제는, 예를 들어 유방암, 폐암, 췌장암, 결장암, 난소암, 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 호지킨 림프종에 대한 요법으로서, 또는 상기 암의 화학요법 또는 방사선 요법을 위한 증감제로서 유용하다.
본 설명에서 언급되는 용어 "암의 치료"는 암 환자에서 암 세포의 성장이 억제되도록 항암제를 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 치료는 일부 형태의 암 성장 퇴행을 유발하거나, 또는 상기 치료는 암의 재발을 지연 또는 방지한다. 보다 바람직하게는, 치료는 암의 완전한 소실을 일으킨다.
본 설명에서 언급되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 의학적 개입 또는 치료를 필요로 하는 수용자를 의미한다. 포유동물 및 비-포유동물 환자 또는 대상체가 포함된다.
본 설명에서 언급되는 용어 "예측 바이오마커"는 주어진 치료제 또는 치료제의 부류에 대한 반응과 상호관련된 발현을 갖는 유전자 마커를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 WEE1 억제제의 치료 효과와 상호관련된 발현을 갖는 PKMYT1을 지칭한다. 본원의 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 WEE1-1이다.
"마커-유래 폴리뉴클레오티드"는 마커 유전자로부터 전사된 RNA, 그로부터 생산된 임의의 cDNA 또는 cRNA, 및 그로부터 유도된 임의의 핵산, 예컨대 마커 유전자에 상응하는 유전자로부터 유도된 서열을 갖는 합성 핵산을 의미한다.
용어 "대조군", "대조 수준", "참조 수준" 또는 "미리 결정된 참조 수준"은 무질환일 수 있거나 아닐 수 있는 비교가능한 대조 세포에서 측정된 별도의 기준선 수준을 의미한다. 이는 동일한 개체로부터의 것일 수 있거나, 또는 정상인 또 다른 개체 또는 수득한 질환 샘플 또는 시험 샘플과 동일한 질환이 존재하지 않는 또 다른 개체로부터의 것일 수 있다. 따라서, "참조 값"은 절대 값, 값의 범위, 평균 값, 중앙 값, 중간 값, 또는 특정한 대조 또는 기준선 값과 비교한 값일 수 있다. 참조 값은 개체 샘플 값, 예컨대 WEE1 키나제 연관 암을 갖는 개체로부터의 보다 초기의 시점의 또는 치료 전의 샘플로부터 얻은 값, 또는 시험되는 개체 이외의 WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 환자, 또는 "정상" 개체, 즉 WEE1 키나제 연관 암으로 진단되지 않은 개체로부터의 샘플로부터 얻은 값을 기초로 할 수 있다. 참조 값은, 예컨대 WEE1 키나제 매개 암으로 진단된 다수의 환자 또는 정상 개체로부터의 다수의 샘플, 또는 치료될 샘플을 포함하거나 이를 제외시킨 샘플의 풀을 기초로 할 수 있다.
본 설명에서 언급되는 용어 "PKMYT1"은 세린/트레오닌 단백질 키나제 패밀리의 구성원인 단백질인, 막-연관 티로신- 및 트레오닌-특이적 CDK1 억제 키나제를 코딩하는 유전자를 의미하며 (Liu, F., et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17(2):571-583), 그의 서열은 NCBI 참조 서열 NM_004203 (서열 1) 및 NP_004194 (서열 2)로 제시된다.
본 설명에서 언급되는 용어 "PKMYT1의 낮은 발현" 또는 "낮은 PKMYT1 발현"은, 암으로 진단되지 않은 환자 또는 이를 특징으로 하는 세포주로부터 수득한 세포 또는 대조 세포와 비교하여, 보다 낮은 PKMYT1 DNA, mRNA 또는 단백질 발현을 갖거나 PKMYT1 유전자 카피 수의 감소를 갖는 것을 특징으로 하는 세포주, 또는 상기 특징을 갖는 암으로 진단된 환자로부터 수득한 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "발현 수준 측정", "유전자 발현 수준 측정 " 또는 "발현 수준 획득" 등은 유전자, 예를 들어 마이크로 RNA (miRNA)의 전사체 또는 유전자에 의해 코딩된 단백질에 의해 예시되는 표적 유전자 발현 수준을 정량화하는 방법, 뿐만 아니라 관심 대상 유전자가 조금이라도 발현되는지를 결정하는 방법을 포함한다. 따라서, 발현의 양의 정량화를 반드시 제공하지 않아도 "예" 또는 "아니오"의 결과를 제공하는 검정은 상기 용어로서의 "발현 측정"이 본원에 사용된 것인 검정이다. 대안적으로, 상기 용어는 발현된 표적 유전자의 발현 수준을 정량적 값으로 정량화하는 것, 예를 들어 발현의 배수 변화, 대조 유전자에 비해 또는 또 다른 샘플의 동일 유전자에 비해 높거나 낮음, 또는 발현의 로그 비, 또는 그의 임의의 시각적 표현, 예컨대 예를 들어 색상 강도가 검출된 유전자 발현의 양을 나타내는 "열지도"를 포함할 수 있다. 유전자의 발현의 수준을 검출하기 위한 예시적인 방법은 노던 블롯팅, 도트 또는 슬롯 블롯, 리포터 유전자 매트릭스 (예를 들어, US 5,569,588 참조), 뉴클레아제 보호, RT-PCR, 마이크로어레이 프로파일링, 차별 디스플레이, SAGE (Velculescu et al., (1995), Science 270:484-87), 디지털 유전자 발현 시스템 (WO2007076128; WO2007076129 참조), 멀티플렉스 mRNA 검정 (Tian et al., (2004), Nucleic Acids Res. 32:e126), PMAGE (Kim et al., (2007), Science 316:1481-84), cDNA-매개 어닐링, 선택, 연장 및 라이게이션 검정 (DASL, Bibikova, et al., (2004), AJP 165:1799-807), 멀티플렉스 분지 DNA 검정 (Flagella et al., (2006), Anal. Biochem. 352:50-60), 2D 겔 전기영동, SELDI-TOF, ICAT, 효소 검정, 항체 검정 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
WEE1 억제제
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 WEE1 억제제는 WEE1-1이며, 그의 구조는 하기 나타낸 바와 같다.
Figure 112015049198685-pct00001
WEE1-1은 암의 치료에 유용한 WEE1 억제제이다. WEE1-1은 또한 2-알릴-1-[6-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-2-일]-6-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온으로 공지되어 있다. WEE1-1은 미국 특허 번호 7,834,019, 및 PCT 국제 공개 WO2007/126122, WO 2007/126128 및 WO2008/153207에 기재된 바 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. WEE1-1의 결정질 형태는 미국 공개 US2010-0124544 및 PCT 국제 공개 WO2011/034743에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 WEE1 억제제는 WEE1-2이며, 그의 구조는 하기 나타낸 바와 같다.
Figure 112015049198685-pct00002
WEE1-2는 암의 치료에 유용한 WEE1 억제제이다. WEE1-2는 또한 3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-7-[(2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-일)아미노]-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온으로 공지되어 있다. WEE1-2는 PCT 국제 공개 WO2008/153207 및 미국 공개 US2011-0135601에 기재된 바 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. WEE1-2의 결정질 형태는 국제 공개 WO2009/151997 및 미국 공개 US2011-0092520에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물은 비대칭 중심, 키랄 축 및 키랄 면을 가질 수 있고 (문헌 [E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190]에 기재된 바와 같음), 라세미체, 라세미 혼합물로서, 및 광학 이성질체를 비롯한 모든 가능한 이성질체 및 그의 혼합물을 포함하여 개별 부분입체이성질체로서 발생하고, 이러한 모든 입체이성질체는 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 개시된 화합물은 호변이성질체로서 존재할 수 있고, 오직 하나의 호변이성질체 구조가 묘사되더라도 호변이성질체 형태 둘 다가 본 발명의 범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물에서, 원자는 그의 천연 동위원소 존재비를 나타낼 수 있거나, 또는 원자 중 1개 이상은 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 우세하게 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 특정한 동위원소로 인위적으로 농축될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 화합물의 모든 적합한 동위 원소 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 수소 (H)의 다양한 동위원소 형태는 경수소 (1H) 및 중수소 (2H)를 포함한다. 경수소는 자연에서 발견되는 우세한 수소 동위원소이다. 중수소에 대한 농축은 특정의 치료 이점, 예컨대 생체내 반감기의 증가 또는 투여량 요건의 감소를 제공할 수 있거나, 또는 생물학적 샘플의 특성화를 위한 표준물로서 유용한 화합물을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 동위원소-농축된 화합물은 통상의 기술자에게 널리 공지된 통상의 기술에 의해, 또는 적절한 동위원소-농축된 시약 및/또는 중간체를 사용하여 본원의 반응식 및 실시예에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 과도한 실험 없이 제조될 수 있다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 다양한 결정, 무정형 물질, 제약상 허용되는 염, 수화물 및 용매화물로서 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 WEE1 억제제는 전구약물로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 이러한 전구약물은 생체에 의해 필요한 화합물로 용이하게 전환될 수 있는 본 발명의 WEE1 억제제의 기능적 유도체이다. 따라서, 본 발명의 다양한 암의 치료 방법에서, 용어 "투여"는 특정 화합물의 투여, 뿐만 아니라 환자에게 투여된 후에 생체에서 특정 화합물로 전환할 수 있는 화합물의 투여를 포함한다. 적합한 전구약물 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상의 방법은, 예를 들어 문헌 ["Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985]에 기재되어 있고, 상기 문헌은 본원에서 참조되며 그 전문이 본 설명의 일부로서 본원에 포함된다. 화합물의 대사물은 생물학적 환경 하에서 화합물이 생산하는 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 화합물의 범위 내에 포함된다.
바이오마커 발현 수준의 결정
A. 바이오마커를 측정하는 방법
한 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 억제제에 의한 WEE1 억제에 감수성인 발현을 갖는 예측 바이오마커, PKMYT1이다. 샘플에서의 예측 바이오마커의 발현 수준은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다. 발현 수준은 바이오마커로부터 전사된 핵산을 단리하고 상기 핵산의 수준 (즉, 양)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 바이오마커에 의해 코딩된 특정 단백질의 수준이 결정될 수 있다.
바이오마커의 발현 수준은 샘플 내에 존재하는 mRNA, 또는 그로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 양을 결정함으로써 달성될 수 있다. RNA 수준을 결정하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, RNA를 샘플로부터 단리하고, 아가로스 겔 상에서 분리한다. 분리된 RNA를 이어서 고체 지지체, 예컨대 필터로 옮긴다. 하나 이상의 마커를 나타내는 핵산 프로브를 이어서 노던 혼성화에 의해 필터에 혼성화하고, 마커-유래 RNA의 양을 결정한다. 이러한 결정은, 시각에 의한 것일 수 있거나, 또는 예를 들어 덴시토미터의 사용에 의해 기계-보조될 수 있다. RNA 수준을 결정하는 또 다른 방법은 도트-블롯 또는 슬롯-블롯의 이용에 의한 것이다. 이 방법에서, 샘플로부터의 RNA 또는 그로부터 유도된 핵산은 표지된다. RNA 또는 그로부터 유도된 핵산은 이어서 하나 이상의 마커 유전자로부터 유도된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 필터에 혼성화되며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 필터 상에서, 용이하게-확인가능한 개별 위치에 배치된다. 필터-결합 올리고뉴클레오티드로의 표지된 RNA의 혼성화 또는 혼성화의 부재는 시각적으로 결정되거나 또는 덴시토미터에 의해 결정된다. 폴리뉴클레오티드는 방사성표지 또는 형광 (즉, 가시적) 표지를 사용하여 표지될 수 있다.
"조직 어레이"를 이용하여 다수의 조직 시편에서의 바이오마커 유전자의 발현을 특성화할 수 있다 (Kononen et al., Nat. Med, 1998, 4(7):844-847). 조직 어레이에서, 다수의 조직 샘플이 동일한 마이크로어레이 상에서 평가될 수 있다. 조직 어레이는 RNA 및 단백질 수준의 계내 검출을 가능하게 하고; 연속 절편은 다수 샘플의 동시 분석을 가능하게 한다.
이들 예는 제한적인 것으로 의도되지 않으며, RNA 존재비를 결정하는 다른 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
B. 마이크로어레이
일부 실시양태에서, 각각의 바이오마커의 발현 상태가 동시에 평가되도록 발현을 측정하기 위해 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이가 이용될 수 있다. 상기 측정 방법이 이용될 경우에, 마이크로어레이는 바람직하게는 대상체 하위세트 내의 분류-정보로서 확인되는 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 바이오마커 또는 모든 바이오마커 또는 바이오마커의 임의의 조합을 포함한다. 마이크로어레이가 포함하는 정보 바이오마커의 실제 개수는 관심 대상의 특정한 상태, 확인된 바이오마커의 수, 및 임의로 종점 표현형의 결정에서 최소의 유형 I 오차, 유형 II 오차, 또는 유형 I 및 유형 II 오차를 유발하는 것으로 밝혀진 정보 바이오마커의 수에 따라 달라질 것이다. 본원에 사용될 때, "유형 I 오차"는 가양성을 의미하고 "유형 II 오차"는 가음성을 의미하며; CDK 억제제에 대한 노출에 대한 환자의 치료 반응을 예측하는 예에서, 유형 I 오차는 CDK 억제제에 대해 치료 반응을 갖는 개체의 CDK 억제제 치료에 비-반응성인 것으로의 특성화오류이고, 유형 II 오차는 CDK 억제제 치료에 대해 반응이 없는 개체의 치료 반응을 갖는 것으로의 특성화오류이다.
구체적 실시양태에 사용될 경우에, 본 발명은 특정한 대상체 하위세트에 대해 확인된 바이오마커가 폴리뉴클레오티드 어레이 상의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 프로브를 구성하는 것인 폴리뉴클레오티드 어레이를 제공한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 마이크로어레이는 다수의 프로브를 포함하며, 여기서 상기 다수의 프로브는 특정한 환자 하위세트에 대해 확인된 WEE1 억제제 노출/예측-정보 바이오마커의 적어도 75%에 상보적이고 그에 혼성가능한 프로브를 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 물론 특정한 상태에 대해 확인된 다수의 대상체 하위세트 또는 각각의 대상체 하위세트에 대한 WEE1 억제제 예측/평가-정보 바이오마커에 상보적이고 그에 혼성화될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 그에 더하여, 본 발명의 마이크로어레이는 관심 대상 상태에 대해 확인된 각각의 대상체 하위세트에 대해 확인된 WEE1 억제제 예측/평가-정보 바이오마커의 적어도 75%에 상보적이고 그에 혼성화되는 다수의 프로브를 포함하며, 여기서 상기 프로브는 총합하여 상기 마이크로어레이 상의 프로브 중 적어도 50%이다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 마이크로어레이는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 적어도 2개의 바이오마커를 포함하는, 상업적으로 입수가능한 cDNA 마이크로어레이이다. 바람직하게는, 상업적으로 입수가능한 cDNA 마이크로어레이는 본원에 기재된 방법에 의해 특정한 상태에 대한 환자 하위세트에 대한 정보를 주는 것으로서 확인된 모든 바이오마커를 포함한다. 그러나, 이러한 마이크로어레이는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 이러한 마커, 확인된 최대 개수 이하의 마커를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 마이크로어레이는 키트 내의 밀봉된 용기에 제공될 수 있다.
C. 예측 바이오마커의 생성물을 측정하기 위해 이용된 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리펩티드 예측 바이오마커, PKMYT1을 코딩하는 mRNA 전사체에 특이적으로 또는 선택적으로 결합될 수 있는 폴리뉴클레오티드가 또한 고려된다. 예를 들어: 본 발명의 예측 바이오마커의 RNA 생성물 중 하나 이상에 특이적으로 및/또는 선택적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드, cDNA, DNA, RNA, PCR 생성물, 합성 DNA, 합성 RNA, 또는 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오티드의 다른 조합이 본 발명에 따라 유용하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 예측 바이오마커의 RNA 생성물 중 하나 이상에 특이적 및 선택적 둘 다의 방식으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드, cDNA, DNA, RNA, PCR 생성물, 합성 DNA, 합성 RNA, 또는 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드의 다른 조합이 사용된다.
