MX2015006729A - Composiciones y metodos para tratar cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento de cáncer asociado con la cinasa WEE1, administrando un inhibidor de WEE1, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1- 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar a un paciente con cáncer asociadó con la cinasa WEE1, que comprende administrar un inhibidor de WEE1, en donde las células cancerosas de dicho paciente que se va a tratar se caracterizan por bajos niveles de expresión de PKMYT1.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR CÁNCER CAMPO DELAINVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a la identificación de un biomarcador cuyo nivel de expresión es útil para predecir la respuesta de un paciente al tratamiento con un agente antiproliferativo, en particular un inhibidor de WEE1. El nivel de expresión del biomarcador puede usarse para predecir un paciente que presenta una condición cancerosa que es mediada por la inhibición de la apoptosis y quien es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de WEE1.

ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Muchos fármacos anticáncer usados comúnmente focalizan indiscriminadamente el ADN en las células en división, y causan finalmente daño al ADN. Esto, a su vez, desencadena la activación de los puntos de control del ciclo celular que detienen la progresión del ciclo celular (en las fases Gl, S o G2/M) con el propósito de que se permita tiempo para que el ADN sea reparado antes de que la célula sufra replicaclón del ADN o división. Desde un punto de vista terapéutico, la inhibición de las cinasas del punto de control que median la detención del ciclo celular podría forzar a las células tumorales a que continúen la división celular antes de que el daño del ADN químicamente inducido sea reparado, causando finalmente apoptosis o catástrofe mitótica (Medema, R. H. y Macurek, L, Oncoqene. 2012, 31(21): 2601-2613). Estudios de líneas de células apoyan esta hipótesis, y muestran quimiosensibilización y radiosensibilización por la alteración farmacológica o genética de la actividad de las cinasas del punto de control que incluyen a CHK1, WEE1, ATR y ATM. Los inhibidores contra estas cinasas están en varias etapas de desarrollo preclínico y clínico por su capacidad para sensibilizar a las células tumorales al daño terapéutico del ADN.

La cinasa de punto de control WEE1 cataliza una fosforilación inhibidora de CDK1 (CDC2) y CDK2 en la tirosina 15 (Parker, L. L. y Piwnica-Worms, H., Science. 1992, 257(5078): 1955-1957; Watanabe, N., et aL, Embo 1. 1995, 14(9): 1878-1891). La inhibición de CDK1 y CDK2 dependiente de WEE1 detiene el ciclo celular en respuesta al daño del ADN inducido extrínsecamente (Hamer, P. C. D., et ai, Clin. Cáncer Res. 2011, 17(13): 4200-4207). La actividad de WEE1 es también esencial para el ciclo celular no perturbado (Mcgowan, C. H. y Russell, P., Embo 3.. 1993, 12(1): 75-85; Tominaga, Y., et aL, Intl. 1 Biol. Sci.. 2006, 2(4): 161-170). Estudios de sincronización de las células en fibroblastos humanos normales, revelaron que cantidades similares de la proteína WEE1 se detectaron en las fases S y G2/M, pero que su más grande actividad estaba en la fase S del ciclo celular (Watanabe, N., 1995). Además, tras la expresión bloqueada condicional de WEE1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs), las células muestran evidencia de inestabilidad genómica, mal funcionamiento de los puntos de control y mitosis prematura (Tominaga, et aL, 2006). Este fenotipo fue explicado en parte por hallazgos recientes que demuestran una función crítica para WEE1 en la síntesis del ADN. La expresión suprimida de WEE1, en ausencia de agentes que dañan el ADN, llevó a la detección rápida y vigorosa de rompimientos de la doble cadena del ADN específicamente en las células en fase S que sufren replicación del ADN (Beck, H., etaL, 1 Cell Biol.. 2010, 188(5): 629-638; Dominguez-Kelly, R., etaL, 3. Cell Biol.. 2011, 194(4): 567-579). Los datos apoyan un modelo de estabilidad genómica dependiente de WEE1 en el cual la expresión suprimida o inhibición de WEE1 lleva a actividad aberrantemente alta de CDK1 y 2, dando como resultado la activación inapropiadamente regulada de excesivos orígenes de replicación del ADN que agotan rápidamente las reservas de nucleótidos, y lleva a horquillas de replicación inmovilizadas las cuales, en ausencia de actividad de WEE1, son substratos para las exonucleasas del ADN y se resuelven en rompimientos de la doble cadena del ADN (Beck, H., etaL, 2012).

Se cree que la actividad o expresión desregulada de WEE1 es un distintivo de la patología en varios tipos de cáncer. WEE1 es con frecuencia sobreexpresada en glioblastomas, y su actividad protege a este tipo de tumor de la catástrofe mitótica, de modo que los altos niveles de WEE1 están asociados con mal pronóstico (Mir, S. E., etaL, Cáncer Cell. 2010, 18(3): 244-257). Se encontró alta expresión de WEE1 en melanoma maligno, y se correlacionó con supervivencia deficiente libre de enfermedad en esta población (Magnussen, G. I., etaL, Píos One. 2012, 7(6)). La expresión aberrante de WEE1 ha sido implicada en tipos de tumores adicionales tales como carcinoma hepatocelular (Masaki, T., et aL, Hepatoloav. 2003, 37(3): 534-543), cáncer de mama (Iorns, E., et aL, Píos One. 2009, 4(4)), carcinoma de colon (Backert, S., et aL, Intl., J. Cáncer. 1999, 82(6): 868-874)), carcinoma de pulmón (Yoshida, T., et al., Annals of Oncoloqy. 2004, 15(2): 252-256) y carcinoma escamocelular de cabeza y cuello (Wu, Z. X., et aL, Mol. 8i Cell. Proteomics, 2011, 10(12)). Los tumores avanzados con un nivel incrementado de inestabilidad genómica pueden requerir puntos de control funcionales que permitan la reparación de dicho daño letal del ADN. Como tal, WEE1 representa un objetivo atractivo en tumores avanzados, en donde se cree que su inhibición resulta en daño irreparable del ADN (Sorensen, C. S. y Siljuasen, R. G., Nuc. Acids Res.. 2012, 40(2): 477-486).

Existe la necesidad por biomarcadores que puedan usarse para predecir qué pacientes están propensos al tratamiento con terapias específicas, en particular por pacientes quienes son no sensibles o quienes es probable que lleguen a ser refractarios a las terapias de primera línea. Por lo tanto, es un objetivo de esta invención proveer un biomarcador profético para seleccionar pacientes que responden probablemente al tratamiento con un inhibidor de WEE1.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente a la identificación de un biomarcador profético cuyo nivel de expresión es útil para evaluar y clasificar a pacientes para tratamiento con un inhibidor de WEE1. En una modalidad de la invención, el biomarcador profético, PKMYT1, se usa para identificar a pacientes que responden probablemente al tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1-1. En otra modalidad, la invención es un método para tratar a un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con WEE1 con un inhibidor de WEE1, en donde las células cancerosas de dicho paciente se caracterizan por baja expresión de PKMYT1. En otra modalidad, la invención es un método para tratar a un paciente con cáncer quien es sensible al tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde las células cancerosas de dicho paciente se caracterizan por un nivel de expresión de PKMYTl que está abajo del nivel de un valor de referencia. En otra modalidad, la invención es un método para identificar inhibidores de WEE1 para su uso en el tratamiento de un cáncer asociado con la cinasa WEE1. En otra modalidad, la invención es un kit para identificar a pacientes que responden probablemente al tratamiento con un inhibidor de WEE1, que comprende reactivos que reaccionan con PKMYTl.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una ilustración gráfica de la interrupción de la proliferación celular en diversas líneas de células tumorales por un inhibidor de WEE1. La proliferación sobre una ventana de 96 horas se puso a prueba por triplicado para 522 líneas de células cancerosas tratadas con la titulación de 9 puntos de WEE1-1. Los datos de la respuesta de las líneas de células se analizan en el tejido tumoral de origen y representados como viabilidad fraccional (respecto a células control tratadas con DMSQ) como una función de la concentración de WEE1-1.

Las figuras 2A y 2B son ilustraciones del daño del ADN en la fase S que resulta del tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde las células ES-2, A2058, A431, A427, KNS62 y NCI-H460 se trataron con DMSO (-) o concentraciones crecientes de WEE1-1 por 2 horas. Se analizaron los lisados de proteínas mediante Western blotting con anticuerpos contra CHK1S345 fosforilada, CDK1Y15 fosforilada, CDKl™ fosforilada o actina como un control de carga (figura 2A). Se trataron células TOV-21G con DMSO o WEE1-1 150 nM por hasta 2 o 6 horas (figura 2B). Las células fueron marcadas con pulsos una hora antes de la cosecha con BrdU que marca a las células en fase S que sufren activamente replicación del ADN. Las células se analizaron mediante citometría de flujo para rompimientos de la doble cadena del ADN (gH2AC) contra contenido de ADN total (figura 2B, paneles de la izquierda) o gH2AC contra absorción de BrdU (figura 2B, paneles de la derecha). El porcentaje de células que se tiñen con gH2AC representa la población de células que contienen rompimientos de la doble cadena del ADN, y se indica para cada condición de tratamiento y separada por el estado de Brdü en los paneles de la derecha.

Las figuras 3A a 3B y cuadro A son ilustraciones de las demoras en la progresión de la fase S que resultan del tratamiento con un inhibidor de WEE1. Se sincronizaron células ES-2 después de retiro del suero por 36 horas. En las figuras 3A y 3B, las células fueron estimuladas para reanudar la cielización con FBS a 20% en presencia añadida de vehículo (DMSO) en los campos 1 a 6, o WEE1-1 500 nM en los campos 7 a 11. Se indica el tiempo de la cosecha después de la estimulación con FBS. Una hora antes de la cosecha, las células fueron marcadas con pulsos con BrdU, y el porcentaje de células que se tiñen con BrdU se muestra en el panel superior. Los lisados de proteínas de las células ES-2 tratadas en paralelo se colectaron seguido de Western blotting con los anticuerpos indicados. En comparación con el control tratado con vehículo, el tratamiento con WEE1-1 demora la progresión a través de la fase S (figura 3A, panel superior, y figura 3B) y la absorción de BrdU en la fase S (figura 3A, panel superior), indicando un retardo de la replicación del ADN. El tratamiento con WEE1-1 demora la expresión de la ciclina A e induce señalización del daño del ADN como es puesto en evidencia por pChklS345 (figura 3A, panel inferior de la izquierda). La figura 3B muestra el análisis de la citometría de flujo en muestras seleccionadas (tratamientos por 4, 12 y 24 horas) de la parte A que compara la tinción con BrdU y el contenido de ADN.

Las figuras 4A y 4B ilustran que la mitosis prematura no es necesaria para inducir citotoxicidad con la inhibición de WEE1. Se trataron células A2058, HT-29 y LoVo por 24 horas con DMSO (- WE1-1) o WEE1-1 a concentraciones EC90 del fármaco. Se usó citometría de flujo para identificar la población de células positivas para el marcador mitótico histona H3 fosforilada (pHH3S10, figura 4A), o el marcador de los rompimientos de la doble cadena del ADN, gH2AC (figura 4B). En los paneles superiores, la entrada a la derecha indica la población mitótica esperada (contenido de ADN, 4N), y la entrada a la izquierda indica las células positivas para pHH3 con contenido de ADN menor de 4N.

Las figuras 5A a 5D son ilustraciones de la eficacia in vivo del tratamiento con el agente individual WEE1-1, en las cuales ratones que poseen el xenoinjerto A427 fueron dosificados con vehículo (metilcelulosa a 0.5%) o 60 mg/kg de WEE1-1. La dosificación del vehículo y el compuesto fue dos veces al día por 28 días consecutivos. Se tomaron volúmenes de tumores de xenoinjerto dos veces por semana, y se graficaron (volumen medio -/+ SEM) contra días de tratamiento para ratones tratados con vehículo (n = 10) y WEE1-1 (n = 10) (figura 5A). La figura 5B muestra el volumen final del tumor de xenoinjertos A427 individuales tratados por 28 días con vehículo o MK-1775. El volumen medio del tumor al inicio del estudio fue de 164 mm3, y es indicado por una línea a rayas. Las figuras 5C y 5D ilustran estudios de eficacia in vivo adicionales llevados a cabo en modelos de xenoinjerto SK-MES-1 (C) y LoVo (D) como se describió para la figura 5A, salvo que el tratamiento con WEE1-1 se interrumpió en el día 13 en el estudio del xenoinjerto LoVo (indicado por un asterisco) y los volúmenes de los tumores se midieron por otras 2 semanas.

Las figuras 6A y 6B ilustran que la expresión suprimida de PKMYT1 incrementó selectivamente la sensibilidad a WEE1-1, y redujo la fosforilación inhibidora de CDK1. La figura 6A ilustra que PKMYT1 fue suprimida en su expresión en dos líneas de células que exhiben resistencia relativa a WEE1-1, H460 y KNS62. Las células fueron transfectadas con reservas de ARNsi que contienen secuencias control (CT) o PKMYT1 sin focalización. Las células fueron tratadas con WEE1-1, carboplatino, un inhibidor de MEK (PD0325901) o doxorrubicina por 72 horas antes de la prueba para proliferación con la prueba de ATP ViaLight. La expresión suprimida de PKMYT1 disminuyó la EC50 de proliferación para WEE1-1 solo, pero no para los otros compuestos puestos a prueba. En la figura 6B, células KNS62 fueron transfectadas con reservas de ARNsi control (CT) o PKMYT1 sin focalización y tratadas con WEE1-1 400 nM por los tiempos indicados.

Las figuras 7A y 7B ilustran que la baja expresión de PKMYT1 intensificó la sensibilidad a WEE1-1. En la figura 7A, la expresión relativa de PKMYT1 (base de datos CCLE, Broad-Novartis) se gráfico contra la respuesta al tratamiento con WEE1-1 400 nM en 305 líneas de células, cada una representada por un sólo punto. La respuesta a WEE1-1 (eje x) es un valor ajustado basado en una prueba de proliferación de 96 horas, en donde un valor de 1 indica ningún cambio en la tasa de crecimiento respecto a las células tratadas con DMSO, y un valor de 0.25 (línea a rayas vertical) o menos indica una tasa de crecimiento negativa, o muerte celular. La expresión relativa media de PKMYT1 entre las 305 líneas de células, es 413. La figura 7B ilustra la respuesta proliferativa a WEE1-1, medida en valores de EC50 (pM), graficada contra la expresión relativa del ARNm de PKMYT1 (panel de la izquierda) o proteína PKMYT1 (panel de la derecha) para trece líneas de células no incluidas en el análisis en la figura 7A anterior.

Las figuras 8A y 8B ilustran que la inhibición de WEE1 por WEE1-1 lleva a actividad incrementada de CDK1 y 2. Células ES-2 fueron tratadas por 24 horas con DMSO o WEE1-1 250 nM, colectadas y lisadas para análisis Western blot. En la figura 8A, los lisados fueron sondeados con anticuerpos individuales contra el substrato de WEE1 (pCDKlY15), el marcador de DDR (pCHKls:M5) o los substratos de CDK1 y 2 (pStathminS38 y pLaminA/CS22, respectivamente). En la figura 8B, los lisados fueron sondeados con un anticuerpo del motivo CDK-substrato.

Las figuras 9A y 9B ilustran que el daño del ADN, inducido por el tratamiento con WEE1-1, requiere estimulación del mitógeno. Células ES-2 fueron privadas de suero por 36 horas, punto en el cual se dejaron no estimuladas o tratadas con FBS a 20%. Las células cultivadas bajo ambas condiciones recibieron DMSO o WEE1-1 500 nM por 24 horas antes de la colecta para el análisis por citometría de flujo del contenido de ADN (7-AAD) y los rompimientos de la doble cadena del ADN (gH2AC). La figura 9A ilustra un histograma de la distribución del ciclo celular. La figura 9B ilustra una gráfica de dispersión con entradas que indican la población de gH2AC. El porcentaje de células totales se indica en la fase del ciclo celular o como positivo para gH2AC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Muchos tratamientos anticáncer actúan dañando el ADN, lo cual inicia posteriormente la respuesta al daño del ADN (DDR) y activa a las cinasas de punto de control que detienen la división mientras el ADN es reparado. WEE1, una tirosina cinasa, es activada por la DDR para fosforilar e inhibir a las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) 1 y 2 y, como tal, detener la división celular. La inhibición de WEE1 potencia los tratamientos que dañan el ADN suprimiendo la detención del ciclo celular y la reparación apropiada del ADN.

WEE1-1, conocido también como 2-alil-1-[6-(l-hidroxi-l-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-l-il)fenil]amino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona, es un inhibidor de WEE1 (Hirai, H., et al., Mol. Cáncer Ther.. 2009, 8(11): 2992-3000) de pequeña molécula potente (IC5o = 5.2 nM) y selectivo competitivo por el ADN, que está actualmente bajo desarrollo clínico como un agente antitumoral en combinación con la quimioterapéutica de estándar de cuidado (SOC) (Stathis, A. y Oza A., Drua News & Perspectives. 2010, 23(7): 425-429; Schellens, J. H. M., eta/., Crin. Oncol. 2011, 29: 2011 (suplemento; resumen 3068); Mizuarai, S., eta!., Mol. Cáncer. 2009, 8: 34). Estudios previos sobre WEE1-1 han demostrado su potencial como un adyuvante o sensibilizador para la quimioterapéutica de estándar de cuidado (SOC) actualmente usada por su capacidad para forzar la mitosis no programada que da como resultado finalmente apoptosis o catástrofe mitótica (Hirai, H., et al., Cáncer Biol. & Ther.. 2010, 9(7): 514-522; Aarts, M., et al., Cáncer Discoverv. 2012, 2(6): 524-539; Indovina, P. y Giordano A., Cáncer Biol, &Ther.. 2010, 9(7): 523-525; Wang, Y. L., et al., Cáncer Biol. & Ther.. 2004, 3(3): 305-313). Sin embargo, el efecto terapéutico potencial de la inhibición de WEE1 en ausencia de la quimioterapia de SOC está menos definido. La expresión suprimida de WEE1 por el ARNi inhibió la proliferación de líneas de células cancerosas (Iorns, E., et aL, Cáncer Taraets. 2009. Píos One, 4(4); Murrow, L. M., et al., Breast Cáncer Research and Treatment. 2010, 122(2): 347-357), y recientemente se demostró que WEE1-1 solo puede inducir apoptosis en líneas de células de sarcoma tratadas ín vitro (Kreahling, J. M., et aL. Mol. Cáncer Ther.. 2012, 11(1): 174-182).

Los solicitantes demuestran en la presente que la inhibición farmacológica de WEE1 sola, a través del uso de WEE1-1 como un agente individual, fue citotóxica a través de un amplio panel de líneas de células tumorales, e indujo fuertemente rompimientos de la doble cadena del ADN. Notablemente, WEE1-1 indujo daño del ADN que fue independiente de la quimioterapia de SOC o la radioterapia, que ocurrió en las células en fase S, y que dependió de la replicación activa del ADN. A dosis toleradas, la terapia con el agente individual WEE1-1 lleva a la inhibición o regresión del crecimiento de tumores de xenoinjerto. La expresión suprimida de PKMYT1, una cinasa relacionada funclonalmente con WEE1, sensibilizó selectivamente a las células cancerosas a WEE1-1, pero no las sensibilizó a otros agentes citotóxicos. Como se describe en la presente, la expresión de PKMYT1 estuvo abajo del promedio en aproximadamente tres cuartas partes de las líneas de células cancerosas más sensibles a WEE1-1. La selección de líneas de células que tuvieran bajos niveles de expresión de PKMYT1 fue profética de la sensibilidad in vitro de estas líneas de células a WEE1-1. Considerados en conjunto, estos hallazgos proveen la base para el uso de la inhibición de WEE1 como una potente terapia anticáncer con un agente individual y el uso de la baja expresión de RKM'GGI para identificar y seleccionar a pacientes que responden más probablemente a la terapia con el agente individual WEE1-1.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a métodos para tratar cáncer con un inhibidor de WEE1, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE 1-2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, la invención se refiere a un biomarcador profético, PKMYT1, cuya expresión es sensible a la inhibición de WEE1 por un inhibidor de WEE1. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar a un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con la cinasa WEE1 que necesita tratamiento del mismo, con un inhibidor de WEE1, en donde las células cancerosas de dicho paciente se caracterizan por baja expresión de PKMYT1, y en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEEl-1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE 1-2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, la invención es un método para tratar a un paciente con cáncer que es sensible al tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde las células cancerosas de dicho paciente se caracterizan por un nivel de expresión de PKMYT1 que está abajo del nivel de un valor de referencia, y en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEEl-1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE 1-2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, la invención es un método para identificar inhibidores de PKMYT1 para su uso en el tratamiento de un cáncer asociado con la cinasa WEE1. En otra modalidad, la invención es un kit para identificar a pacientes que responden probablemente al tratamiento con un inhibidor de WEE1, que comprende reactivos que reaccionan con PKMYT1.

