JPH0491089A - テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方法 - Google Patents
テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオ異性体の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［０００１］
本発明は、５．６．７．８−テトラヒドロ葉酸のラセミ
混合物の５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸成分のみ
を、細菌的に誘導したホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に１０−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テト
ラヒドロ葉酸に転化させることよりなる、テトラヒドロ
葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオマーの新
規な製造方法に関するものである。 ［０００２］ 本発明を要約すれば、たとえば５．６．７．８−テトラ
ヒドロ葉酸のラセミ混合物の５．６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸成分のみをホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に１岬ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸に転化させ、続いて環化、加水分解および誘
導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）することよりなる、テ
トラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレ
オ異性体の製造方法が記載されていることである。この
方法はまた、誘導体または（放射性標識した）テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの所望の実質的
に純粋な（６Ｒまたは６Ｓ）エナンショマーを製造する
にも有用である。 ［０００３］ ロイコボリンおよびその塩は医薬として有効であること
が知られている。レミントン医薬案内（Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｅｒｖｉ
ｃｅ） 、 ７７り出版社（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ、 、 Ｅａｓｔｏｎ、 ＰＡ） １９８
５ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ｓ） １０２３ページを参
照されたい。カーフ−（Ｋｅｒｗａｒ）らのＵ、 Ｓ
、 ４．７４６．６６２は、メトトレキセートの抗関節
炎効力がロイコボリンまたはその塩の水溶液の注射によ
り増強し得ることを開示している。１９８８年５月４日
付のＥＰ○特許公報第０．２６６、０４２号は、５−フ
ルオロウラシルと組み合わせて直腸癌（ｃｏ１ｏｒｅｃ
ｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）を処置するためのメトトレキセ
ート緊急排除（ｒｅｓｃｕｅ）用の、および葉酸欠損症
（ｄｅｆ １ｃｉｅｎｃいの処置用の医薬を製造するた
めに、純粋なロイコボリン異性体を使用することを記載
しテいる。Ｕ、 Ｓ、 ４，５００，７１１において、
ワイゾヮティ−（Ｗｉｓｏｗａｔいらはロイコボリンお
よびその塩の精製を記述している。 ［０００４］ ロイコボリンは通常は塩、たとえばアルカリ金属塩およ
びアルカリ土類金属塩たとえばロイコボリンのカルシウ
ム塩の形状で投与され、リットル−異性体が好ましい。 ［０００５］ 化合物Ｎ−（（（２−アミノ−５−ホルミル−３，４，
５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソ−６プテリ
ジニル）−メチル）−アミノ）−ベンゾイル）−Ｌ−グ
ルタミン酸、カルシウム塩（１： １）五水和物（ロイ
コボリンカルシウムＵＳＰ）は、式（Ｉａ およびＩｂ
）の１：１混合物のカルシウム塩として市販されており
、これらの化合物はそれぞれＣ−６において（Ｒ）およ
び（Ｓ）立体化学性を有している。 ［０００６］
混合物の５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸成分のみ
を、細菌的に誘導したホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に１０−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テト
ラヒドロ葉酸に転化させることよりなる、テトラヒドロ
葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレオマーの新
規な製造方法に関するものである。 ［０００２］ 本発明を要約すれば、たとえば５．６．７．８−テトラ
ヒドロ葉酸のラセミ混合物の５．６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸成分のみをホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵
素の存在下に１岬ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸に転化させ、続いて環化、加水分解および誘
導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）することよりなる、テ
トラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステレ
オ異性体の製造方法が記載されていることである。この
方法はまた、誘導体または（放射性標識した）テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルの所望の実質的
に純粋な（６Ｒまたは６Ｓ）エナンショマーを製造する
にも有用である。 ［０００３］ ロイコボリンおよびその塩は医薬として有効であること
が知られている。レミントン医薬案内（Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｅｒｖｉ
ｃｅ） 、 ７７り出版社（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ、 、 Ｅａｓｔｏｎ、 ＰＡ） １９８
５ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ｓ） １０２３ページを参
照されたい。カーフ−（Ｋｅｒｗａｒ）らのＵ、 Ｓ
、 ４．７４６．６６２は、メトトレキセートの抗関節
炎効力がロイコボリンまたはその塩の水溶液の注射によ
り増強し得ることを開示している。１９８８年５月４日
付のＥＰ○特許公報第０．２６６、０４２号は、５−フ
ルオロウラシルと組み合わせて直腸癌（ｃｏ１ｏｒｅｃ
ｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）を処置するためのメトトレキセ
ート緊急排除（ｒｅｓｃｕｅ）用の、および葉酸欠損症
（ｄｅｆ １ｃｉｅｎｃいの処置用の医薬を製造するた
めに、純粋なロイコボリン異性体を使用することを記載
しテいる。Ｕ、 Ｓ、 ４，５００，７１１において、
ワイゾヮティ−（Ｗｉｓｏｗａｔいらはロイコボリンお
よびその塩の精製を記述している。 ［０００４］ ロイコボリンは通常は塩、たとえばアルカリ金属塩およ
びアルカリ土類金属塩たとえばロイコボリンのカルシウ
ム塩の形状で投与され、リットル−異性体が好ましい。 ［０００５］ 化合物Ｎ−（（（２−アミノ−５−ホルミル−３，４，
５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソ−６プテリ
ジニル）−メチル）−アミノ）−ベンゾイル）−Ｌ−グ
ルタミン酸、カルシウム塩（１： １）五水和物（ロイ
コボリンカルシウムＵＳＰ）は、式（Ｉａ およびＩｂ
）の１：１混合物のカルシウム塩として市販されており
、これらの化合物はそれぞれＣ−６において（Ｒ）およ
び（Ｓ）立体化学性を有している。 ［０００６］
【化１】
［０００７］
【化２】
［０００８］
これは主として葉酸拮抗体、たとえば、ジヒドロ葉酸の
テトラヒドロ葉酸への転化を遮ｉ （ｂｌｏｃｋ）する
メトトレキセートに対する解毒剤として使用される。ロ
イコボリン塩は水中で適当な保存剤と、内科医の手引き
（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ｓ ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ）のロイコボリンカルシウム注射（Ｌｅｕｃｏｖｏｒ
ｉｎ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ） 、第４
３版、メディカルエコノミクス社（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅ
ｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、 ０ｒａｄｅｌｌ
、 ＮＪ）１９８９ （ＰＤＲ４３版） １１２４ペー
ジに記載されているようにして注射用に配合する。 ［０００９］ 上託の２種の異性体の薬物動力学的挙動は、 （Ｓ）−
異性体（Ｉ ｂ ）が胃腸管から選択的に吸収され、（
Ｒ）−異性体（Ｉａ）よりも血清的半減期が短いことに
おいて異なる。 ［００１０１ ６Ｓジアステレオ異性体である天然起源の異性体Ｉｂ
は、その１炭素代謝の回復における有効性のために、緊
急治療用に重要であることが報告されている（テンプル
二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ Ｊｒ、 ） ローズ（Ｊ、
Ｐ、 Ｒｏｓｅ） ラスター（Ｗ、 Ｒ，Ｌａ５ｔ
ｅｒ ）およびモンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇ
ｏｍｅｒｙ） 、癌装置報告（ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ） 、 ６５．１１１７−
１１１９ （１９８１） ）。 ［００１１］ 乳酸菌（Ｌ、 ｃａｓｅｉ）よりのチミジレート合成が
テトラヒドロ葉酸５，１０−メチレンの非天然ジアステ
レオ異性体により阻害されるという報告（リーリー（Ｒ
，Ｐ。 Ｌｅａｒｙ） ゴーモン（Ｙ、 Ｇａｕｍｏｎｔ）お
よびキスリューク（Ｒ，Ｌ、 Ｋ１５ｌｉｕｋ） 、生
物化学および生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、
） 、 ５６゜４８４−４８８ （１９７４） ）な
らびに大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１）よりのテトラヒドロ葉
酸５．１０−メチレン脱水素酵素も同一のジアステレオ
異性体により阻害されるという報告（スコツト（Ｖ、
Ｆ、 ５ｃｏｔｔ）およびドナルドソン（Ｋ、 ０．
Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ） 、生物化学および生物物理学
研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 ） 、 １４．５２３
−５２６ （１９６４） ）が、１０−ホルミルテトラ
ヒドロ葉酸化合物の同一のジアステレオ異性体がニワト
リの肝臓からのグリシンアミドリボヌクレオチドホルミ
ル転移酵素（ＧＡＲ）の潜在的な競合的阻害剤であると
いう観察（スミス（Ｇ、 Ｋ、 Ｓｍ１ｔｈ）ペンコビ
ッチ（Ｐ、 Ａ、 Ｂｅｎｋｏｖｉｃ）およびペンコビ
ッチ（Ｓ、 Ｊ、 Ｂｅｎｋｏｖｉｃ） 、生化学（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、） ２０．４０３４−４０３６） （
１９８１） ）と結び付いて、テトラヒドロ葉酸化合物
の１炭素誘導体の非天然ジアステレオ異性体によるピリ
ミジン生合成およびプリン生合成の双方の、ひいてはＤ
ＮＡ生合成の阻害を指摘している。したがって、非天然
形状が生物学的に不活性であるとは考えられない、この
種の阻害が哨乳類系に存在するならば、テトラヒドロ葉
酸化合物、特にロイコボリンの天然の（６Ｓ）形状のみ
に対する潜在的な臨床的要求が存在する。 ジアステレ
オ異性体成分Ｉａ およびＩｂ は分別結晶化により、
（コスリヒ（Ｄ、 Ｂ、 Ｃｏ５ｕｌｉｃｈ） スミ
ス二世（Ｊ、 Ｍ、 Ｓｍ１ｔｈ Ｊｒ、 ）およびプ
ログリスト（Ｈ，Ｐ、 Ｐｒｏｇｌｉｓｔ）アメリカ化
学会誌（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、） 、 ７
４．４２１５ （１９５３） ）また、クロマトグラフ
ィーにより（フィー＝ −（Ｊ、 Ｆｅｅｎｅい、バー
ドソール（Ｂ、 Ｂｉｒｄｓａｌｌ） アルブランド
（Ｊ、Ｐ、Ａｌｂｒａｎｄ） ｏパーツ（Ｇ、 Ｃ，
Ｋ、 Ｒｏｂｅｒｔｓ） ブンゲン（Ａ、 Ｓ。 Ｂｕｎｇｅｎ） チャールトン（Ｐ、 Ａ、Ｃｈａｒ
ｌｔｏｎ）およびヤング（Ｄ、 Ｗ、 Ｙｏｕｎｇ）
、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 、 ２０．１８３７
（１９８１） ）分離されている。ジヒドロ葉酸還元酵
素により触媒されたジヒドロ葉酸化合物の立体特異的還
元は、立体特異的に６（Ｓ）−異性体を与えると報告さ
れている（リーズ（Ｌ、 Ｒｅｅｓ） ヴアレンテ（
Ｅ、 Ｖａｌｅｎｔｅ） サクリング（ｃ，Ｊ、 Ｓｕ
ｃｋｌｉｎｇ）およびウッド（Ｈ，Ｃ，Ｓ、 Ｗｏｏｄ
） 、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ） 、
４２．１１７ （１９８６） ）。 ［００１２］ リーズ、ヴアレンテ、サクリングおよびウッドの論文、
テトラヘドロン、斡。 １１７−１３６ （１９８６）は、ロイコボリンを含む
テトラヒドロ葉酸の対掌性誘導体の合成を記述している
。この系は大腸菌からのジヒドロ葉酸還元酵素の使用と
広範囲の、経費のかかる還元補足因子ＮＡＤＰＨの再循
環とを必要とする。リーズサクリングおよびウッドの他
の論文、化学会誌化学通信（Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ
、Ｃｈｅｍ。 Ｃｏｍｍｕｎ、） ４７０ （１９８７） （ヨーａ
ツバ特許出願０２６６０４２ Ａ２）は、クロロギ酸（
−）−メンチルを用いる６（Ｒ，Ｓ）−テトラヒドロ葉
酸化合物をアシル化してジアステレオ異性体混合物とし
てのＮ−５誘導体を与え、これを分別沈澱により分離す
ることを記載している。引き続き、各ジアステレオ異性
体をギ酸と酢酸中の臭化水素とで処理し、続いて加水分
解して５−ホルミルテトラヒドロ葉酸化合物の各ジアス
テレオ異性体を得る。 ［００１３］ テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステ
レオ異性体が本発明に従ってより容易に製造し得ること
がここに見いだされた。本件方法は、主要段階が１種の
酵素、他の呼び方ではギ酸活性化酵素またはホルミルテ
トラヒドロ葉酸合成酵素（ＦＴＨＦＳ）と呼ばれる、５
．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ葉酸（ＩＩ ａ
、ｂ）のラセミ混合物に使用した場合に所望のホルミル
基を６Ｓジアステレオ異性体のみに選択的に添加する、
テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼの使用を要求するのみで
あるために、驚Ｘはど簡単であることにおいて、これま
でに公刊された、または特許された方法を超える主要な
利点を有している。この酵素の利用はさらに、広範囲な
補助因子の再生系を使用する必要がないことにおいて、
酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を超える明確な利
点をも有している。 ［００１４］ テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼは、ミクロコックス・ア
エロゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃまた、他の微生物、植物
および動物により得ることができる（バトレア（Ｄ、
ＨＢｕｔｌａｉｒｅ、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） 、 ６６、５８５−５９
９ （１９８０））。 ［００１５］ 放射性標識したギ酸アンモニウム、または工程内で製造
したもの、放射性標識したギ酸塩もしくは酵素的ホルミ
ル化中の誘導体を含む他のいかなるものを用いても標識
した（ＩＩＩ ｂ ）が得られ、標識しな（ＩＶｂ）ま
たは標識した（より ）に転化させることができる。酵
素５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼの助けを借りれば、放射性標識した、ホルミル基を有