본 발명의 실시에서 PKMYT1의 (높은 또는 낮은) 발현 수준을 결정하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에서 확인 및 개시된 유전자에 혼성화된 RNA의 검출에 기초한 발현이 이용된다. 이는 관련 기술분야에서 동등한 것으로 공지되거나 인지되는 임의의 RNA 검출 또는 증폭 방법, 예컨대 비제한적으로 역전사-PCR, 및 RNA 안정화 또는 불안정화 서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법에 의해 용이하게 수행된다.
대안적으로, DNA 상태의 검출에 기초한 발현이 이용될 수 있다. 특정한 결과와 상호관련되어 증가된 발현을 갖는 유전자에 대해, 확인된 유전자의 DNA의 검출이 이용될 수 있다. 이는 관련 기술분야에 공지된 PCR 기반 방법, 예를 들어 비제한적으로 Q-PCR에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 반대로, 증폭된 것으로 확인된 유전자의 DNA의 검출은 특정한 치료 결과와 상호관련되어 증가된 발현을 갖는 유전자에 대해 이용될 수 있다. 이는 관련 기술분야에 공지된 PCR 기반, 형광 계내 혼성화 (FISH) 및 염색체 계내 혼성화 (CISH) 방법에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
D. 바이오마커의 RNA 생성물을 측정하기 위한 기술
1. 실시간 PCR
실제로, 소수의 유전자 즉, 약 1 내지 3000개의 유전자를 기반으로 하는 유전자 발현-기반 발현 검정은 임상 실험실에 친숙한 기존 정량적 실시간 PCR 기술을 이용하여 상대적으로 적은 노력으로 수행될 수 있다. 정량적 실시간 PCR은 이중-표지된 형광 프로브를 통해 PCR 생성물 축적을 측정한다. 다양한 정규화 방법, 예컨대 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁인자, 샘플 내에 함유된 정규화 유전자, 또는 하우스키핑 유전자가 이용될 수 있다. 실시간 PCR에 충분한 RNA는 대상체로부터의 낮은 밀리그램 양으로부터 단리될 수 있다. 정량적 써말 사이클러가 현재 다유전자 발현-기반 검정의 상용적 임상 용도를 현실적 목적으로 만드는 시약이 예비로딩된 마이크로유체 카드와 함께 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 검정되는 본 발명의 예측 바이오마커 또는 그의 하위세트의 유전자 마커는 전형적으로 전체 RNA 또는 mRNA 또는 역전사된 전체 RNA 또는 mRNA의 형태이다. 전체 및 mRNA 추출을 위한 일반적 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 비롯한 분자 생물학의 표준 교과서에 개시되어 있다. RNA 단리는 또한 상업적 제조업체, 예컨대 퀴아젠 (Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아) 및 암비온 (Ambion, 텍사스주 오스틴)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 수행될 수 있다.
택맨(TAQman) 정량적 실시간 PCR은 상업적으로 입수가능한 PCR 시약 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티) 및 장비, 예컨대 ABI 프리즘(Prism) 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 수행될 수 있다. 이 시스템은 써모사이클러, 레이저, 전하-결합 소자 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 써모사이클러에서 96-웰 또는 384-웰 포맷으로 샘플을 증폭시킨다. 증폭 동안, 모든 96개의 웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 레이저-유도된 형광 신호를 실시간으로 수집하고, CCD에서 검출한다. 상기 시스템은 기기를 구동시키고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
본 발명에서 확인된 예측 바이오마커에 기반하여, 유전자 발현을 측정하고 본원에 기재된 분류 방법을 수행하기 위해 실시간 PCR 택맨 검정이 이용될 수 있다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 예측 바이오마커에 상보적이거나 그에 혼성화되는 광범위하게 다양한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 예측 바이오마커 전사체 서열에 기초하여 선택될 수 있다.
2. 어레이 혼성화
본 발명의 RNA 생성물을 측정하는데 사용된 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 한 측면에 따른 어레이를 구성하는 지지체와 안정하게 회합된 핵산 구성원으로서 사용될 수 있다. 핵산 구성원의 길이는 8 내지 1000개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있고, 본 발명의 예측 바이오마커의 RNA 생성물에 특이적이도록 선택된다. 한 실시양태에서, 이들 구성원은 본 발명의 RNA 생성물에 대해 선택적이다. 핵산 구성원은 단일 또는 이중 가닥일 수 있고/거나 cDNA로부터 증폭된 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 단편일 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 대략 20-30개 뉴클레오티드 길이이다. EST는 바람직하게는 100 내지 600개 뉴클레오티드 길이이다. 통상의 기술자는 어레이 상의 프로브로서 본 발명의 예측 바이오마커의 발현된 영역의 부분을 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 유전자에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 및 본 발명의 유전자로부터 유도된 cDNA 또는 EST가 유용하다. 올리고뉴클레오티드 기반 어레이에 대해, 프로브로서 유용한 관심 대상 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 선택은 관련 기술분야에서 널리 이해된다. 보다 구체적으로, 표적 핵산으로의 혼성화를 가능하게 할 영역을 선택하는 것이 중요하다. 올리고뉴클레오티드의 Tm, 퍼센트 GC 함량, 이차 구조의 정도 및 핵산의 길이와 같은 인자가 중요한 인자이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,551,784를 참조한다.
3. 핵산 어레이의 구축
제안된 방법에서, 실질적으로 지지체의 표면과 안정하게 회합된 핵산 구성원의 어레이는 상보적 핵산 구성원/표적 복합체의 혼성화 패턴을 생성하기에 충분한 혼성화 조건 하에 표적 핵산을 포함하는 샘플과 접촉되며, 여기서 어레이 상의 독특한 위치에서의 하나 이상의 상보적 핵산 구성원은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화된다. 혼성화된 표적 핵산의 정체는 어레이 상의 핵산 구성원의 위치를 참조로 결정될 수 있다.
핵산 구성원은 확립된 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 역전사 (RT)를 이용하여 생성될 수 있다. 이들 방법은 관련 기술분야에 현재 공지되어 있는 것들과 유사하다 (예를 들어, 문헌 [PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al., 1995 및 PCR: Introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton, A. Graham,1997] 참조). 증폭된 핵산은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예를 들어, 칼럼 정제 또는 알콜 침전)에 의해 정제된다. 핵산이 프라이머, 및 목적 핵산의 합성 동안 생성된 불완전 생성물을 실질적으로 함유하지 않도록 단리된 경우에, 핵산은 순수한 것으로 간주한다. 바람직하게는, 정제된 핵산은 또한 분자의 특이적 결합 활성을 방해하거나 달리 차폐시킬 수 있는 오염물을 실질적으로 함유하지 않을 것이다.
본 발명의 한 측면에 따른 어레이는 20개 초과의 다양한 핵산/cm2의 밀도로 지지체의 한 표면에 부착된 다수의 핵산을 포함하며, 여기서 각각의 핵산은 동일하지 않은 사전-선택된 영역에서 지지체의 표면 (예를 들어 마이크로어레이)에 부착된다. 어레이 상의 각각의 회합된 샘플은 하기 보다 상세히 기재된 바와 같은, 정체가 공지된, 통상적으로 서열이 공지된 핵산 조성물을 포함한다. 임의의 가능한 기질이 본 발명에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 지지체의 표면에 부착된 핵산은 DNA이다. 한 실시양태에서, 지지체의 표면에 부착된 핵산은 cDNA 또는 RNA이다. 또 다른 실시양태에서, 지지체의 표면에 부착된 핵산은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 합성된 cDNA이다. 통상적으로, 본 발명에 따른 어레이에서의 핵산 구성원은 적어도 10, 25, 50, 60개 뉴클레오티드 길이이다. 한 실시양태에서, 핵산 구성원은 적어도 150개 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 핵산 구성원은 1000개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 보다 바람직하게는, 핵산 구성원은 500개 미만의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 어레이에서, 핵산 조성물은 지지체의 표면과 안정하게 회합되며, 여기서 지지체는 가요성 또는 경질 지지체일 수 있다. "안정하게 회합된"은 각각의 핵산 구성원이 혼성화 및 세척 조건 하에 지지체에 대하여 독특한 위치를 유지한다는 것을 의미한다. 이와 같이, 샘플은 지지체 표면과 비-공유적으로 또는 공유적으로 안정하게 회합된다. 비-공유 회합의 예는 비-특이적 흡착, 정전기 상호작용 (예를 들어, 이온 쌍 상호작용), 소수성 상호작용, 수소 결합 상호작용에 기초한 결합, 지지체 표면에 공유적으로 부착된 특이적 결합 쌍 구성원을 통한 특이적 결합 등을 포함한다. 공유 결합의 예는 핵산과, 경질 지지체의 표면 상에 존재하는 관능기 (예를 들어, --OH) 사이에 형성된 공유 결합을 포함하며, 여기서 관능기는 자연 발생할 수 있거나 하기 보다 상세히 기재된 바와 같은 도입 연결기의 구성원으로서 존재할 수 있다.
각각의 조성물에 존재하는 핵산의 양은 어레이가 이용된 검정 동안 표적 핵산 서열의 적당한 혼성화 및 검출을 제공하기에 충분할 것이다. 일반적으로, 어레이의 지지체와 안정하게 회합된 각각의 핵산 구성원의 양은 적어도 약 0.001 ng, 바람직하게는 적어도 약 0.02 ng, 보다 바람직하게는 적어도 약 0.05 ng이며, 여기서 상기 양은 1000 ng 이상만큼 높을 수 있지만, 통상적으로 약 20 ng을 초과하지 않을 것이다. 핵산 구성원이 전체 원형 치수를 채우는 스폿으로 지지체 상에 "스폿팅"된 경우에, "스폿"의 직경은 일반적으로 약 10 내지 5,000 μm, 통상적으로 약 20 내지 2,000 μm, 보다 통상적으로 약 100 내지 200 μm 범위일 것이다
대조 핵산 구성원이 어레이 상에 존재할 수 있으며, 이는 게놈 DNA, 하우스키핑 유전자, 벡터 서열, 식물 핵산 서열, 음성 및 양성 대조 유전자 등에 상응하는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 포함하는 핵산 구성원을 포함한다. 대조 핵산 구성원은 관심 대상의 특정한 "핵심" 유전자의 발현 여부는 알려주지 않지만 발현의 배경 또는 기저 수준과 같은 다른 유용한 정보를 제공하는 기능을 갖는 보정 또는 대조 유전자이다.
다른 대조 핵산을 어레이 상에 스폿팅하여, 프로브가 지정된 표적 이외의 샘플 내의 핵산에 대한 비-특이적 결합 또는 교차-혼성화를 모니터링하기 위한 표적 발현 대조 핵산 및 미스매치 대조 뉴클레오티드로서 사용한다. 따라서 미스매치 프로브는 혼성화가 특이적인지 아닌지를 나타낸다. 예를 들어, 표적이 존재하는 경우에, 완벽하게 매치된 프로브는 미스매치된 프로브보다 일관되게 밝아야 한다. 추가로, 모든 대조 미스매치가 존재하는 경우에, 미스매치 프로브는 돌연변이를 검출하는데 사용된다.
다수의 방법이 기질에 대한 본 발명의 핵산 구성원의 부착 ("스폿팅"으로 지칭되는 과정)을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 예를 들어 미국 특허 번호 5,807,522의 기술을 이용하여 부착되며, 상기 특허는 중합체 부착의 방법의 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 스폿팅은 관련 기술분야에 공지된 접촉 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 RNA 생성물 발현의 측정은 RNA 생성물의 발현을 정량화하기 위해 본 발명의 RNA 생성물에 대해 특이적이고/거나 선택적인 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적 실시양태에서, RNA 생성물에 대해 특이적이고/거나 선택적인 폴리뉴클레오티드는 프로브 또는 프라이머이다. 한 실시양태에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 측정되는 개체의 샘플로부터 RNA를 측정하기 위해 어레이 상에 스폿팅될 수 있는 핵산 프로브의 형태이다. 또 다른 실시양태에서, RNA 생성물의 발현을 측정하는데 상업적 어레이가 이용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 RNA 생성물에 대해 특이적이고/거나 선택적인 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 SYBR®그린을 이용하거나 택맨® 또는 분자 비콘(Molecular Beacon) 기술을 이용하는 정량적 실시간 RT PCR과 같은 기술에서 프로브 및 프라이머 형태로 사용되며, 여기서 사용된 폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 택맨 표지된 프로브 또는 분자 비콘 표지된 프로브의 형태로 사용된다.
단 1개 또는 2개의 유전자가 분석되는 실시양태에서, 샘플 세포(들)로부터 유도된 핵산은, 유방 세포에서 발현되는 다른 유전자로부터의 배경 신호를 감소시키기 위해 분석되는 유전자만이 증폭되도록, 적절한 프라이머를 사용하여 우선적으로 증폭될 수 있다. 대안적으로, 다수의 유전자가 분석되거나 또는 극소수의 세포 (또는 하나의 세포)가 이용되는 경우에, 샘플로부터의 핵산은 고정화 폴리뉴클레오티드에 혼성화되기 전에 전반적으로 증폭될 수 있다. 물론 RNA 또는 그의 cDNA 대응부는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 증폭 없이 직접적으로 표지되고 사용될 수 있다.
4. 마이크로어레이의 이용
"마이크로어레이"는 고체 지지체, 예컨대 비제한적으로 유리, 플라스틱 또는 합성 막의 표면 상에 형성된, 각각 규정된 면적을 갖는, 바람직하게는 개별 영역의 선형 또는 2-차원 어레이이다. 마이크로어레이 상의 개별 영역의 밀도는 단일 고체 상 지지체의 표면에서 검출되는 고정화 폴리뉴클레오티드의 총 개수에 의해 결정되며, 바람직하게는 적어도 약 50/cm2, 보다 바람직하게는 적어도 약 100/cm2, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 500/cm2, 바람직하게는 약 1,000/cm2 미만이다. 바람직하게는, 어레이는 총합하여 약 500, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 또는 약 3000개 미만의 고정화 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, DNA 마이크로어레이는 샘플로부터 증폭 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는데 사용된, 칩 또는 다른 표면 상에 위치된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 어레이이다. 어레이에서의 프라이머의 각각의 특정한 기의 위치가 공지되어 있기 때문에, 샘플 폴리뉴클레오티드의 정체는 마이크로어레이에서의 특정한 위치에 대한 그의 결합을 기초로 하여 결정될 수 있다.
유전자 발현 수준의 결정은 마이크로어레이를 이용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 하기 단계가 포함될 수 있다: (a) 대상체로부터 mRNA 샘플을 채취하고 그로부터의 표지된 핵산 ("표적 핵산" 또는 "표적")을 제조하고; (b) 표적 핵산이 어레이 상의 상응하는 프로브에, 예를 들어 혼성화 또는 특이적 결합에 의해 결합하기에 충분한 조건 하에 표적 핵산을 어레이와 접촉시키고; (c) 어레이로부터 비결합 표적을 임의로 제거하고; (d) 결합 표적을 검출하고; (e) 예를 들어 컴퓨터 기반 분석 방법을 이용하여 결과를 분석한다. 본원에 사용된 바와 같이, "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 어레이에 부착된 핵산인 반면, "표적 핵산"은 어레이에 혼성화된 핵산이다.
핵산 시편은 "침습" 또는 "비-침습" 샘플링 수단을 이용하여 시험될 대상체로부터 수득될 수 있다. 샘플링 수단이 동물 (뮤린, 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개 또는 고양이 동물 포함)의 피부 또는 기관 내부으로부터 핵산의 수집을 포함하는 경우에 이는 "침습"으로 칭해진다. 침습 샘플링 수단의 예는 혈액 수집, 정액 수집, 바늘 생검, 흉막 흡인, 제대 생검을 포함한다. 이러한 방법의 예는 문헌 [Kim, et al., J. Virol., 1992, 66:3879-3882, Biswas, et al., Ann. NY Acad. Sci., 1990, 590:582-583, 및 Biswas, et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2228-2233]에 논의되어 있다.