En una modalidad de la invención, el inhibidor de WEE1 es WEEl-1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra modalidad de la invención, el inhibidor de WEE1 se administra a una dosis entre 100 mg por día y 200 mg por día. En una modalidad de la invención, los inhibidores de WEE1 pueden ser dosificados dos veces al día durante el curso de dos y medio días (para un total de 5 dosis), o una vez al día durante el curso de dos días (para un total de 2 dosis).

El término "cáncer", como es referido en esta descripción, incluye varios sarcomas y carcinomas, e incluye cáncer sólido y cáncer hematopoyético. El cáncer sólido como es referido en la presente incluye, por ejemplo, cáncer de cerebro, cáncer cervicocerebral, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de vesícula biliar/conductos biliares, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, coriocarcinoma, cáncer del cuerpo del útero, cáncer uterocervlcal, cáncer de pelvis renal/uréter, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de testículos, cáncer fetal, tumor de Wilms, cáncer de piel, melanoma maligno, neuroblastoma, osteosarcoma, tumor de Ewing o sarcoma de partes blandas. Por otra parte, el cáncer hematopoyético incluye, por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica, policitemia vera, linfoma maligno, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin.

El término "cáncer asociado con la cinasa WEE1", como es referido en esta descripción, significa un cáncer asociado con la actividad o inhibición de cinasas WEE1 y que incluye, pero no está limitado a, cáncer de cerebro, cáncer cervicocerebral, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de vesícula biliar/conductos biliares, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, coriocarcinoma, cáncer del cuerpo del útero, cáncer uterocervical, cáncer de pelvis renal/uréter, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de testículos, cáncer fetal, cáncer de Wilms, cáncer de piel, melanoma maligno, neuroblastoma, osteosarcoma, tumor de Ewing, sarcoma de partes blandas, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica o linfoma de Hodgkin, o como sensibilizadores para quimioterapia o radioterapia de esos cánceres. En particular, el inhibidor de WEE1 de la invención es útil como remedio, por ejemplo, para cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica o linfoma de Hodgkin, o como sensibilizador para quimioterapia o radioterapia de esos cánceres.

El término "tratamiento de cáncer", como es referido en esta descripción, significa que un agente anticáncer se administra a un paciente con cáncer para inhibir el crecimiento de las células cancerosas en el paciente. De preferencia, el tratamiento resulta en alguna forma de regresión del crecimiento del cáncer, o que el tratamiento demora o previene la recidiva del cáncer. Más preferiblemente, el tratamiento da como resultado la desaparición completa del cáncer.

El término "paciente" o "sujeto", como es referido en esta descripción, significa el receptor que necesita de intervención médica o tratamiento. Se incluyen pacientes o sujetos mamíferos y no mamíferos.

El término "biomarcador profético", como es referido en esta descripción, significa un marcador genético cuya expresión se correlaciona con una respuesta a un agente terapéutico dado o clases de agentes terapéuticos dados. Como se usa en la presente, el término se refiere a PKMYT1, cuya expresión se correlaciona con el efecto terapéutico de un inhibidor de WEE1. En una modalidad en la presente, el inhibidor de WEE1 es WEE1-1.

El término "polinucleótidos derivados de marcadores", significa el ARN transcrito de un gen marcador, cualquier ADNc o ARNc producido del mismo, y cualquier ácido nucleico derivado del mismo, tal como un ácido nucleico sintético que tiene una secuencia derivada del gen que corresponde al gen marcador.

Los términos "control", "nivel de control", "nivel de referencia" o "nivel de referencia predeterminado" significan un nivel en la línea base separado, medido en una célula control comparable, la cual puede o no estar libre de enfermedad. Puede ser del mismo individuo o de otro individuo que es normal o no presenta la misma enfermedad de la cual se obtiene la muestra de prueba o de la enfermedad. De esta manera, el "valor de referencia" puede ser un valor absoluto, una escala de valores, un valor promedio, un valor mediano, un valor medio o un valor en comparación con un valor en la línea base o valor control particular. Un valor de referencia puede basarse en un valor de muestra individual, tal como un valor obtenido de una muestra de un individuo con un cáncer asociado con la cinasa WEE1, pero en un punto en el tiempo más temprano o antes del tratamiento, o un valor obtenido de una muestra de un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con la cinasa WEE1 diferente del individuo que está siendo puesto a prueba, o un individuo "normal", es decir, un individuo no diagnosticado con un cáncer asociado con la cinasa WEE1. El valor de referencia puede basarse en muchas muestras, tal como de pacientes múltiples diagnosticados con un cáncer mediado por la cinasa WEE1, o individuos normales, o basado en un grupo de muestras que incluyen o que excluyen la muestra que se va a poner a prueba.

El término "PKMYT1", como es referido en esta descripción, significa el gen que codifica para la cinasa inhibidora de CDK1 específica de treonina y tirosina asociada con la membrana, una proteína que es un miembro de la familia de la serina/treonina proteína cinasa (Liu, F., et al., Mol. Cell. Biol. 1997, 17(2): 571-583, cuya secuencia se expone en los números de secuencia de referencia del NCBI NM_004203 (SEQ ID NO: 1) y NP_004194 (SEQ ID NO: 2).

El término "baja expresión de PKMYT1" o "expresión baja de PKMYT1", como es referido en esta descripción, significa una célula, obtenida de una línea de células caracterizada como de un paciente diagnosticado con cáncer, que tiene menor expresión de ADN, ARNm o proteína de PKMYT1, o una disminución en el número de copias del gen de PKMYT1, en comparación con una célula, obtenida de una línea de células caracterizada como de un paciente no diagnosticado con cáncer, o una célula control.

Como se usa en la presente, los términos "medición de los niveles de expresión", "medición del nivel de expresión génica" u "obtención de un nivel de expresión", y similares, incluyen métodos que cuantifican el nivel de expresión génica objetivo ejemplificado por un transcrito de un gen, incluyendo microARN (ARNmi) o una proteína codificada por un gen, así como métodos que determinan si un gen de interés es expresado en lo absoluto. De esta manera, una prueba que provee un resultado de "sí" o "no" sin que necesariamente provea la cuantificación de una cantidad de expresión, es una prueba que "mide la expresión" como el término se usa en la presente. En forma alternativa, el término puede incluir cuantificar el nivel de expresión génica objetivo expresado en un valor cuantitativo, por ejemplo, un cambio en número de veces en la expresión, hacia arriba o hacia abajo, respecto a un gen control o respecto al mismo gen en otra muestra, o un logaritmo de la relación de expresión, o cualquier representación visual del mismo tal como, por ejemplo, un "mapa térmico", en donde la intensidad de un color es representativa de la cantidad de expresión génica detectada. Ejemplos de métodos para detectar el nivel de expresión génica incluyen, pero no están limitados a, Northern blotting, dot o slot blots, matriz de gen reportero (véase, por ejemplo, el documento US 5,569,588), protección ante nucleasas, RT-PCR, análisis de microdisposiciones, exhibición diferencial, SAGE (Velculescu et al., (1995), Science 270: 484-87), sistema digital para la expresión génica (véase los documentos W02007076128; W02007076129), prueba de ARNm multiplex (Tian et al., (2004), Nucleic Acids Res. 32: el26), PMAGE (Kim et al., (2007), Science 316: 1481-84), prueba de unión, selección, extensión y ligación mediada por ADNc (DASL, Bibikova, eta/., (2004), AJP 165: 1799-807), prueba multiplex de ADN ramificado (Flagella et ai, (2006), Anal. Biochem, 352: 50-60), electroforesis en gel bidimensional, SELDI-TOF, ICAT, prueba de enzimas, prueba de anticuerpos, y similares.

Inhibidores de WEE1 En una modalidad de la invención, el inhibidor de WEE1 de la presente invención es WEE1-1, cuya estructura es como se muestra a continuación: WEE1-1 es un inhibidor de WEE1, el cual es útil para el tratamiento de cáncer. WEE1-1 se conoce también como 2-alil-1-l-[6-(l-hidroxi-l-metiletil)piridin-2-il]-6-{[4-(4-metilpiperazin-l-il)fenil]am¡no}-1,2-d¡hidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona. Se ha descrito a WEE1-1 en la patente de los Estados Unidos No. 7,834,019, y en la publicación internacional del PCT WO2007/126122, WO 2007/126128 y W02008/153207, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Formas cristalinas de WEE1-1 se describen en la publicación de los Estados Unidos US2010-0124544 y en la publicación internacional del PCT WO2011/034743, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

En una modalidad de la invención, el inhibidor de WEE1 de la presente invención es WEEl-2, cuya estructura es como se muestra a continuación: WEEl-2 WEEl-2 es un inhibidor de WEE1, el cual es útil para el tratamiento de cáncer. WEEl-2 se conoce también como 3-(2,6-diclorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-l'H-espirotciciopropan-l^'-isoquinolinl-y'-i aminoj^^-dihidropirimidot^S-dlpirimidin^ 1HJ-ona. Se ha descrito a WEEl-2 en la publicación internacional del PCT W02008/153207 y en la publicación de los Estados Unidos US2011-0135601, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Formas cristalinas de WEEl-2 se describen en la publicación internacional WO2009/151997 y en la publicación de los Estados Unidos US2011-0092520.

Los compuestos de la presente invención pueden tener centros asimétricos, ejes quirales y planos quirales (como se describe en: E. L. Eliel y S. H. Wilen, Stereochemistry of Carbón Compounds, John Wilcy & Sons, New York, 1994, págs. 1119-1190), y ocurren como racematos, mezclas racémicas y como diastereómeros individuales, con todos los isómeros posibles y mezclas de los mismos, incluyendo isómeros ópticos, siendo incluida la totalidad de dichos estereoisómeros en la presente invención. Además, los compuestos descritos en la presente pueden existir como tautómeros, y se pretende que ambas formas tautómeras sean abarcadas por el alcance de la invención, aún cuando sólo una estructura tautómera se describa.

En los compuestos descritos en la presente invención, los átomos pueden exhibir sus abundancias isotópicas naturales, o uno o más de los átomos pueden ser enriquecidos artificialmente en un isótopo particular que tiene el mismo número atómico, pero una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa encontrado predominantemente en la naturaleza. Se pretende que la presente invención incluya todas las variaciones isotópicas adecuadas de los compuestos descritos en la presente. Por ejemplo, diferentes formas isotópicas de hidrógeno (H) incluyen protio (1H) y deuterio (2H). El protio es el isótopo de hidrógeno predominante encontrado en la naturaleza. El enriquecimiento para deuterio puede dar ciertas ventajas terapéuticas, tales como vida media in vivo creciente o reducción de los requerimientos de dosificación, o puede proveer un compuesto útil como un estándar para la caracterización de muestras biológicas. Los compuestos isotópicamente enriquecidos descritos en la presente pueden prepararse sin experimentación indebida mediante téenicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica, o mediante procedimientos análogos a los descritos en los esquemas y ejemplos usando en la presente intermediarios y/o reactivos isotópicamente enriquecidos apropiados.

Los inhibidores de WEE1 de la presente invención pueden existir también como varios cristales, sustancias amorfas, sales farmacéuticamente aceptables, hidratos y solvatos. Además, los inhibidores de WEE1 de la presente invención pueden proveerse como profármacos. En general, dichos profármacos son derivados funcionales de los inhibidores de WEE1 de la presente invención que pueden ser convertidos fácilmente en compuestos que son necesitados por los cuerpos vivos. Por consiguiente, en el método de tratamiento de varios cánceres en la invención, el término "administración" incluye no sólo la administración de un compuesto específico, sino también la administración de un compuesto el cual, después de haber sido administrado a los pacientes, puede ser convertido en el compuesto específico en los cuerpos vivos. Métodos convencionales para la selección y producción de derivados de profármaco adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985, cita que es referida en la presente y se incorpora enteramente en la presente como parte de la presente descripción. Los metabolitos del compuesto pueden incluir compuestos activos que se producen poniendo el compuesto en un ambiente biológico, y están dentro del alcance del compuesto en la invención.

Determinación de los niveles de expresión del biomarcador A. Métodos de medición de un biomarcador En una modalidad, la invención es un biomarcador profético, PKMYT1, cuya expresión es sensible a la inhibición de WEE1 por un inhibidor de WEE1. Los niveles de expresión del biomarcador profético en una muestra pueden determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. El nivel de expresión puede determinarse aislando y determinando el nivel (es decir, la cantidad) del ácido nucleico transcrito a partir del biomarcador. En forma alternativa o además, puede determinarse el nivel de proteínas específicas codificadas por el biomarcador.

El nivel de expresión de un biomarcador puede lograrse determinando la cantidad de ARNm, o polinucleótidos derivados del mismo, presentes en una muestra. Puede usarse cualquier método para determinar los niveles de ARN. Por ejemplo, se aísla ARN de una muestra, y se separa sobre un gel de agarosa. El ARN separado es transferido entonces a un soporte sólido, tal como un filtro. Sondas de ácido nucleico que representan uno o más marcadores son entonces hibrldadas con el filtro mediante hibridación Northern, y se determina la cantidad de ARN derivado del marcador. Dicha determinación puede ser visual, o facilitada por una máquina, por ejemplo, mediante el uso de un densitómetro. Otro método de determinación de los niveles de ARN es mediante el uso de un dot-blot o un slot-blot. En este método, ARN, o ácido nucleico derivado del mismo, de una muestra, es marcado. El ARN o ácido nucleico derivado del mismo es hibridado entonces con un filtro que contiene oligonucleótidos derivados de uno o más genes marcadores, en donde los oligonucleótidos son puestos sobre el filtro en sitios discretos fácilmente identificables. La hibridación, o falta de la misma, del ARN marcado, con los oligonucleótidos unidos al filtro, se determina visualmente o mediante un densitómetro. Los polinucleótidos pueden ser marcados usando una marca radiactiva o una marca fluorescente (es decir, visible).

La expresión de un gen biomarcador en muchos especímenes de tejido puede caracterizarse usando una "disposición de tejido" (Kononen et ai, Nat. Med. 1998, 4(7): 844-847). En una disposición de tejido, múltiples muestras de tejido pueden evaluarse en la misma microdisposición. La disposición de tejido permite la detección in situ de los niveles de ARN y proteína; secciones consecutivas permiten el análisis de muestras múltiples simultáneamente.

No se pretende que estos ejemplos sean limitativos, puesto que otros métodos de determinación de la abundancia de ARN se conocen en la téenica.

B. Microdisposiciones En algunas modalidades, pueden usarse microdisposiciones de polinucleótidos para medir la expresión, de modo que el estado de expresión de cada biomarcador se evalúe simultáneamente. Cuando se usa este método de medición, la microdisposición comprende de preferencia por lo menos 2, 3, 4, 5 o más biomarcadores, o la totalidad de los biomarcadores, o cualquier combinación de biomarcadores, identificados como informativos de la clasificación dentro de un subgrupo de sujetos. El número real de biomarcadores informativos que la microdisposición comprende variará, dependiendo de la condición de interés particular, el número de biomarcadores identificados y, opcionalmente, el número de biomarcadores informativos que se encuentra dan como resultado por lo menos un error de tipo I, error de tipo II, o error de tipo I y tipo II en la determinación de un fenotipo de punto de extremo. Como se usa en la presente, el "error de tipo I" significa un falso positivo y el "error de tipo II" significa un falso negativo; en el ejemplo de la predicción de la respuesta terapéutica de un paciente a la exposición a un inhibidor de CDK, el error de tipo I es la caracterización errónea de un individuo con una respuesta terapéutica a un inhibidor de CDK siendo no sensible al tratamiento con el inhibidor de CDK, y el error de tipo II es la caracterización errónea de un individuo sin respuesta al tratamiento con el inhibidor de CDK que tiene una respuesta terapéutica.

Cuando se usa en una modalidad específica, la invención provee disposiciones de polinucleótidos en las cuales los biomarcadores identificados para un subgrupo de sujetos particular, comprenden por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las sondas sobre dicha disposición. En otra modalidad específica, la microdisposición comprende una pluralidad de sondas, en donde dicha pluralidad de sondas comprende sondas complementarias e hibridables con por lo menos 75% de los biomarcadores informativos de la predicción/exposición al inhibidor de WEE1 identificados para un subgrupo de pacientes particular. Las microdisposiciones de la invención, de hecho, pueden comprender sondas complementarias a y que son capaces de hibridar con biomarcadores informativos de la evaluación/predicción del inhibidor de WEE1 para una pluralidad de los subgrupos de sujetos, o para cada subgrupo de sujetos, identificados para una condición particular. En fomento de la misma, una microdisposición de la invención comprende una pluralidad de sondas complementarias a y las cuales hibridan con por lo menos 75% de los biomarcadores informativos de la evaluación/predicción del inhibidor de WEE1 identificados para cada subgrupo de sujetos identificados para la condición de interés, y en donde dichas sondas, en total, son por lo menos 50% de las sondas en dicha microdisposición.

En otra modalidad específica, la microdisposición es una microdisposición de ADNc disponible comercialmente que comprende por lo menos dos biomarcadores identificados mediante los métodos descritos en la presente. De preferencia, una microdisposición de ADNc disponible comercialmente comprende todos los biomarcadores identificados mediante los métodos descritos en la presente siendo informativos para un subgrupo de pacientes para una condición particular. Sin embargo, dicha microdisposición puede comprender por lo menos 1, 2, 3, 4 o 5 de dichos marcadores, hasta el número máximo de marcadores identificados.

Cualquiera de las microdisposiciones descritas en la presente, puede proveerse en un contenedor sellado en un kit.

C. Polinucleótidos usados para medir los productos del biomarcador profético Se contemplan también polinucleótidos capaces de unirse específicamente o selectivamente a los transqritos de ARNm que codifican para el biomarcador profético de polipéptidos, PKMYT1, de la invención. Por ejemplo, oligonucleótidos, ADNc, ADN, ARN, productos de PCR, ADN sintético, ARN sintético, u otras combinaciones de nucleótidos de ocurrencia natural o modificados que hibridan específicamente y/o selectivamente con uno o más de los productos de ARN del biomarcador profético de la invención, son útiles de conformidad con la invención.

En una modalidad preferida, se usan los oligonucleótidos, ADNc, ADN, ARN, productos de PCR, ADN sintético, ARN sintético u otras combinaciones de nucleótidos de ocurrencia natural o modificados que hibridan específicamente y/o selectivamente con uno o más de los productos de ARN del biomarcador profético de la invención.

Para determinar el nivel de expresión (alto o bajo) de PKMYT1 en la práctica de la presente invención, puede usarse cualquier método conocido en la téenica. En una modalidad de la invención, se usa la expresión basada en la detección de ARN que híbrida con el gen identificado y descrito en la presente. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante cualquier método de amplificación o detección de ARN conocido o reconocido como equivalente en la técnica tal como, pero no limitado a, transcripción inversa-PCR, y métodos para detectar la presencia, o ausencia, de secuencias que estabilizan o desestabilizan el ARN.

En forma alternativa, puede usarse la expresión basada en la detección del estado del ADN. La detección del ADN de un gen identificado puede usarse para genes que tienen expresión incrementada en correlación con un resultado particular. Esto puede llevarse a cabo fácilmente mediante métodos basados en PCR conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, Q-PCR. A la inversa, la detección del ADN de un gen identificado como amplificado puede usarse para genes que tienen expresión incrementada en correlación con un resultado de tratamiento particular. Esto puede llevarse a cabo fácilmente mediante métodos basados en PCR, hibridación fluorescente ¡n s/¾/(FISH) e hibridación de cromosomas ¡n 5/¾/(CISH) conocidos en la técnica.