する５、６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸化合物（Ｉｂ
、ＩＩＩ ｂ、またはＩＶ ｂ ） 好ましくは（Ｆ
ｂ ）のいかなるものも、標識した５、１０−メチレ
ン−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸に転化さ
せることができ、さらにこれを酵素５，１０−メチレン
テトラヒドロ葉酸レダクターゼの作用下に放射性標識し
た５−メチル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸に転化させることができる。したがって、本発明の適
用により生成した放射性標識した（Ｉ ｂ ）は、放射
性標識した５、 ６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸誘導体の製造に有用な化合物である。 ［００１６］ 本発明の方法はまた、予期しないことであっため飄酵素
によりホルミル化されない５．６Ｒ，７，８−テトラヒ
ドロ葉酸（工Ｉａ）の単離を可能にするのである。単離
された（王Ｉａ）はそのままで販売する（希少化合物と
して市販されている）ことができるか、または、たとえ
ばモラン（Ｒ，Ｇ、 Ｍｏｒａｎ）およびコルマン（Ｐ
、 Ｄ、 Ｃｏｌｍａｎ） 、分析生化学（Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、） １２２．７０−７８ （１９８
２）に記載されている方法と同様にして、水溶性カルボ
ジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミドを使用して、または使用する
ことなく、ギ酸を用いて５−ホルミル−５，６Ｒ，７，
８−テトラヒドロ葉酸（Ｉａ）の製造用の出発物質とし
て使用することができる。しかし、（ＩＩＩ ｂ ）の
（ＩＶ）および／または（Ｉ ｂ ）への転化が完了し
たのちの（ＩＩ ａ ）の単離が好ましい。このことは
、たとえば逆相クロマトグラフィーによる各成分のより
容易な分離を可能にする。また（ＩＩ ａ ）は、（Ｉ
Ｉ ａ ）の５−位がなお反応性であり、他方（ＩＶ
ｂ ）または（Ｉ ｂ ）の５−位は反応性でないので
、（ＩＶｂ）および／または（Ｉ ｂ ）の存在下に改
変（ｍｏｄｉｆｙ） して誘導体化した（ＩＩ ａ ）
たとえば５−カルボキシメチル−５，６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸を製造することができ、これは簡単
な吸収段階で（ＩＶ ｂ ）または（Ｉ ｂ ）から分
離することができる。 ［００１７］ さらに、分離した（ＩＩ ａ ）はテンプル二世（ｃ，
Ｔｅｍｐｌｅ、 Ｊｒ、） ベネット二世（Ｌ、 Ｌ
、 Ｂｅｎｅｔｔ、 Ｊｒ、） ローズ（Ｊ、 Ｄ
、 Ｒｏｓｅ） エリオツド（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔ
ｔ）モンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒい
およびマンガム（Ｊ、 Ｈ，Ｍａｎｇｕｍ） 、医化学
雑誌 （Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ２５．
１６１−１６６ （１９８２）に報告されているものと
同様にして反応させ、種々の５−および１０−置換、５
，１０−ジ置換、および５，１〇−橋架は置換５，６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体を製造することがで
きる。特に５−メチル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒド
ロ葉酸化合物は、ブレア（Ｊ、Ａ、 Ｂｌａｉｒ）およ
びソーンダース（Ｋ、 Ｊ、 ５ａｕｎｄｅｒｓ）、分
析生化学（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、） ３４．３
７６ （１９７０）の方法に記載されているものと同様
にして、塩基性条件下でホルムアルデヒドとホウ水素化
ナトリウムとを用いて（ＩＩ ａ ）より合成すること
ができる。硫酸ジメチルを用いる、Ｎ、Ｎ−ジメチルア
セタミド中、５５℃における（ＩＩ ａ ）のアルキル
化は、日本特許７３３２．１２０ （１９７３） ；
ケミカル・アブストラクツ（ｃｂｅｍ、 Ａｂｓｔ、）
、 ８０．２７９２ｘ （１９７４）に記載されてい
る方法を使用することにより達成される。 ［００１８］ 上記の各反応中のギ酸またはアルキル化剤を放射性標識
したギ酸もしくはその誘導体、または放射性標識したア
ルキル化剤置き換えることにより、放射性標識した５、
６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体が得られる。 ［００１９］ 本発明に従えば、たとえば酵素的メカニズムを研究する
試験に有用な化合物である放射性標識した５、６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸誘導体および放射性標識した５
、６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体の双方、なら
びにそれらの塩を個別に製造することができる。 ［００２０］ 本発明に従えば、 （ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換テトラヒ
ドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの６Ｒ
および６Ｓジアステレオ異性体の混合物の６Ｓ形状を酵
素的にホルミル化して１０−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；存在すれば未反応の５．６Ｓ、７．８−テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未反応の
５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルよりなる混合物を形成させ；（ｂ）
（１） １０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルから分離し、その後環化し、上記の１０−ホルミル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを環化し、加水分解して５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５
−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸
またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの
双方を形成させるか；または、（２）上記の１０−ホル
ミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルを５．６Ｒ，７，８−テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５−ホルミル−５，６
Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはそれらの塩も
しくはエステルを、またはこれらの双方を形成させ：そ
の後、（ｉ） ５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸ま
たはその塩もしくはエステルを誘導体化して５−置換５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを形成すせ、ついで各成分を分離するか、ま
たは、これに替えて（ｉｉ）全ての５，１０−メテニル
−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸および全て
の５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸
、またはそれらの塩もしくはエステルを５、６ Ｒ、７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
から分離し；分離後、所望ならば、 （３）上記の未反応の５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを化学的にホルミル
化し、環化し、加水分解して５−ホルミル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを製造するが、または、これに替えて、上記の５．６
Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステルを他の官能基で誘導体化して５−置換５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル、または５−ホルミル−５，６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する酸
、塩またはエステルに転化させる各段階よりなる、テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル誘導体の所
望の実質的に純粋な（６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異
性体の製造方法が提供される。 ［００２１］ 本件方法の生成物は本来、たとえば治療に、および他の
価値ある生成物を製造するための中間体として価値があ
り、放射性標識した場合には、たとえば酵素的メカニズ
ムの研究に使用することができる。当業者には、この種
の化合物をこの種の目的に使用する方法は周知されてい
るであろう。 本件方法は好ましくは、所望の実質的に純粋な５−ホル
ミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルの製造に使用される。この種の
化合物は救急薬剤として価値ある性質を有している。特
に好ましいものは、テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼを含
む酵素を選択的ホルミル化に使用する方法である。また
本件方法は（放射性標識しな）テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルの誘導体の所望の実質的に純粋
な （６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異性体の製造に
も有用である。この種の物質は酵素的メカニズムの研究
に使用することができる。 ［００２２］ 本発明に使用する出発化合物は、生化学的転移反応の技
術分野での熟練者に周知されている技術により製造する
ことができる。ＩＩａ（Ｒ） とＩＩｂ（Ｓ） との
混合物は、テンプル二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ、 Ｊｒ
、） −ｒ−リオット（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔｔ）
ローズ（Ｊ、Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリー（
Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌（Ｊ
、 Ｍｅｄ。 Ｃｈｅｍ、）、η、 ７３１ （１９７９）の方法を使
用して、葉酸のホウ水素化ナトリウム還元により製造す
ることができる。 ［００２３］ これらの物質から出発すれば、本発明の方法の反応様式
は図式１に示すとおりである： ［００２４］
テトラヒドロ葉酸への転化を遮ｉ （ｂｌｏｃｋ）する
メトトレキセートに対する解毒剤として使用される。ロ
イコボリン塩は水中で適当な保存剤と、内科医の手引き
（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ｓ ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ）のロイコボリンカルシウム注射（Ｌｅｕｃｏｖｏｒ
ｉｎ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ） 、第４
３版、メディカルエコノミクス社（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅ
ｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、 ０ｒａｄｅｌｌ
、 ＮＪ）１９８９ （ＰＤＲ４３版） １１２４ペー
ジに記載されているようにして注射用に配合する。 ［０００９］ 上託の２種の異性体の薬物動力学的挙動は、 （Ｓ）−
異性体（Ｉ ｂ ）が胃腸管から選択的に吸収され、（
Ｒ）−異性体（Ｉａ）よりも血清的半減期が短いことに
おいて異なる。 ［００１０１ ６Ｓジアステレオ異性体である天然起源の異性体Ｉｂ
は、その１炭素代謝の回復における有効性のために、緊
急治療用に重要であることが報告されている（テンプル
二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ Ｊｒ、 ） ローズ（Ｊ、
Ｐ、 Ｒｏｓｅ） ラスター（Ｗ、 Ｒ，Ｌａ５ｔ
ｅｒ ）およびモンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇ
ｏｍｅｒｙ） 、癌装置報告（ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ） 、 ６５．１１１７−
１１１９ （１９８１） ）。 ［００１１］ 乳酸菌（Ｌ、 ｃａｓｅｉ）よりのチミジレート合成が
テトラヒドロ葉酸５，１０−メチレンの非天然ジアステ
レオ異性体により阻害されるという報告（リーリー（Ｒ
，Ｐ。 Ｌｅａｒｙ） ゴーモン（Ｙ、 Ｇａｕｍｏｎｔ）お
よびキスリューク（Ｒ，Ｌ、 Ｋ１５ｌｉｕｋ） 、生
物化学および生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、
） 、 ５６゜４８４−４８８ （１９７４） ）な
らびに大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１）よりのテトラヒドロ葉
酸５．１０−メチレン脱水素酵素も同一のジアステレオ
異性体により阻害されるという報告（スコツト（Ｖ、
Ｆ、 ５ｃｏｔｔ）およびドナルドソン（Ｋ、 ０．
Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ） 、生物化学および生物物理学
研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 ） 、 １４．５２３
−５２６ （１９６４） ）が、１０−ホルミルテトラ
ヒドロ葉酸化合物の同一のジアステレオ異性体がニワト
リの肝臓からのグリシンアミドリボヌクレオチドホルミ
ル転移酵素（ＧＡＲ）の潜在的な競合的阻害剤であると
いう観察（スミス（Ｇ、 Ｋ、 Ｓｍ１ｔｈ）ペンコビ
ッチ（Ｐ、 Ａ、 Ｂｅｎｋｏｖｉｃ）およびペンコビ
ッチ（Ｓ、 Ｊ、 Ｂｅｎｋｏｖｉｃ） 、生化学（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、） ２０．４０３４−４０３６） （
１９８１） ）と結び付いて、テトラヒドロ葉酸化合物
の１炭素誘導体の非天然ジアステレオ異性体によるピリ
ミジン生合成およびプリン生合成の双方の、ひいてはＤ
ＮＡ生合成の阻害を指摘している。したがって、非天然
形状が生物学的に不活性であるとは考えられない、この
種の阻害が哨乳類系に存在するならば、テトラヒドロ葉
酸化合物、特にロイコボリンの天然の（６Ｓ）形状のみ
に対する潜在的な臨床的要求が存在する。 ジアステレ
オ異性体成分Ｉａ およびＩｂ は分別結晶化により、
（コスリヒ（Ｄ、 Ｂ、 Ｃｏ５ｕｌｉｃｈ） スミ
ス二世（Ｊ、 Ｍ、 Ｓｍ１ｔｈ Ｊｒ、 ）およびプ
ログリスト（Ｈ，Ｐ、 Ｐｒｏｇｌｉｓｔ）アメリカ化
学会誌（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、） 、 ７
４．４２１５ （１９５３） ）また、クロマトグラフ
ィーにより（フィー＝ −（Ｊ、 Ｆｅｅｎｅい、バー
ドソール（Ｂ、 Ｂｉｒｄｓａｌｌ） アルブランド
（Ｊ、Ｐ、Ａｌｂｒａｎｄ） ｏパーツ（Ｇ、 Ｃ，
Ｋ、 Ｒｏｂｅｒｔｓ） ブンゲン（Ａ、 Ｓ。 Ｂｕｎｇｅｎ） チャールトン（Ｐ、 Ａ、Ｃｈａｒ
ｌｔｏｎ）およびヤング（Ｄ、 Ｗ、 Ｙｏｕｎｇ）
、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 、 ２０．１８３７
（１９８１） ）分離されている。ジヒドロ葉酸還元酵
素により触媒されたジヒドロ葉酸化合物の立体特異的還
元は、立体特異的に６（Ｓ）−異性体を与えると報告さ
れている（リーズ（Ｌ、 Ｒｅｅｓ） ヴアレンテ（
Ｅ、 Ｖａｌｅｎｔｅ） サクリング（ｃ，Ｊ、 Ｓｕ
ｃｋｌｉｎｇ）およびウッド（Ｈ，Ｃ，Ｓ、 Ｗｏｏｄ
） 、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ） 、
