KR920007403B1 - L(-)-테트라히드로폴산의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 L(-)-류코보린(L(-)-leucovorin) 제조를 위한 출발물질 및 기타목적을 위해 사용되는 물질인 L(-)-테트라히드로폴산(L(-)-tetrahydrofolic acid)의 제조 방법에 관한 것이다. L(-)-류코보린은 메토트렉세이트와 같은 폴산 길항제의 투여에 의해 초래되는 악성 빈혈의 예방 작용 및 항암제인 5-플루오로우라실의 치료학적 효과를 증진시키는 작용을 지니는 공지된 유용한 약물이다.
L(-)-테트라히드로폴산의 제조방법은 화학적 방법 및 효소적 방법의 두 주요 부류로 나눌 수 있다. 화학적 방법의 예로서, 폴산을 수용액내에서 NaBH4로 환원시키고, 이로써 생성된 L(±)-테트라히드로폴산을 산성 조건하 분해시키는 방법[Journal of Medicinal Chemistry, 22,731(197g)] ; 및 테트라히드로폴산을 6R 및 6S 부분 입체 이성질체 혼합물의 N-5 또는 N-10중 어느 한쪽에 비대칭 보조기를 결합시키고, 새로운 부분입체 이성질체를 분리시키고, 원하는 (6R 또는 6S)부분 입체 이성질체에 상응하는 원하는 새로운 부분입체 이성질체(6R 또는 6S)를 회수하고, 회수한 실질적으로 순수한 새로운 부분입체 이성질체를 상응하는 부분입체 이성질체로 전환시킴을 특징으로 하는 방법(EP-A-0266042)이 공지되어 있다.
화학적 방법에 의해 폴산으로 부터 L(-)-테트라히드로폴산을 제조할 때, L(+)-테트라히드로폴산은 부산물로서 반드시 형성된다 ; 따라서, 순수한 L(-)-테트라히드로폴산을 수득하기 위해 광학적 분해 과정이 반드시 필요하며 이 결과 제조을의 감소를 초래한다. 효소적 방법의 예로서, 디히드로폴레이트 리덕타제를 조효소 NADPH 존재하에 디히드로폴산에 작용시키는 방법이 공지되어 있다[Tetrahedron,42, 117(1986)]. 디히드로폴레이트 리덕타제에 의한 1몰의 디히드로폴산의 환원은 일반적으로 1몰의 NADPH의 1몰의 NADP로의 산화를 수반한다. NADPH는 고가의 화합물이므로, NADP의 환원에 의해 NADPH를 재생하는 효소적 시스템(이하, NADPH-재생 시스템이라 함)이 생산 비용을 감소시키기 위해 종종 사용된다.
종래, 이소시트레이트 데히드로계나제 또는 글루코오즈-6-포스페이트 데히드로게나제[Tetrahedron, 42, 117(1986)], 말레이트 데히드로게나제(일본국 특허 공재 제 128895/1986 호), 및 6-포스포클루코네이트 데히드로게나제 [Methods in Enzymology, 122, 360(1986)]를 사용한 NADPH-재생 시스템들이 공지되어 있다.
디히드로폴산에 대한 디히드로폴레이트 데히드로게나제의 작용에 의해 L(-)-테트라히드로폴산을 제조하는 효소적 방법에서 이소시트레이트 데히드로게나제를 NADPH-재생 시스템에 사용하는 경우, 기질로 사용되는 이소시트르산은 고가의 화합물이며, 이 반응에 장시간이 소요되고, 제조율은 낮다. NADPH-재생 시스템에 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나제를 사용하는 경우, 기질로 사용되는 글루코오즈-6-포스페이트는 고가의 화합물이며, 기질로 사용되는 클루코오즈-6-포스페이트를 공급하기 위해 반응 시스템 내에 크레아틴키나아제 또는 아세테이트 키나아제를 반드시 사용해사 하며, 반응에 장시간이 소요되고, 제조율은 낮다. NADPH-재생 시스템에 말레이트 데히드로게나제를 사용하는 경우, 디히드로플레이트 리덕타제를 2.9mM정도의 저농도로 디히드로폴산에 작용시켜야 하므로, 이 결과 소량의 L(-)-테트라히드로폴산이 생성된다. 또한, 디히드로폴산의 양에 비해 다량의 NADPH를 사용해야 한다, 따라서, 이는 효율적연 방법이 아니다. NADPH-재생 시스템에서 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 사용하는 경우, 기질로 사용되는 6-포스포글루콘산은 고가의 화합물이며, 디히드로폴산의 농도는 낮으며, 또한 디히드로폴산의 양에 비해 다량의 NADPH를 사용해야 한다 ; 따라서, 이는 효율적인 방법이 아니다.