D. Técnicas para medir los productos de ARN de un biomarcador 1. PCR en tiempo real En la práctica, una prueba de expresión basada en la expresión génica basada en un pequeño número de genes, es decir, aproximadamente 1 a 3000 genes, puede llevarse a cabo con relativamente poco esfuerzo usando la tecnología de PCR en tiempo real cuantitativa existente conocida por los laboratorios clínicos. La PCR en tiempo real cuantitativa mide la acumulación del producto de PCR a través de una sonda fluorógena doblemente marcada. Puede usarse una variedad de métodos de normalización, tales como un competidor interno para cada secuencia objetivo, un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen de mantenimiento. Puede aislarse suficiente ARN para la PCR en tiempo real a partir de bajas cantidades en miligramos de un sujeto.

Pueden usarse ahora cielizadores térmicos cuantitativos con tarjetas microfluídicas precargadas con reactivos que hacen que el uso clínico de rutina de las pruebas basadas en la expresión de genes múltiples sea un propósito real.

Los marcadores de genes del biomarcador profético inventivo o un subgrupo de los mismos, los cuales se ponen a prueba de conformidad con la presente invención, están típicamente en la forma de ARN total o ARNm o ARNm o ARN total transcrito en forma inversa. Métodos generales para la extracción de ARNm y total son bien conocidos en la téenica y se describen en libros de texto estándar de biología molecular, que incluyen Ausubel et a!., Current Protocols of Molecular Biologv. John Wilcy and Sons (1997). El aislamiento del ARN puede llevarse a cabo también usando un kit de purificación, serie de reguladores de pH y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen (Valencia, CA) y Ambion (Austin, TX), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La PCR en tiempo real cuantitativa TAQman puede llevarse a cabo usando reactivos de PCR disponibles comercialmente (Applied Biosystems, Foster City, CA) y equipo, tal como el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sistema consiste de un termociclizador, rayo láser, dispositivo acoplado a carga (CCD), cámara y computadora. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 cavidades o 384 cavidades en un termociclizador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por el rayo láser es colectada en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todas las 96 cavidades, y detectada en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para el análisis de los datos.

Con base en el biomarcador profético identificado en la presente invención, puede usarse una prueba TAQman de PCR en tiempo real para obtener mediciones de la expresión génica, y llevar a cabo los métodos de clasificación descritos en la presente. Como es evidente para los expertos en la técnica, una amplia variedad de iniciadores de oligonucleótidos y sondas que son complementarias a o que hibridan con el biomarcador profético de la invención, pueden seleccionarse con base en la secuencia de transcritos del biomarcador profético. 2. Hibridación de la disposición El polinucleótido usado para medir los productos de ARN de la invención puede usarse como miembros de ácido nucleico asociados establemente con un soporte que comprende una disposición de conformidad con un aspecto de la invención. La longitud de un miembro de ácido nucleico puede variar de 8 a 1000 nucleótidos de longitud, y se selecciona de modo que sea específica para los productos de ARN del biomarcador profético de la invención. En una modalidad, estos miembros son selectivos para los productos de ARN de la invención. Los miembros de ácido nucleico pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena, y/o pueden ser oligonucleótidos o fragmentos de PCR amplificados a partir de ADNc. De preferencia, los oligonucleótidos son de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos de longitud. Los ESTs son de preferencia de 100 a 600 nucleótidos de longitud. Los expertos en la téenica entenderán que pueden usarse porciones de las regiones expresadas del biomarcador profético de la invención, como una sonda en la disposición. Más particularmente, son útiles oligonucleótidos complementarios a los genes de la invención y ADNc o ESTs derivados de los genes de la invención. Para disposiciones basadas en oligonucleótidos, la selección de oligonucleótidos que corresponden al gen de interés los cuales son útiles como sondas, es bien entendida en la técnica. Más particularmente, es importante elegir regiones que permitan la hibridación con los ácidos nucleicos objetivo. Factores tales como la Tm del oligonucleótido, el por ciento de contenido de GC, el grado de estructura secundaria y la longitud del ácido nucleico, son factores importantes. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,551,784. 3. Construcción de una disposición de ácido nucleico En los métodos propuestos, una disposición de miembros de ácido nucleico asociados establemente con la superficie de un soporte, es puesta en contacto con una muestra que comprende ácidos nucleicos objetivo bajo condiciones de hibridación suficientes para producir un patrón de hibridación de complejos de objetivo/miembros de ácido nucleico complementarios en el cual uno o más miembros de ácido nucleico complementarios en posiciones únicas en la disposición hibridan específicamente con ácidos nucleicos objetivo. La identidad de los ácidos nucleicos objetivo que hibridan puede determinarse con relación a la ubicación de los miembros de ácido nucleico en la disposición.

Los miembros de ácidos nucleico pueden producirse usando técnicas establecidas tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la transcripción inversa (RT). Estos métodos son similares a los conocidos actualmente en la técnica (véase, por ejemplo, PCR Strateaies. Michael A. Innis (editor), et al., 1995, v PCR: Introduction to Biotechniaues Series. C. R. Newton, A. Graham, 1997). Los ácidos nucleicos amplificados son purificados mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, purificación en columna o precipitación con alcohol). Un ácido nucleico es considerado puro, cuando ha sido aislado de modo que está sustancialmente libre de iniciadores y los productos incompletos producidos durante la síntesis del ácido nucleico deseado. De preferencia, un ácido nucleico purificado estará también sustancialmente libre de contaminantes que pueden Impedir o de otra manera enmascarar la actividad de unión específica de la molécula.

Una disposición, de conformidad con un aspecto de la invención, comprende una pluralidad de ácidos nucleicos unidos a una superficie de un soporte a una densidad que excede 20 ácidos nucleicos diferentes/cm2, en donde cada uno de los ácidos nucleicos está unido a la superficie del soporte en una región pre-seleccionada no idéntica (por ejemplo, una microdisposición). Cada muestra asociada en la disposición comprende una composición de ácido nucleico, de identidad conocida, usualmente de secuencia conocida, como se describe en mayor detalle más adelante. Cualquier substrato concebible puede usarse en la invención.

En una modalidad, el ácido nucleico unido a la superficie del soporte es ADN.. En una modalidad, el ácido nucleico unido a la superficie del soporte es ADNc o ARN. En otra modalidad, el ácido nucleico unido a la superficie del soporte es ADNc sintetizado mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Usualmente, un miembro de ácido nucleico en la disposición, de conformidad con la invención, es de por lo menos 10, 25, 50 o 60 nucleótidos de longitud. En una modalidad, un miembro de ácido nucleico es de por lo menos 150 nucleótidos de longitud. De preferencia, un miembro de ácido nucleico es menor de 1000 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, un miembro de ácido nucleico es menor de 500 nucleótidos de longitud.

En las disposiciones de la invención, las composiciones de ácido nucleico están asociadas establemente con la superficie de un soporte, en donde el soporte puede ser un soporte flexible o rígido. Por el término "asociado establemente", se entiende que cada miembro de ácido nucleico mantiene una posición única respecto al soporte bajo las condiciones de hibridación y lavado. Como tal, las muestras están asociadas establemente no covalentemente o covalentemente con la superficie del soporte. Ejemplos de asociación no covalente incluyen adsorción no específica, unión basada en interacciones electrostáticas (por ejemplo, interacciones de par de iones), interacciones hidrofóbicas, Interacciones de unión por enlaces de hidrógeno, unión específica a través de un miembro de un par de unión específico unido covalentemente a la superficie del soporte, y similares. Ejemplos de unión covalente incluyen enlaces covalentes formados entre los ácidos nucleicos y un grupo funcional presente sobre la superficie del soporte rígido (por ejemplo, -OH), en donde el grupo funcional puede estar ocurriendo naturalmente o puede estar presente como un miembro de un grupo de enlace introducido, como se describe en mayor detalle más adelante.

La cantidad de ácido nucleico presente en cada composición será suficiente para proveer hibridación y detección adecuada de las secuencias de ácido nucleico objetivo durante la prueba en la cual se usa la disposición. En general, la cantidad de cada miembro de ácido nucleico asociado establemente con el soporte de la disposición es de por lo menos aproximadamente 0.001 ng, de preferencia por lo menos aproximadamente 0.02 ng, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 0.05 ng, en donde la cantidad puede ser tan alta como 1000 ng o mayor, pero usualmente no excederá aproximadamente 20 ng. En donde el miembro de ácido nucleico es "salpicado" sobre el soporte en una mancha que comprende una dimensión circular general, el diámetro de la "mancha" variará en general de aproximadamente 10 a 5,000 mm, usualmente de aproximadamente 20 a 2,000 pm, y más usualmente de aproximadamente 100 a 200 pm.

Miembros de ácido nucleico control pueden estar presentes en la disposición, incluyendo miembros de ácido nucleico que comprenden oligonucleótidos o ácidos nucleicos que corresponden a ADN genómico, genes de mantenimiento, secuencias de vector, secuencias de ácido nucleico de plantas, genes control positivos y negativos, y similares. Los miembros de ácido nucleico control son genes control o de calibración cuya función no es decir si un gen de interés "clave" particular es expresado, sino más bien proveen otra información útil, tal como el nivel de expresión basal o de fondo.

Otros ácidos nucleicos control son salpicados sobre la disposición, y usados como ácidos nucleicos control de la expresión objetivo y nucleótidos control de no apareamiento para monitorear la unión no específica o la hibridación cruzada con un ácido nucleico en la muestra diferente del objetivo hacia el cual la sonda es dirigida. Las sondas de no apareamiento indican de esta manera si una hibridación es específica o no. Por ejemplo, si el objetivo está presente, las sondas perfectamente apareadas deben ser consistentemente más brillantes que las sondas no apareadas. Además, si todos los no apareamientos control están presentes, las sondas de no apareamiento se usan para detectar una mutación.

Numerosos métodos pueden usarse para la unión de los miembros de ácido nucleico de la invención al substrato (un procedimiento referido como "salpicado o manchado"). Por ejemplo, los ácidos nucleicos son unidos usando las téenicas de, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,807,522, la cual se incorpora en la presente como referencia para la enseñanza de métodos de unión de polímeros. En forma alternativa, el salpicado puede llevarse a cabo usando la tecnología de impresión por contacto, como es sabido en la técnica.

La medición de la expresión del producto de ARN de la invención puede hacerse usando aquellos polinucleótidos que sean específicos y/o selectivos para los productos de ARN de la invención, para cuantificar la expresión del producto de ARN. En una modalidad específica de la invención, los polinucleótidos que son específicos y/o selectivos para los productos de ARN, son sondas o iniciadores. En una modalidad, estos polinucleótidos están en la forma de sondas de ácido nucleico las cuales pueden ser salpicadas sobre una disposición, para medir el ARN de la muestra de un individuo que se va a medir. En otra modalidad, pueden usarse disposiciones comerciales para medir la expresión del producto de ARN. En otra modalidad, los polinucleótidos que son específicos y/o selectivos para los productos de ARN de la invención, se usan en la forma de sondas e iniciadores en técnicas tales como RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando, por ejemplo, SYBR®Green, o usando las técnicas TaqMan® o Molecular Beacon (guía molecular), en donde los polinucleótidos usados se usan en la forma de un iniciador delantero, un iniciador inverso, una sonda marcada con TaqMan o una sonda marcada con Molecular Beacon.

En modalidades en donde sólo un gen o dos genes se va a analizar, el ácido nucleico derivado de la célula muestra puede ser amplificado de preferencia mediante el uso de iniciadores apropiados, de modo que sólo los genes que van a ser analizados sean amplificados para reducir las señales de fondo de otros genes expresados en la célula de mama. En forma alternativa, y en donde genes múltiples van a ser analizados o en donde se usan muy pocas células (o una célula), el ácido nucleico de la muestra puede ser amplificado globalmente antes de la hibridación con los polinucleótidos inmovilizados. De hecho el ARN, o la contraparte de ADNc del mismo, pueden ser marcados directamente y usados, sin amplificación, mediante métodos conocidos en la téenica. 4. Uso de una microdisposición Una "microdisposición", es una disposición lineal o bidimensional de regiones de preferencia discretas, cada una teniendo un área definida, formada sobre la superficie de un soporte sólido tal como, pero no limitado a, vidrio, plástico o membrana sintética. La densidad de las regiones discretas en una microdisposición se determina mediante el número total de polinucleótidos inmovilizados que se detectarán sobre la superficie de un soporte de fase sólida individual, de preferencia por lo menos aproximadamente 50/cm2, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 100/cm2, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 500/cm2, pero de preferencia abajo de aproximadamente 1,000/cm2. De preferencia, las disposiciones contienen menos de aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500 o aproximadamente 3000 polinucleótidos inmovilizados en total. Como se usa en la presente, una microdisposición de ADN es una disposición de oligonucleótidos o polinucleótidos puestos sobre un chip u otras superficies usadas para hibridar con polinucleótidos amplificados o clonados de una muestra. Puesto que se conoce la posición de cada grupo de iniciadores particular en la disposición, las identidades de los polinucleótidos. de una muestra pueden determinarse con base en su unión a una posición particular en la microdisposición.

La determinación de los niveles de expresión génica puede lograrse usando microdisposiciones. En general, pueden estar implicados los siguientes pasos: (a) obtener una muestra de ARNm de un sujeto, y preparar ácidos nucleicos marcados de la misma (los "ácidos nucleicos objetivo" u "objetivos"; (b) poner en contacto los ácidos nucleicos objetivo con una disposición bajo condiciones suficientes para que los ácidos nucleicos objetivo se unan a las sondas correspondientes en la disposición, por ejemplo, mediante hibridación o unión específica; (c) remoción opcional de los objetivos no unidos de la disposición; (d) detectar los objetivos unidos; y (e) analizar los resultados, por ejemplo, usando métodos de análisis basados en computadora. Como se usa en la presente, las "sondas de ácido nucleico" o "sondas", son ácidos nucleicos unidos a la disposición, mientras que los "ácidos nucleicos objetivo" son ácidos nucleicos que son hibridados con la disposición.

Un espécimen de ácido nucleico puede obtenerse de un sujeto que se va a poner a prueba usando medios de muestreo "invasivos" o "no invasivos". Se dice que un medio de muestreo es "invasivo", si implica la colecta de ácidos nucleicos desde dentro de la piel o los órganos de un animal (incluyendo un animal murino, humano, ovino, equino, bovino, porcino, canino o felino). Ejemplos de un medio de muestreo invasivo, incluyen colecta de sangre, colecta de semen, biopsia con aguja, aspiración pleural o biopsia de cordón umbilical. Ejemplos de dichos métodos son discutidos por Kim, et aL, J. Virol. 1992, 66: 3879-3882, Biswas, et ai, Ann. NY Acad. Sci., 1990, 590: 582-583, y Biswas, etal., J. Clin. Microbiol. 1991, 29: 2228-2233.

En contraste, un medio de muestreo "no invasivo", es uno en el cual las moléculas de ácido nucleico se recuperan de una superficie interna o externa del animal. Ejemplos de un medio de muestreo "no invasivo", incluyen "hisopado" o colecta de lágrimas, saliva, orina, materia fecal, o similares.

En una modalidad de la presente invención, una o más células, es decir, una muestra, de un sujeto que se va a poner a prueba se obtienen, y se aísla ARN de las células. Es posible también obtener una muestra de células de un sujeto, y entonces enriquecer la muestra para un tipo de célula deseado. Por ejemplo, pueden aislarse células de otras células usando una variedad de téenicas, tales como el aislamiento con un anticuerpo que se une a un epítope sobre la superficie de la célula del tipo de célula deseado. En donde las células deseadas están en un tejido sólido, pueden disectarse células particulares, por ejemplo, mediante microdisección o mediante microdisección por captura de rayo láser (LCM) (véase, por ejemplo, Bonner, et aL, Science. 1997, 278: 1481, Emmert-Buck, etal., Science. 1996, 274: 998, Fend, etal, Am. J. Path.. 1999, 154: 61 y Murakami, etal.. Kidnev Hit.. 2000, 58: 1346.

Puede extraerse ARN de muestras de tejido o de células mediante una variedad de métodos, por ejemplo, lisis con tiocianato de guanidinio seguida de centrifugación con CsCI (Chirgwin, et aL, Biochemistrv. 1979, 18: 5294-5299). Puede obtenerse ARN de células individuales como se describe en los métodos para preparar colecciones de ADNc a partir de células individuales (véase, por ejemplo, Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 1998, 36: 245 y Jena, etal., J. Immunol Methods. 1996, 190: 199).

La muestra de ARN puede ser enriquecida adicionalmente para una especie particular. En una modalidad, por ejemplo, puede aislarse ARN poli(A)+ de una muestra de ARN. En otra modalidad, la población de ARN puede ser enriquecida para secuencias de interés mediante síntesis de ADNc específica del iniciador, o rondas múltiples de amplificación lineal basadas en la síntesis de ADNc, y transcripción ín vitro dirigida por el molde (véase, por ejemplo, Wang, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1989, 86: 9717; Dulac, et al., véase anteriormente; Jena, et al., véase anteriormente). Además, la población de ARN, enriquecida o no en especies o secuencias particulares, puede ser amplificada adicionalmente mediante una variedad de métodos de amplificación, que incluyen PCR, reacción en cadena de ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu y Wallace, Genomics. 1989, 4: 560; Landegren, et a/., Science. 1988, 241: 1077), replicación de secuencias auto-sostenida (SSR) (véase, por ejemplo, Guatelli, et a!., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1990, 87: 1874), amplificación de secuencias basada en ácido nucleico (NASBA) y amplificación por transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh, eta/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1989, 86: 1173). Métodos para la teenología de PCR son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, PCR TechnoloQv: Principies and Applications for DNA Amplification. ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila, et a/., Nucleic Acids Res.. 1991, 19: 4967; Eckert, et aL, PCR Methods and Applications. 1991, 1: 17; PCR. eds. McPherson et aL, IRL Press, Oxford; y la patente de los Estados Unidos No. 4,683,202). Métodos de amplificación son descritos, por ejemplo, por Ohyama, et al., BioTechniaues. 2000, 29: 530; Luo, et aL, Nat. Med., 1999, 5: 117; Hegde, et al., BioTechniaues. 2000, 29: 548; Kacharmina, et al., Meth. Enzvmol. 1999, 303: 3; Livescy, eta/., Curr. Biol. 2000, 10: 301; Spirin, et al., Invest. Qphtalmol. Vis. Sci.. 1999, 40: 3108; y Sakai, et al., Anal. Biochem.. 2000, 287: 32. La amplificación del ARN y la síntesis de ADNc pueden llevarse a cabo también en células ¡n situ (véase, por ejemplo, Eberwine, eta!., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1992, 89: 3010).

En otra modalidad de la invención, la totalidad o parte de una secuencia de marcador descrita puede amplificarse y detectarse mediante métodos tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y variaciones de la misma tales como, pero no limitadas a, PCR cuantitativa (Q-PCR), transcripción inversa-PCR (RT-PCR) y PCR en tiempo real, opcionalmente RT-PCR en tiempo real. Dichos métodos utilizarían uno o dos iniciadores que son complementarios a porciones de una secuencia descrita, en donde los iniciadores se usan para iniciar la síntesis del ácido nucleico.

Los ácidos nucleicos recién sintetizados son opcionalmente marcados, y pueden ser detectados directamente o mediante hibridación con un polinucleótido de la invención.

Las moléculas de ácido nucleico pueden ser marcadas para permitir la detección de la hibridación de las moléculas de ácido nucleico con una microdisposición. Es decir, la sonda puede comprender un miembro de un sistema que produce señales y de esta manera, es detectable, ya sea directamente o a través de la acción combinada con uno o más miembros adicionales de un sistema que produce señales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser marcados con un dNTP marcado con fluorescencia (véase, por ejemplo, Kricka, Nonisotopic DNA Probe Techniaues. Academic Press San Diego, Calif., 1992), dNTPs biotinilados o rNTP seguido de la adición de estreptavidina marcada, marcadores quimioluminiscentes o isótopos. Otro ejemplo de marcadores incluye "porciones moleculares", como se describe en Tyagi y Kramer, Nature Biotech.. 1996, 14: 303. Los ácidos nucleicos recién sintetizados pueden ser puestos en contacto con polinucleótidos (que contienen secuencias) de la invención, bajo condiciones que permitan su hibridación. La hibridación puede determinarse también, por ejemplo, mediante resonancia de plasmones (véase, por ejemplo, Thiel, etal, Anal. Chem.. 1997, 69: 4948).