４２．１１７ （１９８６） ）。 ［００１２］ リーズ、ヴアレンテ、サクリングおよびウッドの論文、
テトラヘドロン、斡。 １１７−１３６ （１９８６）は、ロイコボリンを含む
テトラヒドロ葉酸の対掌性誘導体の合成を記述している
。この系は大腸菌からのジヒドロ葉酸還元酵素の使用と
広範囲の、経費のかかる還元補足因子ＮＡＤＰＨの再循
環とを必要とする。リーズサクリングおよびウッドの他
の論文、化学会誌化学通信（Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ
、Ｃｈｅｍ。 Ｃｏｍｍｕｎ、） ４７０ （１９８７） （ヨーａ
ツバ特許出願０２６６０４２ Ａ２）は、クロロギ酸（
−）−メンチルを用いる６（Ｒ，Ｓ）−テトラヒドロ葉
酸化合物をアシル化してジアステレオ異性体混合物とし
てのＮ−５誘導体を与え、これを分別沈澱により分離す
ることを記載している。引き続き、各ジアステレオ異性
体をギ酸と酢酸中の臭化水素とで処理し、続いて加水分
解して５−ホルミルテトラヒドロ葉酸化合物の各ジアス
テレオ異性体を得る。 ［００１３］ テトラヒドロ葉酸化合物の光学異性的に純粋なジアステ
レオ異性体が本発明に従ってより容易に製造し得ること
がここに見いだされた。本件方法は、主要段階が１種の
酵素、他の呼び方ではギ酸活性化酵素またはホルミルテ
トラヒドロ葉酸合成酵素（ＦＴＨＦＳ）と呼ばれる、５
．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ葉酸（ＩＩ ａ
、ｂ）のラセミ混合物に使用した場合に所望のホルミル
基を６Ｓジアステレオ異性体のみに選択的に添加する、
テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼの使用を要求するのみで
あるために、驚Ｘはど簡単であることにおいて、これま
でに公刊された、または特許された方法を超える主要な
利点を有している。この酵素の利用はさらに、広範囲な
補助因子の再生系を使用する必要がないことにおいて、
酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を超える明確な利
点をも有している。 ［００１４］ テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼは、ミクロコックス・ア
エロゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃまた、他の微生物、植物
および動物により得ることができる（バトレア（Ｄ、
ＨＢｕｔｌａｉｒｅ、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄ Ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） 、 ６６、５８５−５９
９ （１９８０））。 ［００１５］ 放射性標識したギ酸アンモニウム、または工程内で製造
したもの、放射性標識したギ酸塩もしくは酵素的ホルミ
ル化中の誘導体を含む他のいかなるものを用いても標識
した（ＩＩＩ ｂ ）が得られ、標識しな（ＩＶｂ）ま
たは標識した（より ）に転化させることができる。酵
素５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼの助けを借りれば、放射性標識した、ホルミル基を有
する５、６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸化合物（Ｉｂ
、ＩＩＩ ｂ、またはＩＶ ｂ ） 好ましくは（Ｆ
ｂ ）のいかなるものも、標識した５、１０−メチレ
ン−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸に転化さ
せることができ、さらにこれを酵素５，１０−メチレン
テトラヒドロ葉酸レダクターゼの作用下に放射性標識し
た５−メチル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸に転化させることができる。したがって、本発明の適
用により生成した放射性標識した（Ｉ ｂ ）は、放射
性標識した５、 ６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸誘導体の製造に有用な化合物である。 ［００１６］ 本発明の方法はまた、予期しないことであっため飄酵素
によりホルミル化されない５．６Ｒ，７，８−テトラヒ
ドロ葉酸（工Ｉａ）の単離を可能にするのである。単離
された（王Ｉａ）はそのままで販売する（希少化合物と
して市販されている）ことができるか、または、たとえ
ばモラン（Ｒ，Ｇ、 Ｍｏｒａｎ）およびコルマン（Ｐ
、 Ｄ、 Ｃｏｌｍａｎ） 、分析生化学（Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、） １２２．７０−７８ （１９８
２）に記載されている方法と同様にして、水溶性カルボ
ジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミドを使用して、または使用する
ことなく、ギ酸を用いて５−ホルミル−５，６Ｒ，７，
８−テトラヒドロ葉酸（Ｉａ）の製造用の出発物質とし
て使用することができる。しかし、（ＩＩＩ ｂ ）の
（ＩＶ）および／または（Ｉ ｂ ）への転化が完了し
たのちの（ＩＩ ａ ）の単離が好ましい。このことは
、たとえば逆相クロマトグラフィーによる各成分のより
容易な分離を可能にする。また（ＩＩ ａ ）は、（Ｉ
Ｉ ａ ）の５−位がなお反応性であり、他方（ＩＶ
ｂ ）または（Ｉ ｂ ）の５−位は反応性でないので
、（ＩＶｂ）および／または（Ｉ ｂ ）の存在下に改
変（ｍｏｄｉｆｙ） して誘導体化した（ＩＩ ａ ）
たとえば５−カルボキシメチル−５，６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸を製造することができ、これは簡単
な吸収段階で（ＩＶ ｂ ）または（Ｉ ｂ ）から分
離することができる。 ［００１７］ さらに、分離した（ＩＩ ａ ）はテンプル二世（ｃ，
Ｔｅｍｐｌｅ、 Ｊｒ、） ベネット二世（Ｌ、 Ｌ
、 Ｂｅｎｅｔｔ、 Ｊｒ、） ローズ（Ｊ、 Ｄ
、 Ｒｏｓｅ） エリオツド（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔ
ｔ）モンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒい
およびマンガム（Ｊ、 Ｈ，Ｍａｎｇｕｍ） 、医化学
雑誌 （Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ２５．
１６１−１６６ （１９８２）に報告されているものと
同様にして反応させ、種々の５−および１０−置換、５
，１０−ジ置換、および５，１〇−橋架は置換５，６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体を製造することがで
きる。特に５−メチル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒド
ロ葉酸化合物は、ブレア（Ｊ、Ａ、 Ｂｌａｉｒ）およ
びソーンダース（Ｋ、 Ｊ、 ５ａｕｎｄｅｒｓ）、分
析生化学（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、） ３４．３
７６ （１９７０）の方法に記載されているものと同様
にして、塩基性条件下でホルムアルデヒドとホウ水素化
ナトリウムとを用いて（ＩＩ ａ ）より合成すること
ができる。硫酸ジメチルを用いる、Ｎ、Ｎ−ジメチルア
セタミド中、５５℃における（ＩＩ ａ ）のアルキル
化は、日本特許７３３２．１２０ （１９７３） ；
ケミカル・アブストラクツ（ｃｂｅｍ、 Ａｂｓｔ、）
、 ８０．２７９２ｘ （１９７４）に記載されてい
る方法を使用することにより達成される。 ［００１８］ 上記の各反応中のギ酸またはアルキル化剤を放射性標識
したギ酸もしくはその誘導体、または放射性標識したア
ルキル化剤置き換えることにより、放射性標識した５、
６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体が得られる。 ［００１９］ 本発明に従えば、たとえば酵素的メカニズムを研究する
試験に有用な化合物である放射性標識した５、６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸誘導体および放射性標識した５
、６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸誘導体の双方、なら
びにそれらの塩を個別に製造することができる。 ［００２０］ 本発明に従えば、 （ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換テトラヒ
ドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの６Ｒ
および６Ｓジアステレオ異性体の混合物の６Ｓ形状を酵
素的にホルミル化して１０−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；存在すれば未反応の５．６Ｓ、７．８−テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未反応の
５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルよりなる混合物を形成させ；（ｂ）
（１） １０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルから分離し、その後環化し、上記の１０−ホルミル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを環化し、加水分解して５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５
−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸
またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの
双方を形成させるか；または、（２）上記の１０−ホル
ミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルを５．６Ｒ，７，８−テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に
環化、加水分解して５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５−ホルミル−５，６
Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはそれらの塩も
しくはエステルを、またはこれらの双方を形成させ：そ
の後、（ｉ） ５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸ま
たはその塩もしくはエステルを誘導体化して５−置換５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを形成すせ、ついで各成分を分離するか、ま
たは、これに替えて（ｉｉ）全ての５，１０−メテニル
−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸および全て
の５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸
、またはそれらの塩もしくはエステルを５、６ Ｒ、７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
から分離し；分離後、所望ならば、 （３）上記の未反応の５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを化学的にホルミル
化し、環化し、加水分解して５−ホルミル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを製造するが、または、これに替えて、上記の５．６
Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステルを他の官能基で誘導体化して５−置換５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル、または５−ホルミル−５，６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する酸
、塩またはエステルに転化させる各段階よりなる、テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル誘導体の所
望の実質的に純粋な（６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異
性体の製造方法が提供される。 ［００２１］ 本件方法の生成物は本来、たとえば治療に、および他の
価値ある生成物を製造するための中間体として価値があ
り、放射性標識した場合には、たとえば酵素的メカニズ
ムの研究に使用することができる。当業者には、この種
の化合物をこの種の目的に使用する方法は周知されてい
るであろう。 本件方法は好ましくは、所望の実質的に純粋な５−ホル
ミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルの製造に使用される。この種の
化合物は救急薬剤として価値ある性質を有している。特
に好ましいものは、テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼを含
む酵素を選択的ホルミル化に使用する方法である。また
本件方法は（放射性標識しな）テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルの誘導体の所望の実質的に純粋
な （６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異性体の製造に
も有用である。この種の物質は酵素的メカニズムの研究
に使用することができる。 ［００２２］ 本発明に使用する出発化合物は、生化学的転移反応の技
術分野での熟練者に周知されている技術により製造する
ことができる。ＩＩａ（Ｒ） とＩＩｂ（Ｓ） との
混合物は、テンプル二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ、 Ｊｒ
、） −ｒ−リオット（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔｔ）
ローズ（Ｊ、Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリー（
Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌（Ｊ
、 Ｍｅｄ。 Ｃｈｅｍ、）、η、 ７３１ （１９７９）の方法を使
用して、葉酸のホウ水素化ナトリウム還元により製造す
ることができる。 ［００２３］ これらの物質から出発すれば、本発明の方法の反応様式
は図式１に示すとおりである： ［００２４］
【化３】
区ブＬ −ｔ
エエａ
［００２５］
［００２６］
図式２に示したように、クロマトグラフィーにより （
ＩＩＩ ｂ ）から分離し得る（ＩＩ ａ ）をギ酸で
ホルミル化して、非連続的な（Ｉａ）の形成反応中にイ
ミダゾリニウム塩（ＩＶ ａ ）を得、これを結晶化し
たのちに加水分解してロイコボリンの純粋な非天然異性
体（Ｉａ）を得る。これに替えて、 （ＩＩＩ ｂ ）
と（ＩＩａ）との混合物から出発して（ＩＩより ）を
（ＩＶｂ）および／または（Ｉ ｂ ）に転化させ、こ
こで（ＩＶｂ ）および／または（Ｉ ｂ ）と（ＩＩ
ａ）との混合物を製造することもできる。この混合物の
成分、すなわち（ＩＩ ａ ）と（ＩＶｂ）および／ま
たは（Ｉ ｂ ）とは、クロマトグラフィーにより容易
に分離することができる。 この単離工程も、６Ｒテトラヒドロ葉酸ジアステレオ異
性体と６Ｓ異性体との実際上の分割を構成している。（
ＩＩａ）は（Ｉａ）に化学的に変換することができるの
で、本発明は形式上、より一般的にはロイコボリンの天
然形状および非天然形状と呼ばれる（Ｉ ｂ ）と（Ｉ
ａ）との効果的な分割方法を完成する。 ［００２７］
ＩＩＩ ｂ ）から分離し得る（ＩＩ ａ ）をギ酸で
ホルミル化して、非連続的な（Ｉａ）の形成反応中にイ
ミダゾリニウム塩（ＩＶ ａ ）を得、これを結晶化し
たのちに加水分解してロイコボリンの純粋な非天然異性
体（Ｉａ）を得る。これに替えて、 （ＩＩＩ ｂ ）
と（ＩＩａ）との混合物から出発して（ＩＩより ）を
（ＩＶｂ）および／または（Ｉ ｂ ）に転化させ、こ
こで（ＩＶｂ ）および／または（Ｉ ｂ ）と（ＩＩ
ａ）との混合物を製造することもできる。この混合物の
成分、すなわち（ＩＩ ａ ）と（ＩＶｂ）および／ま
たは（Ｉ ｂ ）とは、クロマトグラフィーにより容易
に分離することができる。 この単離工程も、６Ｒテトラヒドロ葉酸ジアステレオ異
性体と６Ｓ異性体との実際上の分割を構成している。（
ＩＩａ）は（Ｉａ）に化学的に変換することができるの
で、本発明は形式上、より一般的にはロイコボリンの天
然形状および非天然形状と呼ばれる（Ｉ ｂ ）と（Ｉ