대조적으로, "비-침습" 샘플링 수단은 핵산 분자를 동물의 내부 또는 외부 표면으로부터 회수하는 것이다. "비-침습" 샘플링 수단의 예는 "면봉채취", 눈물, 타액, 소변, 대변 물질 등의 수집을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 시험되는 대상체로부터 하나 이상 세포, 즉 샘플이 채취되고, RNA가 세포로부터 단리된다. 대상체로부터 세포 샘플을 채취하고, 이어서 목적 세포 유형에 대해 샘플을 풍부화하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 목적 세포 유형의 세포 표면 상의 에피토프에 결합하는 항체를 사용한 단리 등의 다양한 기술을 이용하여 다른 세포로부터 단리될 수 있다. 목적 세포가 고형 조직에 있는 경우에, 특정한 세포는, 예를 들어 미세-절제에 의해 또는 레이저 포획 미세-절제 (LCM)에 의해 절제될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bonner, et al., Science, 1997, 278:1481, Emmert-Buck, et al., Science, 1996, 274:998, Fend, et al., Am. J. Path., 1999, 154:61, 및 Murakami, et al., Kidney Hit., 2000, 58:1346] 참조).
RNA는 다양한 방법, 예를 들어 구아니듐 티오시아네이트 용해에 이어서 CsCl 원심분리에 의해 조직 또는 세포 샘플로부터 추출될 수 있다 (Chirgwin, et al., Biochemistry, 1979, 18:5294-5299). 단세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법에 기재된 바와 같이, 단세포로부터 RNA를 수득할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dulac, Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 36:245, 및 Jena, et al., J. Immunol. Methods, 1996, 190:199] 참조).
RNA 샘플은 특정 종에 대해 추가로 풍부화될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 폴리(A)+RNA가 RNA 샘플로부터 단리될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RNA 집단은 프라이머-특이적 cDNA 합성, 또는 cDNA 합성 및 주형-지정 시험관내 전사에 기초한 다중 라운드의 선형 증폭에 의해 관심 대상 서열에 대해 풍부화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:9717]; 상기 문헌 [Dulac, et al.]; 상기 문헌 [Jena, et al.] 참조). 추가로, 특정한 종 또는 서열에서 풍부화되거나 풍부화되지 않은 RNA의 집단은 다양한 증폭 방법, 예를 들어 PCR, 리가제 연쇄 반응 (LCR) (예를 들어, 문헌 [Wu and Wallace, Genomics, 1989, 4:560; Landegren, et al., Science, 1988, 241:1077] 참조), 자가-유지 서열 복제 (SSR) (예를 들어, 문헌 [Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:1874] 참조), 핵산 기반 서열 증폭 (NASBA) 및 전사 증폭 (예를 들어, 문헌 [Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:1173] 참조)에 의해 추가로 증폭될 수 있다. PCR 기술에 대한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila, et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19:4967; Eckert, et al., PCR Methods and Applications, 1991, 1:17; PCR, eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford]; 및 미국 특허 번호 4,683,202 참조). 증폭 방법은, 예를 들어 문헌 [Ohyama, et al., BioTechniques, 2000, 29:530; Luo, et al., Nat. Med., 1999, 5:117; Hegde, et al., BioTechniques, 2000, 29:548; Kacharmina, et al., Meth. Enzymol., 1999, 303:3; Livesey, et al., Curr. Biol., 2000, 10:301; Spirin, et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 1999, 40:3108; 및 Sakai, et al., Anal. Biochem., 2000, 287:32]에 기재되어 있다. RNA 증폭 및 cDNA 합성은 또한 세포에서 계내 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Eberwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:3010] 참조).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 개시된 마커 서열의 전부 또는 일부가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 그의 변형, 예컨대 비제한적으로 정량적 PCR (Q-PCR), 역전사 PCR (RT- PCR) 및 실시간 PCR, 임의로 실시간 RT-PCR과 같은 방법에 의해 증폭 및 검출될 수 있다. 이러한 방법은 개시된 서열의 일부에 상보적인 1 또는 2개의 프라이머를 이용할 것이며, 여기서 프라이머는 핵산 합성을 프라이밍하는데 사용된다.
새롭게 합성된 핵산은 임의로 표지되고, 직접적으로 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로의 혼성화에 의해 검출될 수 있다.
핵산 분자는 마이크로어레이로의 핵산 분자의 혼성화의 검출이 가능하도록 표지될 수 있다. 즉, 프로브는 신호 생성 시스템의 구성원을 포함할 수 있고, 따라서 직접적으로 또는 신호 생성 시스템의 하나 이상의 추가적 구성원과의 조합 작용을 통해 검출가능하다. 예를 들어, 핵산은 형광 표지된 dNTP (예를 들어, 문헌 [Kricka, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif., 1992] 참조), 비오티닐화 dNTP 또는 rNTP로 표지될 수 있고, 이어서 표지된 스트렙타비딘, 화학발광 표지 또는 동위원소가 첨가될 수 있다. 표지의 또 다른 예는 문헌 [Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 1996, 14:303]에 기재된 바와 같은 "분자 비콘"을 포함한다. 새롭게 합성된 핵산은 그의 혼성화가 허용되는 조건 하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (서열 함유)와 접촉될 수 있다. 혼성화는 또한, 예를 들어 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thiel, et al., Anal. Chem., 1997, 69:4948] 참조).
한 실시양태에서, 다수의, 예를 들어 두 세트의 표적 핵산이 표지되고 하나의 혼성화 반응에 사용된다 ("멀티플렉스" 분석). 한 세트의 핵산은 하나의 세포로부터의 RNA에 상응할 수 있고, 또 다른 세트의 핵산은 또 다른 세포로부터의 RNA에 상응할 수 있다. 다수의 세트의 핵산은 이들이 구별될 수 있도록 별개의 방출 스펙트럼을 갖는 상이한 표지, 예컨대 상이한 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인 및 로다민)로 표지될 수 있다. 이어서, 상기 세트는 혼합되고 하나의 마이크로어레이에 동시에 혼성화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shena, et al., Science, 1995, 270:467-470] 참조).
다수의 상이한 마이크로어레이 배위 및 그의 생성 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412, 087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5,700,637; 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674; 및 6,156,501; 문헌 [Shena, et al., Tibtech 16:301, 1998; Duggan, et al., Nat. Genet. 21:10, 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25, 1999; Lipshutz, et al., 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et al., 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et al., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat. Biotechol. (2001) 19:342]에 개시되어 있으며; 이들 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 다양한 적용에서의 어레이의 이용 방법을 기재하는 특허는 미국 특허 번호 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; 및 5,874,219를 포함하며; 이들 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 어레이는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 예시적인 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 중합체, 금속, 준금속, 세라믹, 유기물 등을 포함한다. 칩 마스킹 기술 및 광보호 화학을 이용하여, 핵산 프로브의 정렬된 어레이를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어 "DNA 칩" 또는 초대규모 고정화 중합체 어레이 ("VLSIPS®" 어레이)로 공지되어 있는 어레이는 약 1 cm2 내지 수 cm2의 면적을 갖는 기판 상에 수백만개의 규정된 프로브 영역을 포함할 수 있으며, 이로써 몇몇 내지 수백만개의 프로브를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,631,734 참조).
발현 수준을 비교하기 위해, 표지된 핵산은 표적 핵산과 어레이 상의 프로브 사이의 결합에 충분한 조건 하에 어레이와 접촉될 수 있다. 한 실시양태에서, 혼성화 조건, 즉 표지된 핵산과 마이크로어레이 상의 프로브 사이에서 혼성화가 발생하기에 충분한 조건은 혼성화 특이성의 바람직한 수준을 제공하도록 선택될 수 있다.
혼성화는 본질적으로 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 수행될 수 있다. 핵산의 길이 및 GC 함량은 열 융점을 결정할 것이며, 따라서, 표적 핵산으로의 프로브의 특이적 혼성화를 얻기 위해 필요한 혼성화 조건을 결정할 것이다. 이들 인자는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 또한 검정에서 시험될 수 있다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993]에서 찾아볼 수 있다.
상기 기재된 방법은 어레이 표면 상에 표지된 표적 핵산의 혼성화 패턴의 생성을 일으킬 것이다. 표지된 핵산의 생성된 혼성화 패턴은 다양한 방식으로 시각화 또는 검출될 수 있으며, 특정한 검출 방식은 표적 핵산의 특정한 표지에 기반하여 선택된다. 대표적인 검출 수단은 섬광 계수, 자가방사법, 형광 측정, 열량 측정, 발광 측정, 광 산란 등을 포함한다.
한가지 이러한 검출 방법은 상업적으로 입수가능한 어레이 스캐너 (아피메트릭스(Affymetrix), 캘리포니아주 산타 클라라), 예를 들어 417® 어레이어(Arrayer), 418® 어레이 스캐너, 또는 애질런트 진어레이(Agilent GeneArray)® 스캐너를 이용한다. 이 스캐너는 인터페이스 및 사용이 용이한 소프트웨어 도구가 장착된 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 출력은 다양한 소프트웨어 어플리케이션으로 직접 입력되거나 또는 그에 의해 직접 판독될 수 있다. 예시적인 스캐닝 장치는 예를 들어 미국 특허 번호 5,143,854 및 5,424,186에 기재되어 있다.
투여 및 투여 경로
본 발명의 WEE1 억제제와 관련하여, 다양한 제제 형태가 선택될 수 있으며, 그의 예는 경구 제제, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립 또는 액체, 또는 멸균 액체 비경구 제제, 예컨대 용액 또는 현탁액, 좌제, 연고 등을 포함한다. WEE1 억제제는 제약상 허용되는 염으로서 이용가능하다. 본 발명의 WEE1 억제제는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제조된다.
본 설명에서 언급되는 용어 "제약상 허용되는 염"은 통상의 제약상 허용되는 염을 의미한다. 예를 들어, 화합물이 히드록실 기, 또는 산성 기, 예컨대 카르복실 기 및 테트라졸릴 기를 갖는 경우에, 이는 히드록실 기 또는 산성 기에서 염기-부가염을 형성할 수 있거나; 또는 화합물이 아미노 기 또는 염기성 헤테로시클릭 기를 갖는 경우에, 이는 아미노 기 또는 염기성 헤테로시클릭 기에서 산-부가염을 형성할 수 있다.
염기-부가염은 예를 들어 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염; 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염; 암모늄 염; 및 유기 아민 염, 예컨대 트리메틸아민 염, 트리에틸아민 염, 디시클로헥실아민 염, 에탄올아민 염, 디에탄올아민 염, 트리에탄올아민 염, 프로카인 염, N,N'-디벤질에틸렌디아민 염을 포함한다.
산-부가염은 예를 들어 무기 산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 퍼클로레이트; 유기 산 염, 예컨대 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 시트레이트, 아스코르베이트, 트리플루오로아세테이트; 및 술포네이트, 예컨대 메탄술포네이트, 이세티오네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트를 포함한다.
용어 "제약상 허용되는 담체 또는 희석제"는 부형제 (예를 들어, 지방, 밀납, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 또는 수소화 오일 등); 물 (예를 들어, 증류수, 특히 주사용 증류수 등), 생리 염수, 알콜 (예를 들어, 에탄올), 글리세롤, 폴리올, 글루코스 수용액, 만니톨, 식물성 오일 등, 및 첨가제 (예를 들어, 증량제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 분산제, 보존제, 감미제, 착색제, 시즈닝제 또는 방향화제, 농도조절제, 희석제, 완충 물질, 용매 또는 가용화제, 보관 효과를 얻기 위한 화학물질, 삼투압을 개질시키기 위한 염, 코팅제 또는 항산화제 등)를 지칭한다.
고체 제제는 임의의 첨가제 없이 또는 적절한 담체 (첨가제)를 사용하여 정제, 캡슐, 과립 및 분말의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 담체 (첨가제)의 예는 사카라이드, 예컨대 락토스 또는 글루코스; 옥수수, 밀 또는 벼의 전분; 지방산, 예컨대 스테아르산; 무기 염, 예컨대 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트 또는 무수 인산칼슘; 합성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리알킬렌 글리콜; 알콜, 예컨대 스테아릴 알콜 또는 벤질 알콜; 합성 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스; 및 다른 통상적으로 사용되는 첨가제, 예컨대 젤라틴, 활석, 식물 오일 및 아라비아 검을 포함할 수 있다.
이들 고체 제제, 예컨대 정제, 캡슐, 과립 및 분말은 일반적으로, 예를 들어 각각의 제제의 총 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 100 중량%, 바람직하게는 5 내지 98 중량%의 WEE1 억제제를 함유할 수 있다.
액체 제제는 액체 제제에 통상적으로 사용되는 적절한 첨가제, 예컨대 물, 알콜 또는 식물-유래 오일, 예컨대 대두 오일, 땅콩 오일 및 참깨 오일을 사용하여 현탁액, 시럽, 주사제 및 점적 주입제 (정맥내 유체)의 형태로 제조된다.
특히, 제제를 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 피하 주사의 형태로 비경구 투여하는 경우, 적절한 용매 또는 희석제는 주사용 증류수, 리도카인 히드로클로라이드 수용액 (근육내 주사용), 생리 염수, 글루코스 수용액, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 정맥내 주사액 (예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨 등의 수용액) 또는 전해질 용액 (정맥내 점적 주입 및 정맥내 주사용), 또는 그의 혼합된 용액으로 예시될 수 있다.
이러한 주사제는 미리 용해된 용액의 형태, 또는 사용 시점에 용해되는 분말 자체 또는 적합한 담체 (첨가제)와 회합된 분말의 형태일 수 있다. 주사액은 예를 들어 각각의 제제의 총 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 10 중량%의 활성 성분을 함유할 수 있다.
액체 제제, 예컨대 경구 투여용 현탁제 또는 시럽은, 예를 들어 제제의 총 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 10 중량%의 활성 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 각각의 제제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 종래의 방법 또는 통상의 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 제제가 경구 제제인 경우, 제제화는 예를 들어 적절한 양의 본 발명의 화합물을 적절한 양의 락토스와 혼합하고 상기 혼합물을 경구 투여에 적합한 경질 젤라틴 캡슐 내로 충전함으로써 수행될 수 있다. 다른 한편으로는, 본 발명의 화합물을 함유하는 제제가 주사제인 경우, 제제화는 예를 들어 적절한 양의 본 발명의 화합물을 적절한 양의 0.9% 생리 염수와 혼합하고 상기 혼합물을 주사용 바이알 내에 충전함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 화합물은 표준 제약 관행에 따라, 인간을 비롯한 포유동물에게 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 조합되어, 제약 조성물로 투여될 수 있다. 화합물은 경구로, 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여 경로를 비롯하여 비경구로 투여될 수 있다.
적합한 투여량은 진료의에게 공지되어 있고, 물론 특정한 질환 상태, 투여될 조성물의 특이적 활성 및 치료를 받고 있는 특정한 환자에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에서, 목적 치료량을 달성하기 위해, 반복 투여, 즉 특정한 모니터링 또는 계량 용량의 반복 개별 투여를 제공하는 것이 필요할 수 있고, 개별 투여는 목적 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다. 적합한 투여량에 대한 추가의 정보는 하기에 제공된다.