En una modalidad, una pluralidad, por ejemplo, dos series de ácidos nucleicos objetivo, son marcados y usados en una reacción de hibridación ("análisis multiplex"). Una serie de ácidos nucleicos puede corresponder a ARN de una célula, y otra serie de ácidos nucleicos puede corresponder a ARN de otra célula. La pluralidad de series de ácidos nucleicos puede ser marcada con diferentes marcadores, tales como diferentes marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína y rodamina), los cuales tienen espectros de emisión distintos, de modo que pueden distinguirse. Las series pueden ser entonces mezcladas e hibridadas simultáneamente con una microdisposición (véase, por ejemplo, Shena, etal., Science. 1995, 270: 467-470).

Muchas configuraciones de microdisposiciones diferentes y métodos para su producción son conocidos por los expertos en la téenica, y se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5,700,637; 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674; y 6,156,501; y en Shena, et al., Tibtech 16: 301, 1998; Duggan, etal., Nat. Genet. 21: 10, 1999; Bowtell, etal., Nat. Genet. 21: 25, 1999; Lipshutz, etal., 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et ai, 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et a!., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; y Hughes, et a!., Nat. Biotechol. (2001) 19: 342; cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Patentes que describen métodos de uso de las disposiciones en varias aplicaciones, incluyen las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; y 5,874,219; cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia.

En una modalidad, una disposición de oligonucleótidos puede sintetizarse sobre un soporte sólido. Ejemplos de soportes sólidos incluyen vidrio, plásticos, polímeros, metales, metaloides, cerámicas, substratos orgánicos, etc. Mediante el uso de las tecnologías de enmascaramiento de chips y la química fotoprotectora, es posible generar disposiciones ordenadas de sondas de ácido nucleico. Estas disposiciones, las cuales se conocen, por ejemplo, como "chips de ADN" o disposiciones de polímero inmovilizado a escala muy grande (disposiciones "VLSIPS®"), pueden incluir millones de regiones definidas de la sonda sobre un substrato que tiene un área de aproximadamente 1 cm2 hasta varios cm2, incorporando de esta manera de unas cuantas sondas hasta millones de sondas (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,631,734).

Para comparar los niveles de expresión, los ácidos nucleicos marcados pueden ser puestos en contacto con la disposición bajo condiciones suficientes para la unión entre el ácido nucleico objetivo y la sonda en la disposición. En una modalidad, las condiciones de hibridación pueden seleccionarse para proveer el nivel deseado de especificidad de la hibridación; es decir, condiciones suficientes para que ocurra la hibridación entre los ácidos nucleicos marcados y las sondas en la microdisposición.

La hibridación puede llevarse a cabo en condiciones que permitan una hibridación esencialmente específica. La longitud y el contenido de GC del ácido nucleico determinarán el punto de fusión térmico y de esta manera, las condiciones de hibridación necesarias para obtener la hibridación específica de la sonda con el ácido nucleico objetivo. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la téenica, y pueden ponerse a prueba también en pruebas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos puede encontrarse en Tijssen, et a , Laboratorv Techniaues in Biochemistrv and Molecular Bioloav. Vol. 24: Hvbridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993.

Los métodos descritos anteriormente darán como resultado la producción de patrones de hibridación de los ácidos nucleicos objetivo marcados sobre la superficie de la disposición. Los patrones de hibridación resultantes de los ácidos nucleicos marcados pueden visualizarse o detectarse en una variedad de formas, con la manera de detección particular seleccionada con base en el marcador particular del ácido nucleico objetivo. Medios de detección representativos incluyen conteo de escintilación, autorradiografía, medición de fluorescencia, medición calorimétrica, medición de la emisión de luz, dispersión de luz, y similares.

Uno de dichos métodos de detección utiliza un explorador de disposiciones que está disponible comercialmente (Affymetrix, Santa Clara, Callf), por ejemplo, el desplegador 417®, el explorador de disposiciones 418® o el explorador de Agilent GeneArray®. Este explorador es controlado desde la computadora de un sistema con una interfaz y herramientas de software fáciles de usar. El resultado puede ser importado directamente en o leído directamente por una variedad de aplicaciones de software. Ejemplos de dispositivos de exploración se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,143,854 y 5,424,186.

Dosificación v vías de administración Con respecto a los inhibidores de WEE1 de la invención, pueden seleccionarse varias formas de preparación, y ejemplos de las mismas incluyen preparaciones orales tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos o líquidos, o preparaciones parenterales líquidas esterilizadas tales como soluciones o suspensiones, supositorios, ungüentos, y similares. Los inhibidores de WEE1 están disponibles como sales farmacéuticamente aceptables. Los inhibidores de WEE1 de la invención se preparan con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

El término "sal farmacéuticamente aceptable", como es referido en esta descripción, significa una sal ordinaria farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, cuando el compuesto tiene un grupo hidroxilo, o un grupo ácido tal como un grupo carboxilo y un grupo tetrazolilo, entonces puede formar una sal básica de adición en el grupo hidroxilo o el grupo ácido; o cuando el compuesto tiene un grupo amino o un grupo heterocíclico básico, entonces puede formar una sal ácida de adición en el grupo amino o el grupo heterocíclico básico.

Las sales básicas de adición incluyen, por ejemplo, sales de metal alcalino tales como sales de sodio y sales de potasio; sales de metal alcalinotérreo tales como sales de calcio y sales de magnesio; sales de amonio; y sales de aminas orgánicas tales como sales de trimetilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina, sales de etanolamina, sales de dietanolamina, sales de trietanolamina, sales de procaína y sales de N,N'-dibenciletilendiamina.

Las sales ácidas de adición incluyen, por ejemplo, sales de ácidos inorgánicos tales como clorhidratos, sulfatos, nitratos, fosfatos y percloratos; sales de ácidos orgánicos tales como maleatos, fumaratos, tartratos, citratos, ascorbatos y trifluoroacetatos; y sulfonatos tales como metansulfonatos, isetionatos, bencensulfonatos y p-toluensulfonatos.

El término "vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable" se refiere a excipientes (por ejemplo, grasas, cera de abejas, polioles líquidos y semisólidos, aceites naturales o hidrogenados, etc.), agua (por ejemplo, agua destilada, agua particularmente destilada para inyección, etc.), solución salina fisiológica, alcohol (por ejemplo, etanol), glicerol, polioles, solución acuosa de glucosa, manitol, aceites vegetales, etc.) y aditivos (por ejemplo, agente de dilución, agente de desintegración, aglutinante, lubricante, agente mojante, estabilizador, emulsionante, dispersante, conservador, edulcorante, colorante, condimento o aromatizador, agente de concentración, diluyente, sustancia reguladora de pH, solvente o agente de solubilización, agente químico para lograr efecto de almacenamiento, sal para modificar la presión osmótica, agente de revestimiento o antioxidante, o similares).

Pueden obtenerse preparaciones sólidas en las formas de tableta, cápsula, gránulo y polvo sin aditivo alguno, u obtenidas usando vehículos (aditivos) apropiados. Ejemplos de dichos vehículos (aditivos) pueden incluir sacáridos tales como lactosa o glucosa; almidón de maíz, trigo o arroz; ácidos grasos tales como ácido esteárico; sales inorgánicas tales como aluminato-metasilicato de magnesio o fosfato de calcio anhidro; polímeros sintéticos tales como polivinilpirrolidona o polialquilenglicol; alcoholes tales como alcohol estearílico o alcohol bencílico; derivados de celulosa sintéticos tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etllcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa; y otros aditivos usados convencionalmente, tales como gelatina, talco, aceite vegetal y goma arábiga.

Estas preparaciones sólidas tales como tabletas, cápsulas, gránulos y polvos pueden contener generalmente, por ejemplo, 0.1 a 100% en peso, y de preferencia 5 a 98% en peso, del inhibidor de WEE1, con base en el peso total de cada preparación.

Se producen preparaciones líquidas en las formas de suspensión, jarabe, inyección e infusión para goteo (fluido intravenoso) usando aditivos apropiados que se usan convencionalmente en preparaciones líquidas, tales como agua, alcohol o un aceite derivado de plantas tales como aceite de soya, aceite de cacahuate y aceite de ajonjolí.

En particular, cuando la preparación se administra parenteralmente en la forma de una inyección intramuscular, inyección intravenosa o inyección subcutánea, el solvente o diluyente apropiado puede ser ejemplificado por agua destilada para inyección, una solución acuosa de clorhidrato de lidocaína (para inyección intramuscular), solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, líquido para inyección intravenosa (por ejemplo, una solución acuosa de ácido cítrico, citrato de sodio, y similares), o una solución electrolítica (para infusión para goteo intravenoso e inyección intravenosa), o una solución mixta de las mismas.

Dicha inyección puede estar en una forma de una solución preliminarmente disuelta, o en una forma de polvo per se o polvo asociado con un vehículo (aditivo) adecuado, el cual se disuelve al momento del uso. El líquido para inyección puede contener, por ejemplo, 0.1 a 10% en peso de un ingrediente activo con base en el peso total de cada preparación.

Preparaciones líquidas tales como una suspensión o jarabe para administración oral pueden contener, por ejemplo, 0.1 a 10% en peso de un ingrediente activo con base en el peso total de cada preparación.

Cada preparación en la invención puede ser obtenida por el experto en la téenica de acuerdo con métodos convencionales o técnicas comunes. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una preparación, si la preparación es una preparación oral, por ejemplo, mezclando una cantidad apropiada del compuesto de la invención con una cantidad apropiada de lactosa, y vertiendo esta mezcla en cápsulas de gelatina duras las cuales son adecuadas para la administración oral. Por otra parte, puede llevarse a cabo la preparación, si la preparación que contiene al compuesto de la invención es una inyección, por ejemplo, mezclando una cantidad apropiada del compuesto de la invención con una cantidad apropiada de solución salina fisiológica a 0.9% y vertiendo esta mezcla en viales para inyección.

Los componentes de esta invención pueden administrarse a mamíferos, incluyendo humanos, ya sea solos o en combinación con vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en una composición farmacéutica, de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Los componentes pueden administrarse oralmente o parenteralmente, incluyendo las vías de administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, rectal y tópica.

Dosificaciones adecuadas son conocidas por los médicos generales y dependerán, de hecho, del estado de enfermedad particular, la actividad específica de la composición que está siendo administrada, y el paciente particular que sufre el tratamiento, En algunos casos, para lograr la cantidad terapéutica deseada, puede ser necesario proveer una administración repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis medida o monitoreada particular, en donde las administraciones individuales se repiten hasta que se logre el efecto o la dosis diaria deseada. Más información acerca de dosificaciones adecuadas, se provee a continuación.

El término "administración" y variantes del mismo (por ejemplo, "administrar" un compuesto) con relación a un componente de la invención, significa introducir el componente o un profármaco del componente en el sistema del animal que necesita de tratamiento. Cuando un componente de la invención o profármaco del mismo se provee en combinación con uno o más de otros agentes activos (por ejemplo, el inhibidor de WEE1), se entiende que cada "administración" y sus variantes incluyen la introducción concurrente y secuencial del componente o profármaco del mismo y otros agentes.

Como se usa en la presente, se pretende que el término "composición" abarque un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, significa aquella cantidad de compuesto o agente farmacéutico activo que induce una respuesta biológica o medicinal en un tejido, sistema, animal o humano, que está siendo buscada por un investigador, veterinario, médico u otro médico clínico. Esto incluye la terapia de combinación que implica el uso de agentes terapéuticos múltiples, tales como una cantidad combinada de un primer y segundo tratamiento, en donde la cantidad combinada logrará la respuesta biológica deseada. La respuesta biológica deseada es inhibición, demora o prevención total o parcial del progreso del cáncer que incluye metástasis del cáncer; inhibición, demora o prevención de la recidiva de cáncer que incluye metástasis del cáncer; o la prevención del inicio o desarrollo de cáncer (quimioprevención) en un mamífero, por ejemplo, un humano.

Una cantidad adecuada de un inhibidor de WEE1 se administra a un paciente que sufre tratamiento por cáncer. En una modalidad, un inhibidor de WEE1 se administra en dosis que varían de aproximadamente 100 mg por día a 250 mg por día. En una modalidad de la invención, un inhibidor de WEE1 se administra dos veces al día, durante el curso de dos y medio días, para un total de 5 dosis. En otra modalidad de la invención, un inhibidor de WEE1 se administra una vez al día durante el curso de dos días, para un total de 2 dosis.

En una modalidad de la invención, un inhibidor de WEE1 puede administrarse 5 veces por semana. En otra modalidad de la invención, un inhibidor de WEE1 puede administrarse 2 veces por semana.

Indicaciones En una modalidad, la invención en la presente es un método de tratamiento de un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con WEE1 con un inhibidor de WEE1, en donde dicho paciente se caracteriza porque tiene baja expresión de PKMYT1. El inhibidor de WEE1 de la invención tiene un efecto inhibidor de cinasa, especialmente un efecto inhibidor de la cinasa WEE1 y, como tal, es por lo tanto útil como un remedio para varios cánceres asociados con la cinasa WEE1. Ejemplos de un cáncer asociado con la cinasa WEE1 incluyen, pero no están limitados a, cáncer de cerebro, cáncer cervicocerebral, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de vesícula biliar/conductos biliares, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de ovario, coriocarcinoma, cáncer del cuerpo del útero, cáncer uterocervical, cáncer de pelvis renal/uréter, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de testículos, cáncer fetal, cáncer de Wilms, cáncer de piel, melanoma maligno, neuroblastoma, osteosarcoma, tumor de Ewing, sarcoma de partes blandas, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica o linfoma de Hodgkin, o como sensibilizadores para quimioterapia o radioterapia de esos cánceres.

En particular, el inhibidor de la invención es útil como remedio, por ejemplo, para cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica o linfoma de Hodgkin, o como sensibilizador para la quimioterapia o radioterapia de esos cánceres.

Además del tratamiento de los cánceres anteriores asociados con la cinasa WEE1, el inhibidor de WEE1 puede ser también útil para el tratamiento de los siguientes cánceres: Cardiaco: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma; pulmón: carcinoma broncogénico (escamocelular, de células pequeñas indiferenciadas, de células grandes indiferenciadas, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronqulolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; gastromtestinal: esófago (carcinoma escamocelular, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma), colon, colorrectal, rectal; del tracto urogenital: riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia), vejiga y uretra (carcinoma escamocelular, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); hígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; hueso: sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células del retículo), mieloma múltiple, cordoma, tumor maligno de células gigantes, osteocronfroma (exostosis osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteoide y tumores de células gigantes; sistema nervioso: cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformante), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); ginecológico: útero (carcinoma endometrial), cerviz (carcinoma cervical, displasia cervical pre-tumor), ovario (carcinoma de ovario [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma no clasificado], tumores de células de la teca-granulosa, tumores de células de Sertoli-Lcydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma escamocelular, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de células claras, carcinoma escamocelular, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), trompas de Falopio (carcinoma); hematológico: sangre (leucemia mieloide [aguda y crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin [linfoma maligno]; y giel: melanoma maligno, carcinoma de células básales, carcinoma escamocelular, sarcoma de Kaposi, nevo displásico pigmentoso, lipoma, angioma y dermatofibroma. De esta manera, el término "célula cancerosa", como se provee en la presente, incluye una célula afectada por cualquiera de las condiciones identificadas anteriormente.

Incluido además dentro del alcance de la invención, es un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en la cual la angiogénesis está implicada, el cual comprende administrar a un mamífero que necesita de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de la presente invención. Las enfermedades neovasculares oculares son un ejemplo de condiciones en donde gran parte del daño resultante al tejido puede atribuirse a la infiltración aberrante de vasos sanguíneos en el ojo (véase el documento WO 2000/30651). La infiltración no deseable puede ser desencadenada por retinopatía isquémica, tal como la que resulta de retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, oclusiones de venas retinianas, etc., o por enfermedades degenerativas, tales como la neovascularización coroidal observada en la degeneración macular relacionada con la edad. La inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos mediante la administración de los presentes compuestos, prevendría por lo tanto la infiltración de los vasos sanguíneos, y prevendría o trataría enfermedades en donde la angiogénesis está implicada, tales como enfermedades oculares tales como la vascularización retiniana, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, y similares.

Incluido además dentro del alcance de la invención, es un método de tratamiento o prevención de una enfermedad no maligna en la cual la angiogénesis está implicada incluyendo, pero no limitada a, enfermedades oculares (tales como vascularización retiniana, retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad), aterosclerosis, artritis, psoriasis, obesidad y enfermedad de Alzheimer (Dredge, etal., Expert Opin. Biol. Ther., 2002, 2(8): 953-966). En otra modalidad, un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en la cual la angiogénesis está implicada incluye: enfermedades oculares (tales como vascularización retiniana, retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad), aterosclerosis, artritis y psoriasis.

Incluido además dentro del alcance de la invención, es un método de tratamiento de trastornos hiperproliferativos tales como restenosis, inflamación, enfermedades autoinmunes y alergia/asma.

Incluido además dentro del alcance de la invención, es el uso de la presente combinación para revestir stents y, por lo tanto, el uso de los presentes compuestos en stents revestidos para el tratamiento y/o prevención de restenosis (véase el documento WO 2003/032809).

Incluido además dentro del alcance de la invención, es el uso de la presente combinación para el tratamiento y/o prevención de osteoartritis (véase el documento WO 2003/035048).

Incluido además dentro del alcance de la invención, es un método de tratamiento de hipoinsulinismo.

Ejemplificando la invención, es el uso del inhibidor de WEE1 descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer asociado con WEE1.

Agentes anticáncer adicionales El inhibidor de WEE1 administrado en los métodos de la presente invención es también útil en combinación con agentes terapéuticos, quimioterapéuticos y anticáncer adicionales. Otra combinación con un inhibidor de WEE1 de la presente invención con agentes terapéuticos, quimioterapéuticos y anticáncer, está dentro del alcance de la invención. Ejemplos de dichos agentes pueden encontrarse en Cáncer Principies and Practice of Oncoloqy por V. T. Devita y S. Hellman (editores), 6a. edición (febrero 15 de 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. El experto en la téenica sería capaz de discernir qué combinaciones de agentes serían útiles con base en las características particulares de los fármacos y el cáncer implicado. Dichos agentes adicionales incluyen los siguientes: moduladores del receptor de estrógeno, moduladores del receptor de andrógeno, moduladores del receptor retinoide, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antiproliferativos, inhibidores de prenil-proteína transferasa, inhibidores de HMG-CoA reductasa y otros inhibidores de angiogénesis, inhibidores de la proteasa del VIH, inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores de la proliferación celular y señalización de supervivencia, bisfosfonatos, inhibidores de aromatasa, terapéuticas con ARNsi, inhibidores de g-secretasa, agentes que interfieren con tirosina cinasas receptoras (RTKs) y agentes que interfieren con los puntos de control del ciclo celular. La combinación del inhibidor de mTOR y el antagonista de la integrina anb3 de la presente invención, puede ser particularmente útit cuando se co-administra con radioterapia.

Los "moduladores del receptor de estrógeno" se refieren a compuestos que interfieren con o inhiben la unión del estrógeno al receptor, sin tener en cuenta el mecanismo.

Ejemplos de moduladores del receptor de estrógeno incluyen, pero no están limitados a, tamoxifeno, raloxifeno, idoxifeno, LY353381, LY117081, toremifeno, fulvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-1-oxopropox¡-4-metil-2-[4-[2-(l-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-l-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-dimetilpropanoato, 4,4'-dihidroxibenzofenona-2,4-dinitrofenil-hidrazona y SH646.

Los "moduladores del receptor de andrógeno" se refieren a compuestos que interfieren o inhiben la unión de andrógenos al receptor, sin tener en cuenta el mecanismo. Ejemplos de moduladores del receptor de andrógeno incluyen finasterida y otros inhibidores de 5a-reductasa, nilutamida, flutamida, bicalutamida, liarozol y acetato de abiraterona.