ａ）との効果的な分割方法を完成する。 ［００２７］
【化５】
図式
％式％］
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、いかな
る様式であれ、特許請 求の範囲を限定することを意図したものではない。 ［００２９］ ロストリジウム （ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種ＡＴＣＣ第７９０５ とも呼ばれる） の単離 および増殖を行う。 ［００３０］ クロストリジウムは嫌気性菌であるので、全ての培養生
産、保持および取り扱い操作は苗株の酸素への暴露を最
小にする条件下で行う。同様に、テトラヒドロ葉酸化合
物およびその誘導体の極端な酸素不安定性のために、こ
れらの化合物を含む全ての工程は酸素の不存在で行う。 無酸素の気体窒素源に接続したプラスチックス製の嫌気
袋装置をこの目的に使用する。
る様式であれ、特許請 求の範囲を限定することを意図したものではない。 ［００２９］ ロストリジウム （ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種ＡＴＣＣ第７９０５ とも呼ばれる） の単離 および増殖を行う。 ［００３０］ クロストリジウムは嫌気性菌であるので、全ての培養生
産、保持および取り扱い操作は苗株の酸素への暴露を最
小にする条件下で行う。同様に、テトラヒドロ葉酸化合
物およびその誘導体の極端な酸素不安定性のために、こ
れらの化合物を含む全ての工程は酸素の不存在で行う。 無酸素の気体窒素源に接続したプラスチックス製の嫌気
袋装置をこの目的に使用する。
【００３月
１、尿酸増殖媒体の製造。
［００３２］
ＡＴＣＣ媒体ハンドブック（ＡＴＣＣＭｅｄｉａ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ）−調合法第５１９に記載されているもの
と同様にして尿酸媒体を製造する：尿酸媒体組戊掬 尿酸 ３．０ｇ酵母抽出
液 １．０ｇリン酸二水素ナ
トリウム ４．０ｇ硫酸マグネシウム七水
和物０．１ｇ 硫酸鉄（ＩＩ） ５．０
ｍｇ＊Ｑ、 ０４％フェノールレッド溶液 １．
０ｇチオグリコール酸ナトリウム ０．５ｇ蒸
留水 １．０リットル＊
０．１ｇの指示薬に必要な０．０１Ｎ水酸化ナトリウム
１４．９ｍ１０蒸留水で２５０ｍ１に希釈し、０．０４
％溶液とする。 ［００３３］ この媒体を製造する際には、尿酸を液体のほとんど全体
積に懸濁させ、沸騰するまで加熱し、フェノールレッド
のバラ色が定常的になる（ｐＨ７，６）ように水酸化ナ
トリウムで調節する。ｐＨをｐＨ試験紙で検査する。固
体媒体には、上記の媒体に２０．０ｇの寒天を添加する
。 ［００３４］ この媒体をスクリューキャップフラスコに、はぼ全体積
にまで注ぎ入れ、ついで無酸素の気体窒素でパージしな
がら煮沸する。加圧 （ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の直後に
フラスコのキャップを十分緊密に締める。 ［００３５］ この媒体を室温で貯蔵して、低温における尿酸の沈澱を
避ける。 ［００３６］ 週狸二）培養液の接種。 ［００３７］ 全ての手順をクロ４−ブバツグ中の嫌気条件下で実施す
る。液体尿酸媒体の１．０ｍ１部分を、ＡＴＣＣから得
た細菌の凍結乾燥したペレットに添加する。このペレッ
トを溶解させ、滅菌使い捨て接種ループを用いて、再懸
濁させた培養液を尿酸平板（ｐｌａｔｉｎｇ）媒体上に
画Ｒ（ｓｔｒｅａｋ）させる。この平板をＨ，Ｃ○２発
生外被（ｅｎｖｅｌ ｏｐｅ）とメチレンブルー帯状試
験紙とを含有する嫌気ジャーに入れる。 接種した平板を含有するジャーを３７℃で培養する。２
４時間以内に平板上で、コロニーから放射される明るい
透明な指状の突出物（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として、
増殖が見られる。位相差顕微鏡下で見られる代表的なコ
ロニーの試料は典型的なり口［００３８］ ［００３９］ フンゲート（）Ｉｕｎｇａｔｅ）管（ペルコグラス社（
Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ、 ） ）−各管中の
媒体１０ｍ１−中で尿酸平板媒体を製造し、定常的なり
ロストリジウム・シリンドロスポルムの貯蔵培養液の供
給源として使用に供する。上記のコロニーの細胞の単一
のコロニー小片を滅菌接種ループで取り出し、フンゲー
ト管の媒体中に刺し込む。この手順は気体窒素を含有す
る嫌気バッグ中で行う。このフンゲート管を嫌気ジャー
に入れ、３５℃で培養する。５日後、このフンゲート管
をジャーから取り出し、キャップをパラフィンで密封す
る。以後使用するまで、このフンゲート管を室温で貯蔵
する。 ［００４０］ ４、液体増殖媒体接種材料の製造。 ［００４１］ 半固体尿酸媒体（バクト寒天（Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ）
１リットル中２．５ｇ））の管に久ロストリジウム・
シリンドロスポルムのコロニーを上記の方法と同様にし
て接種し、３５℃で培養し、室温で貯蔵する。これらの
培養物を、後続の各章で記述する液体媒体増殖用の接種
材料源として使用に供する。 ［００４２］ ５、クロストリジウム・シリンドロスポルムの液体媒体
増殖。 ［００４３］ １個の柔らかい寒天管培養物（全量１０ ｍｌ）を１リ
ツトルの液体尿酸媒体に添加する。全ての操作を嫌気バ
ッグ中で行い、全培養物を嫌気ジャー中、３５℃で４日
間培養する。 ［００４４］ 抽出物の製造を実施する。 ［００４５］ クロストリジウムが嫌気性菌であるので、方法Ａと同様
に全ての培養生産、保持および取り扱い操作は菌株の酸
素への暴露を最小にする条件下で行う。同様に、テトラ
ヒドロ葉酸化合物およびその誘導体の極端な酸素不安定
性のために、これらの化合物を含む全ての工程は酸素の
不存在で行う。無酸素の気体窒素源に接続したプラスチ
ックス製の嫌気製装置をこの目的に使用する。上記の１
リツトルの培養液が濁り、粒状物質が媒体から沈降する
。この培養液を４個の２５０ｍ１の部分に分け、４個の
２５０ ｍｌの遠心ビンに添加する。この培養液をベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｊ ２−２１型遠心器中、
４℃、８．０００ ＲＰＭで１５分間遠心する。 媒体
を４℃に急冷するが、尿酸は細菌により消費されている
ので沈澱しない。上記の細胞ペレットを４個の２５ｍ１
の水冷蒸留水中に再懸濁させ、上と同様にして遠心する
。ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検定に先立って
、このペレットを一２０℃で５日間凍結する。 ［００４６］ 凍結したペレットを全量４．０ｍｌの緩衝液（リン酸水
素二カリウム０．０５Ｍ、２−メルカプトエタノール０
．０５Ｍ（１Ｍ水酸化カリウムの添加によりｐＨ７，５
））中で融解させる。ペレットを混合し、室温で断続的
に６０分間撹拌（ｓｗｉｒｌ）して、溶解させる。注意
すべきことには、細胞溶解（ｃｅｌｌ １ｙｓｉｓ）の
ために細胞ペレットが粘稠になる。自己分解（ａｕｔｏ
ｌｙｓ ｉ ｓ ）が室温で起きるのである。この細
胞分解物（ｌｙｓａｔｅ）を１７，０００ ＲＰＭで３
０分間遠心し、上澄液を氷上に保持し、ホルミルテトラ
ヒドロ葉酸合成酵素を検定する。 方法−ｑ バトレア（Ｂｕｔｔｌａｉｒｅ） 、 ”ホルミルテ
トラヒドロ葉酸合成酵素の精製と性質（Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
Ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ５ｙ
ｎｔｈｅｔａｓｅ） ”酵素学（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） ６６巻、５８５ページ、 （１９８０）に示され
た方法により、ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検
定を行う。 ［００４７］ 【実施例月 最近の文献の方法（テンプル二世（ｃ０Ｔｅｍｐｌｅ、
Ｊｒ、） −ｒ−リオット（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔｔ
） 、ローズ（Ｊ、Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリ
ー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌
（Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ２２．７３１
（１９７９） ）を用い、ホウ水素化ナトリウムを使
用して葉酸の５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ
葉酸への還元を実施する。 ［００４８］ 【実施例２】 １０−ホルミル−５６３７８−テトラヒドロ−酸の生成
５．６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸の１０−
ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の製造
用の酵素的ホルミル化に適した以下の混合物を製造する
１１．０Ｍトリエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８，０）
１００ｍ１．０．５Ｍアデノシン三リン酸（ｐＨ８，
０） １００ ｍｌ、０．５Ｍ塩化カリウム１００ ｍ
ｌ、０．１Ｍ塩塩化マグネシウム氷水和物１００ｍｌお
よび０．２Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ８，０） ２００
ｍ１０全量５ｇの５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸（シグマ；純度 ６９パーセント；ロット番
号１１７Ｆ−５０１３）のバイアルの内容物を２００ｍ
１（７） ０．２ Ｍ ）リス−ＨＣｌ１０．０５
Ｍ ２−メルカプトエタノール（ｐＨ７，０）に懸濁さ
せ、約１５ｍ１の１Ｍ水酸化カリウムを添加して溶解さ
せる。この透明な溶液を上記の混合物に注ぎ入れ、蒸留
水（約２００ ｍｌ）を添加して全量１．０リツトルの
反応混合物とし、２リツトルのガラスビンに入れる。 ［００４９］ ４ ｍｌの“ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素”（Ｆ
ＴＨＦＳ）を含有する粗酵素抽出物を添加して反応を開
始させ、室温（２２℃）で反応を進行させる。試料を定
期的に採取し、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１
Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変（ｍｏｄｉｆｙ）
して１２ないし２５％の直線的な濃度勾配（ｌｉｎｅ
ａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で３０分にわたり、ＨＰＬＣ
で反応の進行を監視する。カラムの流出液を２８２ ｎ
ｍで監視して１２分で５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テト
ラヒドロ葉酸を、１６分で５．１０−メテニルテトラヒ
ドロ葉酸を検出する。反応は１８時間後に完了する。 ここで、曲線下の面積で測定して、５．６（Ｒ，、Ｓ）
、７．８−テトラヒドロ葉酸の初期量の４８パーセント
が残留している。反応混合物からの１０−ホルミル−５
，６Ｓ 、 ７．８テトラヒドロ葉酸の１５８５ ｍｇ
相当量がＨＰＬＣクロマトグラムから計算されこれは５
，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸を表す。これは、出
発物質の３４５０ ｍｇの５．６（Ｒ，Ｓ ）、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸の１７２５ ｍｇのみが酵素的転
化反応に利用されたことを考慮して、理論量の９２パー
セントの転化率を示す。理論量の５０パーセントが５時
間後に転化する。 ［００５０］
ｎｄｂｏｏｋ）−調合法第５１９に記載されているもの
と同様にして尿酸媒体を製造する：尿酸媒体組戊掬 尿酸 ３．０ｇ酵母抽出
液 １．０ｇリン酸二水素ナ
トリウム ４．０ｇ硫酸マグネシウム七水
和物０．１ｇ 硫酸鉄（ＩＩ） ５．０
ｍｇ＊Ｑ、 ０４％フェノールレッド溶液 １．
０ｇチオグリコール酸ナトリウム ０．５ｇ蒸
留水 １．０リットル＊
０．１ｇの指示薬に必要な０．０１Ｎ水酸化ナトリウム
１４．９ｍ１０蒸留水で２５０ｍ１に希釈し、０．０４
％溶液とする。 ［００３３］ この媒体を製造する際には、尿酸を液体のほとんど全体
積に懸濁させ、沸騰するまで加熱し、フェノールレッド
のバラ色が定常的になる（ｐＨ７，６）ように水酸化ナ
トリウムで調節する。ｐＨをｐＨ試験紙で検査する。固
体媒体には、上記の媒体に２０．０ｇの寒天を添加する
。 ［００３４］ この媒体をスクリューキャップフラスコに、はぼ全体積
にまで注ぎ入れ、ついで無酸素の気体窒素でパージしな
がら煮沸する。加圧 （ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の直後に
フラスコのキャップを十分緊密に締める。 ［００３５］ この媒体を室温で貯蔵して、低温における尿酸の沈澱を
避ける。 ［００３６］ 週狸二）培養液の接種。 ［００３７］ 全ての手順をクロ４−ブバツグ中の嫌気条件下で実施す
る。液体尿酸媒体の１．０ｍ１部分を、ＡＴＣＣから得
た細菌の凍結乾燥したペレットに添加する。このペレッ
トを溶解させ、滅菌使い捨て接種ループを用いて、再懸
濁させた培養液を尿酸平板（ｐｌａｔｉｎｇ）媒体上に
画Ｒ（ｓｔｒｅａｋ）させる。この平板をＨ，Ｃ○２発
生外被（ｅｎｖｅｌ ｏｐｅ）とメチレンブルー帯状試
験紙とを含有する嫌気ジャーに入れる。 接種した平板を含有するジャーを３７℃で培養する。２
４時間以内に平板上で、コロニーから放射される明るい
透明な指状の突出物（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として、
増殖が見られる。位相差顕微鏡下で見られる代表的なコ
ロニーの試料は典型的なり口［００３８］ ［００３９］ フンゲート（）Ｉｕｎｇａｔｅ）管（ペルコグラス社（
Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ、 ） ）−各管中の
媒体１０ｍ１−中で尿酸平板媒体を製造し、定常的なり
ロストリジウム・シリンドロスポルムの貯蔵培養液の供
給源として使用に供する。上記のコロニーの細胞の単一
のコロニー小片を滅菌接種ループで取り出し、フンゲー
ト管の媒体中に刺し込む。この手順は気体窒素を含有す
る嫌気バッグ中で行う。このフンゲート管を嫌気ジャー
に入れ、３５℃で培養する。５日後、このフンゲート管
をジャーから取り出し、キャップをパラフィンで密封す
る。以後使用するまで、このフンゲート管を室温で貯蔵
する。 ［００４０］ ４、液体増殖媒体接種材料の製造。 ［００４１］ 半固体尿酸媒体（バクト寒天（Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ）
１リットル中２．５ｇ））の管に久ロストリジウム・
シリンドロスポルムのコロニーを上記の方法と同様にし
て接種し、３５℃で培養し、室温で貯蔵する。これらの
培養物を、後続の各章で記述する液体媒体増殖用の接種
材料源として使用に供する。 ［００４２］ ５、クロストリジウム・シリンドロスポルムの液体媒体
増殖。 ［００４３］ １個の柔らかい寒天管培養物（全量１０ ｍｌ）を１リ
ツトルの液体尿酸媒体に添加する。全ての操作を嫌気バ
ッグ中で行い、全培養物を嫌気ジャー中、３５℃で４日
間培養する。 ［００４４］ 抽出物の製造を実施する。 ［００４５］ クロストリジウムが嫌気性菌であるので、方法Ａと同様
に全ての培養生産、保持および取り扱い操作は菌株の酸
素への暴露を最小にする条件下で行う。同様に、テトラ
ヒドロ葉酸化合物およびその誘導体の極端な酸素不安定
性のために、これらの化合物を含む全ての工程は酸素の
不存在で行う。無酸素の気体窒素源に接続したプラスチ
ックス製の嫌気製装置をこの目的に使用する。上記の１
リツトルの培養液が濁り、粒状物質が媒体から沈降する
。この培養液を４個の２５０ｍ１の部分に分け、４個の
２５０ ｍｌの遠心ビンに添加する。この培養液をベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｊ ２−２１型遠心器中、
４℃、８．０００ ＲＰＭで１５分間遠心する。 媒体
を４℃に急冷するが、尿酸は細菌により消費されている
ので沈澱しない。上記の細胞ペレットを４個の２５ｍ１
の水冷蒸留水中に再懸濁させ、上と同様にして遠心する
。ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検定に先立って
、このペレットを一２０℃で５日間凍結する。 ［００４６］ 凍結したペレットを全量４．０ｍｌの緩衝液（リン酸水
素二カリウム０．０５Ｍ、２−メルカプトエタノール０
．０５Ｍ（１Ｍ水酸化カリウムの添加によりｐＨ７，５
））中で融解させる。ペレットを混合し、室温で断続的
に６０分間撹拌（ｓｗｉｒｌ）して、溶解させる。注意