L(-)-테트라히드로폴산(이하, 테트라히드로폴산이라 함)을 낮은 비용으로 제조하는 효율적인 공업적 방법을 개발하려는 집중적인 연구결과, 본 발명자들은 효소적 방법의 NADPH-재생 시스템에 있어 글루코오즈 데히드로게나제의 사용으로 디히드로폴레이트 리덕타제가 소량의 NADPH 존재하 고농도로 디히드로폴산에 작용하여, 테트라히드로폴산이 고효율로 제조됨을 발견하였다.
본 발명은 디히드로폴레이트 리덕타제를 수용액내(1) NADP 또는 NADPH, (2) 글루코오즈 및 (3) 글루코오즈 데히드로게나제 존재하 디히드로폴산에 작용시키고, 수용액내에 L(-)-테트라히드로폴산을 축적시키고, 여기에서 L(-)-테트라히드로폴산을 회수함을 특징으로 하는 L(-)-테트라히드로폴산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 디히드로폴레이트 리덕타제는 고도로 정제된 효소제제, 대강 정제된 효소제제, 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 활성을 지닌 미생물 세포 및 그들의 처리생성물과 같은 디히드로폴레이트 리덕타제-함유 물질일 수 있다. 디히드로폴레이트 리덕타제 활성을 지닌 미생물 세포로서, JP-A-69990/87에 기재된 플라스미드를 보유하는 에스케리키아콜리(Escherichia coli) 균주가 바람직하게 사용된다. 처리된 미생물 세포로서, 건조 생성물, 계면활성제-처리 생성물, 효소-처리 생성물, 초음파 처리 생성물, 기계적 파일 생성물, 용매-처리 생성물, 세포의 단백질 분획, 및 세포 또는 처리된 세포의 고정화생성물을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 글루코오즈 데히드로게나제로서는, NADP를 NADPH로 환원시킬 수 있는한, 고도로 정제된 제제, 대강 정제된 제제 및 글루코오즈 데히드로게나제 활성을 지닌 미생물 세로의 처리산물과 같은 글루코오즈 데히드로게나제-함유 물질중 어느 것을 사용할 수 있다. 효소원으로서, 아세토박터(Acetobacter), 박테리움(Bacterium), 글루코노박터(Gluconobacter), 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 크산토모나스(Xanthomonas) 속에 속하는 미생물 및 고등 동물의 간을 들수 있다. 고도로 정제된 효소제제는 예를들어, 이 효소를 생산할 수 있는 미생물의 세포를 기계적으로 파열시키고, 생성된 용액을 염석, 흡착 크로마토그래피, 이온-교환크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피에 의해 정제하여 수득할 수 있다.
디히드로폴레이트 리덕타제 및 글루코오즈 데히드로게나제를 가지고, 그들의 고도로 또는 대강 정제된 제제를 공지된 방법에 따라 담체(예, 알르긴산)에 의해 고정화 시킬 수 있으며, 또한 이 고정화 제제를 반복하여 사용할 수 있다. 디히드로폴레이트 리덕타제와 디히드로폴산의 반응은 디히드로폴레이트 리덕타제 및 글루코오스 데히드로게나제를 디히드로폴산, 클루코오즈 및 NADPH를 함유하는 물, 포스페이토 완충액 또는 Tris-HC1 완충액에 첨가하고 생성된 혼합물을 20 내지 40℃, 바람직하게는 28 내지 32℃의 온도 범위내, 5 내지 S, 바람직하게는 6 내지 7의 pH 범위내로 유지시키는 것이 효과적이다. 이 반응은 반응 시스템의 산소를 제거하기 위해 반응 혼합물내로 질소 및 아르곤과 같은 불활성 기체를 불어넣어 주면서 교반하에 수행하는 것이 바람직하다.
이 반응시스템내 디히드로폴산의 농도는 10 내지 300mM, 바람직하게는 30 내지 200mM의 범위내이고, 글루코오즈의 농도는 10 내지 1,000mM, 바람직하게는 50 내지 300mM의 범위내이고, NADPH의 농도는 0.02 내지 10mM, 바람직하게는 0.5 내지 5mM의 범위내이다. NADP를 NADPH 대신 사용할 수 있다. 이 반응 용액내 디히드로폴레이트 리덕타제 및 글루코오즈 데히드로게나제의 농도는 모두 1 내지 20U/ml, 바람직하게는 3 내지 10U/ml의 범위내이다.
디히드로폴레이트 리덕타제의 활성은 문헌[Biochemistry, 14, 5267(1975)]에 기재된 방접에 따라 pH 7.4에서 측정한다. 글루코오즈 데히드로게나제의 활성은 100mM 포스페이트 완충액(pH 7.0) 내 30℃에서 1μmole의 글루코오즈를 1분 동안 환원시키는 양을 1유니트(1U)라 정의하여 표시한다.
반응 시스템내 디히드로폴산이 디히드로폴레이트 리덕타제의 작용에 의해 환원됨에 따라 테트라히드로폴산은 반응 용액내에 축적된다. 디히드로폴산의 변화량을 측정하고, 축적된 테트라히드로폴산을 디히드로폴산이 모두 소모될 때 회수한다. 반응 시간은 통상적으로 0.5 내지 18시간이다 또한, 디히드로폴산의 양은 디히드로폴산 대신 소비된 글루코오즈를 분석하여 측정할 수 있다.