Los "moduladores del receptor retinoide" se refieren a compuestos que interfieren o inhiben la unión de los retinoides al receptor, sin tener en cuenta el mecanismo. Ejemplos de dichos moduladores del receptor retinoide incluyen bexaroteno, tretinoína, ácido 13-cis-retinoico, ácido 9-cis-retinoico, a-difluorometilornitina, ILX23-7553, trans-N-(4'-hidroxifenil) retinamida y N-4-carboxifenil retinamida.

Los "agentes citotóxicos/citostáticos" se refieren a compuestos que causan muerte celular o inhiben la proliferación celular principalmente interfiriendo directamente con el funcionamiento de la célula, o que inhiben o interfieren con la mitosis celular, incluyendo agentes alquilizantes, factores de necrosis tumoral, intercaladores, compuestos activables por hipoxia, inhibidores de microtúbulos/agentes estabilizadores de microtúbulos, inhibidores de cinesinas mitóticas, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de cinasas implicadas en la progresión mitótica, inhibidores de cinasas implicadas en las vías de transducción de señales de atocinas y factor de crecimiento, antimetabolitos, modificadores de respuesta biológica, agentes terapéuticos hormonales/anti-hormonales, factores de crecimiento hematopoyético, agentes terapéuticos focalizados por anticuerpos monoclonales, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de proteosomas, inhibidores de ubiquitina ligasa e inhibidores de aurora cinasa.

Ejemplos de agentes citotóxicos/citostáticos incluyen, pero no están limitados a, sertenef, caquectina, ifosfamida, tasonermina, lonidamina, carboplatino, altretamina, prednimustina, dibromodulcitol, ranimustina, fotemustina, nedaplatino, oxaliplatino, temozolomida, heptaplatino, estramustina, tosilato de improsulfán, trofosfamida, nimustina, cloruro de dibrospidio, pumitepa, lobaplatino, satraplatino, profiromicina, cisplatino, irofulven, dexifosfamida, cis-aminodicloro(2-metil-piridinjplatino, bencilguanina, glufosfamida, GPX100, tetracloruro de (trans, trans, trans)-bis-mu-(hexan-l,6-diamino)-mu-[diamino-platino(II)]bis[diamino(cloro)platino (II)], diarizidinilespermina, trióxido arsénico, l-(ll-dodecilamino-10-hidroxiundecil)-3,7-dimetilxantina, zorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, bisantreno, mitoxantrona, pirarrubicina, pinafida, valrrubicina, amrrubicina, antineoplastona, 3'-desamino-3'-morfolino-13-desoxo-10-hidroxicarminomicina, ana icina, galarrubicina, elinafida, MEN10755, 4-demetoxi-3-desamino-3-aziridin¡l-4-metilsulfonil-daunorrubicina (véase el documento WO 00/50032), inhibidores de Raf cinasa (tal como Bay43-9006) e inhibidores de mTOR, tales como ridaforolimus, everolimus, temsirolimus, sirolimus o un análogo de rapamicina.

Un ejemplo un compuesto activado por hipoxia es tirapazamina.

Ejemplos de inhibidores de proteosomas incluyen, pero no están limitados a, lactacistina y MLN-341 (Velcade).

Ejemplos de agentes inhibidores de microtúbulos/estabilizadores de microtúbulos incluyen paclitaxel, sulfato de vindesina, 3',4'-didehidro-4'-desoxi-8'-norvincaleucoblastina, docetaxol, rizoxina, dolastatina, isetionato de mivobulina, auristatina, cemadotina, RPR109881, BMS184476, vinflunina, criptoficina, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoxifenil)bencensulfonamida, anhidrovinblastina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-prolil-L-prolina-t-butilamida, TDX258, las epotilonas (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,284,781 y 6,288,237) y BMS188797. En una modalidad, las epotilonas no se incluyen en los agentes inhibidores de microtúbulos/estabilizadores de microtúbulos.

Algunos ejemplos de inhibidores de topoisomerasa son topotecan, hicaptamina, ¡rinotecan, rubitecan, 6-etoxipropionil-3’,4'-O-exo-benciliden-cartreusina, 9-metoxi-N,N-dimetil-5-nitropirazolo[3,4,5-kl]acridino-2-(6H)propanamina, l-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H^H-benzotdelpiranotS'^b^j-indolizinotl^bjquinolino-lC^O gi-^lSI-Odiona, lurtotecan, 7-[2-(N-isopropilamino)etil]-(20S)camptotecina, BNP1350, BNP11100, BN80915, BN80942, fosfato de etopósido, tenipósido, sobuzoxano, 2'-dimetilamino-2’-desox¡-etopósido, GL331, N-[2- (dimetilamino)etil]-9-hidroxi-5,6-dimetil-6H-plrido[4,3-b]carbazol-1-carboxamida, asulacrina, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(dimetiiamino)etil]-N-metilamino]etil]-5-[4-hidrooxi-3,5-dimetoxifenil]-5,5a,6,8,8a,9-hexohidrofuro(3',4':6,7)nafto(2,3-d)-1,3-dioxol-6-ona, 2,3-(metilendioxi)-5-metil-7- h¡drox¡-8-metox¡benzo[c]-fenantr¡din¡o, 6,9-bis[(2-aminoetil)amino]benzo[g]isoquinolino-5,10-diona, 5-(3-ammopropilamino)-7,10-dihidroxi-2-(2-hidroxietilaminometil)-6H-pirazolo[4,5,l-de]acridifi-6-ona, N-[l-[2(d¡etilam¡no)et¡lam¡no]-7-metoxi-9-oxo-9H-tioxanten-4-¡lmet¡l]formam¡da, N-(2-(d¡met¡lamino)etil)acr¡dino-4-carboxam¡da; 6-[[2-(dimetilamino)etil]amino]-3-hidroxi-7H-indeno[2,l-c]quinol¡n-7-ona y dimesna.

Ejemplos de inhibidores de cinesinas mitóticas, y en particular la cinesina mitótica humana KSP, se describen en las publicaciones WO 2003/039460, WO 2003/050064, WO 2003/050122, WO 2003/049527, WO 2003/049679, WO 2003/049678, WO 2004/039774, WO 2003/079973, WO 2003/099211, WO 2003/105855, WO 2003/106417, WO 2004/037171, WO 2004/058148, WO 2004/058700, WO 2004/126699, WO 2005/018638, WO 2005/019206, WO 2005/019205, WO 2005/018547, WO 2005/017190 y US 2005/0176776. En una modalidad, los inhibidores de cinesinas mitóticas incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de KSP, inhibidores de MKLP1, inhibidores de CENP-E, inhibidores de MCAK e inhibidores de Rab6-KIFL.

Ejemplos de "inhibidores de histona desacetilasa" incluyen, pero no están limitados a, SAHA, TSA, oxamflatin, PXD101, MG98 y scriptaid. Otra referencia a otros inhibidores de histona desacetilasa puede encontrarse en el siguiente manuscrito: Miller, T. A., et al., J. Med. Chem.. 2003, 46(24): 5097-5116.

Los "inhibidores de cinasas implicadas en la progresión mitótica" incluyen, pero no está limitados a, inhibidores de aurora cinasa, inhibidores de cinasa tipo Polo (PLK; en particular inhibidores de PLK-1), inhibidores de bub-1 e inhibidores de bub-Rl. Un ejemplo de un "inhibidor de aurora cinasa", es VX-680.

Los "agentes antiproliferativos" incluyen oligonucleótidos de ADN y ARN antisentido tales como G3139, ODN698, RVASKRAS, GE 231 e IIMX3001, y antimetabolitos tales como enocitabina, carmpfur, tegafur, pentostatina, doxifluridina, trimetrexato, fludarabina, capecitabina, galocitabina, ocfosfato de citarabina, hidrato sódico de fosteabina, raltitrexed, paltitrexid, emitefur, tiazofurina, decitabina, nolatrexed, pemetrexed, nelzarabina, 2'-desoxi-2,-metilidencitidina, 2'-fluorometilen-2'-desoxicitidina, N-[5-(2,3-dihidro-benzofuril)sulfonil]-N'-(3,4-diclorofenil)urea, N6-[4-desoxi-4-[N2-[2(E),4(E)-tetradecadienoil]glicilamino]-L-glicero-B-L-mano-heptopiranosil]adenina, aplidina, ecteinascidina, troxacitabina, ácido 4-[2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimidino[5,4-b][,4]tiazin-6-il-(S)-etil]-2,5-tienoil-L-glutámico, aminopterina, 5-fluorouracilo, alanosina, éster de ácido ll-acetil-8-(carbamoiloximetil)-4-formil-6-metoxi-14-oxa-l, ll-diazatetraciclo(7.4.1.0.0)-tetradeca-2,4,6-trien-9-il acético, swainsonina, lometrexol, dexrazoxano, metioninasa, 2'-ciano-2'-desoxi-N4-palmitoiI-1-B-D-arabino furanosil citosina, 3-aminopiridin-2-carboxaldehído tiosemicarbazona y trastuzumab.

Ejemplos de agentes terapéuticos focalizados por anticuerpos monoclonales, incluyen aquellos agentes terapéuticos que tienen agentes citotóxicos o radioisótopos unidos a un anticuerpo monoclonal específico de células objetivo o específico de células cancerosas. Ejemplos incluyen Bexxar.

Los "inhibidores de HMG-CoA reductasa" se refieren a inhibidores de 3-hidrox¡-3-metilglutaril-CoA reductasa. Ejemplos de inhibidores de HMG-CoA reductasa que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, lovastatina (MEVACOR®; véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,231,938, 4,294,926 y 4,319,039), simvastatina (ZOCOR®; véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,444,784, 4,820,850 y 4,916,239), pravastatina (PRAVACOL®; véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,346,227, 4,537,859, 4,410,629, 5,030,447 y 5,180,589), fluvastatina (LESCOL®; véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,354,772, 4,911,165, 4,929,437, 5,189,164, 5,118,853, 5,290,946 y 5,356,896), atorvastatina (LIPITOR®; véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,273,995, 4,681,893, 5,489,691 y 5,342,952) y cerivastatina (conocida también como rivastatina y BAYCOL®; véase la patente de los Estados Unidos No. 5,177,080). Las fórmulas estructurales de estos y otros inhibidores de HMG-CoA reductasa que pueden usarse en los presentes métodos, se describen en la página 87 de M. Yalpani, Cholesterol Lowering Drugs, Chemistrv & Industrv. 1996, pp. 85-89, y en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,782,084 y 4,885,314. El término inhibidor de HMG-CoA reductasa como se usa en la presente, incluye todas las formas de ácido abierto y de lactona farmacéuticamente aceptables (es decir, en donde el anillo de lactona es abierto para formar el ácido libre), así como las formas de sal y de éster de compuestos que tienen actividad inhibidora de HMG-CoA reductasa, y por lo tanto el uso de dichas sales, ésteres, y formas de lactona y de ácido abierto, se incluyen dentro del alcance de esta invención.

El término "inhibidor de prenil-proteína transferasa", se refiere a un compuesto que inhibe cualquiera o cualquier combinación de las enzimas prenil-proteína transferasa, incluyendo farnesil-proteína transferasa (FPTasa), geranilgeranil-proteína transferasa tipo I (GGPTasa-I) y geranilgeranil-proteína transferasa tipo-II (GGPTasa-II, llamada también Rab GGPTasa).

Ejemplos de inhibidores de prenil-proteína transferasa pueden encontrarse en las siguientes publicaciones y patentes: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119 y WO 95/32987, patente de los Estados Unidos No. 5,420,245, patente de los Estados Unidos No. 5,523,430, patente de los Estados Unidos No. 5,532,359, patente de los Estados Unidos No. 5,510,510, patente de los Estados Unidos No. 5,589,485, patente de los Estados Unidos No. 5,602,098, patente europea publicación 0 618 221, patente europea publicación 0 675 112, patente europea publicación 0 604 181, patente europea publicación 0 696 593, documentos WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572 y WO 95/10514, patente de los Estados Unidos No. 5,661,152, documentos WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169 y WO 96/00736, patente de los Estados Unidos No. 5,571,792, documentos WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350 y WO 98/02436, y patente de los Estados Unidos No. 5,532,359. Para un ejemplo de la fundón de un inhibidor de prenil-proteína transferasa sobre la angiogénesis, véase European J. of Cáncer. 1999, 35(9): 1394-1401.

Los "inhibidores de angiogénesis" se refieren a compuestos que inhiben la formación de nuevos vasos sanguíneos, sin tener en cuenta el mecanismo. Ejemplos de inhibidores de angiogénesis incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de tirosina cinasa, tales como los inhibidores de los receptores de tirosina cinasa Flt-1 (VEGFR1) y Flk-l/KDR (VEGFR2), inhibidores de los factores de crecimiento derivados de la epidermis, derivados de fibroblastos o derivados de plaquetas, inhibidores de MMP (metaloproteasa de matriz), bloqueadores de integrina, interferón-a, interleucina-12, polisulfato de pentosán, inhibidores de ciclooxigenasa que incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINEs), como aspirina e ibuprofeno, así como inhibidores selectivos de cidooxigenasa-2 tales como celecoxib y rofecoxib (véase PNAS. 1992, 89: 7384; JNCI. 1982, 69: 475; Arch. Qphthalmol.. 1990, 108: 573; Anat. Rec. 1994, 238: 68; FEBS Letters. 1995, 372: 83; Clin. Orthop.. 1995, 313: 76; J. Mol. Endocrinol· 1996, 16: 07; Jon. J. Pharmacol. 1997, 75: 105; Cáncer Res.. 1997, 57: 1625; Ce|l, 1998, 93: 705; Intl. J. Mol Med.. 1998, 2: 715; y J. Biol Chem.. 1999. 274: 9116), fármacos antiinflamatorios esteroidales (tales como corticosteroides, mineralocorticoides, dexametasona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona y betametasona), carboxiamidotriazol, combretastatina A-4, escualamina, 6-O-cloroacetil-carbonil)-fumagilol, talidomida, angiostatina, troponina-1, antagonistas de angiotenslna II (véase Fernandez, et al., Lab. Clin. Med.. 1985, 105: 141-145), y anticuerpos para el VEGF (véase Nature Biotechnoloav. 1999, 17: 963-968); Kim, et al., Nature. 1993, 362: 841-844; documento WO 2000/44777; y documento WO 2000/61186).

Otros agentes terapéuticos que modulan o inhiben la angiogénesis y que pueden usarse también en combinación con los compuestos de la presente invención, incluyen agentes que modulan o inhiben los sistemas de coagulación y fibrinólisis (véase la revisión en Clin. Chem. La. Med.. 2000, 38: 679-692). Ejemplos de dichos agentes que modulan o inhiben las vías de coagulación y fibrinólisis incluyen, pero no están limitados a, heparina (véase Thromb. Haemost., 1998, 80: 10-23), inhibidores de carboxipeptidasa U y heparinas de bajo peso molecular (conocidos también como inhibidores del inhibidor de fibrinólisis activo activable por trombina [TAFIa]) (véase Thrombosis Res.. 2001, 101: 329-354). Se han descrito inhibidores de TAFIa en la publicación internacional del PCX WO 2003/013526. El término "agentes que interfieren con los puntos de control del ciclo celular", se refiere a compuestos que inhiben proteína cinasas que transducen señales del punto de control del ciclo celular, sensibilizando de esta manera a la célula cancerosa a los agentes que dañan el ADN. Dichos agentes incluyen inhibidores de ATR, ATM y CHK1 cinasas e inhibidores de cdk y cdc cinasa, y son ejemplificados específicamente por los compuestos 7-hidroxi-estaurosporina, flavopiridol, CYC202 (Cyclacel) y BMS-387032.

Los "agentes que interfieren con las tirosina cinasas receptoras (RTKs)" se refieren a compuestos que inhiben a las RTKs, y por lo tanto los mecanismos implicados en la oncogénesis y la progresión de tumores. Dichos agentes incluyen inhibidores de c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 y c-Met. Otros agentes incluyen inhibidores de RTKs, como es descrito por Bume-Jensen y Flunter, Nature. 2001, 411: 355-365.

Los "inhibidores de la vía de señalización de supervivencia y proliferación celular" se refieren a compuestos que inhiben las cascadas de la transducción de señales corriente abajo de los receptores de la superficie de la célula. Dichos agentes incluyen inhibidores de serina/treonina cinasas (incluyendo, pero no limitados a, inhibidores de Akt, tal como se describe en los documentos WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, WO 2006/135627, WO 2006/091395 y WO 2006/110638), inhibidores de Raf cinasa (por ejemplo, BAY-43-9006), inhibidores de MEK (por ejemplo, CI-1040 y PD-098059), inhibidores de mTOR (por ejemplo, CCI-779 de Wyeth) e inhibidores de PI3K (por ejemplo, LY294002).

Anticuerpos anti-IGF-lR específicos incluyen, pero no están limitados a, dalotuzumab, figitumumab, cixutumumab, SHC 717454, R1507 de Roche, EM164 o AMG479 de Amgen.

Como se describió anteriormente, las combinaciones con AINEs están dirigidas al uso de los AINEs, los cuales son potentes agentes inhibidores de COX-2. Para los propósitos de esta especificación, un AINE es potente si posee una IC50 para la inhibición de COX-2 de 1 mM o menos, según se mide mediante pruebas microsomales o celulares.

La invención abarca también combinaciones con AINEs que son inhibidores selectivos de COX-2. Para los propósitos de esta especificación, los AINEs que son inhibidores selectivos de COX-2 se definen como aquellos que poseen una especificidad por la inhibición de COX-2 sobre COX-1 de por lo menos 100 veces, según se mide mediante la relación de la IC50 para COX-2 sobre la IC50 para COX-1 evaluada mediante pruebas microsomales o celulares. Dichos compuestos incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos 5,474,995, patente de los Estados Unidos 5,861,419, patente de los Estados Unidos 6,001,843, patente de los Estados Unidos 6,020,343, patente de los Estados Unidos 5,409,944, patente de los Estados Unidos 5,436,265, patente de los Estados Unidos 5,536,752, patente de los Estados Unidos 5,550,142, patente de los Estados Unidos 5,604,260, patente de los Estados Unidos 5,698,584, patente de los Estados Unidos 5,710,140, documento WO 94/15932, patente de los Estados Unidos 5,344,991, patente de los Estados Unidos 5,134,142, patente de los Estados Unidos 5,380,738, patente de los Estados Unidos 5,393,790, patente de los Estados Unidos 5,466,823, patente de los Estados Unidos 5,633,272 y patente de los Estados Unidos 5,932,598, todos los cuales se incorporan de esta manera en la presente como referencia.

Los inhibidores de COX-2 que son particularmente útiles en el presente método de tratamiento son: 3-fenil-4-(4-(metilsulfonil)fenil)-2-(5H)-furanona; y 5-cloro-3-(4-metilsulfonil)fenil-2-(2-metil-5-piridinil)piridina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Compuestos que se han descrito como inhibidores específicos de COX-2 y son por lo tanto útiles en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: parecoxib, BEXTRA® y CELEBREX®, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otros ejemplos de inhibidores de angiogénesis incluyen, pero no están limitados a, endostatina, ukraína, ranpirnasa, IM862, 5-metoxi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-butenil)oxiranil]-1-oxaespiro[2,5]oct-6-il(cloroacetil)carbamato, acetildinanalina, 5-amino-l-[[3,5-dicloro-4-(4-clorobenzoil)fenil]metil]-1H-1,2,3-tr¡azol-4-carboxamida, CM101, escualamina, combretastatina, RPI4610, NX31838, fosfato sulfatado de manopentaosa, 7,7-(carbonil-bis[imino-N-metil-4,2-pirrolocarbonilimino[N-metil-4,2-pirroi]-carbonilimino]-bis-(1,3-naftalendisulfonato) y 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5416).