すべきことには、細胞溶解（ｃｅｌｌ １ｙｓｉｓ）の
ために細胞ペレットが粘稠になる。自己分解（ａｕｔｏ
ｌｙｓ ｉ ｓ ）が室温で起きるのである。この細
胞分解物（ｌｙｓａｔｅ）を１７，０００ ＲＰＭで３
０分間遠心し、上澄液を氷上に保持し、ホルミルテトラ
ヒドロ葉酸合成酵素を検定する。 方法−ｑ バトレア（Ｂｕｔｔｌａｉｒｅ） 、 ”ホルミルテ
トラヒドロ葉酸合成酵素の精製と性質（Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
Ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ５ｙ
ｎｔｈｅｔａｓｅ） ”酵素学（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） ６６巻、５８５ページ、 （１９８０）に示され
た方法により、ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の検
定を行う。 ［００４７］ 【実施例月 最近の文献の方法（テンプル二世（ｃ０Ｔｅｍｐｌｅ、
Ｊｒ、） −ｒ−リオット（Ｒ，Ｄ、 Ｅｌｉｏｔｔ
） 、ローズ（Ｊ、Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリ
ー（Ｊ、 Ａ、 Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌
（Ｊ、 Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ、 ） 、 ２２．７３１
（１９７９） ）を用い、ホウ水素化ナトリウムを使
用して葉酸の５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ
葉酸への還元を実施する。 ［００４８］ 【実施例２】 １０−ホルミル−５６３７８−テトラヒドロ−酸の生成
５．６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸の１０−
ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の製造
用の酵素的ホルミル化に適した以下の混合物を製造する
１１．０Ｍトリエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８，０）
１００ｍ１．０．５Ｍアデノシン三リン酸（ｐＨ８，
０） １００ ｍｌ、０．５Ｍ塩化カリウム１００ ｍ
ｌ、０．１Ｍ塩塩化マグネシウム氷水和物１００ｍｌお
よび０．２Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ８，０） ２００
ｍ１０全量５ｇの５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸（シグマ；純度 ６９パーセント；ロット番
号１１７Ｆ−５０１３）のバイアルの内容物を２００ｍ
１（７） ０．２ Ｍ ）リス−ＨＣｌ１０．０５
Ｍ ２−メルカプトエタノール（ｐＨ７，０）に懸濁さ
せ、約１５ｍ１の１Ｍ水酸化カリウムを添加して溶解さ
せる。この透明な溶液を上記の混合物に注ぎ入れ、蒸留
水（約２００ ｍｌ）を添加して全量１．０リツトルの
反応混合物とし、２リツトルのガラスビンに入れる。 ［００４９］ ４ ｍｌの“ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素”（Ｆ
ＴＨＦＳ）を含有する粗酵素抽出物を添加して反応を開
始させ、室温（２２℃）で反応を進行させる。試料を定
期的に採取し、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１
Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変（ｍｏｄｉｆｙ）
して１２ないし２５％の直線的な濃度勾配（ｌｉｎｅ
ａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）で３０分にわたり、ＨＰＬＣ
で反応の進行を監視する。カラムの流出液を２８２ ｎ
ｍで監視して１２分で５．６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テト
ラヒドロ葉酸を、１６分で５．１０−メテニルテトラヒ
ドロ葉酸を検出する。反応は１８時間後に完了する。 ここで、曲線下の面積で測定して、５．６（Ｒ，、Ｓ）
、７．８−テトラヒドロ葉酸の初期量の４８パーセント
が残留している。反応混合物からの１０−ホルミル−５
，６Ｓ 、 ７．８テトラヒドロ葉酸の１５８５ ｍｇ
相当量がＨＰＬＣクロマトグラムから計算されこれは５
，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸を表す。これは、出
発物質の３４５０ ｍｇの５．６（Ｒ，Ｓ ）、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸の１７２５ ｍｇのみが酵素的転
化反応に利用されたことを考慮して、理論量の９２パー
セントの転化率を示す。理論量の５０パーセントが５時
間後に転化する。 ［００５０］
【実施例３】
実施例２の反応混合物を他日分析してその組成に変化が
ないことを認めた。 この混合物の１００ｍ１を三つ首ビンに移し、この溶液
のｐＨを硫酸を用いて６．５に調整する。窒素で脱気し
ながらこのビンを水浴に浸し、９０−９５℃で２時間加
熱する。ついで、反応を窒素下、４０℃で一晩継続させ
る。この反応混合物は１６時間後には褐色の外見を有し
ている。逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１Ｍのギ
酸で溶離し、メタノールで改変して１２ないし２５％の
直線的な濃度勾配で ３０分にわたり、ＨＰＬＣで試料
を分析する。カラムの流出液を２８２ ｎｍで監視する
。ＨＰＬＣ分析は、５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸化合物のピークと５−ホルミル
−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸のピークと
に関して、曲線下の面積を考慮すれば９０．２パーセン
トの転化率を示す。未変化の５．６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸の面積は出発物質のものに対して３３．１パ
ーセントに減少している（４８パーセント）。
ないことを認めた。 この混合物の１００ｍ１を三つ首ビンに移し、この溶液
のｐＨを硫酸を用いて６．５に調整する。窒素で脱気し
ながらこのビンを水浴に浸し、９０−９５℃で２時間加
熱する。ついで、反応を窒素下、４０℃で一晩継続させ
る。この反応混合物は１６時間後には褐色の外見を有し
ている。逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１Ｍのギ
酸で溶離し、メタノールで改変して１２ないし２５％の
直線的な濃度勾配で ３０分にわたり、ＨＰＬＣで試料
を分析する。カラムの流出液を２８２ ｎｍで監視する
。ＨＰＬＣ分析は、５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸化合物のピークと５−ホルミル
−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸のピークと
に関して、曲線下の面積を考慮すれば９０．２パーセン
トの転化率を示す。未変化の５．６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸の面積は出発物質のものに対して３３．１パ
ーセントに減少している（４８パーセント）。
【００５月
反応混合物の試料をポンプを経て製造用ＨＰＬＣ逆相カ
ラム（ダイナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ） ６０Ａ−
Ｃ１８，８ミクロン、２．１ Ｘ ３０ ｃｍ）に添加
し、ライで、０゜１Ｍ水性ギ酸とメタノールとの濃度勾
配で、１３メ一トルリツトル／分の流速で６０分間展開
する。若干黄色い５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸が８２パーセントの通算（ｏｖｅｒ
ａｌｌ）収率で得られ、これを酸性溶離条件下（０，１
Ｍ水性ギ酸およびメタノール）で５，１０−メテニル−
５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸に転化させ、つい
でこれを３ないし６ ｍｇ／メートルリットルの濃度で
放置して収集バイアル中でゲルを形成させる。対掌性カ
ラム（ダイアセルキーラセル（ＤｉａｃｅｌＣｈｉｒａ
ｃｅｌ）○Ｄ）を用い、０．５パーセントのギ酸アンモ
ニウム、ｐＨ＝ ３．８、および２５パーセントメタノ
ールで平等に溶離するＨＰＬＣで、この試料のエナンシ
ョマー的純度を測定した。１５．２分の保持時間が記録
され、ギ酸中の旋光度は以下のとおりである： 濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 壬酸溶液Ｙ 三少Ｙ 化合印 ５．１０−メテニル− ５，６Ｓ、７．８−テトラ ヒドロ葉酸 ［００５２］ 【実施例４】 ５１０−メテニル−５６３ ０，６１１＋４２ ７８−テトラヒドロ−の５−ホルミル−５６３７８−テ
トラヒドロー および５６Ｒ７８−テトラヒドロ 酸へ
の実施例２で得られる反応混合物の残余のｐＨを硫酸を
用し）で８．０から５．０に調整し、１０−ホルミル−
５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸への迅
速環化を開始させ、ついで、これを室温のまま徐々に加
水分解して５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒ
ドロ葉酸を形成させる。後者はｐＨ調整の前には反応混
合物中に検出されない。 ［００５３］ この反応に続いて、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０
．１Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変して、１２な
いし２５パーセントの直線的な濃度勾配で３０分にわた
りＨＰＬＣを行う。ＨＰＬＣによる反応の監視により、
初期の５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸の７０パ一セント以上が室温で５日後に５−
ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸に転化
したが、この時間中、反応混合物中の５．６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸濃度は変化しなかったことが示され
ている。ついで、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メテニル−５，６
Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸として得られるホルミル
化生成物、ならびにホルミル化されなかった５、６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸を、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で、１３ｍ ｌ ／分の流速で６０
分間展開する製造用ＨＰＬＣ逆相カラム（ダイナマック
ス６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２． Ｉ Ｘ ３０
ｃｍ）で単離する。２種の製造の測定した収率（５０ｍ
ｌの反応混合物に対する各当量）は以下のとおりである
： 離したヒ合 ｍ 収率り０ 祖粧収量５．１０
−メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸（２
２，６） １２．９ ６．５５−ホルミル−５，
６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸（１１８，２）
６７．５ ３３．８５．６Ｒ，７，８−テトラヒド
ロ 葉酸＊（１４５，５） ８３，１ ４１
．６＊’４−離１．り５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸を直ちに乾燥し、ギ酸でホルミル化（以下に記載す
るように）して５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸を得る。これは、６Ｓ型とは異なり
、希ギ酸から結晶化する。 ［００５４］
ラム（ダイナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ） ６０Ａ−
Ｃ１８，８ミクロン、２．１ Ｘ ３０ ｃｍ）に添加
し、ライで、０゜１Ｍ水性ギ酸とメタノールとの濃度勾
配で、１３メ一トルリツトル／分の流速で６０分間展開
する。若干黄色い５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸が８２パーセントの通算（ｏｖｅｒ
ａｌｌ）収率で得られ、これを酸性溶離条件下（０，１
Ｍ水性ギ酸およびメタノール）で５，１０−メテニル−
５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸に転化させ、つい
でこれを３ないし６ ｍｇ／メートルリットルの濃度で
放置して収集バイアル中でゲルを形成させる。対掌性カ
ラム（ダイアセルキーラセル（ＤｉａｃｅｌＣｈｉｒａ
ｃｅｌ）○Ｄ）を用い、０．５パーセントのギ酸アンモ
ニウム、ｐＨ＝ ３．８、および２５パーセントメタノ
ールで平等に溶離するＨＰＬＣで、この試料のエナンシ
ョマー的純度を測定した。１５．２分の保持時間が記録
され、ギ酸中の旋光度は以下のとおりである： 濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 壬酸溶液Ｙ 三少Ｙ 化合印 ５．１０−メテニル− ５，６Ｓ、７．８−テトラ ヒドロ葉酸 ［００５２］ 【実施例４】 ５１０−メテニル−５６３ ０，６１１＋４２ ７８−テトラヒドロ−の５−ホルミル−５６３７８−テ
トラヒドロー および５６Ｒ７８−テトラヒドロ 酸へ
の実施例２で得られる反応混合物の残余のｐＨを硫酸を
用し）で８．０から５．０に調整し、１０−ホルミル−
５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸への迅
速環化を開始させ、ついで、これを室温のまま徐々に加
水分解して５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒ
ドロ葉酸を形成させる。後者はｐＨ調整の前には反応混
合物中に検出されない。 ［００５３］ この反応に続いて、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０
．１Ｍのギ酸で溶離し、メタノールで改変して、１２な
いし２５パーセントの直線的な濃度勾配で３０分にわた
りＨＰＬＣを行う。ＨＰＬＣによる反応の監視により、
初期の５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラ
ヒドロ葉酸の７０パ一セント以上が室温で５日後に５−
ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸に転化
したが、この時間中、反応混合物中の５．６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸濃度は変化しなかったことが示され
ている。ついで、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メテニル−５，６
Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸として得られるホルミル
化生成物、ならびにホルミル化されなかった５、６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸を、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で、１３ｍ ｌ ／分の流速で６０
分間展開する製造用ＨＰＬＣ逆相カラム（ダイナマック
ス６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２． Ｉ Ｘ ３０
ｃｍ）で単離する。２種の製造の測定した収率（５０ｍ
ｌの反応混合物に対する各当量）は以下のとおりである
： 離したヒ合 ｍ 収率り０ 祖粧収量５．１０
−メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸（２
２，６） １２．９ ６．５５−ホルミル−５，
６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸（１１８，２）
６７．５ ３３．８５．６Ｒ，７，８−テトラヒド
ロ 葉酸＊（１４５，５） ８３，１ ４１
．６＊’４−離１．り５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸を直ちに乾燥し、ギ酸でホルミル化（以下に記載す