본 발명의 화합물과 관련하여 용어 "투여" 및 그의 변형 (예를 들어, 화합물을 "투여하는")은 성분 또는 성분의 전구약물을 치료를 필요로 하는 동물의 계통 내로 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 성분 또는 그의 전구약물이 하나 이상의 다른 활성제 (예를 들어, WEE1 억제제)와 조합되어 제공되는 경우에, "투여" 및 그의 변형은 각각 성분 또는 그의 전구약물 및 다른 작용제의 공동 또는 순차적 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생성물, 뿐만 아니라 구체적 양의 구체적 성분의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성된 임의의 생성물을 포괄하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 구해지는, 조직, 계통, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는 활성 화합물 또는 제약 작용제의 양을 의미한다. 이는 다중 치료제, 예컨대 제1 및 제2 치료의 조합된 양 (여기서, 조합된 양은 목적 생물학적 반응을 달성할 것임)의 사용을 포함하는 조합 요법을 포함한다. 목적 생물학적 반응은 포유동물, 예를 들어 인간에서의 암 전이를 비롯한 암의 진행의 부분 또는 전체 억제, 지연 또는 예방; 암 전이를 비롯한 암의 재발의 억제, 지연 또는 예방; 또는 암의 발병 또는 발생의 예방 (화학예방)이다.
적합한 양의 WEE1 억제제가 암의 치료를 받고 있는 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 하루에 약 100 mg 내지 하루에 250 mg 범위의 용량으로 투여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 총 5회 용량의 경우에 2.5일에 걸쳐 1일 2회 (BID) 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, WEE1 억제제는 총 2회 용량의 경우에 2일에 걸쳐 1일 1회 (QD) 투여된다.
본 발명의 한 실시양태에서, WEE1 억제제는 주 5회 투여될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, WEE1 억제제는 주 2회 투여될 수 있다.
적응증
한 실시양태에서, 본 발명은 WEE1 연관 암으로 진단된 환자를 WEE1 억제제를 사용하여 치료하는 방법이며, 여기서 상기 환자는 PKMYT1의 낮은 발현을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 WEE1 억제제는 키나제-억제 효과, 특히 WEE1 키나제-억제 효과를 가지며, 따라서 이는 그 자체로 WEE1 키나제와 연관된 다양한 암에 대한 요법으로서 유용하다. WEE1 키나제 연관 암의 예는 뇌암, 뇌경부암, 식도암, 갑상선암, 소세포 암, 비소세포 암, 유방암, 폐암, 위암, 담낭/담관암, 간암, 췌장암, 결장암, 직장암, 난소암, 융모막암종, 자궁체암, 자궁경부암, 신우/요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환암, 태아암, 윌름스 암, 피부암, 악성 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 유잉 종양, 연부 육종, 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 호지킨 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특히, 본 발명의 WEE1 억제제는 요법으로서, 예를 들어 유방암, 폐암, 췌장암, 결장암, 난소암, 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 호지킨 림프종을 위한 요법으로서, 또는 상기 암의 화학요법 또는 방사선 요법을 위한 증감제로서 유용하다.
상기 WEE1 키나제 연관 암의 치료 이외에도, WEE1 억제제는 또한 하기 암: 심장: 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성 암종 (편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암종), 폐포 (세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골성 과오종, 중피종; 위장: 식도 (편평 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위 (암종, 림프종, 평활근육종), 췌장 (관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, VIP종), 소장 (선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암종, 세관성 선종, 융모성 선종, 과오종, 평활근종), 결장, 결장직장, 직장; 비뇨생식관: 신장 (선암종, 윌름스 종양 [신모세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도 (편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아성 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선양 종양, 지방종); 간: 간세포암 (간세포성 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골: 골원성 육종 (골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 림프종 (세망 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 골연골종 (골연골성 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종 및 거대 세포 종양; 신경계: 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배세포종 [송과체종], 다형성 교모세포종, 핍지교종, 슈반세포종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁 (자궁내막 암종), 자궁경부 (자궁경부 암종, 전-종양 자궁경부 이형성증), 난소 (난소 암종 [장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종], 과립-난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양, 미분화배세포종, 악성 기형종), 외음부 (편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상 육종 (배아성 횡문근육종), 난관 (암종); 혈액: 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성], 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비-호지킨 림프종 [악성 림프종]; 및 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 용어 "암성 세포"는 상기-확인된 상태 중 임의의 것을 앓는 세포를 포함한다.
또한, 혈관신생이 관련되는 질환의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 본 발명의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 또는 예방 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 안구 신생혈관 질환은 생성된 조직 손상 중 다량이 눈의 혈관의 비정상적 침윤으로 인한 것일 수 있는 상태의 예이다 (WO 2000/30651). 바람직하지 않은 침윤은 허혈성 망막병증, 예컨대 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 망막 정맥 폐쇄 등으로부터 발생하는 것, 또는 퇴행성 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성에서 관찰되는 맥락막 신생혈관화에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 투여에 의해 혈관의 성장을 억제하는 것은 혈관의 침윤을 예방하고, 혈관신생이 관련되는 질환, 예컨대 안구 질환, 예를 들어 망막 혈관화, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성 등을 예방 또는 치료할 것이다.
또한, 혈관신생이 관련되는 비-악성 질환, 예를 들어 비제한적으로 안구 질환 (예컨대, 망막 혈관화, 당뇨병성 망막병증 및 연령-관련 황반 변성), 아테롬성동맥경화증, 관절염, 건선, 비만 및 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다 (Dredge, et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2002, 2(8):953-966). 또 다른 실시양태에서, 혈관신생이 관련되는 질환의 치료 또는 예방 방법은 안구 질환 (예컨대, 망막 혈관화, 당뇨병성 망막병증 및 연령-관련 황반 변성), 아테롬성동맥경화증, 관절염 및 건선을 포함한다.
또한, 과다증식성 장애, 예컨대, 재협착, 염증, 자가면역 질환 및 알레르기/천식의 치료 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 스텐트를 코팅하기 위한 본 발명의 조합물의 용도 및 이에 따른 재협착의 치료 및/또는 예방을 위한 코팅된 스텐트 상에서의 본 발명의 화합물의 용도 (WO 2003/032809)가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 골관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 조합물의 용도 (WO 2003/035048)가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 저인슐린증의 치료 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명을 예시하는 것은 WEE1 연관된 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 상기 기재된 WEE1 억제제의 용도이다.
추가의 항암제
본 발명의 방법으로 투여된 WEE1 억제제는 또한 추가의 치료제, 화학요법제 및 항암제와 조합되어 유용하다. 또한, 본 발명의 WEE1 억제제와 치료제, 화학요법제 및 항암제의 조합물이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 작용제의 예는 문헌 [Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 찾아볼 수 있다. 통상의 기술자는 어떤 작용제의 조합이 약물 및 관련된 암의 특정한 특성에 기반하여 유용할 것인지를 식별할 수 있을 것이다. 이러한 작용제는 다음을 포함한다: 에스트로겐 수용체 조절제, 안드로겐 수용체 조절제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성제/세포증식억제제, 항증식제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제 및 다른 혈관신생 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 역전사효소 억제제, 세포 증식 및 생존 신호전달의 억제제, 비스포스포네이트, 아로마타제 억제제, siRNA 치료제, γ-세크레타제 억제제, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제 및 세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제. 본 발명의 mTOR 억제제 및 αvβ3 인테그린 길항제 조합물은 방사선 요법과 공동-투여될 경우에 특히 유용할 수 있다.
"에스트로겐 수용체 조절제"는 메카니즘에 상관없이, 에스트로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 에스트로겐 수용체 조절제의 예는 타목시펜, 랄록시펜, 이독시펜, LY353381, LY117081, 토레미펜, 풀베스트란트, 4-[7-(2,2-디메틸-1-옥소프로폭시-4-메틸-2-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-2H-1-벤조피란-3-일]-페닐-2,2-디메틸프로파노에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논-2,4-디니트로페닐-히드라존 및 SH646을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"안드로겐 수용체 조절제"는 메카니즘에 상관없이, 안드로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 안드로겐 수용체 조절제의 예는 피나스테리드 및 다른 5α-리덕타제 억제제, 닐루타미드, 플루타미드, 비칼루타미드, 리아로졸 및 아비라테론 아세테이트를 포함한다.
"레티노이드 수용체 조절제"는 메카니즘에 상관없이, 레티노이드가 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 레티노이드 수용체 조절제의 예는 벡사로텐, 트레티노인, 13-시스-레티노산, 9-시스-레티노산, α-디플루오로메틸오르니틴, ILX23-7553, 트랜스-N-(4'-히드록시페닐) 레틴아미드 및 N-4-카르복시페닐 레틴아미드를 포함한다.
"세포독성제/세포증식억제제"는 세포 사멸을 초래하거나, 또는 주로 세포의 기능을 직접적으로 방해하여 세포 증식을 억제하거나, 또는 세포 유사분열을 억제하거나 또는 방해하는 화합물, 예컨대 알킬화제, 종양 괴사 인자, 인터칼레이터, 저산소상태 활성화가능한 화합물, 미세관 억제제/미세관-안정화제, 유사분열 키네신의 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 유사분열 진행에 관련된 키나제의 억제제, 성장 인자 및 시토카인 신호 전달 경로에 관련된 키나제의 억제제, 항대사물, 생물학적 반응 조절제, 호르몬/항호르몬 치료제, 조혈 성장 인자, 모노클로날 항체 표적화된 치료제, 토포이소머라제 억제제, 프로테오솜 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 및 오로라 키나제 억제제를 지칭한다.
세포독성제/세포증식억제제의 예는 세르테네프, 카켁틴, 이포스파미드, 타소네르민, 로니다민, 카르보플라틴, 알트레타민, 프레드니무스틴, 디브로모둘시톨, 라니무스틴, 포테무스틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 테모졸로미드, 헵타플라틴, 에스트라무스틴, 임프로술판 토실레이트, 트로포스파미드, 니무스틴, 디브로스피듐 클로라이드, 푸미테파, 로바플라틴, 사트라플라틴, 프로피로마이신, 시스플라틴, 이로풀벤, 덱스이포스파미드, 시스-아민디클로로(2-메틸-피리딘)백금, 벤질구아닌, 글루포스파미드, GPX100, (트랜스, 트랜스, 트랜스)-비스-뮤-(헥산-1,6-디아민)-뮤-[디아민-백금(II)]비스[디아민(클로로)백금 (II)]테트라클로라이드, 디아리지디닐스페르민, 삼산화비소, 1-(11-도데실아미노-10-히드록시운데실)-3,7-디메틸크산틴, 조루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 비산트렌, 미톡산트론, 피라루비신, 피나피드, 발루비신, 암루비신, 안티네오플라스톤, 3'-데아미노-3'-모르폴리노-13-데옥소-10-히드록시카르미노마이신, 안나마이신, 갈라루비신, 엘리나피드, MEN10755, 4-데메톡시-3-데아미노-3-아지리디닐-4-메틸술포닐-다우노루비신 (WO 00/50032 참조), Raf 키나제 억제제 (예컨대 Bay43-9006) 및 mTOR 억제제, 예컨대 리다포롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 시롤리무스 또는 라파마이신-유사체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
저산소상태 활성화된 화합물의 예는 티라파자민이다.
프로테오솜 억제제의 예는 락타시스틴 및 MLN-341 (벨케이드)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
미세관 억제제/미세관-안정화제의 예는 파클리탁셀, 빈데신 술페이트, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈카류코블라스틴, 도세탁솔, 리족신, 돌라스타틴, 미보불린 이세티오네이트, 아우리스타틴, 세마도틴, RPR109881, BMS184476, 빈플루닌, 크립토피신, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐) 벤젠 술폰아미드, 안히드로빈블라스틴, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-L-프롤린-t-부틸아미드, TDX258, 에포틸론 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,284,781 및 6,288,237 참조) 및 BMS188797을 포함한다. 한 실시양태에서 에포틸론은 미세관 억제제/미세관-안정화제에 포함되지 않는다.
토포이소머라제 억제제의 일부 예는 토포테칸, 하이캅타민, 이리노테칸, 루비테칸, 6-에톡시프로피오닐-3',4'-O-엑소-벤질리덴-카르트레우신, 9-메톡시-N,N-디메틸-5-니트로피라졸로[3,4,5-kl]아크리딘-2-(6H) 프로판아민, 1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':b,7]-인돌리지노[1,2b]퀴놀린-10,13(9H,15H)디온, 루르토테칸, 7-[2-(N-이소프로필아미노)에틸]-(20S)캄프토테신, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 소부족산, 2'-디메틸아미노-2'-데옥시-에토포시드, GL331, N-[2-(디메틸아미노)에틸]-9-히드록시-5,6-디메틸-6H-피리도[4,3-b]카르바졸-1-카르복스아미드, 아술라크린, (5a, 5aB, 8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸아미노]에틸]-5-[4-히드로옥시-3,5-디메톡시페닐]-5,5a,6,8,8a,9-헥사히드로푸로(3',4':6,7)나프토(2,3-d)-1,3-디옥솔-6-온, 2,3-(메틸렌디옥시)-5-메틸-7-히드록시-8-메톡시벤조[c]-페난트리디늄, 6,9-비스[(2-아미노에틸)아미노]벤조[g]이소퀴놀린-5,10-디온, 5-(3-아미노프로필아미노)-7,10-디히드록시-2-(2-히드록시에틸아미노메틸)-6H-피라졸로[4,5,1-de]아크리딘-6-온, N-[1-[2(디에틸아미노)에틸아미노]-7-메톡시-9-옥소-9H-티오크산텐-4-일메틸]포름아미드, N-(2-(디메틸아미노)에틸)아크리딘-4-카르복스아미드, 6-[[2-(디메틸아미노)에틸]아미노]-3-히드록시-7H-인데노[2,1-c] 퀴놀린-7-온 및 디메스나이다.
유사분열 키네신, 특히 인간 유사분열 키네신 KSP의 억제제의 예는 공개 WO 2003/039460, WO 2003/050064, WO 2003/050122, WO 2003/049527, WO 2003/049679, WO 2003/049678, WO 2004/039774, WO 2003/079973, WO 2003/099211, WO 2003/105855, WO 2003/106417, WO 2004/037171, WO 2004/058148, WO 2004/058700, WO 2004/126699, WO 2005/018638, WO 2005/019206, WO 2005/019205, WO 2005/018547, WO 2005/017190, US 2005/0176776에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 유사분열 키네신의 억제제는 KSP의 억제제, MKLP1의 억제제, CENP-E의 억제제, MCAK의 억제제 및 Rab6-KIFL의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"히스톤 데아세틸라제 억제제"의 예는 SAHA, TSA, 옥삼플라틴, PXD101, MG98 및 스크립타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 히스톤 데아세틸라제 억제제에 대한 추가의 참조는 하기 문헌 [Miller, T.A., et al., J. Med. Chem., 2003, 46(24):5097-5116]에서 찾아볼 수 있다.
"유사분열 진행에 관련된 키나제의 억제제"는 오로라 키나제의 억제제, Polo-유사 키나제 (PLK; 특히 PLK-1의 억제제)의 억제제, bub-1의 억제제 및 bub-R1의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "오로라 키나제 억제제"의 예는 VX-680이다.
"항증식제"는 안티센스 RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드, 예컨대 G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 및 INX3001 및 항대사물, 예컨대 에노시타빈, 카르모푸르, 테가푸르, 펜토스타틴, 독시플루리딘, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 카페시타빈, 갈로시타빈, 시타라빈 옥포스페이트, 포스테아빈 소듐 수화물, 랄티트렉세드, 팔티트렉시드, 에미테푸르, 티아조푸린, 데시타빈, 놀라트렉세드, 페메트렉세드, 넬자라빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘, 2'-플루오로메틸렌-2'-데옥시시티딘, N-[5-(2,3-디히드로-벤조푸릴)술포닐]-N'-(3,4-디클로로페닐)우레아, N6-[4-데옥시-4-[N2-[2(E),4(E)-테트라데카디에노일]글리실아미노]-L-글리세로-B-L-만노-헵토피라노실]아데닌, 아플리딘, 엑테이나시딘, 트록사시타빈, 4-[2-아미노-4-옥소-4,6,7,8-테트라히드로-3H-피리미디노[5,4-b][1,4]티아진-6-일-(S)-에틸]-2,5-티에노일-L-글루탐산, 아미노프테린, 5-플루오로우라실, 알라노신, 11-아세틸-8-(카르바모일옥시메틸)-4-포르밀-6-메톡시-14-옥사-1,11-디아자테트라시클로(7.4.1.0.0)-테트라데카-2,4,6-트리엔-9-일 아세트산 에스테르, 스와인소닌, 로메트렉솔, 덱스라족산, 메티오니나제, 2'-시아노-2'-데옥시-N4-팔미토일-1-B-D-아라비노 푸라노실 시토신, 3-아미노피리딘-2-카르복스알데히드 티오세미카르바존, 및 트라스투주맙을 포함한다.