Como se indicó anteriormente, los "bioqueadores de integrina" se refieren a compuestos que ántagonizan, inhiben o contrarrestan selectivamente la unión de un ligando fisiológico a la integrina anb3, a compuestos que antagonizan, inhiben o contrarrestan selectivamente la unión de un ligando fisiológico a la integrina anb5, a compuestos que antagonizan, inhiben o contrarrestan la unión de un ligando fisiológico a la integrina a„b3 y la integrina anb5, y a compuestos que antagonizan, inhiben o contrarrestan la actividad de las integrinas particulares expresadas sobre las células endoteliales capilares. El término se refiere también a antagonistas de las integrinas anb6, a„b8, Oibi, a2bi, a5bi, a6b! y a6b4. El término se refiere también a antagonistas de cualquier combinación de las integrinas anb3, anb5, anb6, anb8, a^, a2bi, a5bi, a6b! y a6b4.

Algunos ejemplos específicos de inhibidores de tirosina cinasa incluyen N-(trifluorometilfenil)-5-metilisoxazol-4-carboxamida, 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilidenil)indolin-2-ona, 17-(al¡lam¡no)-17-demetoxigeldanamicina, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metox¡-6-[3-(4- morfolin¡l)propoxil]quinazolina, N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolinamina, BIBX1382, 2,3,9,10,ll,12-hexahidro-10-(hidroximetil)-10-hidroxi-9-metil-9,12-epoxi-1H-diindolo[1,2,3-fg:3'/2', -kl]p¡rrolo[3/4-¡][l/6]benzod¡azoc¡n-1-ona, SH268, genisteína, STI571, CEP2563, 4-(3-clorofen¡lamino)-5,6-d¡met¡l-7H-pirrolo[2,3-d]p¡r¡mid¡nmetansulfonato, 4-(3-bromo-4-h¡drox¡fen¡l)amino-6,7-dimetoxiqu¡nazolina, 4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetox¡qu¡nazol¡na( SU6668, STI571A, N-4-clorofen¡l-4-(4-p¡r¡d¡lmetil)-l-ftalazinamina y EMD121974.

Combinaciones con compuestos diferentes de compuestos anti-cáncer, son abarcadas también en los presentes métodos. Por ejemplo, combinaciones del inhibidor de mTOR y la combinación del antagonista de la integrina anb3 de la presente invención con agonistas de PPAR-g (es decir, PPAR-gamma) y agonistas de PPAR-d (es decir, PPAR-delta), son útiles en el tratamiento de ciertas malignidades. PPAR-y y PPAR-d son los receptores nucleares activados por el proliferador de peroxisomas g y d. La expresión de PPAR-g en las células endoteliales y su envolvimiento en la angiogénesis, se han reportado en la literatura (véase 1 Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 31: 909-913; J. Biol. Chem.. 1999, 274: 9116-9121; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.. 2000, 41: 2309-2317). Más recientemente, se ha mostrado que los agonistas de PPAR-g inhiben la respuesta angiogénica al VEGF in vitro ; el maleato de troglitazona y rosiglitazona inhibe el desarrollo de la neovascularización retiniana en ratones (Arch. Ophthalmol. 2001; 119: 709-717). Ejemplos de agonistas de PPAR-g y agonistas de PPAR-g/a incluyen, pero no están limitados a, tiazolidinodionas (tales como DRF2725, CS-011, troglitazona, rosiglitazona y pioglitazona), fenofibrato, gemfibrozilo, clofibrato, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, ácido 2-[(5,7-dipropil-3-trifluorometil-l,2-benzisoxazol-6-il)oxi]-2-metilpropiónico (descrito en el documento USSN 09/782,856) y ácido 2(R)-7-(3-(2-cloro-4-(4-fluorofenoxi)fenoxi)propoxi)-2-etilcroman-2-carboxílico (descrito en el documento USSN 60/235,708 y 60/244,697).

Otra modalidad de la presente invención es el uso de los compuestos actualmente descritos en combinación con la terapia génica para el tratamiento dei cáncer. Para un resumen de estrategias genéticas para tratar el cáncer, véase Hall, eta/., Am. J. Flum. Genet.. 1997, 61: 785-789 y Kufe, etal., Cáncer Medicine. 5a. ed, B. C. Decker, Hamilton, 2000, pp. 876-889. La terapia génica puede usarse para suministrar cualquier agente supresor de tumores. Ejemplos de dichos genes incluyen, pero no están limitados a, p53, el cual puede suministrarse por medio de la transferencia de genes mediada por virus recombinantes (véase la patente de los Estados Unidos No. 6,069,134), un antagonista de uPA/uPAR (Gene Therapy. 1998, 5(8): 1105-13) e interferón gamma (1 Immunol.. 2000, 164: 217-222).

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse también en combinación con un inhibidor de la resistencia inherente a fármacos múltiples (MDR), en particular la MDR asociada con los altos niveles de expresión de las proteínas transportadoras. Dichos inhibidores de la MDR incluyen inhibidores de p-glucoproteína (P-gp), tales como LY335979, XR9576, OC144-093, R101922, VX853 y PSC833 (valspodar).

Un compuesto de la presente invención puede usarse en conjunto con agentes antieméticos para tratar náusea o emesis, incluyendo emesis aguda, retardada, de fase tardía y anticipada, lo cual puede resultar del uso de un compuesto de la presente invención, solo o con radioterapia. Para la prevención o el tratamiento de emesis, un compuesto de la presente invención puede usarse en conjunto con otros agentes antieméticos, especialmente antagonistas del receptor de neurocinina-1, antagonistas del receptor de 5HT3, tales como ondansetrón, granisetrón, tropisetrón y zatisetrón, agonistas del receptor de GABAB, tales como baclofeno, un corticosteroide tal como Decadron (dexametasona), Kenalog, Aristocort, Nasalide, Preferid, Benecorten u otros, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 2,789,118, 2,990,401, 3,048,581, 3,126,375, 3,929,768, 3,996,359, 3,928,326 y 3,749,712, un antidopaminérgico, tal como las fenotiazinas (por ejemplo, proclorperazina, flufenazina, tioridazina y mesoridazina), metoclopramida o dronabinol. En otra modalidad, la terapia conjunta con un agente antiemesis seleccionado de un antagonista del receptor de neurocinina-1, un antagonista del receptor de 5HT3 y un corticosteroide, se describe para el tratamiento o prevención de emesis que puede resultar de la administración de los presentes compuestos.

Antagonistas del receptor de neurocinina-1 de uso en conjunto con los compuestos de la presente invención se describen completamente, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,162,339, 5,232,929, 5,242,930, 5,373,003, 5,387,595, 5,459,270, 5,494,926, 5,496,833, 5,637,699 y 5,719,147; patente europea publicación Nos. EP 0 360 390, 0 394 989, 0 428 434, 0 429 366, 0 430 771, 0436 334, 0 443 132, 0 482 539, 0 498 069, 0 499 313, 0 512 901, 0 512 902, 0 514 273, 0 514 274, 0 514 275, 0 514 276, 0 515 681, 0 517 589, 0 520 555, 0 522 808, 0 528 495, 0 532 456, 0 533 280, 0 536 817, 0 545 478, 0 558 156, 0 577 394, 0 585 913,0 590 152, 0 599 538, 0 610 793, 0 634402, 0 686 629, 0 693 489, 0 694 535, 0 699655, 0 699 674, 0 707 006, 0 708 101, 0 709 375, 0 709 376, 0 714 891, 0 723 959, 0 733 632 y 0 776 893; patente internacional del PCT publicación Nos. WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418, 95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661, 96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 y 97/21702; y en la patente británica publicación Nos. 2 266 529, 2 268 931, 2 269 170, 2 269 590, 2 271 774, 2 292 144, 2 293 168, 2 293 169 y 2 302 689. La preparación de dichos compuestos se describe completamente en las patentes y publicaciones mencionadas anteriormente, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

En una modalidad, el antagonista del receptor de neurocinina-1 para su uso en conjunto con los compuestos de la presente invención, se selecciona de: 2-(R)-(l-(R)-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)etoxi)-3-(S)-(4-fluorofenil)-4-(3-(5-oxo-1H,4H-1,2,4-triazolo)metil)morfolina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, la cual se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,719,147.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede administrarse también con un agente útil en el tratamiento de anemia. Dicho agente para el tratamiento de anemia es, por ejemplo, un activador continuo del receptor de eritropoyesis (tal como Epoetin alfa).

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede administrarse también con un agente útil en el tratamiento de neutropenia. Dicho agente para el tratamiento de neutropenia es, por ejemplo, un factor de crecimiento hematopoyético el cual regula la producción y función de neutrófilos, tal como un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) humanos. Ejemplos de un G-CSF incluyen filgrastim.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede administrarse también con un fármaco que intensifica la respuesta inmunológica, tal como levamisol, isoprinosina y Zadaxin.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar o prevenir cáncer, incluyendo cáncer óseo, en combinación con bisfosfonatos (que se entiende incluyen bisfosfonatos, difosfonatos, ácidos bisfosfónicos y ácidos difosfónicos). Ejemplos de bisfosfonatos incluyen, pero no están limitados a, etidronato (Didronel), pamidronato (Aredia), alendronato (Fosamax), risedronato (Actonel), zoledronato (Zometa), ibandronato (Boniva), incadronato o cimadronato, clodronato, EB-1053, minodronato, neridronato, piridronato y tiludronato, incluyendo cualquiera y todos los hidratos, derivados, sales, y mezclas de los mismos farmacéuticamente aceptables.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar o prevenir cáncer de mama en combinación con inhibidores de aromatasa. Ejemplos de inhibidores de aromatasa incluyen, pero no están limitados a, anastrozol, letrozol y exemestano.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar o prevenir cáncer en combinación con terapéuticas con ARNsi.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede administrarse también combinación con inhibidores de g-secretasa y/o inhibidores de la señalización NOTCH. Dichos inhibidores incluyen compuestos descritos en los documentos WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, USSN 10/957,251, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 y WO 02/47671 (incluyendo LY-450139).

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar o prevenir cáncer en combinación con inhibidores de Akt. Dichos inhibidores incluyen compuestos descritos en, pero no limitados a, las siguientes publicaciones: WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361.WO 2006/135627, WO 2006091395 y WO 2006/110638).

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar o prevenir cáncer en combinación con inhibidores de PARP.

La radioterapia misma significa un método ordinario en el campo de tratamiento del cáncer. Para la radioterapia, utilizables son varias radiaciones tales como rayos X, rayos gamma, rayos de neutrones, haz de electrones, haz de protones; y fuentes de radiación. En una radioterapia más popular, un acelerador lineal se usa para la irradiación con radiaciones externas, tales como rayos gamma.

El inhibidor de WEE1 de la presente invención puede ser también útil para tratar cáncer en otra combinación con los siguientes agentes terapéuticos: abarelix (Plenaxis depot®); acetato de abiraterona (Zytiga®); (Actiq®); aldesleukin (Prokine®); Aldesleukin (Proleukin®); Alemtuzumab (Campath®); clorhidrato de alfuzosina (UroXatral®); alitretinoína (Panretin®); alopurinol (Ziloprim®); altretamina (Hexalen®); amifostina (Ethyol®); anastrozol (Arimidex®); (Anzemet®); (Anexsia®); aprepitant (Emend®); trióxido arsénico (Trisenox®); asparaginasa (Elspar®); azacitidina (Vidaza®); clorhidrato de bendamustina (Treanda®); bevacuzimab (Avastin®); cápsulas de bexaroteno (Targretin®); gel de bexaroteno (Targretin®); bleomicina (Blenoxane®); bortezomib (Velcade®); (Brofenac®); busulfán intravenoso (Busulflex®); busulfán oral (Myleran®); cabazitaxel (Jevtana®); calusterona (Methosarb®); capecitabina (Xeloda®); carboplatino (Paraplatin®); carmustina (BCNU®, BiCNU®); carmustina (Gliadel®); carmustina con implante de Polifeprosan 20 (Gliadel Wafer®); celecoxib (Celebrex®); cetuximab (Erbitux®); clorambucllo (Leukeran®); cinacalcet (Sensipar®); cisplatino (Platinol®); cladrlbina (Leustatin®, 2-CdA®); clofarabina (Clolar®); clclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®); dclofosfamida (Cytoxan Injection®); dclofosfamida (Cytoxan Tablet®); citarablna (Cytosar-U®); citarabina llposomal (DepoCyt®); dacarbazina (DTIC-Dome®); dactinomielna, actinomlcina D (Cosmegen®); Darbepoetin alfa (Aranesp®); dasatinlb (Sprycel®); daunorrublclna llposomal (DanuoXome®); daunorrublclna, daunomicina (Daunorubicin®); daunorrubiclna, daunomlclna (Cerubldine®); decltabina (Dacogen®); degarelix (Degarelix®); Denileukin diftltox (Ontak®); denosumab (Xgeva®); dexrazoxano (Zinecard®); docetaxel (Taxotere®); doxorrubiclna (Adrlamycin PFS®); doxorrublclna (Adriamycin®, Rubex®); doxorrubiclna (Adrlamycin PFS Injection®); doxorrubiclna liposomal (Doxil®); propionato de dromostanolona (dromostanolone®); propionato de dromostanolona (masterone injection®); solución B de Elliott (Elliott's B Solution®); epirrubicina (Ellence®); Epoetin alfa (epogen®); mesilato de erlbullna (Flalaven®); erlotinlb (Tarceva®); estramustina (Emcyt®); fosfato de etopósido (Etopophos®); etopósldo, VP-16 (Vepesld®); everolimus (Afinitor®); exemestano (Aromasin®); fentanilo bucal (Onsolls®); citrato de fentanilo (Fentora®); tabletas sublinguales de fentanilo (Abstral®); Fllgrastim (Neupogen®); floxuridina (intraarterial) (FUDR®); fludarabina (Fludara®); fluorouradio, 5-FU (Adrucil®); flutamida (Eulexin®); fulvestrant (Faslodex®); gefitinib (Iressa®); gemcitabina (Gemzar®); gemtuzumab ozogamicina (Milotarg®); acetato de goserelina (Zoladex Implant®); acetato de goserelina (Zoladex®); granlsetrón (Kytrll Solution®) (Sancuso®); acetato de histrelina (Histrelln implant®); vacuna bivalente de virus del papiloma humano (Cervarix®); hidroxlurea (Hydrea®); Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin®); idarrubicina (Idamycin®); ifosfamida (IFEX®); mesilato de ¡matinib (Gleevec®); interferón alfa 2a (Roferon A®); Interferón alfa-2b (Intron A®); ipilimumab (Yervoy®); ¡rlnotecan (Camptosar®); (Kadian®); ixabepilona (Ixempra®); lapatinlb (Tykerb®); lenalidomida (Revlimid®); letrozol (Femara®); leucovorina (Wellcovorin®, Leucovorin®); acetato de leuprolida (Eligard®); (Lupron Depot®); (Viadur®); levamisol (Ergamisol®); levoleucovorina (Fusllev®); lomustina, CCNU (CeeBU®); mecloretamina, mostaza nitrogenada (Mustargen®); acetato de megestrol (Megace®); melfalán, L-PAM (Alkeran®); mercaptopurina, 6-MP (Purinethol®); mesna (Mesnex®); mesna (Mesnex tabs®); metotrexato (Methotrexate®); metoxsaleno (Uvadex®); mitomicina C (Mutamycin®); mitomicina C (Mitozytrex®); mitotano (Lysodren®); mitoxantrona (Novantrone®); fenpropionato de nandrolona (Durabolin-50®); neiarabina (Arranon®); monohidrato de clorhidrato de nilotinib (Tasigna®); Nofetumomab (Verluma®); ofatumumab (Arzerra®); ondansetrón (Zuplenz®); Oprelvekin (Neumega®); (Neupogen®); oxaliplatino (Eloxatin®); paclitaxel (Paxene®); paclitaxel (Taxol®); partículas de paclítaxel unidas a proteína (Abraxane®); palifermlna (Kepivance®); palonosetrón (Aloxi®); pamidronato (Aredia®); panitumumab (Vectibix®); pazopanib (Votrient®); pegademasa (Adagen (Pegademase Bovine)®); pegaspargasa (Oncaspar®); Pegfilgrastim (Neulasta®); peginterferón alfa-2B (Sylatron®); pemetrexed disódico (Alimta®); pentostatina (Nipent®); pipobromano (Vercyte®); inyección de plerixafor (Mozobil®); plicamicina, mitramicina (Mithracin®); porfimer sódico (Photofrin®); inyección de pralatrexato (Folotyn®); procarbazina (Matulane®); (Quadramet®); vacuna recombinante cuadrivalente del virus del papiloma humano (tipos 6, 11, 16, 18) (Gardasil®); quinacrina (Atabrine®); clorhidrato de raloxifeno (Evista®); Rasburicase (Elitek®); Rituximab (Rituxan®); romidepsina (Istodax®); sargramostim (Leukine®); Sargramostim (Prokine®); secretina (SecreFlo®); sipuleucel-T (Provenge®); sorafenib (Nexavar®); estreptozocina (Zanosar®); maleato de sunitinib (Sutent®); talco (Sclerosol®); tamoxifeno (Nolvadex®); temozolomida (Temodar®); temsirolimus (Torisel®); tenipósido, VM-26 (Vumon®); (Temodar®); testolactona (Teslac®); talidomida (Thalomid®); tioguanina, 6-TG (Thioguanine®); tiotepa (Thioplex®); topotecan (Hycamtin®); toremifeno (Fareston®); Tositumomab (Bexxar®); Tositumomab/tositumomab 1-131 (Bexxar®); Trastuzumab (Herceptin®); (Trelstar LA®); tretinoína, ATRA (Vesanoid®); pamoato de triptorelina (Trelstar Depot®); (UltraJect®); mostaza de uracilo (Uracil Mustard Capsules®); valrrubicina (Valstar®); vandetanib (Vandetanib®); vinblastina (Velban®); vincristina (Oncovin®); vinorelbina (Navelbine®); vorinostat (Zolinza®); (Zofran ODT®); y zoledronato (Zometa®).

Todas las patentes, publicaciones y solicitudes de patente pendientes identificadas, se incorporan de esta manera en la presente como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de WEE1-1 Producción de 2-alil-1-r6-íl-hidroxi-1-metiletinp¡ridin-2-ill-6-¡T4-(4-metilpiperazin-l-il)fenillamino}-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona Paso 11 Producción de 2-(6-bromo-2-piridinin-2-propanol: En una atmósfera de nitrógeno, 30 mL de yoduro de metilmagnesio 3 M/éter dietílico se añadieron a 300 mL de solución en éter dietílico de 8.72 g de 6-bromopiridín-2-carboxilato de metilo. Se añadieron agua y ácido clorhídrico 2 N al líquido de reacción, y se extrajeron con acetato de etilo. Esto se lavó con solución acuosa de carbonato ácido de sodio saturado y agua salina saturada, y se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente se evaporó bajo presión reducida, para dar 2-(6-bromo-2-piridinil)-2-propanol crudo como una sustancia oleosa amarilla.

^-RMN (400 MHz, CDCI3) d: 7.56 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 7.8, 1.0 Hz), 7.36 (1H, dd, J = 7.8, 1.0 Hz), 1.55 (6H, s). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H]+ 216, 218.

Paso 21 Producción de 2-alil-l-r6-fl-hidroxi-l-metiletilV2-piridinil1-6-fmetiltioV1.2-dihidro-3H-pirazolor3.4-dlDirimidin-3-ona: El compuesto del título se obtuvo de la misma manera como en el ejemplo preparativo 1-1, para lo cual, sin embargo, el compuesto obtenido en la reacción anterior se usó en lugar de la 2-yodopiridina usada en el ejemplo preparativo 1-1.

‘H-RMN (400 MHz, CDCI3) d: 8.95 (1H, s), 7.91 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.76 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 7.8, 1.0 Hz), 5.70 (1H, ddt, J = 17.1, 10.2, 6.3 Hz), 5.06 (1H, dd, J = 10.2, 1.0 Hz), 4.93 (1H, dd, J = 17.1, 1.2 Hz), 4.81 (2H, d, J = 6.3 Hz), 2.59 (4H, s), 1.59 (6H, s). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H]+: 358.