るように）して５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８
−テトラヒドロ葉酸を得る。これは、６Ｓ型とは異なり
、希ギ酸から結晶化する。 ［００５４］
【実施例５】
クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した５、６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸の試料２５３ ｍｇを２パー
セントのトリフルオロ酢酸を含有する９７パーセントの
ギ酸５０ ｍｌに溶解させ、窒素下の反応ビン中、環境
温度で撹拌せずに放置する。 反応は、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１Ｍの水
性ギ酸で溶離し、メタノールで改変して、１２ないし２
５パーセントの直線的な濃度勾配で３０分にわたるＨＰ
ＬＣにより分析し、２８２ ｎｍで監視する。３時間後
には、５，１０−メテニル−５，６Ｒ、７，８−テトラ
ヒドロ葉酸を表す新しいピークがＨＰＬＣクロマトグラ
ムに出現することにより判定されるように、全ての５，
６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸が反応している。続い
て、ギ酸の大部分を蒸発により除去し、この混合物をと
きどき撹拌しながら３０ ｍｌの０．１Ｍ水性ギ酸を徐
々に添加する。ついで、この溶液を冷却室に一晩貯蔵す
る。／Ｊ轄い黄色の針状物が生成して溶液に固体様の外
見を与える。この結晶を焼結ガラスロート（ｇｌａｓｓ
−ｆｒｉｔｔｅｄ ｆｕｎｎｅｌ）に集めてアセトンで
洗浄し、真空中で乾燥して２１８ ｍｇの黄色の結晶性
物質を得る。 ［００５５］ 結晶性の５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８−テト
ラヒドロ葉酸のエナンショマー的純度は対掌性カラム（
ダイアセルキーラセルＯＤ）を用い、０．５パーセント
のギ酸アンモニウム、ｐＨ＝ ３．８、および２５パー
セントメタノールで平等に溶離して測定する。生成物の
５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸は１８．２分で溶離した。 ［００５６３ ８８パーセントギ酸中の溶液として測定した旋光度は以
下のとおりである：濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 化合撚 壬醸溶液Ｌ ム歩ｙ５．１０−メ
テニル− ５，６Ｒ，７，８−テトラ ヒドロ葉酸 ［００５７］
７，８−テトラヒドロ葉酸の試料２５３ ｍｇを２パー
セントのトリフルオロ酢酸を含有する９７パーセントの
ギ酸５０ ｍｌに溶解させ、窒素下の反応ビン中、環境
温度で撹拌せずに放置する。 反応は、逆相カラム（ｃ−１８）を用い、０．１Ｍの水
性ギ酸で溶離し、メタノールで改変して、１２ないし２
５パーセントの直線的な濃度勾配で３０分にわたるＨＰ
ＬＣにより分析し、２８２ ｎｍで監視する。３時間後
には、５，１０−メテニル−５，６Ｒ、７，８−テトラ
ヒドロ葉酸を表す新しいピークがＨＰＬＣクロマトグラ
ムに出現することにより判定されるように、全ての５，
６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸が反応している。続い
て、ギ酸の大部分を蒸発により除去し、この混合物をと
きどき撹拌しながら３０ ｍｌの０．１Ｍ水性ギ酸を徐
々に添加する。ついで、この溶液を冷却室に一晩貯蔵す
る。／Ｊ轄い黄色の針状物が生成して溶液に固体様の外
見を与える。この結晶を焼結ガラスロート（ｇｌａｓｓ
−ｆｒｉｔｔｅｄ ｆｕｎｎｅｌ）に集めてアセトンで
洗浄し、真空中で乾燥して２１８ ｍｇの黄色の結晶性
物質を得る。 ［００５５］ 結晶性の５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８−テト
ラヒドロ葉酸のエナンショマー的純度は対掌性カラム（
ダイアセルキーラセルＯＤ）を用い、０．５パーセント
のギ酸アンモニウム、ｐＨ＝ ３．８、および２５パー
セントメタノールで平等に溶離して測定する。生成物の
５，１０−メテニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸は１８．２分で溶離した。 ［００５６３ ８８パーセントギ酸中の溶液として測定した旋光度は以
下のとおりである：濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 化合撚 壬醸溶液Ｌ ム歩ｙ５．１０−メ
テニル− ５，６Ｒ，７，８−テトラ ヒドロ葉酸 ［００５７］
【実施例６】
０、６１９ −４７
リーズ、サクリングおよびウッド、化学会誌化学通信（
Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 Ｃｈｅｍ。 Ｃｏｍｍｕｎ、 ） ４７０ （１９８７）に示された
方法を変更して、実施例４の反応混合物の試料に（−）
メンチルクロロギ酸を添加し、ｐＨ７に調整すると、５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸のみのカルボキシメ
ンチル化が生じ、５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テ
トラヒドロ葉酸および／または５，１０−メテニル−５
，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸は反応せずに残
る。反応はＨＰＬＣにより監視した。５−メンチルオキ
シカルボニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の
未反応成分からの効果的な分離は、ＸＲＤ−２負荷カラ
μに反応混合物を通過させて達成される。５−メンチル
オキシカルボニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉
酸は樹脂に吸収され、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７
．８−テトラヒドロ葉酸または５，１０−メテニル−５
，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸は通過する。 ［００５８］
Ｊ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 Ｃｈｅｍ。 Ｃｏｍｍｕｎ、 ） ４７０ （１９８７）に示された
方法を変更して、実施例４の反応混合物の試料に（−）
メンチルクロロギ酸を添加し、ｐＨ７に調整すると、５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸のみのカルボキシメ
ンチル化が生じ、５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テ
トラヒドロ葉酸および／または５，１０−メテニル−５
，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸は反応せずに残
る。反応はＨＰＬＣにより監視した。５−メンチルオキ
シカルボニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の
未反応成分からの効果的な分離は、ＸＲＤ−２負荷カラ
μに反応混合物を通過させて達成される。５−メンチル
オキシカルボニル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉
酸は樹脂に吸収され、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７
．８−テトラヒドロ葉酸または５，１０−メテニル−５
，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸は通過する。 ［００５８］
【実施例７】
実施例４の反応混合物の一部（５０または１００ｍ１）
を、負荷用ポンプを通して逆相カラム（ダイナマックス
６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２． Ｉ Ｘ ３０ ｃ
ｍ）に直接に負荷し、ついで、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で、１３ ｍｌ／分の流速で ６０
分間展開する。使用した濃度勾配は５パーセントのメタ
ノール濃度から出発して１２分の作業時間（ｒｕｎ ｔ
ｉｍｅ）後に１０パーセントに達するものである。つい
で、１０パーセントメタノールの濃度を次の１０分間一
定に保ち、このとき（作業開始後２２分）に、メタノー
ルのレベルを直線的に増加させて３８分で１８パーセン
トに到達させ、ここからさらに５２分の作業時間には
２５パーセントに到達させる。この濃度は、作業の終了
までこれ以上は増加させない。カラム溶離液は、５，１
０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸と５−ホルミル−５，６Ｓ 。 ７．８−テトラヒドロ葉酸とがその波長で同一の吸収係
数を有するので、３１９ ｎｍで監視する。 ［００５９］ これらの製造条件下で５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸は１１分ないし１７．５分で溶離し、他方、５−ホ
ルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸は３９．
５分ないし４４゜５分で溶離する。５，１０−メテニル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸バンドの溶離は
濃度に強く依存して２０分ないし３０分に尾を引くピー
クとして現れる。７００ ｍｇの物質に相当する１４０
メートルリットルを超える反応混合物を負荷すれば、５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸バンドと５，１０−
メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸バンド
とは完全には分離することができない。 ［００６０１ 液体を直ちに凍結し得るように、５，６Ｒ，７，８−テ
トラヒドロ葉酸と５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テ
トラヒドロ葉酸との溶離バンドとをドライアイスに浸し
たガラスビンに集める。ついで、凍結した分画を凍結乾
燥して５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の場合には
灰色がかった白色の粉末を、５−ホルミル−５，６Ｓ
、 ７．８−テトラヒドロ葉酸の場合には黄色がかった
白色の粉末を得る。これらの粉末に関して、逆相カラム
（ダイナマックス６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２．
Ｉ Ｘ ３０ ｃｍ）を用い、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で展開してＨＰＬＣ分析を行う。曲
線下の面積から、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸は純度９７パーセントであり・５．
６ Ｒ、７，８−テトラヒドロ葉酸は純度 ９３パーセ
ントであることが示される。５．６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸の不安定性のために、これを化学的にホルミ
ル化して、より安定な５，１０−メテニル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸に転化させる。５−ホルミル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の全ての安定性
の問題を打ち消すためにこの化合物を実施例８の記載と
同様にしてカルシウム塩に転化させる。 ［００６１］
を、負荷用ポンプを通して逆相カラム（ダイナマックス
６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２． Ｉ Ｘ ３０ ｃ
ｍ）に直接に負荷し、ついで、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で、１３ ｍｌ／分の流速で ６０
分間展開する。使用した濃度勾配は５パーセントのメタ
ノール濃度から出発して１２分の作業時間（ｒｕｎ ｔ
ｉｍｅ）後に１０パーセントに達するものである。つい
で、１０パーセントメタノールの濃度を次の１０分間一
定に保ち、このとき（作業開始後２２分）に、メタノー
ルのレベルを直線的に増加させて３８分で１８パーセン
トに到達させ、ここからさらに５２分の作業時間には
２５パーセントに到達させる。この濃度は、作業の終了
までこれ以上は増加させない。カラム溶離液は、５，１
０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉
酸と５−ホルミル−５，６Ｓ 。 ７．８−テトラヒドロ葉酸とがその波長で同一の吸収係
数を有するので、３１９ ｎｍで監視する。 ［００５９］ これらの製造条件下で５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸は１１分ないし１７．５分で溶離し、他方、５−ホ
ルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸は３９．
５分ないし４４゜５分で溶離する。５，１０−メテニル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸バンドの溶離は
濃度に強く依存して２０分ないし３０分に尾を引くピー
クとして現れる。７００ ｍｇの物質に相当する１４０
メートルリットルを超える反応混合物を負荷すれば、５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸バンドと５，１０−
メテニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸バンド
とは完全には分離することができない。 ［００６０１ 液体を直ちに凍結し得るように、５，６Ｒ，７，８−テ
トラヒドロ葉酸と５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テ
トラヒドロ葉酸との溶離バンドとをドライアイスに浸し
たガラスビンに集める。ついで、凍結した分画を凍結乾
燥して５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の場合には
灰色がかった白色の粉末を、５−ホルミル−５，６Ｓ
、 ７．８−テトラヒドロ葉酸の場合には黄色がかった
白色の粉末を得る。これらの粉末に関して、逆相カラム
（ダイナマックス６０Ａ−Ｃ１８，８ミクロン、２．
Ｉ Ｘ ３０ ｃｍ）を用い、０．１Ｍ水性ギ酸とメタ
ノールとの濃度勾配で展開してＨＰＬＣ分析を行う。曲
線下の面積から、５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８
−テトラヒドロ葉酸は純度９７パーセントであり・５．
６ Ｒ、７，８−テトラヒドロ葉酸は純度 ９３パーセ
ントであることが示される。５．６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸の不安定性のために、これを化学的にホルミ
ル化して、より安定な５，１０−メテニル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸に転化させる。５−ホルミル
−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸の全ての安定性
の問題を打ち消すためにこの化合物を実施例８の記載と
同様にしてカルシウム塩に転化させる。 ［００６１］
【実施例８】
５−ホルミル−５６３７８−テトラヒドロ カルシウ
ムまたは５−ホルミル−５６Ｒ７８−テトラヒドロ−酸
カルシウムの製造テンプル二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ、
Ｊｒ、） エリオツド（Ｒ，Ｄ、Ｅｌｉｏｔｔ）
ローズ（Ｊ。 Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌（Ｊ、 Ｍｅｄ、
Ｃｈｅｍ、）、η、 ７３１ （１９７９）により公刊
された方法を変更して、ラセミ体５−ホルミル−５、６
（Ｒ，Ｓ ）、 ７．８−テトラヒドロ葉酸カルシウム
を製造し、生成した５−ホルミル−５、６Ｓ 、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸をエーテルで洗浄して可能なギ酸
アンモニウムを除去する。ついで、洗浄した物質の６２
ｍｇを３２ ｍｌの脱気メタノール（塩非含有ギ酸は
メタノールに良好に溶解する）に溶解させ、これに約１
ｍｌのメタノール性塩化カルシウム溶液（メタノール１
ｍｌあたりメタノール７２ ｍｇ）を添加する。 この塩の添加により直ちに純白でない白色の沈澱が生成