모노클로날 항체 표적화된 치료제의 예는 암 세포 특이적 또는 표적 세포 특이적 모노클로날 항체에 부착되는 세포독성제 또는 방사성동위원소를 갖는 치료제를 포함한다. 예는 벡사르를 포함한다.
"HMG-CoA 리덕타제 억제제"는 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리덕타제의 억제제를 지칭한다. 사용될 수 있는 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 예는 로바스타틴 (메바코르(MEVACOR)®; 미국 특허 번호 4,231,938, 4,294,926 및 4,319,039 참조), 심바스타틴 (조코르(ZOCOR)®; 미국 특허 번호 4,444,784, 4,820,850 및 4,916,239 참조), 프라바스타틴 (프라바콜(PRAVACHOL)®; 미국 특허 번호 4,346,227, 4,537,859, 4,410,629, 5,030,447 및 5,180,589 참조), 플루바스타틴 (레스콜(LESCOL)®; 미국 특허 번호 5,354,772, 4,911,165, 4,929,437, 5,189,164, 5,118,853, 5,290,946 및 5,356,896 참조), 아토르바스타틴 (리피토르(LIPITOR)®; 미국 특허 번호 5,273,995, 4,681,893, 5,489,691 및 5,342,952 참조) 및 세리바스타틴 (리바스타틴 및 베이콜(BAYCHOL)®로도 공지되어 있음; 미국 특허 번호 5,177,080 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 이들 및 추가의 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 구조 화학식은 문헌 [M. Yalpani, Cholesterol Lowering Drugs, Chemistry & Industry, 1996, pp. 85-89]의 87페이지, 및 미국 특허 번호 4,782,084 및 4,885,314에 기재되어 있다. 본원에 사용된 용어 HMG-CoA 리덕타제 억제제는 HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 갖는 화합물의 모든 제약상 허용되는 락톤 및 개방-산 형태 (즉, 락톤 고리가 개방되어 유리 산을 형성함) 뿐만 아니라 염 및 에스테르 형태를 포함하며, 따라서 이러한 염, 에스테르, 개방-산 및 락톤 형태의 사용은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
"프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제"는 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 효소, 예컨대 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 (FPTase), 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 유형 I (GGPTase-I), 및 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 유형-II (GGPTase-II, 또한 Rab GGPTase로 지칭됨) 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 화합물을 지칭한다.
프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 예는 하기 공개 및 특허에서 찾아볼 수 있다: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, 미국 특허 번호 5,420,245, 미국 특허 번호 5,523,430, 미국 특허 번호 5,532,359, 미국 특허 번호 5,510,510, 미국 특허 번호 5,589,485, 미국 특허 번호 5,602,098, 유럽 특허 공개 0 618 221, 유럽 특허 공개 0 675 112, 유럽 특허 공개 0 604 181, 유럽 특허 공개 0 696 593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, 미국 특허 번호 5,661,152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, 미국 특허 번호 5,571,792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436, 및 미국 특허 번호 5,532,359. 혈관신생에 대한 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 역할의 예에 대해서는 문헌 [European J. of Cancer, 1999, 35(9):1394-1401]을 참조한다.
"혈관신생 억제제"는 메카니즘에 상관없이, 새로운 혈관의 형성을 억제하는 화합물을 지칭한다. 혈관신생 억제제의 예는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 티로신 키나제 수용체 Flt-1 (VEGFR1) 및 Flk-1/KDR (VEGFR2)의 억제제, 표피-유래, 섬유모세포-유래 또는 혈소판 유래 성장 인자의 억제제, MMP (매트릭스 메탈로프로테아제) 억제제, 인테그린 차단제, 인터페론-α, 인터류킨-12, 펜토산 폴리술페이트, 시클로옥시게나제 억제제, 예를 들어 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), 예컨대 아스피린 및 이부프로펜, 뿐만 아니라 선택적 시클로옥시게나제-2 억제제, 예컨대 셀레콕시브 및 로페콕시브 (PNAS, 1992, 89:7384; JNCI, 1982, 69:475; Arch. Opthalmol., 1990, 108:573; Anat. Rec., 1994, 238:68; FEBS Letters, 1995, 372:83; Clin, Orthop., 1995, 313:76; J. Mol. Endocrinol., 1996, 16:07; Jpn. J. Pharmacol., 1997, 75:105; Cancer Res., 1997, 57:1625; Cell, 1998, 93:705; Intl. J. Mol. Med., 1998, 2:715; J. Biol. Chem., 1999. 274:9116), 스테로이드성 항염증제 (예컨대, 코르티코스테로이드, 미네랄로코르티코이드, 덱사메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드, 베타메타손), 카르복시아미도트리아졸, 콤브레타스타틴 A-4, 스쿠알라민, 6-O-클로로아세틸-카르보닐)-푸마길롤, 탈리도미드, 안지오스타틴, 트로포닌-1, 안지오텐신 II 길항제 (문헌 [Fernandez, et al., J. Lab. Clin. Med., 1985, 105:141-145] 참조), 및 VEGF에 대한 항체 (문헌 [Nature Biotechnology, 1999, 17:963-968; Kim, et al., Nature, 1993, 362:841-844]; WO 2000/44777; 및 WO 2000/61186 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈관신생을 조절하거나 또는 억제하고, 또한 본 발명의 화합물과 조합되어 사용될 수 있는 다른 치료제는 응고 및 섬유소용해 시스템을 조절하거나 또는 억제하는 작용제를 포함한다 (문헌 [Clin. Chem. La. Med., 2000, 38:679-692]에서의 검토 참조). 응고 및 섬유소용해 경로를 조절하거나 또는 억제하는 이러한 작용제의 예는 헤파린 (문헌 [Thromb. Haemost., 1998, 80:10-23] 참조), 저분자량 헤파린 및 카르복시펩티다제 U 억제제 (활성 트롬빈 활성화가능한 섬유소용해 억제제 [TAFIa]의 억제제로도 공지되어 있음) (문헌 [Thrombosis Res., 2001, 101:329-354] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TAFIa 억제제는 PCT 국제 공개 WO 2003/013526에 기재된 바 있다. "세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제"는 세포 주기 체크포인트 신호를 전달하는 단백질 키나제를 억제함으로써 암 세포를 DNA 손상 작용제에 대해 감작화시키는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제는 ATR, ATM, 및 CHK1 키나제의 억제제 및 cdk 및 cdc 키나제 억제제를 포함하고, 이는 구체적으로 7-히드록시-스타우로스포린, 플라보피리돌, CYC202 (시클라셀(Cyclacel)) 및 BMS-387032로 예시된다.
"수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제"는 RTK를 억제하고 이에 따라 종양발생 및 종양 진행에 관련된 메카니즘을 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제는 c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 및 c-Met의 억제제를 포함한다. 추가의 작용제는 문헌 [Bume-Jensen and Hunter, Nature, 2001, 411:355-365]에 기재된 바와 같은 RTK의 억제제를 포함한다.
"세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제"는 세포 표면 수용체의 신호 전달 캐스케이드 하류를 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제는 세린/트레오닌 키나제의 억제제 (WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, WO 2006/135627, WO 2006/091395, WO 2006/110638에 기재된 바와 같은 Akt의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않음), Raf 키나제의 억제제 (예를 들어, BAY-43-9006), MEK의 억제제 (예를 들어, CI-1040 및 PD-098059), mTOR의 억제제 (예를 들어, 와이어쓰(Wyeth) CCI-779), 및 PI3K의 억제제 (예를 들어, LY294002)를 포함한다.
특이적 항-IGF-1R 항체는 달로투주맙, 피기투무맙, 식수투무맙, SHC 717454, 로슈(Roche) R1507, EM164 또는 암젠(Amgen) AMG479를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 기재된 바와 같이, NSAID와의 조합은 강력한 COX-2 억제제인 NSAID의 사용에 관한 것이다. 본 명세서의 목적을 위해, NSAID는 세포 또는 마이크로솜 검정에 의해 측정시 1μM 이하의 COX-2 억제에 대한 IC50을 보유하는 경우에 강력하다.
본 발명은 또한 선택적 COX-2 억제제인 NSAID와의 조합을 포괄한다. 본 명세서의 목적을 위해, COX-2의 선택적 억제제인 NSAID는 세포 또는 마이크로솜 검정에 의해 평가된 COX-1의 IC50에 대한 COX-2의 IC50의 비를 측정했을 때 COX-1에 비해 적어도 100배의 COX-2 억제 특이성을 보유하는 것들로서 정의된다. 이러한 화합물은 미국 특허 5,474,995, 미국 특허 5,861,419, 미국 특허 6,001,843, 미국 특허 6,020,343, 미국 특허 5,409,944, 미국 특허 5,436,265, 미국 특허 5,536,752, 미국 특허 5,550,142, 미국 특허 5,604,260, U.S. 5,698,584, 미국 특허 5,710,140, WO 94/15932, 미국 특허 5,344,991, 미국 특허 5,134,142, 미국 특허 5,380,738, 미국 특허 5,393,790, 미국 특허 5,466,823, 미국 특허 5,633,272, 및 미국 특허 5,932,598에 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 치료 방법에 특히 유용한 COX-2의 억제제는 3-페닐-4-(4-(메틸술포닐)페닐)-2-(5H)-푸라논; 및 5-클로로-3-(4-메틸술포닐) 페닐-2-(2-메틸-5-피리디닐)피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
COX-2의 특이적 억제제로서 기재된 바 있고, 따라서 본 발명에 유용한 화합물은 파레콕시브, 벡스트라(BEXTRA)® 및 셀레브렉스(CELEBREX)® 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈관신생 억제제의 다른 예는 엔도스타틴, 우크라인, 란피르나제, IM862, 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)옥시라닐]-1-옥사스피로[2,5]옥트-6-일(클로로아세틸)카르바메이트, 아세틸디나날린, 5-아미노-1-[[3,5-디클로로-4-(4-클로로벤조일)페닐]메틸]-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복스아미드, CM101, 스쿠알라민, 콤브레타스타틴, RPI4610, NX31838, 황산화 만노펜타오스 포스페이트, 7,7-(카르보닐-비스[이미노-N-메틸-4,2-피롤로카르보닐이미노[N-메틸-4,2-피롤]-카르보닐이미노]-비스-(1,3-나프탈렌 디술포네이트) 및 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸렌]-2-인돌리논 (SU5416)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기에 사용된 "인테그린 차단제"는 αvβ3 인테그린에 대한 생리학적 리간드의 결합을 선택적으로 길항하거나, 억제하거나 또는 방해하는 화합물, αvβ5 인테그린에 대한 생리학적 리간드의 결합을 선택적으로 길항하거나, 억제하거나 또는 방해하는 화합물, αvβ3 인테그린 및 αvβ5 인테그린 둘 다에 대한 생리학적 리간드의 결합을 길항하거나, 억제하거나 또는 방해하는 화합물, 및 모세관 내피 세포 상에서 발현되는 특정한 인테그린(들)의 활성을 길항하거나, 억제하거나 또는 방해하는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, 및 α6β4 인테그린의 길항제를 지칭한다. 상기 용어는 또한 αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, 및 α6β4 인테그린의 임의의 조합의 길항제를 지칭한다.
티로신 키나제 억제제의 일부 구체적 예는 N-(트리플루오로메틸페닐)-5-메틸이속사졸-4-카르복스아미드, 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸리데닐)인돌린-2-온, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭실]퀴나졸린, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-헥사히드로-10-(히드록시메틸)-10-히드록시-9-메틸-9,12-에폭시-1H-디인돌로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][1,6]벤조디아조신-1-온, SH268, 게니스테인, STI571, CEP2563, 4-(3-클로로페닐아미노)-5,6-디메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘메탄 술포네이트, 4-(3-브로모-4-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(4'-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, SU6668, STI571A, N-4-클로로페닐-4-(4-피리딜메틸)-1-프탈라진아민 및 EMD121974를 포함한다.
항암 화합물 이외의 화합물과의 조합물이 또한 본 발명의 방법에 포괄된다. 예를 들어, 본 발명의 mTOR 억제제 및 αvβ3 인테그린 길항제 조합물과 PPAR-γ (즉, PPAR-감마) 효능제 및 PPAR-δ (즉, PPAR-델타) 효능제의 조합물은 특정 악성종양의 치료에 유용하다. PPAR-γ 및 PPAR-δ는 핵 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 γ 및 δ이다. 내피 세포 상에서의 PPAR-γ의 발현 및 혈관신생에서의 그의 관여가 문헌에 보고된 바 있다 (문헌 [J. Cardiovasc. Pharmacol., 1998, 31:909-913; J. Biol. Chem., 1999, 274:9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci., 2000, 41:2309-2317] 참조). 보다 최근에, PPAR-γ 효능제가 시험관내에서 VEGF에 대한 혈관신생 반응을 억제하는 것으로 나타났으며; 트로글리타존 및 로시글리타존 말레에이트 둘 다는 마우스에서 망막 신생혈관화의 발달을 억제한다 (Arch. Ophthamol., 2001; 119:709-717). PPAR-γ 효능제 및 PPAR-γ/α 효능제의 예는 티아졸리딘디온 (예컨대, DRF2725, CS-011, 트로글리타존, 로시글리타존 및 피오글리타존), 페노피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-디프로필-3-트리플루오로메틸-1,2-벤즈이속사졸-6-일)옥시]-2-메틸프로피온산 (USSN 09/782,856에 개시됨) 및 2(R)-7-(3-(2-클로로-4-(4-플루오로페녹시)페녹시)프로폭시)-2-에틸크로만-2-카르복실산 (USSN 60/235,708 및 60/244,697에 개시됨)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 암의 치료를 위한 유전자 요법과 조합된 본원에 개시된 화합물의 용도이다. 암을 치료하기 위한 유전학적 전략의 개관에 대해서는 문헌 [Hall, et al., Am. J. Hum. Genet., 1997, 61:785-789 및 Kufe, et al., Cancer Medicine, 5th Ed, , B.C. Decker, Hamilton, 2000, pp 876-889]을 참조한다. 유전자 요법은 임의의 종양 억제 유전자를 전달하는데 이용될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 재조합 바이러스-매개 유전자 전달을 통해 전달될 수 있는 p53 (미국 특허 번호 6,069,134 참조), uPA/uPAR 길항제 (Gene Therapy, 1998, 5(8):1105-13), 및 인터페론 감마 (J. Immunol., 2000, 164:217-222)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 화합물은 또한 내재된 다중약물 내성 (MDR), 특히 수송체 단백질의 높은 수준의 발현과 연관된 MDR의 억제제와 조합되어 투여될 수 있다. 이러한 MDR 억제제는 p-당단백질 (P-gp)의 억제제, 예컨대 LY335979, XR9576, OC144-093, R101922, VX853 및 PSC833 (발스포다르)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 방사선 요법과 함께 사용함으로써 발생할 수 있는 오심 또는 구토, 예컨대 급성, 지연, 후기 및 예기 구토를 치료하기 위해 항구토제와 함께 사용될 수 있다. 구토의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 다른 항구토제, 특히 뉴로키닌-1 수용체 길항제, 5HT3 수용체 길항제, 예컨대 온단세트론, 그라니세트론, 트로피세트론 및 자티세트론, GABAB 수용체 효능제, 예컨대 바클로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 데카드론(Decadron) (덱사메타손), 케나로그(Kenalog), 아리스토코르트(Aristocort), 나살리드(Nasalide), 프레페리드(Preferid), 베네코르텐(Benecorten), 또는 예컨대 미국 특허 번호 2,789,118, 2,990,401, 3,048,581, 3,126,375, 3,929,768, 3,996,359, 3,928,326 및 3,749,712에 개시되어 있는 다른 것, 항도파민제, 예컨대, 페노티아진 (예를 들어, 프로클로르페라진, 플루페나진, 티오리다진 및 메소리다진), 메토클로프라미드 또는 드로나비놀과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 뉴로키닌-1 수용체 길항제, 5HT3 수용체 길항제 및 코르티코스테로이드로부터 선택된 항구토제와의 공동 요법이 본 발명의 화합물의 투여시에 유발될 수 있는 구토의 치료 또는 예방을 위해 개시된다.