Paso S) Producción de 2-alil-l-r6-fl-hidroxi-l-metileti0p¡ridin-2-il1-6-fr4-f4-metilpiperazin-l-iljfeninamino>-1.2-dihidro-3H-pirazolor3.4-d1pirimidin-3-ona: Se añadieron 817 mg de ácido m-cloroperbenzoico (> 65%) a solución en tolueno (20 mL) de 1.10 g del producto anterior, y se agitaron por 20 minutos. Se añadieron 1.61 mL de N,N-diisopropiletilamina y 706 mg de 4-(4-metilpiperazin-l-il)anilina al líquido de reacción, y se agitaron durante la noche. Se añadió solución acuosa de carbonato ácido de sodio saturado al líquido de reacción, se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua salina saturada, y se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente se evaporó, y el residuo se purificó a través de cromatografía en columna de gel de sílice básica (hexano/acetato de etilo = 1/1 a 0/1, acetato de etilo/etanol = 98/2). Después de concentrado, éste se recristalizó a partir de acetato de etilo, para dar el compuesto del título como un sólido amarillo.

^-RMN (400 MHz, CDCI3) d: 8.83 (1H, s), 7.86 (1H, dd, J = 8.0, 7.8 Hz), 7.75 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.49 (1H, brs), 7.48 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.34 (1H, d, J = 7.4 Hz), 6.93 (2H, d, J = 9.0 Hz), 5.70 (1H, ddt, J = 17.2, 10.0, 6.5 Hz), 5.04 (1H, d, J = 10.0 Hz), 4.94 (1H, d, J = 17.2 Hz), 4.74 (2H, d, J = 6.5 Hz), 3.26 (4H, t, J = 4.8 Hz), 2.73 (4H, brs), 2.44 (3H, s), 1.59 (6H, s). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H]+ 501.

EJEMPLO PREPARATIVO 1-1 Producción de 2-al¡l-6-(,metiltioH-pir¡din-2-il-3H-pirazolor3.4-d1p¡rimidin-3-ona: Se añadieron 2.4 mL de N,N'-dimetiletilendiamina a una solución en 1,4-dioxano (50 mL) de 4.44 g de 2-alil-6-(metiltio)-1,2-dihidro-3H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-ona, 3.80 g de yoduro de cobre (I), 5.33 g de 2-yodopiridina y 3.80 g de carbonato de potasio, y se agitaron durante la noche a 95°C. El líquido de reacción se enfrió, se añadió amoníaco acuoso al mismo y se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua salina saturada y se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente se evaporó bajo presión reducida y se cristalizó con acetato de etilo, para dar el compuesto del título como un sólido blanco.

^-RMN (400 MHz, CDCI3) d: 8.94 (1H, s), 8.52 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.90 (2H, d, J = 3.5 Hz), 7.29-7.25 (1H, m), 5.68 (1H, ddt, J = 17.0, 10.2, 6.3 Hz), 5.05 (1H, d, J = 10.2 Hz), 4.91 (1H, d, J = 17.0 Hz), 4.85 (1H, d, J = 6.3 Hz), 2.58 (3H, s).

EJEMPLO 2 Preparación de WEE1-2 Producción de 3-f2.6-d¡clorofenilV4-imino-7-rf2'-metil-2'.3'-dihidro- H-espirorciclopropan-1.4,-isoaumolin1-7'-¡namino1-3.4-dih¡dropirimidor4.5-d1pirim¡din-2(1H')-ona Una solución en 1-butanol de 1.5 g de la 7-cloro-3-(2,6-diclorofenil)-4-imino-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirim¡din-2(lH)-ona obtenida en el ejemplo preparativo 2-1, 1 g de la 2'-metil-2',3,-dihidro-l'H-espiro[ciclopropan-1,4'-isoquinolin]-7'-amina obtenida en el ejemplo preparativo 2-2, y 0.83 g de monohidrato de ácido p-toluensulfónico, se agitó a 90°C por 15 minutos. El líquido de reacción se enfrió, se diluyó con cloroformo, y la capa orgánica se lavó con solución acuosa de bicarbonato de sodio saturado y entonces agua salina saturada, y se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró, y el solvente se evaporó. Obtenido de esta manera, el producto aproximadamente purificado se purificó a través de cromatografía en columna de gel de sílice básica, para dar 3-(2,6-diclorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2,,3,-dihidro-rH-espiro[ciclopropan-1,4'-isoquinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidropirimido[4,5-d]pirimidin-2(1H)-ona. Ésta se disolvió en un solvente mixto de cloroformo/metanol y se añadieron a la misma 1.5 equivalentes de solución acuosa de ácido clorhídrico, y se agitó a temperatura ambiente por 5 minutos. Entonces, el solvente se evaporó, y el residuo se lavó con acetato de etilo, para dar diclorhidrato de 3-(2,6-diclorofenil)-4-imino-7-[(2'-metil-2',3'-dihidro-l'H-espiro[cicloprópan-l,4,-isoquinolin]-7'-il)amino]-3,4-dihidrop¡rimido[4,5-d]pirimidin-2(lH)-ona como un sólido amarillo.

^-RMN (400 MHz, DMSO-d6) d: 11.83 (1H, brs), 10.05 (1H, brs), 9.10 (1H, s), 8.88 (1H, s), 7.79-7.68 (1H, m), 7.63-7.59 (2H, m), 7.47 (1H, t, J = 8.2 Hz), 7.38 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.63 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.59 (2H, s), 2.44 (2H, s), 2.32 (3H, s), 0.90-0.81 (4H, m). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H]+ 494.

EJEMPLO PREPARATIVO 2-1 Producción de 7-cloro-3-(2.6-diclorofenilV4-imíno-3.4-dihidropirinnidor4.5-d1p¡rimidin-2ílHVona 1.12 g de hidruro de sodio se añadieron a una solución en N,N-dimetilformamida (35 mL) de 3.0 g de 4-amino-2-cloropirimidin-5-carbonitrilo, y se agitaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Se añadieron al líquido de reacción 4.38 g de isocianato de 2,6-diclorofenilo, y se agitaron a temperatura ambiente por 1 hora. Se añadieron a la solución de reacción acetato de etilo y solución acuosa de ácido clorhídrico 1 N, y la capa orgánica se separó. Ésta se lavó con agua salina saturada, se secó con sulfato de magnesio anhidro, y el solvente se evaporó. El sólido precipitado se solidificó con un solvente mixto de metanol/acetato de etilo, y se absorbió a través de filtración, para dar el compuesto del título como un sólido blanco.

^-RMN (400 MHz, DMSO-d6) d: 9.33 (1H, s), 7.66 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.53 (1H, t, J = 8.2 Hz). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 342.

EJEMPLO PREPARATIVO 2-2 Producción de 2'-metil-2'.3'-dih¡dro- H-esp¡rorc¡clopropan-1.4'-¡soau¡nolin1-7'-amina Paso lj Producción de l-f2-c¡anofeniPc¡clopropancarboxilato de metilo: 1.5 g de bromuro de tetra-n-butilamonio, 6.5 g de 1,2-dibromoetano y 20 mL de solución acuosa de hidróxido de sodio a 50%, se añadieron a una solución en tolueno (40 mL) de 4.0 g de 2-cianofenilacetato de metilo, y se agitaron a temperatura ambiente por 1 hora. Se añadió agua al líquido de reacción, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua salina saturada, se secó con sulfato de magnesio anhidro, y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo se purificó a través de cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo), para dar el compuesto del título como un compuesto incoloro.

^-R N (400 MHz, CDCI3) d: 7.66 (1H, dd, J = 7.6, 1.2 Hz), 7.55 (1H, td, j = 7.6, 1.2 Hz), 7.43-7.36 (2H, m), 3.66 (3H, s), 1.82 (2H, q, J = 3.7 Hz), 1.30 (2H, q, J = 3.7 Hz). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 202.

Paso _ 2) _ Producción _ de _ monoclorhidrato de _ 1-G2- (aminometinfenillciclopropancarboxilato de metilo: 1.6 g de paladio a 10%/carbono se añadieron a una solución en etanol (50 mL) de 2.95 g del compuesto obtenido en el paso de reacción 1) anterior, y se agitaron en una atmósfera de hidrógeno bajo presión atmosférica a temperatura ambiente por 3 horas. El paladio/carbono se removió a través de filtración, el filtrado se concentró bajo presión reducida y el producto crudo se lavó con éter dietílico, para dar el compuesto del título como un sólido incoloro.

LH-RMN (DMSO-d6) d: 8.47 (2H, s), 7.55 (1H, d, J = 6.8 Hz), 7.38 (3H, td, J = 7.2, 2.1 Hz), 7.36-7.29 (2H, m), 4.04 (2H, d, J = 4.9 Hz), 3.54 (3H, s), 1.61-1.56 (2H, m), 1.33-1.29 (2H, m). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 206.

Paso 31 Producción de l'.2'-dihidro-3'H-espirordclopropan-1.4'-isoau¡nolin1-3'-ona: 4 mL de solución acuosa de hidróxldo de sodio 5 N se añadieron a una solución en metanol (50 mL) de 3.2 g del compuesto obtenido en el paso de reacción 2) anterior, y se agitaron a temperatura ambiente por 30 minutos. Esto se neutralizó con ácido clorhídrico 1 N acuoso añadido a la misma, y se evaporó metano! bajo presión reducida. El residuo se diluyó con agua y se extrajo tres veces con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua salina saturada, se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se evaporó bajo presión reducida, para dar el compuesto del título como un sólido incoloro.

‘H-RMN (CDCI3) d: 7.23 (1H, td, J = 7.8, 1.1 Hz), 7.18 (1H, td, J = 7.3, 1.1 Hz), 7.10 (1H, dd, J = 7.3, 1.0 Hz), 6.73 (1H, dd, J = 7.8, 1.0 Hz), 4.69 (2H, d, J = 1.5 Hz), 1.85 (2H, q, J = 3.7 Hz), 1.24 (2H, q, J = 3.7 Hz). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 174.

Paso 41 Producción de 7'-nitro-l'.2'-dihidro-3'H-espirorciclopropan-1.4'-isoaumolin1- 3'-ona: 1.3 g de nitrato de potasio se añadieron gradualmente a una solución en ácido sulfúrico (60 mL) de 2.1 g del compuesto obtenido en la reacción 3) anterior, tardando 5 minutos, y se agitaron adicionalmente a temperatura ambiente por 10 minutos. El líquido de reacción se vertió en agua helada, el cristal precipitado se absorbió a través de filtración y se lavó con agua, para dar el compuesto del título como un sólido amarillo.

MH-RMN (CDCI3) d: 8.09 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 8.01 (1H, t, J = 2.4 Hz), 6.86 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.30 (1H, s), 4.78 (2H, d, J = 1.5 Hz), 2.01 (2H, q, J = 4.1 Hz), 1.35 (2H, q, J = 4.1 Hz). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 219.

Paso 51 Producción de 7'-n¡tro- .2'-d¡hidro-3,H-espirordclopropan-1.4'-isoqumolina1: Con enfriamiento con hielo, 6.3 g de complejo de trifluoruro de boro-éter dietílico se añadieron a una suspensión en tetra h id rofu rano de 1.3 g de borohidruro de sodio, y se agitaron por 1 hora. Una solución en tetrahidrofurano (100 mi) de 2.4 g del compuesto obtenido en el paso de reacción 4) anterior se añadió al líquido de reacción, y se calentó bajo reflujo por 2 horas. El líquido de reacción se enfrió, y entonces se neutralizó con solución acuosa de bicarbonato de sodio saturado. El solvente se evaporó bajo presión reducida, el residuo se disolvió en etanol, se añadió al mismo ácido clorhídrico 5 N, y se calentó bajo reflujo por 1 hora. El líquido de reacción se enfrió, entonces el solvente se evaporó bajo presión reducida, y el residuo se neutralizó con solución acuosa de carbonato de potasio. La capa acuosa se extrajo con cloroformo, la capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se evaporó bajo presión reducida, para dar el compuesto del título.

ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 205.

Paso 61 Producción de 2'-metil-7'-nitro-2'.3'-dihidro-l'H-espirorciclopropan-1.4'-isoauinolinal: 1.5 g de cianoborohidruro de sodio se añadieron a una solución en metanol (50 mL) del compuesto (2.3 g) obtenido en el paso de reacción 5) anterior, 2.7 mL de solución acuosa de formaldehído a 37% y 0.7 mL de ácido acético, y se agitaron a temperatura ambiente por 15 horas. El líquido de reacción se neutralizó con solución acuosa de bicarbonato de sodio saturado, y se evaporó metanol bajo presión reducida. El residuo se diluyó con agua y se extrajo tres veces con cloroformo. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, el solvente se evaporó bajo presión reducida, y el producto crudo se purificó a través de cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo), para dar el compuesto del título como un sólido incoloro.

^-RMN (CDCI3) d: 7.97 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 7.91 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.78 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.77 (2H, s), 2.57 (2H, s), 2.48 (3H, s), 1.16-1.12 (2H, m), 1.10-1.06 (2H, m). ESI-MS. Encontrado: m/z [M+H] 219.

Paso 7) Producción de 2'-metil-2'.3'-dihidro- H-esp¡rordcloDropan-1.4'-isoaumolin1- 7'-amina: 800 mg de paladio a 10%/carbono se añadieron a una solución en etanol (20 mL) de 1.7 g del compuesto obtenido en el paso de reacción 6) anterior, y se agitaron en una atmósfera de hidrógeno bajo 1 atmósfera de presión a temperatura ambiente por 15 horas. Se removió el paladio/carbono a través de filtración, el filtrado se concentró bajo presión reducida, y el producto crudo se purificó a través de cromatografía en columna de gel de sílice básica (hexa no/acetato de etilo), para dar el compuesto del título como un sólido incoloro.

‘HTRMN (CDCI3) d: 6.50-6.48 (2H, m), 6.38-6.36 (1H, m), 3.61 (2H, s), 3.50 (2H, s), 2.49 (2H, s), 2.42 (3H, s), 0.91 (2H, dd, J = 6.3, 4.6 Hz), 0.81 (2H, dd, J = 6.3, 4.6 Hz). ESI-MS.

Encontrado: m/z [M+H] 189.

EJEMPLO 3 Materiales v métodos generales A. Cultivo de células, pruebas de proliferación v expresión suprimida del ARNsi de MYT1 Todas las líneas de células cancerosas se cultivaron en medio recomendado por el proveedor de las líneas de células (ATCC). El medio de cultivo de tejidos, el suero y los complementos se adquirieron de Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO). Para el examen de la prueba de proliferación (figura 1), las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 384 cavidades y se cultivaron bajo tratamiento con compuesto o vehículo. Después de 96 horas, se usó CelITiter-Glo (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante, para aproximarse al contenido de células. Se obtuvieron muestras por triplicado, y el crecimiento se calculó como el valor sin elaborar de CelITiter-Glo de las muestras tratadas respecto a las cavidades control tratadas con vehículo.

Para los estudios de expresión suprimida, NCI-H460 y KNS62, dos líneas de células cancerosas de pulmón de células no pequeñas, de la American Type Culture Collection, Manassas, VA, fueron transfectadas con grupos de ARNsi (grupo SMART, Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con control sin focalización o secuencias de PKMYT1. Las células se sembraron 48 horas después de la transfección en placas de cultivo de tejidos de 96 cavidades, y al día siguiente se trataron con compuesto o vehículo por 72 horas. Para aproximarse al contenido de células, se usó ViaLight (Lonza, Basel, Suiza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se obtuvieron muestras por triplicado, y el crecimiento se calculó determinando el porcentaje del valor sin elaborar control para cada tratamiento.

B. Western Blottinq Células fueron Usadas en reactivo de extracción de proteínas de mamífero (MPER, Thermo Flsher 78505, Waltham, MA), y sometidas entonces a SDS-PAGE y transferidas sobre membranas de nltrocelulosa o PVDF. Los anticuerpos usados para el Western blotting, son de las siguientes fuentes: CDK1 total, pCDKln5, pCDKl™, pCHKlS345, pStathminS38, pLaminA/Cs22, motivo de substrato de pCDK, gH2AC, cielina A y PKMYT1 total de Cell Slgnallng Technologies (Beverly, MA); actina-HRP de Santa Cruz Blotechnology (Santa Cruz, CA); y anticuerpos anti-ratón y conejo secundarlos conjugados con HRP de GE Healthcare (Waukesha, WI). Los blots fueron expuestos con el substrato qulmioluminiscente SuperSIgnal West Femto (Thermo Fisher Plerce, Waltham, MA).

C. Citometría de fluio Para detectar los rompimientos de la doble cadena del ADN, las células fueron teñidas con un anticuerpo anti-yH2AX (S139) conjugado con FITC (kit 17-344, Mlllipore, Billerica, MA) después de haber sido fijadas durante la noche en etanol a 70% enfriado en hielo. Se usó solución de yoduro de propidio (PI)/ribonucleasa (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) para detectar el contenido de ADN total. Para los estudios de la interrogación de la mitosis prematura, se añadió un anticuerpo anti-pHH3-Alexa 647 (BD Biosciences 558217).

Para los estudios de sincronización, las células se incubaron en medio libre de suero por 36 horas, seguido de abastecimiento con FBS a 20%. Una hora antes de cada cosecha, las células fueron pulsadas con bromodesoxiuridina (BrdU) 10 mM. Las células fueron fijadas y teñidas para contenido de BrdU y ADN con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con FITC y colorante de 7-aminoactinomicina-D (7-AAD), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones en el kit de flujo de FITC BrdU de BD Pharmingen™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Todos los datos de la citometría se colectaron en el citómetro de flujo de BD LSR II usando el software de BD FACS Diva™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), y los resultados se analizaron en FlowJo versión 7.5.

D. Estudios de la eficacia in vivo Se obtuvieron ratones hembras CD-I Nu/Nu de 5 a 6 semanas de Charles River Laboratories (Wilmington, DE), y fueron alojados en la instalación para el cuidado de animales de los solicitantes en condiciones de laboratorio estándar y provistos con la dieta tratada en autoclave 2018S (Harían Laboratories, Indianápolis, IN) y agua a voluntad. El protocolo fue aprobado por el comité interno para el uso y cuidado de animales de los solicitantes. Los ratones fueron inoculados subcutáneamente (SC) con células (1:1 MatrigehPBS) en el flanco derecho. Cuando el volumen del tumor alcanzó 200 mm3 (+/-50), los ratones fueron equiparados en pares, de modo que cada grupo tuviera media y desviación estándar similares. El volumen del tumor y los pesos corporales se registraron quincenalmente. Los ratones recibieron cuatro ciclos de tratamiento de dosificación dos veces al día por dos días, recibiendo vehículo o WEE1-1 (60 mpk).

EJEMPLO 4 La inhibición de WEE1 altera la proliferación celular en diversas líneas de celulas tumorales La pérdida de la expresión de WEE1 en ratones a través de la focalización de los genes es letal, alterando el desarrollo incluso antes de que los embriones alcancen la etapa de blastocisto (día 3.5 pre-embrionario). Este fenotipo es causado por la apoptosis y mitosis prematuras en los embriones, así como el daño del ADN en los fibroblastos embrionarios de ratón que carecen del gen de WEE1 (Tominaga, Y., et ai, J. Biol. Sciences. 2006, 2(4): 161-170). Además, el silencia iento de WEE1 mediado por el ARNi lleva a viabilidad deteriorada en numerosas líneas de células humanas transformadas. WEE1-1 es un potente inhibidor competitivo de WEE1 por el ATP y sensibiliza a las células cancerosas ante el daño exógeno del ADN (Hirai, H., et al., Mol. Cáncer Ther.. 2009, 8(11): 2992-3000). Los solicitantes usaron este inhibidor de pequeña molécula para investigar los efectos de la inhibición farmacológica de WEE1 a través de un panel diverso de líneas de células tumorales humanas (figura 1).

Una amplia gama de respuestas se observó cuando 522 líneas de células cancerosas, que representan 16 tipos de tumor diferentes, se examinaron con WEE1-1 en una prueba de proliferación celular (figura 1). Los valores de la EC50 variaron de < 0,1 mM en 2% (9/522) a > 1 pM en 19% (98/522) para las líneas de células puestas a prueba. La comparación de los valores medios de la EC50 de los diferentes tipos de tumor reveló que, como grupo, las líneas de células de cáncer colorrectal fueron menos sensibles (EC50 media = 1.16 pM, n = 66, escala 0.17 a >10 pM), y las líneas de células tumorales de neuroblastoma fueron en promedio más sensibles al tratamiento con WEE1-1 (EC50 media = 0.28 pM, n = 7, escala 0.12 a 0.45 pM). El tamaño de muestra del último grupo fue limitado, pero el hallazgo de que las células de neuroblastoma tienden a ser más sensibles a la inhibición de WEE1, es consistente con los hallazgos recientes (Russell et al., manuscrito referido). Fue notable que muchas líneas de células seguían creciendo y dividiéndose, incluso en presencia de mayores concentraciones de WEE1-1. Estos datos demostraron el potencial antiproliferativo de la inhibición farmacológica de WEE1 y la diversidad entre numerosas líneas de células tumorales.