するので、これを焼結ガラスロートに集めて真空中で乾
燥する。乾燥後の収量は ６０．５ ｍｇ （理論収
量の９０パーセント）である。 ［００６２］ ６Ｒ物質についてこの手順を繰り返せば、５−ホルミル
−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸カルシウムが得
られる。 ［００６３］ 製造した物質の純度は、いかなるＵＶ−非吸収性物質の
存在にも配慮することなく、ＵＶ／ＨＰＬＣにより測定
する。エナンショマー的な純度は、５，１０−メテニル
−５，６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ葉酸誘導体
の段階において、対掌性カラム（ダイアセルキーラセル
○Ｄ）を用い、０．５パーセントのギ酸アンモニウム、
ｐＨ＝３．８、および ２５パーセントメタノールで平
等に溶離して、ＨＰＬＣにより測定する。５，１０−メ
テニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸が最初に
、１５．２分の保持時間で溶離し、一方、５，１０−メ
チ丹ルー５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸は１８．
２分で溶離する。 ［００６４］ ギ酸の方が酸性が弱く、葉酸塩に対する溶解能力が大き
いので、文献に報告されているように、製造した化合物
の１０ Ｍまたは１２ Ｍ塩酸溶液よりもむしろギ酸溶
液を、その旋光性の記録に使用する。上記の製造の試料
は以下の旋光度を示した： 濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 化合掬 壬醸溶液月 Ｌ氾Ｌ５．１０−メ
テニル− ５、６Ｓ 、 ７．８−テトラ ０．６１１
＋４２ヒドロ葉酸＊ ５．１０−メテニル− ５，６Ｒ，７，８−テトラ ０．６１９ −
４７ヒドロ葉酸＊＊ ＊ ５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉
酸として、０．１Ｍギ酸混合物で溶離してクロマトグラ
フィー的に単離し、５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸に転化させ、ついで固化してゲ
ルを形成させ、これを凍結乾燥する。 ＊＊ 最初に非転化５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉
酸として単離し、これを凍結乾燥したのち、直ちに上記
のものと同様にしてギ酸を用いてホルミル化する。得ら
れる、希ギ酸混合物から晶出しな５，１０−メテニル−
５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸を集め、アセトン
で洗浄し、真空中で乾燥する。２５３ ｍｇの５．６Ｒ
，７゜８−テトラヒドロ葉酸（重量で）から２１８ ｍ
ｇの結晶性５，１０−メテニル−５，６Ｒ。 ７．８−テトラヒドロ葉酸（重量で）が回収される。 ［００６５］
ムまたは５−ホルミル−５６Ｒ７８−テトラヒドロ−酸
カルシウムの製造テンプル二世（ｃ，Ｔｅｍｐｌｅ、
Ｊｒ、） エリオツド（Ｒ，Ｄ、Ｅｌｉｏｔｔ）
ローズ（Ｊ。 Ｄ、 Ｒｏｓｅ）およびモンゴメリー（Ｊ、 Ａ、 Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）、医化学雑誌（Ｊ、 Ｍｅｄ、
Ｃｈｅｍ、）、η、 ７３１ （１９７９）により公刊
された方法を変更して、ラセミ体５−ホルミル−５、６
（Ｒ，Ｓ ）、 ７．８−テトラヒドロ葉酸カルシウム
を製造し、生成した５−ホルミル−５、６Ｓ 、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸をエーテルで洗浄して可能なギ酸
アンモニウムを除去する。ついで、洗浄した物質の６２
ｍｇを３２ ｍｌの脱気メタノール（塩非含有ギ酸は
メタノールに良好に溶解する）に溶解させ、これに約１
ｍｌのメタノール性塩化カルシウム溶液（メタノール１
ｍｌあたりメタノール７２ ｍｇ）を添加する。 この塩の添加により直ちに純白でない白色の沈澱が生成
するので、これを焼結ガラスロートに集めて真空中で乾
燥する。乾燥後の収量は ６０．５ ｍｇ （理論収
量の９０パーセント）である。 ［００６２］ ６Ｒ物質についてこの手順を繰り返せば、５−ホルミル
−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸カルシウムが得
られる。 ［００６３］ 製造した物質の純度は、いかなるＵＶ−非吸収性物質の
存在にも配慮することなく、ＵＶ／ＨＰＬＣにより測定
する。エナンショマー的な純度は、５，１０−メテニル
−５，６（Ｒ，Ｓ）、７．８−テトラヒドロ葉酸誘導体
の段階において、対掌性カラム（ダイアセルキーラセル
○Ｄ）を用い、０．５パーセントのギ酸アンモニウム、
ｐＨ＝３．８、および ２５パーセントメタノールで平
等に溶離して、ＨＰＬＣにより測定する。５，１０−メ
テニル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸が最初に
、１５．２分の保持時間で溶離し、一方、５，１０−メ
チ丹ルー５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸は１８．
２分で溶離する。 ［００６４］ ギ酸の方が酸性が弱く、葉酸塩に対する溶解能力が大き
いので、文献に報告されているように、製造した化合物
の１０ Ｍまたは１２ Ｍ塩酸溶液よりもむしろギ酸溶
液を、その旋光性の記録に使用する。上記の製造の試料
は以下の旋光度を示した： 濃度（％） 旋光度 （８８％ （２６℃での 化合掬 壬醸溶液月 Ｌ氾Ｌ５．１０−メ
テニル− ５、６Ｓ 、 ７．８−テトラ ０．６１１
＋４２ヒドロ葉酸＊ ５．１０−メテニル− ５，６Ｒ，７，８−テトラ ０．６１９ −
４７ヒドロ葉酸＊＊ ＊ ５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉
酸として、０．１Ｍギ酸混合物で溶離してクロマトグラ
フィー的に単離し、５，１０−メテニル−５，６Ｓ、７
．８−テトラヒドロ葉酸に転化させ、ついで固化してゲ
ルを形成させ、これを凍結乾燥する。 ＊＊ 最初に非転化５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉
酸として単離し、これを凍結乾燥したのち、直ちに上記
のものと同様にしてギ酸を用いてホルミル化する。得ら
れる、希ギ酸混合物から晶出しな５，１０−メテニル−
５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸を集め、アセトン
で洗浄し、真空中で乾燥する。２５３ ｍｇの５．６Ｒ
，７゜８−テトラヒドロ葉酸（重量で）から２１８ ｍ
ｇの結晶性５，１０−メテニル−５，６Ｒ。 ７．８−テトラヒドロ葉酸（重量で）が回収される。 ［００６５］
【実施例９】
、識したホルミル−酸および誘導 の製造ギ酸アンモニ
ウムを放射性標識したギ酸アンモニウム、または他のい
かなるものであれ、放射性標識したギ酸誘導体で置き換
えて実施例２の手順を繰り返せば、放射性標識した１０
−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸が得
られる。これを実施例３−８の方法にかければ、対応す
る放射性標識した酸および塩が得られるであろう。 ［００６６］ 上記の特許、刊行物および試、験方法は本件明細書中に
引用文献として組み入れる。 ［００６７］ 上記の詳細な記述は当業者に多くの自明の変更を示唆す
る。たとえば、カルシウムロイコボリンに替えてストロ
ンチウムロイコボリンまたはナトリウムロイコボリンを
製造することもできる。テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼ
はクロストリジウム・アシジーウリキ（ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ａｃｉｄｉ−ｕｒｉｃｉ）より得られる。こ
の種の全ての自明の改変は、添付した特許請求の範囲の
意図した全範囲の内にある。 本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。 ［００６Ｓ］ １、（ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換テト
ラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの
６Ｒおよび６Ｓジアステレオ異性体の混合物の６Ｓ形状
を酵素的にホルミル化して１０−ホルミル−５，６Ｓ、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；存在すれば未反応の５．６ Ｓ 、 ７．８−テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未
反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステルを含んでなる混合物を形成させ；（
ｂ） （１） １０−ホルミル−５，６Ｓ、７．８
−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５
．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルから分離し、その後、上記の１０−ホルミル
−５，６Ｓ、７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを環化し、加水分解して５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸もしく
は５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸
またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの
双方を形成させるか；または、（２）上記の１０−ホル
ミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステルを５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に環化
、加水分解して５，１０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７
．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５−ホルミル−５，６
Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはそれらの塩も
しくはエステルを、またはこれらの双方を形成させ；そ
の後、（ｉ） ５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸ま
たはその塩もしくはエステルを誘導体化して５−置換５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを形成させ、ついで各成分を分離するが、ま
たは、これに替えて（ｉｉ） 全ての５，１０−メテニ
ル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸および全
ての５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒド
ロ葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを５．６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルから分離し；分離後、所望ならば、 （３）上記の未反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを化学的にホルミル
化し、環化し、加水分解して５−ホルミル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを製造するか、または、これに替えて、上記の５，６
Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステルを他の官能基で誘導体化して５−置換５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル、または５−ホルミル−５，６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する酸
、塩またはエステルに転化させる各段階を有する、５．
６（ＲまたはＳ）、７，８−テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルの誘導体の所望の実質的に純粋な
（６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異性体の製造方法。 ［００６９］ ２、選択的ホルミル化に使用する酵素がテトラヒドロ葉
酸ホルミラーゼよりなるものであることを特徴とする上
記の第１項記載の方法。 ［００７０１ ３、上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼがクロストリ
ジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種ＡＴＣＣ第７９０
５号、またはその変種より得られるものであることを特
徴とする上記の第２項記載の方法。 ４、未反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の化
学的ホルミル化をカルボジイミドの存在下にギ酸を用い
て実施することを特徴とする上記の第」項記載の方法［
００７１］ ５、転化段階（ｃ）が葉酸誘導体を対応する塩転化させ
ることよりなるものであることを特徴とする上記の第１
項記載の方法。 ［００７２］ ６．上記の塩がカルシウム塩、マグネシウム塩、ストロ
ンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれかの混合物よ
りなるものであることを特徴とする上記の第５項記載の
方法。 ［００７３］ ７、上記の酵素的ホルミル化を放射性標識したギ酸また
はその化学的同等物を含有する反応混合物中で行うこと
を特徴とする上記の第１項記載の方法。 ［００７４］ ８、 （ａ） ５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルの６Ｒおよび６Ｓジアス
テレオ異性体の混合物の６Ｓ形状を酵素的にホルミル化
して１０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；存在すれば未
反応の５．６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステル；および未反応の５．６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルよりなる混合物を形成させ； （ｂ） 上記の１０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを
５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルの存在下に環化し、加水分解して５，１０
−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸
もしくは５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラ
ヒドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、また
はこれらの双方を形成させ；その後、（ｃ） 全ての
５，１０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ，７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
から分離し； 分離後、所望ならば、 （ｄ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルを対応する酸、塩またはエステルに転化させる各段
階を有する、所望の実質的に純粋な５−ホルミル−５，
６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルの製造方法。 ［００７５］ ９、選択的ホルミル化に使用する酵素がテトラヒドロ葉
酸ホルミラーゼよりなるものであることを特徴とする上
記の第８項記載の方法。 ［００７６］ １０、上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼがクロスト
リジウム種ＡＴＣＣ第７９０５号、またはその変種より
得られるものであることを特徴とする上記の第９項記載
の方法。 ［００７７］ １１、転化段階（ｄ）が葉酸誘導体を対応する塩転化さ
せることよりなるものであることを特徴とする上記の第
８項記載の方法。 ［００７８］ １２、上記の塩がカルシウム塩、マグネシウム塩、スト
ロンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれかの混合物