본 발명의 화합물과 함께 사용되는 뉴로키닌-1 수용체 길항제는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,162,339, 5,232,929, 5,242,930, 5,373,003, 5,387,595, 5,459,270, 5,494,926, 5,496,833, 5,637,699, 5,719,147; 유럽 특허 공개 번호 EP 0 360 390, 0 394 989, 0 428 434, 0 429 366, 0 430 771, 0 436 334, 0 443 132, 0 482 539, 0 498 069, 0 499 313, 0 512 901, 0 512 902, 0 514 273, 0 514 274, 0 514 275, 0 514 276, 0 515 681, 0 517 589, 0 520 555, 0 522 808, 0 528 495, 0 532 456, 0 533 280, 0 536 817, 0 545 478, 0 558 156, 0 577 394, 0 585 913,0 590 152, 0 599 538, 0 610 793, 0 634 402, 0 686 629, 0 693 489, 0 694 535, 0 699 655, 0 699 674, 0 707 006, 0 708 101, 0 709 375, 0 709 376, 0 714 891, 0 723 959, 0 733 632 및 0 776 893; PCT 국제 특허 공개 번호 WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418, 95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661, 96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 및 97/21702; 및 영국 특허 공개 번호 2 266 529, 2 268 931, 2 269 170, 2 269 590, 2 271 774, 2 292 144, 2 293 168, 2 293 169, 및 2 302 689에 충분히 기재되어 있다. 이러한 화합물의 제조는 상기 언급된 특허 및 공개에 충분히 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물과 함께 사용되는 뉴로키닌-1 수용체 길항제는 미국 특허 번호 5,719,147에서 기재되어 있는 2-(R)-(1-(R)-(3,5-비스 (트리플루오로메틸)페닐)에톡시)-3-(S)-(4-플루오로페닐)-4-(3-(5-옥소-1H,4H-1,2,4-트리아졸로) 메틸)모르폴린 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 빈혈의 치료에 유용한 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 빈혈 치료제는, 예를 들어 지속적 적혈구생성 수용체 활성화제 (예컨대, 에포에틴 알파)이다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 호중구감소증의 치료에 유용한 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 호중구감소증 치료제는, 예를 들어 호중구의 생산 및 기능을 조절하는 조혈 성장 인자, 예컨대 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)이다. G-CSF의 예는 필그라스팀을 포함한다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 면역-증진 약물, 예컨대 레바미솔, 이소프리노신 및 자닥신과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 비스포스포네이트 (비스포스포네이트, 디포스포네이트, 비스포스폰산 및 디포스폰산을 포함하는 것으로 이해됨)와 조합하여 골암을 비롯한 암을 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 비스포스포네이트의 예는 에티드로네이트 (디드로넬(Didronel)), 파미드로네이트 (아레디아(Aredia)), 알렌드로네이트 (포사맥스(Fosamax)), 리세드로네이트 (악토넬(Actonel)), 졸레드로네이트 (조메타(Zometa)), 이반드로네이트 (보니바(Boniva)), 인카드로네이트 또는 시마드로네이트, 클로드로네이트, EB-1053, 미노드로네이트, 네리드로네이트, 피리드로네이트 및 틸루드로네이트 (이들의 임의의 및 모든 제약상 허용되는 염, 유도체, 수화물 및 혼합물 포함)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 아로마타제 억제제와 조합되어 유방암을 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 아로마타제 억제제의 예는 아나스트로졸, 레트로졸 및 엑세메스탄을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 siRNA 치료제와 조합되어 암을 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 γ-세크레타제 억제제 및/또는 NOTCH 신호전달의 억제제와 조합되어 투여될 수 있다. 이러한 억제제는 WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, USSN 10/957,251, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 및 WO 02/47671에 기재된 화합물 (LY-450139 포함)을 포함한다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 Akt의 억제제와 조합되어 암을 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 이러한 억제제는 하기 공개: WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361,WO 2006/135627, WO 2006091395, WO 2006/110638에 기재된 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 PARP 억제제와 조합되어 암을 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
방사선 요법 자체는 암의 치료의 분야에서 통상적인 방법을 의미한다. 방사선 요법에 대해, 다양한 방사선, 예컨대 X선, γ선, 중성자선, 전자 빔, 양성자 빔; 및 방사선원이 이용가능하다. 대부분의 대중적인 방사선 요법에서, 선형 가속기가 외부 방사선, γ선으로의 조사에 이용된다.
본 발명의 WEE1 억제제는 또한 하기 치료제와 추가로 조합되어 암을 치료하는데 유용할 수 있다: 아바렐릭스 (플레낙시스 데포(Plenaxis depot)®); 아비라테론 아세테이트 (자이티가(Zytiga)®); (액틱(Actiq)®); 알데스류킨 (프로킨(Prokine)®); 알데스류킨 (프로류킨(Proleukin)®); 알렘투주맙 (캄파트(Campath)®); 알푸조신 HCl (유로자트랄(UroXatral)®); 알리트레티노인 (판레틴(Panretin)®); 알로퓨리놀 (질로프림(Zyloprim)®); 알트레타민 (헥살렌(Hexalen)®); 아미포스틴 (에티올(Ethyol)®); 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®); (안제메트(Anzemet)®); (아넥시아(Anexsia)®); 아프레피탄트 (에멘드(Emend)®); 삼산화비소 (트리세녹스(Trisenox)®); 아스파라기나제 (엘스파르(Elspar)®); 아자시티딘 (비다자(Vidaza)®); 벤다무스틴 히드로클로라이드 (트레안다(Treanda)®); 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)®); 벡사로텐 캡슐 (탈그레틴(Targretin)®); 벡사로텐 겔 (탈그레틴(Targretin)®); 블레오마이신 (블레녹산(Blenoxane)®); 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®); (브로페낙(Brofenac)®); 부술판 정맥내 (부술플렉스(Busulflex)®); 부술판 경구 (밀레란(Myleran)®); 카바지탁셀 (제브타나(Jevtana)®); 칼루스테론 (메토사르브(Methosarb)®); 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®); 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®); 카르무스틴 (BCNU®, BiCNU®); 카르무스틴 (글리아델(Gliadel)®); 폴리페프로산 20을 함유하는 카르무스틴 임플란트 (글리아델 웨이퍼(Gliadel Wafer)®); 셀레콕시브 (셀레브렉스(Celebrex)®); 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®); 클로람부실 (류케란(Leukeran)®); 시나칼세트 (센시파르(Sensipar)®); 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®); 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®, 2-CdA®); 클로파라빈 (클로라르(Clolar)®); 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)®, 네오사르(Neosar)®); 시클로포스파미드 (시톡산 주사®); 시클로포스파미드 (시톡산 정제®); 시타라빈 (시토사르-U(Cytosar-U)®); 시타라빈 리포솜 (데포사이트(DepoCyt)®); 다카르바진 (DTIC-돔(DTIC-Dome)®); 닥티노마이신, 악티노마이신 D (코스메겐(Cosmegen)®); 다르베포에틴 알파 (아라네스프(Aranesp)®); 다사티닙 (스프리셀(Sprycel)®); 다우노루비신 리포솜 (다우녹솜(DanuoXome)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (다우노루비신(Daunorubicin)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (세루비딘(Cerubidine)®); 데시타빈 (다코겐(Dacogen)®); 데가렐릭스 (데가렐릭스(Degarelix)®); 데니류킨 디프티톡스 (온탁(Ontak)®); 데노수맙 (엑스제바(Xgeva)®); 덱스라족산 (지네카드(Zinecard)®); 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®); 독소루비신 (아드리아마이신(Adriamycin) PFS®); 독소루비신 (아드리아마이신®, 루벡스(Rubex)®); 독소루비신 (아드리아마이신 PFS 주사®); 독소루비신 리포솜 (독실(Doxil)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (드로모스타놀론(dromostanolone)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (마스테론(masterone) 주사®); 엘리오트(Elliott) B 용액 (엘리오트 B 용액®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)®); 에포에틴 알파 (에포겐(epogen)®); 에리불린 메실레이트 (할라벤(Halaven)®); 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)®); 에스트라무스틴 (엠사이트(Emcyt)®); 에토포시드 포스페이트 (에토포포스(Etopophos)®); 에토포시드, VP-16 (베페시드(Vepesid)®); 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)®); 엑세메스탄 (아로마신(Aromasin)®); 펜타닐 협측 (온솔리스(Onsolis)®); 펜타닐 시트레이트 (펜토라(Fentora)®); 펜타닐 설하 정제 (앱스트랄(Abstral)®); 필그라스팀 (뉴포젠(Neupogen)®); 플록수리딘 (동맥내) (FUDR®); 플루다라빈 (플루다라(Fludara)®); 플루오로우라실, 5-FU (아드루실(Adrucil)®); 플루타미드 (유렉신(Eulexin)®); 풀베스트란트 (파슬로덱스(Faslodex)®); 게피티닙 (이레사(Iressa)®); 겜시타빈 (겜자르(Gemzar)®); 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스(Zoladex) 임플란트®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스®); 그라니세트론 (키트릴(Kytril) 용액®) (산쿠소(Sancuso)®); 히스트렐린 아세테이트 (히스트렐린(Histrelin) 임플란트®); 인간 유두종바이러스 2가 백신 (서바릭스(Cervarix)®); 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®); 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®); 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®); 이포스파미드 (IFEX®); 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)®); 인터페론 알파 2a (로페론(Roferon) A®); 인터페론 알파-2b (인트론(Intron) A®); 이필리무맙 (예르보이(Yervoy)®); 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®); (카디안(Kadian)®); 익사베필론 (익셈프라(Ixempra)®); 라파티닙 (타이커브(Tykerb)®); 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®); 레트로졸 (페마라(Femara)®); 류코보린 (웰코보린(Wellcovorin)®, 류코보린(Leucovorin)®); 류프롤리드 아세테이트 (엘리가드(Eligard)®); (루프론 데포(Lupron Depot)®); (비아두르(Viadur)®); 레바미솔 (에르가미솔(Ergamisol)®); 레보류코보린 (푸실레브(Fusilev)®); 로무스틴, CCNU (CeeBU®); 메클로레타민, 질소 머스타드 (머스타르겐(Mustargen)®); 메게스트롤 아세테이트 (메게이스(Megace)®); 멜팔란, L-PAM (알케란(Alkeran)®); 메르캅토퓨린, 6-MP (퓨린톨(Purinethol)®); 메스나 (메스넥스(Mesnex)®); 메스나 (메스넥스 정제®); 메토트렉세이트 (메토트렉세이트(Methotrexate)®); 메톡살렌 (우바덱스(Uvadex)®); 미토마이신 C (뮤타마이신(Mutamycin)®); 미토마이신 C (미토지트렉스(Mitozytrex)®); 미토탄 (리소드렌(Lysodren)®); 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®); 난드롤론 펜프로피오네이트 (듀라볼린-50(Durabolin-50)®); 넬라라빈 (아라논(Arranon)®); 닐로티닙 히드로클로라이드 1수화물 (타시그나(Tasigna)®); 노페투모맙 (베르루마(Verluma)®); 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)®); 온단세트론 (주플렌즈(Zuplenz)®); 오프렐베킨 (뉴메가(Neumega)®); (뉴포젠(Neupogen)®); 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 파클리탁셀 (팍센(Paxene)®); 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®); 파클리탁셀 단백질-결합 입자 (아브락산(Abraxane)®); 팔리페르민 (케피반스(Kepivance)®); 팔로노세트론 (알록시(Aloxi)®); 파미드로네이트 (아레디아(Aredia)®); 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)®); 파조파닙 (보트리엔트(Votrient)®); 페가데마제 (아다겐(Adagen) (소 페가데마제)®); 페가스파르가제 (온카스파르(Oncaspar)®); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)®); 페그인터페론 알파-2B (실라트론(Sylatron)®); 페메트렉세드 이나트륨 (알림타(Alimta)®); 펜토스타틴 (니펜트(Nipent)®); 피포브로만 (베르사이트(Vercyte)®); 플레릭사포르 주사 (모조빌(Mozobil)®); 플리카마이신, 미트라마이신 (미트라신(Mithracin)®); 포르피머 나트륨 (포토프린(Photofrin)®); 프랄라트렉세이트 주사 (폴로틴(Folotyn)®); 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); (콰드라메트(Quadramet)®); 4가 인간 유두종바이러스 (유형 6, 11, 16, 18) 재조합 백신 (가르다실(Gardasil)®); 퀴나크린 (아타브린(Atabrine)®); 랄록시펜 히드로클로라이드 (에비스타(Evista)®); 라스부리카제 (엘리텍(Elitek)®); 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®); 로미뎁신 (이스토닥스(Istodax)®); 사르그라모스팀 (류킨(Leukine)®); 사르그라모스팀 (프로킨(Prokine)®); 세크레틴 (세크레플로(SecreFlo)®); 시푸류셀-T (프로벤지(Provenge)®); 소라페닙 (넥사바르(Nexavar)®); 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®); 수니티닙 말레에이트 (수텐트(Sutent)®); 활석 (스클레로솔(Sclerosol)®); 타목시펜 (놀바덱스(Nolvadex)®); 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®); 템시롤리무스 (토리셀(Torisel)®); 테니포시드, VM-26 (부몬(Vumon)®); (테모다르(Temodar)®); 테스토락톤 (테슬락(Teslac)®); 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)®); 티오구아닌, 6-TG (티오구아닌(Thioguanine)®); 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®); 토포테칸 (하이캄틴(Hycamtin)®); 토레미펜 (파레스톤(Fareston)®); 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)®); 토시투모맙/I-131 토시투모맙 (벡사르®); 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)®); (트렐스타(Trelstar) LA®); 트레티노인, ATRA (베사노이드(Vesanoid)®); 트립토렐린 파모에이트 (트렐스타 데포®); (울트라젝트(UltraJect)®); 우라실 머스타드 (우라실 머스타드(Uracil Mustard) 캡슐®); 발루비신 (발스타(Valstar)®); 반데타닙 (반데타닙(Vandetanib)®); 빈블라스틴 (벨반(Velban)®); 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®); 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®); 보리노스타트 (졸린자(Zolinza)®); (조프란(Zofran) ODT®); 및 졸레드로네이트 (조메타(Zometa)®).