디히드로폴산의 정량 분석은 문헌[Methods in EnzymoIogy, 181,605(1971)]에 기재된 방법에 따라 수행하고, 글루코오즈는 글루코오즈 분석기 GL-101(Mitsubishi Kasei Cc,rporation사 제품)를 사용하여 정량 분석 한다. 형성된 테트라히드로폴산은 불안정 화합물이므로, 문헌[JoumaI of Chromatography,140,114(1977)]에 기재된 방법에 따라 그의 메테닐 유도체로 전환시킨 후 분석한다.
형성된 테트라히드로폴산은 문헌[Journal of MedicinaI Chemistry, 22,73(1979)]에 기재된 방법에 따라 회수하고, L-류코보린으로 전환시킬 수 있다. 하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 실명한다.
[실시예 1]
52mM 디히드로폴산, 61mM 글루코오즈 및 NaOH를 사용하여 pH 6.85로 조절시킨 1.0mM NADPH를 함유하는 수용액 100m1에 5.7U/m1 디히드로폴레이트 리덕타제 및 5.6U/m1 글루코오즈 데히드로게나제를 첨가한다. 반응을 질소 가스를 불어넣어 주면서 30℃에서 교반하 수행하고, 디히드로폴산 및 글루코오즈의 농도 변화를 측정한다. 반응 전과정 동안, 3N-NaOH를 첨가하여 pH를 6.8 내지 7.0 범위내로 유지시킨다. 반응시작 2시간 40분후, 모든 디히드로폴산이 테트라히드로폴산으로 전환되면, 아스코로브산 나트륨 1.9g를 첨가하고, 추가로 20분 동안 교반을 계속한다. 반응 혼합물의 pH를 염산을 첨가하여 3.55로 낮추고, 혼합물을 얼음 냉각하에 2시간 동안 교반한다. 테트라히드로폴산의 침전물을 분리해내고, 이 침전물을 여과에 의해 수거하고 물로 세척한다. 이렇게 수득한 침전물에, 포름산 40m1 및 트리플루오로아세토산 8ml를 첨가하고, 혼합물을 질소 기류하 실온에서 17시간 방치시킨다. 반응 혼합물을 감압하 농축시키고,0.5 N-HC1 60m1를 이 농축물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 교반하 밤새 방치한다. 침전물을 분리해내고, 이 침전물을 여과에 의해 수거하고 건조시켜 테트라히드로폴산의 메테닐 유도체 2.43g(수율 : 71%)을 수득한다.
[실험예]
실시예1에서 수득한 테트라히드로폴산의 메테닐 유도체(2.43g)을 일수 58m1에 첨가하고, 이 혼합물을, NaOH를 첨가하여 pH를 5.6 내지 6.9 범위내로 유지시키며 120℃ 오일욕에서 5.5시간 가열한다. 반응완료시, 무수 염화칼슘 1.2g 및 에탄올 11m1을 첨가하고, 1시간 동안 교반한다.
침전물을 분리해내고, 침전물을 여과 제거한다. 에탄올 400m1를 1시간에 걸쳐 냉각하에 여액에 적가한다. 침전물을 분리해내고, 침전물을 여과에 의해 수거하고 건조시켜 L(-)-류코보린 2.21g을 수득한다.
HPLC로 측정했을때, 이것의 순도의 100%이고, 디히드로폴산으로 부터의 수율은 65%이며, 이것의 광학적 순도는 99.9%이다. 최종 산물은 L(-)-류코보린임이 NMR 및 TLC에 의해 확인되었다.
Claims (6)
- 디히드로폴레이트 리덕타제를 수용액내 (1) NADP 또는 NADPH, (2) 글루코오즈 및 (3) 글루고오즈 데히드로게나제 존재하 디히드로폴산에 작용시키고; L(-)-테트라히드로폴산을 수용액내에 축척시키고, 여기에서 L(-)-테트라히드로폴산을 회수함을 특징으로 하는 L(-)-테트라히드로폴산의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 디히드로폴레이트 러덕타제 및 글루코오즈 데히드로게나제를 정제된 효소제제, 상기효소-함유 물질 또는 그들의 고정화 생성물의 형태로 사용함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 수용액이 물 및 완충액으로 구성된 군으로 부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 디히드로폴산의 농도 및 NADP 또는 NADPH의 농도가 각각 10 내지 300mM 및 0.02내지 10mM의 범위내 임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 디히드로폴레이트 리덕타제의 농도 및 글루코오즈 데히드로게나제의 농도가 모두 1내지 20U/m1 범위내 임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 환원 반응을 20 내지 40℃, 5 내지 8의 PH에서 0.5 내지 18시간 동안 수행함을 특징으로 하는 방법.
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