よりなるものであることを特徴とする上記の第１１項記
載の方法。
ウムを放射性標識したギ酸アンモニウム、または他のい
かなるものであれ、放射性標識したギ酸誘導体で置き換
えて実施例２の手順を繰り返せば、放射性標識した１０
−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸が得
られる。これを実施例３−８の方法にかければ、対応す
る放射性標識した酸および塩が得られるであろう。 ［００６６］ 上記の特許、刊行物および試、験方法は本件明細書中に
引用文献として組み入れる。 ［００６７］ 上記の詳細な記述は当業者に多くの自明の変更を示唆す
る。たとえば、カルシウムロイコボリンに替えてストロ
ンチウムロイコボリンまたはナトリウムロイコボリンを
製造することもできる。テトラヒドロ葉酸ホルミラーゼ
はクロストリジウム・アシジーウリキ（ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ａｃｉｄｉ−ｕｒｉｃｉ）より得られる。こ
の種の全ての自明の改変は、添付した特許請求の範囲の
意図した全範囲の内にある。 本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。 ［００６Ｓ］ １、（ａ） テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換テト
ラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステルの
６Ｒおよび６Ｓジアステレオ異性体の混合物の６Ｓ形状
を酵素的にホルミル化して１０−ホルミル−５，６Ｓ、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ル；存在すれば未反応の５．６ Ｓ 、 ７．８−テト
ラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未
反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステルを含んでなる混合物を形成させ；（
ｂ） （１） １０−ホルミル−５，６Ｓ、７．８
−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５
．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルから分離し、その後、上記の１０−ホルミル
−５，６Ｓ、７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステルを環化し、加水分解して５，１０−メテ
ニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸もしく
は５−ホルミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸
またはそれらの塩もしくはエステルを、またはこれらの
双方を形成させるか；または、（２）上記の１０−ホル
ミル−５，６Ｓ、７．８−テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステルを５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはそれらの塩もしくはエステルの存在下に環化
、加水分解して５，１０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７
．８−テトラヒドロ葉酸もしくは５−ホルミル−５，６
Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはそれらの塩も
しくはエステルを、またはこれらの双方を形成させ；そ
の後、（ｉ） ５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸ま
たはその塩もしくはエステルを誘導体化して５−置換５
，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしく
はエステルを形成させ、ついで各成分を分離するが、ま
たは、これに替えて（ｉｉ） 全ての５，１０−メテニ
ル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸および全
ての５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒド
ロ葉酸、またはそれらの塩もしくはエステルを５．６Ｒ
，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルから分離し；分離後、所望ならば、 （３）上記の未反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを化学的にホルミル
化し、環化し、加水分解して５−ホルミル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを製造するか、または、これに替えて、上記の５，６
Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステルを他の官能基で誘導体化して５−置換５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを形成させ、所望ならば （ｃ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テル、または５−ホルミル−５，６Ｒ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対応する酸
、塩またはエステルに転化させる各段階を有する、５．
６（ＲまたはＳ）、７，８−テトラヒドロ葉酸またはそ
の塩もしくはエステルの誘導体の所望の実質的に純粋な
（６Ｒまたは６Ｓ）ジアステレオ異性体の製造方法。 ［００６９］ ２、選択的ホルミル化に使用する酵素がテトラヒドロ葉
酸ホルミラーゼよりなるものであることを特徴とする上
記の第１項記載の方法。 ［００７０１ ３、上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼがクロストリ
ジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種ＡＴＣＣ第７９０
５号、またはその変種より得られるものであることを特
徴とする上記の第２項記載の方法。 ４、未反応の５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸の化
学的ホルミル化をカルボジイミドの存在下にギ酸を用い
て実施することを特徴とする上記の第」項記載の方法［
００７１］ ５、転化段階（ｃ）が葉酸誘導体を対応する塩転化させ
ることよりなるものであることを特徴とする上記の第１
項記載の方法。 ［００７２］ ６．上記の塩がカルシウム塩、マグネシウム塩、ストロ
ンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれかの混合物よ
りなるものであることを特徴とする上記の第５項記載の
方法。 ［００７３］ ７、上記の酵素的ホルミル化を放射性標識したギ酸また
はその化学的同等物を含有する反応混合物中で行うこと
を特徴とする上記の第１項記載の方法。 ［００７４］ ８、 （ａ） ５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルの６Ｒおよび６Ｓジアス
テレオ異性体の混合物の６Ｓ形状を酵素的にホルミル化
して１０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；存在すれば未
反応の５．６ Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸また
はその塩もしくはエステル；および未反応の５．６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルよりなる混合物を形成させ； （ｂ） 上記の１０−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．
８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを
５．６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルの存在下に環化し、加水分解して５，１０
−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸
もしくは５−ホルミル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラ
ヒドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、また
はこれらの双方を形成させ；その後、（ｃ） 全ての
５，１０−メテニル−５，６Ｓ 、 ７．８−テトラヒ
ドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ，７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
から分離し； 分離後、所望ならば、 （ｄ） 実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ 、
７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエス
テルを対応する酸、塩またはエステルに転化させる各段
階を有する、所望の実質的に純粋な５−ホルミル−５，
６Ｓ 、 ７．８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルの製造方法。 ［００７５］ ９、選択的ホルミル化に使用する酵素がテトラヒドロ葉
酸ホルミラーゼよりなるものであることを特徴とする上
記の第８項記載の方法。 ［００７６］ １０、上記のテトラヒドロ葉酸ホルミラーゼがクロスト
リジウム種ＡＴＣＣ第７９０５号、またはその変種より
得られるものであることを特徴とする上記の第９項記載
の方法。 ［００７７］ １１、転化段階（ｄ）が葉酸誘導体を対応する塩転化さ
せることよりなるものであることを特徴とする上記の第
８項記載の方法。 ［００７８］ １２、上記の塩がカルシウム塩、マグネシウム塩、スト
ロンチウム塩、鉄塩、またはこれらのいずれかの混合物
よりなるものであることを特徴とする上記の第１１項記
載の方法。
Claims (2)
- 【請求項１】（ａ）テトラヒドロ葉酸の、もしくは置換
テトラヒドロ葉酸の、またはそれらの塩もしくはエステ
ルの６Ｒおよび６Ｓジアステレオ異性体の混合物の６Ｓ
形状を酵素的にホルミル化して１０−ホルミル−５，６
Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステル；存在すれば未反応の５，６Ｓ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル；および未反
応の５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩
もしくはエステルを含んでなる混合物を形成させ（ｂ）
（１）１０−ホルミル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ，７，
８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルか
ら分離し、その後、上記の１０−ホルミル−５，６Ｓ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを環化し、加水分解して５，１０−メテニル−５，６
Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉酸もしくは５−ホルミル−
５，６Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはそれらの塩
もしくはエステルを、またはこれらの双方を形成させる
か；または、（２）上記の１０−ホルミル−５，６Ｓ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはそれら
の塩もしくはエステルの存在下に環化、加水分解して５
，１０−メテニル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉
酸もしくは５−ホルミル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒ
ドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、または
これらの双方を形成させ；その後、（ｉ）５，６Ｒ，７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
を誘導体化して５−置換５，６Ｒ，７，８−テトラヒド
ロ葉酸またはその塩もしくはエステルを形成させ、つい
で各成分を分離するか、または、これに替えて（ｉｉ）
全ての５，１０−メテニル−５，６Ｓ，７，８−テトラ
ヒドロ葉酸および全ての５−ホルミル−５，６Ｓ，７，
８−テトラヒドロ葉酸、またはそれらの塩もしくはエス
テルを５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその
塩もしくはエステルから分離し；分離後、所望ならば、 （３）上記の未反応の５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステルを化学的にホルミル
化し、環化し、加水分解して５−ホルミル−５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを製造するか、または、これに替えて、上記の５，６
Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエ
ステルを他の官能基で誘導体化して５−置換５，６Ｒ，
７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステ
ルを形成させ、所望ならば （ｃ）実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ，７，８
−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル、ま
たは５−ホルミル−５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを対応する酸、塩また
はエステルに転化させる各段階を有する、５，６（Ｒま
たはＳ），７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もし
くはエステルの誘導体の所望の実質的に純粋な（６Ｒま
たは６Ｓ）ジアステレオ異性体の製造方法。 - 【請求項２】（ａ）５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸
またはその塩もしくはエステルの６Ｒおよび６Ｓジアス
テレオ異性体の混合物の６Ｓ形状を酵素的にホルミル化
して１０−ホルミル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒドロ
葉酸またはその塩もしくはエステル；存在すれば未反応
の５，６Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩も
しくはエステル；および未反応の５，６Ｒ，７，８−テ
トラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルよりなる
混合物を形成させ；（ｂ）上記の１０−ホルミル−５，
６Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくは
エステルを５，６Ｒ，７，８−テトラヒドロ葉酸または
その塩もしくはエステルの存在下に環化し、加水分解し
て５，１０−メテニル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒド
ロ葉酸もしくは５−ホルミル−５，６Ｓ，７，８−テト
ラヒドロ葉酸またはそれらの塩もしくはエステルを、ま
たはこれらの双方を形成させ；その後、（ｃ）全ての５
，１０−メテニル−５，６Ｓ，７，８−テトラヒドロ葉
酸またはその塩もしくはエステルを５，６Ｒ，７，８−
テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルから分
離し； 分離後、所望ならば、 （ｄ）実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ，７，８
−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステルを対
応する酸、塩またはエステルに転化させる各段階を有す
る、所望の実質的に純粋な５−ホルミル−５，６Ｓ，７
，８−テトラヒドロ葉酸またはその塩もしくはエステル
の製造方法。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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