확인되는 모든 특허, 공개 및 계류 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
WEE1-1의 제조
Figure 112015049198685-pct00003
2-알릴-1-[6-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-2-일]-6-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온의 제조
단계 1) 2-(6-브로모-2-피리디닐)-2-프로판올의 제조:
질소 분위기 하에, 3 M 메틸마그네슘 아이오다이드/디에틸 에테르 30 mL를 메틸 6-브로모피리딘-2-카르복실레이트 8.72 g의 디에틸 에테르 용액 300 mL에 첨가하였다. 물 및 2 N 염산을 반응액에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이를 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켜 조 2-(6-브로모-2-피리디닐)-2-프로판올을 황색 유성 물질로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00004
단계 2) 2-알릴-1-[6-(1-히드록시-1-메틸에틸)-2-피리디닐]-6-(메틸티오)-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온의 제조:
표제 화합물을, 제조 실시예 1-1에서와 동일한 방식으로, 그러나 제조 실시예 1-1에서 사용된 2-아이오도피리딘 대신에 상기 반응에서 수득한 화합물을 사용하여 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00005
단계 3) 2-알릴-1-[6-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-2-일]-6-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온의 제조:
m-클로로퍼벤조산 (> 65%) 817 mg을 상기 생성물 1.10 g의 톨루엔 (20 mL) 용액에 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 1.61 mL 및 4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린 706 mg을 반응액에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액을 반응액에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 염기성 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 = 1/1 → 0/1, 에틸 아세테이트/에탄올 = 98/2)를 통해 정제하였다. 농축시킨 후, 이를 에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00006
제조 실시예 1-1
2-알릴-6-(메틸티오)-1-피리딘-2-일-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온의 제조:
N,N'-디메틸에틸렌디아민 2.4 mL를 2-알릴-6-(메틸티오)-1,2-디히드로-3H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-온 4.44 g, 아이오딘화구리 (I) 3.80 g, 2-아이오도피리딘 5.33 g 및 탄산칼륨 3.80 g의 1,4-디옥산 (50 mL) 용액에 첨가하고, 95℃에서 밤새 교반하였다. 반응액을 냉각시키고, 여기에 수성 암모니아를 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 에틸 아세테이트로 결정화하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00007
실시예 2
WEE1-2의 제조
Figure 112015049198685-pct00008
3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-7-[(2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로 [시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-일)아미노]-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온의 제조
제조 실시예 2-1에서 수득한 7-클로로-3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온 1.5 g, 제조 실시예 2-2에서 수득한 2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-아민 1 g 및 p-톨루엔 술폰산 1수화물 0.83 g의 1-부탄올 용액을 90℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응액을 냉각시키고, 클로로포름으로 희석하고, 유기 층을 포화 중탄산나트륨 수용액에 이어서 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 이에 따라 수득한 대략적으로-정제된 생성물을 염기성 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-7-[(2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-일)아미노]-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온을 수득하였다. 이를 클로로포름/메탄올의 혼합 용매 중에 용해시키고, 여기에 1.5 당량의 수성 염산 용액을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 세척하여 3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-7-[(2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-일)아미노]-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온 디히드로클로라이드를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00009
제조 실시예 2-1
Figure 112015049198685-pct00010
7-클로로-3-(2,6-디클로로페닐)-4-이미노-3,4-디히드로피리미도[4,5-d]피리미딘-2(1H)-온의 제조
수소화나트륨 1.12 g을 4-아미노-2-클로로피리미딘-5-카르보니트릴 3.0 g의 N,N-디메틸포름아미드 (35 mL) 용액에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 2,6-디클로로페닐 이소시아네이트 4.38 g을 반응액에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 및 1 N 염산 수용액을 반응 용액에 첨가하고, 유기 층을 분리하였다. 이를 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 침전된 고체를 메탄올/에틸 아세테이트의 혼합 용매로 고체화시키고, 여과하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00011
제조 실시예 2-2
2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-아민의 제조
Figure 112015049198685-pct00012
단계 1) 메틸 1-(2-시아노페닐)시클로프로판카르복실레이트의 제조:
테트라-n-부틸암모늄 브로마이드 1.5 g, 1,2-디브로모에탄 6.5 g 및 50% 수산화나트륨 수용액 20 mL를 메틸 2-시아노페닐아세테이트 4.0 g의 톨루엔 (40 mL) 용액에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 반응액에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 표제 화합물을 무색 화합물로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00013
Figure 112015049198685-pct00014
단계 2) 메틸 1-[2-(아미노메틸)페닐]시클로프로판카르복실레이트 모노히드로클로라이드의 제조:
10% 팔라듐-탄소 1.6 g을 상기 반응 단계 1)에서 수득한 화합물 2.95 g의 에탄올 (50 mL) 용액에 첨가하고, 수소 분위기에서 2기압 하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 팔라듐-탄소를 여과를 통해 제거하고, 여과물을 감압 하에 농축시키고, 조 생성물을 디에틸 에테르로 세척하여 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00015
Figure 112015049198685-pct00016
단계 3) 1',2'-디히드로-3'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-3'-온의 제조:
5 N 수산화나트륨 수용액 4 mL를 상기 반응 단계 2)에서 수득한 화합물 3.2 g의 메탄올 (50 mL) 용액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 수성 1 N 염산을 여기에 첨가하여 이를 중화시키고, 메탄올을 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 층을 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켜 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00017
Figure 112015049198685-pct00018
단계 4) 7'-니트로-1',2'-디히드로-3'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-3'-온의 제조:
질산칼륨 1.3 g을 상기 반응 3)에서 수득한 화합물 2.1 g의 황산 (60 mL) 용액에 서서히 첨가하고 (5분 소요), 실온에서 10분 동안 추가로 교반하였다. 반응액을 얼음 물에 붓고, 침전된 결정을 여과하고, 물로 세척하여 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00019
Figure 112015049198685-pct00020
단계 5) 7'-니트로-1',2'-디히드로-3'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]의 제조:
얼음으로 냉각시키면서, 삼플루오린화붕소-디에틸 에테르 착물 6.3 g을 수소화붕소나트륨 1.3 g의 테트라히드로푸란 현탁액에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 단계 4)에서 수득한 화합물 2.4 g의 테트라-히드로푸란 (100ml) 용액을 반응액에 첨가하고, 환류 하에 2시간 동안 가열하였다. 반응액을 냉각시킨 다음, 포화 중탄산나트륨 수용액으로 중화시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 에탄올 중에 용해시키고, 5 N 염산을 여기에 첨가하고, 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 반응액을 냉각시킨 다음, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 탄산칼륨 수용액으로 중화시켰다. 수성 층을 클로로포름으로 추출하고, 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00021
Figure 112015049198685-pct00022
단계 6) 2'-메틸-7'-니트로-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]의 제조:
소듐 시아노보로히드라이드 1.5 g을 상기 반응 단계 5)에서 수득한 화합물 (2.3g)의 메탄올 (50 mL) 용액, 37% 포름알데히드 수용액 2.7 mL 및 아세트산 0.7 mL에 첨가하고, 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응액을 포화 중탄산나트륨 수용액으로 중화시키고, 메탄올을 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 물로 희석하고, 클로로포름으로 3회 추출하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고, 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015049198685-pct00023
Figure 112015049198685-pct00024
단계 7) 2'-메틸-2',3'-디히드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,4'-이소퀴놀린]-7'-아민의 제조:
10% 팔라듐-탄소 800 mg을 상기 반응 단계 6)에서 수득한 화합물 1.7 g의 에탄올 (20 mL) 용액에 첨가하고, 수소 분위기에서 1기압 하에 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 팔라듐-탄소를 여과를 통해 제거하고, 여과물을 감압 하에 농축시키고, 조 생성물을 염기성 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트)를 통해 정제하여, 표제 화합물을 무색 고체로서 수득하였다.
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실시예 3
일반적 물질 및 방법
A. 세포 배양, 증식 검정 및 MYT1 siRNA 녹다운
모든 암 세포주를 세포주 공급처 (ATCC)에 의해 권장되는 배지에서 성장시켰다. 조직 배양 배지, 혈청 및 보충물은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)® (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 증식 검정 스크린 (도 1)을 위해, 세포를 384-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 화합물 또는 비히클 처리 하에 성장시켰다. 96시간 후, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 세포 함량을 근사화하였다. 샘플을 3회 반복 시험하고, 비히클-처리 대조 웰에 대한 처리된 샘플의 셀타이터-글로 원시 값으로 성장을 계산하였다.
녹다운 연구를 위해, NCI-H460 및 KNS62의 2가지 비소세포 폐암 세포주 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 버지니아주 마나사스)를 비-표적화 대조군 또는 PKMYT1 서열을 갖는 siRNA 풀 (스마트풀(SMARTpool), 다마콘(Dharmacon), 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠주 월섬)로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 48시간 후에 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고, 다음 날에 이를 화합물 또는 비히클로 72시간 동안 처리하였다. 세포 함량을 근사화하기 위해, 비아라이트(ViaLight) (론자(Lonza), 스위스 바젤)를 제조업체의 프로토콜에 따라 이용하였다. 샘플을 3회 반복으로 시험하고, 각각의 처리에 대한 대조군 원시 값의 백분율을 결정함으로써 성장을 계산하였다.
B. 웨스턴 블롯팅
세포를 포유동물 단백질 추출 시약 (MPER, 써모 피셔(Thermo Fisher) 78505, 매사추세츠주 월섬) 중에서 용해시키고, 이어서 SDS-PAGE에 적용하고, 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막 위로 옮겼다. 웨스턴 블롯팅에 사용된 항체는 하기 공급원으로부터의 것이었다: 전체 CDK1, pCDK1Y15, pCDK1T14, pCHK1S345, p스타트민S38, p라민A/CS22, pCDK 기질 모티프, γH2AX, 시클린 A, 및 전체 PKMYT1 - 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies) (매사추세츠주 비벌리); 액틴-HRP - 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) (캘리포니아주 산타 크루즈); 이차 HRP-접합 항-마우스 및 토끼 항체 - 지이 헬스케어(GE Healthcare) (위스콘신주 워케샤). 블롯을 슈퍼시그널 웨스트 펨토(SuperSignal West Femto) 화학발광 기질 (써모 피셔 피어스(Thermo Fisher Pierce), 매사추세츠주 월섬)에 노출시켰다.
C. 유동 세포측정법
DNA 이중 가닥 절단을 검출하기 위해, 세포를 FITC-접합 항-γH2AX (S139) 항체 (키트 17-344, 밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌러리카)로 염색하고, 빙냉 70% 에탄올 프로피듐 아이오다이드 (PI)/RNase 용액 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에서 밤새 고정시킨 후, 이를 사용하여 총 DNA 함량을 검출하였다. 조기 유사분열을 조사하는 연구를 위해, 항-pHH3-알렉사(Alexa) 647 항체 (BD 바이오사이언시스 558217)를 첨가하였다.
동기화 연구를 위해, 세포를 혈청-무함유 배지 중에서 36시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 20% FBS를 보충하였다. 각각의 수확 1시간 전에, 세포를 10 μM 브로모데옥시우리딘 (BrdU)으로 펄싱하였다. 세포를 고정시키고, BD 파밍겐(BD Pharmingen)™ FITC BrdU 플로우 키트 (BD 바이오사이언시스, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)의 지침에 따라 각각 항-BrdU FITC-접합 항체 및 7- 아미노악티노마이신-D (7-AAD) 염료를 사용하여 BrdU 및 DNA에 대해 염색하였다. 모든 세포측정 데이터를 BD LSR II 유동 세포측정기 상에서 BD FACS 디바(Diva)™ 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 이용하여 수집하고, 결과를 플루우조(FlowJo) 버전 7.5에서 분석하였다.
D. 생체내 효능 연구
5-6 주령의 CD-1 Nu/Nu 암컷 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories) (델라웨어주 윌밍톤)로부터 입수하고, 표준 실험실 조건에서 출원인의 동물 관리 시설에 수용하고, 2018S 오토클레이브가능 식이 (하를란 래보러토리즈(Harlan Laboratories), 인디애나주 인디애나폴리스) 및 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 프로토콜은 출원인의 내부 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 마우스에게 세포 (1:1 매트리겔(Matrigel):PBS)를 우측 측복부 내로 피하 (SC) 접종하였다. 종양 부피가 200 mm3 (+/-50)에 도달했을 때, 각각의 군이 유사한 평균 및 표준 편차를 갖도록 마우스를 쌍-매칭시켰다. 종양 부피 및 체중을 격주로 기록하였다. 비히클 또는 WEE1-1 (60 mpk)을 제공받는 마우스에게 2일 동안 1일 2회 투여 (BID)의 4회 처리 사이클을 제공하였다.
실시예 4
WEE1의 억제는 다양한 종양 세포주에서 세포 증식을 방해한다
유전자 표적화를 통한 마우스에서의 WEE1 발현의 손실은 치사적이며, 심지어 배아가 배반포 단계 (배아전 3.5일)에 도달하기 전에 발달을 방해한다. 이 표현형은 배아에서 아폽토시스 및 조기 유사분열을 유발할 뿐만 아니라 WEE1 유전자가 결핍된 마우스 배아 섬유모세포에서 DNA 손상을 유발한다 (Tominaga, Y., et al., J. Biol. Sciences, 2006, 2(4):161-170). 추가로, WEE1의 RNAi-매개 침묵은 다수의 형질전환된 인간 세포주에서 생존율 손상을 유발한다. WEE1-1은 WEE1의 강력한 ATP-경쟁적 억제제이고, 외인성 DNA 손상에 대해 암 세포를 감작화한다 (Hirai, H., et al., Mol. Cancer Ther., 2009, 8(11):2992-3000). 본 출원인은 상기 소분자 억제제를 사용하여 다양한 패널의 인간 종양 세포주에 걸쳐 WEE1의 약리학적 억제의 효과를 조사하였다 (도 1).
16개의 상이한 종양 유형을 나타내는 522개 암 세포주를 세포 증식 검정에서 WEE1-1로 스크리닝했을 때, 다양한 반응이 관찰되었다 (도 1). 시험된 세포주에 대한 EC50 값은 2% (9/522)가 ≤ 0.1 μM 내지 19% (98/522)가 ≥ 1μM 범위였다. 다양한 종양 유형의 평균 EC50 값의 비교는, 군으로서, 결장직장암 세포주가 WEE1-1 처리에 덜 감수성이었고 (평균 EC50 = 1.16 μM, n = 66, 0.17 내지 >10 μM 범위) 신경모세포종 종양 세포주가 평균에서 보다 감수성이었음을 (평균 EC50 = 0.28 μM, n = 7, 0.12 내지 0.45 μM 범위) 밝혀냈다. 후자의 군의 샘플 크기는 제한되었지만, 신경모세포종 세포가 WEE1 억제에 보다 반응성인 경향을 갖는다는 발견은 최근의 발견과 일치한다 (Russell et al., 제출된 원고). 많은 세포주가 심지어 더 높은 농도의 WEE1-1의 존재에도 불구하고 계속하여 성장하고 분열한다는 점이 주목할 만하였다. 이들 데이터는 약리학적 WEE1 억제의 항증식 잠재성 및 체액 종양 세포주 중에서의 다양성을 입증하였다.
실시예 5
WEE1 억제는 DNA 손상 반응을 활성화시킨다
기능적 게놈 스크린 및 확인 연구는 WEE1의 녹다운이 DNA 이중 가닥 절단 및 DNA 손상 반응 (DDR)의 활성화를 유발한다는 것을 입증하였다. 본 출원인은 WEE1-1에 대한 감수성이 다른 하기 6개의 세포주에서 WEE1의 약리학적 억제의 효과를 검사하기 위해 pCHK1S345를 활성화된 DDR의 마커로서 사용하였다: ES-2 (EC50 = 256 nM), A2058 (EC50 = 225 nM), A431 (EC50 = 170 nM), A427 (EC50 = 116 nM), KNS62 (EC50 = 487 nM), 및 NCI-H460 (EC50 = 535 nM). pCHK1S345에 대한 웨스턴 블롯은 모든 6개의 세포주에서의 DDR의 용량-의존성 활성화, 및 보다 감수성인 세포주, 즉 ES-2, A2058, A431 및 A427에서의 50 nM의 낮은 WEE1-1에 의한 pCHK1S345 증가의 증거를 입증하였다 (도 2a). WEE1-1 처리의 결과로서의 CDK 활성 상승은 ES-2 세포에서 확인되었다 (도 8a). 예상대로, pCDK1Y15의 동반 용량-의존성 감소가 또한 모든 6개의 세포주에서 관찰되었으며, 이는 DDR의 유도와 WEE1 억제의 결과로서의 상승된 CDK 활성 사이의 관련성을 제공한다. PKMYT1에 의한 T14에서의 CDK1 및 CDK2의 인산화는 또한 CDK1/2 키나제 활성을 손상시키는 것으로 공지되어 있으며, WEE1-1은 WEE1을 억제하는데 필요한 농도보다 대략 100배 더 높은 농도에서 시험관내에서 PKMYT1을 억제한다 (Hirai, H., et al., 2009). 본 출원인은 pCDK1T14 수준이 DNA 손상을 유도하는 WEE1-1 농도에 의해 영향을 받았는지의 여부에 대해 의문을 가졌다. A427 세포주의 가능성을 제외하고는, 본 출원인은 pCDK1T14에 대한 WEE1-1-의존성 효과를 관측하지 못했다 (도 2a).