EJEMPLO 5 La inhibición de WEE1 activa la respuesta de daño del ADN Exámenes genómicos funcionales y estudios de validación han demostrado que la expresión suprimida de WEE1 lleva a rompimientos de la doble cadena del ADN y la activación de la respuesta al daño del ADN (DDR). Los solicitantes usaron a pCHKlS345 como un marcador de la DDR activada para examinar el efecto de la inhibición farmacológica de WEE1 en seis líneas de células de sensibilidad variable a WEE1-1: ES-2 (EC50 = 256 nM), A2058 (EC50 = 225 nM), A431 (EC50 = 170 nM), A427 (EC50 = 116 nM), KNS62 (EC50 = 487 nM) y NCI-H460 (ECS0 = 535 nM). Los Western blots para pCHKlS345 demostraron una activación dependiente de la dosis de la DDR en las seis líneas de células, y evidencia de pCHKlS345 incrementado con tan poco como WEE1-1 50 nM en las líneas de células más sensibles, es decir, ES-2, A2058, A431 y A427 (figura 2A). La actividad elevada de CDK como resultado del tratamiento con WEE1-1 se confirmó en células ES-2 (figura 8A). Como era de esperarse, una reducción dependiente de la dosis acompañante en pCDKlY15 se observó también en las seis líneas de células, proveyendo un enlace entre la inducción de la DDR y la actividad elevada de CDK como resultado de la inhibición de WEE1. Se sabe también que la fosforilación de CDK1 y CDK2 en T14 por PKMYT1 deteriora la actividad de la cinasa CDK1/2, y WEE1-1 inhibe a PKMYT1 in vitro a concentraciones aproximadamente 100 veces mayores que las requeridas para inhibir a WEE1 (Hirai, H., etal., 2009). Los solicitantes cuestionaron si los niveles de pCDKl™ fueron afectados por las concentraciones de WEE1-1 que indujeron daño del ADN. Con la posible salvedad de la línea de células A427, los solicitantes no observaron un efecto dependiente de WEE1-1 sobre pCDKl™ (figura 2A).

EJEMPLO 6 La inhibición de WEE1 interrumpe la dinámica de la fase S v la integridad de la replicación del ADN Para entender en dónde el daño del ADN dependiente de WEE1-1 ocurre, los solicitantes analizaron células de cáncer de ovario T0V21G mediante citometría de flujo. En células TOV21G que crecen exponencialmente, 1% a 2% de la población se tiñó positiva para el marcador gH2AC de los rompimientos de la doble cadena del ADN. Sin embargo, tan poco como dos horas de tratamiento con WEE1-1 dieron como resultado 23% de las células tiñéndose positivas para gH2AC (figura 2B, panel de la izquierda). El contenido cromosómico de las células positivas para gH2AC fue >2N, sugiriendo que el daño del ADN que surge de la inhibición de WEE1, ocurre durante o después del inicio de la replicación del ADN en la fase S. Cuando las células TOV21G fueron tratadas con WEE1-1 y marcadas con pulsos con BrdU, se detectó daño del ADN casi exclusivamente en las células positivas para BrdU (95% a 2 horas, 92% a 6 horas), lo cual apoya la observación de los solicitantes de que los rompimientos de la doble cadena del ADN son una consecuencia de la inhibición de WEE1 durante la replicación del ADN (figura 2B, panel de la derecha).

Se esperó que los rompimientos cromosómicos en la fase S activaran el punto de control de la replicación del ADN y retardaran la progresión a través de la fase S. Se llevaron a cabo estudios de sincronización de las células para confirmar esta expectativa. Se seleccionaron las líneas de células ES-2 para estos estudios, debido a que eran más receptivas que otras líneas de células a la sincronización de la fase G1 inducida por el retiro del mitógeno tras la depleción del suero (datos no mostrados). Otros procedimientos para la sincronización de la fase S (por ejemplo, doble bloque de timidina, afidicolina, hidroxlurea, actinomicina D, etc.) no se usaron, debido a que estos métodos pueden inducir independientemente daño del ADN, y son desorganizadores para la dinámica de la replicación del ADN. Como se muestra en la figura 3A, el retiro del suero por 36 horas no detuvo completamente a las células ES-2 en la Gl. Sin embargo, la adición de FBS a 20% hizo que las células ES-2 tratadas con vehículo duplicaran su población en la fase S hasta aproximadamente 40% por horas y alcanzaran un pico a 50% por 12 a 14 horas. En contraste, cuando el tratamiento con WEE1-1 se Incluyó con la adición de FBS a 20%, no hubo cambio detectable en la población en la fase S por 8 horas, y los niveles pico (aproximadamente 50%) fueron retardados hasta 24 horas post-FBS (figura 3A). Incluso en este pico, la intensidad fluorescente media de la BrdU incorporada fue mucho menor en WEE1-1 en comparación con las células tratadas con vehículo, lo cual sugiere replicación retardada del ADN en la población de células positivas para BrdU. El análisis Western blot presentado en la figura 3A confirmó la progresión retardada en la fase S (delina A), una activación más rápida y vigorosa de la DDR (pCHKlS345) e inhibición de la actividad de la cinasa WEE1 (pCDKlY15) en las células tratadas con WEE1-1 respecto a las células tratadas con vehículo. De modo interesante, la fosforilación de pCDKlY15 se incrementó durante el curso de tiempo de 24 horas en las células ES-2. El grado de los rompimientos de la doble cadena del ADN (gH2AC) inducido por 24 horas de tratamiento con WEE1-1, fue apreciablemente más grande bajo condiciones de estimulación del mitógeno en donde un incremento agudo de la replicación del ADN se observó en comparación con las células que no fueron reestimuladas (figura 3B y figuras 9A a 9B).

Los datos en el cuadro A son representativos de las células ES-2 privadas de suero a las cuales se añadió WEE1-1 500 nM en presencia o ausencia de FBS a 20%. Veinticuatro horas después, el contenido de ADN y gH2AC (rompimientos de la doble cadena del ADN) se analizaron mediante citometría de flujo. Los porcentajes de la población total de células se dan en el esquema (Cuadro A), demostrando que WEE1-1 induce rompimientos de la doble cadena del ADN en más células cuando la población es estimulada por FBS a 20%.

CUADRO A +WEE1-1 +FBS Sin FBS EJEMPLO 7 Daño del ADN como la consecuencia citotóxica primaria de la inhibición de WEE1 Se requiere WEE1 para la activación temporal de las cinasas CDK2 y CDK1 en las fases S y G2 del ciclo celular, respectivamente. Se esperó que la inhibición de WEE1, por lo tanto, llevara a defectos en la fase S (rompimientos de la doble cadena del ADN durante la replicación del ADN) y defectos en G2-M (mitosis prematura). Para evaluar si cualquiera o ambos de estos efectos son necesarios o suficientes para la sensibilidad a WEE1-1, gH2AC y la histona fosforilada H3 (pHH3), un marcador de mitosis, a concentraciones citotóxicas (EC90) de WEE1-1, se examinaron en tres líneas de células sensibles, A2058, HT-29 y LoVo. Después de 24 horas de tratamiento con WEE1-1, el porcentaje de células positivas para pHH3 se había incrementado en las tres líneas de células (figuras 4A y 4B). De las tres líneas, sólo las células HT-29 contenían una población mitótica sustancial, 43% con ADN 4N y 23% con ADN <4N, lo cual indica que la mitosis prematura de las células en fase S no había completado la replicación del ADN. Sin embargo, una población sustancial de células positivas para H2AX se observó en las tres líneas de células después del tratamiento con WEE1-1 (8% en A2058, 59% en HT-29 y 27% en LoVo). Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría, estos datos sugieren que la inducción de los rompimientos de la doble cadena del ADN (gH2AC) más que la mitosis prematura (pHH3), fue la consecuencia citotóxica primaria de la inhibición de WEE1 por WEE1-1 en las líneas de células sensibles.

EJEMPLO 8 Actividad antitumoral in vivo a partir de la inhibición de WEE1 Para determinar el efecto del tratamiento de la monoterapia con WEE1-1 sobre el crecimiento tumoral in vivo a dosis toleradas, se estableció una dosis tolerada máxima (MTD) a 60 mg por kg para la dosificación dos veces al día. La pérdida del peso corporal medio durante el curso de un estudio de 28 días a esta dosis y plan, no excedió 5% en el grupo tratado (datos no mostrados). WEE1-1 inhibió la proliferación en la línea de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas A427 a bajas concentraciones (EC50 = 116 nM), e indujo rápidamente la respuesta de daño dei ADN (figura 2A). En el modelo de xenoinjerto de A427, el tratamiento con WEE1-1 causó regresión hasta aproximadamente 50% del volumen medio inicial del tumor (figura 5A). El análisis del tumor individual mostró que 9 de los 10 tumores de A427 tratados con vehículo crecieron entre 2 a 6 veces sobre su volumen de partida (figura 5B). En contraste, los volúmenes finales para los 10 tumores tratados con WEE1-1 fueron más pequeños que sus volúmenes iniciales (figura 5B). Se observaron efectos de crecimiento antitumoral del tratamiento con el agente individual WEE1-1 en modelos de xenoinjerto adicionales (figura 5C): La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) fue de 92% en el modelo de SK-MES-l NSCLC, 13% de regresión del tumor en un modelo de tumor colorrectal LoVo, 88% de TGI en un modelo de tumor epidermoide A431 y 64% de TGI en un modelo de NCI-H2122 NSCLC. El por ciento de TGI se calculó como 100- (100 * A?/AC) si DT > 0, en donde DT = volumen medio final - volumen medio inicial del grupo tratado y AC = volumen medio final - volumen medio inicial del grupo control tratado con vehículo. En conjunto, estos datos demostraron el potencial terapéutico antitumoral de la inhibición de WEE1 a dosis bien toleradas de WEE1-1.

EJEMPLO 9 La expresión de PKMYT1 afectó la sensibilidad al inhibidor de WEE1 La expresión de WEE1 es esencial para la viabilidad embrionaria (Tomlnaga, Y., et ai, 2006), y la mayoría de las líneas de células cancerosas examinadas muestran por lo menos cierto grado de sensibilidad al tratamiento con WEE1-1 (figura 1). Sin embargo, no todas las líneas de células fueron igualmente susceptibles a la inhibición de WEE1, y los valores de la EC50 antiproliferativos variaron por lo menos 10 veces (figura 1). Los solicitantes han encontrado en la presente que un determinante potencial de la sensibilidad a la inhibición de WEE1 es la actividad de una cinasa inhibidora de CDK funcionalmente relacionada, PKMYT1. La fosforilación de CDK1 o CDK2 en cualquiera de dos sitios N-terminales, T14 o Y15, causó inactivación de esta cinasa a pesar de la presencia de un miembro de unión a cielina de otra manera activador (ciclina B o ciclina A, respectivamente). Se sabe que WEE1 fosforila a Y15 de CDK1 y CDK2, y se ha mostrado que PKMYT1 inhibe de igual manera a CDK1 y CDK2 a través de la fosforilación en T14 y/o Y15 (Mueller, P. R., etal.. Science. 1995, 270(5233): 86-90).

Los solicitantes usaron en la presente la expresión suprimida del ARNsi para evaluar si la expresión de PKMYT1 puede alterar específicamente la respuesta a la inhibición de WEE1 en dos líneas de células, NCI-H460 y KNS62. Estas líneas se seleccionaron debido a que demuestran insensibilidad relativa al tratamiento con WEE1-1, y tienen expresión relativamente alta de PKMYT1 (datos no mostrados). Las células fueron transfectadas con un grupo de cuatro moléculas de ARNsi distintas, todas focalizando a PKMYT1, y se analizaron en pruebas de proliferación para sensibilidad a diferentes agentes citotóxicos (figura 6A). Como se ilustra en la figura 6A, los valores de la EC50 antiproliferativos de WEE1-1 para NCI-H460 (n = 3) y KNS62 (n = 2) cambiaron de 677 nM a 104 nM y de 487 nM a 93 nM, respectivamente, cuando PKMYT1 fue suprimido en su expresión. Notablemente, el efecto máximo del tratamiento con WEE1-1 no fue afectado por la depleción de PKMYT1. Mediante el uso del cambio en número de veces en la EC50 como una medida de la potenciación, PKMYT1 potenció a WEE1-1 un promedio de 4.7 veces en las células NCI-H460 (n=3), y 4.9 veces en las células KNS62 (n=2). La especificidad de la sensibilización a WEE1-1 dependiente de PKMYT1 se confirmó mediante curvas de respuesta a la dosis, idénticas, en las células control (CT) y las células transfectadas con el ARNsi de PKMYT1 tratadas con carboplatino, un inhibidor de MEK (PD-0325901), o doxorrubicina (figura 6A). El análisis Western blot de las células KNS62 (figura 6B) indicó que la expresión suprimida de PKMYT1 dio como resultado fosforilación basal ligeramente menor de CDK1 y 2 en Y15, y redujo notablemente la fosforilación basal en T14 (campo 9 contra campos 1 y 5). La expresión suprimida de PKMYT1 llevó también a un incremento general en pCHKlS345 y gH2AC. Esto fue consistente con las observaciones de que la citotoxicidad mediada por WEE1-1 resultó del daño del ADN (figuras 4A y 4B), y que la expresión suprimida de PKMYT1 incremento la sensibilidad a WEE1-1 y su efecto antiproliferativo (figura 6B).

Porque la expresión suprimida de PKMYT1 llevó a sensibilidad incrementada a WEE1-1, los solicitantes formularon la hipótesis de que la baja expresión de PKMYT1 puede ser también profética de la mayoría de las líneas de células sensibles a WEE1-1. Para validar esta hipótesis, se evaluó un panel de 522 líneas de células para los niveles de ARNm de PKMYT1 usando la enciclopedia de líneas de células cancerosas (CCLE) de Broad-Novartis, una base de datos de líneas de células disponible públicamente, de la colaboración entre el Broad Institute (Cambridge, MA) y el Novartis Institute for Biomedical Research (Cambridge, MA) y su Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (San Diego, CA) (Stransky, B. C, et al., Nature. 2012, 483: 603-807). De las 522 líneas de células cancerosas puestas a prueba para la sensibilidad a WEE1-1, estuvieron disponibles los datos de la expresión para PKMYT1 para 305 líneas. Una gráfica de la expresión relativa de PKMYT1 a partir de la base de datos de la CCLE contra los datos de la respuesta observada en las líneas de células a 450 nM de WEE1-1, no demostró una correlación entre el ARNm de PKMYT1 y la sensibilidad a WEE1-1 (figura 7A). Sin embargo, 24 de las 33 líneas de células (73%) que fueron destruidas cuando fueron tratadas con WEE1-1 a 450 nM (respuesta < 0.25 en una escala ajustada, indicada por la línea a rayas en la figura 7A), tuvieron menos que el nivel de expresión medio, es decir, 413 ± 154, para el ARNm de PKMYT1.

Para poner a prueba adicionalmente la hipótesis de que la expresión de PKMYT1 fue profética de la sensibilidad a WEE1-1, se seleccionaron 13 líneas de células adicionales de la base de datos de la CCLE que no habían sido tratadas previamente con WEE1-1. Los valores de la EC50 antiprollferativos para WEE1-1 en estas 13 líneas de células, se correlacionaron con la expresión del ARNm (figura 7B, panel de la izquierda) y los niveles de proteína (figura 7B, panel de la derecha) de PKMYT1. Considerados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que la baja expresión de PKMYT1 fue profética de las líneas de células sensibles a WEE1-1, es decir, sensibilidad al tratamiento con WEE1-1.

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un inhibidor de WEE1 en la elaboración de un medicamento para tratar a un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con la cinasa WEE1, en donde se mide el nivel de expresión génica de PKMYT1 en una muestra biológica que comprende células cancerosas de dicho paciente y en una muestra control; en donde se determina si el nivel de expresión génica en la muestra de dicho paciente está arriba o abajo del nivel respecto al nivel en dicha muestra control; en donde se selecciona a dicho paciente para tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde el nivel del biomarcador profético de la muestra de dicho paciente está abajo del nivel de la muestra control.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde dicha muestra control es de uno o más sujetos quienes están libres de enfermedad, o quienes no han sido diagnosticados con un cáncer asociado con la cinasa WEE1.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1> o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6.-?I uso de un inhibidor de WEE1 en la elaboración de un medicamento para tratar a un paciente con cáncer sensible al tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde se mide el nivel de expresión génica de PKMYT1 en una muestra biológica que comprende células cancerosas de dicho paciente y en una muestra control; en donde se determina si el nivel de expresión génica en la muestra de dicho paciente está arriba o abajo del nivel respecto al nivel en dicha muestra control; en donde se identifica a dicho paciente sensible para tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde el nivel de PKMYT1 de la muestra de dicho paciente está abajo del nivel de la muestra control.

7.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicha muestra control es de uno o más sujetos quienes están libres de enfermedad, o quienes no han sido diagnosticados con un cáncer asociado con la cinasa WEE1.

8.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho cáncer es un cáncer asociado con la cinasa WEE1 seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica y linfoma de Hodgkin.

12.- El uso de un inhibidor de WEE1, en la elaboración de un medicamento para tratar a un paciente con cáncer asociado con la cinasa WEE1, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde las células cancerosas de dicho paciente que se va a tratar se caracterizan por baja expresión de PKMYT1.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

14.- Un kit para identificar a un paciente con cáncer sensible al tratamiento con un inhibidor de WEE1, que comprende un agente de detección capaz de detectar el producto de expresión de PKMYT1 en una muestra de prueba biológica.

15.- Un inhibidor de WEE1 para usarse en el tratamiento a un paciente diagnosticado con un cáncer asociado con la cinasa WEE1, en donde se mide el nivel de expresión génica de PKMYT1 en una muestra biológica que comprende células cancerosas de dicho paciente y en una muestra control; en donde se determina si el nivel de expresión génica en la muestra de dicho paciente está arriba o abajo del nivel respecto al nivel en dicha muestra control; en donde se selecciona a dicho paciente para tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde el nivel del biomarcador profético de la muestra de dicho paciente está abajo del nivel de la muestra control.

16.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 15, en donde dicha muestra control es de uno o más sujetos quienes están libres de enfermedad, o quienes no han sido diagnosticados con un cáncer asociado con la cinasa WEE1.

17.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 15, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

18.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 17, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

19.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 17, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

20.- Un inhibidor de WEE1 para usarse en el tratamiento a a un paciente con cáncer sensible al tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde se mide el nivel de expresión génica de PKMYT1 en una muestra biológica que comprende células cancerosas de dicho paciente y en una muestra control; en donde se determina si el nivel de expresión génica en la muestra de dicho paciente está arriba o abajo del nivel respecto al nivel en dicha muestra control; en donde se identifica a dicho paciente sensible para tratamiento con un inhibidor de WEE1, en donde el nivel de PKMYT1 de la muestra de dicho paciente está abajo del nivel de la muestra control.

21.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 20, en donde dicha muestra control es de uno o más sujetos quienes están libres de enfermedad, o quienes no han sido diagnosticados con un cáncer asociado con la cinasa WEE1.

22.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 20, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

23.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 22, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

24.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 22, en donde dicho inhibidor de WEE1 es WEE1-2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

25.- El inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 20, en donde dicho cáncer es un cáncer asociado con la cinasa WEE1 seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, leucemia aguda, leucemia linfática crónica, leucemia mielocítica crónica y linfoma de Hodgkin.

26.- Un inhibidor de WEE1 para usarse en el tratamiento a un paciente con cáncer asociado con la cinasa WEE1, en donde el inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o WEE1-2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde las células cancerosas de dicho paciente que se va a tratar se caracterizan por baja expresión de PKMYT1.

27.- El Inhibidor de WEE1 para usarse de la reivindicación 26, en donde el Inhibidor de WEE1 es WEE1-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.