실시예 6
WEE1 억제는 S-기 역학 및 DNA 복제 완전성을 방해한다
WEE1-1-의존성 DNA 손상이 어디에서 일어나는지를 이해하기 위해, 본 출원인은 유동 세포측정법에 의해 TOV21G 난소암 세포를 분석하였다. 지수적으로 성장하는 TOV21G 세포에서, 집단의 1% 내지 2%가 DNA 이중 가닥 절단 마커 γH2AX에 양성으로 염색되었다. 그러나, 2시간의 짧은 WEE1-1 처리로 세포의 23%가 γH2AX에 양성으로 염색되었다 (도 2b, 좌측 패널). γH2AX 양성 세포의 염색체 함량은 >2N이었으며, 이는 WEE1 억제로 인해 발생한 DNA 손상이 S-기에서 DNA 복제의 개시 동안에 또는 그 후에 일어난다는 것을 시사한다. TOV21G 세포를 WEE1-1로 처리하고 BrdU로 펄스-표지한 경우에, DNA 손상은 BrdU-양성 세포에서 거의 독점적으로 검출되었고 (2시간째에 95%, 6시간째에 92%), 이는 DNA 이중 가닥 절단이 DNA 복제 동안의 WEE1 억제의 결과라는 본 출원인의 관찰을 뒷받침한다 (도 2b, 우측 패널).
S-기에서의 염색체 절단이 DNA 복제 체크포인트를 활성화시키고 S-기를 통한 진행을 저속화시킬 것으로 예상하였다. 세포 동기화 연구를 수행하여 이 예상을 확인하였다. ES-2 세포주가 다른 세포주보다 혈청 고갈시 미토겐 회수에 의해 유도되는 G1 동기화에 더 순응성이었기 때문에 (데이터는 나타내지 않음), 이들 연구에 대해 이를 선택하였다. S-기 동기화에 대한 다른 접근법 (예를 들어 이중-티미딘 차단, 아피디콜린, 히드록시우레아, 악티노마이신 D 등)은 독립적으로 DNA 손상을 유도하고 DNA 복제의 역학을 방해할 수 있기 때문에, 이들 방법은 이용하지 않았다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 36시간 동안의 혈청 회수는 G1의 ES-2 세포를 완전히 정지시키지 않았다. 그러나, 20% FBS의 첨가는, 비히클-처리된 ES-2 세포에 있어서 그의 S-기 집단이 8시간째에 약 40%로, 12 내지 14시간째에 50%의 피크로 배가되도록 유도하였다. 대조적으로, 20% FBS의 첨가와 함께 WEE1-1 처리가 포함된 경우, 8시간째까지 S-기 집단에서 어떠한 검출가능한 변화도 없었고, 피크 수준 (약 50%)은 FBS-24시간 후까지 지연되었다 (도 3a). 심지어 그의 피크에서, 혼입된 BrdU의 평균 형광 강도는 비히클-처리된 세포와 비교하여 WEE1-1에서 훨씬 낮았으며, 이는 BrdU 양성 집단에서 DNA 복제가 저속화되었음을 시사한다. 도 3a에 나타낸 웨스턴 블롯 분석은 비히클-처리된 세포와 비교하여 WEE1-1-처리된 세포에서 지연된 S-기 진행 (시클린 A), DDR의 보다 신속하고 강건한 활성화 (pCHK1S345) 및 WEE1 키나제 활성의 억제 (pCDK1Y15)를 확인하였다. 흥미롭게도, pCDK1Y15의 인산화는 ES-2 세포에서 24시간에 걸쳐 증가하였다. WEE1-1 처리 24시간째에 유발된 DNA 이중 가닥 절단 (γH2AX)의 정도는 재자극되지 않은 세포와 비교하여 DNA 복제의 급격한 증가가 관찰된 미토겐 자극의 조건 하에 눈에 띄게 더 컸다 (도 3b 및 도 9).
실시예 7
WEE1 억제의 주요 세포독성 결과로서의 DNA 손상
WEE1은 각각 세포 주기의 S 및 G2 기에서의 CDK2 및 CDK1 키나제 둘 다의 일시적 활성화에 요구된다. 따라서, WEE1의 억제가 S 기 결함 (DNA 복제 동안의 DNA 이중 가닥 절단) 및 G2-M 결함 (조기 유사분열)을 유발할 것으로 예상하였다. 이들 효과 중 어느 하나 또는 둘 다가 WEE1-1에 대한 감수성에 필요하거나 충분할지의 여부를 평가하기 위해, γH2AX, 및 유사분열의 마커인 인산화 히스톤 H3 (pHH3)을 세포독성 (WEE1-1의 EC90 농도)에서, 3개의 감수성 세포주, A2058, HT-29 및 LoVo에서 검사하였다. WEE1-1을 사용한 처리 24시간 후에, pHH3 양성 세포의 백분율이 모든 3개의 세포주에서 증가하였다 (도 4). 3개 세포주 중, 단지 HT-29 세포만이 유의한 유사분열 집단을 함유하였고 (43%가 4N DNA를 함유하고 23%가 <4N DNA를 함유함), 이는 S-기 세포로부터 조기 유사분열이 DNA 복제를 완료하지 않았음을 나타낸다. 그러나, 유의한 H2AX -양성 세포 집단은 WEE1-1 처리 후에 모든 3개의 세포주에서 관찰되었다 (A2058에서 8%, HT-29에서 59%, LoVo에서 27%). 임의의 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 이들 데이터는 조기 유사분열 (pHH3)보다는 DNA 이중 가닥 절단 (γH2AX)의 유도가 감수성 세포주에서의 WEE1-1에 의한 WEE1 억제의 주요 세포독성 결과였음을 시사한다.
실시예 8
WEE1 억제로 인한 생체내 항종양 활성
허용 용량에서의 종양 성장에 대한 WEE1-1 단독요법 치료의 생체내 효과를 결정하기 위해, 최대 허용 용량 (MTD)을 1일 2회 (BID) 투여에 대해 kg당 60 mg으로 설정하였다. 상기 용량 및 스케줄로의 28-일 연구 과정에 걸친 평균 체중 감소는 처리군에서 5%를 초과하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). WEE1-1은 낮은 농도 (EC50 = 116 nM)에서 A427 비소세포 폐암 세포주의 증식을 억제하였고, DNA 손상 반응을 용이하게 유발하였다 (도 2a). A427 이종이식편 모델에서, WEE1-1 처리는 초기 평균 종양 부피의 대략 50%로의 퇴행을 유발하였다 (도 5a). 개별 종양 분석은 10개의 비히클 처리된 A427 종양 중 9개가 그의 출발 부피에 비해 2 내지 6배 성장했음을 보여주었다 (도 5b). 대조적으로, 모든 10개의 WEE1-1 처리된 종양의 경우 최종 부피는 그의 초기 부피보다 더 작았다 (도 5b). WEE1-1 단일 작용제 처리의 항종양 성장 효과가 추가의 이종이식편 모델에서 관찰되었다 (도 5c): 종양 성장 억제 (TGI)는 SK-MES-1 NSCLC 모델에서 92%, LoVo 결장직장 종양 모델에서 13% 종양 퇴행, A431 표피양 종양 모델에서 88% TGI, 및 NCI-H2122 NSCLC 모델에서 64% TGI였다. 퍼센트 TGI를 100 - (100 * ΔT/ΔC)로서 계산하였고, ΔT > 0인 경우에 ΔT = 처리군의 최종 평균 부피 - 초기 평균 부피이고, ΔC = 비히클 대조군의 최종 평균 부피 - 초기 평균 부피이다. 집합적으로, 이들 데이터는 WEE1-1의 우수 허용 용량에서의 WEE1 억제의 항종양 치료 잠재력을 입증하였다.
실시예 9
PKMYT1 발현은 WEE1 억제제에 대한 감수성에 영향을 미쳤다
WEE1 발현은 배아 생존율에 필수적이고 (Tominaga, Y., et al., 2006), 스크리닝된 대부분의 암 세포주는 WEE1-1을 사용한 치료에 대해 적어도 어느 정도의 감수성을 나타낸다 (도 1). 그러나, 모든 세포주가 WEE1 억제에 대해 동등하게 민감하지는 않았으며, 항증식 EC50은 적어도 10배 범위였다 (도 1). 본 출원인은 본원에서 WEE1 억제에 대한 감수성의 잠재적 결정인자가, 기능적으로 관련된 CDK-억제 키나제인 PKMYT1의 활성이라는 것을 밝혀냈다. 두 N-말단 부위 T14 또는 Y15 중 어느 하나에서의 CDK1 또는 CDK2의 인산화는 다른 활성화 시클린 결합 파트너 (각각 시클린 B 또는 시클린 A)의 존재에도 불구하고 상기 키나제의 불활성화를 유발하였다. WEE1은 CDK1 및 CDK2의 Y15를 인산화하는 것으로 공지되어 있고, PKMYT1은 T14 및/또는 Y15에서의 인산화를 통해 CDK1 및 CDK2를 유사하게 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Mueller, P.R., et al., Science, 1995, 270(5233):86-90).
본 출원인은 본원에서, PKMYT1 발현이 두 세포주 NCI-H460 및 KNS62에서 WEE1 억제에 대한 반응을 특이적으로 변경시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해 siRNA 녹다운을 이용하였다. 이들 세포주는 WEE1-1 처리에 대해 상대적으로 비감수성을 나타내고 상대적으로 높은 PKMYT1의 발현을 갖기 때문에 선택되었다 (데이터는 나타내지 않음). 모두 PKMYT1을 표적화하는 4개의 특징적 siRNA의 풀로 세포를 형질감염시키고, 다양한 세포독성제에 대한 감수성에 대하여 증식 검정으로 분석하였다 (도 6a). 도 6a에 도시된 바와 같이, PKMYT1이 녹다운되었을 때, NCI-H460 (n = 3) 및 KNS62 (n = 2)에 대한 WEE1-1 항증식 EC50은 각각 677 nM에서 104 nM로, 487 nM에서 93 nM로 이동하였다. 두드러지게, WEE1-1 처리의 최대 효과는 PKMYT1 고갈에 영향을 받지 않았다. 강화작용의 척도로서 EC50에서의 배수-변화의 이용시, PKMYT1은 WEE1-1을 평균 NCI-H460 세포 (n=3)에서 4.7배 및 KNS62 세포 (n=2)에서 4.9배 강화하였다. 카르보플라틴, MEK 억제제 (PD-0325901) 또는 독소루비신으로 처리된 대조군 (CT) 및 PKMYT1 siRNA 형질감염 세포 둘 다에서 동일한 용량 반응 곡선에 의해, WEE1-1에 대한 PKMYT1-의존성 감작의 특이성이 확인되었다 (도 6a). KNS62 세포의 웨스턴 블롯 분석 (도 6b)은, PKMYT1 녹다운이 Y15 상의 CDK1 및 2의 기저 인산화를 약간 낮추었고 T14 상의 기저 인산화를 현저하게 감소시켰음을 나타내었다 (레인 9 대 레인 1 및 5). PKMYT1의 녹다운은 또한 pCHK1S345 및 γH2AX 둘 다의 전반적 증가를 일으켰다. 이는, WEE1-1-매개 세포독성이 DNA 손상으로 인해 발생하였고 (도 4a 및 4b) PKMYT1 녹다운이 WEE1-1에 대한 감수성 및 그의 항증식 효과를 증가시켰다는 관찰 (도 6b)과 일치하였다.
PKMYT1 녹다운이 WEE1-1에 대한 감수성을 증가시킨다는 점에서, 본 출원인은 낮은 PKMYT1 발현이 또한 대부분의 WEE1-1-반응성 세포주를 예측할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설을 입증하기 위해, 브로드(Broad) 연구소 (매사추세츠주 캠브리지) 및 노파르티스(Novartis) 생의학 연구소 (매사추세츠주 캠브리지) 및 노파르티스 연구 재단의 게놈 연구소 (캘리포니아주 샌디에고) 사이의 공동작업의 공개적으로 이용가능한 세포주 데이터베이스인 브로드-노파르티스 암 세포주 백과사전 (CCLE)을 이용하여, PKMYT1 mRNA 수준에 대해 522개의 세포주 패널을 평가하였다 (Stransky, B. C., et al., Nature, 2012, 483:603-807). WEE1-1에 대한 감수성에 대해 검정된 522개의 암 세포주 중, 305개의 세포주의 PKMYT1에 대한 발현 데이터가 이용가능하였다. 450 nM의 WEE1-1에서 관찰된 세포주 반응 데이터에 대한, CCLE 데이터베이스로부터의 상대적 PKMYT1 발현의 플롯은 PKMYT1 mRNA와 WEE1-1 감수성 사이의 상관관계를 입증하지 못하였다 (도 7a). 그러나, 450 nM의 WEE1-1로 처리했을 때 사멸된 (조정된 스케일에 대해 < 0.25의 반응, 도 7a에 파선으로 나타냄) 33개의 세포주 중 24개 (73%)가 PKMYT1 mRNA에 대해 평균 발현 수준, 즉 413 ± 154 미만이었다.
PKMYT1 발현이 WEE1-1 감수성을 예측한다는 가설을 추가로 시험하기 위해, 앞서 WEE1-1로 처리하지 않았던 13개의 추가의 세포주를 CCLE 데이터베이스로부터 선택하였다. 이들 13개의 세포주에서의 WEE1-1에 대한 항증식 EC50 값은 PKMYT1의 mRNA 발현 (도 7b, 좌측 패널) 및 단백질 수준 (도 7b, 우측 패널) 둘 다와 상호관련되었다. 이들 데이터는 함께, 낮은 PKMYT1 발현이 WEE1-1 반응성 세포주, 즉 WEE1-1을 사용한 치료에 감수성인 세포주를 예측한다는 가설을 뒷받침한다.

Claims (14)

  1. (a) WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 환자로부터 채취한 암 세포를 포함하는 생물학적 샘플 및 대조 샘플에서 PKMYT1의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계, 및
    (b) 상기 환자 샘플에서의 유전자 발현 수준이 상기 대조 샘플에서의 수준 초과인지 미만인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 환자를 WEE1 억제제를 사용하여 치료하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대조 샘플이 무질환이거나 또는 WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 적이 없는 하나 이상의 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  6. (a) WEE1 억제제를 사용한 치료에 감수성인 암 환자로부터 채취한 암 세포를 포함하는 생물학적 샘플 및 대조 샘플에서 PKMYT1의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계, 및
    (b) 상기 환자 샘플에서의 유전자 발현 수준이 상기 대조 샘플에서의 수준 초과인지 미만인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, WEE1 억제제를 사용한 치료에 감수성인 암 환자를 치료하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대조 샘플이 무질환이거나 또는 WEE1 키나제 연관 암으로 진단된 적이 없는 하나 이상의 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 WEE1 억제제가 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 암이 유방암, 폐암, 췌장암, 결장암, 난소암, 급성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 WEE1 키나제 연관 암인 방법.
  12. 치료 유효량의 WEE1 억제제를 포함하는, WEE1 키나제 연관 암의 치료를 필요로 하는 WEE1 키나제 연관 암 환자를 치료하기 위한 제약 조성물이며, 여기서
    WEE1 억제제는 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 WEE1-2 또는 그의 제약상 허용되는 염이고,
    치료될 WEE1 키나제 연관 암 환자의 암 세포는 PKMYT1의 낮은 발현을 특징으로 하는 것인
    제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, WEE1 억제제가 WEE1-1 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제약 조성물.
  14. 생물학적 시험 샘플에서 PKMYT1의 발현 생성물을 검출할 수 있는 검출 작용제를 포함하는, WEE1 억제제를 사용한 치료에 감수성인 암 환자를 확인하기 위한 키트.
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